Validación de la Prueba de Tetrazolio como Método de Vigor para semillas de Glycine max.

Gallo1, C.; França-Neto

2, J.B; Arango

1, M.; Gonzalez

3, S.; Francomano

4, V.; Carracedo

5, C.; Costa

6, O.; Alves

7,

R.; Craviotto1, R.

1 INTA, Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria, Estación Experimental Agropecuaria Oliveros, Oliveros, Argentina. (gallo.carina@inta.gob.ar)

2 EMBRAPA Soja, Londrina, Brasil

3 INIA, Instituto Nacional de Investigación Agropecuaria, La Estanzuela, Uruguay

4 Francomano & Picardi SRL, Laboratorio de Semillas, Buenos Aires, Argentina

5 LEA, Laboratorio de Especialidades Agronómicas, Colón, Argentina

6 Sementes Adriana, Rondonopolis, Brasil

7 COCARI Seed, Mandaguari, Brasil.

RESUMEN

El objetivo de este estudio fue demostrar que la Prueba de Tetrazolio es un Método de Vigor para Glycine max, repetible dentro de los laboratorios y reproducible entre ellos. Se analizaron tres lotes de semillas de Glycine max, con una germinación de ≥ 80% (lote 1: 92%; lote 2: 89% y lote 3: 80%), empleando la Prueba de Tetrazolio. En la validación participaron 6 laboratorios. Las semillas fueron clasificadas en cuatro categorías: vigor alto, vigor medio, vigor bajo y otras tinciones (semillas viables no vigorosas y semillas no viables). La suma de la proporción de semillas de vigor alto, medio y bajo se expresó como Vigor-TZ (%). Los valores de Vigor-TZ (%) se encontraron dentro de los niveles de tolerancia establecidos por ISTA. El dato de Vigor-TZ fue analizado separadamente usando el cálculo del valor z-scores, valores h y valores k. El cálculo de los valores z-scores reveló que los datos de Vigor-TZ no excedieron el valor 2, por lo tanto los resultados son considerados satisfactorios. Los valores h mostraron que cinco laboratorios no sobreestimaron ni subestimaron los resultados de todos los lotes de semillas. Los valores k mostraron la variabilidad entre las repeticiones de cada uno de los lotes dentro de cada laboratorio. Las repeticiones estuvieron en tolerancia para todos los lotes y todos los laboratorios. La prueba fue repetible dentro de los laboratorios y reproducible en diferentes laboratorios. Concluimos que el dato para Vigor-TZ (%) muestra una variación aceptable y por lo tanto la Prueba de Tetrazolio puede ser aplicada como un método de vigor para soja.

INTRODUCCIÓN

El diagnóstico estimado de vitalidad de una semilla, evaluado con la técnica de Tetrazolio, fue denominada por Lakon como "vitalidad de la semilla", y por lo tanto fue asimilada para el término "poder de germinación" (ISTA, Working Sheets, 2003). Este término se refiere al hecho de que las semillas podrían ser evaluadas con una tinción de tetrazolio para verificar su potencial para producir nuevas plántulas.

La Prueba de Tetrazolio también provee una rápida evaluación del vigor de semillas viables (Moore, 1985) y fue rápidamente aceptada en Estados Unidos, América del Sur y Europa, donde se aplicó para numerosas especies comerciales. Muchas investigaciones fueron realizadas para explicar el fenómeno de "cuán vivas están las semillas vivas". Esto condujo al uso del análisis de la viabilidad no sólo para encontrar una correspondencia con el poder de germinación de un lote de semillas, sino también a la creación de una herramienta capaz de clarificar aspectos esenciales relacionados al vigor de las simientes. Por lo tanto, la Prueba de Tetrazolio como un método de vigor fue descripto para cereales en general por Lakon (1950) y presentado para semillas de trigo por Perry (1987). Además, esta técnica ha sido usada en maíz (Dias and Barros, 1995), algodón (Santos et al., 1992; Vieira & Von Pinho, 1999), maní (Gelmond, 1962; Moore, 1972; Bittencourt, 1995), soja (França-Neto et al., 1988; Craviotto et al., 1995; Costa et al., 1998; Craviotto et al., 2009), arveja, pino y trébol (AOSA, 1983).

La confiabilidad y la precisión de la prueba de tetrazolio fue revelada por el trabajo de 41 laboratorios que analizaron varias muestras de semillas de soja mediante las pruebas de germinación estándar, envejecimiento acelerado y tetrazolio, y emergencia en arena (França-Neto et al., 1986). La prueba de tetrazolio fue determinada como la segunda prueba más precisa con respecto a la repetibilidad después de la prueba de germinación estándar.

