REA DE CIENCIAS BSICAS Y AMBIENTALES

BIOLOGA IIManual de Laboratorio

INSTITUTO TECNOLGICO DE SANTO DOMINGO 2011

1

REGLAS A SEGUIR EN EL LABORATORIO DE BIOLOGA

1. Cada prctica se iniciar a la hora en punto. No se permitir la entrada al laboratorio de estudiantes que lleguen pasada la hora. 2. Estudiantes que no posean la bata de laboratorio no recibirn la prctica. 3. Dentro del laboratorio est prohibido el consumo de comida y bebida. 4. No se permite fumar en el laboratorio. 5. Todo desperdicio slido debe ser desechado en los basureros y no en los fregaderos del laboratorio. 6. Al finalizar la prctica es responsabilidad de todos los estudiantes dejar el laboratorio completamente limpio y ordenado. 7. Al final de la prctica cada estudiante entregar un protocolo de las actividades realizadas dentro del laboratorio. La prctica deber ser firmada por la profesora o el monitor antes de salir del laboratorio. 8. No se repondrn las prcticas. 9. Trate todos los instrumentos con cuidado por su seguridad y la del instrumento. 10. Trate todos los reactivos como peligrosos, cuidando de no derramarlos ni echarlos sobre la piel. 11. No ingerir, oler ni tocar directamente los reactivos utilizados en el laboratorio. 12. Cada laboratorio incluye una parte de investigacin prelaboratorio. Es necesario mostrar que se haya completado el trabajo al principio de cada clase. 13. La evaluacin del laboratorio ser de la siguiente forma: - Pruebines bisemanales (4; 6pts. c/u): 24 puntos. - Participacin oral: 4 puntos. - Asistencia: 2 puntos.14. Si durante los pruebines un estudiante intenta copiar las

respuestas de otro estudiante, automticamente se le anular el pruebin.

2

PRCTICA NO. 1 ADN1. Introduccin El ADN es el material gentico bsico de la mayora de los organismos vivos. A pesar de ser una molcula de gran tamao y aparentemente compleja, de hecho su estructura es asombrosamente simple (Bostrorn et al.,1995). La Gentica se inicia con el redescubrimiento de las leyes de Mendel en 1900 y no fue hasta 1906 que el britnico William Bateson acuo el trmino y escribi el primer libro de texto; los avances conceptuales del siglo XIX fueron fundamentales para el pensamiento gentico posterior (Barbadilla, http://biologa.uab.es/genetica/curso/Historia.html). En 1784 Nageli enuncia la teora del idioplasma, que establece que el ncleo celular es el vehculo de la herencia. En 1883 van Beneden trabajando en el nemtodo Ascaris descubre la meiosis y reconoce la individualidad de los cromosomas (Barbadilla, http://biologa.uab.es/genetica/curso/Historia.html). El ADN fue aislado por Friedrich Miescher en 1869, se utiliz ADN de esperma de salmn y de pus de heridas abiertas. Dado que lo encontr solamente en los ncleos, Miescher denomin a este compuesto nuclena. A posteriori se lo cambi a cido nucleico y por ltimo a cido desoxirribonucleico o ADN (Raisman, 2000). 1900-1940: La Gentica Clsica En 1909 el dans Wilhelm Johannsen introduce el trmino gen (Barbadilla, http://biologa.uab.es/genetica/curso/Historia.html). Thomas Hunt Morgan (1866-1945) estudi la transmisin de caracteres hereditarios en la mosca del vinagre y demostr la localizacin de los genes en los cromosomas. Gracias a su trabajo, Drosophila melanogaster se convirti en uno de los principales organismos modelo en gentica. A principios de la dcada de 1940 dos genetistas estadounidenses, George Wells Beadle y Edgard Lawrie Tatum, trabajaron con el hongo Neurospora y Penicillium, y descubrieron que los genes dirigen la formacin de enzimas a travs de las unidades que los constituyen. Este trabajo orient los estudios hacia la naturaleza qumica de los genes y ayud a establecer el campo de la gentica molecular. Sin embargo, en 1944, el bacterilogo canadiense Oswald Theodore Avery y Colin McLeod realizan un experimento en el cual demuestran que el ADN es la sustancia que causa la transformacin bacteriana.

3

Otro momento decisivo en la investigacin de la estructura del ADN (todava no se saba que el ADN formaba una doble hlice) se alcanz en 1951, cuando Rosalind Franklin obtuvo una excelente fotografa del ADN mediante difraccin de rayos X (Prescott et al.,1999). Sin realizar en realidad ningn experimento, Watson y Crick construyen su modelo combinando las reglas de Chargaff sobre la composicin de bases con los datos de los estudios con rayos X de Franklin y sus predicciones acerca de cmo deba comportarse el material gentico. Fueron ellos los que descubrieron que el ADN era de doble hlice; Watson, Crick y Wilkins (colega de R. Franklin que muri de cncer en 1958) recibieron el Premio Nbel en 1962 por sus descubrimientos (Prescott et al.,1999). Investigue y Estudie Advertencia! Estas preguntas pueden incluirse en un pruebn pre-laboratorio 1- Leerse y estudiar el Captulo 11: cido desoxirribonucleico: Portador de la informacin gentica (Solomon et al., 2001: 253-266). 2- De qu est compuesto el ADN? 3- Dnde se encuentra el ADN en la clula? 4- Cuntos cromosomas tenemos? 5- Cuntos genes tenemos? 6- Cul es la funcin que posee un gen? 7- Las estructuras presentes en la figura 1 se llaman telmeros. Qu son y cul es su funcin?

