Viabilidad de granos de polen 46 - Facultad de Agronomia y ... · Por ello es fundamental estudiar la biodiversidad de las poblaciones existentes, y proponer estrategias de conservación

MAESTRÍA EN CIENCIAS AGRARIAS ORIENTACIÓN: PRODUCCIÓN SOSTENIBLE Facultad de Agronomía y Zootecnia Ing. Agr. Carlos Jorge Budeguer

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INDICE DE CONTENIDOS

Pág.

RESUMEN 5

SUMMARY 7

INTRODUCCION 9

Descripción de la especie 10

Taxonomía 13

Distribución geográfica y usos 13

Conservación de la variabilidad genética 16

Análisis de la variabilidad genética 22

Caracteres morfológicos y anatómicos foliares 25

Caracteres citogenéticos 27

Caracteres bioquímicos 29

Peroxidasas 33

Esterasas 33

HIPOTESIS 35

OBJETIVOS

Objetivo general 37

Objetivos específicos 37

MATERIALES Y METODOS 38

Ejemplares analizados 39


3

Metodología

Métodos para el estudio de caracteres morfológicos

Y anatómicos foliares 42

Métodos para el estudio de caracteres citogenéticos

Meiosis 45

Mitosis 45

Viabilidad de granos de polen 46

Métodos para el estudio de caracteres bioquímicos

Preparación de extractos 47

Marcha técnica 48

Revelado de isoenzimas 50

RESULTADOS 52

Análisis de caracteres morfológicos y anatómicos foliares

Morfología foliar 53

Anatomía foliar 53

Arquitectura foliar 54

Análisis de caracteres citogenéticos 59

Análisis de caracteres bioquímicos 61

DISCUSION 64

Caracteres morfológicos y anatómicos foliares 65

Caracteres citogenéticos 69


4

Caracteres bioquímicos 71

CONCLUSIONES 74

FIGURAS 76

BIBLIOGRAFIA CITADA 92


5

RESUMEN

En este trabajo se estudia a Chenopodium ambrosioides L., (actualmente

Dysphania ambrosioides L. Mosyakin y Clemants), conocida popularmente en

nuestro país como “paico”. Esta especie vegetal es utilizada por sus propiedades

medicinales y antiparasitarias. Posee además, probados efectos insecticidas que

la convierten en un potencial y valioso recurso para la industria de la terapéutica

vegetal.

El uso más destacado es a partir de sus hojas en infusiones con fines

digestivos y antihelmínticos. La venta en forma desecada y triturada de las hojas

constituye una fuente de ingreso de muchas familias rurales, que extraen los

ejemplares que crecen en forma natural, sin manejo ni conservación de los

mismos.

La conservación de este recurso natural tiene importancia debido a que

puede proveer la base de futuros programas de domesticación o mejoramiento.

Por ello es fundamental estudiar la biodiversidad de las poblaciones existentes, y

proponer estrategias de conservación que permitan disponer en el futuro, de

germoplasma nativo adaptados a nuestra región.

El objetivo de este trabajo es determinar si existe variabilidad genotípica y

fenotípica de poblaciones locales de Chenopodium ambrosioides, mediante

estudios morfológicos y anatómicos foliares, citogenéticos e isoenzimáticos. Se

analizaron ocho localidades de la provincia de Tucumán: Lules, Leales, Horco

Molle, Raco, El Naranjo, el Sunchal, El Naranjo y Tafí del Valle.

De los resultados obtenidos, se desprende que existe variabilidad entre las

poblaciones estudiadas, a nivel de caracteres anatómicos foliares y en isoenzimas

esterasas, los que pueden servir como indicadores de variabilidad. No se encontró


6

variaciones en mitosis ni meiosis (2n= 32), siendo regular en todas las

poblaciones analizadas.

Se concluye que la variación encontrada en los caracteres anteriormente

mencionados merece ser tenida en cuenta para la conservación del germoplasma

nativo de la especie y proyectar futuros programas de domesticación y

mejoramiento genético.


7

SUMMARY

This work studies the species Chenopodium ambrosioides L.,

(actually Dysphania ambrosioides L. Mosyakin and Clemants), common name in

Argentina: “paico”. It is used for its medicinal and antiparasitic properties. It has

also proved insecticidal effects that turn it into a valuable potential resource for

plant therapeutics industry.

The most highlight use is from their leaves in infusions with digestive and

anthelmintic purposes. Dried and milled plants are sold as a source of income for

many rural families, which extract specimens that grow naturally, without any

kind ofagricultural management or conservation practices.

Conservation of this natural resource is important because it can provide

the basis for future domestication or breeding programs. It is therefore essential

to study the biodiversity of existing populations, and to propose conservation

strategies for making available in the future, native germplasm adapted to our

region.

The aim of this work is to determine whether genotypic and phenotypic

variability of local populations of Chenopodium ambrosioides by leaf

morphological and anatomical studies, as well as cytogenetic and isoenzymatic.

Eight locations in the province of Tucumán were studied: Lules, Leales, Horco

Molle, Raco, El Naranjo, El Sunchal, El Naranjo and Tafi del Valle.

From the results obtained it follows that there is variability among the

populations studied, at the level of leaf anatomical features and esterase

isoenzymes, which can serve as indicators of variability. No variations were

found in mitosis and meiosis (2n = 32), that were regular in all the populations

that were analyzed


8

Is concluded that the variation found in the aforementioned characters

deserves to be considered, in order to conserve native germplasm of this species

and to project future programs of domestication and breeding.


9

INTRODUCCIÓN


10

INTRODUCCIÓN

Descripción de la especie

Chenopodium ambrosioides L. es una hierba conocida popularmente como

paico, té de los jesuitas, epazote, caá-né, pichim tirao, y yerba de Santa María. Es

una planta aromática, anual, a veces leñosa en la base, de pilosa a glabra con

tricomas glandulares y eglandulares. Posee tallos erectos con numerosas costillas,

hojas pecioladas, angosto elípticas, aserradas, pinnatinervadas (Fig. 1A).

Glomérulos en panojas terminales (Fig. 1B y 1C). Cáliz formado por 5 sépalos

glabros y membranáceos libres hasta la mitad. Pétalos ausentes. Flores perfectas,

con 5 estambres. Ovario esférico, comprimido, estilo breve. Fruto totalmente

encerrado en un cáliz inflado; éste último forma 5 gibas laterales en la región

apical; pericarpio no adherente, translúcido, con tricomas glandulares de color

ámbar, sobre todo en el ápice. Semillas color marrón brillante, de 0,6 a 0,8 mm

de diámetro. Es maleza secundaria de cultivos y montes frutales (Barboza et al.,

2001).

El nombre Chenopodium proviene del griego “pata de ganso” en alusión a

la forma que tienen las hojas de algunas de las especies. El término ambrosioides

deriva del latín ambrosia = manjar de los dioses.


11

Gupta (1995) la describe como hierba anual o perenne, erguida o

ascendente, fuertemente olorosa, de 40 cm a 1 m de alto. Tallo simple o

ramificado. Hojas pecioladas, oblongas y lanceoladas, de 3 a 10 cm de largo por

1 a 5 cm de ancho, gradualmente reducidas hacia la parte superior, subenteras, o

sinuado-dentadas. Inflorescencia en forma de espigas con numerosas flores,

dispuestas en panícula piramidal, con o sin hojas interpuestas. Perianto de 1 mm

de largo, glanduloso. Semilla horizontal o vertical, negra brillante y lisa, de unos

0,7 mm de diámetro, margen obtuso.

Esta planta oriunda de América ha sido utilizada como medicinal y como

alimento por siglos, por las diferentes culturas de América, desde los aborígenes

norteamericanos y mexicanos (Viesca, 1984), hasta las diferentes culturas de

Sudamérica, tales como Brasil, Bolivia, Perú, Chile, Paraguay, Uruguay y

Ecuador (Estrella, 1988; Girault, 1987). Está ampliamente distribuida en las

regiones templadas y tropicales de todo el mundo. Crece naturalmente en los

bordes de las chacras, terrenos de cultivo, bordes de los jardines y parques. Se

adapta bien en terrenos arcillosos, arenosos, xerofíticos y subxerofíticos y su

ecología se relaciona con altitudes entre 0 a 2760 m.s.m. (Alban, 1984).

Mosyakin y Clemants (2002), han realizado estudios y revisiones

taxonómicas de especies del género Chenopodium. A partir de los mismos

ubicaron las especies de Chenopodium con pelos glandulares dentro del género


12

Dysphania (Chenopodiaceae); resultando Chenopodium ambrosioides (L.) como

sinónimo de Dysphania ambrosioides (L.) Mosyakin y Clemants (Mosyakin y

Clemants, 2002). En la sinonimia de D. ambrosioides (L.) Mosyakin y Clemants

podemos citar las siguientes: Ambrina ambrosioides (L.) Spach; Ambrina

antihelmíntica Spach; Ambrina incisa Moq.; Ambrina parvula Phil.;

Chenopodium ambrosioides L.; Chenopodium ambrosioides L. var. typicum

(Speg.); C. ambrosioides L. f. dentatum (Fenzl); C. ambrosioides L. f. genuinum;

C. ambrosioides L. f. integrifolium (Fenzl); C. ambrosioides L. var. pinnatifidum

Willk.; C. suffruticosum Willd. ssp. remotum Willd.; C. suffruticosum Willd.;

Teloxys ambrosioides (L.) W.A. Weber1 .

A pesar de este cambio en la clasificación de la especie, la revisión

bibliográfica ha permitido constatar que se continua asignando el nombre de

Chenopodium ambrosioides en lugar de Dysphania ambrosioides a la especie,

por lo que en el desarrollo de este trabajo se referirá a la misma como

Chenopodium ambrosioides L.

1 Catálogo de plantas vasculares de la República Argentina. http://www.floraargentina.edu.ar.

Consultado en marzo de 2012.


13

Taxonomía

Reino: Plantae

Phylum: Angiospermae

Clase: Dicotyledoneae

Orden: Caryophyllales

Familia: Chenopodiaceae

Género: Dysphania

Especie: Dysphania ambrosioides (L.) Mosyakin y Clemants.

(sin. Chenopodium ambrosioides L.)

Distribución geográfica y usos

La familia Chenopodiaceae está presente en Argentina con 14 géneros y

123 especies (Catálogo de plantas vasculares de la República Argentina:

www.floraargentina.edu.ar).

Dysphania comprende alrededor de 13 especies originarias de las

regiones templadas y templadas - cálidas de América Central y 11 están presentes

en Argentina. Su centro de origen es México y las zonas templadas de todo el

continente americano, aunque ha sido naturalizada en otras regiones del mundo

(Mosyakin y Clemants, 2002). Chenopodium ambrosioides tiene una amplia

distribución en el mundo y es considerada por la Organización Mundial de la


14

Salud como una de las especies más utilizadas entre los remedios tradicionales

del mundo entero (Lorenzi y Matos, 2002).

En la República Argentina, habita de 0 a 2000 m.s.n.m. en las provincias

de Buenos Aires, Chaco, Córdoba, Corrientes, Distrito Federal, Entre Ríos,

Formosa, Jujuy, La Pampa, La Rioja, Mendoza y Misiones (Zuloaga y Morrone,

1999). Por revisión de ejemplares del herbario de la Fundación Miguel Lillo (en

adelante LIL) la distribución en Argentina se amplía a las provincias de Río

Negro, Santa Fé, Santiago del Estero, San Juan y Tucumán. Zuloaga y Morrone

(1999) consignan ejemplares en los países limítrofes de Bolivia, Brasil, Chile,

Paraguay y Uruguay.

Desde el punto de vista farmacológico, C. ambrosioides ha demostrado

excelentes propiedades antiparasitarias, siendo ésta uno de los principales usos

populares de la especie. También demostró acciones antimalárica, analgésica,

antiinflamatoria, y antimicrobiana, (Alonso y Desmarchelier, 2006). Su principal

componente medicinal es el monoterpeno ascaridol (42 - 90 % de la esencia)

responsable del efecto antiparasitario. Además posee p-cimeno, (-) limoneno, (+)

alcanfor, artasona, safrol, N-docosano, N-hentriacontano, N-heptacosano, ß

pineno, metadieno, salicilato de metilo, dimetil sulfóxido, d terpineol y otros

componentes (Desmarchelier y Witting Schaus, 2000).


15

Los órganos utilizados son las hojas y los frutos. Algunas obras como las

de Alonso (2004), Gupta (1995), Germosén Robineau (1996) y Martínez (1988)

describen su uso etnobotánico y en medicina popular. En la región noroeste de

Argentina se emplean las hojas en infusiones para tratar problemas digestivos y

parásitos en niños.