Subsecuentemente, França-Neto et al. (2001, 2002) realizó un referee test involucrando 27 laboratorios de semillas. Ellos concluyeron que la prueba de Tetrazolio fue tan precisa como la prueba de germinación estándar para determinar la viabilidad y fue más precisa que la prueba de envejecimiento acelerado para determinar el vigor. En 2004, França-Neto et al. (2004), concluyeron, sobre una base de 1117 lotes de semillas de soja evaluados entre 1997 y 2002 en Brasil, que el valor de vigor determinado por la prueba de tetrazolio puede ser confiablemente usada para estimar la emergencia potencial de plántulas en condiciones de campo (EPP) cuando la prueba es realizada tres o cuatro semanas antes de la siembra. Se desarrolló una ecuación para predecir la emergencia potencial a campo sobre la base del vigor de las semillas analizadas usando la prueba de Tetrazolio (EPP = 0.6165 * Vigor TZ + 35.716). Cuando esta ecuación fue analizada para 100 lotes de semillas en 2002, el coeficiente de regresión de 0.79 fue altamente significativo (P< 0.001). Esta ecuación está siendo actualmente evaluada por compañías de semillas de soja en Brasil." (Seed Vigour Testing Handbook, AOSA 2009)

La Prueba de Tetrazolio está basada en la actividad de ciertas enzimas llamadas deshidrogenasas, las cuáles participan en las reacciones de respiración que se producen en la mitocondria de las células vivas. Estas enzimas están presentes en los tejidos vivos de las semillas, y reducen la solución incolora de 2,3,5-trifenil cloruro de tetrazolio en un color rojo/rosa genéricamente llamado formazan. Cuando las semillas están sumergidas en una solución de tetrazolio, las células vivas de los tejidos sufren una reacción química de óxido reducción donde están presentes las enzimas participantes (Glenner, 1990).

La tinción de las semillas de soja muestra la actividad respiratoria de los diferentes tejidos. Como consecuencia de la condición de vitalidad de las estructuras seminales, aparecen diferentes colores e intensidades, reflejando las diferencias en la actividad respiratoria de cada estructura. Por lo tanto, de acuerdo a su condición fisiológica, se produce una imagen

topográfica de las semillas sobre sus superficies externas e internas (Moore, 1985; Craviotto et al., 2008; França-Neto et al., 1998).

El objetivo de este estudio fue demostrar que la Prueba de Tetrazolio es una método de vigor para Glycine max, repetible dentro de laboratorios y reproducible entre ellos.

MATERIALES Y MÉTODOS

Se emplearon muestras de tres lotes de semillas de Glycine max convencionales las cuales fueron provistas por la Estación Experimental Agropecuaria Paraná del Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria de Argentina. Todos los lotes de semillas tuvieron una germinación estándar superior al 80% (lote 1: 92%; lote 2: 89% y lote 3: 80%). Las muestras de los lotes de semillas se codificaron y fueron enviadas desde Oliveros, Argentina a los laboratorios participantes: Laboratorio de Semillas Francomano y Picardi, Argentina; Laboratorio de Semillas LEA, Argentina; EMBRAPA Soja, Brasil; Semillas Adriana, Brasil; Semillas COCARI, Brasil; Instituto Nacional de Investigación Agropecuaria, Uruguay e Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria, Argentina.

Los laboratorios participantes de Argentina, Brasil y Uruguay están acreditados por las Reglas MERCOSUR. Además, los laboratorios de Argentina y Uruguay están acreditados por el Instituto Nacional de Semillas de ambos países. Los Institutos Nacionales de Semillas de Argentina y Uruguay están acreditados por ISTA. Los laboratorios privados participantes fueron seleccionados por su prestigio, su gran entrenamiento, responsabilidad y experiencia en la Prueba de Tetrazolio, especialmente en semillas de soja.

Los tres lotes de semillas seleccionados, identificados por los números expresados en la Tabla 1, fueron enviados a todos los laboratorios participantes por el Laboratorio de Semillas del Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria de Argentina en Diciembre de 2013. Los resultados fueron recibidos en Febrero de 2014. Cada laboratorio recibió los tres lotes codificados con un número de lote de semillas con el correspondiente protocolo sin ninguna mención sobre los valores de germinación ni sobre el nombre de los demás participantes.

Las muestras de los tres lotes de semillas se enviaron en sobres cerrados, los cuáles fueron almacenados en contenedores a prueba de humedad (bolsas de polietileno) a baja temperatura (10ºC) antes de comenzar el análisis de las semillas.

Método de la Prueba

Preparación de la solución de tetrazolio: La sal de 2,3,5 trifenil cloruro de tetrazolio se disolvió en una solución buffer de acuerdo a lo establecido por la Reglas ISTA (ISTA, 2014).