Fig. 1: Telmeros 8- Cmo se pueden utilizar los telmeros en medicina forense? 9- Qu carga posee el ADN (carga positiva, negativa o ninguna)? Por qu? 10-En qu consisti el proyecto del Genoma Humano?

4

Objetivos Realizar la extraccin de ADN vegetal (lentejas). Utilizar el protocolo para extraer ADN de las clulas de la mejilla.

Materiales Estudiante: lentejas. Laboratorio: agua destilada, NaCl 5%, probeta, beaker, detergente, tubo de ensayo, licuadora, colador, ablandador de carne, etanol, 30ml de una solucin de sal al 1%, 5 ml de solucin jabonosa al 25%, 30 ml de alcohol etlico fro, tubo de ensayo con tapa, taza plstica, barra de madera para mezclar.

PROCEDIMIENTO PARTE I: Encontr ADN en mi Comida! 1. Has comido ADN alguna vez?

2. Has comido ADN genticamente modificado?

3. El ADN genticamente modificado puede provocar problemas de salud? (cncer, indigestin, alergia, reaccin imunitaria......)

4. Puede usted observar el ADN a simple vista, sin el uso de un microscopio? Describa cmo usted se imagina el ADN.

5. Dibuje detalladamente un cromosoma. Cmo los cientficos decidieron cul cromosoma sera el cromosoma 1, el cromosoma 2, 3, etctera?

5

PARTE II: Extraccin de ADN casera Prepare 80ml de agua destilada con NaCl al 5% en una probeta de 100ml. Luego agregue 10ml de detergente (jabn de fregar). Agregue 25 lentejas ms la solucin preparada en una licuadora durante 30 segundos. Asegrese de colocarle la tapa a la licuadora. Luego filtre con un colador la solucin en un beaker. Lo que nos interesa es el sobrenadante. Prepare 10ml de una solucin con ablandador de carne al 10% y mezclela con el sobrenadante. Ahora tome un tubo de ensayo y agregue 5ml de la solucin preparada y agrguele 5ml de etanol. 1. Describa lo que va sucediendo. _______________________________________________________________ _______________________________________________________________. 2. Qu funcin lleva a cabo el detergente en la extraccin? _______________________________________________________________. 3. Qu funcin cumple el ablandador de carne para la extraccin? _______________________________________________________________. 4. Qu papel juega el etanol en la extraccin de ADN? ______________________________________________. 5. Puede usted ver el ADN? ______________________________________________. 6. Cmo se ve? _____________________________________________.

6

PARTE III: Extraccin de ADN de las Clulas de la Mejilla Humana Esta extraccin funciona mejor si los estudiantes no han comido recientemente o masticado goma de mascar (chicle). 1. Agregue 5ml de jabn en un tubo de ensayo. 2. Violentamente tome o beba la solucin de agua salada al 5% (no se la trague) por 30 segundos, asegurndose de frotar la lengua a lo largo de sus mejillas. 3. Escupa cuidadosamente la mezcla del agua de su boca dentro del tubo de ensayo con la solucin jabonosa. Mezcle, invirtiendo 5 veces el tubo de ensayo. 4. Agregue bastante alcohol etlico hasta duplicar el volumen de la solucin que se tiene hasta el momento (aprox. 8 ml de alcohol etlico). Luego de esto no incline, ni sacuda, ni mezcle el tubo de ensayo, porque puede que no vea su ADN. 5. Si usted mira a la lnea de separacin entre la capa de agua y la capa de alcohol (el interfaz) usted comenzar a ver burbujas adheridas como pelos minsculos en forma de secuencias o tiritas blancas que se levantan a travs del alcohol. Estas secuencias o tiras son su ADN. Dibuje y tabule lo que observ en su tubo de ensayo con ADN.

7

PRCTICA NO. 2 Mitosis y Meiosis1. Introduccin Los organismos eucariticos unicelulares se multiplican por divisin celular, mientras que los organismos pluricelulares crecen por divisin celular. Las clulas eucariticas de carcter vegetativo tienen dos conjuntos homlogos de cromosomas 2n (diploides), debido a que cada progenitor aporta un conjunto de cromosomas, que representa el nmero mnimo de cromosomas n (haploide), de la especie correspondiente. La divisin celular involucra dos procesos: el primero es la divisin del ncleo o mitosis, durante la cual el material gentico del ncleo, que ha sido previamente duplicado durante la interfase, se divide dando origen a dos nuevos ncleos idnticos; el segundo es la divisin del citoplasma o citocinesis, durante la cual se forma una nueva pared celular que separa en entidades celulares independientes los dos ncleos recin formados, originndose de esta manera dos nuevas clulas. La mitosis es un proceso continuo en el cual se distinguen convencionalmente cuatro etapas: profase, metafase, anafase y telofase, que se reconocen por el arreglo de los cromosomas en el citoplasma. El lapso entre una divisin y otra se denomina interfase. El tejido ms comnmente utilizado para el estudio de la mitosis es el meristema de las races nuevas. Lo meristemos (tejido meristemtico) son regiones en donde se producen nuevas clulas, durante toda la vida de la planta, a travs de procesos de divisin celular. En esta prctica se utilizarn races de cebolla. Investigue y Estudie Advertencia! Estas preguntas pueden incluirse en un pruebn pre-laboratorio 1- Leerse y estudiar el Captulo 9: Cromosomas, mitosis y meiosis (Solomon et al., 2001: 200-219). 2- Describe brevemente las etapas de la mitosis y la meiosis. Utilizando la primera letra de cada etapa de la mitosis, invntese una frase para acordarse del orden de las etapas. Las palabras de la frase tienen que empezar con la primera letra de cada etapa.

