Y ANÁLISIS BIOINFORMÁTICO DE LOS PROMOTORES DE … · universidad de chile f a c u l t a d d e c iencias q u Í m i c a s y f armacÉuticas escuela de postgrado “identificaciÓn

UNIVERSIDAD DE CHILE

F A C U L T A D D E C I E N C I A S Q U Í M I C A S Y F A R M A C É U T I C A S

ESCUELA DE POSTGRADO

“IDENTIFICACIÓN DE GENES QUE PARTICIPAN EN

LA RESPUESTA TRANSCRIPCIONAL AL ION MN2+ EN

CERIPORIOPSIS SUBVERMISPORA

Y ANÁLISIS BIOINFORMÁTICO DE LOS

PROMOTORES DE GENES RELACIONADOS”

Tesis para optar al grado académico de

Magíster en Bioquímica,

área de especialización en Proteínas Recombinantes y Biotecnología

y Memoria para optar Título Profesional de Bioquímico

Por

ARES SALVADOR TIRADO SOMMELLA

Director de Tesis:

Dr. Sergio Lobos C.

Santiago, Chile

2009

UNIVERSIDAD DE CHILE

FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS Y FARMACÉUTICAS

INFORME DE APROBACIÓN

TESIS DE MAGISTER Y TÍTULO DE BIOQUÍMICO

Se informa a la dirección de postgrado de la Facultad de Ciencias Químicas y Farma-

céuticas que la tesis de Magíster presentada por el candidato:

ARES SALVADOR TIRADO SOMMELLA

Ha sido aprobada por la comisión informante de Tesis como requisito para optar al gra-

do de Magíster en Bioquímica, área de especialización Proteínas Recombinantes y

Biotecnología y al título de Bioquímico, en el examen de defensa de tesis rendido el día

____________________________________________________________________ .

Director de Tesis:

_____________________Dr. Sergio Lobos Camus

Comisión Informante de Tesis:

____________________Dra. Inés Contreras (Presidenta)

____________________Dra. Daniela Seelenfreund

____________________Dr. Patricio Hinrichsen

ii

Dedicada a mis padres, mis hermanos,

a mi amada Carolina

y a mi abuelo Rabindranath S. Tirado F.

que en paz descanse

iii

FINANCIAMIENTO

Esta tesis fue realizada en el Laboratorio de Biología Molecular del Departamento

de Bioquímica y Biología Molecular, Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas,

Universidad de Chile. La investigación aquí documentada fue financiada por el proyec-

to FONDECYT N°1070588, titulado “Mecanismos de Regulación de la Expresión Géni-

ca por Metales en Hongos Basidiomicetes que Degradan Lignina”.

iv

TABLA DE CONTENIDOS

Página

...................................................................................................INDICE GENERAL v

..............................................................................................INDICE DE FIGURAS !

.................................................................................................INDICE DE TABLAS "

......................................................................................................ABREVIATURAS #

................................................................................................................RESUMEN $

..............................................................................................................ABSTRACT %&

INDICE GENERAL

Página

1. INTRODUCCIÓN.................................................................................................. 1

1.1 .................................................................................................. Presentación 1

.............................................................. 1.2. Manganeso en sistemas biológicos 1

1.3. Fisiología del transporte del Mn2+................................................................. 3

1.4. Mn2+ ........................................................................... al interior de la célula 6

1.5. Ceriporiopsis subvermispora ........................................................................ 6

1.6. Mn2+ en C. subvermispora .......................................: Degradando la lignina 7

1.7. Respuesta fisiológica a Mn2+ en C. subvermispora ...................................... 9

.......................................................... 1.8. Análisis bioinformático de promotores 11

.............................................................................................................. Hipótesis 12

................................................................................................... Objetivo general 12

.......................................................................................... Objetivos específicos 13

2. MATERIALES Y METODOLOGÍA ....................................................................... 14

..................................................................................................... 2.1. Materiales 14

............................................................ 2.1.1. Reactivos e insumos generales 14

.................................................................................. 2.1.2. Material biológico 15

.................................................................................. 2.1.3. Medios de cultivo 15

v

2.1.3.1. Medios para el crecimiento de cepas bacterianas

........................................................................................... y bacteriófagos 15

2.1.3.2. Medios de cultivo para C. subvermispora ..................................... 16

................................................................ 2.1.4. Amortiguadores y soluciones 16

........................................................................... 2.1.5. Sistemas comerciales 17

..................... 2.1.6. Herramientas y programas para análisis bioinformáticos 17

................................................................................. 2.1.7. Material radiactivo 17

................................................................................... 2.1.8. Oligonucleótidos 18

.................................................................................................. 2.2. Metodología 19

........................................................ 2.2.1. Definición de las sondas a utilizar 19

2.2.2. Búsqueda de los genes de interés en la genoteca genómica

de C. subvermispora ....................................................................................... 20

................... 2.2.2.1. Determinación de la concentración de bacteriófagos 20

........................ 2.2.2.2. Amplificación de la genoteca genómica en placas 20

........... 2.2.2.3. Preparación del DNA de bacteriófagos en discos de nylon 20

................................................ 2.2.2.4. Hibridación de los discos de nylon 21

................................ 2.2.3. Comprobación de los bacteriófagos identificados 21

..................... 2.2.3.1. Amplificación de los bacteriófagos en medio líquido 21

...................................... 2.2.3.2. Extracción del DNA de los bacteriófagos 22

................................. 2.2.3.3. Southern Blot de los segmentos genómicos 23

................................... 2.2.4. Secuenciamiento de los segmentos genómicos 23

............................. 2.2.4.1. Subclonamiento del DNA de los bacteriófagos 23

.................................. 2.2.4.2. Amplificación de los segmentos genómicos 24

............................................... 2.2.4.3. Digestión de los productos de PCR 25

......................................................... 2.2.4.4. Preparación de adaptadores 26

............................................................... 2.2.4.5. Ligación de adaptadores 26

2.2.4.6. Amplificación de los fragmentos de digestión de los

............................................................................... segmentos genómicos 26

.......................................... 2.2.4.7. Clonamiento de los productos de PCR 26

2.2.5. Secuenciamiento del gDNA de C. subvermispora ................................ 27

....................................... 2.2.5.1. Crecimiento del hongo en medio líquido 27

2.2.5.2. Extracción de gDNA de C. subvermispora .................................... 28

vi

....................................................................... 2.2.5.3. Digestión del gDNA 29

............................................................... 2.2.5.4. Ligación de adaptadores 29

..................... 2.2.5.5. Amplificación de fragmentos ligados a adaptadores 29

2.2.5.6. Recuperación de los productos de amplificación desde geles

.................................................................................................. de agarosa 30

.................................................................... 2.2.6. Procedimientos generales 31

2.2.6.1. Preparación de E. coli .................... DH5! F’ electrocompetentes 31

....................................................... 2.2.6.2. Extracción de DNA plasmidial 31

............................................................................ 2.2.6.3. Análisis de DNA 31

.................................................................... 2.2.6.4. Marcación de sondas 32

3. RESULTADOS ..................................................................................................... 33

..................................................................... 3.1. Identificación de bacteriófagos 33

.... 3.2. Comprobación de las hibridaciones de los bacteriófagos seleccionados 33

............................................ 3.3. Subclonamiento del DNA de los bacteriófagos 35

3.4. Reconstrucción de las secuencias de los segmentos genómicos

de C. subvermispora .................................................................................... 40

........................... 3.5. Secuenciamiento adicional de los segmentos genómicos 42

3.6. Identificación de un elemento de respuesta a Mn2+ ..................................... 44

4. DISCUSIÓN.......................................................................................................... 46

4.1. Caracterización de la respuesta fisiológica de C. subvermispora a Mn2+ .... 46

4.2. Comparación entre los resultados obtenidos por cDNA-AFLP y el estudio

de los segmentos genómicos relacionados con la respuesta a Mn2+ ............ 49

4.3. Elemento de respuesta a Mn2+ ..................................................................... 52

5. CONCLUSIONES ................................................................................................ 55

6. PROYECCIONES................................................................................................. 56

7. BIBLIOGRAFÍA ................................................................................................... 57

vii

INDICE DE FIGURAS

Página

Figura 1. Vías principales del transporte de Mn2+ en S. cerevisiae ................ 4

Figura 2. Esquema de digestión parcial usada en el subclonamiento........... 24

Figura 3. Diseño de partidores para la amplificación del segmento genómico de C. subvermispora ......................................................... 25

Figura 4. Amplificación de fragmentos de los segmentos genómicos .......... 27

Figura 5. Esquema de resumen de la estrategia para obtener información de secuencias vecinas a las determinadas para los segmentos genómicos ........................................................................................... 30

Figura 6. Extracción de DNA de bacteriófagos ................................................ 34

Figura 7. Resultados de la técnica de Southern Blot para la comprobación de las hibridaciones ............................................................................ 34

Figura 8. Ensayo de digestión de gDNA de bacteriófago con Sau3AI ........... 35

Figura 9. Amplificación del segmento del genoma de C. subvermispora

clonado en el vector LambdaGEM 11 ................................................ 37

Figura 10. Digestión de los amplicones obtenidos a partir del DNA de los bacteriófagos ........................................................................... 38

Figura 11. Amplificación de los fragmentos generados por digestión con Sau3AI ........................................................................................... 39

Figura 12. Amplificación de los fragmentos de gDNA de C. subvermispora con partidores de 2AC2 y PstRv ......................... 43

Figura 13. Resultado del análisis bioinformático de promotores de genes que responden a Mn2+......................................................... 45

Figura 14. Modelo integrativo del posible funcionamiento de los componentes identificados en la respuesta a Mn2+ en C. subvermispora ................................................................................ 47

Figura 15. Identificación del elemento de respuesta a Mn2+ en los promotores de MnP de C. subvermispora y P. chrysosporium ...... 53

viii

INDICE DE TABLAS

Página

Tabla 1. Oligonucleótidos utilizados en el estudio .......................................... 18

Tabla 2. Marcadores moleculares (TDFs) seleccionados ................................ 19

Tabla 3. Resultados de los análisis realizados a través de BLAST ................ 41

Tabla 4. Comparación entre las predicciones iniciales de los marcadores y pos-secuenciamiento de los segmentos genómicos ..................... 50

ix

ABREVIATURAS

ABC : ATP Binding Cassette

AcBSA : BSA acetiladaAFLP : Amplified Fragment Length Polymorphism

ATP : Adenosine triphosphate (Adenosín trifosfato)BLAST : Basic Local Alignment Search Tool

BSA : Bovine Serum Albumin (Seroalbúmina de bovino)Bsd2 : Bypass SOD defficiency

CCC1 : Ca2+-sensitive Cross- Complementer 1cDNA : DNA obtenido por la transcripción inversa de los mRNAcDNA-AFLP : AFLP que utiliza cDNA como sustratoCIAP : Calf Intestine Alkaline Phosphatase