Pretratamiento: La Prueba de Tetrazolio se condujo sobre dos repeticiones de 100 semillas para cada uno de los lotes de simientes. Las semillas se sumergieron toda la noche durante 16-18 horas entre rollos de papel de filtro a 20ºC ± 2ºC dentro de bolsas plásticas selladas para evitar la evaporación. Luego, si fue necesario, las semillas se sumergieron en agua durante 30 a 60 minutos a 20ºC ± 2ºC para completar la imbibición adicional. Al final del período de imbibición pueden presentarse semillas duras a las cuáles se les debe realizar

una incisión en el área cotiledonar opuesta al embrión. Luego, las semillas duras se sumergieron durante 16-18 horas entre rollos de papel de filtro a 20ºC ± 2ºC.

Tinción: Las semillas embebidas intactas se colocaron en una solución de 2,3,5 cloruro de trifenil tetrazolio al 0.1%, durante 3 horas a 35ºC ± 2ºC.

Preparación para la evaluación: Antes de la evaluación, se eliminó la solución de tetrazolio y las semillas se enjuagaron con agua. Las semillas permanecieron sumergidas en agua durante la evaluación para evitar la deshidratación y la decoloración. El tegumento de la semilla se removió manualmente (Figuras 1 y 2) y luego el embrión se expuso para cortarlo cuidadosamente a través de la mitad de los cotiledones y del hipocótilo con una hoja de afeitar (Figuras 3 y 4).

Evaluación: Las semillas teñidas se observaron interna y externamente. Las semillas con tegumento fuertemente adherido al eje embrionario y cotiledones se relacionaron directamente con tejidos sanos y vigorosos, lo cuáles siempre aparecen turgentes y rosados, tanto externa como internamente (Figura 5). En este tipo de semillas, la solución de

Figura 3. Corte a través de la mitad de

los cotiledones y del eje embrionario

usando una hoja de afeitar.

Figura 4. Detalle del área interna de una

semilla. Corte longitudinal del eje

embrionario y del cotiledón.

Figura 1. Remoción del tegumento de

una semilla de soja.

Figura 2. Tegumento de la semilla

totalmente removido.

tetrazolio penetró superficialmente, e internamente este tipo de semillas mostró una coloración blanco brillante rodeada por un área de color rosa (Figura 6). Los tejidos deteriorados siempre aparecieron de color rojo y los tejidos muertos de color blanco mate (Figura 7). Los tejidos que presentaron coloraciones amarillentas, y/o grisáceas y/o violáceas y verde fueron consideradas como tejidos no vivos (Figura 8).

Figura 5. Vista externa.

Semilla vigorosa de color

rosa.

Figura 6: Vista interna. Semilla vigorosa de color blanco brillante rodeado de un área rosa.

Figura 8. Vista externa.

Semilla con tejido deteriorado

color rojo (a) y verde (b) y tejidos

muertos de color blanco mate (c).

b

a

c

a

b

Figura 7. Vista externa.

Semilla con tejido deteriorado

color rojo (a) y tejido muerto de

color blanco mate (b).

Las semillas se clasificaron en diferentes categorías de acuerdo al color, a la turgencia del

tejidos y la localización (extensión y profundidad) de las áreas dañadas sobre la semilla

(Figura 9).

Vigor Alto: Semilla completamente turgente y teñida de color rosa (Figuras 5 y 6).

Vigor Medio: Presencia de áreas menores de color rojo, sin tinción, con tejidos necróticos o flácidos con una extensión limitada y de poca profundidad en cualquier lugar de la semilla (incluyendo eje embrionario y área de unión del eje embrionario y los cotiledones) (Figuras 9 y 10).

Vigor Bajo: Presencia de mayores o múltiples áreas de color rojo, sin tinción, tejidos flácidos o necróticos con una extensión desde 1/3 hasta 3/3 del área cotiledonar el extremo distal del cotiledón(es); y una profundidad de 1/2 del cotiledón hasta un cotiledón entero (Figuras 9 y 11).

Otras Tinciones: Esta categoría incluye a las Semillas Viables-No Vigorosas (Figura 12 A-E): Radícula con hasta 1/3 de tejidos deteriorados, sin tinción o perdidos (A); área de unión del eje embrionario y cotiledones con tejidos deteriorados rojos (B); cotiledones con más de 1/2 de tejidos deteriorados, sin tinción o perdidos (C); cotiledones con más de 1/4 de tejidos deteriorados o sin tinción en profundidad (D); cotiledones con más de 3/4 de tejidos deteriorados, sin tinción o perdidos (E). Semillas No Viables: Radícula con más de 1/3 de tejidos deteriorados, sin tinción o perdidos (Figura 12F); área de unión del eje embrionario y cotiledones sin tinción (Figura 12G); plúmula deteriorada o perdida (Figura 12H); cotiledones con 1/2 o más de tejidos deteriorados, sin tinción o perdidos (Figura 12I); cotiledones con más de 1/4 de tejidos deteriorados o sin tinción en profundidad (Figura 12J); cotiledón con más de 3/4 de tejidos deteriorados, sin tinción o perdidos (Figura 12K); semilla entera sin tinción (Figura 12L).