8

3- Cules son las diferencias principales entre estos dos procesos (mitosis y meiosis)? 4- Si la clula no est en mitosis, en qu puede estar? y haciendo qu? 5- Define y describe brevemente cada una de las etapas del ciclo celular. 6- Cul es la importancia del conocimiento del ciclo celular en medicina? 7- Cuntas veces se divide una clula somtica? (para esto consultar el concepto del Lmite de Hayflick). Destacar la importancia de esto en la medicina. 8- Qu es la apoptosis? 9- Defina: cromtide, centrmero, huso acromtico, centrolo, citocinesis, citoplasma, haploide, diploide. 10- Qu es el tejido meristemtico? Objetivos Observar e identificar las diferentes fases de la mitosis y la meiosis. Actuar las diferentes fases de la divisin celular.

Materiales: Estudiante: bulbos de cebolla con races (ver PARTE II Preparacin de las races), cuerda larga. Laboratorio: orcena aceto-clorhdrica, cristal de reloj, pinzas, tijera, navaja, papel de filtro, laminillas, portaobjetos, cubreobjetos, microscopio, plaquitas de mitosis y meiosis.

PROCEDIMIENTO PARTE I: Actuando las fases de la Mitosis Para esta parte del laboratorio se necesitar un hilo para simular la membrana nuclear y tener a mano unas tijeras. Este debe ser lo bastante largo como para rodear al menos 6 personas. Ahora todos los integrantes del laboratorio, sin excepciones, van a actuar o simular el proceso de la mitosis en el aula de laboratorio. Tome en cuenta las siguientes recomendaciones: 1. Elija a una persona para ser el reportero. El trabajo de esta persona ser el de ir explicando lo que va ocurriendo. 2. Si pueden graben un video del proceso. 3. Elija al menos, 4 estudiantes para interpretar los cromosomas, 2 estudiantes para ser los centrolos y un estudiante para manipular la membrana nuclear. Los estudiantes que sobren sern la membrana celular. A medida que vallan actuando todas las fases de la mitosis, debern buscar la manera de representar cada fase de la clula y cada evento que ocurre durante la divisin celular.

9

PARTE II: Observando la mitosis en tejido meristemtico de cebolla Preparacin de las races: Para obtener las races se colocan cebollas en frascos de agua de manera que no queden sumergidas, pero que toquen la superficie del agua. Es conveniente que a las cebollas se les eliminen las escamas externas para conseguir un desarrollo ms rpido de las races, y que cambien el agua todos los das, de esta manera se pueden conseguir races en un perodo de 48 horas. Corte los extremos de las races de aproximadamente 1cm de largo, colquelos en un cristal de reloj con el colorante y caliente en una lmpara de alcohol hasta que se inicien vapores. Deje enfriar y de nuevo caliente repitiendo tres veces la operacin. Es importante no calentar mucho. Con la ayuda de una navaja corte el meristemo sobre una laminilla dejando solamente el extremo que contiene las clulas en divisin. Agregue una gota de orcena y un cubreobjeto y con la punta de un lpiz de golpecitos sobre el cubreobjeto para que las clulas se separen. Con un papel de filtro quite el exceso de colorante y con el dedo presiones bien fuerte para hacer el aplastado de la preparacin. Esto se hace poniendo papel absorbente sobre el cubreobjeto y haciendo presin uniforme sobre el mismo hasta que vea que el material se ha dispersado, es ms fcil hacer esto colocando la laminilla en el borde de la mesa. -- Qu fases puedes observar? -- En qu fase se distinguen mejor los cromosomas? -- Cul es la fase ms abundante en su preparacin? Realice las observaciones bajo el microscopio, comenzando por ubicar las agrupaciones de clulas meristemticas sobre el portaobjetos para luego cambiar a un aumento de observacin mayor e identificar las distintas fases que caracterizan la divisin celular (interfase y mitosis) y de la mitosis (profase, metafase, anafase y telofase). Calcule el ndice mittico (IM) utilizando los datos anteriores, de acuerdo a la siguiente frmula: IM = Nmero total de clulas en mitosis Nmero total de clulas x 100

10

El ndice mittico da una idea de la velocidad de divisin de un tejido.

PARTE III: Mitosis book Busque en los anexos un Mitosis Book y complete la actividad segn las instrucciones. La actividad consiste en dibujar paso a paso el proceso de divisin celular. Luego recortar los cuadros y unirlos para as ver el proceso de la divisin celular en movimiento.

11

PRCTICA NO. 3 Replicacin, Transcripcin y Traduccin1. Introduccin En esta semana usted aprender cmo un gen proporciona las instrucciones necesarias a la clula para hacer una protena. Las protenas son muy importantes en la determinacin de las caractersticas de nuestro cuerpo. La funcin primordial de las protenas es producir tejido corporal y sintetizar enzimas. Las instrucciones para hacer una protena son proporcionadas por los genes. Cada gen contiene una secuencia especfica de nucletidos. Esta secuencia de nucletidos especifica qu secuencia de aminocidos se deben de ensamblar para formar la protena. Los genes son aproximadamente 99% idnticos en todos los seres humanos, pero El 1% de variacin es muy importante! La variacin en la secuencia de los nucletidos produce alelos de un mismo gen y los alelos producen variacin a nivel protenico. Por esto no somos todos idnticos! Investigue y Estudie Advertencia! Estas preguntas pueden incluirse en un pruebn pre-laboratorio 1- Leerse y estudiar el Captulo 12: cido ribonucleico y sntesis de protenas: Expresin de la informacin gentica (Solomon et al., 2001: 268-282). 2- A su criterio, cmo piensa usted que se lleva a cabo la duplicacin del ADN, de manera conservativa, semiconservativa o dispersiva? Consulte y describa el experimento de Meselson y Stahl (Solomon et al., 2001: 257-259). 3- Explique el proceso de replicacin, incluyendo las enzimas involucradas en este. 4- Qu es un gen? Diga algunos ejemplos de genes. 5- Qu es una protena? Diga algunos ejemplos de protenas. 6- Explique el proceso de transcripcin, incluyendo las enzimas involucradas en este. 7- Qu es el TATA box? Dnde se encuentra? Para qu se usa? 8- Explique el proceso de traduccin, incluyendo las enzimas involucradas en este. 9- Qu es el ARNm, ARNr y ARNt? Cul es la funcin de cada uno? 12

