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XXXI CURSO INTERNACIONAL DE EDAFOLOGIA Y BIOLOGIA VEGETAL
BIOMARCADORES EN SEDIMENTOS RECIENTES
Angela Mancha Jiménez, Julio de 1994
Instituto de Recursos Naturales y Agrobiologia de Sevilla (IRNAS) Consejo Superior de Investigaciones Cientificas
I.
II.
II.l.
11.2.
INDICE
INTRODUCCION ...••••..•.•••••.•••.•.••..•••••••.••••.••.•••• 1
TRABAJOS DE INVESTIGACION y RESULTADOS •••••••..•.••••••.••• 4
TECNICAS y PROTOCOLOS UTILIZADOS .••••••.••••••...•••••...•• 4
ANALISIS DE SEDIMENTOS DE ORIGEN DIVERSO Y
DISCUSION DE LOS DATOS MAS RELEVANTES ••••••••..•••••••.•••• 9
11.2.1. Origenes y caracteristicas de las muestras ••••...•••••••••• 9
11.2.2. Parámetros fisicoquimicos .•••••••••••••••••••.••..•••••••• ll
11.2.3. Análisis de la composición mineralógica ••••••.••.••••••••• 14
11.2.4. Análisis de componentes mediante GC y GC/MS ••.•••..•••.••• 15
11.3. RESULTADOS OBTENIDOS DE LA EXPERIENCIA DE CULTIVO •.•.•.••• 23
11.3.1. Parámetros fisicoquimicos •••••..•.••••••••••••••..•••••••• 25
11.3.2. Composición mineralógica •••••••.••..••...•••••.•••..•.•••• 31
11.3.3. Composición lipidica •••••••••••••••••••..•••••••.•.••••••• 32
11.4. Otros análisis de sedimentos acuicolas •••••••..•..•••••••• 48
111. ACTIVIDADES COMPLEMENTARIAS •••••••••••••.••.••••••••.••..• 53
IV. PREVISIONES DE FUTURO •••••••••••••••••.•••••••••...••••••• 56
l. INTRODUCCION
El presente Informe recoge los resultados de la labor
investigadora desarrollada en el primer semestre de 1994,
incluidos en un balance resumido del conjunto de actividades
llevadas a cabo hasta ahora durante el tiempo de vigencia del
Convenio (1992-1994).
Asimismo, se detallan en esta Memoria las actividades
complementarias a la investigación en las que ha participado el
personal científico adscrito al proyecto.
Por último se describen las actividades a realizar a corto
plazo, y se sugieren líneas de actuación a más largo plazo, que
permitirían aprovechar adecuadamente la experiencia adquirida en
este tipo de estudios.
Este Proyecto de Investigación se inicia a la firma del
Convenio en Junio de 1992, y no contaba con ningún tipo de
antecedentes, si se exceptúa la amplia dedicación de los
investigadores del lRNAS al estudio de la materia orgánica de
suelos, residuos orgánicos y sedimentos carbonosos.
En el Plan de Trabajo diseñado se contemplaron dos tipos de
actividades fundamentales a desarrollar en fases sucesivas:
a) La caracterización y determinación de parámetros
específicos en sedimentos que puedan tener un efecto
limitante en el cultivo de especies concretas.
b) La monitorización y diagnóstico de procesos
degradati vos de los sistemas acuícolas, del medio
sedimentario en particular, como consecuencia de las
prácticas de manejo de los mismos.
_Í-
Entre los diversos componentes del sistema que mejor
reflejan la calidad del mismo y la presión ambiental externa, se
adoptó el SEDIMENTO como objeto prioritario de estudio, sin
olvidar que las determinaciones en el mismo deben ser
correlacionadas con las realizadas en la columna de agua y en la
interfase agua-sedimento.
Durante la primera fase se hizo una prospección de áreas
potenciales de estudio y se seleccionaron un conjunto de
muestras, con el fin de optimizar los métodos y técnicas
instrumentales de análisis.
Dicho muestreo se llevó a cabo en instalaciones acuicolas
(parcelas experimentales de cultivos marinos en zonas abiertas
y confinadas), yen zonas abiertas contiguas a los cultivos, como
rios y caños del entorno, todas ellas ubicadas en las
instalaciones del Centro de Investigación y Cultivos de Especies
Marinas "El Toruño", situado en El Puerto de Santa Maria, Cádiz.
Se procuró hacer la elección atendiendo a la máxima variabilidad
ambiental (en las condiciones de oxidación-reducción, flujos de
agua, etc.) dentro de la natural homogeneidad del entorno, para
asegurar que encontariamos un amplio rango de valores en los
diferentes parámetros que se estudiarian a lo largo del trabajo.
Entre las innovaciones metodológicas ensayadas destacan los
estudios sobre métodos alternativos de derivatización y
saponificación de los extractos lipidicos, que fueron comparados
en eficacia con los métodos convencionales.
Los resultados de estos estudios se presentaron en los
Informes de Progreso del segundo semestre de 1992 y del primer
semestre de 1993.
En el primer semestre de 1993 se inició un estudio detallado
de las variaciones que se producen en las características fisico
químicas y biológicas de los sedimentos, durante una experiencia
de cultivo de especies marinas, diseñada por técnicos de Pemares.
Los resultados finales obtenidos en esta experiencia se
resumen en el presente Informe, aunque más adelante serán objeto
de discusión detallada y difundidos convenientemente.
Además de los descritos se han llevado a cabo otros
trabajos de investigación relacionados también con la
determinación de parámetros ambientales en sedimentos acuícolas,
cuyos resultados se exponen también en esta Memoria.
II. TRABAJOS DE INVESTIGACION y RESULTADOS
II.l. TECNICAS y PROTOCOLOS UTILIZADOS
Se describen a continuación resumidamente los métodos
experimentales utilizados en el análisis de los sedimentos
acuícolas:
Preparación de las muestras para el análisis
Se ha seguido la norma general de mantener los sedimentos
éongelados hasta el inicio de su preparación para los análisis.
Para ello las muestras se' congelaron a -20·C inmediatamente
después de su toma en recipientes de cristal lavados con mezcla
crómica, y se mantuvieron en la oscuridad para evitar posibles
cambios en la materia orgánica, causados por fotoxidación o por
acción bacteriana.
El primer paso tras la descongelación es la completa
eliminación de agua, presente en mayor o menor medida en todas
las muestras. Este proceso se ha llevado a cabo por liofilización
para evitar las frecuentes alteraciones que provoca en la materia
orgánica lábil el secado por encima de los 60 oC. Por término
medio, el secado por liofilización se realiza durante 24 horas.
Una vez secos se eliminaron manualmente componentes extraños
(conchas de bivalvos en algunos de ellos), y se molieron en un
mortero de cerámica. Finalmente se pasaron a través de un tamiz
de 1 mm de luz de malla, suficiente para garantizar la
homogenización de las muestras, aumentar la superficie de
contacto y el rendimiento de las extracciones.
Análisis de la fracción mineralógica
La caracterización de la fracción mineralógica de los
sedimentos se realizó por difracción de Rayos X mediante el
método del polvo cristalino, que se basa en la capacidad de los
cristales para dispersar los RX. Las muestras ya liofilizadas y
homogeneizadas se trituraron de nuevo en un mortero de ágata para
conseguir un fino tamaño de partícula, requerido para este tipo
de análisis. El equipo utilizado fue un Difractometro D-501
Modelo Siemens
Determinación de Materia Orgánica Total nutrientes y metales pesados
(MOT) ,
La MOT se ha determinado por los métodos de calcinación (a
550 e durante 16 horas) y oxidación con dicromato potásico.
Se ha realizado el análisis de los macronutrientes,
micronutrientes y metales pesados por los métodos convencionales
de análisis de suelos.
Extracción y fraccionamiento de las lipídicas
fracciones
Para el análisis de la fracción lipídica, que contiene la
mayor parte de las familias de compuestos de orígenes diversos
que pueden utilizarse como biomarcadores, se seleccionó el
protocolo que se presenta en la fig 1.
SEDIMENTO
Soxlot (lOh) I Cl.CU.:MeOfl (:1:1)
-r- ~ Lipidou Rouiduo
saponificación 12% KOfl/MeOH (5h)
t ~ Y.Neutra P.Acida
t Darivatlzación J ce/f.'lO GC/HS
Figuru 1
ce/nD Ge/lis
Aquellos extractos que presentaban precipitados y un color
verdoso (indicativos de la presencia de pigmentos y esteroles de
alto peso molecular) se purificaron mediante cromatografía de
adsorción.
