Ventajas de las columnas Agilent AdvanceBio SEC para análisis biofarmacéuticosComparación de columnas de diferentes fabricantes para mejorar la calidad de los datos

Resumen técnico

IntroducciónLa cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) es una técnica estándar para la determinación de los promedios de masa molar que suele emplearse para describir la separación de biomoléculas en función de su tamaño. En la técnica SEC, la eficiencia de la separación solo se ve afectada por la fase estacionaria; la fase móvil no ejerce ningún efecto. En consecuencia, la selección de columna para una biomolécula dada resulta esencial para la exitosa aplicación de la SEC. Existen diferentes tipos de columnas SEC disponibles comercialmente, con diferentes dimensiones, porosidades y tamaños de partículas. Las columnas AdvanceBio SEC incorporan una tecnología revolucionaria para el análisis SEC. Agilent ha diseñado y fabricado las columnas para que proporcionen la máxima eficiencia sin riesgo de degradación de las muestras por corte ni de obstrucción entre las partículas. El exclusivo método de fabricación, que controla el tamaño, la estructura y el volumen del poro y, a continuación, aplica un revestimiento polimérico hidrofílico, garantiza que los picos de las proteínas sean estrechos y estén bien resueltos.

La presente nota técnica compara columnas SEC de diferentes fabricantes utilizando una fase móvil frecuentemente usada para una separación con patrones de proteínas, anticuerpos monoclonales y un conjugado anticuerpo-fármaco (ADC) El objetivo es identificar diferencias en la prestación de la columna que puedan afectar a la calidad de los datos que se generan. Mostramos la exclusiva ventaja de las columnas AdvanceBio SEC para la separación de alta resolución de biomoléculas para aplicaciones biofarmacéuticas.

2

Materiales y métodosColumnas7,8 × 300 mm

• Agilent AdvanceBio SEC 300 Å, 2,7 µm

• Otro fabricante A 200 Å, 3,5 µm • Otro fabricante B 450 Å, 3,5 µm • Otro fabricante C 250 Å, 5 µm• Otro fabricante D 250 Å, 4 µm• Otro fabricante E 300 Å, 3 µm

4,6 × 300 mm

• Agilent AdvanceBio SEC 300 Å, 2,7 µm

• Otro fabricante F 450 Å, 2,5 µm • Otro fabricante G 200 Å, 1,7 µm

Resultados y comentariosComparación de columnas SEC de 7,8 × 300 mm para métodos SEC-DAD robustosSeparación de patrones de proteínasEn la Figura 1 se compara la resolución de un estándar de referencia con mezcla de seis proteínas en columnas con distinto tamaño de poro; se aprecia con claridad el efecto que tiene el tamaño del poro sobre la resolución. Las proteínas más grandes (tiroglobulina y su monómero) presentan una buena resolución con poros de 450 Å y 300 Å. No obstante, cuando se reduce el tamaño del poro, las proteínas más grandes quedan excluidas y la resolución es mala. Mientras que las proteínas más grandes se resuelven mejor en la columna de 450 Å (B) y de 300 Å (E), ambas columnas proporcionaron mayores anchuras de pico, lo que dificulta la cuantificación de bajos niveles de agregación y disminuye su precisión. La columna AdvanceBio SEC mejoró la resolución de biomoléculas de peso molecular alto, medio y bajo, lo que resulta crítico para la separación de muchas de ellas (Figura 1). AdvanceBio SEC también proporcionó mejor sensibilidad, menor anchura de pico y menor volumen de elución.

Tabla 1. Condiciones cromatográficas.

Parámetro Columnas SEC de 7,8 × 300 mm Columnas SEC de 4,6 × 300 mmFlujo 0,8 ml/min 0,4 ml/minFase móvil Tampón fosfato 150 mM, pH 7,0 Tampón fosfato 150 mM, pH 7,0Instrumento Sistema LC cuaternario bio-inerte

Agilent 1260 InfinitySistema LC binario Agilent 1290 Infinity con detector de diodo array (DAD) G1315D y celda de flujo bio-inerte (1200 bar)

Volumen de inyección

5 µl 5 µl

TCC Ambiente AmbienteDetección UV, 220 nm UV, 220 nmMuestras • Marcadores de peso molecular de proteínas (agregado de tiroglobulina,

tiroglobulina, IgG, albúmina de suero bovino, mioglobina) y marcador de penetración total de uracilo

• Anticuerpos monoclonales terapéuticos (rituximab y trastuzumab)• Conjugado anticuerpo terapéutico-fármaco

Figura 1. Comparación de los perfiles SEC de los patrones de proteínas en columnas SEC de 7,8 × 300 mm. Se calculó la resolución entre los picos 1 y 2, 3 y 4, y 5 y 6.