10-Qu es el factor de transcripcin? 11- Cul es la funcin de los ribosomas? Cul es la diferencia entre la subunidad mayor y la subunidad menor de un ribosoma? Objetivo Modelar la transcripcin y traduccin de una cadena de ADN.

Materiales Laboratorio: tijera, tape transparente.

PROCEDIMIENTO PARTE I: Cmo se producen las protenas? A. Compare la replicacin del ADN, y las 2 fases en la sntesis de protenas: Proceso Forma de la molcula templete Tipo de molcula creada Lugar donde ocurre

B. Fase No. 1: ________________________. 1- Cul protena es la responsable principal de esta fase? ________________. 2- Qu semejanzas y diferencias tiene este proceso con la replicacin del ADN? 3- Qu es un codn? 4- De acuerdo a cmo se transcribe la cadena de ADN en la de ARNm. Aada los nucletidos correspondientes a la tabla 1.

Nucletido ADN A G C T

Nucletido ARN

Tabla 1: Transcripcin

13

C. Fase No. 2: ________________________. 1- Qu tipo de ARN se necesita para esta fase? (2 tipos). Dibjelos e identifique las partes importantes. 2- Qu es un anticodn? 3- Marque en el dibujo los siguientes nombres: aminocidos, ARNt, codn, anticodn, ribosoma (subunidad mayor y menor), ARNm:

4- Complete la tabla 2 para indicar el anti codn apropiado en el ARNt para cada uno de los aminocidos incluidos: 5- Para qu sirve la tabla 3? Cmo se utiliza? Aminocido Treonina (Thr) Histidina (His) Prolina (Pro) Leucina (Leu) cido Glutmico (Glu) Valina (Val) codon ARNm ACU CAU CCU CUG GAG GUG Tabla 2: Complete con el anti codn Anti-codon en la molcula de ARNt Que lleva este aminocido UGA

14

Tabla 3: Para qu sirve

PARTE II: Creando modelos de Transcripcin y Traduccin Usted modelar la secuencia de pasos utilizada por la clula para realizar la transcripcin y la traduccin. Usted podr probablemente pensar en una manera ms rpida de hacer el ARNm, pero debe seguir la secuencia de pasos descritos ms abajo para aprender cmo la clula hace realmente el ARNm. Para modelar el proceso de la transcripcin, usted necesitar: una secuencia de ADN de un gen, nucletidos de ARN, el factor de transcripcin, ARN polimerasa y un ribosoma (subunidad mayor y subunidad menor). Todo esto ser entregado en una hoja por separado 1. Recorte por separado ambas cadenas complementarias que representan la secuencia de ADN mostrada en la hoja. 2. Recorte cada uno de los nucletidos del ARN. As mismo, recorte el factor de transcripcin, el ARN polimerasa, ambas subunidades de los ribosomas y el ARN de transferencia. 3. Tome una hoja en blanco y dibuje un crculo en el centro, el cual representar el ncleo de la clula, dentro de este coloque de manera diagonal ambas cadenas recortadas unindose por un extremo y separadas por el otro. 4. 4. Coloque el factor de transcripcin en el inicio de la cadena de ADN al nivel de los nucletidos TATAAA de la secuencia, y sobre la secuencia del gen coloque el ARN polimerasa, el cual se encargar de ir colocando los nucletidos correspondientes a medida que la cadena se completa de acuerdo a la complementariedad de las bases. 5. Coloque la secuencia de bases lograda en una tira de tape transparente. 6. Afuera del ncleo coloque las dos subunidades del ribosoma una sobre la otra (la mayor sobre la menor) y coloque la tira de tape sobre la subunidad menor. 7. Tome al ARN de transferencia y colquelo sobre la subunidad mayor, para as ir completando los codones en la base y en el crculo de arriba ir colocando las abreviaciones del aminocido que se est formando (para esto auxiliarse de la tabla en la parte I). 8. Unir los aminocidos con tape transparente y ya tienes una protena.

15

PARTE III: Cmo el ADN determina los rasgos de un organismo? En esta simulacin, vamos a examinar el ADN de SNORKS, una especie descubierta en el planeta, ADE ENE. Los snorks tienen solamente un cromosoma, con 8 genes. Su misin es la de analizar los genes y determinar qu rasgos tiene el organismo y dibujar su identikit:

Para simplificar, las secuencias de los genes sern mucho ms cortas que la de los genes reales. Cada gen, tendr 2 alelos.Gen Gene 1 - pelo Gene 2 - cuerpo Gene 3 - piernas Gene 4 - cabeza Gene 5 snork Gene 6 - cejas Gene 7 - ojos Gene 8 - boca Gene 9 - orejas Secuencia de aminocidos val - ser - leu val - ser - lys tyr - pro - glu - glu - lys val - leu - thr - pro - lys leu - leu - leu - pro leu - leu - ser - ala ala - val - val val - ala - ala his - ile his - his ser - pro - val val - phe - tyr asp - ile - leu - leu - pro - thre asp - ile - pro - pro - pro - thre val - asn - asn - ala asn - asn - asn - ala phe - ser - his phe - phe - gly Descripcin liso crespo gordito delgado 3 piernas 2 piernas redonda cuadrada derecho curvo espesas delgadas almendra redonda grande chiquita con puntas redondas