El extracto obtenido de esta planta ha demostrado una actividad

insecticida importante. Se documentaron efectos sobre el mosquito Popillia

japonica y sobre Luptzomya longipalpis (Grainge y Ahmed, 1998; Okuyama et

al., 1992). Un concentrado emulsionable del aceite esencial demostró efectividad

frente al áfido Myzus persicae, así como frente a Trialeurodes vaporariorum,

Frankliniella ocidentalis y Encarsia formosa (Chiasson et al., 2004). Silva-

Aguayo et al. (2005) evaluaron el efecto del polvo de tres especies del género

Chenopodium (ambrosioides L., album L. y quinoa Wild.) para el control de

Sitophilus zeamais, observando que sólo el de C. ambrosioides tiene efecto

repelente. Tapondjou et al. (2002) probaron la eficiencia del polvo y el aceite

esencial en la protección de granos contra seis escarabajos.

Los antecedentes sobre esta especie están orientados principalmente, a las

propiedades de sus aceites esenciales. En esta línea de trabajo se pueden citar los

siguientes: Gadano et al. (2002, 2006), que evaluaron in vitro la toxicidad de C.

ambrosioides y efectos genotóxicos de especies de la familia Chenopodiaceae;


16

Rajesh et al. (2007), mostraron la actividad antifúngica y antioxidante del aceite

y Cavalli et al. (2004) realizaron determinaciones cuantitativas de ascaridol.

En Argentina es aprovechada a partir de ejemplares que crecen en forma

silvestre. Algunos habitantes protegen las plantas que crecen cerca de sus casas, o

bien reproducen ejemplares para su uso particular. Ha sido cultivada desde

principios del siglo XVII en Europa y del siglo XIX en EE.UU. Según Cerrutti

(2000), el cultivo se inicia a partir de semillas que se siembran en primavera, la

germinación se presenta a los 7 a 10 días de la siembra y el periodo vegetativo es

de aproximadamente 9 meses.

Conservación de la variabilidad genética

La escasa variabilidad genética de las especies cultivadas se debe a la

selección y manejo que hace el hombre de la variabilidad observada en las

formas silvestres de las que provienen aquellas. De allí surgen variedades locales,

líneas de mejora y otras combinaciones genéticas. Las especies silvestres pueden

ser de uso directo, indirecto y/o potencial, y por esto es necesario conservar los

recursos fitogenéticos (Holle, 1984).

“El ADN, material genético hereditario que se transmite de una

generación a la siguiente, dicta las características propias de una especie. La


17

información está codificada en el ADN en forma de una secuencia de

subunidades químicas denominadas nucleótidos. Cada célula de un organismo

contiene típicamente, una o dos copias de la dotación completa de ADN, llamada

genoma. El propio genoma está constituido por una o más moléculas de ADN,

extraordinariamente largas, empaquetadas cada una de ellas en una estructura

denominada cromosoma. Los genes son, simplemente, las unidades funcionales

del ADN cromosómico” (Griffiths et al., 1999). Por esto podemos considerar a

los organismos como “reservorios” de genes particulares y característicos de cada

especie.

El Convenio sobre la diversidad biológica2 presenta una definición propia

sobre recursos genéticos. El artículo 2 describe a los recursos genéticos como el

material genético de valor real ó potencial, de origen vegetal, animal o

microbiano que contenga unidades funcionales de la herencia.

La diversidad de una especie está constituida por todas las variaciones

genéticas de la misma, manifestada a través de la heterogeneidad de sus

poblaciones. Si no hay variación para un carácter dentro de una población, el

hombre no puede seleccionar entre los mejores individuos y esa población no es

útil para realizar domesticación y mejoramiento.

2 Adoptado en la Conferencia de las Naciones Unidas sobre el Medio Ambiente y Desarrollo, celebrada

en Rio de Janeiro en 1992; entró en vigencia el día 29 de diciembre de 1993.


18

En la evolución de la diversidad genética natural de las plantas intervienen

fenómenos tales como: mutación, reproducción, recombinación, acción de la

selección natural, adaptación, aislamiento reproductivo, especiación y deriva

genética. La evolución produce cambios debido a la acumulación en las

poblaciones de genes o complejos de genes adaptados a condiciones ambientales

cambiantes. Estos genes o complejos de genes se van a establecer en mayor o

menor frecuencia por efecto de la selección natural. Eventualmente, el proceso de

evolución puede culminar en nuevas especies por efecto del aislamiento

reproductivo. Este proceso de evolución ocurre siempre, pero ha sido modificado

por la intervención del hombre (Holle, 1984). Lo que el hombre ha realizado

desde el comienzo de la agricultura es seleccionar los mejores individuos de las

poblaciones naturales para domesticarlos y formar poblaciones cultivadas. En

estas últimas los genotipos son uniformes, por lo que la variabilidad genética

original se reduce. Otro aspecto a tener en cuenta en la modificación de la

evolución natural es el cambio climático global provocado por la actividad

humana y que impacta directamente sobre los ecosistemas naturales.

El fitomejorador, para mejorar y obtener cultivos con alta productividad,

precisa de variabilidad genética para realizar la selección; por otro lado algunos

cultivares mejorados se difunden enormemente y su extenso uso provoca una

reducción de variabilidad genética en las zonas de producción donde tienen éxito,

ya que la diversidad natural es reemplazada con pocas especies que se


19

incorporaron al cultivo. Shiva (1991) señala que la reducción de esta diversidad y

la creación de uniformidad genética en los cultivos simultáneamente, conducen a

la inestabilidad y aumento de la vulnerabilidad de los sistemas.

Una de las razones más importantes para mantener la biodiversidad es que

esta provee la base genética de todas las plantas de uso agrícola. Los cultivos

actuales derivan de especies silvestres que han sido domesticadas y luego

mejoradas (Altieri, 1997; Blanckaert et al., 2012).

Algunos programas de mejoramiento ponen poco énfasis en la

conservación de cultivos minoritarios y especies silvestres con conocido

potencial como fuente de nutrientes, o germoplasma destacado (resistencia a

enfermedades, amplia adaptación, servicios ecológicos) y se minimiza el interés

en plantas con propósitos no alimenticios como por ejemplo combustible,

medicinal o de uso industrial ( Frankel y Bennet, 1970; Frankel y Hawkes, 1975;

Frankel y Soulé, 1981; Prescott-Allen y Prescott-Allen, 1981; Wilkes, 1983).

Para plantas cultivadas, este fenómeno es particularmente importante en áreas

con algún tipo de agricultura tradicional, donde los cultivos son aún enriquecidos

por intercambio de genes con especies nativas y malezas emparentadas (De Wet

y Harlan, 1975; Harlan, 1965).

Aunque la mayoría de los agroecosistemas están bajo algún proceso de

modernización o modificación, la conservación de los recursos genéticos de


20

cultivos locales puede ser integrada con el desarrollo agrícola, especialmente en

regiones donde los proyectos de desarrollo rural preservan la diversidad de la

vegetación de agroecosistemas tradicionales y afianzan el conocimiento de los

campesinos para utilizar mejor los recursos locales. (Alcorn, 1984; Nabhan,

1985; Sarukhán, 1985). Los agroecosistemas poseen altos rendimientos en el

corto plazo, pero carecen de la sustentabilidad y estabilidad de los ecosistemas

maduros.

La Región Noroeste de Argentina cuenta con especies aromáticas nativas

y naturalizadas cuya demanda se incrementó por su uso como medicinales en

herboristerías, en productos culinarios y en la fabricación de bebidas sin alcohol.

La extracción de estos recursos vegetales presenta el riesgo de una pérdida

irrecuperable de los mismos y pone en evidencia la urgente necesidad de

conservarlos y poder utilizarlos de manera sustentable (Ojeda, 2004).

La importancia del presente trabajo reside en el aporte de conocimientos

sobre la variabilidad genética de Chenopodium ambrosioides en la provincia de

Tucumán, Argentina. Dicha información servirá para el desarrollo de futuros

programas de domesticación y mejoramiento que permitan el cultivo de esta

especie de alto valor medicinal. Actualmente es aprovechada a partir de la

recolección de ejemplares que crecen en forma natural, lo que podría ocasionar

pérdida de germoplasma nativo adaptado a condiciones particulares de la región.


21

Existen antecedentes de estudios citogenéticos de especies del género

Chenopodium en Tucumán. Pastoriza et al. (2006) estudiaron a C. graveolens y

C. ambrosioides, determinando regularidad meiótica y una buena capacidad

reproductiva. Sin embargo no se analizó variabilidad genética ni fenotípica en

ninguna de las especies antes citadas.

Por lo expuesto, y considerando que no se dispone de antecedentes

suficientes en Tucumán que determinen la variabilidad genotípica y fenotípica de

Chenopodium ambrosioides se propone este trabajo, para propender el manejo

sustentable de este recurso nativo y la conservación de su germoplasma.


22

ANÁLISIS DE LA VARIABILIDAD

GENÉTICA


23

ANÁLISIS DE LA VARIABILIDAD GENÉTICA

Conceptualmente, el fenotipo de un individuo está constituido por todos

los caracteres que se pueden percibir con los sentidos. Para determinar qué

proporción de las diferencias fenotípicas de una población corresponde a factores

genéticos y cuáles a los ambientales, se debe contar con alguna medida

cuantitativa del fenotipo en consideración; esto representa la varianza fenotípica

(Vf). Algunas de las diferencias en el fenotipo pueden deberse a diferencias en el

genotipo de los individuos de una población. Estas diferencias corresponden a la

varianza genotípica (Vg).

Por otro lado, las diferencias en el fenotipo pueden deberse a diferencias

ambientales entre las plantas; esto es la varianza ambiental (Va). La varianza

ambiental se puede atribuir a factores ambientales específicos, como la cantidad

de luz o agua que recibe la planta, temperatura, altura sobre el nivel del mar, etc.

Cualquier variación en el fenotipo que no sea hereditaria es, por definición, una

parte de la varianza ambiental.

Cuando el efecto genético depende del ambiente específico en el cual se

encuentra un genotipo, se adiciona la varianza de la interacción genético-

ambiental (Vga).


24

Teniendo en cuenta los conceptos anteriores, podemos expresar en una

ecuación un modelo que describe las posibles causas de las diferencias que

observamos entre los fenotipos individuales:

Vf = Vg + Va + Vga.

Es importante destacar que este modelo incluye estrictamente las

diferencias observables (varianza) en los fenotipos de los miembros individuales

de una población; no indica nada acerca del valor absoluto de la característica ni

acerca de los genotipos subyacentes que producen estas diferencias (Pierce,

2010).

Dentro de una población dada, hay múltiples fuentes de variación

fenotípica, y cada una es el reflejo de diversas causas subyacentes. Los factores

que componen dicha variación fenotípica determinan si un carácter tiene la

habilidad de responder a la selección natural ó artificial, como así también si

puede responder a cambios ambientales. Por lo tanto, los investigadores se

interesan en determinar la importancia relativa de ambos factores, los genéticos y

los ambientales, en la manifestación de caracteres particulares (Williams, 1965).

En vegetales, es posible estimar la variación fenotípica mediante caracteres

morfológicos y anatómicos, y la variación genética mediante el análisis

cromosómico y de isoenzimas ya que éstas son el producto directo de la

expresión de genes particulares.


25

Caracteres morfológicos y anatómicos foliares

La familia Chenopodiaceae presenta gran diversidad de estructuras

foliares, con numerosas variaciones en sus rasgos anatómicos.

El material a partir del cual se fabrica la infusión es material seco

triturado, comúnmente sin flores, lo que torna difícil la identificación a través de

la exomorfología. En el campo también es, por los motivos citados, dificultosa.

Metcalfe y Chalk (1950) expresan que la anatomía comparada es una técnica

valiosa para la identificación del material, permitiendo la separación de géneros y

también de especies.

Costa y Tavares (2006) han estudiado la anatomía foliar de Chenopodium

ambrosioides en Brasil. En la región noroeste de Argentina no se han realizado

estudios anatómicos de esta especie para determinar variabilidad fenotípica, por

lo que este trabajo contribuye con un aporte al conocimiento de la especie en

Tucumán.

Pérez Cuadra y Hermann (2009) realizaron una comparación anatómica de

dos especies del género Nitrophila (Chenopodiaceae), demostrando que si bien

las características morfológicas y anatómicas generales son similares en estas

especies, cada una presenta algunas variaciones específicas, por lo cual el estudio

anatómico reviste valor taxonómico a nivel de especie.