Para la determinación específica de ésteres metílicos
de ácidos grasos (FAMES), hemos adaptado a nuestras muestras un
método de extracción y metilación 11 in si tu 11 desarrollado
recientemente para el análisis de material biológico. Dicho
método consiste en calentar a 80 o C durante 2 h una cantidad
determinada de muestra junto con un reactivo específico formado
por la mezcla siguiente: metanol-heptano-tolueno-2,2-
dimetoxipropano-H2 S04 (39:34:20:5:2 en vol.). Se deja enfriar la
mezcla y se separan las dos fases obtenidas, quedando los ácidos
metílicos de ácidos grasos en la fase de heptano.
Separación e identificación de las mezclas componentes mediante Cromatografía de Gases Espectrometría de Masas.
de y
Las separaciones se han llevado a cabo en columnas capilares
de sílice fundida de 25 y 50 m de longitud (0.2 mm de diámetro
interno), impregnadas de OV-IOl instaladas simultáneamente en un
Cromatógrafo de Gases Hewlet Packard 5890, con detector de
ionización de llama (FlD), yen el sistema GC-Espectrometría de
Masas-Computador HP 5988.
El conjunto de parámetros seleccionados para la separación ,
de las muestras de componentes se recoge en la tabla l.
'l'lI.blll l. Condiciones crorrlQtoqnHl.cas utilizadas PU'¡¡ lu sopnración o ldentificnción do componontes on los extractoD lipidicOli.
~u fQmdOT(H1) Gil f'9r\~d9r[ft) Moo&!idl~ di ¡~yecdon Telp. dHeetQr flP hlP' ¡ml¡J di Inyecci6n Purql ~Il Hpt~1 hlp, !ny~«lón
Tnp. lnlcll11ll1 V:JlXldld hm~ 10) flUp-Q ¡ mI rup. tlnd rm 1¡Uf"" ¡\ t(2) V~loeldl'l' butl mI Mm df ¡Qn!ucJ~n VQJtijt di !or,l¡,dón VolUit d~l Ivltip¡¡n~r ia.'!YO di JUU V~IIX!dld ~I hrr!M Ulbrd di dttl«16n df UUI
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"'" 1 Jl¡IJA
hp.¡cto tltrtrilnj~ 10 ,v
'00'" llHOO IIU i~lIIll'
m ,,"IAW
Para incrementar la volatilidad de los muchos componentes
polares presentes en las fracciones ácida, tales como ácidos
grasos, esteroles, etc., y facilitar su separación por columnas
apolares, utilizables a altas temperaturas, es necesario recurrir
a diversos métodos de derivatización. Los empleados en este
trabajo han sido los siguientes:
* Metilación con diazometano: especialmente recomendado
para metilar los grupos carboxílicos de ácidos grasos. El
procedimiento consiste en hacer pasar diazometano etéreo
producido "in situ", por una suspensión de la muestra a metilar
en metanol hasta que ésta toma color amarillento. El diazometano
se prepara haciendo reaccionar N-metil-N-nitros-p-toluen
sulfonamida (diazald) con dietilenglicol-monometil-éter
(carbitol) en un tubo de ensayo en medio alcalino. El proceso
se repitió varias veces para asegurar una metilación completa de
la muestra.
* Silanización con N.O-bis-(Trimetilsilil)-
trifluoroacetamida (BSTFA): se emplea para silanizar los grupos -
OH de alcoholes ,esteroles, etc. A la muestra a derivatizar se
le añaden 0.5 mI de BSTFA y se agita hasta disolución. Antes de
inyectar se calienta a 75 ·c durante 20 minutos, se evapora la
mezcla y se redisuelve en cloroformo.
La identidad de cada componente se determinó por comparación
de sus espectros de masas con la de sustancias patrones
inyectadas en las mismas condiciones, con los existentes en
tablas (EPA/NIH Mas Spectral Data Base) y en las librerías del
ordenador (NBS Spectra) o con espectros publicados anteriormente
en la bibliografía. Componentes de algunas series homólogas
fueron detectados mediante la técnica de monitorización de ión
simple (SIM, single ion monitoring), que permite visualizar en
el barrido de masas sólo aquellos fragmentos característico~ de
determinadas clases de compuestos, lo que aumenta notablemerlt~,
la sensibilidad del análisis.
II. 2.
11.2.1
ANALISIS DE SEDIMENTOS DE ORIGEN DIVERSO DISCUSION DE LOS DATOS MAS RELEVANTES
Origen y características de las muestras
y
Como se indicó en la Introducción, la primera fase del Plan
de Trabajo consitió en el análisis de una serie de muestras de
sedimentos de origen diverso. En el mapa de la figura 2, de la
granja marina del CICEM "El Torufto" y su entorno próximo, se
indican los puntos de muestreo.
¡Jhl:!1 JUNTl\ DE IH1Ui\LUClI\ (cmrpiJ ó: N¡"kv/f.I.n r p('{.l
H:/v'V1~" C..ICl: lo( lllOrrut.Q
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Figura 2.
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RESERVA DE ,AGUA í ... ¡"
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1 Ofl(III ... ·. Y LAOOH/I.IOI!IO':. 111A'I( 01' PJlOOUCCION
u SfMlllfRO F"lOT.o.rI1( CE I-lO~vS(O~
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c...-:"J " OC AUH(NI..,ClOU n (A$,o. Di 801-1811,$ _ la COMPUERTA DE OESAGt!f 11 COMPUfRTA UE~AOO flnER"'" O( ... W' 20 (SlACION ME1fOROLOGIC.o. ~1 PUENTE . n CARRETERA
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Ot: Acceso DE CRIA Of ClJt.lIVO Oto PfCE~ 1
OE ~o\US" O! Ilft1(t-IIA
111. In ''''N¡\l(S Clf ft-rGO"('lf
Las muestras fueron tomadas en la superficie de los
respectivos sedimentos (profundidad de hasta 10 cm como máximo),
que es donde se encuentra la mayor parte de la materia orgánica
de nuestro interés, tales como las acumulaciones de productos de
desecho, de sobrealimentación, metabolitos, etc. Dos de las
muestras, las situadas en el Rio San Pedro, fueron tomadas con
"core" a mayor profundidad, 20 cm, para compararlas con los
respectivos sedimentos superficiales. En la tabla 11. se detallan
las caracteristicas de cada una de las muestras.
Tabla Il Curacteristlcas de l.as muost!'OB.
H'UtsTl/J. ORI01ll DfSCRI~¡O~ ChR.icrER:S~ICn
I)RV.l. Granja Roservil Sediaento seco y cuutedOO¡ ~~(O no arado. peures interior de
agua.
!)N. Granja Canal de Seduento scca¡JQ y ar~(jo. Er ;~ (eeba de Puares engordo, t~estreo inundado por dqua de lluva y
filtraciO/le:> de ~gua salada. )jQ contiene ní~gUn cultivo.
3)1 ... 2,} , Granja Estanque de Se<Jinnto secadO aNdo y hvaoo antes de la Pnans Ctlltivo de SiQlbra, btanquQ s01e~i(jo a f!lJjQ CQntlnuo
, ahejas. Ije ~qlJ~ y tdpi¡~do p<)t l:crQ~,q~s,
llRY.2. Crdn)~ I Reserva Reserva lleM ,,:~ agua pe~HI1~nelente. W PnHH uterlor de captaclón de: agua S9 hace por oolOOQ del
, agua. Rlc San P~dro
$) r. 1. cano de Swhento ~u':$tr~ tOldaa en el nivel l~ClO de !~ !on~
S~ncli· nalur~J . il\ten~re~l, y por l~nlO sOIHi¡Ja ~ ~rlod05 p~tri , ~ecos (horas J,
,)r.!. Ca,~o d~ St\III~nto lI~enr~ tOHd~ ~n el n¡vel inferior de li Sanctj· nitl,lnl. lona jnterure~!, fXlr :0 que rarnente st I PeteJ de1>cubre Con l~s ureas, Durarte todo el afio
, S~ encuentra tapj!~do J~ illj"N mlHm
l)T. I c,n, d. Stdaento )(Jcstra tOHda en e! n:'1el leClo de la fOlla S<lnC~I' tranS[¡¡rlJilo 11terlHNl. B~ ~jdo c~ltJ'{~d~ UJl~ sol~ vel, PHrJ con ucna ~n So) h4 le¡c~~do el !anqc orJ(¡it~~ con Huna
1 IHl ~O. ~.íddld~. Se 3prccia qrLlIl cdnt!ódd de
1 CU.1!í_lWil!~~_
i 3).R.SP.1. R!Q San Seoacnto )l~~str~ toud~ en el n:'1b J~~:O d~ Id lona I Pedro tr~nsrorudQ intenan"d!. ~s<Jij h~cc tres !'Jos no hay
;1 en 19U. cIl!tiyo, tJ farljO nHl.ull esl~ le¡c:~do con el ~\!str~to ~fldljldo. s~ ~preciol qno
I c~nt idad de :i.<:(Q~ili.LlLi.LWDJ y p"] lt¡\leloS, I(u~s\r~ to;~dÍJ en la su~er[lcle, 1
9)R,5P,2. Rico san SNucnto I(\,estrd toud~ er, el n;ve] WilO de ¡Il lon~
,edro nHuu). jnt~ndrea!. I(uestra touda e/l h st.:~rficle.