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23

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61

Agilent AdvanceBio SEC, 2,7 µm, 300 Å, 7,8 × 300 mm

Otro fabricante A, 3,5 µm, 200 Å, 7,8 × 300 mm

Otro fabricante B, 3,5 µm, 450 Å, 7,8 × 300 mm

Otro fabricante C, 5 µm, 250 Å, 7,8 × 300 mm

Otro fabricante D, 4 µm, 250 Å, 7,8 × 300 mm

Otro fabricante E, 3 µm, 300 Å, 7,8 × 300 mm

Rs = 1,44

Rs = 0,52

Rs = 2,0

Rs = 0,81

Rs = 0,97

Rs = 1,7Rs = 2,27

Rs = 4,90

Rs = 2,81

Rs = 1,77

Rs = 2,12

Rs = 1,86

Rs = 1,88

Rs = 3,70

Rs = 2,86

Rs = 3,49

Rs = 3,4

Rs = 5,59

N.º de pico1. Agregados de tiroglobulina2. Tiroglobulina (662 kDa)3. IgG (150 kDa)4. BSA (66 kDa)5. Mioglobina (17 kDa)6. Uracilo (112 Da)

3

Para evaluar el efecto del tamaño del poro sobre la separación de distintos patrones de proteínas, también se representaron las curvas de calibración de cada columna (Figura 2). Las moléculas de tamaño mayor que el del poro quedan excluidas, y las moléculas más pequeñas penetran en los poros para definir el límite de exclusión y el rango de permeabilidad de las columnas. La columna SEC ideal es aquella que separa las biomoléculas en la parte más lineal de la curva de calibración. Cuando evaluamos columnas para estudiar la separación del mismo rango de proteínas, AdvanceBio SEC proporcionó una pendiente lineal y más uniforme en la mayor parte de la curva de calibración. Este rendimiento produjo una mejor separación de los patrones de proteínas dentro del rango de pesos moleculares de 662 kDa a 112 Da (el rango de la mayor parte de los productos bioterapéuticos basados en proteínas).

Comparación de los volúmenes de los porosLa capacidad de picos y la resolución en SEC vienen determinadas principalmente por el volumen del poro. Un volumen del poro mayor proporciona una mejor resolución en un rango de pesos moleculares más amplio. En la tabla 2 se muestran los volúmenes de los poros, calculados a partir del punto de penetración total (uracilo) y el límite de exclusión (agregado de tiroglobulina) para las columnas. AdvanceBio SEC proporcionó un volumen de poro superior (7,11 ml) que las demás columnas y, en consecuencia, proporcionó una mejor resolución y una capacidad de picos mayor.

1,5

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Volumen de elución (ml)

Volumen de elución (ml)

Comparación entre las curvas de calibración de Agilent AdvanceBio SEC y de las columnas A y B

Columna Agilent AdvanceBio SEC, 300 ÅOtro fabricante A, 200 ÅOtro fabricante B, 450 Å

R2 = 0,9868R2 = 0,9538R2 = 0,8175

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

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4,5

5,0

5,5

6,0

6,5

4 6 8 10 12 14

Log

PM

Comparación entre las curvas de calibración de Agilent AdvanceBio SEC y de las columnas C, D y E

Columna Agilent AdvanceBio SEC, 300 Å

Otro fabricante C, 250 ÅOtro fabricante D, 250 Å

Otro fabricante E, 300 Å

R2 = 0,9868

R2 = 0,9201R2 = 0,8862

R2 = 0,9123

Figura 2. Curvas de calibración para patrones de proteínas en diversas columnas SEC de 7,8 × 300 mm

Tabla 2. Comparación de los volúmenes totales de los poros en las columnas.