26

Las hojas de C. ambrosioides son los órganos más usados por los

consumidores ya que concentra la mayor cantidad de aceites esenciales. En este

sentido, es útil el estudio de la anatomía de estomas y tricomas foliares que puede

brindar información de valor sistemático y permite también realizar una

estimación de la variabilidad fenotípica entre poblaciones. Roth et al. (1986)

plantearon que en los estudios relacionados con la anatomía foliar, se deben

considerar fenómenos anatómicos individuales tales como índice estomático (IE),

que puede variar dentro de la misma hoja según la parte del limbo que se utilice y

según la posición de las hojas en la planta. Por otra parte, se debe considerar que

el ambiente puede ejercer cierta influencia sobre la distribución de estomas.

Tanto la DE como el IE pueden estar influenciados por las condiciones

ambientales y nutricionales (Roth et al., 1986). Se sabe que la densidad de

estomas es afectada por el estadio del desarrollo foliar, y también varía en las

diferentes partes de la misma planta (Stace, 1965; Poole et al., 1996). La

densidad de estomas también está influenciada por factores ambientales como

ser: disponibilidad de agua, temperatura y radiación solar (Gay y Hurd, 1975; Ma

et al., 2004), disponibilidad de nutrientes y concentración de dióxido de carbono

atmosférico (Woodward y Bazzaz, 1988; Royer, 2001).


27

Costa y Tabares (2006) han estudiado detalladamente los tricomas de C.

ambrosioides en Brasil, ya que dentro de la familia Chenopodiaceae pueden ser

de diferentes tipos.

Teniendo en cuenta los antecedentes anteriormente mencionados se puede

considerar que las variables seleccionadas en este trabajo para estimar la

variabilidad fenotípica son adecuadas.

Caracteres citogenéticos

Existen escasos antecedentes de estudios citogenéticos de Chenopodium

ambrosioides L. Los existentes, se limitan a describir número cromosómico de

especies del género Chenopodium (Giusti, 1970; Cole, 1962; Darlington y Wile,

1955; Homsher, 1963; Kawatani y Ohno, 1950; Kjellmark, 1934). Sin embargo

no informan sobre el comportamiento de cromosomas en meiosis ni su relación

con la fertilidad. Por lo expuesto en la introducción, el conocimiento derivado de

estos estudios es fundamental para hacer un uso agronómico y/o ecológico de

una especie, buscando mantener el recurso natural o multiplicarlo para uso

comercial.

Algunos autores han realizado conteo cromosómico en especies de

Chenopodium que tienen interés económico: C. quinoa (2n=36) y C. berlandieri


28

subsp nuttalliae (2n=36) se han originado de cultivos y semillas en Sudamérica y

México respectivamente, mientras que C. album (2n= 18, 36, 54) es un ensamble

de formas heteromórficas salvajes y semi-cultivadas (Mehra y Malik 1963;

Wilson 1990; Gangopadhyay et al. 2002). Según Bhargava et al. (2005) se

pueden encontrar mayores datos citotaxonómicos en los chenopodios cultivados,

especialmente C. quinoa, debido a que son muy estudiadas por la calidad de su

proteína y su contenido de minerales y vitaminas.

El número cromosómico de C. ambrosioides informado por diferentes

autores varía entre 16, 32 y 36 (Giusti, 1970). En Darlington y Wile (1955) se

cita el número básico para el género de x= 9 y x= 8, proveniente de distintos

autores. Giusti informa que la especie es tetraploide.

Santos y Correa (2006) analizaron la diversidad genética de C.

ambrosioides de la región de Bahía (Brasil) en base a marcadores RAPD. Sólo

6,9% de las 216 bandas amplificadas fueron polimórficas, por lo que hay una

baja variabilidad entre las accesiones estudiadas.

En España y Portugal se citan para Chenopodium ambrosioides L., los

siguientes números cromosómicos:

2n=32 para España (Bjorkqvist, 1969) y (Silvestre, 1984)

2n=32 para Portugal (Queirós, 1973).


29

Santosh et al. (2011) informan para India un número cromosómico 2n =

32. Estos autores señalan que hay un alto porcentaje (75%) de poliploidía en el

género Chenopodium, encontrándose niveles de ploidía de 2x, 4x y 6x; y

números básicos probables de x= 8 y x= 9.

Caracteres bioquímicos

Chenopodium ambrosioides, ha sido identificado tradicionalmente a

campo, en base a su aspecto general, mediante caracteres exomorfológicos. Pero

esto no constituye un criterio inequívoco ya que la forma y tamaño de hojas

pueden variar con las condiciones ambientales, dificultando la identificación a

campo y dando lugar a errores taxonómicos.

Se pueden emplear métodos para evaluar el genoma a través de

marcadores bioquímicos como ser, las proteínas e isoenzimas. Las proteínas

están formadas por largas cadenas de aminoácidos que poseen grupos ionizables

por lo que pueden migrar a través de un campo eléctrico a diferentes niveles, de

acuerdo con su carga eléctrica específica y su dificultad estérica, evidenciando

débiles diferencias de carga, debidas por ejemplo al cambio de un aminoácido.

Así es que analizando mediante electroforesis uno de los productos directos de la

expresión de los genes, las isoenzimas, se puede tener una idea relativamente

precisa de una parte del genoma estudiado (Orstein, 1964; Hart y Bhatia, 1967;

Brewbaker et al, 1968; Avise, 1974; Feldmann, 1984 y Cooke, 1992).


30

El término isoenzima fue acuñado por Market y Moller (1959) para

referirse a las diferentes formas moleculares de una enzima con afinidad por un

mismo sustrato, y que se hallan presentes en un mismo organismo.

La técnica de electroforesis consiste en la separación de moléculas

cargadas eléctricamente a través de un campo eléctrico. La electroforesis de

isoenzimas permite detectar diferencias de fenotipos enzimáticos. La información

aportada por las bandas reveladas en geles, que se interpretan como fenotipos

enzimáticos, brindan firmes indicios de variabilidad genotípica. Las ventajas de

las isoenzimas como marcadores bioquímicos radican en la codominancia de los

alelos de un determinado locus. Esta codominancia permite diferenciar

individuos homocigotos de heterocigotos, lo cual constituye una ventaja sobre

los descriptores morfológicos que en la mayoría de los casos son de carácter

dominante (Market y Moller, 1959).

Las enzimas son macromoléculas formadas por largas cadenas de

aminoácidos que poseen grupos ionizables, por lo que la molécula posee una

carga eléctrica global. Las técnicas electroforéticas utilizan esta propiedad para

separar moléculas en un gel sometido a un campo eléctrico (Feldmann, 1984).

La identificación taxonómica de diferentes poblaciones de una especie

puede hacerse apelando al análisis electroforético como una herramienta de


31

determinación rápida y exacta. Cada genotipo será entonces caracterizado por la

presencia o ausencia de diferentes niveles de bandas (Feldmann, 1984).

La electroforesis de proteínas se ha convertido en una poderosa

herramienta para la investigación en múltiples disciplinas biológicas. El análisis

de isoenzimas es importante tanto en sistemática y biología evolutiva, así como

en agronomía (Tanksley y Orton, 1983).

Algunos de los sistemas enzimáticos que es posible revelar con esta

técnica son: Peroxidasas, esterasas, fosfatasas ácidas, catalasas, amilasas,

galactosidasas, entre otros. Feldmann (1984) advierte que los patrones de

esterasas y peroxidasas son suficientes para conocer la variabilidad en

poblaciones.

Cuando los geles de electroforesis se sumergen en soluciones de tinción de

enzimas específicas, se pueden revelar una o más regiones de actividad

enzimática. El patrón de bandas resultantes es el fenotipo electroforético, el cual

consiste normalmente de una o más bandas coloreadas para cada individuo

analizado. Este fenotipo varía ampliamente, dependiendo de numerosos factores,

incluyendo el organismo, tejido, y enzima analizada. En algunos casos consiste

en una banda simple en todas las muestras. En contraste, algunas enzimas pueden

estar codificadas por varios genes y mostrar fenotipos complejos con 15 o más

bandas por individuos. Aunque la migración relativa y el número de bandas


32

observadas pueden dar información adecuada para algunos tipos de estudios, para

hacer una interpretación genética se requiere que los fenotipos electroforéticos

sean traducidos a genotipos, ya que los patrones revelados de isoenzimas son la

expresión directa de uno o más genes (Soltis y Soltis, 1989).

El revelado de las enzimas en los geles constituye una expresión

fenotípica que puede ser modificada en ambientes diferentes, por lo que la

expresión de patrones de una determinada especie puede cambiar, según el

ambiente y a través del tiempo de vida de la misma.

Varios factores pueden considerarse determinantes primarios del número

de bandas observadas en un gel, incluyendo: (1) el número de genes codificantes;

(2) su estado alélico (homocigota o heterocigota); (3) estructura cuaternaria de

los productos proteicos; (4) su compartimentalización subcelular (Soltis y Soltis,

1989).

El caso más simple involucra una sola región de tinción con variantes

electromórficas (aloenzimas) observadas en diferentes individuos. Debido a que

las aloenzimas son generalmente codominantes, cruces entre individuos que

porten electromorfos diferentes resultará en una progenie F1 que muestra ambas

bandas parentales. Además, la F1 puede poseer bandas “híbridas” no observadas

en los padres, cuya presencia y número depende de la cantidad de subunidades

polipeptídicas contenidas en la enzima activa. Por lo tanto, para una enzima


33

dimérica, se observan tres bandas, dos parentales homodiméricas y una adicional,

producto de la movilidad intermedia o heterodímera, compuesta de un

polipéptido codificado por cada uno de los dos alelos parentales. Por otra parte, si

la enzima es tetramérica, cinco bandas se observarán en heterocigotas, dos

homotetrámeras (AAAA, BBBB) y tres heterotetrámeras (AAAB, AABB,

ABBB) (Soltis & Soltis, 1989).

Peroxidasas

Son enzimas que se hallan ampliamente distribuidas en el reino

vegetal y son fáciles de revelar, por lo cual es muy frecuente su uso.

Son hemoglicoproteínas con un núcleo férrico que catalizan la

siguiente reacción:

2 H2O2 2 H2O + O2

Su especificidad es estricta con el H2O2, pero pueden oxidar

numerosos compuestos, como fenoles, compuestos aromáticos, nitritos, etc.

(Feldmann, 1984).

Esterasas

Estas enzimas intervienen en numerosas reacciones bioquímicas. Su

principal acción es hidrolizar ésteres, catalizando la siguiente reacción:

R-COOR+ + H2O R-COOH + R

+ OH


34

En este sistema se encuentran las α esterasas y las β esterasas. En las

plantas, la variabilidad esencial de estas isoenzimas se debe a variaciones

fisiológicas (Feldmann, 1984).


35

HIPÓTESIS

Existe variabilidad genética entre las poblaciones de Chenopodium

ambrosioides L., de diferentes localidades de la provincia de Tucumán.


36

OBJETIVOS


37

OBJETIVOS

Objetivo General

Evaluar la existencia variabilidad genotípica y fenotípica entre

poblaciones de Chenopodium ambrosioides L. (Chenopodiaceae) provenientes

de ocho localidades de la provincia de Tucumán, Argentina.

Objetivos específicos

a) Evaluar la morfología y anatomía foliar de cada población, para

determinar variabilidad fenotípica.

b) Determinar el número de cromosomas y su comportamiento

durante la meiosis para estimar variación genotípica.

c) Estimar variabilidad genotípica mediante electroforesis de

isoenzimas esterasas y peroxidasas.

d) Inferir el valor de las determinaciones morfoanatómicas,

citogenéticas y de polimorfismo enzimático en la variabilidad genotípica y

fenotípica en C. ambrosioides.


38

MATERIALES Y MÉTODOS


39

MATERIALES Y MÉTODOS

Ejemplares analizados

Los estudios se realizaron en ejemplares provenientes de ocho localidades

de la provincia de Tucumán (Figura 2). Las características de cada localidad se

muestran en la Tabla 1. Se observó en el campo que las poblaciones están

constituidas por pocos individuos de C. ambrosioides, por lo que se trabajó con

cuatro individuos de cada localidad (plantas con cinco a seis hojas) y repicados

en macetas a fin de disponer de todo el material para los estudios a realizar. De

cada localidad se tomó una muestra durante noviembre-diciembre de 2009. Para

tomar las muestras se seleccionaron hojas, flores y raíces en cantidad necesaria y

se herborizó e incorporó al herbario de la Fundación Miguel Lillo (LIL)

ejemplares de cada procedencia, a saber:

- Dysphania ambrosioides. ARGENTINA, Tucumán. Dep. Lules: Lules,

385 m.s.n.m. 6- XI- 2009, C. J. Budeguer s/n, LIL 611759.

