(PO) VITRIFICACIN DE EMBRIONES DE DORADA (Sparus aurata): EFECTO
DE LAS SOLUCIONES CRIOPROTECTORAS Y DEL PROCESO DE CONGELACIN /
DESCONGELACIN Cabrita, E1.; Robles, V2.; Cuado, S2.; Sarasquete,
M.3; Herrez, M.P.2 1Faculdade de Ciencias do Mar e do Ambiente,
Universidade do Algarve, 8000 Faro Portugal, [email protected]
2Depto de Biologia Celular, Facultad de Biologa, Universidad de
Len, 24071 Len, Espaa, [email protected] 3ICMAN-CSIC, 11510 Puerto
Real, Cdiz, Espaa, [email protected] Introduccin La
criopreservacin de embriones de peces es una tcnica de indudable
valor para la acuicultura. Hasta el momento, y a pesar del gran
xito de la congelacin de embriones de mamferos aun no se han
conseguido resultados con embriones de peces. Se han realizado
estudios en pez cebra (Zhang et al., Robles et al. 2003), carpa
(Ahammad et al. 2002) y rodaballo (Chereguini et al. 1996, Cabrita
et al. 2003, Robles et al. 2003), permitiendo de este modo
identificar los problemas especficos que dificultan la aplicacin de
la criopreservacin a embriones de telesteos. En primer lugar, su
pequea relacin superficie/volumen dificulta la velocidad a la cual
el agua y los crioprotectores pueden salir o entrar al embrin
durante los pasos de exposicin a los crioprotectores. En segundo
lugar, un sistema complejo de membranas delimita distintos
compartimentos en el embrin, produciendo diferencias de
permeabilidad entre estos. El tercer problema reside en la gran
cantidad de vitelo presente en estos embriones que aumenta su
susceptibilidad al fro. Varias estrategias han sido aplicadas para
intentar criopreservar embriones de peces marinos o de agua dulce.
La vitrificacin, o congelacin ultrarrpida se presenta como una
alternativa a la congelacin tradicional y permite eliminar los daos
asociados a la susceptibilidad al fro y a la formacin de cristales
de hielo. Esta tcnica se ha desarrollado en embriones de mamferos
con bastante xito y representa en la actualidad una de las
perspectivas de futuro para la congelacin de embriones en peces.
Material y Mtodos En el presente trabajo, se han desarrollado
varios protocolos de vitrificacin diseados para embriones de peces
y se estudi su efecto sobre dos estadios embrionarios de dorada. Se
ha estudiado el efecto de la adicin de las soluciones
vitrificantes, as como el de la congelacin/descongelacin. Con este
propsito se han utilizado varios lotes de embriones de dorada que
fueron expuestos a cada una de las soluciones vitrificantes. La
incorporacin de los crioprotectores se realiz en 4 pasos,
sometiendo lotes de 100 embriones a una solucin de 2M de
dimetilsulfoxido (DMSO), en el segundo paso a 3M de DMSO, en el
tercero a 5M de DMSO + 1M de etilen glicol + 2M de metanol, y en el
ltimo paso a la solucin vitrificante que contena 5M DMSO + 1M
etilen glicol + 2M metanol conjuntamente con uno de los siguientes
crioprotectores: 10% sacarosa, 5% de PVP (polivilnilpirrolidona) o
2% de X-1000 (inhibidor de la formacin de hielo). Posteriormente
parte de los embriones fueron lavados con agua de mar en una malla
de 150m para eliminar la solucin crioprotectora e incubados en
pequeos incubadores a 18C con flujo constante, hasta un da despus
de la eclosin. Paralelamente, y tras la exposicin al protocolo de
incorporacin anteriormente mencionado, se envasaron aproximadamente
20 embriones por pajuela, utilizando volmenes de envase de 0.5ml y
de 1ml. La vitrificacin se realiz colocando directamente las
pajuelas en nitrgeno liquido (-196C). Se congelaron 10 pajuelas por
solucin y envase. Para la descongelacin de los dos tipos de
pajuelas se utiliz un bao termostatizado a 0C o a 25C. Tras la
descongelacin los embriones fueron lavados cuidadosamente en
sucesivos baos de agua de mar con el fin de eliminar los
crioprotectores. Se observaron y registraron fotogrficamente las
principales alteraciones morfolgicas provocadas por la exposicin a
los crioprotectores y por la vitrificacin y se incubaron tal como
se ha descrito anteriormente. Se determin el porcentaje de
embriones morfolgicamente intactos y el porcentaje de eclosin tras
cada tratamiento. Las diferencias significativas entre los
distintos tratamientos fueron determinadas mediante ANOVA y el test
estadstico SNK. Resultados y Discusin Se observ que la exposicin a
las soluciones vitrificantes provoca daos en algunos estadios
embrionarios y que las principales alteraciones morfolgicas
registradas se encuentran asociadas al saco vitelino y a las clulas
embrionarias. La vitrificacin produjo una disminucin significativa
del porcentaje de embriones morfolgicamente intactos cuando fue
comparado con los resultados obtenidos tras la exposicin a las
soluciones vitrificantes sin realizar el proceso de
congelacin/descongelacin. Una de las principales alteraciones
registradas fue la rotura de los embriones, la cual posiblemente se
encuentre relacionada con la presencia de pequeos cristales de
hielo en el interior debido a una insuficiente incorporacin de
crioprotector. Este hecho se registr en todos los protocolos de
vitrificacin ensayados, incluso utilizando envases de menor
volumen, en los cuales la velocidad de congelacin es ms rpida.