Columna Volumen del poro (ml)7,8 × 300 mmAgilent AdvanceBio SEC 300 Å, 2,7 µm 7,11Otro fabricante A 200 Å, 3,5 µm 6,25Otro fabricante B 450 Å, 3,5 µm 4,57Otro fabricante C 250 Å, 5 µm 6,51Otro fabricante D 250 Å, 4 µm 6,70Otro fabricante E 300 Å, 3 µm 5,624,6 × 300 mmAgilent AdvanceBio SEC 300 Å, 2,7 µm 2,36Otro fabricante F 450 Å, 2,5 µm 2,06Otro fabricante G 200 Å, 1,7 µm 2,20

4

D fueron las que mostraron los factores de resolución más elevados (2,37 y 2,41, respectivamente) para el monómero de trastuzumab y su agregado. La columna E, que asegura separar las proteínas más grandes o los dímeros de anticuerpos y los agregados más grandes, no pudo resolver el agregado; tampoco se pudo integrar el monómero y el agregado para determinar su resolución.

Separación de anticuerpos monoclonales terapéuticosEn la figura 3 se muestra la mejora en cuanto a calidad de los datos para la separación de trastuzumab terapéutico en la columna AdvanceBio SEC de 2,7 µm. El cromatograma muestra los valores de resolución de diversas columnas para la separación de monómeros y agregados. AdvanceBio SEC y la columna

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Agilent AdvanceBio SEC, 2,7 µm, 300 Å, 7,8 × 300 mm

Rs = 2,37

Rs = 1,89

Rs = 1,70

Rs = 2,1

Rs = 2,41

Otro fabricante A, 3,5 µm, 200 Å, 7,8 × 300 mm

Otro fabricante B, 3,5 µm, 450 Å, 7,8 × 300 mm

Otro fabricante C, 5 µm, 250 Å, 7,8 × 300 mm

Otro fabricante D, 4 µm, 250 Å, 7,8 × 300 mm

Otro fabricante E, 3 µm, 300 Å, 7,8 × 300 mm

Figura 3. Análisis del monómero y el agregado de trastuzumab utilizando columnas SEC de 7,8 × 300 mm.

5

También se realizaron comparaciones entre las columnas para la separación del anticuerpo monoclonal terapéutico comercial rituximab, para mostrar el rendimiento de las columnas en situaciones reales. El área resaltada en la Figura 4 revela la capacidad de AdvanceBio SEC para resolver agregados

Figura 4. Comparación de los perfiles de rituximab en diversas columnas SEC de 7,8 × 300 mm.

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min5 10 15

Agilent AdvanceBio SEC, 2,7 µm, 300 Å, 7,8 × 300 mm

Otro fabricante A, 3,5 µm, 200 Å, 7,8 × 300 mm

Otro fabricante B, 3,5 µm, 450 Å, 7,8 × 300 mm

Otro fabricante C, 5 µm, 250 Å, 7,8 × 300 mm

Otro fabricante D, 4 µm, 250 Å, 7,8 × 300 mm

Otro fabricante E, 3 µm, 300 Å, 7,8 × 300 mm

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Ampliación

y fragmentos en comparación con las columnas A a E. El óptimo tamaño del poro y volumen del poro de AdvanceBio SEC ofrece la mayor resolución necesaria para la separación de anticuerpos monoclonales terapéuticos, sus agregados y sus productos de degradación.

6

Este método también proporcionó la mayor resolución del monómero y del agregado (Rs = 1,75), lo que indica que no existen interacciones no específicas entre el fármaco hidrofóbico y la fase estacionaria (figura 5). Además, la columna AdvanceBio SEC consiguió separar y resolver los agregados del conjugado anticuerpo-fármaco mejor que las demás columnas, lo que indica su idoneidad para el análisis de conjugados anticuerpo-fármaco y agregados. Los picos más anchos producidos por las columnas de otros fabricantes no solo afectaron a la sensibilidad y limitaron la detección de niveles bajos de agregados, sino que también dificultaron la integración de picos.

aumento de la viscosidad de la fase móvil, y por tanto de la presión, puede poner en riesgo la velocidad de flujo o la vida útil de la columna. La integridad de la muestra también puede ponerse en peligro dado que los compuestos orgánicos pueden afectar a la agregación de la muestra.

El análisis de conjugados anticuerpo-fármaco mediante las columnas A a E con una fase móvil acuosa produjo una forma de pico deficiente debido a la interacción no específica de la carga hidrofóbica con la fase estacionaria, como se muestra en la Figura 5. No obstante, cuando se analizó el conjugado anticuerpo-fármaco con una columna AdvanceBio SEC y una fase móvil acuosa (tampón fosfato 150 mM), los picos fueron simétricos.