- Dysphania ambrosioides. ARGENTINA, Tucumán. Dep. Leales: Leales,

335 m.s.n.m. 10- XI- 2009, C. J. Budeguer s/n, LIL 611827.

- Dysphania ambrosioides. ARGENTINA, Tucumán. Dep. Tafí Viejo:

Raco, 1180 m.s.n.m. 13- XI- 2009, C. J. Budeguer s/n, LIL 611761.


40

- Dysphania ambrosioides. ARGENTINA, Tucumán. Dep. Yerba Buena:

Horco Molle, 664 m.s.n.m. 8- XI- 2009, C. J. Budeguer s/n, LIL 611762.

- Dysphania ambrosioides. ARGENTINA, Tucumán. Dep. Burruyacu: El

Naranjo, 650 m.s.n.m. 20- XI- 2009, C. J. Budeguer s/n, LIL 611760.

- Dysphania ambrosioides. ARGENTINA, Tucumán. Dep. Burruyacu: El

Sunchal, 642 m.s.n.m. 20- XI- 2009, C. J. Budeguer s/n, LIL 611828.

- Dysphania ambrosioides. ARGENTINA, Tucumán. Dep. Tafí del Valle:

Tafí del Valle, 1900 m.s.n.m. 10- XII- 2009, C. J. Budeguer s/n, LIL

611829.

- Dysphania ambrosioides. ARGENTINA, Tucumán. Dep. Trancas:

Trancas, 750 m.s.n.m. 28- XI- 2009, C. J. Budeguer s/n, LIL 611758.

Tabla 1: Caracterización de las regiones de muestreo de Chenopodium ambrosioides L.

según región agroecológica (Zuccardi y Fadda, 1985) y comunidad vegetal (Vervoost,

1982).

Localidad Region

agroecológica

Comunidad

vegetal

Clima Suelos

El Naranjo Pedemonte

subhúmedo-

húmedo

Bosque de

transición

Subhúmedo húmedo

cálido. Precipitación

media anual 900mm.

Tº media anual de 19

ºC.

Hapludoles fluvénticos y

cumúlicos.

Ustorthents típicos.

Horco Molle Pedemonte

húmedo y

perhúmedo

Bosque

montano

inferior

subtropical

Húmedo y perhúmedo

cálido. Precipitaciones

superiores a 1000 mm

anuales. Tº media

anual 19 ºC. Libre de


cumúlicos.

Argiudoles típicos y Hapludoles

típicos


41

perennifolio heladas.

Leales Llanura

deprimida salina

seca sub-

húmeda

Bosque de

transición

Seco subhúmedo


anuales entre 650 y

900 mm. Tº media

anual de 19,5 ºC.

Hapludoles fluvacuénticos y

Haplacuoles aéricos.


cumúlicos.

Argiudoles ácuicos.

Udifluvents típicos y

Udipsamments típicos.

Todos asociados a fases salinas y

salino-sódicas.

Lules Pedemonte

húmedo y

perhúmedo

Bosque

montano

inferior

subtropical

perennifolio

Húmedo y perhúmedo


superiores a 1000 mm

anuales. Tº media

anual de 19 ºC. Libre

de heladas.


cumúlicos.

Argiudoles típicos y Hapludoles

típicos.

Raco Región serrana Bosque

montano

inferior

subtropical

caducifolio

Semiárido cálido Haplustoles énticos, fluvénticos y

típicos. Ustifluvents típicos.

El Sunchal Llanura Chaco-

Pampeana

subhúmeda-

húmeda

Bosque de

transición

Seco sub-húmedo

cálido. Precipitación

media anual 750 a

1000 mm. Tº media

anual 19 ºC.

Argiudoles típicos.

Argiustoles típicos.

Trancas Cuenca

intermontana

Tapi-Trancas

Bosque

chaqueño

Semiárido cálido.

Precipitación media

anual de 400 a 500

mm. Tº media anual 18

a 19 ºC.

Ustifluvents típicos y Ustorthents

típicos.

Haplustoles fluvénticos y énticos.


42

METODOLOGÍA

Métodos para el estudio de caracteres morfológicos y

anatómicos foliares

Para evaluar los caracteres morfológicos y anatómicos foliares se fijaron

hojas mediales de dos plantas de cada localidad. La fijación se realizó con FAA

(alcohol etílico 96°: agua destilada: formol: ácido acético glacial) según técnica

de D´ Ambrogio de Argueso (1986).

Para describir el patrón de nerviación se empleó la terminología de Hickey

(1974) en hojas diafanizadas según la técnica de Dizeo de Strittmatter (1973). Se

utilizó la coloración safranina hidroalcohólica y azul de bromofenol (D´

Ambrogio de Argueso, 1986). Las observaciones fueron realizadas con

microscopio Zeiss Axiolab equipado con ocular micrométrico. Las fotografías se

obtuvieron con cámara digital Cannon power Shot A 310. Los parámetros

cuantificados fueron: longitud de estomas (LE), densidad estomática (DE), índice

estomático(IE) e índice de empalizada o clorofiliano (IC) (Gattuso y Gattusso,

1999). Se consideró además, ápice, base y margen de la lámina foliar, tipos de

tricomas, forma de las células epidérmicas y tipo de venación.

Se realizaron 10 mediciones para índice estomático de ambas epidermis y

30 para las variables: longitud, densidad e índice de empalizada o clorofiliano de


43

ambas epidermis, considerando lo propuesto por D´ Ambrogio de Argueso

(1986) para el estudio de estas variables.

El índice de estomas es una constante dentro de ciertos límites y permite la

caracterización de hojas por comparación con testigos o con valores ya tabulados.

Se procedió a diafanizar un trozo de hoja de 5 x 5 mm y se transfirió a un

portaobjetos montándolo sobre una gota de hidrato de cloral. Se observó con un

microscopio equipado con un tubo de cámara clara, con un objetivo de 40x y

ocular de 10x. Se dibujó en papel una cruz por cada célula epidérmica y un

círculo por cada estoma. Se calculó el resultado con la siguiente fórmula: I= S x

100/ (E + S); donde I es índice de estomas, S es número de estomas observado en

el campo y E es número total de células epidérmicas en el mismo campo. Para

cada muestra se calculó la media aritmética de 10 mediciones.

El índice de empalizada, también llamado índice clorofiliano, es un

método que se usa fundamentalmente para el control de calidad de hojas, y puede

revelar diferencias significativas entre distintas muestras. Se procedió a

diafanizar un trozo de hoja de alrededor de 5 x 5 mm y se transfirió a un

portaobjetos montándolo en una gota de hidrato de cloral. Se enfocó las células

del clorénquima en empalizada y se contaron cuántas de éstas se encontraban

dentro de las paredes de cada célula epidérmica. Se contaron 30 células

epidérmicas de cada epidermis para todas las localidades.


44

Se realizó análisis de varianza para detectar diferencias de las variables

evaluadas (longitud de estomas, densidad de estomas, índice clorofiliano e índice

estomático) entre las poblaciones. Las medias fueron comparadas mediante el

test de comparaciones múltiples de Tukey, empleándose un intervalo de

confianza del 95% (α= 0,05), (Zar, 1996). Para ambas epidermis se realizó un

análisis multivariado de componentes principales que permitió analizar la

interdependencia de las variables evaluadas y una representación gráfica de

dispersión (Biplot) usando como ejes el componente principal 1 (CP1) y el

componente principal 2 (CP2) que permite visualizar la mayor variabilidad entre

observaciones (Johnson y Wichern, 1992).

Los análisis estadísticos se hicieron con el programa estadístico Infostat

(Di Rienzo et al. 2010).


45

Métodos para el estudio de caracteres citogenéticos

Meiosis

Las plantas fueron conservadas en macetas hasta el momento de floración

en un campo adyacente al laboratorio. Se fijaron flores jóvenes, en estado previo

a antesis floral, en una solución de Newcomer (alcohol isopropílico: ácido acético

glacial: éter de petróleo: acetona: dioxano, en proporción 6:3:1:1:1). Los

preparados se realizaron siguiendo la marcha técnica de Andrada et al. (1975) y

Boggiatto et al. (1979). Se aplastó anteras entre porta y cubre objetos, utilizando

hematoxilina al 2% como colorante y citrato férrico al 1% como mordiente. Se

observaron alrededor de cincuenta células madres de polen (CMP) de cada

muestra. Las fotomicrografías de las células de meiosis, así como las de mitosis

se realizaron con cámara digital Cannon power Shot A 310, acoplada a un

microscopio ZEISS Axiolab.

Mitosis

Se realizaron preparados a partir de raicillas obtenidas de plantas en

macetas con un sustrato liviano formado por tierra con arena. Las raicillas se

extrajeron a los 6 días del transplante de campo a maceta, con 1 a 2 cm

aproximadamente. Se hizo un pretratamiento con paradiclorobenceno (Paclosol)


46

durante 2 hs 20 min a T° ambiente y se fijaron en solución de Carnoy (3:1)

(alcohol etílico: ácido acético). Luego se hidrolizaron durante 1 min a 57 °C en

ácido clorhídrico 1 N. La tinción se realizó con hematoxilina 2% como colorante

y citrato férrico 1% como mordiente.

Viabilidad de granos de polen

Se analizó la viabilidad de los granos de polen mediante la técnica de

tinción con azul de algodón en lactofenol. Se usaron flores con anteras maduras,

que se extrajeron antes que se produzca la antesis y se aplastaron en unas gotas

de azul de algodón sobre un portaobjetos. Se cubrió con cubreobjetos de 24 x 24

mm. Se dejó teñir 24 horas y se observó en microscopio a 400x. En cada campo

del microscopio se contaron los granos normales y anormales. En esta técnica se

consideran normales a los granos turgentes, bien coloreados y como anormales a

los deformes o sin colorear, ya que la viabilidad está altamente correlacionada

con la buena formación de los granos.


47

Métodos para el estudio de caracteres bioquímicos

Preparación de extractos

Los extractos se realizaron a partir de hojas jóvenes, las que se

conservaron a menos 20° C hasta el momento de su procesamiento.

La cuba de electroforesis utilizada permite la carga de 5 muestras, por lo

que se seleccionaron las siguientes localidades, tomando una transecta en

dirección este-oeste (de menor a mayor altitud): Lules, Leales, Raco, Horco

Molle y Tafí del Valle.

Los pasos seguidos para obtener el extracto de las muestras fueron:

- Molienda de 0,5 g de muestra congelada en mortero con buffer

fosfato de sodio 0,2 M de pH 7,5 + mercaptoetanol 10 mM.

- Centrifugado a 4°C 15 minutos a 10.000 revoluciones.

- Separación del sobrenadante y desechado del resto de material.

- Dosaje de proteínas de Loury al sobrenadante.

Para determinar la cantidad de proteínas de los extractos obtenidos de cada

muestra y determinar el volumen de extracto a sembrar en el gel de

poliacrilamida se realizó un dosaje de proteínas siguiendo la técnica descripta en


48

Loury et al. (1951). La lectura se realizó en espectrofotómetro con una densidad

óptica (D O) de 750 mm.

Marcha técnica

Se realizó electroforesis vertical discontinua en gel de poliacrilamida,

según Ornstein (1964) y modificada en el Laboratorio de Genética de la Facultad

de Agronomía y Zootecnia de la UNT para electroforesis vertical.

El principio de la electroforesis vertical discontinua está dado por la

utilización de diferentes buffer en el gel y en la cuba, además de concentraciones

diferentes del gel.

Se trabajó con dos geles: un gel de poro grueso donde la muestra es

concentrada rápidamente (gel stacking) y un gel de poro fino (gel separador) que

produce la separación de las enzimas por su carga eléctrica y peso molecular. En

la Tabla 2 se indica la composición de los geles.


49

Tabla 2: Composición de los geles de poro grueso y de poro fino, de los buffers y del

voltaje empleado.

Gel Buffer del gel Buffer de los

electrodos Voltaje

Gel de poro grueso

Acrilamida: 2,5%

Bis acrilamida:

6,625%

Tris – HCl

0,0617 M

0,75 %

pH 6,7

Tris Glicina

pH 8,3 10x

30 mA

(constante)

( ~180 V)

30 min.

Gel de poro fino

Acrilamida: 9%

Bis acrilamida:

0,157%

Persulfato de NH4

0,30%

Temed

Tris –HCl

0,375 M

4,54 %

pH 8,9

40 mA

(constante)

( 200V)

3 – 3,5 h.