lO)R.SP,l.C. RJo San $edaento )lvestra tOl4d~ en el n¡\'c¡ Jeo.o d~ la lona 'edrO transfonado J/lt~mnJl. ~sde Mce tres aros no hay
11
en 1m. Cl.ltiYQ. E: [~nqo natural estJ !Hc1aCio con
11 el ~ustrato a~~d,do. Se aprec-:cl qran c~r¡t;dad de :ifr~~.;.L0..J.'!l y
I F"¡ :quetos, H'.!mra lOHd~ a 20 el de i ! pr'lr·.nd¡daO, I I
l1)I.$'.!.C. R:o ~n &l.>dllento I )loc~~r~ tOlad,) er ~J /1: I~l leo,'} d~ la lona ! P~o nHural. ¡ inururea!. )lue~t(a l~Jada ~ ~O c. ~~ ¡
I : pOrUJld¡d~J
II.2.3. Parámetros fisicoquimicos.
En la tabla III se presentan los resultados de la
determinación de Materia Orgánica Total (MOT) por el método de
calcinación y por via húmeda (método de la oxidación con
dicromato) y los valores de pH y contenido en carbonatos.
Tabla III. Porcentajes de HOT calculados por calcinaci6n y por oxidación con dicromato, de carbonatos y contenido en pH de las Illuostrus do sedimentos de origen divor8o.
Huestra HOT por HO'I' por I Carbonato ¡ calcinación (%) oxidación (l) e\)
l)RV.l, 9.8<1
2)R-6. 9.25
3 )Z. 2. 3. 10.85
4 )RV. 2. 8.83
5)F.l. 7.30
6)F.2. 6.79
7)T 10.98
8)R.SP. 10.94
9)R.SP. 6.06
lO)R.SP.l.C 5.06
1l)R,SP.2.C 4.66
RV: reserva de aqua R y Z: estanques productivos FI odn~l de Sanet! Petri RSP¡ R10 San Pedro
:.60 I 13.4
1. 90 12.5
1. J 4 19. 1\
1.1ll 18,6
2.07 11, O
2,78 , 14.5
1. 55 i 18,9
2.0"1 I 16.4 I
0.79 17, O
1 . .¡B 17.7
I 17 19. !:> ----
pI!
7,60
7,130
8.00
7,80
8.00
8.JO
8,20 1I 8. '0 I1
8.20-1
8.10 ~
8.,0.J
Como es de esperar para este tipo de sedimentos, se observa
que los valores obtenidos utilizando el método de calcinación son
entre 5 Y 10 veces más elevados que los obtenidos con el método
del dicromato. Esto se debe a que en el porcentaje de C orgánico
total, determinado por calcinación, se incluyen fracciones de C
inorgánico (carbonatos principalmente) y C orgánico "inerte" a
la oxidación \presente en bio-geolipidos de elevado peso
molecular. La potencial gran variabilidad de las contribuciones
de estas formas de C a la MOT, explica asimismo que no exista una
correlación directa entre ambos grupos de valores.
Refiriéndonos exclusivamente a los datos de MO oxidable, los
de mayor interés para nuestro trabajo, se observa que las
muestras de sedimento natural muestreadas en distintos puntos de
la zona intermareal en el Caño de sancti-Petri (F. l. y F.2.)
presentan los contenidos más elevados de MO. Cuando este
sedimento se transforma con arena (muestra T) el contenido de MO
es lógicamente menor. Esta tendencia se invierte cuando la
transformación del sedimento se realiza con un sustrato orgánico,
como se observa claramente en los sedimentos del Río S. Pedro,
de los cuales el sedimento natural (RSP 2) presenta un valor muy
inferior (0,79 %) al transformado (2.07 %). No existe una
explicación clara al hecho de que en estos sedimentos se invierta
la tendencia al considerar las muestras tomadas a distintas
profundidades, es decir, que en el sedimento transformado es
mayor el contenido en MO en la superficie, mientras que en el
natural ocurre al revés.
Los demás sedimentos presentan valores normales de MOT,
aunque es de señalar que no sea más elevado el contenido del
estanque Z.2.3., que estaba tapizado de microalgas.
En la tabla IV se presentan los contenidos en
macronutrientes, oligoelementos y metales pesados, de las
diversas muestras de sedimentos muestreadas originalmente.
I--,!UESTRA N % P % K % Ca % "g % Na % Fe (,,,,, >In(ffm Znl! ,)cuh )cr Ni 1)RV.1. 0.09 0.09 3.1 7.3 2.17 1. 95 49080 1298 88 46 116 68
2)R-6 0.06 0.06 1.8 9.1 1. 69 3.20 27608 1084 35 27 60 42
3) Z. 2.3. 0.08 0.04 2.2 8.2 0.18 1. 19 2968 495 83 36 63 42
4 )R. V. 2. 0.10 0.04 1.5 9.5 0.14 1 .47 20842 388 73 24 40 26
5) P.1. 0.08 0,04 1.5 1.3 5.23 0,10 14167 162 57 19 27 19
6)P. 2. 0.15 0.10 2.3 7.1 1.43 1. 82 37106 520 78 43 88 .9
7)T 0.10 0.06 1.5 8.1 0.12 1. 33 18353 202 69 26 37 26
8)R.SP.1. 0.15 0.06 1.5 9.9 0.13 1. 67 21338 431 91 36 '4 27
9)R.SP.2. 0.05 0.04 1.3 7.9 0,08 1.26 16751 277 60 2. 34 23
10)R.SP.l.C 0.06 0.04 1.2 8.3 0.82 0.92 16501 613 20 22 '1 25
11)R.SP.2.C 0.06 0.0' 1.2 9.5 0.91 1.59 J 'la:!. 7 615 36 21 41 29
Tabla IV. Contenido en macronutrientes (%), micronutrientes (ppm) y metales pesados (ppm) de las muestras de sedimentos de origen diverso.
En la tabla V se presentan los porcenta jes de extractos
totales de lípidos, y el reparto de los mismos en las
subfracciones neutra y ácida.
Tabla V. Porcentajes del extracto lipídico y su distribución en fracciones acídas y neutras, todo referido al peso de MOT.
MUESTRA EXTRACTO F. NEUTRA F.ACIDA
1) R.V.1. 11.96% 51% 48%
3) Z.2.3. 2.40% 20% 80%
4) RV.2. 8.43% 70% 30%
5) F.1. 2.90% 60% 40%
6) F.2. 11. 70% 52% 46%
7) T. 11. 09% 55% 45%
8) R.SP.1. 10.38% 40% 60%
9) R.SP.2. 6.37% 82% 18%
10) R.SP.1.C. 10.32% 65% 35%
Se observan, en general, valores relativamente elevados en
comparación con las proporciones de lípidos en sedimentos
terrestres, incluyendo suelos, que raramente superan el 1 %. En
este sentido, son un buen ejemplo los casos de las reservas
interior y exterior de agua. Por otra parte, es de destacar la
variabilidad de valores entre los diferentes sedimentos, que
reflejan la diferente importancia de las contribuciones orgánicas ,
al material ac~mulado en la superficie.
Comparando los contenidos de di versas muestras, es de
resaltar como el sedimento natural del cano de Sancti Petri,
muestreado en la zona intermareal sujeta a periodos secos (F.Il,
contiene una proporción de lípidos muy inferior a la del mismo
sedimento inundado y cubierto de algas (F.2l. Cabría esperar por
- ! ~ -
11.2.3. Análisis de la fracción mineralógica.
En los diagramas de la figura 3 se presenta el análisis de
la composición mineralógica de las muestras de sedimentos del
estanque de cultivo de almejas (Z.2.3.) y del sedimento natural
del Caño de Sancti-Petri (F.l.), los cuales son representativos
de todos ellos.
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h:··'\:;¡a 1 ~M¡J2~'i~Ob' Al1Vf,'l'H'in, ¡.vli
Figura 3.