16

Los genomas de snorks voluntarios han sido recolectados. Analiza y dibuja 2: Snicker Snork AUG | GUC AGC AAA | UAC CCC GAA GAG AAA | CUC UUA AGU GCG | GCU GUU GUG | CAU CAU | GUU UUU UAC | GAU AUC UUA CUG CCC ACC | AAU AAC AAU GCC | UUU UCU CAC | UAA Snuffle Snork AUG |GUA UCU AAA | GUU CUC ACU CCA AAG | CUU CUC CUC CCC | GUU GCG GCU | CAU CAC | GUA UUU UAU | GAC AUU CUU CUG CCC ACA | AAU AAU AAU GCA | UUC UCG CAC | UAA Snapple Snork AUG | GUC AGC AAA | UAC CCC GAA GAA AAA | CUC UUA AGU GCG | GUU GCG GCU | CAC AUU | UCU CCC GUA | GAU AUU CUC CUC CCC ACC | GUU AAU AAU GCA | UUC UUU GGU | UAA Snoopy Snork AUG | GUA UCC CUC | UAC CCC GAA GAG AAA | UUA UUG CUG CCC | GUG GCA GCU | CAU AUU | UCU CCC GUA | GAC AUU CUU CUG CCC ACA | AAU AAC AAU GCC | UUU UCU CAC | UAA Ejercicio No. 1: Llena esta seccin para uno de los 2 snorks: Secuencia gen Secuencia ARNm (codon) Secuencia ARNt (anticodon) Aminocido Rasgo Secuencia gen Secuencia ARNm (codon) Secuencia ARNt

17

(anticodon) Aminocido Rasgo

PRCTICA NO. 3.1: Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR) 2. Introduccin La reaccin en cadena de la polimerasa, conocida como PCR por sus siglas en ingls (Polymerase Chain Reaction), es una tcnica de biologa molecular descrita en 1986 por Kary Mullis, cuyo objetivo es obtener un gran nmero de copias de un fragmento de ADN particular, partiendo de un mnimo; en teora basta partir de una nica copia de ese fragmento original, o molde. Esta tcnica sirve para amplificar un fragmento de ADN; su utilidad es que, tras la amplificacin, resulta mucho ms fcil identificar con una muy alta probabilidad virus o bacterias causantes de una enfermedad, identificar personas (cadveres) o hacer investigacin cientfica sobre el ADN amplificado. Estos usos derivados de la amplificacin han hecho que se convierta en una tcnica muy extendida, con el consiguiente abaratamiento del equipo necesario para llevarla a cabo. La electroforesis es una tcnica para la separacin de molculas segn la movilidad de estas en un campo elctrico. La variante de uso ms comn para el anlisis de mezclas de protenas o de cidos nucleicos utiliza como soporte un gel, habitualmente de agarosa o de poliacrilamida. Los cidos nucleicos ya disponen de una carga elctrica negativa, que los dirigir al polo positivo, mientras que las protenas se cargan al unirse con sustancias como el SDS (detergente) que incorpora cargas negativas de una manera dependiente de la masa molecular de la protena. Al poner la mezcla de molculas y aplicar un campo elctrico, stas se movern y debern ir pasando por la malla del gel (una red tridimensional de fibras cruzadas), por lo que las pequeas se movern mejor, ms rpidamente. As, las ms pequeas avanzarn ms y las ms grandes quedarn cerca del lugar de partida. Investigue y Estudie 1234Cmo funciona el PCR? Describa cada uno de los pasos. Qu reactivos se necesitan para realizar la tcnica de PCR? Mencione 2 o 3 aplicaciones que tiene el PCR para la medicina. Para qu sirve la electroforesis?

Objetivos Familiarizarse con el uso del PCR. Observar el fragmento amplificado en un gel de agarosa.

Materiales 18

- Laboratorio: PCR, aparato de electroforesis, gel de agarosa (1.5%), tinte para cargar la muestra en el gel, ladder (escalera de tamaos en kilobases), ADN, tips, micropipetas, guantes, tubitos de PCR, tips con filtros, agua destilada, PCR buffer, oligomix (cebadores), dNTPs (deoxynuclesidos), Polimerasa Tag. PROCEDIMIENTO PARTE I: PCR Se preparara un producto PCR de 20l en cada tubito. En cada uno de los tubitos se echarn los reactivos en las siguientes proporciones y siguiendo el orden establecido: 12345611.9l de H2O destilada 2l de PCRbuffer 0.5l del oligomix 0.4l de dNTPs 0.2l de la AmpliTag DNA Polymerase 5l de ADN

Para facilitar este proceso se va a tener un tubo extra de 2ml y se va a tabular como PCR Mix en este se har una mezcla de los reactivos que habr que echar en todos los tubitos. Por ejemplo: si se van a realizar 4 reacciones de PCR (por lo que son 4 tubitos) se multiplica todos los reactivos por 4 y se echa esa cantidad en un mismo tubo (en el PCR Mix) excepto el ADN. El ADN se echa de ltimo, ya que cada tubo tendr ADN de un individuo diferente. Una vez colocado todos los reactivos en el tubito de PCR, el mismo se coloca en el equipo de PCR y se programa la corrida de la siguiente manera, se llevarn a cabo 30 ciclos (esto son 130 repeticiones de los pasos 2, 3 y 4 mencionados ms abajo): 1. 2. 3. 4. 5. Inicializacin: durante 5 minutos a 94C. Desnaturalizacin: durante 30 segundos a 94C. Alineamiento/Unin del cebador: durante 30 segundos a 52C. Extensin/Elongacin de la Cadena: durante 90 segundos a 72C. Elongacin Final: durante 5 minutos a 72C.