Se preparó la solución del gel de poro fino y se dejó gelificar a

temperatura ambiente por acción del sistema catalítico Persulfato de amonio -

Temed. Luego se colocó la solución de poro grueso y el peine, el cual después de

gelificar, deja delimitada las calles en donde se deposita mediante jeringa

Eppendorf, cada una de las muestras.


50

Se sembraron cantidades equivalentes a 9,5 µg de proteínas en cada celda,

con una gota de azul de bromofenol para indicar el nivel del frente de corrida.

Revelado de isoenzimas

Esterasas

Se preincubó el gel en ácido bórico 0,5 M durante 1 h. en heladera, para

reducir el pH del gel a 6. Luego se incubó durante 30-60 minutos a 37º en una

solución buffer fosfato 0,2 M conteniendo 100 mg. de Fast Blue RR Salt y se

agregó 2 ml. de naftil acetato ( N.A.) y de naftil acetato ( N. A.) al 1% en

alcohol 70º. Se enjuagaron luego los geles con agua destilada y se conservó en

metanol: ácido acético: agua, en una proporción de 6:1:4 (Brewbaker, 1968).

Los productos formados con N.A. dan un fenotipo de color azul y los

formados con N.A. un fenotipo rojo (Saidman y Naranjo, 1982).

Peroxidasas

Se incubó el gel en 100 mg. de o-dianisidina, 70 ml de alcohol 75º, 28 ml

de buffer acetato 0,2 M y pH = 5 y 2 ml de H2O2 al 3%. Se deja teñir de 25 a 60

minutos, hasta la obtención de bandas marrón – rojizo. Se lava con alcohol 70º y

se conserva en una solución de glicerol al 10% en ácido acético al 7%.

Los patrones de bandeo de y esterasas y de peroxidasas fueron

esquematizados en sus respectivos zimogramas utilizando las distancias


51

promedio de cada unidad taxonómica, medida desde el frente de corrida y

relativas a una distancia predeterminada del gel (10 cm.). La comparación entre

las poblaciones se hizo sobre la base de las variaciones de nivel e intensidad de

las bandas, designándose como banda 1 a la más rápida en la migración anódica.


52

RESULTADOS


53

RESULTADOS

Evaluación de caracteres morfológicos y anatómicos foliares

Morfología foliar

La morfología foliar de todas las poblaciones evaluadas fue semejante,

lámina foliar de 8 a 10 cm de longitud, simétrica, ovalada longitudinal, con ápice

y base aguda, siendo ésta decurrente. De margen revoluto abaxialmente con

borde aserrado convexo y con curvas sinuosas. Pecíolo de 1-3 cm de longitud,

brevemente alado (Fig. 1).

Anatomía foliar

Ambas epidermis presentan células de paredes anticlinales sinuosas más

acentuadas en la epidermis abaxial (Fig. 3 A y B) con estomas anomocíticos, en

ocasiones gemelos (Fig. 3 D). Los estomas se encuentran en ambas epidermis,

con mayor densidad en la abaxial.

Los tricomas eglandulares (martillo) con epitricopodio, se presentan en

ambas superficies, son multicelulares uniseriados constituidos por cinco células,

una célula basal elíptica, dos a tres células intermedias comprimidas en sentido

periclinal y una porción distal unicelular acintada (Fig. 3 E).

Tricomas glandulares vesiculosos presentes en la epidermis abaxial, en

depresiones de la lámina foliar. Están formados por una célula basal elíptica y


54

una o dos células intermedias achatadas en el sentido periclinal y una cabeza

glandular subelipsoidal (Fig. 3 F).

Arquitectura foliar

La nerviación es pinnada craspedródroma simple (Fig. 4 A). La nervadura

primaria es de curso recto, las nervaduras secundarias presentan ángulo de

divergencia agudo moderado (50 grados) (Fig. 4 B), de trayecto uniformemente

curvado o con ramificaciones de segundo orden, forman aréolas intercostales.

Las nervaduras terciarias se presentan aleatoriamente, reticuladas. Las aréolas se

presentan incompletamente cerradas lo que permite observar tamaños y formas

anómalas. Las terminaciones vasculares pueden ser simples o ramificadas, una o

más veces (Fig. 4 C). La venación última marginal es curvada (Fig. 4 D).

Respecto a las variables anatómicas evaluadas, el análisis estadístico

muestra los siguientes resultados (Tabla 3):


55

Tabla 3: Valores promedio e intervalos de confianza del 95% para índices estomático

adaxiales y abaxiales.

Índice estomático adaxial Índice estomático abaxial

El Naranjo 11.11 1.04 ab

11.26 1.80 a

Horco Molle 11.33 1.89 ab

14.54 1.23 bc

Leales 10.76 1.53 ab

15.02 1.45 bc

Lules 8.48 2.23 a 14.44 1.51

bc

Raco 12.47 0.57 b 15.38 1.35

c

Sunchal 12.93 1.65 b 15.42 0.84

c

Trancas 11.51 2.06 ab

12.31 0.88 ab

Estadístico F (valor p) 2.90 (0.0147) 6.59 (0.0001)

Nota: medias con iguales letras no difieren entre sí según la prueba de Tukey (α = 0.05)

La tabla 3 muestra que Lules presenta un índice estomático adaxial

significativamente menor (α = 0.05) que Raco y Sunchal. El Naranjo presenta un

índice estomático abaxial significativamente menor (α = 0.05) que Raco y

Sunchal, las que presentan los valores mayores en ambos índices.


56

Tabla 4: Valores promedio e intervalos de confianza del 95% para longitud de estomas,

densidad de estomas e índice empalizada en ambas epidermis en las áreas evaluadas. Localidades Epidermis adaxial Epidermis abaxial

Longitud

estomas

Densidad

estomas

Índice

clorofiliano

Longitud

estomas

Densidad

estomas

Índice

clorofiliano

El Naranjo 22.25 0.51a 2.43 o.53

ab 2.63 0.11

a 23.72 0.53

ab 3.80 0.14

b 2.70 0.27

bc

Horco Molle 27.86 0.34c 2.57 0.10

b

2.07 0.14a 22.43 0.67

a 4.30 0.29

bc 3.00 0.24

c

Leales 25.48 0.27b 2.33 0.09

ab 2.53 0.15

a 23.48 0.73

a 4.47 0.25

c 2.00 0.24

a

Lules 28.44 0.33c 1.97 0.10

a 3.40 0.14

b 25.91 0.55

c 2.93 0.24

a 3.00 0.22

c

Raco 27.35 0.33c 4.23 0.16

d 3.37 0.13

b 26.07 0.47

c 4.03 0.06

bc 3.13 0.24

c

Sunchal 25.25 0.23b 3.17 0.11

c 3.57 0.21

b 23.67 0.78

ab 4.53 0.29

c 2.20 0.25

ab

Trancas 24.97 0.23b 2.00 0.00

a 5.17 0.24

c 25.12 0.96

bc 4.10 0.25

bc 2.67 0.20

bc

Estadístico F

(valor p)

55.30

(<0.0001)

38.49

(<0.0001)

37.32

(<0.0001)

15.07

(<0.0001)

20.6

(<0.0001)

12.84

(<0.0001)

Nota: medias con iguales letras no difieren entre sí según la prueba de Tukey (α =

0.05)

La tabla 4 muestra que la densidad de estomas fue mayor en la epidermis

abaxial en todas las localidades excepto Lules. En la epidermis adaxial es

significativamente mayor (α= 0,05) en Raco y Sunchal con respecto a las otras

localidades. En la epidermis abaxial fue significativamente menor (α= 0,05) en

Lules en relación con las otras zonas.

La longitud estomática fue mayor en la epidermis adaxial que abaxial, en

todas las localidades excepto El Naranjo y Trancas; y cada epidermis presentó


57

diferencias significativas entre localidades. Respecto al índice clorofiliano, fue

mayor en la epidermis adaxial, excepto para las localidades de Horco Molle y El

Naranjo.

-3.00 -1.50 0.00 1.50 3.00

CP 1 (42.0%)

-3.00

-1.50

0.00

1.50

3.00

CP

2 (

30

.4%

)

El Naranjo

Horco MolleLeales

Lules

Raco

Sunchal

Trancas

Longitud de estomas

Densidad de estomas

Indice empalizada

El Naranjo

Horco MolleLeales

Lules

Raco

Sunchal

Trancas

Longitud de estomas

Densidad de estomas

Indice empalizada

Gráfico 1: Biplot del análisis de componentes principales para los promedios de epidermis

adaxial. Números entre paréntesis indican porcentajes de varianza explicada por cada eje.

El gráfico 1 muestra que existe una correlación positiva entre densidad y

longitud estomática en la epidermis adaxial. Se puede observar que la localidad

de Raco presenta los mayores valores de densidad y de longitud de estomas. En


58

Trancas se encontraron los menores valores de índice de empalizada. Las demás

localidades tomaron valores intermedios en todas las variables.

-3.00 -1.50 0.00 1.50 3.00

CP 1 (69.7%)

-3.00

-1.50

0.00

1.50

3.00

CP

2 (

18

.7%

) El Naranjo

Horco Molle

Leales

Lules

Raco

SunchalTrancas

Longitud de estomas

Densidad estomática

Indice empalizada

El Naranjo

Horco Molle

Leales

Lules

Raco

SunchalTrancas

Longitud de estomas

Densidad estomática

Indice empalizada

Gráfico 2: Biplot del análisis de componentes principales para los promedios de epidermis

abaxial. Números entre paréntesis indican los porcentajes de varianza explicada para cada eje.

El gráfico 2 muestra que el primer eje es un contraste entre densidad

estomática e índice de empalizada y longitud de estomas. Existe correlación

negativa entre estas variables. Se observó un claro gradiente de valores en el

gráfico, en el que Lules presentó los menores valores de densidad estomática y


59

mayores de índice de empalizada y longitud de estomas. Sunchal y Leales

mostraron los valores mayores de densidad estomática y los menores de valores

de índice y longitud estomática.

Análisis de caracteres citogenéticos

Meiosis

Del análisis del comportamiento de los cromosomas durante la división

meiótica, en la mayoría de las poblaciones se observó regularidad en la división I

(Fig. 5). Sin embargo en la división II se detectaron asincronías en algunas fases,

según el siguiente detalle: Horco Molle (Fig. 6 A, B, E y G), Raco (Fig. 7 E y N),

Leales (Fig. 8 D y E), Lules (Fig. 9 G) y Tafí del Valle (Fig. 10 C).

Al final de la meiosis se observaron tétradas normales en todas las

poblaciones analizadas (Fig. 11 C).

Mitosis

Los preparados citológicos de células meristemáticas radiculares muestran

un tamaño de cromosomas muy pequeño (1 a 2 µm aproximadamente), lo que

dificulta la confección de cariotipo. Sin embargo, a pesar de la dificultad que

ofrece el tamaño de estos cromosomas, se contaron 32 cromosomas en estado de

metafase (Fig. 12).


60

Viabilidad de granos de polen

El conteo de granos de polen ha dado como resultado una alta viabilidad

(99%) para todas las localidades analizadas (Tabla 5). La morfología muestra

concordancia con el resto de la familia Chenopodiaceae (Fig. 11)

Tabla 5: Porcentaje de granos de polen viables.

Granos viables Granos no viables % viabilidad

Leales 3819 47 98,78

Lules 3770 37 99,03

Horco Molle 2150 20 99,08

Raco 3044 16 99,48

Tafí del Valle 3151 12 99,62

Trancas 3412 11 99,68

El Naranjo 1175 14 98,82

El Sunchal 3526 17 99,52


61

Análisis de caracteres bioquímicos

De la prueba de dosaje de proteínas de Loury se obtuvieron los siguientes

resultados (Tabla 6):

Tabla 6: µg de proteína de cinco localidades obtenidas mediante dosaje de

proteínas de Loury.

Muestra microlitros D.O. 750mm µg proteína

Raco 10 0,028 3,5

20 0,048 6

25 0,073 8,5

30 0,125 14,5

Tafí del Valle 10 0,043 4,5

20 0,045 5,5

25 0,045 5,5

30 0,095 11

Lules 10 0,098 11,5

20 0,111 13

25 0,161 18

30 0,158 17,5

Leales 10 0,064 7,5

20 0,123 14

25 0,158 18

30 0,169 19

Horco Molle 10 0,033 4

20 0,029 3,2

25 0,078 9

30 0,083 10

Se puede observar que con los valores de densidad óptica (DO) obtenidos

con 30 µl de extracto hay cantidad suficiente de proteínas para ser reveladas con

geles de poliacrilamida por lo que se seleccionó este volumen de trabajo. Los


62

microgramos de proteínas correspondientes a este volumen se muestran en la

Tabla 7.

Tabla 7: µg de proteína en 30 µl de extracto para las 5 localidades analizadas.