Separación de conjugados anticuerpo-fármacoEl análisis SEC de conjugados anticuerpo-fármaco (ADC) requiere columnas con una interacción secundaria reducida de cargas hidrofóbicas con la fase estacionaria de la columna. La mayoría de los métodos publicados de análisis SEC de conjugados anticuerpo-fármaco realizados con fases acuosas dieron lugar a una forma de pico deficiente y a una resolución incompleta del agregado respecto al conjugado monomérico. Este efecto se debió a una interacción no específica entre la carga hidrofóbica y la fase estacionaria. Se ha demostrado que la adición de modificadores orgánicos permite superar este efecto, pero el

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Rs = 1,75

Rs = 1,11

Rs = 1,40

Rs = 1,28

Ampliación

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0200400600 Agilent AdvanceBio

SEC, 2,7 µm, 300 Å, 7,8 × 300 mm

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0200400600 Otro fabricante A,

3,5 µm, 200 Å, 7,8 × 300 mm

min5 10 15

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0200400600 Otro fabricante B,

3,5 µm, 450 Å, 7,8 × 300 mm

min5 10 15

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0200400600 Otro fabricante C,

5 µm, 250 Å, 7,8 × 300 mm

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0200400600 Otro fabricante D,

4 µm, 250 Å, 7,8 × 300 mm

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0200400600 Otro fabricante E,

3 µm, 300 Å, 7,8 × 300 mm

Figura 5. Comparación de los perfiles de conjugado anticuerpo terapéutico-fármaco en diversas columnas SEC de 7,8 × 300 mm.

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Comparación de columnas SEC de 4,6 × 300 mm para métodos sensibles Separación de patrones de proteínasEn la figura 6 se compara la resolución de un estándar de referencia de cinco proteínas en AdvanceBio SEC 300 Å, 4,6 × 300 mm, 2,7 µm y en las columnas F y G. La proteína más grande, el agregado de tiroglobulina (pico 1), se resolvió bien, con mayor sensibilidad y picos estrechos en comparación con las otras columnas. En general, AdvanceBio SEC ofrece una mejor resolución para marcadores de peso molecular alto, medio y bajo que la columna F, y es comparable con la columna G de 1,7 µm.

La curva de calibración AdvanceBio SEC presenta menor pendiente y la curva muestra un excelente valor del coeficiente para un peso molecular más preciso (figura 7). AdvanceBio SEC también proporciona un volumen de poro superior (2,36 ml) que la columna F (2,06 ml) y que la columna G (2,20 ml) y, en consecuencia, proporciona una mejor resolución y una capacidad de picos mayor. Además, la columna F requiere un tiempo de análisis mayor para resolver el mismo rango de marcadores. El rango de permeabilidad de la columna (5,48 ml) también supera el volumen de la columna (4,9 ml), lo que sugiere cierta interacción no específica durante la elución.

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380 bar

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Agilent AdvanceBio SEC, 2,7 µm, 300 Å, 4,6 × 300 mm

Otro fabricante F, 2,5 µm, 450 Å, 4,6 × 300 mm

Otro fabricante G, 1,7 µm, 200 Å, 4,6 × 300 mm

Rs = 2,11

Rs = 2,52

Rs = 3,61

Rs = 2,20

Rs = 1,89

Rs = 1,44

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N.º de pico1. Agregados de tiroglobulina2. Tiroglobulina (662 kDa)3. IgG (150 kDa)4. BSA (66 kDa)5. Mioglobina (17 kDa)6. Uracilo (112 Da)

Figura 6. Comparación de los perfiles de los patrones de proteínas en diversas columnas SEC de 4,6 × 300 mm. Se calculó la resolución entre los picos 1 y 2, 3 y 4, y 5 y 6.