Los minerales presentes en los sedimentos fueron los mismos
en todos los casos: Quarzo (57-70%), Carbonatos (20-40%),
Feldespato (5-10%) Y trazas de Anortita y Mica.
esta misma razón una mayor riqueza lipídica en el estanque
Z.2.3., que no se produce probablemente por el efecto de arrastre
del flujo continuo de agua al que está sometido. En cuanto a las
muestras de sedimentos del Río S. Pedro, el sedimento mezclado
con sustrato (RSP.l) es más rico en material lipídico que el
sedimento natural (RSP.2). En ninguno de ellos se apreció apenas
diferencias en contenido lipídico entre las muestras tomadas en
la superficie y a 20 cm.
El reparto de los extractos totales en subfracciones ácida
.y neutra ofrece una primera aproximación cualitativa a la
naturaleza de los componentes mayoritarios en cada extracto.
Se observan, sin embargo, algunos valores de difícil
explicación. Mientras las muestras de sedimentos de Sancti-Petri
se comportan de forma similar, y contienen fracciones neutras en
ligera mayor proporción que ácidas, los extractos lipídicos de
los sedimentos muestreados en el Río S. Pedro se no se comportan
linealmente, ni entre ellos, ni respecto de los niveles
muestreados. Es de destacar, en fin, la elevada proporción de
fracción ácida del extracto del estanque Z.2.3.
II. 2.4. Análisis de componentes mediante GC y GC/MS.
* Fracciones neutras
En la figura 4 se presentan los Cromatogramas de Ion Total
(TIC) representativos de las fracciones neutras de los diferentes
extractos lipídicos. La naturaleza química de los compuestos
identificados se indica con diferentes letras en cada uno de los
picos cromatográficos. En la tabla VI se detalla la composición
de las diferentes series homólogas y componentes individuales
identificados.
TIC 01 DATA:FNS-2,D J .2 E +5
J • 0E +5
8. 0E +4 Q.) ~ < <.l c;
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J 4.",.j 111 11
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" 1 t I I 2,0[+4'
0.0[+0 J 5 20 25 30 35 40 45 50 55
Time (min.) -' ______ . ..
TIC of DATA:FNS-7.D
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5. raE +4
¡ j ¡ , i I
15 213 25 30 35 40 45 50 55 Time ( m 1 n .
Fig.4,Cromatograma de Ion Total de las fracciones neutras de las muestras del Canal de engorde (a) y del sedimeto transformado con arena del Caño Sancti-Petri (b).
, ..J
1 ,
Tabla VI. Composición de las Fracciones Neutras.
n-Alcanos Insat/ Cicloalc
l)RV.1. 18-31
2)R-6. 20-30
4)RV.2. 20-31
5)F.1. 22-30
6)r.2. 20-31
6S)F.2. 22-31
7)T. 21-31
8)R.SP.1. 21-31
9)R.SP.2. 19-31
9S)R.SP.2. 19-31
10)R.SP.1.C 24-31
(1) e: Colesterol Cn: Colestanol
B: Brassicasterol Cp: Campesterol
Es: Estigma~terol BS: B-sitosterol
BSn: B-sitostanol
(2) Alquenos Alcoboles ramificados
+
+
+
-+
+
+
+
-
-
+
Alcoboles ritol primarios
16-30 -
20-24 +
16-28 +
18-24 -16-28 +
22-28 +
16-28 +
14-28 +
16-22 +
14-32 + ,
20-28 +
Desconocidos. En proceso de identificación.
Esteroles otros ¡
(1) (2)
C,Cn,B,Es, + BS,BSn
e,en +
e,en,B,Es, + BS,BSn
e +
e,Cn,B,Es, + BS,BSn
e,en,B,BS +
e,Cn,B,Es, + BS,BSn
C,Cn,B,Es, + Cp,BS
C,Cn,B,Cp, + Es,BS,BSn
C,Cn,B,Cp, + Es,BS,BSn
C,en,B,ep, + Es,BS,BSn
La serie de n-alcanos en el intervalo C18-C31 es
predominante en todas las muestras, con pequeñas variaciones de
unas a otras. En los sedimentos tomados a distintas profundidades
es clara la mayor abundancia de n-alcanos en la superficie.
En aquellas muestras donde la contribución algal es evidente
(estanque Z.2.3., sedimentos del caño Sancti-Petri y del Rio S.
Á7
Pedro) se han detectado en cantidades traza (con ayuda del SIH)
homólogos de menor peso molecular, principalmente el C17. Los
componentes mayoritarios en todas las muestras son los homólogos
que van del C29 al C3l, con la típica distribución de n-alcanos
en plantas superiores, lo que indica la contribución prioritaria
de éstas a la HO acumulada.
Hidrocarburos insaturados y cicloalcanos, típicos
representantes del fitoplacton, se han detectado en prácticamente
todas las muestras.
En todas las muestras
primarios desde el C14 al
analizadas aparecen
C30, aunque con
alcoholes
diferentes
distribuciones. Las contribuciones a estos compuestos son muy
variables. Así, la serie C14-C24 es típica de invertebrados, la
C14-C18 de microorganismos y la C26-C34 de plantas superiores,
por lo que no es fácil discernir en las muestras individuales el
grado en que intervienen las posibles fuentes, aunque, de nuevo,
parece predominar en todas las muestras la contribución de
plantas. Es de destacar la detección en todas las muestras del
fitol, típico producto de la diagénesis de clorofila y algunas
especies de bacterias, que se asocia a la contribución de
fitoplancton.
Al igual que ocurría en los n-alcanos, se observa que las
muestras tomadas en la superficie presentan mayor abundancia de
n-alcoholes que las tomadas en profundidad.
Los esteroles detectados en las diferentes fracciones
neutras son muy similares en todas ellas, y pueden proceder de
muy distintas fuentes, tales como fitoplacton, algas, tejidos de
animales, plantas superiores ,etc.
* Fracciones ácidas.
En las figura 5 se presentan los Cromatogramas de Ion Total
(TIC) represntativos de las fracciones ácidas de los extractos
lipídicos de las muestras. La identidad de los diferentes
componentes individuales, indicada en cada pico, se detalla en
la Tabla VII.
Tabla VII. Composición de las Fracciones Acidas.
A.cidos grasos: Sat. ¡nsat. Rali!.
I)RV.!. 14-30 16,18
3)!.2.3. 14028 16,18
¡)RV.2. 14-28 16,17
S)Y.!. 14026 16,18
6)Y.2. 14-28 16,17 18
6S)P.2. 14028 16,17 18
7)T. H-27 16,18
8)R.SP.l 14-27 16,17 18
9)R.SP.2 14-26 16,17 18
9S)R.SP.2 14-26 16,17 18
lO)R.SP.!.e 14-27 16,18
1l)R.SP.2.C 14-28 16,18
(1) e: Colesterol B: Brassicasterol
Cp: C .. pesterol
16
15
IS,17
IS ,17
15,17
15,17
15,17
15,17
15,17
15,17
15,17
15,17
w-Hidro:dácidos Alcoholes Fitol 9,10-priJarios Dioles
16-26 16-22 ; ---21-24 14-22 ; ---20-24 --- ; ---15-23 18-20 --- ---19-23 18-22 ; ---19-23 20 ; ---
22-24 16-22 --- ---22-24 20 --- ---
17 16-20 + ------ 20 --- 16(18
22-24 16-20 --- ------ 16-20 ; 16
Esteroles (1)
C,B,Cp
e
------
. e
e
e
e
---
---e
---
Los componentes mayoritarios son los ácidos grasos, que se
presentan en forma saturada preferentemente, aunque también se
detectan homól'ogos insaturados y ramificados - En todas las
fracciones ácidas se detecta la serie C14-C30 de n-ácidos grasos
y el ácido graso ramificado C15.
El potencial origen de esta serie de ácidos grasos es
múltiple, ya que son conocidos componentes del fitoplacton,
tejidos de animales, bacterias y plantas superiores. Así, los
Fig.5 Cromatogramas de Ion Total de las fracciones ácidas de las muestras de reserva interior (a) y de reserva exterior (b).
saturados de número par de átomos de carbono, desde el C12 al
C24, pueden formar parte de los cuatro grupos citados; los
monoinsaturados de número par de átomos de carbono desde el C12
al C24, solo forman parte de los tres grupos primeros y los de
número impar de átomos de carbono, desde el C13 al C23 se
encuentran principalmente en las bacterias, aunque también
aparecen en animales y fitoplacton.
En todas las fracciones ácidas aparecen w-hidroxiácidos
desde el C16 hasta el C24, excepto en algunas muestras tomadas
en el Río S. Pedro, donde sólo se ha detectado el homólogo C17
(9.R.+SP.2.) o ninguno (id tomada a 20 cm.).