Muestra D.O. 750 µg proteína

Raco 0,125 14,5

Tafí del Valle 0,095 10,5

Lules 0,158 18,5

Leales 0,169 19,5

Horco Molle 0,083 9,5

La menor concentración corresponde a la muestra de Horco Molle (9,5

µg), entonces para tener en todas las celdas una concentración equivalente a la

menor anteriormente citada, se tomaron volúmenes proporcionales en las

muestras restantes (Tabla 8).

Tabla 8: µl de extracto de cada localidad equivalente a la concentración de 9,5

µg.

Muestra µl de extracto

Raco 18

Tafí del Valle 24,5

Lules 14


63

Leales 13,5

Horco Molle 30

Interpretación de los patrones electroforéticos

En peroxidasas se reveló una banda por cada muestra, estando las 5

bandas a la misma distancia. En la Figura 13 A y B se muestra el gel y en la

Figura 13 C se muestra el zimograma confeccionado con las bandas observadas

en el gel.

En esterasas, se observó una combinación de bandas correspondientes a

esterasas α y β. Se presentaron bandas anchas y oscuras llamadas “shadow” en

todas las muestras, resultando más intensa la correspondiente a Leales. Este

hecho ha sido informado para varias isoenzimas, incluyendo esterasas. Debido a

que no está claro si surgen in vivo ó in vitro, sólo se tomaron en cuenta para el

análisis, las bandas angostas (Fig. 14 A y B).

Se presentaron dos bandas en la muestra uno, correspondiente a Lules (a

2,5 y 3 cm), una banda para la muestra de Raco a 2 cm, una para Horco Molle a

3,7 cm, y una banda a 3 cm compartida por las muestras de Leales y Tafí del

Valle (Fig. 14 C); esta última banda también se encuentra en la muestra de Lules.


64

DISCUSIÓN


65

DISCUSIÓN

Caracteres morfológicos y anatómicos foliares

El patrón de nerviación determinado en hojas tiene concordancia a lo

observado por Costa y Tavares (2006). El margen, ápice y base foliar coinciden

con la morfología foliar típica de esta especie descriptas por Barboza et al.

(2001), Costa y Tavares (2006) y Bonzani et al. (2003). Los caracteres foliares

anteriormente indicados no variaron entre localidades, lo cual es esperable ya

que corresponden a caracteres morfológicos típicos de la especie y poco

influenciables por el ambiente. Aunque Blanckaert et al. (2012) han encontrado

diferentes morfotipos de paico, cultivados y silvestres, aún se encuentran dentro

de los limites normales informados por distintos autores. Una característica

remarcada por Blanckaert et al. (2012) es la longitud de la hoja, que es un

caracter significativo en la identificación de paicos cultivados en México (de

mayor longitud que los silvestres) y evidencia las diferencias morfológicas que

pueden resultar de la selección del hombre en el contexto de la domesticación de

especies silvestres. En esta tesis se seleccionaron caracteres morfológicos (apice,

base, margen, y venación foliar) con el fin de indagar diferencias con el patrón

común a la especie ya que no existían antecedentes de estudios comparativos

dentro de la provincia de Tucumán. Como se mostró en los resultados, no hubo

diferencias respecto al patrón morfológico típico de la especie entre las


66

poblaciones, posiblemente por ser caracteres poco influenciados por el ambiente

y por lo tanto no aportan evidencias de variabilidad fenotípica.

La epidermis muestra un patrón común con la familia Chenopodiaceae

descripto por Bonzani et al., (2003), epidermis uniseriada, células rectangulares

ligeramente convexas en las paredes tangenciales internas y externas, teniendo

las epidermias abaxial células más pequeñas que la adaxial. Según el mismo

autor se reconocen dos modelos epidermicos, dependiendo de la forma de las

paredes celulares: a) modelo sinuoso, con paredes celulares sinuosas en forma

leve a marcada, y b) modelo no sinuoso, con paderes rectas. Todos los ejemplares

analizados en esta tesis concuerdan con el modelo sinuoso que es indicado por

Bonzani et al. (2003) como característico de C. ambrosioides. En estudios

anatómicos realizados en dos especies halófitas de la familia Chenopodiaceae se

observaron células epidérmica poligonales de formas y tamaños variados en

ambas epidermis (Pérez Cuadra y Herman, 2009), lo que evidencia la variación

existente en la epidermis de esta familia. En los resultados obtenidos en el

presente trabajo no hubo diferencias en el tipo de epidermis de todas las

localidades analizadas, a pesar de ser regiones agroecológicas diferentes, por lo

que este carácter no brinda datos de valor a la variabilidad fenotípica de C.

ambrosioides.

Los estomas observados en ambas superficies foliares, de tipo

anomocíticos, coinciden con los encontrados por Barboza et al. (2001). Metcalfe


67

y Chalk (1950) menciona que una misma especie puede mostrar diferentes tipos

estomáticos. El tipo de estomas observados en este trabajo no varió entre las

diferentes localidades, por lo que no estaría influenciado por las condiciones

ambientales donde se desarrollan las poblaciones, y no es un carácter que

presente valor sistemático ni de variabilidad dentro de la especie.

Los tricomas observados pertenecen a dos tipos; el glandular (con cabeza

subelipsoidal) y el eglandular (martillo) por lo que representa una variabilidad

menor que los registrados en los trabajos de Metcalfe y Chalk (1950) , Barboza et

al., ( 2001) y Costa y Tavares (2006). Gattuso y Gattuso (1987) han estudiado la

ontogenia de los estomas y tricomas en C. ambrosioides, describiendo cuatro

tipos de tricomas: tipo I “pelo secretor vesiculoso”, tipo II “pelo secretor no

vesiculoso”, tipo III “pelo pluricelular con una célula basal” y tipo IV “pelo

pluricelular con dos células basales”; encontrándose dentro de cada tipo,

subtipos. Los tricomas glandulares encontrados coinciden con el tipo I, y los

eglandulares con el tipo IV. Los tricomas gladulares y eglandulares se han

observado en ambas superficies y en todas las muestras analizadas, por lo que no

hay diferencia en la morfología de tricomas que nos sirvan para diferenciar una

población de otra. Bonzani et al. (2001), estudiando 11 especies de

Chenopodium, consideran que es muy difícil diferenciar especies de `paicos´

considernado sólo la morfología de los tricomas glandulares.


68

Al evaluar el índice estomático (IE), se calcularon por separado los

valores de IE adaxial y abaxial, resultando mayor el abaxial. Dicho IE varió en

un rango de 8,48 a 15,42 siendo mayor el valor p del IE abaxial según la prueba

de Tuckey. Se observa de esta manera que las diferencias entre ambas caras de la

hoja son significativas y merecen ser medidas por separado.

Por otro lado, las precipitaciones y la evapotranspiración en cada año

pueden alterar la fenología de las plantas, y con ello la expansión foliar. En este

sentido, Wilkinson (1979) menciona que el IE es una característica de

diagnóstico muy utilizada en sistemática de plantas, porque generalmente se

mantiene sin alteraciones. No obstante, Kürschner et al. (1998) y Salas et al.

(2001) mencionan que el IE es una variable que ha sido afectada por condiciones

estresantes, tanto ambientales como nutricionales.

Respecto a los resultados mostrados en los gráficos 1 y 2, el análisis de

componentes principales, permite detectar las relaciones entre índice de

empalizada, densidad y longitud de estomas en ambas epidermis. El análisis

multivariado de los datos, en relación al análisis univariado, muestra que las

relaciones entre estas variables resultaron diferentes en ambas epidermis. En la

epidermis abaxial la correlación entre longitud de estomas y densidad de estomas

es negativa (a menor densidad mayor longitud de estomas), mientras que en la

epidermis adaxial resulta positiva (a mayor densidad mayor longitud de estomas).

No se encontraron antecedentes bibliográficos de análisis similares de relaciones


69

entre estas tres variables, sin embargo se puede observar que las mismas marcan

diferencias significativas entre las localidades estudiadas. En particular y

siguiendo a Wilkinson (1979) se podría tomar el IE como una variable de

selección de fenotipos.

Caracteres citogenéticos

A partir de las observaciones realizadas en las células de mitosis se puede

establecer el número cromosómico 2n= 32, lo que coincide con lo informado por

Giusti (1970) para la región noroeste de Argentina. Giusti indica que el número

básico es de 8, por lo que la especie es tetraploide; pero en trabajos realizados por

Darlington (1955), Kawatani (1950) y Santosh (2011) se registran números

básicos de x= 8 y también x= 9. Por los resultados producidos en este trabajo, el

número básico para las poblaciones de Tucumán es de x= 8 (2n=4x=32). Cabe

señalar que el pequeño tamaño de los cromosomas (1 a 1,5 µ) no permitió la

realización de un cariograma. Se debe aclarar que el tamaño cromosómico muy

pequeño es común en muchas especies de la familia Chenopodiaceae. Según

Giusti (1970), generalmente se acepta que los poliploides ocupan un área más

extensa que las especies diploides relacionadas, y es una razón para la amplia

difusión de C. ambrosioides en todo el mundo y en casi toda la Argentina. El

trabajo también se tornó dificultoso debido a la baja frecuencia con que se


70

encontraron divisiones celulares, especialmente en meiosis. A pesar de esto se

pudo establecer la regularidad en el comportamiento de los cromosomas.

En un estudio hecho por Bhargava et al., (2005), en el cual se realizaron

cariotipos de algunas especies cultivadas y silvestres de Chenopodium (C. album

y C. berlandieri subsp. nuttalliae) se encuentran referencias sobre la dificultad

de realizar los mismos por el pequeño tamano de los cromosomas. Sin embargo

muestra diferencias menores en cariotipos de C. quinoa debido a alteraciones

cromosómicas, principalmente inversiones pericéntricas y translocaciones, las

cuales se han mantenido por autofecundación y son consistentes con cierto grado

de variabilidad en caracteres morfológicos (Risi y Galwey, 1984; Wilson, 1988),

en perfiles proteicos (Bhargava et al., 2005) y registros de RAPD (Ruas et al.,

1999). Esto significa que hay una congruencia entre variaciones morfológicas,

alteraciones cariotípicas, proteicas y RAPD.

Por los resultados citogenéticos podríamos inferir que las poblaciones

estudiadas corresponden a citotipos similares de C. ambrosioides. A pesar de no

haber diferencias en el estudio comosómico realizado en esta tesis, el estudio

integrado es un valioso aporte al conocimiento de Chenopodium ambrosioides,

recomendándose la realización a futuro de algún marcador molecular que pueda

evidenciar diferencias intra e interpoblacionales. Cabe recordar que es una

especie autógama, por lo que es esperable que desde su introducción en la época

colonial en nuestra región la dispersión se haya producido por semillas,


71

sembradas por los habitantes o dispersas por animales, pero a partir de unos

pocos genotipos originales.

En referencia a este último punto hay estudios realizados en C. quinoa por

Kolano et al., (2001) de hibridación in situ con la sonda 45S rDNA , mostrando

dos sitios de hibridación en dos cromosomas homólogos. A su vez, Ruas et al.,

(1999) estudió la relación genética entre 19 accesiones de seis especies de

Chenopodium por RAPD, mostrando que estos marcadores son una herramienta

útil para detectar variación genética dentro del género Chenopodium.

Caracteres bioquímicos

La estimación de la diversidad genotípica de poblaciones de C.

ambrosioides mediante métodos bioquímicos de isoenzimas, desde una

estimación cualitativa a nivel de bandas reveladas, permite tener una idea de la

variabilidad interpoblacional e intrapoblacional. Si se tiene en cuenta que existe

una relación directa entre fenotipo y genotipo, una banda en un gel de

electroforesis corresponde a un alelo de un gen. El número de alelos por locus

puede ser suficiente para establecer la existencia de variación y la frecuencia de

heterocigotas podría estar relacionada con el tamaño de la población (Laurie-

Ahlberg y Weir, 1979).

La presencia de una sola banda en peroxidasas sería un indicador de

homocigosis para éster carácter, debido a que el producto de los alelos que portan


72

cada uno de ellas no son separables mediante el proceso de electroforesis. El-

Shanshoury (2007) caracterizó mediante electroforesis poblaciones de Vicia

sativa ssp sativa, siendo la enzima peroxidasa la que mostró el patrón de

expresión más simple, como un único locus, mostrando una zona de actividad

producida por un alelo homocigota. En concordancia con esto, el resultado del

presente trabajo muestra que las peroxidasas son monómeros que no presentan

variación electroforética.