Figura 7. Curvas de calibración para patrones de proteínas en diversas columnas SEC de 4,6 × 300 mm

1,52,02,53,03,54,04,55,05,56,06,5

1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 5,5 6,0

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Volumen de elución (ml)

Comparación entre las curvas de calibración de Agilent AdvanceBio SEC y de las columnas F y G

R2 = 0,9868R2 = 0,816R2 = 0,9716

Agilent AdvanceBio SECOtro fabricante F, 450 ÅOtro fabricante G, 200 Å

8

Separación de un anticuerpo monoclonal terapéutico En la figura 8 se muestra la separación del anticuerpo monoclonal trastuzumab en las columnas de 4,6 × 300 mm. El cromatograma muestra los valores de resolución en la separación de monómeros y agregados. La resolución del pico del monómero es comparable entre AdvanceBio SEC, la columna F, de 2,5 µm, y 450 Å y la columna G, de 1,7 µm y 200 Å. Además, AdvanceBio SEC y la columna F pudieron identificar la degradación del trastuzumab, resaltada en azul, que la columna G no pudo separar.

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02468380 bar

176 bar

174 bar

Agilent AdvanceBio SEC, 2,7 µm, 300 Å, 4,6 × 300 mm

Otro fabricante F, 2,5 µm, 450 Å, 4,6 × 300 mm

Otro fabricante G, 1,7 µm, 200 Å, 4,6 × 300 mm

Rs = 1,70

Rs = 1,71

Rs = 1,91

Figura 8. Análisis del monómero y el agregado de trastuzumab utilizando columnas SEC de 4,6 × 300 mm de distintos fabricantes.

9

una excelente separación y capacidad de picos para monómeros, agregados y fragmentos para separaciones fiables y robustas. Para conseguir una mejor sensibilidad, se transfirió el método a una columna de 4,6 × 300 mm y se comparó con columnas de 2,5 µm, 450 Å y 1,7 µm, 200 Å, lo que también mostró una resolución superior. Además, la resolución y las capacidades de picos pueden mejorarse significativamente mediante el acoplamiento de dos columnas en serie. Esto solo es posible con las columnas AdvanceBio SEC, que pueden funcionar a presiones menores. Finalmente, las columnas AdvanceBio SEC proporcionan mejores formas de pico y seguridad en la resolución de monómeros de conjugados anticuerpo-fármaco y de sus agregados en fase móvil acuosa, sin poner en riesgo la vida útil de la columna ni la integridad de la muestra.

fármaco y sus agregados, AdvanceBio SEC opera aproximadamente a 176 bar, en comparación con los 380 bar de la columna G de menos de 2 µm. Esta última precisa sistemas LC capaces de tolerar elevadas retropresiones.

ConclusionesEl potencial de la cromatografía de exclusión por tamaño para la caracterización de biomoléculas es muy alto. Este resumen técnico muestra diversas ventajas de las columnas Agilent AdvanceBio SEC para análisis biofarmacéuticos en comparación con las columnas SEC de otros fabricantes. Primero usamos las columnas de 7,8 × 300 mm para separar un rango de proteínas, monómeros de anticuerpos monoclonales, agregados y fragmentos. El tamaño del poro y volumen del poro ideales de AdvanceBio SEC ofrecen

Separación del conjugado anticuerpo-fármaco En la figura 9 se ilustra la separación SEC del conjugado anticuerpo-fármaco en diversas columnas de 4,6 × 300 mm. Resulta evidente que AdvanceBio SEC presentó el mayor factor de resolución (Rs = 1,47) para el monómero del conjugado anticuerpo-fármaco y su agregado, en comparación con las columnas F y G. Las columnas F y G proporcionaron formas de pico deficientes debido a la interacción de las cargas hidrofóbicas con la fase estacionaria de la columna. La columna AdvanceBio SEC también proporcionó una mejor forma de pico para el monómero del conjugado anticuerpo-fármaco, así como mejor resolución de su agregado. Además de separar mejor los patrones de proteínas, los anticuerpos monoclonales/conjugados anticuerpo-

Figura 9. Comparación de la separación de conjugados anticuerpo-fármaco en diversas columnas SEC de 4,6 × 300 mm.

Agilent AdvanceBio SEC, 2,7 µm, 300 Å, 4,6 × 300 mm

Otro fabricante F, 2,5 µm, 450 Å, 4,6 × 300 mm

Otro fabricante G, 1,7 µm, 200 Å, 4,6 × 300 mm

Rs = 1,47

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www.agilent.com/chem

Esta información está sujeta a cambios sin previo aviso.

© Agilent Technologies, Inc., 2015 Publicado en EE. UU., 1 de diciembre de 2015 5991-6474ES