DNA : Deoxyribonucleic acid (Ácido desoxirribonucléico)DMT1 : Divalent Metal Transporter 1dNTP : Mezcla de los desoxinucleótidos adenina, timidina, citosina y guanina.EDTA : Ácido EtilendiaminotetraacéticoEGFP : Enhanced Green Fluorescent Protein

gDNA : DNA genómicoIPTG : Isopropil-"-D-tiogalactosidoMCF : Mitochondrial carrier family

MFS : Major Facilitator Superfamily

MnP : Manganeso PeroxidasaMnSOD : Manganeso-superóxido dismutasaMRE : Metal Responsive Element

mRNA : RNA mesajeroMTM1 : Manganese traficking factor for mitochondrial SOD2NA : NicotianaminaNramp : Natural Resistance Associated Macrophage Protein

OPT : Oligopeptide Transporter (Transportador de oligopéptidos)pb : pares de basePCR : Polymerase Chain Reaction (Reacción en cadena de la polimerasa de DNA)PEG : Polyetilen glicolPVP : Polyvinyl pirrolidonaRNA : Ácido ribonucléicoROS : Reactive Oxygen Species

Smf : Suppressor of mif 1TDF : Transcript Derived Fragment

ufp : unidades formadoras de placas de lisisUPR : Unfolded Protein Response

YSL : YS1-Like protein

X-GAL : 5-Bromo-4-cloro-3-indolyl "-D-galactopiranósido

x

RESUMEN

“Identificación de genes que participan en la respuesta transcripcional al ion

Mn2+ en Ceriporiopsis subvermispora y análisis bioinformático de los promotores

de genes relacionados”

El manganeso es un componente esencial para los organismos, pues está involu-

crado en muchos de los procesos elementales de la célula. El estado de oxidación +2

es la forma más abundante de este metal en los sistemas biólógicos, en donde es re-

querido por una amplia diversidad de enzimas y proteínas. El ion Mn2+ destaca además

por su capacidad de controlar especies reactivas del oxígeno al interior de la célula.

Aún cumpliendo papeles tan importantes, se ha determinado que altas concentraciones

intracelulares de Mn2+ pueden ser tóxicas. Además, su deficiencia también es respon-

sable de ocasionar trastornos metabólicos que influyen en el desarrollo de los organis-

mos.

En el marco de comprender la dinámica de la homeostasis del ion Mn2+ en la célula,

se han caracterizado varios transportadores que participan en la movilización y alma-

cenamiento de este ion. La existencia de estos sistemas específicos demuestra la im-

portancia que posee el mantener el control estricto de las concentraciones de Mn2+ pa-

ra la célula. Por otra parte, se ha determinado que este ion es capaz de modular la ac-

tividad transcripcional de muchos genes, sin embargo, se desconocen los mecanismos

moleculares a través de los cuales es capaz de realizar esta actividad.

Ceriporiopsis subvermispora es un hongo que se ha caracterizado por ser un efi-

ciente basidiomicete que degrada la lignina. Nuestro grupo ha caracterizado en profun-

didad los procesos involucrados en la degradación de este polímero natural y se ha

determinado que una de las enzimas que utiliza este hongo es muy dependiente de la

disponibilidad del ion Mn2+. A partir de esta y otras evidencias, realizó un estudio de la

influencia de este ion sobre la expresión de la maquinaria ligninolitica en C. subvermis-

pora. Los resultados obtenidos permitieron postular la existencia de mecanismos com-

plejos asociados al control transcripcional de la enzima ligninolítica, sin lograr estable-

cer la forma en que participaba el Mn2+. Estos antecedentes sugerían que aspectos

fundamentales de la fisiología del Mn2+ en C. subvermispora debían ser abordados.

xi

En el trabajo aquí presentado se documenta la identificación de tres componentes

de la respuesta a Mn2+, lograda a través del secuenciamiento de regiones genómicas.

Estas regiones fueron identificadas parcialmente por estudios previos con la técnica de

cDNA-AFLP aplicada para estudiar la homeostasis de Mn2+ en C. subvermispora. Dos

de los segmentos identificados en este estudio muestran una alta homología a trans-

portadores que han sido muy bien caracterizadas en la movilización de este metal: un

homólogo del transportador de fosfatos inorgánicos de Saccharomyces cerevisiae

PHO84, y un transportador de sideróforos. Además, se identificó un segmento que pro-

viene de un marcador inducible por Mn2+, y su función predicha corresponde a una

epimerasa que podría participar en el control de especies radicalarias del oxígeno.

A partir de las funciones propuestas para estos componentes, se establece un mo-

delo integral del control de la concentración del ion Mn2+ y la actividad ligninolítica de

este hongo.

Finalmente, se presentan los resultados de la identificación de un motivo presente

en promotores de genes que son regulados por Mn2+, que sería específico para este

ion. La existencia de este elemento permitiría explicar la respuesta transcripcional pre-

viamente estudiada en C. subvermispora, postulando un mecanismo de control trans-

cripcional a través de factores proteicos capaces de reconocer el ion Mn2+. Esta evi-

dencia es contrastada con los hallazgos documentados en el último tiempo para el con-

trol ejercido por Mn2+, sugiriendo que este elemento sea funcional.

xii

ABSTRACT

“Identification of genes involved in transcriptional response to Mn2+ of the ligni-

nolytic basidiomycete Ceriporiopsis subvermispora and bioinformatic analysis of

the promoters of related genes”

Manganese is a fundamental component for most organisms, because it is involved

in many elemental cell processes. This metal is mainly found in biological systems with

an oxidation state of +2, being required by an enormous diversity of enzymes and pro-

teins. Mn2+ is highlighted by its ability of controlling reactive oxygen species inside the

cell. Although this ion has a fundamental physiological role, it has been determined that

high intracellular concentrations of Mn+2 can cause severe toxicity. Besides, the defi-

ciency of this ion is also responsible for metabolic alterations that may affect the devel-

opment of an organism.

Focused on understanding dynamics of cellular Mn2+ homeostasis, there have been

characterised several carriers involved in the processes of transport and storage of this

ion. These specific systems maintain a strict control of the concentration Mn2+ ion,

which is a very important process for the cell. There is evidence that this ion is capable

of regulating the transcriptional activity of many genes, however the molecular mecha-

nisms involved in this control are still unknown.

Ceriporiopsis subvermispora is a basidiomycete fungus that has been characterised

for being very efficient in lignin breakdown. The metabolic machinery employed by this

fungus to degrade this compound has been studied by our group and we have deter-

mined one of its members, the manganese peroxidase, is widely dependent on Mn2+

availability. This evidence along with other studies, prompted our group to conclude that

this ion could influence the expression of ligninolytic enzymes in C. subvermispora. We

explored this proposal and the results obtained were not sufficient for establishing the

role of Mn2+, but suggested the involvement of complex mechanisms that were capable

of regulating ligninolytic enzymes. To investigate the importance of Mn2+ in the expres-

sion of ligninolytic machinery, fundamental knowledge about Mn2+ homeostasis had to

be understood.

xiii

In the present work, identification of three components of Mn2+ homeostasis are

documented. These results were obtained by sequencing genomic regions, that were

partially described in a previous cDNA-AFLP analysis of Mn2+ homeostasis in C. sub-

vermispora. Two of the genomic regions identified showed high homology to well char-

acterised carriers involved in the transport of this ion: a homolog of the inorganic phos-

phate transporter of Saccharomyces cerevisiae PHO84, and an oligopeptide trans-

porter. The third region was identified from an inducible marker in the cDNA-AFLP

study, and its function was predicted to be an epimerase that could be involved in con-

trol of reactive oxygen species.

Considering predicted functions of the identified regions, an integrative model de-

scribing the control of Mn2+ concentration and ligninolytic activity is proposed.

Finally, the identification of a specific motif found in promoters of Mn2+ regulated

genes is presented. This element could explain the transcriptional response observed in

C. subermispora, through a transcription control mechanism involving a transcriptional

factors able to bind Mn2+. This result is compared with evidence from recent studies of

specific transcriptional control exerted by Mn2+, which suggests that this element is

functional.

xiv

1. INTRODUCCIÓN

1.1. Presentación

La caracterización de la respuesta fisiológica a metales en hongos basidiomicetes

que degradan lignina ha sido el objetivo principal del proyecto que enmarca la investi-

gación aquí documentada. En el presente estudio, se identificaron regiones genómicas

funcionales que se relacionan con la respuesta transcripcional al ion Mn2+, reciente-

mente estudiada en Ceriporiopsis subvermispora.

Esta sección comienza describiendo la importancia del manganeso en los seres vi-

vos y el conocimiento actual acerca de los mecanismos que participan en su transporte

y almacenamiento en distintos tipos de organismos. Posteriormente, se documenta la

investigación realizada en C. subvermispora y la importancia que adquiere el ion Mn2+

en los procesos de degradación de la lignina. Finalmente se exponen los estudios que

llevaron a caracterizar la respuesta transcripcional para este catión, a partir de la cual

se origina esta tesis.

1.2. Manganeso en sistemas biológicos

El manganeso es un componente esencial para los organismos, ya que es requerido

por enzimas que participan en procesos elementales de la célula. Este metal puede

encontrarse en sistemas biológicos con estados de oxidación +2, +3, +4 y posiblemen-

te +5, siendo el estado de oxidación +2 el más importante en este contexto. El ion Mn2+

posee un papel fundamental en la catálisis enzimática que realizan, entre otras, liasas,

hidrolasas, ligasas, y transfersas (Weatherburn, 2001). Ejemplos de enzimas de estos

grupos corresponden a la piruvato carboxilasa, presente en el citoplasma, a glucosil-

transferasas en el Golgi, enzimas del ciclo de Krebs y la polimerasa de DNA, necesaria

para el proceso de replicación, la que ha sido aislada con Mn2+ en su sitio activo (Pelle-

tier y Sawaya, 1996). A nivel estructural es requerido por una diversidad de proteínas

como lectinas e integrinas, además de factores transcripcionales, hasta ahora descritos

sólo en bacterias (Papp-Wallace y Maguire, 2006). En plantas, el requerimiento de

Mn2+ es más evidente, pues este ion forma parte del complejo que cataliza la oxidación

del agua en el fotosistema II durante el proceso de fotosíntesis.

1

Una de las funciones primordiales de este ion es su participación en el control del

estrés oxidativo. La enzima mitocondrial superóxido dismutasa dependiente de manga-

neso (MnSOD) tiene un papel importante en este aspecto, ya que esta enzima cataliza

la conversión de superóxido en oxígeno molecular, a través de la oxidación del ion

Mn2+ a Mn3+ (Bannister et al., 1987). Sin embargo, la actividad de esta enzima podría

ser secundaria al efecto del ion Mn2+, ya que en organismos procariontes se ha descri-

to que este ion actuaría de forma directa en el control de especies reactivas de oxíge-

no, según el estudio en mutantes que no poseen MnSOD (Al-Maghrebi et al., 2002; Ar-

chibald y Fridovich, 1981).