Figura 9. Ubicación de áreas dañadas sobre la semilla.

Figura 10. Semillas de Vigor Medio: áreas menores de color rojo, sin tinción, tejidos flácidos o

necróticos con extensión limitada y superficial.

Figura 11. Semillas de Bajo Vigor: mayores o múltiples áreas de color rojo, sin tinción,

tejidos flácidos o necróticos con una extensión de 1/3 del área cotiledonar (A) hasta 3/3 del

área cotiledonar en el extremo final del cotiledón(es) (B); y una profundidad de ½ del

cotiledón hasta un cotiledón entero.

Figura 12. Otras Tinciones : Semillas Viables - No Vigorosas: Radícula con hasta 1/3 de tejidos deteriorados, sin tinción o perdidos (A); área de unión del eje embrionario y cotiledones con tejidos deteriorados rojos (B); cotiledones con más de 1/2 de tejidos deteriorados, sin tinción o perdidos (C); cotiledones con más de 1/4 de tejidos deteriorados o sin tinción en profundidad (D); cotiledones con más de 3/4 de tejidos deteriorados, sin tinción o perdidos (E). Semillas No Viables: Radícula con más de 1/3 de tejidos deteriorados, sin tinción o perdidos (F); área de unión del eje embrionario y cotiledones sin tinción (G); plúmula deteriorada o perdida (H); cotiledones con 1/2 o más de tejidos deteriorados, sin tinción o perdidos (I); cotiledones con más de 1/4 de tejidos deteriorados o sin tinción en profundidad (J); cotiledón con más de 3/4 de tejidos deteriorados, sin tinción o perdidos (K); semilla entera sin tinción (12L).

A B C D E

I F G H

J K L

A

A A

B

I

Apéndice 1 muestra un ejemplo de la tabla empleada para registrar los resultados. En este registro, el vigor de un lote de semillas es expresado como Vigor-TZ (%), el cuál es la suma de las semillas en las tres categorías de vigor: A (vigor alto) + B (vigor medio) + C (vigor bajo), expresado como porcentaje. La proporción de semillas en cada categoría puede ser usada para evaluaciones complementarias del vigor de semillas. Sin embargo, este registro focalizará solamente sobre la evaluación sobre el total (Vigor-TZ (%)).

Análisis estadístico

Los resultados de Vigor-TZ (%) por la Prueba de Tetrazolio se analizaron separadamente usando el cálculo de los z-scores y la herramienta estadística desarrollada por S. Grégoire de acuerdo a ISO 5725-2 para calcular los valores h y los valores k. La herramienta estadística está disponible en el sitio web de ISTA:

http://www.seedtest.org/upload/cms/user/ISO572511.zip

El rango de tolerancia (Apéndice 2) se usó para comparar el Vigor-TZ (%) para dos repeticiones de 100 semillas analizadas para cada lote de semillas. El análisis estadístico de los resultados de la prueba se realizó mediante un Modelo Lineal. Además, se emplearon tolerancias para comparar los resultados entre los laboratorios participantes: tanto dentro de los laboratorios como entre laboratorios.

Los participantes no brindaron información sobre sus experiencias con respecto a las muestras de semillas de Glycine max analizadas.

Reporte de los resultados

Los resultados de este método se reportaron como un único valor denominado: Vigor-TZ (%).

RESULTADOS

Todos los laboratorios enviaron los resultados del análisis en tiempo y forma. En esta validación no se incluyeron en el análisis datos de la muestra ni de los laboratorios participantes. Los resultados de todos los laboratorios fueron expresados como Vigor-TZ (%) (Tabla 2). El lote 3 tuvo un bajo Vigor- TZ (5) (37, Tabla 2) comparado con los lotes 1 y 2 los cuáles presentaron el mismo valor (66, Tabla 2). Los lotes 1 y 2 también mostraron similares valores medios para el porcentaje de semillas en las categorías A,B y C en los seis laboratorios: Lote 1 - A, 14.1; B, 25.9; C, 24.3; Lote 2 – A, 8.0; B, 29.9; C, 27.0. Dado que los datos para las categorías A, B y C no son reportados, por lo tanto el análisis se limitó al Vigor-TZ (%). El Apéndice 3 muestra los datos de la Prueba de Tetrazolio de los tres lotes de semillas obtenidos por los seis laboratorios. El cálculo de los valores z-scores (Tabla 2) reveló que todos los datos para el Vigor-TZ (%) no excedieron el valor 2, por lo tanto todos los resultados se consideraron satisfactorios.