19

Fig. 3.1.1: Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR)

La corrida en el PCR durar aproximadamente 1-2 horas y despus tendr su producto PCR (ADN amplificado exponencialmente). PARTE II: Electroforesis

Fig. 3.1.2: Preparando el gel

Mientras el PCR se encuentre corriendo calentar el gel de agarosa en el microondas hasta que comience a hervir. Realice este paso 2 o 3 veces para asegurarse que el gel se encuentre bien lquido. Luego eche el mismo en la base preparada para este fin. Deje el gel enfrindose en la nevera hasta que su producto PCR termine. Una vez terminado el PCR siga los siguientes pasos para realizar la electroforesis: 1- En un cubreobjetos eche 1l del tinte para cargar el gel. 2- Luego con la micropipeta tome 10l de su producto de PCR y pipetee o mezcle su producto PCR con el tinte para cargar. 3- Con su producto PCR en la micropipeta valla al gel de agarosa y eche cuidadosamente su producto en uno de los pozos marcados. Asegrese de ver bien en qu pozo ech su producto. 4- Correr el gel a 60-80 voltios y a 200 amperes de corriente.

20

Una vez el ADN entr lo suficiente al gel este se baa en una solucin que contiene Bromuro de Etidio (EtBr) por unos 5-10 minutos. OJO Esta solucin es sumamente txica en caso de hacer contacto con los ojos o con la piel. Para la manipulacin de esta solucin se deben utilizar guantes especiales. Esta parte de la prctica ser llevada a cabo por la profesora o la monitora que se encuentre en el saln Por ltimo, se coloca el gel de agarosa en la cmara de rayos ultravioletas para poder visualizar la banda de ADN amplificada. Debido a que el fragmento que vamos a amplificar es de unas 740pb, vamos a ver la banda bien abajo en el gel, ya que este ADN es bastante pequeo.

PRCTICA NO. 4 Gentica Mendeliana1. Introduccin La ciencia de la gentica naci en 1900, cuando varios investigadores de la reproduccin de las plantas descubrieron el trabajo del monje austriaco Gregor Mendel, que aunque fue publicado en 1866 haba sido ignorado en la prctica. Mendel, que trabaj con la planta del guisante, describi los patrones de la herencia en funcin de siete pares de rasgos contrastantes que aparecan en siete variedades diferentes de esta planta. Observ que los caracteres se heredaban como unidades separadas, y cada una de ellas lo haca de forma independiente con respecto a las otras. Seal que cada progenitor tiene pares de unidades, pero que slo aporta una unidad de cada pareja a su descendiente. Ms tarde, las unidades descritas por Mendel como Factor Hereditario recibieron el nombre de genes. Durante los primeros decenios posteriores al redescubrimiento del trabajo de Mendel, los genetistas empezaron por ampliar los principios de Mendel al correlacionar la transmisin de informacin gentica de generacin en generacin con el comportamiento de los cromosomas durante la meiosis (Solomon et al., 2001). Los genetistas estudian no slo la transmisin de genes, sino tambin la expresin de la informacin gentica. Investigue y Estudie 21

Advertencia! Estas preguntas pueden incluirse en un pruebn pre-laboratorio 1- Leerse y estudiar el Captulo 10: Fundamentos de la herencia (Solomon et al., 2001: 220-243). 2- Definir los siguientes trminos: gametos, gen, alelo, alelos mltiples, alelos dominantes, alelos recesivos, dominancia incompleta, codominancia, fenotipo, genotipo, homocigote, heterocigote. 3- Formule las leyes de Mendel. 4- Qu son los genes mitocondriales? Cul es la utilidad de stos? 5- Realizar los ejercicios de la PARTE I y II antes de venir a clase.

Objetivo Aprender a realizar ejercicios de gentica mendeliana, cruces dihbridos, ejercicios de herencia ligada al sexo, de eptasis, de crossing over y mapeo de los genes y de pedigr.

Materiales Estudiante: lpiz, goma, sacapunta.

PROCEDIMIENTO PARTE I: EJERCICIOS DE GENTICA MENDELIANA 1. En plantas de guisantes el genotipo para semillas lisas es (S), el cual es dominante sobre semillas rugosas (s). En un cruce gentico de dos plantas que son heterocigotas para el carcter "forma de la semilla", qu fraccin de los descendientes deberan tener semillas lisas?

2. En la primera ley de Mendel, plantas de guisante con semillas homocigotas lisas se cruzaron con plantas heterocigotas con semillas rugosas (siendo las semillas lisas dominante). Qu resultados obtuvo en la generacin F2?

22

3. En el hombre el color pardo de los ojos es dominante "A" sobre el color azul, el cual es recesivo "a". Una pareja en la que el hombre tiene los ojos pardos y la mujer ojos azules tienen dos hijos, uno de ellos de ojos pardos y otro de ojos azules. De acuerdo a esto averiguar: 3.1- El genotipo del padre 3.2- La probabilidad de que el tercer hijo sea de ojos azules.