La concentración de Mn2+ al interior de la célula varía dentro del rango micromolar

(Finney y O'Halloran, 2003). Este ion se localiza principalmente asociado a proteínas o

bien al interior de organelos en organismos eucariontes, y en menor proporción, en el

citoplasma unido a moléculas pequeñas como nucleótidos, aminoácidos y glutatión. El

retículo endoplásmico, Golgi y mitocondria, así como la vacuola y el cloroplasto, son

los principales organelos en que se almacena el ion Mn2+ (Culotta et al., 2005; Pittman,

2005). Altas concentraciones intracelulares de este metal resultan tóxicas para muchos

organismos, sin embargo, existen casos como el de Lactobacillus plantarum, que es

capaz de sobrevivir a concentraciones de 35 mM de Mn2+ (Archibald, 1986). Por otra

parte, existe evidencia que la carencia de este metal puede tener consecuencias tras-

cendentales en el crecimiento de un organismo. En Arabidopsis thaliana se ha descrito

que la deficiencia de Mn2+ en los suelos conduce a cambios en el patrón de desarrollo

de sus raíces (Yang, et al., 2008).

La evidencia presentada acerca de los efectos del Mn2+ sobre los organismos guían

el estudio sobre este ion hacia los mecanismos que existen para controlar su concen-

tración al interior de la célula y al tipo de factores que participan en su homeostasis. La

revisión de la dinámica de este ion y cómo éste es movilizado se expone en la siguien-

te sección.

2

1.3. Fisiología del transporte de Mn 2+

La adaptabilidad de los organismos frente a las variaciones en la concentración del

ion Mn2+ está determinada por la capacidad de transportar y almacenar este metal. En

organismos procariontes, existen dos tipos de transportadores que están involucrados

en la movilización de Mn2+ (Papp-Wallace y Maguire, 2006). El primer tipo forma parte

de la familia de transportadores Nramp (Natural Resistance Associated Macrophage

Protein), caracterizados por tener un centro hidrófobo altamente conservado de 10 do-

minios transmembrana, los que se encuentran presentes tanto en microorganismos

como en organismos superiores (Cellier et al., 1995). Los Nramp’s son capaces de mo-

vilizar cationes bivalentes de forma dependiente de protones, actuando como una de

las principales vías de incorporación de Mn2+.

El segundo tipo corresponde a transportadores ABC (ATP Binding Cassettes), de-

nominados permeasas de Mn2+, capaces de trasladar este metal por hidrólisis de ATP.

Al no tener una estructura celular compartimentalizada, los organismos procariontes

deben controlar rigurosamente la actividad de estos transportadores. Sin embargo, se

ha descrito que algunos miembros de este reino pueden almacenar este metal en

grandes concentraciones, formando complejos de alto peso molecular en su interior

(Archibald y Fridovich, 1981).

En organismos eucariontes hay una mayor diversidad de transportadores involucra-

dos en la internalización de Mn2+. Saccharomyces cerevisiae ha sido el modelo utiliza-

do ampliamente para caracterizar la fisiología de este ion en eucariontes (Culotta et al.,

2005; Pittman, 2005) (Figura 1). En esta levadura se ha descrito un sistema de interna-

lización compuestos por Smf1 y Smf2, ambos miembros de la familia Nramp (Culotta et

al., 2005). Smf1 se localiza en la membrana plasmática y media el ingreso de Mn2+ al

interior de la célula. El ion internalizado de esta forma es incorporado de forma especí-

fica en vesículas del Golgi, siendo finalmente movilizado al citoplasma por Smf2, trans-

portador presente en estas vesículas. Este sistema posee un interesante mecanismo

de regulación a nivel postraduccional dependiente de Mn2+ (Liu y Culotta,1999), siendo

el único de este tipo descrito a la fecha para este ion. En condiciones de alta disponibi-

lidad de Mn2+ al interior de la célula, este ion se une a Smf1 y le induce un cambio con-

formacional que es reconocido por Bsd2. El complejo posteriormente es movilizado a la

vacuola para su degradación.

3

Figura 1. Vías principales del transporte de Mn2+ en S. cerevisiae. En la

figura se esquematiza el ingreso de Mn 2+ a la célula (SMF1/SMF2 y PHO84) y su

compartimentalización en Golgi (PMR1), mitocondria (MTM1) y vacuola (CCC1 y

COS16). Adaptado de Culotta et al., 2005.

Otro sistema descrito para la incorporación de Mn2+ es a través de un miembro de la

familia de transportadores MFS (Major Facilitator Superfamily). PHO84 es un gen de S.

cerevisiae que codifica para un transportador de fosfato inorgánico (Pi) y participaría en

el transporte del Mn2+ cuando el sistema de Smf1/Smf2 se encuentra apagado. En un

estudio realizado por Fristedt et al. en 1999, se utilizó como modelo de estudio proteo-

liposomas reconstituidos que contenían este transportador, y con esto se determinó

que la incorporación de Pi era dependiente de metales, ya que la actividad aumentaba

significativamente en presencia de Mn2+ y cobalto (Co2+), siendo completamente inhibi-

da por EDTA. Posteriormente, en otro estudio se determinó que cepas de S. cerevisiae

!pho84 eran resistentes a altas concentraciones de Mn2+, lo que permitió establecer

una participación fundamental de este transportador en la toxicidad observada a Mn2+

en este modelo (Jensen et al., 2003).

Además se han descrito otros transportadores en modelos de plantas y mamíferos.

En Arabidopsis thaliana se han identificado tres genes pertenecientes a la familia de

Nramp’s (AtNramp1, 2 y 3). La expresión heteróloga de estos genes en S. cerevisiae

es capaz de complementar mutantes incapaces de sobrevivir en ausencia de Mn2+

(!smf1), lo que establece la participación de estos transportadores en el transporte de

este ion (Thomine et al., 2000). Por otra parte, en soya (Glycine max) se ha identificado

el gen GmDMT1, que codifica para un transportador homólogo a DMT1 (Divalent Metal

4

COS16

Transporter 1) de la familia Nramp. Al introducir este gen en S. cerevisiae, el transpor-

tador expresado, media la incorporación del ion hierro (Fe2+) marcado radiactivamente

a este organismo. Al agregar Mn2+ a una concentración final de 100 #M al medio de

cultivo, se observó disminución significativa de la incorporación de Fe2+ radiactivo, por

lo que este transportador posee mayor afinidad para el transporte de Mn2+ en compa-

ración a Fe2+, y también a zinc (Zn2+) y a cobre (Cu2+), como se caracterizó posterior-

mente (Kaiser et al., 2003).

Un interesante mecanismo descrito en plantas para el transporte de metales son los

fitosideróforos, compuestos derivados de nicotianamina (NA) que son capaces de que-

lar metales en los suelos de cultivo. Estos complejos son luego incorporados en la

planta por transportadores específicos. En arroz (Oryza sativa) se identificó un gen si-

milar al transportador de fitosideróforos YS1 de maíz, y fue denominado OsYSL2 (YS1-

like gene) (Koike et al., 2004). Al expresar este gen en oocitos de Xenopus laevis, este

es capaz de transportar complejos de Fe2+-NA y Mn2+-NA hacia el interior de estas cé-

lulas. Si bien los derivados de NA constituyen los fitosideróforo, se ha descrito que la

NA podría movilizar metales en el interior de la planta, una vez que han sido atrapados

desde el suelo (Takahashi et al., 2003).

YS1 y OsYSL2 pertenecen a la familia de transportadores de oligopéptidos (OPT:

Oligopeptide Transporter Family) caracterizada por movilizar péptidos entre tres a seis

aminoácidos (Yen et al., 2001). El transportador AtOPT3 de A. thaliana, también es un

miembro de esta familia. A nivel transcripcional, AtOPT3 se caracteriza porque su ex-

presión es fuertemente inducida en la raíz de esta planta, en condiciones de deficiencia

de Mn2+ en los suelos. Al ser expresado en levadura (S. cerevisiae) también es capaz

de complementar mutantes !smf1 (Wintz et al., 2003).

En el modelo mamífero de rata, se han caracterizado una gran variedad de transpor-

tadores de Mn2+ (Au et al., 2008; Aschner, 2000). Estos han sido estudiados en el con-

texto de la neurotoxicidad asociada a este ion, con el objetivo de establecer las vías de

tráfico de éste hacia el cerebro y a través de la barrera hemato-encefálica. Entre estos

están DMT1 (Garrick et al., 2003), ZIP-8, miembro de la familia transportadora de me-

tales SLC39 (He et al., 2006), el receptor de transferrina (Tf) (TfR) (Davidsson et al.,

1989), canales de Ca2+ dependientes de voltaje (Lucaciu et al., 1997), y receptores io-

notrópicos de glutamato (Kannurpatti et al., 2000). Sin embargo, se desconoce el grado

5

de participación de estos transportadores en el control de la concentración de Mn2+, por

lo que es necesario caracterizar la fisiología de este metal en organismos eucariontes

superiores.

1.4. Mn2+ al interior de la célula

El ion Mn2+ dentro de la célula es movilizado hacia el interior de los organelos en los

organismos eucariontes. Estos compartimientos subcelulares contienen transportado-

res que median su internalización de manera específica, los que también han sido muy

bien caracterizados en S. cerevisiae (Culotta et al., 2005).

En la mitocondria de esta levadura se localiza MTM1, que pertenece a la familia

MCF (Mitochondrial Carrier Family). MTM1 moviliza Mn2+ al interior de este organelo de

forma exclusiva para el funcionamiento de la enzima MnSOD, lo que fue demostrado

por estudios realizados en cepas !mtm1, en las que se observó una pérdida de la acti-

vidad de esta enzima, sin afectar la concentración mitocondrial ni citosólica de este me-

tal (Luk et al., 2003). Estos antecedentes sugieren que la participación del Mn2+ en el

control de ROS al interior de la célula es crucial.

Pmr1 es una ATPasa tipo P que transporta calcio (Ca2+) y Mn2+ al interior del Golgi.

Este transportador es fundamental para el adecuado procesamiento y tráfico de proteí-

nas en la vía secretora, como se ha demostrado en cepas de S. cerevisiae !pmr1, en

las que se observa un bloqueo de la respuesta UPR (Durr et al., 1998).

Por otra parte Pmr1 podría funcionar como una ruta de eliminación de Mn2+ a través

de vesículas secretoras cuando este ion se encuentra en concentraciones elevadas.

Además de este transportador, existen CCC1 y COS 16, que se localizan en la vacuola

y representan una alternativa rápida para el control de las elevadas concentraciones de

Mn2+ (Li, L. et al., 2001; Paidhungat, M. y Garrett, S.,1998)

1.5. Ceriporiopsis subvermispora

Ceriporiopsis subvermispora es un hongo filamentoso que pertenece a la división

basidiomycota y se caracteriza por degradar de forma selectiva y eficiente la lignina

(Otjen, L., et al, 1987). Este organismo es uno de los causantes de la denominada “pu-

drición blanca”, debido a que el proceso de degradación causa un blanqueamiento de

6

la madera donde actúa. La maquinaria metabólica que posee este hongo, así como su

regulación para atacar a este polímero natural ha sido el foco principal de investigación

de nuestro grupo por más de 10 años, pues sustenta una propuesta para la obtención

de celulosa menos nociva para el medio ambiente, al reducir el uso de compuestos

químicos altamente dañinos.