En cuanto a esterasas y según Market y Moller (1959), y Feldmann

(1984), la banda presente en las localidades de Leales y Tafí del Valle, podría

estar codificada por un mismo alelo, mientras que la banda correspondiente a

Horco Molle y Raco estarían codificadas por alelos diferentes y no presentes en

las muestras anteriormente citadas de Leales y Tafí del Valle. Estos resultados

estarían mostrando que los individuos de la población de Lules serían

heterocigotas. El resto de las poblaciones estudiadas serían homocigotas y, de

acuerdo al fenotipo que se observa en el zimograma, las poblaciones de Leales y

Tafí del Valle que comparten el mismo alelo serían similares genéticamente. Las

poblaciones de Raco y Horco Molle serían homocigotas para diferentes alelos

puesto que presentan una movilidad electroforética diferente, al migrar las

bandas a diferentes alturas.

Feldmann (1984) ha indicado que los sistemas isoenzimáticos de esterasas

y peroxidasas, tan comunes en los vegetales, son suficientes para detectar


73

variabilidad bioquímica. En el presente trabajo se muestra que las isoenzimas

esterasas mostraron un nivel aceptable de discriminación que evidencian

diferencias a nivel bioquímico, que se correspondería con variabilidad a nivel de

genotipos, la cual puede ser advertida a través de sus fenotipos enzimáticos.

Las peroxidasas, al no mostrar variaciones, no serían útiles en la

diferenciación de poblaciones.

Respecto a las bandas oscuras que se observaron en los geles para

esterasas, Wendel y Weeden (Soltis y Soltis, 1989) explican que varios

fenómenos genéticos y no genéticos pueden complicar la interpretación del

zimograma. Uno de los más comunes se debe a la presencia de dobles o múltiples

bandas, que genéticamente se comportan como alelos simples (a menudo se

refieren a éstas como bandas “shadow” o “ghost”). Estas han sido informadas

para varias isoenzimas, incluyendo esterasas (Tanksley y Rick, 1980) y

peroxidasas (Quiros y Morgan, 1981; Rick y Tanksley, 1981; Millar, 1985).

Generalmente no se sabe si surgen in vivo por modificaciones post-

traduccionales o in vitro por cambios quimicos, pero su frecuencia de aparición

hace que se deba tener cuidado en interpretarlas como “duplicaciones de genes”

(Soltis y Soltis, 1989).


74

CONCLUSIONES


75

CONCLUSIONES

Las poblaciones de Chenopodium ambrosioides estudiadas en este trabajo

no presentan variación en los caracteres morfológicos foliares, por lo que éstos

no pueden considerarse de valor como indicadores de variabilidad.

La variabilidad fenotípica encontrada a través del análisis de índice

clorofiliano, densidad estomática y longitud estomática en ambas epidermis,

permite inferir que estos caracteres son buenos indicadores de variabilidad, y que

las poblaciones analizadas son fenotipos diferentes.

En las poblaciones estudiadas no se encontró diferencias en el número de

cromosomas, por lo que a nivel citogenético, no hay variabilidad genotípica entre

las mismas.

En cuanto a la variabilidad enzimática, el hecho que las peroxidasas

presenten una sola banda permite concluir que no son recomendables como

indicadoras de variabilidad genotípica. Sin embargo las α y β esterasas dan

buenos indicios de diferencias en fenotipos enzimáticos entre las poblaciones

analizadas, siendo la expresión de genotipos diferentes y por lo tanto pueden

usarse como indicadores de variabilidad genotípica.


76

FIGURAS


77


78


79


80


81


82


83


84


85


86


87


88


89


90


91


92

BIBLIOGRAFÍA CITADA


93

BIBLIOGRAFÍA CITADA

Alban, C. J. A. 1984. Plantas Medicinales Usadas en Lima para los

Trastornos Digestivos. Informe de Prácticas pre-profesionales para Optar

Título Profesional, Fac. Ciencias Biológicas, UNMSM, Lima, Perú.

Alcorn, J. B. 1984. Development policy, forests and peasant farms:

sellections on Huastec managed forests contributions to commercial

production and conservation. Econ. Bot. 38: 389-406.

Alonso, J. 2004. Tratado de Fitofármacos y Nutracéuticos. Buenos Aires,

Argentina. Corpus Edit. 1350 pp.

Alonso, J. & C. Desmarchelier. 2006. Plantas medicinales autóctonas de

la argentina. Bases científicas para su aplicación en atención primaria de

la salud. Fitociencia. Buenos Aires. 680 pp.

Altieri, M. A. 1997. El rol ecológico de la biodiversidad en

agroecosistemas. Ecología y Desarrollo. 4: 2-11.

Andrada, B.; A. J. Boggiatto; L. G. Auad y M. Collado. 1975. Estudios citogenéticos en el híbrido intergenérico Euchlaena perennis Hitch. Por Zea mays L. I. Análisis mitótico en plantas de dos generaciones. R.A.N.A. 12(3-4): 323- 330. Avise, J. 1974. Systematic value of electrophoretic data. Syst. Zool. 23: 465-481. Blanckaert, I.; M. Paredes Flores; F. J. Espinosa García; D. Piñero y R. Lira. 2012. Ethnobotanical, morphological, phytochemical and molecular evidence for the incipient domestication of Epazote (Chenopodium ambrosioides L.: Chenopodiaceae) in a semi-arid region of Mexico.

Genet. Resour. Crop Evol. 59: 557-573. Barboza, G. E.; N. Bonzani; E. M. Filippa; M. C. Luján; R. Moreno; M.

Bugatti; N. Decolatti y L. Ariza Espinar. 2001. Atlas histo-morfológico de

plantas de interés medicinal de uso corriente en Argentina. Edición

Museo Botánico, Córdoba. 212 pp.


94

Barboza, G. E.; J. J. Cantero; C. O. Nuñez y L. Ariza Espinar. 2006.

Flora Medicinal de la Provincia de Córdoba (Argentina). Museo Botánico

de Córdoba. 1252 pp.

Barboza, G. E.; J. J. Cantero; C. O. Nuñez; A. Pacciaroni y L. Ariza

Espinar. 2009. Plantas Medicinales. Kurtziana 34 (1-2): 368 pp.

Bhargava, A.; S. Shukla y D. Ohri. 2005. Karyotypic studies on some cultivated and wild species of Chenopodium (Chenopodiaceae). Genetic

resources and crop evolution. 53 (7): 1309-1320. Bjorkqvist, I.; R. von Bothmer; O. Nilsson y B. Nordenstam.1969. Chromosome number in Iberian angiosperms. Bot. Not. 122 (2): 271-283. Boggiatto, A. J.; A. B. Andrada y A. M. Zamudio. 1979. Euchlaena perennis Hitch por Zea mays L. Interpretación citogenética de su

fertilidad. R.A.N.A. 16 (1-4): 75-88. Bonzani, N. E.; G. E. Barboza; M. A. Bugatti y L. Ariza Espinar. 2003.

Morpho-histological studies in the aromatic species of Chenopodium from

Argentina. Fitoterapia 74 (3): 207-225.

Brewbaker, J. L.; M. D. Upadhya; Y. Makinen y T. Mac Donald. 1968. Isoenzyme polymorphism in flowering plants III. Gel electrophoretic methods and applications. Physiol. Plant. 21: 930-940. Cañizares, A.; M. E. Sanabria; D. A. Rodriguez y Y. Perozo. 2003.

Características de los estomas, índice y densidad estomática de las

hojas de lima Tahití (Citrus latifolia Tanaka) injertada sobre ocho

patrones cítricos. Revista UDO Agrícola, 3 (1): 59-64.

Catálogo de plantas vasculares de la República Argentina. http://www.floraargentina.edu.ar


95

Cavalli, J.; F. Tomi; A. Bernardini y J. Casanova. 2004. Combined

analysis of the Chenopodium ambrosioides by GC, GC-MS and 13C-

NMR spectroscopy: quantitative determination of ascaridole, a heat-

sensitive compound. Phytochem Anal. 15: 275-279.

Cerrutti, T. 2000. Plantas medicinales. Cultivo, importancia y formas de

uso. EsSalud-IMET. Iquitos, Perú. 304 pp.

Chiasson, H.; C. Vincent y N. Bostanian. 2004. Insecticidal properties of a

Chenopodium-based botanical. J. Econ. Entomol. 97 (4):1378-1383.

Cole, M. J. 1962. Interspecific relationship relations and intraspecific

variation of Chenopodium album L. in Britain. II. The Chromosome

number of C. album and other species. Watsonia. 5: 117-122.

Cooke, R. J. 1992. Handbook of variety testing. Electrophoresis Handbook: variety identification. Published by: The International Seed Testing Association. Chief editor Cooke, R. J. NIAB, Cambridge, U. K. Zurich. Suiza. 46 pp. Costa, M. V. y E. S. Tavares. 2006. Anatomía foliar de Chenopodium

ambrosiodes L. (Chenopodiaceae). Rev. Bras. Pl. Med. Botucatu 8(3): 63

– 71.

D´ Ambrogio de Argueso, A. 1986. Manual de Técnicas en Histología

Vegetal. Ed. Hemisferio Sur.S.A. 83 pp.

Darlington, C. D. y A. P. Wyle. 1955. Chromosome Atlas of flowering plants. George Allen & Unwin Ltd., London. 397 pp. De Wet, J. M. y J. R. Harlan. 1975. Weeds and domesticates: evolution in

the man-made habitat. Econ. Bot. 29: 99-107.

Desmachelier, C. y F. Witting Schaus. 2000. Sesenta plantas medicinales

de la Amazonia Peruana. Ecología, Etnomedicina y Bioactividad. Ed.

Bellido.


96

Di Rienzo, J. A.; F. Casanoves; M. G. Balzarini; L. Gonzalez; M. Tablada

y C. W. Robledo. 2010. InfoStat versión. Grupo InfoStat, FCA,

Universidad Nacional de Córdoba, Argentina.

Dizeo de Strittmater, C. G. 1973. Nuevas técnicas de diafanización. Bol.

Soc. argent. Bot. 15 (1): 126 – 129.

El-Shanshoury, A. R. 2007. Characterization of Infraspecific

Electrophoretic Genetic Variation within Vicia sativa subspecies sativa

Population. Journal of Biological Sciences, 7 (6): 918-924.

Estrella, E. 1988. El Pan de América. Ed. Abya-yala. 300-304 pp.

Feldmann, P. 1984. Analyse du polymorphisme enzymatique de la canne à sucre (Saccharum sp.): utilisation pour la recherche de variabilitè aprés culture in Vitro. Thèse présentée pour obtenir le Titre de Docteur 3e cycle spècialité: Développement et Amélioration des Végétaux. Université de Paris. Sud Centre D’Orsay. Soutenute le 2 Julliet 1984 devant la Comisión d’examen. Frankel, O. H. y E. Bennett. 1970. Genetic resourses in plants – Their

exploration and conservation. International Biological Programme

Handbook. Blackwell, Oxford, Inglaterra. 575 pp.

Frankel, O. H. y J. G. Hawkes. 1975. Crop Genetic resourses for today

and tomorrow. Cambridge Univ. Press, Inglaterra. 495 pp.

Frankel, O. H. y M. E. Soulé. 1981. Conservation and Evolution.

Cambridge Univ. Press, Cambridge, Inglaterra. 329 pp.

Gadano, A.; A. Guni; P. Lopez; G. Ferraro y M. Carballo. 2002. In vitro

genotoxic evaluation of the medicinal plant Chenopodium ambrosioides L.

Journal of Ethnopharmacology. 81 (1): 11-16.

Gadano, A; A. Gurni y M. A. Carballo. 2006. Argentine folk medicime:

genotoxic effects of Chenopodiacae family. J Ethnopharmacol. 103 (2):

246-251.


97

Gangopadhyay, G.; S. Das y K. Mukherjee. 2002. Speciation in Chenopodium in West Bengal, India. Genet. Res. Crop Evol (49) 503–510. Gattuso, S. J. y M. A. Gattuso. 1987. Physis, Buenos Aires, Secc. C: 45-

85.

Gattuso, M. A. y S. J.Gattuso. 1999. Manual de procedimentos para el

análisis de drogas en polvo. Facultad de Ciencias Agraria. Universidad

Nacional de Rosario. 54 pp.

Gay, A. P. y R. G. Hurd. 1975. The influence of light on stomatal density

in the tomato. New Phytol., 75: 37-46.

Germosén Robineau, L. (Ed). 1996. Farmacopea caribeña. Ed. Emile

Désormeaux. Santo Domingo, Rep. Dominicana. 360 pp.

Girault, L. 1987. Kallawaya: Curanderos Itinerantes de los Andes. Ed.

UNICEF-OPS-OMS. 670 pp.