Los hidroxiácidos son típicos componentes de bacterias,
aunque también se pueden encontrar en fitoplacton, tejidos de
animales y plantas superiores en cantidades traza.
Se presentan en la figura 6 los espectros de masa
representativos de los picos mayoritarios de los diferentes
cromatogramas.
I J..-_
, 111
SI( /
/ ,\1 / IH
001 0\ . --rO"ll'e ;1 11
1")°" r / S¿ JO'! l " • ~J JO' t ¡
!")B't ,
(tU!\
11 .3. RESULTADOS OBTENIDOS DE LA EXPERIENCIA DE t~R-¡ \L\<.t\ C.\ON
En el primer semestre de 1993 se inició la segunda fase del
Plan de Trabajo, que ha consistido en la monitorización de
parámetros fisico-quimicos en sedimentos acuicolas sometidos a
una experiencia programada para evaluar la eficacia de la
fertilización bentónica, en el cultivo semiextensivo de peces y
crustaceos. En particular, se ha prestado especial atención a la
influencia del citado manejo sobre las caracteristicas de la
fracción orgánica de los sedimentos.
Para realizar la experiencia se seleccionaron los ocho
estanques R de la granja marina del CICEM "El Toruño" (ver figura
2). Estos estanques se encuentran situados paralelamente, uno
junto a otro sobre el mismo tipo de terreno y tienen iguales
dimensiones. Todos reciben el mismo manejo de agua procedente de
un canal de entrada, el cual se alimenta de una reserva de agua,
precedida a su vez por otra, que toma agua del Rio San Pedro
(brazo de mar que penetra tierra adentro). Debido a que la
"historia" de utilización de cada uno ha sido diferente, fue
necesaria la caracterización por separado de todos ellos.
La especie elegida por los técnicos de PEMARES para el
cultivo fue Peneus japonicus, y el fertilizante utilizado fue un
pienso granulado, empleado en la alimentación de carpas y añadido
a los estanques con una tasa de 19rjm2 jdia.
Los muestreos iniciales y finales de sedimentos (tanto de
la superficie como a más profundidad) fueron realizados en los
meses de Marzo y Octubre de 1993. El diseño de la experiencia,
elaborado por personal técnico de PEMARES, se resume de la
siguiente forma:
Fertilización
Cultivo
R1
*
R2
* *
R3
* *
R4 R5 R6 R7 R8
*
* * Existieron, por tanto, cuatro tratamientos distintos con dos
replicas cada uno:
Fertilizados, sin cultivar: R1, R4
- Fertilizados, cultivados: R2, R3
- Sin fertilizar, sin cultivar: R6, R8
- Sin fertilizar, cultivados: R5, R7
En lo sucesivo nos referiremos a los distintos tratamientos
con las siguientes denominaciones: AGUA (A) (R6 y R8),
FERTILIZACION (F) (R1 y R4), CULTIVO (CU) (R5 y R7) Y
FERTILIZACION+CULTIVO (F+Cu) (R2 y R3). En el primero de ellos
se evalúa exclusivamente la influencia del manejo de agua que han
experimentado todos los estanques, y que consistió en una
renovación diaria, en una tasa entre ellO y el 15% de su
capacidad.
Los datos de cada uno de estos tratamientos se han comparado
con los de una muestra CONTROL (C), definida mediante tratamiento
estadístico de los valores que presentaban todos los estanques
antes de iniciarse la experiencia.
El tratamiento analítico al que se han sometido las muestras
de sedimentos analizadas en esta experiencia es el descrito en
el apartado Ir.1. La única innovación metodológica introducida
son los tratamientos adicionales para la eliminación de pigmentos
que dificultan el análisis cromatográfico, realizados en algunos
extractos totales y subfracciones ácidas. El procedimiento
consiste básicamente en retener el extracto total por una columna
de alúmina neutra, y eluir posteriormertte con dic10rometano.
11 .3.1 Parámetros fisicoquimicos.
En la tabla VIII se presentan los valores resultantes del
tratamiento estadistico de los datos obtenidos para diferentes
parámetros fisico-quimicos, en las muestras de sedimentos CONTROL
y en los cuatro tratamientos realizados.
Un buen número de parámetros, tales como pH y carbonatos,
algunos oligoelementos (Zn, cu, Cr y Ni) , y algunos
macronutrientes (K, Ca y Mg), no experimentan variaciones
significati vas, aunque en estos últimos se observa un ligero
aumento en los estanques no fertilizados (A y Cu), frente a los
que si lo estaban (F y F+Cu) , tal como se aprecia en la figura
8. Los contenidos en Fe y Mn de los sedimentos experimentan
modificaciones significativas, pero siguiendo tendencias
divergentes, como se aprecia en los correspondientes histogramas
(figura 8).
En el caso del contenido en Cd, éste aumenta en todos los
casos después de la experiencia, siendo mayor el aumento en los
estanques cultivados (Cu y F+Cu) , como se aprecia en los
histogramas de la figura 9.
4" ----------------------------------------1 3.5 ,.
3
2.5
2
1.5
0.5
O Control Agua Fertilización Cultivo Fert'Cult
_ Cd (ppm) FiÓ' IJ.
Tabla V! n. Valores de los parámetros medidos, en el estanque control y en los cuatro tratamientos realizados. (**)
MOT (%)
EL (%)(*)
Neu (%)
Aci (%)
pH
CO, (%)
CE (dSjm)
N
p
(%)
(%)
K (%)
Ca (%)
Mg (%)
Na (%)
Fe (ppm)
Mn (ppm)
Zn (ppm)
CU (ppm)
Cr (ppm)
Ni (ppm)
Cd (ppm)
C A
2.7 b 1.5 a
10 a 15 ab
74 b 80 b
26 a 20 a
7.8 b 7.3 a
14 a 17 a
27 b 15 a
0.12 a 0.01 a
0.07 b 0.07 b
2.1 a 2.6 a
8.6 a 8.8 a
2.3 a 2.4 a
4.3 b 2.2 a
29830 ab 36530 b
854 a 576 a
88 a 77 a
23 a 23 a
73 a 69 a
42 a 44 a
2.1 a 3 ab
F cu F + CU
1.4 a 1.6 a 1.3 a
12 a 13 a 25b
46 a 76 b 71 ab
54 b 24 a 29 ab
7.7 ab 7.7 ab 7.8 b
16 a 15 a 17 a
16 a 16 a 16 a
0.08 a 0.01 a 0.08 a
0.06 a 0.07 b 0.06 a
2.0 a 2.5 a 2.1 a
8.2 a 8.7 a 7.6 a
1.9 a 2.4 a 1.9 a
2.3 a 2.9 a 2.0 a
26580 a 34950 ab 28530 ab
435 a 758 a 495 a
55 a 64 a 50 a
22 a 29 a 22 a
59 a 76 a 61 a
36 a 43 a 38 a
3 ab 3.5 b 3.5 b -----------------------------------------------------------------
c: estanque control A: estanques solo con agua F: estanques fertilizados Cu: estanques cultivados
(*) EL: extracto lipídico
(**) Los valores seguidos por diferentes letras en las mismas filas, difieren significativamente (P<0.05, test de Tukey).
.'\
Miles 40r
I 30 ¡-
20'
10
o
1000 r 800 ~
600 l I
400'
200 -
o·
'J 6j i
4iI
2, !
o
Control
Control
Control
Agua Fertilizaolón Cultivo
1M Fe (ppm)
Agua Fertilización Cultivo
1M Mn (ppm)
Agua Fertilizaoión Cultivo
UK(%) IMCa(%) UMg(%)
Fert+Cult
Fert+Cult
I ¡
I
I I I
!
I I
)
! I í I I ~-
Fert+Cult
F,?;. 8.
Los datos de Conductividad Eléctrica medidos en los
sedimentos indican que a lo largo de la experiencia se ha
producido una clara disminución de la salinidad, que también se
refleja en el descenso en los porcentajes de Na (figura 10). 30 I --------- ------ ------ -.
26
20
16 r 10 r 5~
!
--¡
I
-~¿-f¡;¡¡
'--, I . ¡ I , , r-¡
, I
'" -;, O 17/"1' .. _____ 1f0wo. Mfffi<,7:ff _______ ~._ - ___ 0-1.