En el presente estudio, se ha propuesto comprender la homeostasis del ion Mn2+ en

C. subvermispora, a raíz de los diversos efectos observados en este organismo por

efecto de este metal. De forma específica, se pretende comprender qué componentes

celulares son alterados por el ion Mn2+ y cómo esto influye sobre la actividad de la ma-

quinaria que posee el hongo para degradar la lignina.

La revisión de los componentes de movilización, almacenamiento y eliminación de

Mn2+ descritos en los distintos modelos es fundamental para comprender la respuesta

observada en C. subvermispora. En la siguiente sección se exponen los estudios que

llevaron a investigar la respuesta transcripcional a éste y otros metales en C. subver-

mispora.

1.6. Mn2+ en C. subvermispora: Degradando la lignina

La lignina es un biopolímero estructural de la madera que representa una de las

formas más estables y abundantes de fijación del carbono (Sakakibara y Sano, 2001).

Esta estructura está formada por monolignoles, que corresponden a compuestos fenil-

propanoides derivados del aminoácido fenilalanina. Estos monómeros son ensambla-

dos según un patrón de síntesis complejo e irregular, que varía incluso dentro de distin-

tos tejidos de un organismo vegetal (Whetten et al., 1998). Por otra parte, estas unida-

des también pueden unirse covalentemente a otras estructuras de la pared celular, en-

trecruzando polisacáridos y proteínas en una red muy compleja de macromoléculas.

Estas características hacen de la lignina un sustrato difícil de degradar, propiedad que

genera un gran impacto económico en la industria del papel para lograr la completa

degradación de este componente vegetal.

El sistema de degradación de lignina de C. subvermispora se compone esencial-

mente por las enzimas lacasa y manganeso peroxidasa (MnP) (Rüttimann et al., 1992).

La lacasa cataliza la oxidación en un electrón de compuestos fenólicos, reacción que

7

es mediada por un centro catalítico compuesto por cuatro átomos de Cu2+. La MnP es

una hemo-glicoproteína que cataliza la oxidación de Mn2+ a Mn3+, ion que es capaz de

oxidar compuestos fenólicos cuando se encuentra quelado por ácidos orgánicos. Estas

enzimas son secretadas como una multiplicidad de isoformas, cuyos puntos isoeléctri-

cos van entre 4,1 y 4,6 para la MnP y entre 3,45 y 3,65 para la lacasa (Lobos et al.,

1994).

Las isoformas de MnP provienen de la expresión de cuatro genes en C. subvermis-

pora que han sido identificados por nuestro grupo, denominados Csmnp1, Csmnp2A,

Csmnp2B y Csmnp3 (Tello et al., 2000). En la secuencia de los promotores de

Csmnp1, Csmnp2B y Csmnp3, determinados en el estudio citado anteriormente, se

definieron posibles elementos de respuesta a metales o MRE (Metal Responsive Ele-

ments), que corresponden a una secuencia consenso TGCRCnC (R: A o G; n: A,C,T o

G), parcialmente superpuesta a una región rica en contenido GC (Culotta y Hamer,

1989; Stuart et al., 1984). A partir de este hallazgo y sumado al antecedente previo que

la actividad de la enzima MnP es absolutamente dependiente de Mn2+ (Rüttimann et

al., 1992), se sugirió que estos genes podrían ser regulados por este ion. Un argumen-

to externo que sustentaba esta propuesta era la evidencia reciente de estudios realiza-

dos en otros basidiomicetes ligninolíticos como Trametes versicolor (Johansson et al.,

2002), Phanerochaete chrysosporium (Brown et al., 1991) y Pleurotus ostreatus

(Cohen et al., 2002), en los que se determinó que el ion Mn2+ era capaz de regular la

expresión de los genes de MnP.

A partir de los antecedentes señalados, se realizó un estudio para determinar si el

ion Mn2+ era capaz de ejercer algún efecto directo sobre la activación de los genes de

MnP (Manubens et al., 2003). En este trabajo, se estableció que Csmnp1 era comple-

tamente reprimido por Mn2+ en concentraciones superiores a 80 #M y la expresión de

Csmnp2 no se alteraba de forma significativa en el rango de concentraciones utilizadas

(0 a 320 #M). Sin embargo, la actividad máxima de MnP se detectaba entre 80 y 160

#M, mostrando un comportamiento muy distinto al esperado. Estos resultados sugerían

la existencia de un mecanismo de regulación postraduccional para Csmnp1. Poste-

riormente, al investigar la especificidad de la respuesta observada a través de la adi-

ción de metales como Cu2+, Zn2+, plata (Ag2+) y cadmio (Cd2+), en ausencia de Mn2+, se

determinó que éstos eran capaces de incrementar la cantidad de RNA mensajero de

8

Csmnp1 y Csmnp2, pero sin existir una correlación con un aumento de la actividad de

la MnP, la que paradójicamente se veía completamente abolida.

En vista de la compleja interpretación de estos resultados, se propuso realizar un

estudio global de los efectos de metales divalentes sobre el metabolismo de este hon-

go. En este contexto, la caracterización de la respuesta fisiológica de C. subvermispora

frente a Mn2+ es fundamental para entender los resultados observados para Csmnp1.

1.7. Respuesta fisiológica a Mn2+ en C. subvermispora

El genoma de C. subvermispora aún no ha sido secuenciado, por lo que los estudios

de genómica funcional que entregan grandes cantidades de información, como los mi-

croarreglos de cDNA, no pueden ser aplicados a este hongo. Para caracterizar la res-

puesta a Mn2+ se utilizó la técnica de cDNA-AFLP, utilizando como material de estudio

los cDNAs obtenidos a partir de la transcripción inversa de los RNA mensajeros de C.

subvermispora, cultivado en distintas concentraciones de Mn2+.

La técnica de AFLP consiste en la generación de pequeños fragmentos de DNA a

través de PCR (Polymerase Chain Reaction), los que idealmente forman un perfil único

de bandas para un individuo en estudio. De esta forma, es posible distinguir entre dos

individuos por la diferencia en el perfil de bandas o “marcadores” en alguno de ellos.

Esta técnica no requiere del conocimiento previo de secuencias propias del individuo,

pues la generación de los marcadores se obtiene a partir de la selección aleatoria de

fragmentos de DNA. Al emplear cDNA como sustrato, se puede estudiar un mismo in-

dividuo bajo distintos estímulos, de forma de observar variaciones en el perfil de ban-

das, los que serán un reflejo de la expresión de genes en la condición estudiada.

Así, el primer estudio de cDNA-AFLP identificó un total de 21 marcadores o frag-

mentos derivados de transcrito (TDF: Transcript Derived Fragment) (Gutierrez et al.,

2008). De éstos, nueve mostraron una inducción y cinco una represión por efecto del

Mn2+. El resto de los marcadores mostró un perfil de expresión sin una tendencia defi-

nida. El posterior secuenciamiento de estos marcadores permitió realizar búsquedas

bioinformáticas en base a homología de secuencias a través de la herramienta BLAST.

En esta búsqueda se identificaron importantes genes que podrían participar en la res-

puesta a Mn2+. Sin embargo, el pequeño tamaño de los diversos fragmentos obtenidos

9

por la técnica de cDNA-AFLP (200 a 400 pb aprox.) no permitió esclarecer con certeza

la identidad de todos de ellos.

Para caracterizar la respuesta a Mn2+ se hace imprescindible la identificación ade-

cuada de los genes de C.subvermispora cuya expresión se ve modulada por este ion.

Para esto, se ha propuesto obtener la secuencia completa de los genes correspondien-

tes de los TDFs inicialmente identificados en el estudio de cDNA-AFLP.

La investigación aquí presentada pretende profundizar en la identificación de algu-

nos de estos genes para cumplir con el objetivo propuesto. Además intenta abordar el

estudio de sus respectivos promotores, con el fin de determinar si existen secuencias o

motivos comunes en ellos que permitan postular la existencia de algún nuevo factor

transcripcional que se una directamente al ion Mn2+ o bien que explique la respuesta

observada. En bacterias se ha descrito un factor transcripcional que responde a este

ion, denominado MntR (Que y Helmann, 2000). Este actúa como represor de los trans-

portadores MntH y MntABCD en respuesta a altas concentraciones de Mn2+. Sin

embargo, es capaz de activar la expresión de MntABCD cuando los niveles de este ion

son bajos. Esta evidencia sugiere que posiblemente exista un factor transcripcional es-

pecífico para Mn2+ también en eucariontes.

Otra evidencia que sustenta esta búsqueda, es el estudio realizado por el grupo de

Ma et al., el 2004. En este trabajo, se caracterizó el promotor del gen mnp1 de Phane-

rochaete chrysosporium. Para esto, se construyeron vectores que contenían variacio-

nes en la secuencia de esta región, fusionadas al gen de EGFP (Enhanced Green

Fluorescent Protein), para medir la actividad transcripcional. A través de este análisis

los atuores identificaron un segmento de 33 pb presente en el promotor del gen mnp1,

que sería responsable de su activación transcripcional in vitro. Esta secuencia también

se encuentra presente en los otros genes de MnP de este organismo, mnp2 y mnp3.

Este hallazgo es la única evidencia concreta que supone la existencia de un factor

transcripcional específico de Mn2+, sin embargo, no hay estudios posteriores que pro-

fundicen en su búsqueda.

10

1.8. Análisis bioinformático de promotores

El desarrollo del área de la bioinformática ha permitido, entre otras cosas, imple-

mentar estrategias que facilitan la comparación de secuencias. En la última década se

han desarrollado muchos algoritmos que permiten realizar búsquedas de elementos

comunes entre secuencias de DNA, basados en la comparación de datos obtenidos a

partir de análisis funcionales previos (Das y Dai, 2007). El objetivo final de estos algo-

ritmos es definir elementos de regulación a partir de las secuencias ingresadas para el

análisis. En este contexto, el algoritmo MM desarrollado por Bailey y Elkan en 1994, ha

sido incorporado en programas de análisis desarrollados exclusivamente para realizar

búsquedas in silico de elementos funcionales. Este algoritmo se basa en la búsqueda

de secuencias o motivos comunes dentro de contextos que presentan características

similares, las que son determinadas a través de parámetros que se ajustan a un mode-

lo probabilístico. De esta forma, el modelo probabilístico será definido a través de 2

componentes: la repetición del motivo y el contexto en el que se encuentra. Posterior-

mente, el algoritmo filtra aquellos motivos que son estadísticamente significativos.