La repetibilidad y la reproducibilidad se analizaron con la herramienta estadística desarrollada por S. Grégoire, basada en ISO 5725-2; esto permitió el cálculo de los valores h y k. Los valores h muestran la tendencia de un laboratorio para sobreestimar o subestimar resultados comparada con la media general de todos los resultados disponibles para cada lote. Por otro lado, los valores k brindan una medida de la variabilidad de las repeticiones. Valores altos indican mayores sub o sobreestimaciones (valores h) o mayor variabilidad entre repeticiones (valores k).

La Figura 13 indica que el laboratorio E sobreestimó los resultados del lote 1 si consideramos el valor h crítico al 5% de nivel de significancia, mientras que si consideramos el valor h crítico al 1% de nivel de significancia, este laboratorio no sobreestimó los resultados del mismo lote. Los laboratorios restantes ni sobreestimaron ni subestimaron los resultados en ninguno de los lotes de semillas.

La Figura 14 muestra la variabilidad entre las repeticiones para cada lote. Los resultados obtenidos para el lote 1 y lote 2 en el laboratorio A fueron significativamente mayores que la variabilidad para los mismos lotes en los otros laboratorios. Aún así, las repeticiones estuvieron en tolerancia para todos los lotes y todos los laboratorios (Proceedings of the ISTA Tetrazolium Workshop, Edinburgh, 1997).

La Tabla 3 muestra la repetibilidad y la reproducibilidad de los valores obtenidos de los tres lotes de semillas para todos los laboratorios. Estos valores están dentro de un rango similar a métodos de vigor previamente validados (deterioro controlado, emergencia de radícula, conductividad para Phaseolus vulgaris y Glycine max).

DISCUSIÓN

La prueba reveló claramente que el lote 3 tenía un nivel de vigor más bajo, expresado como Vigor-TZ (%), que los lotes 1 y 2 los cuáles tenían valores similares de vigor. Un trabajo previo mostró que tales diferencias se relacionan estrechamente a la capacidad de las semillas para emerger en el campo (França-Neto et al 2004). Así, el Vigor-TZ (%) predice una de las expresiones de vigor en un lote de semillas: la capacidad de emergencia a campo.

El Vigor-TZ (%) expresa el nivel de vigor entre las semillas vigorosas; semillas no vigorosas y semillas no viables son excluidas. Sin embargo, la separación de los lotes de simientes con similar Vigor-TZ (%) puede ser realizada in-house para la determinación de la proporción de semillas dentro de cada categoría (A, B, C). Sin embargo, como la separación de las semillas dentro de estas categorías puede estar sujeta a la experiencia del analista, estas categorías no son reportadas.

La prueba fue repetible dentro de los laboratorios y reproducible en los diferentes laboratorios. Además, las repeticiones dentro de los laboratorios y los valores medios obtenidos para cada lote en diferentes laboratorios estuvieron dentro de tolerancia, empleando las tablas de tolerancias del Proceedings of the ISTA Tetrazolium Workshop, Edinburgh, 1997. Esto aporta evidencia en apoyo a la incorporación de la Prueba de Tetrazolio en las Reglas ISTA como un método de Vigor para Glycine max.

AGRADECIMIENTOS

Queremos agradecer al Ing. Agr. M.Sc. Diego Santos, de la Estación Experimental Agropecuaria Paraná del INTA, quien nos proveyó los lotes de semillas para el estudio; y a la Lic. Luciana Magnano, de la Estación Experimental Agropecuaria Oliveros del INTA, quien contribuyó en el análisis estadístico de los datos.

REFERENCIAS AOSA. 1983. Seed Vigour Testing Handbook. Contribution Nº 23 to the Handbook on Seed

Testing, Association of Official Seed Analysts, NE, USA.

AOSA. 2009. Seed Vigour Testing Handbook. Contribution Nº 32 to the Handbook on Seed Testing, Association of Official Seed Analysts, NE, USA.

Bittencourt, S.R.M. 1995. Avaliaçao da qualidade fisiológica de sementes de amendoim através do teste de tetrazólio. Dissertaçao (mestrado em agronomia) - Facultade de Ciencias Agrarias e Veterinarias, Universidade Estadual Paulista. Jaboticabal, 111p.

Costa, N.P.; França-Neto, J.B.; Krzyzanowski, F.C.; Henning, A.A.; Oliveira, M.C.N. 1998. Procedimiento alternativo no teste de tetrazólio em sementes de soja. Pesquisa Agropecuária Brasileira, Brasilia, v.33, n.6, 869-877.