Control Agua Fertilización Cultivo Ferl +Cul! F"6· 10. _ Na ('lo) [=~I CEpast (dS/m)
Es muy destacable el inesperado descenso en materia orgánica
total (MOT) que se ha producido en todos los estanques,
fertilizados o no. Como puede observarse en la figura 11, este
descenso generalizado de aproximadamente el 30% produce un
equilibrio entre todos los valores de MOT, que indica en
principio una fuerte influencia del continuo lavado producido por
la renovación diaria del 10-15% de agua,
3~'------
2,5
Control Agua Fertilización Cultivo Fert+Cult
_ MOT ('lo) FiÓ.4IÍ·
El descenso en MOT lleva asociado, como era de esperar,
disminuciones paralelas en los porcentajes de N y P (Figura 12).
0.14,-------------------- 1 0.12
0.1
0.08 1 0.06 t
i 0.04
0.02
o Control Agua Fertilización Cultivo
_N (%) UP (%)
Fert-Cull
~i'a.\2.
I !
La disminución de N es mas pronunciada en los estanques no
fertilizados (A Y Cu) respecto a los que si lo fueron (F y F+Cu) ,
cama consecuencia de un leve efecto compensador del fertilizante
proteico añadido. En lo que se refiere al contenido de P la
tendencia es diferente, ya que apenas se observa variación entre
el estanque CONTROL y los estanques no fertilizados (A y Cu),
mientras la disminución en los estanques fertilizados (F y F+Cu)
es más clara.
Es de resaltar que la disminución en MOT no se refleja en
el porcentaje de Extracto Lipidico (EL), que constituye una
fracción orgánica cuantitativamente menor, pero de gran
significación '. desde el punto de vista biogeoquimico y
medioambiental.
El valor de EL aumenta con respecto al estanque CONTROL en
todos los casos, observándose un aumento considerable en el caso
de los estanques fertilizados y cultivados (F+Cu), como puede
verse más gráficamente en los histogramas de la figura 13.
30r --_._--------
'"f 20
15 r 1 O ~
5 .
O Control Agua Fertilización Cultivo Fert'Cult
II1II Ext. Llpldlco (%)(.) F,'3' 1'5 •
,Este aumento se debe indudablemente a la contribución de
materiales alóctonos (el fertilizante añadido, y materia orgánica
de origen terrestre, en particular) , y al aumento de
contribuciones autóctonas, dominadas por material algal y
microbiano.
Respecto a la distribución del extracto lipidico en
fracciones neutras y ácidas, se ha observado en todos los
estanques una preponderancia de las fracciones neutras respecto
de las ácidas, excepto en el caso de los estanques solamente
fertilizados (F), en los que ambas fracciones se igualan (figura
14) ,
100 i-------------~----------
80
20 ~
O Control Agua Fertilización Cultivo Fert+Cult
_ F. Neutra (%) (.) D F. Aclda (%) (.) fiO' \\j,
II .3.~ Composición mineralógica
En la Figura 15 se muestran los análisis de la composición
mineralógica, por difracción de rayos X, de las muestras de
sedimentos superficiales de uno de los estanques (Ri), antes y
después de la experiencia. Los resultados son representativos de
los obtenidos al analizar todos los estanques, y, como era de
esperar, no se observan diferencias cualitativas en los distintos
sedimentos analizados. Los minerales identificados en todos los
casos en orden decreciente de contenidos fueron Cuarzo, Calcita,
.Halita, Dolomita, Ilita, Albita, y Kaolinita. ____ ~._--~---~, ____ ~·,.--_· __ T_-···__r-----r-
RlS u: {l.1a5Q~ tM\ 1 • ~0 CuX«1
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11 .3.3 Composiciones lipidicas
El aumento cuantitativo relativo que experimenta la fracción
lipídica de los sedimentos después de los diferentes
tratamientos, debe investigarse en profundidad, ya que se trata
de una fracción especialmente activa en los diversos procesos
bioquimicos y geoquimicos en los que participa la materia
orgánica (MO) sedimentaria.
Baste recordar que los animales bénticos y los
microorganismos dependen de la MO para su nutrición. Por otra
parte, dado que muchos componentes lipídicos son fácilmente
oxidables, la concentración de oxígeno disuelto en el agua puede
depender de la presencia o no de tales componentes en la
interfase agua/sedimento. Además, son muy comunes en los
sedimentos las reacciones redox por las que especies inorgánicas
oxidadas son reducidas por interacción con la MO. Por último, el
estudio de las fracciones lipídicas puede suministrar una
información valiosa sobre la eventual incidencia de un input
ambiental concreto.
En el caso que nos ocupa, el único factor controlable que
ha podido influir en la alteración de la fracción lipidica es el
fertilizante añadido (MOT= 85,2 %; Proteinas= 44 %), que contiene
un porcentaje relativamente elevado (5,32 %) de material
lipídico. La naturaleza química de este material se muestra en
los TICs de las fracciones neutra y ácida, que se presentan en
la figura 18. Se observa claramente en los mismos que la fracción
neutra está dominada por el pico correspondiente al colesterol,
mientras que la ácida lo está por los acidos grasos saturados C,.
y C,. y por los insaturados C,." y C .. ".
[Abündance-·-· --------_.- .. _-. -.-. TIC: FN-PIEN.D
- .. ,·--_ .. · __ · __ ·_·_--_·-----""1
I '"O"" I E" ~"r.-yr...I('"~ I K < .. ,': _ <:\ _ { t I R'" - ¡ -,¿-,4t· ¡.\ \f •••• ' _
-" '1 6000000
5000000
4000000
3000000
2000000
1000000-
(
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Figura I~. Cromatogramas de Ión Total de la fracción neutra (a) y de ~a fracción ácida (b) del fertilizante utilizado.
1
I I l·
I
I
En las figuras 19-22 y 23-26 se presentan Cromatogramas de
Ion Total (TIC) correspondientes a las fracciones neutras y
ácidas de muestras de sedimentos representativas de los distintos
tratamientos, comparados con el del estanque CONTROL. En la tabla
IX se recoge la naturaleza química de las principales series de
compuestos detectados en las diferentes muestras.
Tabla IX.
------_ ... -
n-ALCAMOS
n-ALCOHOLES
n-FAMES
FAMES INSATURADOS
FAMES RAMIFICADOS
Ó-HIDROXIACIDOS
FITOL
DIHIDROFITOL
ESTEROLES (*)
9,10-DIOLES
OTROS (**)
(*) Ver Tabla X.
Composición de las muestras de sedimentos en los distintos tratamientos.
CONTROL AGUA PIENSO CULTIVO PIEN+CULT
C17-C38 C17-C34 C16-C36 Cl4-C31 C14-C33
Cl4-C32 C12-C27 Cl4-C26 C12-C38 Cl4-C32
C14-C30 C12-C38 C14-C30 C12-C28 Cl4-C32
C16,C17, C16,C17, C15,C17 C16,C17, C16,C17,C C18 C18 C18 18
C15,C17 C15,C17 C15,C16, C15,C16, C15 C17 C17
C22,C23 C22,C23 C22,C23 C22,C23 C22
** **** **** **** **
* --- --- --- ***
a,b,c,d, b,c,d,g, b,c,d,e, a/b,c,d, c,d,e,g,h e,f,g,h, h,i,k,l f,g,h,i, e,f,g,h, ,i,k,l i,j,k,l, j,k,l,m i,k,l m
C16,C18 C16,C18 C18 C16,C18 C16,C18
DOPG,30- DOPG DOPG Hopanos ---Hopanol, Hopanos
(**) DOPG: di-o-fitanil-glicerol.
En esta tabla se indica que las diferencias cualitativas
entre las composiciones de las muestras control y los
tratamientos son poco relevantes. Sin embargo, las distribuciones
de las principales series de compuestos y las abundancias
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Figura 19. cromatogramas de Ión Total de las fracciones neutras, de la muestra CONTROL (a) y de la muestra representativa de los estanques con tratamiento de agua (b).
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>igura 20. Cromatogramas de Ión Total de las fnlcciones neutras, de la nuestra CONTROL (a) y de la muestra representativa de los estanques lolamente fertilizados (b).
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Figura 21. Cromatogramas de Ión Total de las fracciones neutras, de la muestra CONTROL (a) y de la muestra representativa de los estanques 1_.
solamente cultivados (b).
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Figura 22. Cromatogramas de Ión Total de las fracciones neutras, de la muestra CONTROL (a) y de la muestra representativa de los estanques fertilizados y cultivados (b).
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Figura 23. Cromatogramas de Ión Total de las fracciones ácidas de la muestra CONTROL (a) y de la muestra representativa de los estanques con tratamiento de agua (b).
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Figura 24. cromatogramas de Ión Total de las fracciones ácidas de la muestra CONTROL (a) y de la muestra representativa de los estanques solamente fertilizados (b).