La investigación actual propone aplicar un enfoque basado en una aproximación

informática para caracterizar motivos de DNA relacionados con la respuesta a Mn2+.

De esta forma se pretende estimar de manera más precisa la secuencia de DNA aso-

ciada con la respuesta observada, para posteriormente realizar una comprobación fun-

cional a través de métodos convencionales, como EMSA y footprinting.

A partir de secuencias presentes en las regiones reguladores de genes que son mo-

dulados por el ion Mn2+, se pretende definir un elemento que se asocie a la respuesta

observada para este metal en C.subvermispora.

11

A partir de los antecedentes anteriormente expuestos se ha establecido la siguiente

hipótesis de estudio:

“Los genes de C. subvermispora que aumentan su expresión por efecto del

Mn2+ contienen secuencias específicas en sus promotores que se asocian a la

respuesta observada para este metal.”

Esta propuesta engloba la descripción de los componentes de la respuesta a Mn2+

de C. subvermispora y los posibles mecanismos moleculares que actuarían para que

este ion controe la expresión de los genes involucrados.

Para determinar si la afirmación propuesta es correcta, se ha propuesto el siguiente

objetivo general:

Realizar una exploración bioinformática de los promotores de al menos 3 genes que

aumentan su expresión por estímulos con manganeso y establecer elementos específi-

cos relacionados con la respuesta.

Una caracterizados los genes de C. subvermispora, será posible determinar la pre-

sencia de elementos regulatorios presentes en los respectivos promotores.

12

El objetivo general se desglosa en los siguientes objetivos específicos:

1.- Buscar los clones que contienen los genes que se inducen por efecto de Mn2+

en la genoteca genómica de C. subvermispora, construida en el bacteriófago

Lambda GEM-11.

El objetivo consiste en identificar los bacteriófagos que contienen segmentos del

genoma de C. subvermispora, en donde se localizan los genes que inducen su expre-

sión por efecto del Mn2+, utilizando como sondas los TDFs obtenidos por cDNA-AFLP.

2.- Comprobar que los bacteriófagos identificados contienen el segmento de in-

terés a través de Southern Blot.

Luego de identificar los bacteriófagos estos serán seleccionados y amplificados para

realizar una preparación de DNA de cada de ellos. A partir de sus respectivos DNA se

comprobarán las hibridaciones positivas del punto anterior a través de Southern Blot.

3.- Subclonar los segmentos genómicos de C. subvermispora almacenados en

los bacteriófagos seleccionados y posteriormente secuenciar los fragmentos

parciales.

El DNA de cada bacteriófago seleccionado será fragmentado por digestión parcial y

posteriormente se clonarán los fragmentos generados. Cada clon será enviado a se-

cuenciar a la empresa Macrogen Inc (Seúl, Corea).

4.- Reconstruir los segmentos genómicos a partir de la secuencia de los frag-

mentos parciales e identificar motivos específicos en los promotores de los ge-

nes encontrados.

Utilizando las secuencias de los fragmentos obtenidos, se realizará un ensamblaje

computacional de cada una de ellas, para así obtener los contigs de los segmentos ge-

nómicos. Cada uno de ellos será posteriormente analizado a través de múltiples servi-

dores bioinformáticos, de modo de definir cada uno de los componentes de los seg-

mentos.

Finalmente, se hará el análisis bioinformático de cada promotor en búsqueda de

elementos relacionados con la respuesta a Mn2+.

13

2. MATERIALES Y METODOLOGÍA

2.1. Materiales

2.1.1 Reactivos e insumos generales

BD® (Becton, Dickinson and Company; Franklin Lakes, New Jersey, EE.UU.): Bac-to Agar, extracto de levadura, Bacto Peptona.

Chimerx (Madison, Wisconsin, EE.UU.): CviJI.

Fermentas (Glen Burnie, Maryland, EE.UU.): GeneRuler™ 1 kb DNA Ladder

GE Healthcare® (Buckinghamshire, Inglaterra): Films autorradiográficos (Amersham Hyperfilm™ MP).

Invitrogen® (Carlsbad, California, EE.UU.): fenol, glicerol, pCR®2.1 TOPO.

Merck KGaA (Darmstadt, Alemania): MgSO4$7H2O, CaCl2$2H2O, NaOH, glucosa, clo-roformo, alcohol isoamílico, isopropanol, etanol, gelatina, citrato trisódico di hidratado, NaH2PO4$H2O, ácido bórico, KH2PO4, acteato de sodio.

Millipore (Billerica, Massachusetts, EE.UU.): Membranas de transferencia de placas de lisis de bacteriófagos (Immobilon-Ny+).

New England BioLabs (Ipswich, Massachusetts, EE.UU.): HindIII, EcoRI, PstI, BamHI, T4 Polinucleótido quinasa, LongAmp Taq DNA polimerasa, Crimson LongAmp Taq DNA polimerasa, AcBSA, % DNA-HindIII Digest.

Pall Corporation (East Hills, New York, EE.UU.): Membranas de transferencia para Southern Blot (Biodyne® Nylon).

Promega® (Madison, Wisconsin, EE.UU.): Formamida, GoTaq DNA polimerasa, T4 DNA Ligasa, rATP, dATP, dCTP, dTTP, dGTP, Sau3AI, CIAP (Calf Intestine Alkaline

Phosphatase).

Sigma-Aldrich® (St. Louis, Missouri, EE.UU.): Ácido trans-aconítico, PVP-40, ampici-lina, tartrato de amonio, Ficoll Tipo 400, maltosa monohidrato, PEG (P.M. 8000), KCl, MgCl2.

USBiological (Swampscott, Massachusetts, EE.UU.): Tris Base, EDTA, proteinasa K, RNasa, X-GAL, IPTG, SDS, RNasa A y DNasa I.

Vetec Química Fina (Duque de Caxias, Río de Janeiro, Brasil): NaCl, Tween 20, ácido clorhídrico fumante.

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2.1.2. Material biológico

Ceriporiopsis subvermispora: La cepa FP-105752 de C. subvermispora, fue gentil-

mente donada por el Center For Mycology Research (CFMR, Forest Products Labora-

tory, Madison, Wisconsin, EE.UU). El micelio fue mantenido a 4' en placas de agar

papa dextrosa (39 g/L).

Escherichia coli: Las cepas LE392 y DH5! F’ fueron obtenidas a partir de stocks pre-

parados en el laboratorio de las cepas originales adquiridas de Gibco BRL Life Techno-

logies (Gaithersburg, Maryland, EE.UU.).

Genoteca genómica de C. subvermispora: Se utilizó la genoteca genómica de este

hongo, previamente construida por nuestro grupo en el vector LambdaGEM®-11 (Pro-

mega, Madison, EE.UU)

2.1.3. Medios de cultivo

2.1.3.1. Medios para el crecimiento de cepas bacterianas y bacteriófagos

Caldo LB: Para el crecimiento de E.coli se utilizó caldo LB, compuesto por 1% (p/v)

Bacto Peptona, 0,5% (p/v) extracto de levadura y 0,5% (p/v) NaCl. El medio fue ajusta-

do a pH 7,5 con NaOH 10 M y posteriormente autoclavado a 121' por 15 min. El me-

dio de crecimiento de la cepa LE392 además contenía maltosa al 0,2% (p/v) y MgSO4

10 mM , para la infección con los bacteriófagos. En aquellos casos donde era requeri-

do, se agregó ampicilina a una concentración de 50 #g/mL.

Medio SOC modificado: Para la recuperación de la cepa DH5! F’ transformada, se

utilizó un medio compuesto por Bacto Peptona al 2% (p/v) (en vez de triptona), extracto

de levadura al 0,5% (p/v), NaCl al 0,05% (p/v), KCl 2,5 mM, MgCl2 10 mM y 0,36% (p/v)

de glucosa.

Placas de agar LB: Se agregaron 15 g de Bacto Agar por litro de caldo LB y la mezcla

fue autoclavada a 121' por 15 min. El medio fundido fue vertido sobre placas de vidrio

de 90 mm de diámetro. Los antibióticos y nutrientes termolábiles requeridos en cada

caso, fueron agregados previa solidificación del medio (60').

15

Agar LB blando (Top agar): A 100 mL de caldo LB suplementado con MgSO4 10 mM,

se agregó Bacto Agar a una concentración final de 0,8%. La mezcla fue autoclavada a

121' por 15 min y luego dividida en alícuotas de 3 mL en tubos de vidrio. Las alícuo-

tas fueron mantenidas a 47' hasta el momento de usarlas.

2.1.3.2. Medios de cultivo para C. subvermispora

Medio de cultivo estacionario: El medio de cultivo estacionario estaba compuesto por

KH2PO4 1,5 mM, MgSO4 0,4 mM, CaCl2 0,1 mM, glucosa al 1% (p/v), ácido trans-aconí-

tico (TAA) 10 mM a pH 4,5, tiamina-HCl al 0,001% (p/v), tartrato de amonio 11 mM,

MnSO4 0,2 mM y 1X de solución de elementos trazas. La solución 1000X de elementos

trazas contenía 15 g/L de ácido nitrilotriacético, 1 g/L de FeSO4$7H2O, 0,85 g/L de Co-

Cl2$6H2O, 1 g de ZnSO4$7H2O, 1 g de CuSO4$5H2O, 0,07 g de Al2(SO4)3$18H2O, 0,1 g

de H3BO3, 0,1 g de Na2MoO4$2H2O, 30 g de MgSO4$7H2O, 10 g de NaCl y 1 g de Ca-

Cl2$2H2O. Una vez mezclada, la solución fue autoclavada a 121' por 20 minutos.

Medio de cultivo estándar: El medio estándar tiene la misma composición base del

medio de cultivo estacionario, a excepción del MnSO4, que en este caso se disminuyó

a 0,16 mM. Además, este medio contenía Tween al 0,001% (v/v).

2.1.4. Amortiguadores y soluciones:

Fenol:Cloroformo:Alcohol Isoamílico (25:24:1): Fenol saturado con Tris-Cl pH 8,0 mezclado con una parte igual de cloroformo: alcohol isoamílico (24:1).

GYT: 1% glicerol, 0,125% (p/v) Extracto de levadura y 0,25% (p/v) Bacto Peptona.

SM: Tris-Cl 50 mM pH 7,5, NaCl 100 mM, MgSO4 8 mM y gelatina al 0,01%.

Solución de Denhardt 50X: 1% (p/v) Ficoll 400, 1% (p/v) PVP 40, 1% BSA.

SSC 1X: NaCl 150 mM, Citrato de sodio 15 mM, ajustado a pH 7,5 con HCl.

SSPE 1X: NaCl 150 mM, NaH2PO4 10 mM, EDTA 1 mM, ajustado a pH 7,4 con NaOH.

Stop mix: Azul de bromofenol al 0,25% (p/v), xileno cianol al 0,25% (p/v), glicerol al 30% (v/v) y EDTA 10 mM.

TBE 1X: Tris-borato 90 mM pH 8, EDTA 2 mM.