4. La acondroplasia es una anomala determinada por un gen autosmico que da lugar a un tipo de enanismo en la especie humana. Dos enanos acondroplsicos tienen dos hijos, uno acondroplsico y otro normal. 4.1- La acondroplasia, es un carcter dominante o recesivo? Por qu? 4.2- Cul es el genotipo de cada uno de los progenitores? Por qu? 4.3- Cul es la probabilidad de que el prximo descendiente de la pareja sea normal y de qu sea acondroplsico? Hacer un esquema del cruce.

5. La fenilcetonuria (FCU) es un desorden metablico que se hereda con carcter autosmico recesivo. Dos progenitores sanos tienen un hijo con FCU. 5.1- Indica los fenotipos y genotipos de todos los apareamientos que tericamente pueden dar un descendiente afectado de FCU. 5.2- A cul de estos tipos de apareamiento pertenece el caso descrito? 5.3- Cul es la probabilidad de que el siguiente hijo padezca tambin la enfermedad? 5.4- Cul ser la probabilidad de qu un hijo normal (sano) de estos padres sea portador heterocigtico para FCU?

23

6. El albinismo es un carcter recesivo con respecto a la pigmentacin normal. Cul sera la descendencia de un hombre albino en los siguientes casos?: 6.1- Si se casa con una mujer sin antecedentes familiares de albinismo. 6.2- Si se casa con una mujer normal cuya madre era albina. 6.3- Si se casa con una prima hermana de pigmentacin normal pero cuyos abuelos comunes eran albinos.

PARTE II: CRUCES DIHBRIDOS 1. En los conejillos de india, el pelo ruvido R_ (malo) es dominante sobre el pelo liso (bueno) rr y el pelo negro N_ es dominante sobre el pelo blanco nn. Qu fenotipo tiene a) un macho Rrnn; b) una hembra rrNn; c) la generacin F1?

2. En los caballos, el negro se debe a un alelo dominante (B) el marrn a un alelo recesivo (b). El trotar se debe a un gen dominante (T) y el paso a un alelo recesivo (t). Un heterocigoto negro trotador se cruza con un homocigoto marrn de paso. Qu tipo de descendientes produciran?

3. Ahora inventa un cruce dihbrido original para tu compaero:

PARTE III: HERENCIA LIGADA AL SEXO 1. Qu patrn de herencia llevara a un genetista sospechar que un trastorno hereditario del metabolismo celular se debe a un gen mitocondrial defectuoso?

24

2. El daltonismo rojo-verde es ligado al cromosoma X. Si una mujer daltnica tiene hijos con un hombre normal, qu probabilidad tienen sus hijos y hijas de ser daltnicos?

3. Y qu ocurre si la mujer es portadora?

PARTE IV: EPTASIS 1. El color de pelo de los ratones es determinado por 2 genes que muestran eptasis. El pigmento es producido solamente cuando el alelo N es presente. organismos nn no tiene color. Si el color est presente, un segundo locus determina el color del pelo A_ por pelo agut, a por pelo negro. Qu fenotipos y genotipos esperan en la generacin F1 y F2 en un cruce entre un ratn AANN y aann?

2. Crea uno t:

PARTE V: PEDIGR 1. Estos rasgos son dominantes o recesivos? Por qu?

______________________ 25

______________________

2. Albinismo:

El albinismo es causado por un alelo recesivo en un autosoma. Responde las siguientes preguntas: 2.1- De qu genotipos son IV 1,3,4 y 11 y III 2,3,7,8? 2.2- Qu probabilidad tiene IV6 de ser heterocigoto?

PARTE VI: PROBLEMAS GENTICOS 1. Codomonancia y alelos mltiples: Los grupos sanguneos en los seres humanos (A, B, AB, O) son los resultados de 3 alelos para un gen en la poblacin humana (IA, IB, i). Cada persona puede tener solamente ___ alelos. Del siguiente cruzamiento, qu genotipos saldrn y en qu frecuencia? 1 - IA,i x IB ,I 2 - IA,IB x IA,i

1.1- Investigue en la clase, cuntas personas tienen cada tipo de genotipo? Cuntos son comunes de los 3 alelos?

1.2- Qu pasa si una persona con un grupo sanguneo A recibe sangre tipo B?

26

1.3- Cul grupo sanguneo es llamado Donador Universal y porqu?

1.4- Qu significa ser A + o -?

1.5- En un caso de paternidad ambiguo, Madame Jolie tiene sangre tipo A, y su hijo sangre O. Madame Jolie tena 2 amantes en el momento de concepcin, Seor Pitt, de sangre tipo A y Seor Thornton, de sangre tipo AB. Quin es el padre y porqu?

27

PRCTICA NO. 5 Reproduccin Sexual

Trabajo para entregar el laboratorio prximo:

1. Cul es la diferencia entre reproduccin sexual y asexual? 2. Qu ventajas y desventajas tiene la reproduccin sexual? 3. Cul consideras que es la diferencia ms grande entre la produccin de gametos en los hombres y las mujeres? 4. Cuntos espermatozoides produce un hombre? 5. Dibuja el aparato reproductor masculino, sealando las siguientes partes y SUS FUNCIONES!: pene, glande, escroto, testculo, uretra, cuerpo cavernoso, vescula seminal, conducto eyaculador, prstata, glndula prosttica y bulbo uretral, epiddimo. 6. Dibuja un espermatozoide, sealando las siguientes partes y SUS FUNCIONES!: acrosoma, mitocondria, ncleo, flagelo. 7. Cundo y cmo ocurre la meiosis en los vulos? 8. Explica la relacin entre el ciclo menstrual y las hormonas. Qu funcin tiene cada hormona, en qu momento actan y de dnde son producidas? 9. Una pareja quiere tener hijos, y quiere saber en qu momento del ciclo menstrual sera mejor tener relaciones sexuales. Qu les aconsejaras? 10. Un hombre tiene problemas de infertilidad (produce muy pocos espermatozoides) y quiere saber a) la causa, b) si hay alguna solucin. Qu explicaciones le daras y qu soluciones?