Craviotto, R.M.; Fared, M.; Montero, M.S. 1995. Prueba Topográfica por Tetrazolio. Patrones para la especie soja. Publicación Miscelánea Laboratorio de Semillas EEA Oliveros. Centro Regional Santa Fe. INTA. ISSN 0327 - 3377.

Craviotto, R.M.; Arango, M.R.; Gallo, C. 2008. Topographic Tetrazolium Test for Soybean. Suplemento Especial Nº 1 Revista Análisis de Semillas. Argentina. ISSN 1851-9415. 96 p.

Dias, M.C.; Barros, A.S. 1995. Evaluation of corn seeds quality. Londrina: IAPAR, Nº88. 43 p.

Dias, M.C.; Barros, A.S. 1999. Metodologia do Teste de Tetrazólio em Sementes de Milho.Vigor de sementes: conceitos e testes. Editores Francisco Carlos Krzyzanowski; Roberval Daiton Vieira; José de Barros França-Neto; Associaçao Brasileira de Tecnologia de Sementes, Comite de Vigor de Sementes. Londrina: ABRATES. 218 p.

França-Neto, J.B.; Pereira, L.A.G.; Costa, N.P.; Krzyzanowski, F.C.; Henning, A.A. 1988. Metodologia do teste de tetrazólio em sementes de soja. Londrina: EMBRAPA-CNPSo. 58 p.

França-Neto, J.B.; Krzyzanowski, F.C.; Pereira, L.A.G.; Costa, N.P. 1998. El Test de Tetrazolio em Sementes de Soja. Londrina: EMBRAPA-CNPSo. Documentos, 117. 72 p.

Gelmond, G.H. 1962. A review of problems associated with testing of peanut seed (Arachis hypogaea). Proc. Int. Seed Test. Assoc. Zurich, v.27, n.2, 357-372.

Glenner, G.G. 1990. Formazans and Tetrazolium Salts. In: Biological Stains. Edited by R.D.Lillie, M.D. Sigma Chemical Company. ISBN 0-941633-29-2. 225-235.

International Seed Testing Association. 2003. ISTA Working Sheets on Tetrazolium Testing. Vol. I. Agricultural, Vegetable & Horticultural Species. Edited by Leist, N.; Kramer, S.; Jonitz, A. Bassersdorf, Switzerland. 200 p.

International Seed Testing Association. 2014. ISTA International Rules for Seed Testing. Bassersdorf, Switzerland.

ISO 5725-2. 1994. Accuracy (trueness and precision) of measurement methods and results. Part 2: Basic method for the determination of repeatability and reproducibility of a standard measurement method. First Edition 1994-12-15. International Organization for Standardization. Géneve, Switzerland.

Lakon, G. 1950. Die "Triebkraft" von Samen und ihre Feststellung nach dem topographischen Tetrazolium-Verfahren. Saatgutwirtschaft, 2, 37-41.

Moore, R.P. 1972. Tetrazolium testing of seed peanuts. Oléagineux, Montpellier, v.27, n.(8-9), 433-437.

Moore, R.P. 1985. Handbook on Tetrazolium Testing. International Seed Testing Association, Zurich

Perry, D.A. 1987. Topographical tetrazolium test. In: Handbook of Vigour Test Methods, 2nd Edition, International Seed Testing Association, Zurich, 57-60.

International Seed Testing Association. 1997. Proceedings of the ISTA Tetrazolium Workshop, Edinburgh. Compiled and Edited by Don, R.; Leist, N; Steiner, A.M. 134 pp

Santos, V.L.M.; Banci, C.A.; Calil, A.C.; Mendoza, R.M.; Silva, R.F.; Santos, C.M. 1992. Utilizaçao do testes de tetrazólio na avaliaçao da germinaçao e vigor de sementes de algodao (Gossypium hirsutum L.). Revista Brasileira de Sementes. Brasília, v.14, n.2, 155-159.

Vieira, M.C.; Von Pinho, E.V. 1999. Metodologia do Teste de Tetrazólio em Sementes de Algodao.Vigor de sementes: conceitos e testes. Editores Francisco Carlos Krzyzanowski; Roberval Daiton Vieira; José de Barros França-Neto; Associaçao Brasileira de Tecnologia de Sementes, Comite de Vigor de Sementes. Londrina: ABRATES. 218 p.

Tabla 1: Resultados de Vigor-TZ (%) de dos repeticiones de la Prueba de Tetrazolio para cada uno

de los tres lotes de simientes, obtenidos en seis laboratorios.

Tabla 2: Comparación de medias, desvíos estándar (DS) y valores z-score de valores de Vigor-TZ

para tres lotes de semillas analizados por seis laboratorios empleando la Prueba de Tetrazolio.