TE: Tris-Cl 10 mM pH 8,0, EDTA 1 mM.

16

2.1.5. Sistemas comerciales

Purificación de DNA de bacteriófago: Para la purificación del DNA de los bacteriófa-

gos, se utilizó el sistema QIAGEN Lambda Midi Kit. Este sistema permite obtener hasta

60 #g de DNA de bacteriófago de alta pureza.

Purificación de productos de PCR y de bandas de geles de agarosa: Para recupe-

rar el DNA de geles de agarosa se utilizó el sistema UltraClean™ 15 DNA Purification

Kit. La ventaja de este producto es que también permite realizar la purificación de pro-

ductos de PCR.

2.1.6. Herramientas y programas para análisis bioinformáticos

El programa utilizado para determinar las homologías de las sondas y de los seg-

mentos genómicos fue la versión en línea de BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/) del

sitio del National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).

El ensamblaje de las secuencias se realizó utilizando la versión de prueba de la he-

rramienta SeqMan, incluida en el paquete comercial del producto Lasergene DNAstar

(http://www.dnastar.com/).

Los programas utilizados para el estudio del elemento de respuesta a Mn2+ fueron

GADEM (http://www.niehs.nih.gov/research/resources/software/gadem/) y MEME

(http://meme.nbcr.net/meme4_1/cgi-bin/meme.cgi). Los códigos de fuente de estos

programas fueron descargados e instalados para utilizarlos localmente.

El programa WebLogo (http://weblogo.berkeley.edu/) fue descargado y utilizado para

la generación de las secuencias consenso obtenidas de los análisis hechos por GA-

DEM y MEME.

2.1.7. Material radiactivo

Los nucleótidos [&32P] ATP y [!32P] dCTP fueron adquiridos en PerkinElmer (Wal-

tham, Massachusetts, EE.UU.).

17

2.1.8. Oligonucleótidos

Tabla 1. Oligonucleótidos utilizados en el estudio. Los oligonucleótidos fue-

ron diseñados con la herramienta PrimerQuest del sitio Integrated DNA Technolo-

gies (http://www.idtdna.com).

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Oligonucleótidos generalesOligonucleótidos generalesOligonucleótidos generales Secuencia Descripción

Partidores brazos bacteriófagosPartidores brazos bacteriófagos

FwFagoN 5' CCT CAC TGG CCT AAT ACG ACT CAC TA 3' PCR segmento ge-nómicoRvFagoN 5' TCG TCC GAG AAT AAC GAG TGG ATC TG 3'

PCR segmento ge-nómico

Partidores para amplificar las sondasPartidores para amplificar las sondas

A (Todas las sondas) 5' GAC TGC GTA CCT AAT CC 3' Amplificación de sondas: -A+C: 2AC2 -A+F: 2AF1, sdddff2AF2 -A+B: 2AB1

C (2AC2) 5' GAT GAG TCC TGA CCG AAC 3'

Amplificación de sondas: -A+C: 2AC2 -A+F: 2AF1, sdddff2AF2 -A+B: 2AB1

F (2AF1 y 2AF2) 5' GAT GAG TCC TGA CCG ACA 3'

Amplificación de sondas: -A+C: 2AC2 -A+F: 2AF1, sdddff2AF2 -A+B: 2AB1B (2AB1) 5' GAT GAG TCC TGA CCG AAA 3'

Amplificación de sondas: -A+C: 2AC2 -A+F: 2AF1, sdddff2AF2 -A+B: 2AB1

Oligonucleótidos para adaptadoresOligonucleótidos para adaptadores

HiUp 5' CGG GAT CCT ACC GGA ATT CCA GA 3'Adaptador H

HiDown 5' AGC TTC TGG AAT TCC GGT AGG ATC CCG 3'Adaptador H

PsUp 5' GTT AGG TAC CCC AAT TGG CCG TT 3'Adaptador P

PsDown 5' AAC GGC CAA TTG GGG TAC CTA ACT GCA 3'Adaptador P

PstRv 5' AAC GGC CAA TTG GGG TAC CTA AC 3'

BaUp 5' GAT CCA GGT ACC AGA ATT CAG TTC 3'Adaptador B

BaDown 5' GAA CTG AAT TCT GGT ACC TG 3'Adaptador B

Oligonucleótidos específicosOligonucleótidos específicosOligonucleótidos específicos Secuencia Descripción

Partidores de segmentos genómicosPartidores de segmentos genómicos

C23Fw1 5' AAT ACG TGC TGT ACG GTA GTC CTG 3'

Oligos diseñados a partir de las secuen-cias de los segmen-tos genómicos obte-nidas. sss ss ss ss sss sss sss ss ss Estos oligos fueron utilizados como parti-dores para conocer las regiones vecinas a cada uno de los fragmentos parciales obtenidos.

C23Fw2 5' TTA TGC ACG ACA TGC CAT CAG GAC 3'Oligos diseñados a partir de las secuen-cias de los segmen-tos genómicos obte-nidas. sss ss ss ss sss sss sss ss ss Estos oligos fueron utilizados como parti-dores para conocer las regiones vecinas a cada uno de los fragmentos parciales obtenidos.

C23Rv1 5' TCA GCA GGA GTA CAG AAC CTT GGA 3'Oligos diseñados a partir de las secuen-cias de los segmen-tos genómicos obte-nidas. sss ss ss ss sss sss sss ss ss Estos oligos fueron utilizados como parti-dores para conocer las regiones vecinas a cada uno de los fragmentos parciales obtenidos.

C23Rv2 5' AGT CGT CCT CAT GTC TTG GAA CCT 3'


C22Fw1 5' TAG TTC ATG AGT GTG TCA GCG TCG 3'


C22Fw2 5' ATC AAG TAC TCA CAC AGT CGC AGC 3'


C22Rv1 5' GAA GTC TAA GCA GTC TGT AAG TGC CC 3'


C22Rv2 5' CTT CAG ATT CGT CAG ACA TTC ACG GG 3'


C2FFw1 5' TTT ACA GCG GGT TAT CGG ACC CTA 3'

Oligos diseñados a partir de las secuen-cias de los segmen-tos genómicos obte-nidas. sss ss ss ss sss sss sss ss ss Estos oligos fueron utilizados como parti-dores para conocer las regiones vecinas a cada uno de los fragmentos parciales obtenidos.C2FFw2 5' AAA TGT CGC CCA ATA GCC TGG GAT 3'


C2FRv1 5' CGT ATC GTA CTG GGC AAC TTA GAA GG 3'


C2FRv2 5' GCA TAG CAT GAC CCG TTG AAT CTT CC 3'


2.2. Metodología

2.2.1. Definición de las sondas a utilizar.

Se seleccionaron cuatro marcadores del estudio de cDNA-AFLP para usarlos como

sondas. Estos marcadores corresponden a TDFs de tres genes que se inducen (2AB1,

2AF1, 2AF2) y uno que se reprime (2AC2), en concentraciones entre 20 y 320 #M de

Mn2+. La elección de estos TDFs se basó en el criterio de la magnitud relativa de la

respuesta transcripcional. De esta forma, se determinó una respuesta “inmediata” para

marcadores que alcanzan el máximo de expresión en los niveles más bajos de Mn2+

utilizados, y una respuesta “progresiva” cuando varía proporcionalmente a la concen-

tración de este metal. Por otra parte, los resultados obtenidos a través de BLAST, iden-

tificaron genes ortólogos interesantes que podrían estar relacionados con la respuesta

a Mn2+ observada en C. subvermispora (Tabla 2).

Tabla 2. Marcadores moleculares (TDFs) seleccionados. La tabla muestra la

homología de los marcadores (TDFs) con proteínas de hongos basidiomicetes cer-

canos. * El marcador 2AC2 se reprime en presencia de manganeso.

En la Tabla 2 se observa que los marcadores 2AB1 y 2AF1 poseen un valor de “e”

bastante confiable, en contraste a los de 2AF2 y 2AC2. Estos últimos marcadores fue-

ron seleccionados en vista que las funciones predichas poseen una relación más direc-

ta con la homeostasis de Mn2+, por lo que era importante comprobar la identidad de

estos cada uno de ellos.

19

TDF Tamaño marcador

Tipo de respuesta Homologia Organismo Valor e

2AB1 426 pb ProgresivaAcetil Co-A deshidrogenasa (Gene ID: 6013504)

Coprinopsis cinerea okayama7#130

1,0E-58

2AF1 372 pb InmediataNbp 35 (GeneID: 6008084)

Coprinopsis cinerea okayama7#130

3,0E-65

2AF2 257 pb InmediataReceptor de retención de proteí-nas RE (GeneID: 3632492)

Ustilago maydis 521 3,0E-05

2AC2* 234 pb InmediataProteína ABC1:Transporte de Ca2+/Mn2+

(Accession number: AJ567483)

Phanerochaete chrysosporium

1,3E-01

2.2.2. Búsqueda de los genes de interés en la genoteca genómica de C. subver-

mispora

2.2.2.1. Determinación de la concentración de bacteriófagos

Con el objetivo de establecer la concentración óptima de bacteriófagos para obtener

la genoteca en placas, se realizaron diluciones seriadas con base 10 del stock de la

genoteca en solución. Se agregaron 100 #L de cada dilución a 100 #L de un cultivo de

E. coli LE392 crecido en caldo LB suplementado con maltosa y MgSO4, hasta alcanzar

una OD de 0,6. Posteriormente la mezcla se incubó a 37' durante 20 minutos. Acaba-

do el periodo de incubación, se agregaron 3 mL de agar LB blando a la mezcla y luego

de homogeneizar, el contenido se vació sobre una placa de agar LB. Las placas se in-

cubaron a 37' durante toda la noche.

A partir de las placas de lisis obtenidas, se calculó la concentración inicial de la ge-

noteca, obteniendo 7,64 x106 ufp/mL.

2.2.2.2. Amplificación de la genoteca genómica en placas

Considerando que para la hibridación del DNA de los bacteriófagos es necesario

que exista una alta densidad de placas de lisis no confluentes (alrededor de 200 ufp

por placa de 90 mm), se estimó que el factor de dilución óptimo de la genoteca es

2000. Por otra parte, para identificar al menos un bacteriófago que contenga uno de los

genes de interés, se debe tener representado el genoma de C. subvermispora por

completo. En vista que el vector Lambda GEM-11 puede empaquetar segmentos ge-

nómicos entre 14 y 24 kpb y que el tamaño del genoma de este hongo se estima en

torno a los 30 Mpb, según lo que se ha documentado para Phanerochaete chrysospo-

rium (Martinez et al., 2004), se determinó un número de 30 placas de bacteriófagos, las

que fueron preparadas según se describe en la sección 2.2.2.1.