Giusti, L. 1970. El género Chenopodium en Argentina I: Números de

cromosomas. Darwiniana 16: 98-105.

Grainge, M. y S. Ahmed. 1998. Handbook of Plants with Pest-Control

Properties. New York. John Wiley & Sons. 470 pp.

Griffiths, A.; W. Gelbart; J. Miller y R. Lewontin. 1999. Genética Moderna,

MacGraw-Hill, Madrid. 676 pp.

Gupta, N. P. (Ed.). 1995. 270 Plantas Medicinales Iberoamericanas.

Programa Iberoamericano de Ciencia y Tecnología para el desarrollo,

CYTED. Bogotá, Colombia. 617 pp.

Harlan, J. R. 1965. The possible role of weed races in the evolution of

cultivated plants. Euphytica 14: 173-176.

Hart, G. E. y C. R. Bhatia. 1967. Acrylamide gel electrophoresis of soluble leaf proteins and enzymes from Nicotiana species. Can. J. Genét. Cytol.

9: 367-374.


98

Hickey, L. J. 1974. Clasificación de la arquitectura de las hojas de Dicotiledóneas. Bol. Soc. Argent. Bot. 16: 1-26. Holle, M. 1984. Recursos genéticos vegetales de América del sur:

pasado, presente y futuro. Anales Simposio Recursos Fitogenéticos.

Valdivia. UACH-IBPGR.

Homsher, P. J. 1963. Cytogenetic studies in Chenopodium. Am. J. Bot.

50 (6): 621

Johnson, R. y D. Wichern. 1992. Applied multivariate statistical analysis.

3rd edition. Prentice Hall, USA. 761 pp.

Kawatani, T. y T. Ohno. 1950. Chromosome numbers of genus

Chenopodium. Chromosome number of Mexican Tea (Chenopodium

ambrosioides L. var. antihelminticum A. Gray) and some alied species.

Jap. Jour. Genet. 25: 177-180.

Kjellmark, S. 1934. Einige Neue Chromosomenzahlen in der familia

Chenopodiaceae. Bot. Not. : 136-140.

Kolano, B.; L. G. Pando y J. Maluszynska. 2001. Molecular cytogenetic

studies in Chenopodium quinoa and Amaranthus caudatus. Acta

Societalis Botanicorum Poloniae 70: 85-90.

Kürschner, W.; I. Stulen, F. Wagner y P. Kuiper. 1998. Comparison of

paleobotanical observations with experimental data on the leaf anatomy

of durmast oak [Quercus petrea (Fagaceae)] in response to

environmental changes. Annals of Botany 81: 657-664.

Laurie-Ahlberg, C. C. y B. S. Weir. 1979. Allozymic variation and linkage

disequilibrium in some laboratory population of Drosophila melanogaster.

Genetics, 92: 1295-1314.

Lorenzi, H. E. y F. J. Matos. 2002. Plantas medicinais no Brasil/ Nativas e

exóticas. Nova Odessa: Instituto Plantarum. 554 pp.

Lowry, O. H.; N. J. Rosebrough; A. L. Farr y R. J. Randall. 1951. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 193:265.


99

Ma, Q. W.; C. S. Li; F. L. Li y S. V. Vickulin. 2004. Epidermal structures

and stomatal parameters of Chinese endemic Glyptostrobus pensilis

(Toxidiaceae). Bot. J. Linn. Soc., 146: 153-162.

Markert, C. L. y F. Moller. 1959. Multiple form of isozymes: Tissue

ontogenetic and species specific patterns. Poc. Natl. Acad. Sci. (USA) 45:

753-763.

Martinez, M. 1988. Contribuciones Iberoamericanas al mundo: Botánica,

Medicina, Agricultura. Ed. Anaya. 128 pp.

Mehra, P. N. y C. P. Malik. 1963.Cytology of some Indian Chenopodiaceae. Caryologia 16: 67–84.

Metcalfe, C. y L. Chalk. 1950. Anatomy of Dicotyledons Vol I, 1st edition.

Clarendon Press.Oxford. 1500 pp.

Millar, C. J. 1985. Inheritance of allozyme variants in bishop pine (Pinus

muricata D. Don.) Biochem. Genet. 23: 933-946.

Mosyakin, S. L. y S. E. Clemants. 2002. New nomenclatural combinations

in Dysphania R. Br. (Chenopodiaceae) taxa ocurringin North America.

Ukrain. Bot.J. 59(4): 380- 385.

Nabhan, G. P. 1985. Native crop diversity in Aridoamerica: conservation

of regional gene pools. Econ. Bot. 39:387-399.

Ojeda, M. S. 2004. Caracterización de poblaciones y avances en la

domesticación de peperina Mintostachys mollis (Kunth) Griseb. (Tesis

doctoral). Córdoba, Argentina. UNC-FCA.

Okuyama, E.; K. Umeyama; Y. Saito; M. Yamazaki y M. Satake. 1992.

Ascaridole as a phermacologically active principle of “paico”, a medicinal

Peruvian plant. Chem. Pharm. Bull. 41:309-311.

Orstein, L. 1964. Disc electrophoresis, background and theory. Annals New Cork Academy of Sciences, 121: 321 – 349.


100

Pastoriza, A.; A. M. Nasif; L. Martínez Pulido; B. Andrada Mansilla y A. B.

Andrada. 2006. Comportamiento cromosómico en meiosis de dos

especies del género Chenopodium L. Journal of Basic & Applied

Genetics. 17 (2): 102.

Pérez Cuadra, V. y P. M. Herman. 2009. Comparación anatómica de

Nitrophila australis var. australis y Nitrophila occidentalis

(Chenopodiaceae). Su importancia taxonómica. Bol. Soc. Argent. Bot. 44

(3-4): 329-342.

Poole, I.; J. D. B. Weyers, T. Lawson y J. A. Raven. 1996. Variations in

stomatal density and index: implications for paleoclimatic reconstructions.

Pl. Cell. Environm., 19: 705-712.

Prescott-Allen, R. y C. Prescott-Allen. 1981. In situ conservation of crop

genetic resourses: a report to the International Board for Plant Genetic

Resourses. IBPGR, Roma.

Queirós, M. 1973. Contribuicâo para o conhecimento citotaxonomico das

Spermatophyta de Portugal IX. Cruciferae. Bol. Soc. Brot., sér. 2, 47:

315-335.

Quiros, C. F. y K. Morgan.1981. Peroxidase and Leucine-aminopeptidase

in diploid Medicago species closely related to alfalfa: multiple gene loci,

multiple allelism, and linkage. Theor. Appl. Genet. 60: 221-228.

Rajesh, K.; A. K. Mishra; N. K. Dubey y Y. B. Tripathi. 2007. Evaluation of

Chenopodium ambrosioides oil as a potencial source of antifungal,

antiaflatoxigenic and antioxidant activity. International Journal of Food

Microbiology, 115 (2):150-164.

Risi, J. y N. W. Galwey. 1984. The pattern of genetic diversity in the

Andean grain crop quinoa (Chenopodium quinoa Willd.). I. Associations

between characteristics. Euphytica 41: 147-162.

Rick, C. M. y S. D. Tanksley. 1981. Genetic variation in Solanum

pennellii: comparisons with two other sympatric tomato species. Pl. Syst.

Evol. 139: 11-45.


101

Roth, I.; T. Merida y H. Lindorf. 1986. Morfología y anatomía foliar de

plantas de la Selva Nublada de Rancho Grande. Parque Nacional “Henry

Pittier”. El ambiente físico, ecología general y anatomía vegetal. Fondo

Editorial Act. Cient. Venezolana. Pp. 205-241.

Royer, D. L. 2001. Stomatal density and stomatal index as indicators of

paleoatmospheric CO2 concentration. Rev. Paleobot. Palynol., 114: 1-28.

Ruas, P.; A. Bonifacio; C. Ruas; D. Fairbanks y W. Andersen. 1999.

Genetic relationship among 19 accesions of six species of Chenopodium

L., by Randomly Amplified Polymorphic DNA fragments (RAPD).

Euphytica 105: 25-32.

Saidman, B.O. y C. A. Naranjo. 1982. Variaciones de esterasas en poblaciones de Prosopis ruscifolia (Leguminosae). Mendeliana 5 (2): 61-70. Salas, J. A.; M. E. Sanabria y R. Pire. 2001. Variación en el índice y

densidad estomática en plantas de tomate (Lycopersicon esculentum

Mill) sometidas a tratamientos salinos. Bioagro, 13:99-104.

Santos, S. G. y R. X. Correa. 2006. Diversidade genetica de Chenopodium ambrosioides da regiao cacaueira da Bahia com base em

marcadores RAPD. Pesq. Agropec. Bras. 41 (1): 161-164. Santos, J. K. 1925. A pharmacognostical study of Chenopodium ambrosioides Linn. from Philippines. The Philippine Journal of Science. 31: 529-43. Santosh, B.; R. C. Gupta y P. B. Attri. 2011. Cytological studies on the Monochlamydeae from North India. Chromosome Botany 6: 45-51. Sarukhán, J. 1985. Ecological and social overviews of ethnobotanical

research. Econ. Bot. 39: 431-435.

Shiva, V. 1991. The violence of the green revolution: “Miracle seeds” and

the destruction fo genetic diversity. Third World Agriculture, Ecology and

Politics. Third World Networl. 257 pp.


102

Silva-Aguayo, G. I.; R. Kiger Melivilu; R. Hepp-Gallo y M. Tapia Vargas.

2005. Control de Sitophilus zeamais con polvos vegetales de tres species

del género Chenopodium. Pesq. Agropec. Bras. Brasilia. 40 (10):953-

960.

Silvestre, S. 1984. Números cromosómicos para la flora española.

Lagascalia 12 (2): 298-303.

Soltis, D. E. y P. S. Soltis (Ed.). 1989. Isozymes in plant biology.

Advances in Plant Sciences Series, vol. 4. Dioscorides Press. Oregón,

USA.

Stace, C. A. 1965. Cuticular studies as an aid to plant anatomy. Bull. Br.

Mus. (Nat. Hist.) Bot., 4: 1-78.

Tanksley, S. D. y C. M. Rick. 1980. Genetics of esterases in species of

Lycopersicon. Theor. Appl. Genet. 56: 209-219.

Tanksley, S.D. y T. J. Orton. 1983. Isozymes in plant genetics and breeding. Part B. 472 pp. Tapondjou, L. A.; C. Adler; H. Bouda y D. A. Fontem. 2002. Efficacy of

powder and essential oil from Chenopodium ambrosioides leaves as

post-harvest grain protectants against six stored product beetles. Journal

of stored products research. 38 (4): 395-402.

Vervoost, F. 1982. XVIII Jornadas Argentinas de Botánica. Simposio

Conservación de la vegetación natural en la R. A. Mapa de la vegetación

de la provincia de Tucumán. Serie Conservación de la naturaleza, F. M.

L. 2: 9-24.

Viesca, C. 1984. Prevención y Terapéuticas Mexicanas en Historia

general de la Medicina de México. Tomo I México Antiguo. Univ. Nacional

Autónoma de México. 212 pp.

Wendel, J. F. y N. F. Weeden. 1990. Visualisation and interpretation of

plant isozymes. Pp 5-45 en D. E. Soltis y P. S. Soltis, eds. Isozymes in

plant biology. Chapman and Hall, London.


103

Williams, W. 1965. Principios de genética y mejoramiento de las plantas.

Ed. Acribia. Zaragoza, España.

Wilkes, H. G. 1983. Current status of crop plant germplasm. CRC Crit.

Rev. Pl. Sci.1:1 33-181.

Wilkinson, H. 1979. The plant superface (mainly leaf). In: C. R. Metcalfe y

Chalk (eds.) Anatomy of Dicotyledons. Oxford, Claredon Press. London,

pp. 97-165.

Wilson, H. D. 1988. Quinoa and relatives (Chenopodium sect. Chenopodium subcet. Celluloid). Econ. Bot. 44 (3): 92-110. Woodward, F. I. y F. A. Bazzaz. 1988. The response of stomatal density

to CO2 partial pressure. J. Exp. Bot., 39: 1771-1781.

Zar, J. 1996. Biostatistical analysis. 3rd Edition. Prentice Hall. 663 pp.

Zuccardi, R. B.; y G. S. Fadda. 1985. Bosquejo agroecológico de la

provincia de Tucumán. Misc. 86. Facultad de Agronomía y Zootecnia,

UNT.

Zuloaga, F. y O. Morrone. (Ed.). 1999. Catálogo de las plantas

vasculares de la R.A. II. Missouri Botanical Garden Press. V. 74. 621 pp.

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