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>igura 26. Cromatogramas de Ión Total de las fracciones ácidas de la nuestra CONTROL (a) y de la muestra representativa de los estanques :ertilizados y cultivados (b).
relativas de los principales homólogos presentan notables
diferencias, que se observan a simple vista en los Trcs que se
presentan.
Las citadas diferencias son más acusadas en las fracciones
neutras que en las ácidas, y algunas son particularmente
destacables. Es evidente, por ejemplo, la desaparición de la
distribución bimodal de los n-alcanos en los sedimentos de los
estanques fertilizados (Figuras 20 y 22). Asimismo, llama la
atención el enriquecimientos en n-alcanos de bajo peso molecular
de los sedimentos procedentes de estanques en los que hubo
cultivo (Figuras 21 y 22). En cuanto a las fracciones ácidas, las
diferencias más notables se aprecian al comparar el sedimento
control con los que han recibido fertilización y cultivo (Figura
26).
Estas y otras tendencias serán discutidas a la luz de los
datos medioambientales medidos en la columna de agua, y a los
datos sobre alteraciones del microbentos. Para ello se
seleccionarán los compuestos de más interés como "marcadores
biológicos", y se compararán las distribuciones que presenten en
los diferentes sedimentos.
Como ejemplo representativo se presenta a continuación la
alteración que ha experimentado la fracción de esteroles
identificados en los sedimentos. El estudio de la composición de
estero les ha sido considerado por numerosos autores, como un
método válido para evaluar la actividad bacteriana y el grado de
intervención de inputs específicos, y, en suma, para apreciar la
intensidad de los procesos biogeoquímicos que ocurren en la
interfase agua/sedimento de sedimentos recientes.
En las figuras 27 y 28 se presentan las trazas de compuestos
esteroideos presentes en
mediante monitorización
los diferentes sedimentos, obtenida
de iones de diagnostico de los
correspondientes trimetrilsilil ésteres. Las letras sobre los
picos corresponden a los compuestos individuales que se detallan
en la tabla X.
Como es frecuente en sedimentos de muy diverso origen, los
componentes individuales dominantes son colesterol (e) y dos
esteroles C29, E-si tostanol (1) Y E-si toste rol (k). El colesterol
no puede utilizarse como marcador biológico específico, porque
se encuentra en las membranas celulares de casi todos los
organismos, pero en nuestro caso su variabilidad cuantitativa
está asociada a la fertilización o no de los estanques, dada su
abundante presencia en el fertilizante utilizado (Figura I8a y
28) •
La distribución de estero les varía poco entre las muestras.
Esta relativa uniformidad refleja la dominancia del fitoplankton
como fuente primaria, puesto que las bacterias apenas
biosintetizan esteroles. No obstante, las razones
estanolesjesteroles parecen indicar la presencia de niveles
elevados de biomasa bacteriana heterotrófica. En los sedimentos
de los estanques que recibieron el cultivo es más abundante la
presencia de coprostanol y etil-coprostanol, marcadores de la
contribución de metabolitos de MO.
Se aprecia en todo caso una
importancia relativa de esteroles
avanzar que se ha producido
contribuciones.
cierta variabilidad en la
menores,
una mayor
que nos permite
diversidad de
Tabla X • Naturaleza química de los esteroles individuales identificados en las distintas muestras.
a' 5B-cholestan-3B-ol
a 5B-cholestan-3Ó-ol, (coprostanol)
b 27-nor-24-cholesta-5,22-dien-3B-ol
c cholest-5-en-3B-ol, (cholesterol)
d 5Ó-cholestan-3B-ol, (cholestanol)
e 24-methylcholesta-5,22-dien-3B-ol, (brassicasterol)
f 24-methylcholest-22-en-3B-ol
g 24-methylcholest-5-en-3B-ol, (campesterol)
h 24-methylcholestan-3B-ol, (campestanol)
i 24-ethylcholesta-5,22-dien-3B-ol, (stigmasterol)
j 24-ethylcholest-22-en-3Ó-ol, (stigmastanol)
k 24-ethylcholest-5-en-3B-ol, (B-sitosterol)
1 24-ethylcholestan-3B-ol, (B-sitostanol)
m 4Ó-23,24-trimethylcholest-22-en-3B-ol
n 4Ó,23S,24R-trimethylcholestan-3B-ol
p 24-methylcholest-7-en-3Ó-ol (fungisterol)
q 24-ethylcholest-7-en-3B-ol.
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Figura 27. Cromatogramas de Ión Total de la fracción de esteroles obtenidas de las muestras tomadas en el estanque CONTROL (a), en el del manejo de agua (b) yen el del cultivo (e).
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Figura 28. Cromatogramas de Ión Total de la fracción de esterol es obtenidas de las muestras tomadas en el estanque CONTROL (a), en el fertilizado (b), en el cultivado y fertilizado(c) y en la muestra de fe»tilizante (d).
II.4 OTROS ANALISIS DE SEDIMENTOS ACUICOLAS
Los contactos establecidos con el Centre de Recherche en
Ecologie Marine et Aquaculture de L'Houmeau, CNRS-IFREMER,
(Francia), a través del Dr. Hussenot, cristalizaron en el estudio
de dos muestras de sedimentos suministrados por el grupo francés,
siguiendo nuestros procedimientos. En concreto se han analizado
dos muestras de sedimentos que procedían de dos estanques de
cultivo (denominados "A" y "B"), que se encontraban en
condiciones muy diferentes en cuanto a su grado de contaminación
y estado redox.
En la tabla XI se presentan los resultados de pH, carbonatos
y conductividad eléctrica, en la tabla XII los contenidos en
macronutrientes, oligoelementos y metales pesados, y en la tabla
XIII los contenidos en Materia Orgánica Total (MOT) y extracto
lipídico, y la distribución de éste en subfracciones neutras y
ácidas.
En las figuras 29 y 30, se presentan los Cromatogramas de
Ión Total de las respectivas fracciones neutras y ácidas.
Mientras en estas últimas existen relativamente pocas
diferencias, las fracciones neutras (Figura 29) son muy
diferentes. En la fracción neutra del estanque A, se detectaron
series de compuestos contaminantes procedentes de detergentes y
surfactantes, que demostraban claramente el input de aguas
residuales.
Por otra parte, dadas las diferentes condiciones redox de
los estanques, se hizo un estudio especifico de la presencia de
componentes azufrados en los mismos. Para ello se llevó a cabo
Table XI • Some physico-chemical parameters.
I .
11 SAMPLE pH CO'Ca (%) CEpast (dS/m)
A 7.50 5.00 15.74
B 7.50 9.00 19.00
Table XII . Macronutrients, oligoelements and heavy metals contents in the sediment samples.
--
A B
N (%) 0.188 0.152
P (%) 0.079 0.076
K (%) 2.51 2.90
Mg (%) 1.66 1. 40
Ca (%) 4.12 5.97
Na (%) 3.61 2.65
CU (ppm) 15 20
Fe (ppm) 36660 43226
Mn (ppm) 273 340
Zn (ppm) 91 106
Cr (ppm) 63 72
Ni (ppm) ,..... 41 --50
--------
Table XII!. Total organic matter (TOM) and lipid contents of the sediment samples.
--_._-- - --- --_ .. _--- - - -- ------------- -
SAMPLE TOM (%) LIPID EXTRACTS PARTITION OF THE LIPID EXTRACT (*) (**) -------------------------------
NEUTRAL (%) ACIDIC (%)
A 3.50 0.70 79 21
B 3.53 0.81 44 56 --- ------_ .. _-------------- - ... - ------------ - -- ---- ----------- - --------_ .... _ ... __ ._--
(*) Total dried sediment=100% W/W (**) TOM=100% W/W
~undance
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I 1600000 i
TIC: FN-A.D
A:n-Alcanos C:n-Alcoholes
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Figura 29. Cromatogramas de Ión Total de las fracciones neutras de la muestra A (a) y de la muestra B (b)
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Figura 30. Cromatogr~mas de Ión Total de las fracciones ácidas de la muestra A (a) y de la muestra B (h)
el análisis cromatográfico tras la calibración de un detector
fotométrico de llama (FPD), especialmente sensible a la
determinación de compuestos orgánicos azufrados. De esta forma
se detectaron diferencias muy significativas entre los dos
estanques.
En la figura 31 se presentan las trazas por el detector FID
(a) y el FPD (b) de la muestra de lipidos de B. Esta segunda
traza apenas fué perceptible al analizar los lipidos del
sedimento A.
La discusión de estos resultados se hará conjuntamente con
el Dr. Hussenot, ya que se integrarán en un estudio del medio
ambiente del entorno que actualmente se lleva a cabo en
L'Houmeau.
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Fi gura 31
111. ACTIVIDADES COMPLEMENTARIAS
- Asistencia a reuniones técnicas.