2.2.2.3. Preparación del DNA de bacteriófagos en discos de nylon

Las placas de lisis obtenidas en el paso anterior fueron transferidas a filtros de

nylon, de modo de obtener el DNA de los bateriófagos fijado a esta matriz. Para esto,

se dispusieron discos de nylon Immobilon-Ny+ sobre el agar LB blando que contenía

los bacteriófagos durante 10 minutos a temperatura ambiente. Luego, estas membra-

20

nas fueron puestas en papel filtro humedecido con NaOH 0,5 M - NaCl 1,5 M por 10

minutos para desnaturar los ácidos nucléicos y posteriormente en Tris - HCl 1 M pH 8,0

- NaCl 1,5 M durante 10 minutos adicionales para neutralizar. Por último, las membra-

nas se lavaron con SSC 2X y el DNA del bacteriófago fue fijado a éstas con luz UV du-

rante 3 minutos.

2.2.2.4. Hibridación de los discos de nylon

Los discos que contenían el DNA de los bacteriófagos fueron hibridados con las

sondas descritas en la sección 2.2.1. La hibridación se realizó utilizando una solución

de hibridación compuesta por formamida al 35% (v/v), SSPE 5X, Denhardt 3% y SDS

al 1% a 42'. Los discos fueron pre hibridados con esta solución durante 1 hora y pa-

sado este tiempo se agregaron 100 #L de la reacción de PCR que contenía la sonda

específica seleccionada en 2.2.1., amplificada (ver preparación en la sección 2.2.6.4.).

La hibridación fue incubada durante toda la noche (16-18 horas).

Al día siguiente, los discos se lavaron dos veces con SSC 5X - SDS 0,5% durante

15 minutos y en algunos casos, adicionalmente 1 vez con SSC 1X - SDS 0,5%, todos a

42'. Posteriormente, las membranas se secaron al aire y luego se expuesieron duran-

te toda la noche a películas autorradigráficas Amersham Hyperfilm™ MP a -63'.

Las placas de lisis identificadas en la autoradiografía fueron extraídas de las placas

iniciales con una punta de pipeta automática y luego suspendidas en 200 #L de amorti-

guador SM, liberando los bacteriófagos en solución. Estos bacteriófagos posteriormen-

te se amplificaron en placas, como se describe en la sección 2.2.2.1. y luego se eluye-

ron desde el agar LB blando con 10 mL de amortiguador SM, incubando durante 3 ho-

ras a 4' con agitación moderada. Se recuperó el sobrenadante y luego se almacenó

indefinidamente a 4'.

2.2.3. Comprobación de los bacteriófagos identificados

2.2.3.1. Amplificación de los bacteriófagos en medio líquido

Los bacteriófagos seleccionados fueron amplificados en medios de cultivo líquido

para realizar la extracción del DNA. Se incubaron 20 #L de una dilución 1:5 del sobre-

nadante obtenido de la elución de los bacteriófagos, con 500 #L de un cultivo de E. coli

21

LE392 crecido en caldo LB suplementado con maltosa y MgSO4, durante 20 minutos a

37'. Posteriormente, se agregó la mezcla de incubación a 100 mL de caldo LB suple-

mentado con MgSO4, y luego este medio se mantuvo en agitación a 37' durante toda

la noche. Transcurrido el tiempo, se agregaron 500 #L de cloroformo y se agitó durante

15 minutos para aumentar la eficiencia de la lisis, determinada como la pérdida cualita-

tiva en la turbidez del medio. Luego los cultivos se centrifugaron a 8.000 x g por 10 mi-

nutos para remover los restos celulares y el sobrenadante que contenía los bacteriófa-

gos, se sometío a extracción.

2.2.3.2. Extracción de DNA de los bacteriófagos

Los bacteriófagos obtenidos por amplificación en medio de cultivo líquido se incuba-

ron con RNasa A y DNasa I, para eliminar los ácidos nucleicos residuales de E. coli en

el medio. Luego las partículas fágicas se sedimentaron agregando al medio NaCl y

PEG a una concentración final de 1 M y 9,3% (p/v), respectivamente. Una vez disueltos

estos reactivos, la solución se incubó durante 1 hora a -20'. Posteriormente, los bac-

teriófagos se recuperaron por centrifugación a 10.000 x g durante 20 minutos a 4' y

luego se resuspendieron en amortiguador SM. Los restos celulares se removieron por

centrifugación a 8.000 x g durante 2 minutos.

La lisis de los bacteriófagos se efectuó agregando 100 #L de SDS 10% y 100 #L de

0,5 M EDTA pH 8,0 a la suspensión de bacteriófagos e incubando a 68' durante 20

minutos. Para purificar el DNA, se agregó 1 volumen de fenol: cloroformo:alcohol isoa-

mílico (25:24:1) y luego de homogeneizar se centrifugó durante 10 minutos a 12.000 x

g. Se rescató la fase acuosa y luego se agregó 1 volumen de la mezcla cloroformo: al-

cohol isoamílico (24:1) para eliminar el exceso de Fenol. Luego de centrifugar a 12.000

x g por 10 minutos, se recuperó la fase acuosa y se precipitaron los ácidos nucleicos

con 0,6 volúmenes de isopropanol durante 1 hora a -20'. El DNA se sedimentó por

centrifugación a 12.000 x g durante 20 minutos y el pellet se lavó con 200 #L de etanol

70%. Finalmente, se disolvió el DNA en amortiguador TE y luego se almacenó a 4'.

Alternativamente, se utilizó el sistema de purificación QIAGEN Lambda Midi Kit para

obtener DNA de bacteriófago de alta pureza para el subclonamiento.

22

2.2.3.3. Southern Blot de los segmentos genómicos

Se digirieron 10 #g de DNA purificado a partir de los bacteriófagos identificados con

10 unidades de combinaciones de las enzimas EcoRI, HindIII y PstI a 37' durante 2

horas. El DNA digerido se cargó en un gel de agarosa al 0,6% y se realizó la electrofo-

resis a voltaje constante (15V) durante 14 a 16 horas. Finalmente, el gel se tiñó con

bromuro de etidio y luego fotografiado.

Posteriormente, el gel fue tratado con HCl diluído 1:50 durante 15 minutos para

despurinar el DNA y facilitar su migración. Luego de lavarlo con agua destilada durante

5 minutos, el gel se introdujo en un recipiente que contenía solución desnaturante,

compuesta por NaOH 1 M y NaCl 1,5 M durante 20 minutos. Pasado el tiempo, se

agregó solución neutralizante compuesta por Tris-Cl 1 M pH 7,5 y NaCl 1,5 M y se in-

cubó durante 20 minutos adicionales. Finalmente se removió la solución y se bañó el

gel en SSC 20X.

Se montó el sistema de transferencia y el DNA se transfirió desde el gel a una

membrana de nylon por capilaridad durante toda la noche (12-14 horas). Luego se ex-

puso la membrana en el transiluminador UV para fijar el DNA a esta matriz.

El DNA fijado en las membranas se hibridó con 20 #L de reacción de PCR de las

sondas con partidores marcados en la posición 5’ terminal utilizando la polinucleótido

quinasa del fago T4 (T4 polinucleótido quinasa) y [&32P] ATP (ver preparación en la

sección 2.2.6.4.). Las condiciones de la hibridación fueron las mismas que las utiliza-

das para la genoteca genómica.

2.2.4. Secuenciamiento de los segmentos genómicos

2.2.4.1. Subclonamiento del DNA de los bacteriófagos

El DNA obtenido a partir de los bacteriófagos seleccionados, fue fragmentado usan-

do la enzima Sau3AI (ver Figura 2). Se digirieron 10 #g de DNA de bacteriófago con

diluciones seriadas de esta enzima en amortiguador de reacción y AcBSA, en un volu-

men final de 20 uL. La digestión se realizó a 37' durante 30 minutos y luego la enzima

se inactivó a 65' durante 20 minutos. Los DNAs seleccionados se digirieron utilizando

la dilución 1:10 (5 U totales de Sau3AI en la reacción).

23

Figura 2. Esquema de digestión parcial usada en el subclonamiento. La

figura muestra el esquema de la generación de fragmentos superponibles para el

subclonamiento de los segmentos genómicos. En el DNA de bacteriófago, la región

en blanco representa el segmento de genoma de C. subvermispora y las regiones

grises los brazos del vector. Las marcas negras representan los cortes por Sau3AI.

En los fragmentos generados, las zonas en gris oscuro representan las secuencias

superponibles que permitirán realizar el ensamblaje.

Se realizó la reacción de ligación utilizando 3 #L de la reacción de digestión y 10 ng

del vector pBluescript KSII, en presencia de 0,2 U de ligasa de DNA del fago T4 (T4

DNA ligasa) durante toda la noche a 16'. El vector se linearizó previamente con

BamHI a 37' durante 1 hora y luego se desfosforiló con CIAP a 37' durante 30 mi-

nutos (El corte con la enzima BamHI da origen a extremos cohesivos complementarios

a los que deja Sau3AI). Finalmente, se transformaron por electroporación 2 #L de una

dilución 1:20 de la mezcla de ligación a 40 #L de E.coli DH5 electrocompetentes.

Las bacterias transformadas se recuperaron en 1 mL de medio SOC modificado du-

rante 1 hora a 37' y luego se inocularon alícuotas de 250 #L sobre placas de agar LB

con ampicilina, X-GAL e IPTG y se incubaron en estufa a 37' durante toda la noche.

2.2.4.2. Amplificación de los segmentos genómicos

Los segmentos genómicos almacenados en los bacteriófagos se amplificaron por

PCR. Para esto, se diseñaron partidores en los extremos de cada brazo del DNA del

bacteriófago Lambda GEM-11, que flanquean el segmento genómico de C. subvermis-

pora (ver Figura 3).

24

Figura 3. Diseño de partidores para la amplificación del segmento genómi-

co de C. subvermispora. En la figura se esquematiza el vector que contiene la

genoteca genómica y los tamaños relativos de cada una de las partes que compo-

nen el DNA del bacteriófago. Las flechas ( ) representan los oligonucleótidos

diseñados para la amplificación del segmento de interés.

Utilizando estos partidores, se realizó una reacción de PCR de 25 #L compuesta por

200 ng de gDNA de bacteriófago, 10 mM dNTPs, 0,8 pmoles de cada partidor, 1X del

amortiguador LongAmp Taq y 2,5 U de la enzima LongAmp Taq. La amplificación se

efectuó utilizando un programa de temperatura compuesto por una etapa de desnatu-

ración inicial a 94' durante 2 minutos, 30 ciclos de amplificación y una extensión final

a 65' durante 10 min. Cada ciclo de amplificación estaba compuesto por una etapa a

95' durante 25 segundos, otra etapa a 55' durante 35 segundos y una etapa final a

65' durante 20 minutos.