Lote 1 Lote 2 Lote 3

LAB A 61,5 71,5 26,5

LAB B 58,5 65,5 43,5

LAB C 63,5 61,5 27

LAB D 61,5 57,5 36,5

LAB E 74 67 31

LAB F 66 66 37

Media 64,167 64,833 33,583

Desvío est. 5,419 4,813 6,614

z-score Lote 1 Lote 2 Lote 3

LAB A -0,492 1,385 -1,071

LAB B -1,046 0,139 1,499

LAB C -0,123 -0,693 -0,995

LAB D -0,492 -1,524 0,441

LAB E 1,815 0,450 -0,391

LAB F 0,338 0,242 0,517

Repetición

LABORATORIO

A B C D E F

Lote 1 1 68 58 63 63 76 65

2 55 59 64 60 72 67

Media 62 59 64 62 74 66

Lote 2 1 70 66 61 57 67 66

2 73 65 62 58 67 66

Media 72 66 62 58 67 66

Lote 3 1 26 43 27 37 32 38

2 27 44 27 36 30 36

Media 27 44 27 37 31 37

Figura 13: Valores de Vigor-TZ (%): valores h para tres lotes de semillas de Glycine max analizadas

empleando la Prueba de Tetrazolio en seis laboratorios.

Figura 14: Valores de Vigor-TZ (%): valores k para tres lotes de semillas de Glycine max analizadas

empleando la Prueba de Tetrazolio en seis laboratorios.

Tabla 3: Valores de Vigor-TZ (%) para resultados de repetibilidad y reproducibilidad en la Prueba

de Tetrazolio.

Lote Repetibilidad Reproducibilidad

Lote 1 4,082 6,140

Lote 2 1,000 4,865

Lote 3 0,957 6,648

Apéndice 1. Ejemplo de los resultados de dos repeticiones de la Prueba de Tetrazolio para ilustrar

como se obtiene el valor final de Vigor-TZ (%).

Resultados de la Prueba de Tetrazolio para Vigor

LOTE Nº 1

Niveles de Vigor

Repeticiones

(Número de Semillas)

I

II

Media

(Número de Semillas)

Media

(%)

Vigor Alto (A) 2 4 3 3

Vigor Medio (B) 25 21 23 23

Vigor Bajo (C) 59 57 58 58

Vigor-TZ (A + B + C) 86 82 84 84

Otras Tinciones 14 18 16 16

Apéndice 2. Rangos de Tolerancia.

Extraído de la Asociación Internacional de Análisis de Semillas, Acta del Taller de Tetrazolio de

ISTA, Edinburgo, 1997 (Compilado y Editado por Don,R.; Leist, N; Steiner, A.M.)

Apéndice 3. Resultados de dos repeticiones de la Prueba de Tetrazolio para cada uno de los tres

lotes de semillas analizadas en seis laboratorios.