El personal investigador adscrito a este convenio ha
intervenido activamente en diversas reuniones técnicas,
organizadas por la Consejería de Agricultura y Pesca de la Junta
de Andalucía. Así en "Las Jornadas Técnicas en Investigación y
Desarrollo Tecnológico, Pesquero y Acuícola en Andalucía", que
tuvieron lugar los días 28-29 de Octubre de 1993, se hiz.o una
presentación pÚblica de los resultados más relevantes obtenidos
hasta la fecha, y se contactó con otros investigadores para la
aplicación de nuestras técnicas de estudio al análisis de
problemas puntuales.
Asimismo en "La Reunión Técnica sobre Innovación y Demandas
de I + D Tecnológico en Acuicultura", celebrada el día 10 de
Febrero de 1994, tuvimos ocasión de discutir la importancia del
estudio de la calidad del medio físico para garantizar la
productividad de los sistemas acuícolas.
- Asistencia a Congresos
Los principales resultados parciales obtenidos hasta ahora
han sido presentados en dos congresos Internacionales.
En Septiembre de 1993 asistimos al XI International
Simposium on Environmental Biogeochemistry, en el cual
presentamos un cartel de título "Physico-chemical characteristics
of organic matter deposits in fish aquaculture ponds", en el que
se hacía una descripción detallada de las características de
muestras de origen diverso. Del correspondiente manuscrito se
incluyó una copia en el Informe de Progreso correspondiente al
segundo semestre de 1993.
En Marzo de 1994 presentamos un cartel en Bordeaux
Aquaculture I 94, de titulo "Lipidic deposits in sediments from
aquaculture ponds", en el que se anticipaban los resultados
preliminares de la experiencia de manejo. Además se presentó un
resumen extendido sobre el mismo trabajo, que será publicado en
el número de Junio de la revista "European Aquacul ture". Una
copia de dicho resumen se presenta como anexo en este Informe.
La asistencia a estos dos Congresos nos ha permitido dar a
conocer nuestro trabajo, asi como relacionarnos con otros
investigadores, cuyos temas de estudio están relacionados de
alguna manera con el nuestro.
visita al Centre de Recherche en Ecologie Marine et Aquaculture de L'Houmeau, CNRS-IFREMER, Francia.
Durante el viaje realizado para asistir a Bordeaux
Aquaculture \94, la becaria Angela MANCHA JIMENEZ realizó una
corta estancia en el Centre de Recherche en Ecologie Marine et
Aquaculture de L'Houmeau, CNRS-IFREMER, Francia, invitada por el
Dr.Jérome Hussenot, que le permitió conocer las instalaciones de
dicho Centro y los trabajo que en él se realizan.
Asimismo, tuvo ocasión de discutir con el Dr. Hussenot los
resultados obtenidos al analizar las muestras de sedimentos
suministradas por él, anteriormente presentados.
Por otra parte, Angela MANCHA participó en un seminario con
asistencia de investigadores del citado Centro (Jean Loui Martin,
Robert Galois, entre otros) en el que se discutió la importancia
e interés del análisis del material lipidico como medida de la
calidad ambiental de los sistemas acuicolas.
- Cursos
Financiado por el Convenio, Angela Mancha ha realizado el
Curso "Medida de contaminantes Químicos Ambientales.
Contaminantes Orgánicos", impartido por el Instituto de Estudios
de la Energía, C.I.E.M.A.T., Madrid, con una duración de 26 horas
lectivas, durante el 22-26 de Marzo de 1993.
IV. PREVISIONES DE FUTURO
Entre las actividades que hemos programado para el próximo
semestre figura en lugar prioritario la de diseminar los
principales resultados y conclusiones obtenidos hasta ahora en
revistas especializadas. Con tal fin, hemos previsto ultimar la
discusión de los datos obtenidos en la experiencia de
fertilización (complementando con una revisión exhaustiva de la
bibliografía actual la que se avanza en el presente informe),
para elaborar en colaboración con los técnicos de Pemares en el
CICEM "El Toruño", un manuscrito conjunto correlacionando la
información sobre la dinámica del sedimento con la de los
parámetros ambientales medidos en la columna de agua y con la
actividad del bentos.
Por otra parte, se ha programado la repetición del muestreo
efectuado en Junio de 1992 en algunos puntos concretos
(concretamente en el río San Pedro, en el caño de Sancti Petri,
en las reservas de agua y en el estanque Z.2.3) para analizar la
potencial alteración con el tiempo (y sus causas) de condiciones
ambientales primarias, susceptibles de manifestarse en el medio
sedimentario. Estos análisis y la presentación de los datos
comparativos en un eventual manuscrito estarían terminados a la
finalización del presente convenio en Diciembre de 1994.
En cuanto a la continuidad de este tipo de investigaciones
a más largo plazo, tenemos previsto discutir la posible
elaboración de un nuevo Convenio, con líneas de actuación
adecuadas a los objetivos básicos del reciente Programa Sectorial
de Investigación y Desarrollo Agroalimentario y Pesquero de
Andalucía (PSIAPA, 1994-1997).
De forma genérica, cabría enmarcar el futuro Proyecto de
Investigación, entre aquellos dedicados a estudiar los factores
que influyen y/o controlan la calidad de los sistemas acuícolas,
o 1 lo que es equivalente, entre los que se preocuparan de
integrar en el manejo de los sistemas productivos la conservación
de los recursos renovables y el respeto a los ecosistemas.
Concretamente, algunas 1 íneas programáticas de las señaladas
en el PSIAPA que pueden considerarse son las siguientes ;
11.4. Alimentación en Acuicultura (Investigaciones sobre la
calidad de piensos alternativos a los existentes en el mercado)
111.4. Geoquímica del sedimento en ecosistemas marinos
111.7. Interrelación entre la Acuicultura y el Medio
Ambiente
IV.3. Estudio de la calidad del medio marino
V. 2. Diseño, proyección y técnicas de mantenimiento de
instalaciones (En particular, estudio de acumulaciones de materia
orgánica particulada en filtros, y evaluación de la eficacia de
los mismos.)
Estas sugerencias son sólo un ejemplo de líneas de
investigación que interesa cultivar en las que se aprovecharía
la experiencia adquirida en los últimos años y la formación
específica de personal científico especializado, uno de los
logros más importantes del presente Convenio.
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LIPIDIC DEPOSTTS IN SEDIMENTS PROM AQUACULTURE PONDS
Mancha, A., González-Víla, F.J., Del Rio, J.C., Bautista, J.M. Martin, F., Verdejo, T.
Instituto de Recursos Naturales y Agrobiologia, C.S.LC. P.O. Box 1052, 41080-Sevilla, Spain
Introduction The amount and quality of the organic matter (OM) present in aquatic sediments, and particularly the molecular composition of the lipid fraction, provides useful information about the original sedimentary organic input and the subsequent processes of alteration to which they have been subjected (1). Likewise the OM accumulated in aqllaculture ponds migth reflect their environmental quality, as well as any possible alteration induced by management practices. In this communication we present preliminary results on the influence of an experiment of benthic fertilization (Iow protein feed, l g/m2/day) to enhance the grow of shrimps, Penaeus japonicus, (51m3) on the lipidic composition of sediments taken from the prodllctive ponds.
Material and methods The samples were taken at the sediment sllrface, inmediately frozen to prevent microbial growth and freeze-dried. Oxidizable total organic matter (TOM) was determined by oxidation with K2Cr20,. The sedimentary lipids were extracted, saponified and fractionated into neutrals and acidic fractions, which were subsequently analyzed by GC and GC-MS after derivatization with diazomethane and BSTFA. Experimental details were as previously described (2).
Results and discussion Quantitative determination of TOM and Iipid extracts in the ponds before and after the fertilization treatment showed not significant variations. However, the composition of Iipids vary both quantitatively and qualitatively. As an illustrative case, Fig. l show the total ion chromatograms (TIC) of the neutral (N) fractions of the Iipids extracted from a pond before (a) and after (b) the experiments.
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The distribution of the main series of compounds identified (hydrocarbons, a!cohols, fatty acids, hydroxy acids and sterols) were modified by the treatments. Such differences reflects the relative influences on the sediment of phytoplakton blooms, mierobial reworking, animal metabolisms and external inputs.
Acknowledgement We are indebted to Pemares-Junta de Andalucia for finnaneial support.
References 1. Meyers, P,A, and Ishiwatari,R., Org. Geochem., 20, 867-900,1993 2. Gonzalez-Vila, F.J., Del Rio, J.C., Mancha, A., Bautista, JM and Martin, F., Biogeochemistry (in press)