28

PRCTICA NO. 6 Microbiologa1. Introduccin La microbiologa es la ciencia encargada del estudio de los microorganismos. Es la rama de la biologa dedicada a estudiar los organismos que son solo visibles a travs del microscopio como los virus, procariontes y eucariontes simples. Son considerados microbios todos los seres vivos microscpicos, estos pueden estar constituidos por una sola clula (unicelulares), as como pequeos agregados celulares formados por clulas equivalentes (sin diferenciacin celular); estos pueden ser eucariotas (clulas con ncleo) tales como hongos y protistas, procariotas (clulas carentes de ncleo) como las bacterias, y archaebacterias. Actualmente, el conocimiento microbiolgico se ha especializado tanto que lo encontramos dividido: en la microbiologa mdica que estudia los microorganismos patgenos y la posible cura para las enfermedades que lo producen; la inmunologa que averigua las causas de la aparicin de las enfermedades desde una perspectiva inmunolgica; la microbiologa ecolgica que estudia el nicho que le corresponde a los microorganismos en el medio; la microbiologa agricultural que estudia las relaciones existentes entre plantas y microorganismos; y la biotecnologa que estudia los posibles beneficios que puede llevar para el hombre la explotacin de microbios. Se denomina levadura a cualquiera de los diversos hongos microscpicos unicelulares que son importantes por su capacidad para realizar la fermentacin de hidratos de carbono, produciendo distintas sustancias. Investigue y Estudie Advertencia! Estas preguntas pueden incluirse en un pruebn prelaboratorio 1- Qu es un microorganismo? 2- En cules reinos se encuentran los microorganismos? 3- Mencione 2 o 3 caractersticas de los siguientes reinos: protistas, hongos, bacterias, archaebacterias, animal, plantas. 4- Qu importancias tiene cada uno de stos grupos para nosotros? (de un ejemplo especfico por cada grupo): Bacteria: nombre especie:_____________ funcin:_____________ Archaebacteria: nombre especie:________ funcin:_____________ Hongos: nombre especie:_____________ funcin:_____________ Plantas: nombre especie:______________ funcin:_____________ Animales: nombre especie:____________ funcin:_____________ Protistas: nombre especie:_____________ funcin:_____________

29

5- Cul es la diferencia entre bacteria y archaebacteria? 6- Cmo se produce el vino? Explique el proceso de forma sencilla. 7- Cmo se produce el yoghurt? Objetivos Observar en preparaciones fijas microrganismos representativos de diferentes fillum. Aprender sobre la utilizacin de microorganismos en la industria agroalimentaria.

Materiales Estudiante: 1 litro de leche por mesa de trabajo, 1 botella de jugo de uva u otra fruta de su preferencia. Laboratorio: beakers, levadura, azcar, plaquitas preparadas de microorganismos.

PROCEDIMIENTO PARTE I: Levadura y Fermentacin a) Llene un beaker con 200 ml de agua, y calintela hasta 35 grados Celsius. b) chele 1 cuchara de levadura. c) Divida la solucin en 2 beakers (100 ml cada uno). d) Aada 1 cucharada de azcar a uno de los beakers. Observe qu ocurre despus de 30 minutos: 1. Cul beaker tena ms espuma, y por qu?

2. El azcar es necesaria para que se multiplique la levadura?

3. Para qu productos es importante que la levadura tenga azcar?

PARTE II: Cmo hacer Yogurt? Las instrucciones se darn durante la clase. Explique:

30

PARTE III: Observacin de plaquitas Observa los microorganismos en las plaquitas, y dibuje lo que observa: Plaquita 1: Especie: _______________ Reino:_________________

Plaquita 2: Especie: _______________ Reino:_________________

Plaquita 3: Especie: _______________ Reino:_________________

PARTE IV: Cmo hacer vino? Hacer vino, o alcohol en general, es sencillo por el simple hecho de que la levadura convierte el azcar en etanol (alcohol). Paso 1: Compre jugo de uva u otra fruta de su preferencia. Preferiblemente compre un jugo natural que no posea preservativos. Si tiene vitamina C no hay problema, esta no es un preservativo. La levadura no har su trabajo con presencia de preservativos. El jugo debe encontrarse a temperatura ambiente. Si usted trae al laboratorio un jugo refrigerado, debe dejarlo reposar hasta que alcance la temperatura ambiente. Lleve el jugo en una botella con tapa que se enrosque.

31

Paso 2: Agregue un paquete de levadura activa de panadera. No mezcle. Y no agregue ms levadura despus, se le agrega una sola vez. Paso 3: Cierre y apriete la tapa de la botella y luego afljela un poco, alrededor de una vuelta. La fermentacin produce dixido de carbono, por lo que este debe tener una forma de salida de la botella. Una vez su jugo deje de burbujear, se puede probar el vino. Paso 4: Deje el vino en el laboratorio fermentndose y vuelva la semana que viene para probarlo. Transfiera el vino de su botella de fermentacin a un contenedor limpio de plstico o vidrio. Botellas de vino estriles sera lo mejor. Nota: cuando transfiera su vino, use un embudo de plstico y una vez empieza a echar su vino a una botella limpia no pare hasta que haya echado todo el vino. Debido a que hay sedimentos en el fondo de la botella original que contienen cidos e impurezas. Si mueve mucho la botella, mezclaras el sedimento y arruinars tu vino.

32