LABORATORIO A

LOTE 1

NIVEL DE VIGOR

REPETICIONES

MEDIA (%) I II

VIGOR ALTO (A) 29 16 22,5

VIGOR MEDIO (B) 10 27 18,5

VIGOR BAJO ( C ) 29 12 20,5

VIGOR-TZ (A+B+C) 68 55 62

OTRAS TINCIONES 32 45 39

LOTE 2

NIVEL DE VIGOR

REPETICIONES

MEDIA (%) I II

VIGOR ALTO (A) 16 13 14,5

VIGOR MEDIO (B) 40 32 36

VIGOR BAJO ( C ) 14 28 21

VIGOR-TZ (A+B+C) 70 73 72

OTRAS TINCIONES 30 27 28

LOTE 3

NIVEL DE VIGOR

REPETICIONES

MEDIA (%) I II

VIGOR ALTO (A) 5 1 3

VIGOR MEDIO (B) 11 5 8

VIGOR BAJO ( C ) 10 21 15,5

VIGOR-TZ (A+B+C) 26 27 27

OTRAS TINCIONES 74 73 73

LABORATORIO B

LOTE 1

NIVEL DE VIGOR

REPETICIONES

MEDIA (%) I II

VIGOR ALTO (A) 2 2 2

VIGOR MEDIO (B) 24 20 22

VIGOR BAJO ( C ) 32 37 35

VIGOR-TZ (A+B+C) 58 59 59

OTRAS TINCIONES 42 41 41

LOTE 2

NIVEL DE VIGOR

REPETICIONES

MEDIA (%) I II

VIGOR ALTO (A) 3 2 3

VIGOR MEDIO (B) 32 31 32

VIGOR BAJO ( C ) 31 32 31

VIGOR-TZ (A+B+C) 66 65 66

OTRAS TINCIONES 34 35 34

LOTE 3

NIVEL DE VIGOR

REPETICIONES

MEDIA (%) I II

VIGOR ALTO (A) 1 0 1

VIGOR MEDIO (B) 11 9 10

VIGOR BAJO ( C ) 31 35 33

VIGOR-TZ (A+B+C) 43 44 44

OTRAS TINCIONES 57 56 56

LABORATORIO C

LOTE 1

NIVEL DE VIGOR

REPETICIONES

MEDIA (%) I II

VIGOR ALTO (A) 24 18 21

VIGOR MEDIO (B) 16 26 21

VIGOR BAJO ( C ) 23 20 21,5

VIGOR-TZ (A+B+C) 63 64 63,5

OTRAS TINCIONES 37 36 36,5

LOTE 2

NIVEL DE VIGOR

REPETICIONES

MEDIA (%) I II

VIGOR ALTO (A) 15 9 12

VIGOR MEDIO (B) 22 31 26,5

VIGOR BAJO ( C ) 24 22 23

VIGOR-TZ (A+B+C) 61 62 61,5

OTRAS TINCIONES 39 38 38,5

LOTE 3

NIVEL DE VIGOR

REPETICIONES

MEDIA (%) I II

VIGOR ALTO (A) 0 0 0

VIGOR MEDIO (B) 9 11 10

VIGOR BAJO ( C ) 18 16 17

VIGOR-TZ (A+B+C) 27 27 27

OTRAS TINCIONES 73 73 73

LABORATORIO D

LOTE 1

NIVEL DE VIGOR

REPETICIONES

MEDIA (%) I II

VIGOR ALTO (A) 3 4 4

VIGOR MEDIO (B) 20 23 22

VIGOR BAJO ( C ) 40 33 36

VIGOR-TZ (A+B+C) 63 60 62

OTRAS TINCIONES 37 40 38

LOTE 2

NIVEL DE VIGOR

REPETICIONES

MEDIA (%) I II

VIGOR ALTO (A) 0 0 0

VIGOR MEDIO (B) 12 12 12

VIGOR BAJO ( C ) 45 46 46

VIGOR-TZ (A+B+C) 57 58 58

OTRAS TINCIONES 43 42 42

LOTE 3

NIVEL DE VIGOR

REPETICIONES

MEDIA (%) I II

VIGOR ALTO (A) 1 1 1

VIGOR MEDIO (B) 10 5 8

VIGOR BAJO ( C ) 26 30 28

VIGOR-TZ (A+B+C) 37 36 37

OTRAS TINCIONES 63 64 63

LABORATORIO E

LOTE 1

NIVEL DE VIGOR

REPETICIONES

MEDIA (%) I II

VIGOR ALTO (A) 2 4 3

VIGOR MEDIO (B) 49 47 48

VIGOR BAJO ( C ) 25 21 23

VIGOR-TZ (A+B+C) 76 72 74

OTRAS TINCIONES 24 28 26

LOTE 2

NIVEL DE VIGOR

REPETICIONES

MEDIA (%) I II

VIGOR ALTO (A) 1 1 1

VIGOR MEDIO (B) 40 42 41

VIGOR BAJO ( C ) 26 24 25

VIGOR-TZ (A+B+C) 67 67 67

OTRAS TINCIONES 33 33 33

LOTE 3

NIVEL DE VIGOR

REPETICIONES

MEDIA (%) I II

VIGOR ALTO (A) 0 0 0

VIGOR MEDIO (B) 14 14 14

VIGOR BAJO ( C ) 18 16 16

VIGOR-TZ (A+B+C) 32 30 31

OTRAS TINCIONES 68 70 69

LABORATORIO F

LOTE 1

NIVEL DE VIGOR

REPETICIONES

MEDIA (%) I II

VIGOR ALTO (A) 32 31 32

VIGOR MEDIO (B) 21 27 24

VIGOR BAJO ( C ) 12 9 10

VIGOR-TZ (A+B+C) 65 67 66

OTRAS TINCIONES 35 33 34

LOTE 2

NIVEL DE VIGOR

REPETICIONES

MEDIA (%) I II

VIGOR ALTO (A) 18 18 18

VIGOR MEDIO (B) 32 31 32

VIGOR BAJO ( C ) 16 17 16

VIGOR-TZ (A+B+C) 66 66 66

OTRAS TINCIONES 34 34 34

LOTE 3

NIVEL DE VIGOR

REPETICIONES

MEDIA (%) I II

VIGOR ALTO (A) 1 0 1

VIGOR MEDIO (B) 20 23 21

VIGOR BAJO ( C ) 17 13 15

VIGOR-TZ (A+B+C) 38 36 37

OTRAS TINCIONES 62 64 63