2.2.4.3. Digestión de los productos de PCR

Los segmentos genómicos de C. subvermispora obtenidos por amplificación por

PCR se digirieron con las enzimas Sau3AI y CviJI a tiempos controlados, para generar

fragmentos como los que se describen en la Figura 2. En el caso de la enzima Sau3AI,

se utilizó una dilución de 1:750 (0,03 U de enzima en la reacción) y 2,5 #L del producto

de PCR, para una reacción de 10 #L totales, que además contenía AcBSA y amorti-

guador de reacción 1X, efectuada a 37'. Para la digestión con CviJI, se utilizaron 10

U de enzima y 8 #L del producto de PCR en amortiguador de reacción 1X, completan-

do un volumen final de 20 #L. La inactivación de estas enzimas se logró agregando

solución stopmix y calentando la reacción a 65' durante 20 minutos.

25

2.2.4.4. Preparación de adaptadores

Los adaptadores se prepararon por apareamiento de 1 nanomol de la pareja corres-

pondiente de oligonucleótidos en Tris-Cl 10 mM pH 8,0, EDTA 1 mM y NaCl 50 mM,

con un programa de temperatura de calentamiento a 95' durante 2 minutos y luego

enfriando progresivamente durante 2 horas hasta alcanzar los 25', donde se mantuvo

2 minutos adicionales y luego la mezcla se almacenó a 4'. Posteriormente, se fosfori-

laron 80 pmoles de los adaptadores utilizando 1 U de T4 polinucleótido quinasa y ATP

(rATP) 10 mM en un volumen final de 10 #L a 37' durante 1 hora.

2.2.4.5. Ligación de adaptadores

Se ligaron 200 ng de fragmentos del producto de PCR con 8 pmoles de adaptador

fosforilado, utilizando 0,2 U de T4 DNA ligasa por 2 horas a 20'.

2.2.4.6. Amplificación de los fragmentos de digestión de los segmentos genómi-

cos

Los fragmentos ligados a los adaptadores se amplificaron usando el oligonucleótido

BaDown como partidor (ver Figura 4). La reacción de PCR estaba compuesta por 2 #L

de la mezcla de ligación, 1X de amortiguador Green GoTaq Flexi , MgCl2 1,8 mM, 0,5

mM dNTPs, 2 #M de BaDown y 1,25 U de GoTaq Flexi, en un volumen final de 20 #L.

El programa de temperatura utilizado en este caso consistía de una etapa a 94' du-

rante 5 minutos, 40 ciclos de amplificación y una etapa final a 72' durante 10 minutos.

Cada ciclo de amplificación estaba compuesto de una etapa a 94' durante 30 segun-

dos, una etapa a 53' durante 30 segundos y una extensión a 72' durante 10 minu-

tos.

2.2.4.7. Clonamiento de los productos de PCR

De la reacción de PCR se tomaron 1,5 #L y se ligaron a 10 ng del vector

pCR®2.1-TOPO en un volumen final de 6 #L, de acuerdo con las instrucciones del pro-

veedor. Luego, se electroporó 1 #L de la reacción de ligación a 40 #L de bacterias elec-

trocompetentes. Las bacterias transformadas se recuperaron por incubación a 37'

26

durante 1 hora en medio SOC modificado y posteriormente se plaquearon alícuotas

como se describe en 2.2.4.1.

Figura 4. Amplificación de fragmentos de los segmentos genómicos. La

figura resume las etapas previas al clonamiento de fragmentos de genoma de C.

subvermispora, posterior a la digestión de los productos de PCR, correspondientes

a los segmentos genómicos almacenados en los bacteriófagos. Los adaptadores

obtenidos del apareamiento de los oligos BaUp y BaDown, fueron ligados a los ex-

tremos compatibles dejados por el corte de Sau3AI.

2.2.5. Secuenciamiento del gDNA de C. subvermispora

2.2.5.1. Crecimiento del hongo en medio líquido

C. subvermispora no produce esporas en los medios preparados en el laboratorio,

por lo que debe ser cultivado utilizando inóculos de micelio homogeneizado. A partir del

cultivo en placa, se cortó un trozo de agar papa dextrosa de 1 cm2 de superficie, el que

se inoculó en 25 mL de medio de cultivo estacionario en matraces de 500 mL. Este cul-

tivo se mantuvo durante 14 días a 28' sin agitación y luego se recolectó en frascos de

100 mL que contenían 15 g de esferas de vidrio estériles de 5 mm de diámetro. El mi-

celio se homogeneizó manualmente por agitación del frasco y luego se tomaron 2 alí-

cuotas para determinar la concentración del homogeneizado por peso seco. Los 200

27

#L de cada alícuota se secaron en una estufa a 80' sobre discos de papel filtro de 2

cm de diámetro, previamente pesados.

Luego de determinar la concentración del hongo homogeneizado, se inocularon 45

mg de micelio molido sobre 100 mL de medio de cultivo estándar en matraces de 250

mL, los que se incubaron durante 10 días a 28' en agitación constante a 180 rpm.

Posteriormente, el hongo se cosechó por filtración del medio de cultivo a través de pa-

pel Miracloth y se lavó 3 veces con 200 mL de agua bidestilada. Finalmente, el micelio

recuperado se pesó y luego congeló en nitrógeno líquido, para posteriormente almace-

narlo a -63'.

2.2.5.2. Extracción de gDNA de C. subvermispora

Para extraer el gDNA de C. subvermispora, 5 g del micelio guardado se molieron en

un mortero de porcelana previamente enfriado con nitrógeno líquido para mantener el

hongo congelado. El micelio homogeneizado se transfirió a un tubo Falcon de 50 mL y

luego se le agregaron 8 mL de SDS 20% y un volumen de TE hasta completar 40 mL.

La mezcla se incubó durante 15 minutos a temperatura ambiente y ocasionalmente se

agitó manualmente para facilitar la lisis del micelio. El lisado fue dividido en 2 y a cada

tubo se agregaron 10 mL de la solución fenol: cloroformo: alcohol isoamílico (25:24:1),

mezclando manualmente por 10 segundos. Se recuperó la fase acuosa por centrifuga-

ción a 12.000 x g durante 30 minutos y luego ésta se incubó a 50' durante 30 minutos

con 1 mg de proteinasa K. Luego, la solución se mezcló con 1 volumen de fenol: cloro-

formo: alcohol isoamílico (25:24:1) y se centrifugó a 12.000 x g durante 30 minutos. Se

recuperó la fase acuosa, se dividió en 4 tubos Falcon de 15 mL y se agregó 1/10 de

acetato de sodio 3 M y 2 volúmenes de etanol frío para precipitar los ácidos nucléicos,

dejando a -20' durante 30 minutos.

Los ácidos nucléicos se recuperaron por centrifugación a 12.000 x g durante 30 mi-

nutos a 4' y se disolvieron en 1 mL de amortiguador TE. La solución obtenida se trató

con 1 mg de RNasa a 37' durante 30 minutos, para eliminar el RNA. Posteriormente,

a cada uno de los tubos se agregaron 0,5 mg de proteinasa K y luego 1 volumen de

fenol: cloroformo: alcohol isoamílico (25:24:1) como se describió en el párrafo anterior.

La fase acuosa recuperada se trató con cloroformo: alcohol isoamílico (24:1) y luego

28

centrifugada a 12.000 x g durante 10 minutos. Finalmente el DNA se disolvió en TE

luego de la precipitación con acetato de sodio y etanol, como se ha descrito anterior-

mente. El DNA disuelto se guardó a 4' para su uso posterior.

2.2.5.3. Digestión del gDNA

Se digirió el gDNA de C. subvermispora con las enzimas HindIII, PstI y BamHI (ver

Figura 5, paso 1). Se realizó una digestión inicial de 5 #g de gDNA de C. subvermispo-

ra y 30 U de HindII y PstI en amortiguador de reacción de HindIII, en un volumen de 50

#L. Luego, 45 #L de la reacción se digirieron con 30 U de BamHI en 50 #L totales. Las

digestiones se realizaron a 37' durante 2 horas y las enzimas se inactivaron a 65'

durante 20 minutos.

2.2.5.4. Ligación de adaptadores

Los fragmentos de gDNA se ligaron a los 3 adaptadores respectivos para cada sitio

de corte generado (ver Figura 5, paso 2). Se llevó a cabo la reacción de ligación, com-

puesta por 3 #L de la digestión y 7,5 pmoles de cada adaptador en 1X de amortiguador

de T4 DNA Ligase y utilizando 0,2 U de T4 DNA ligasa, completando un volumen final

de 10 #L. La reacción de ligación se incubó durante 2 horas a 20'. Los adaptadores H

(HiUp:HiDown), P (PsUp:PsDown) y B (BaUp:BaDown) se prepararon como se descri-

be en 2.2.4.4.

2.2.5.5. Amplificación de fragmentos ligados a adaptadores

Los fragmentos de gDNA fueron amplificados utilizando como partidores uno de los

oligonucleótidos de los adaptadores y un partidor diseñado a partir de la secuencia

parcial obtenida del secuenciamiento de los clones del segmento de gDNA obtenido de

los bacteriófagos (ver Figura 5, paso 3). La reacción de PCR estaba compuesta por

0,75 #L de reacción de ligación de los adaptadores a los fragmentos, 0,75 mM de

dNTPs, 0,3 #M del oligo del adaptador específico (HiUp, PstRv o BaDown), 0,75 #M

del oligo diseñado a partir del segmento genómico, 1X de amortiguador Crimson Lon-

gAmp Taq y 1 U de Crimson LongAmp Taq DNA polimerasa. El programa de tempera-

tura consistía de una etapa a 94' durante 2 minutos, 30 ciclos de amplificación y una

etapa final a 65' durante 10 minutos. Cada ciclo de amplificación estaba compuesto

29

por una etapa de desnaturación a 94' durante 30 segundos y otra etapa de alinea-

miento/extensión a 60' durante 13 minutos.

Figura 5. Esquema de resumen de la estrategia para obtener información

de secuencias vecinas a las determinadas para los segmentos genómicos.

Paso 1 : el gDNA de C. subvermispora fue digerido con las enzimas HindIII, PstI y

BamHI Paso 2 : Luego los fragmentos se mezclaron y ligaron con los 3 adaptado-

res compatibles para los extremos cohesivos que dejan las enzimas señaladas.

Paso 3 : Finalmente se realizó una reacción de PCR, utilizando como partidor uno

de los oligos de los adaptadores y uno específico del segmento genómico de inte-

rés. La figura muestra algunos de los posibles productos generados por este méto-

do.

2.2.5.6. Recuperación de los productos de amplificación desde geles de agarosa

Los productos de PCR se recuperaron directamente desde el gel de agarosa, utili-

zando el sistema comercial UltraClean™ 15 DNA Purification Kit, siguiendo las instruc-

ciones que ofrece el proveedor.

30

2.2.6. Procedimientos generales

2.2.6.1. Preparación de E. coli DH5! F’ electrocompetentes

Las E.coli DH5! F’ electrocompetentes fueron preparadas en el laboratorio. Para

esto, se inocularon 5 mL de caldo LB con una colonia de E.coli DH5! F’ y se incubó a

37' durante toda la noche. Al día siguiente, se inoculó una alícuota de 500 #L del cul-

tivo inicial a 500 mL de caldo LB y este se incubó hasta alcanzar una OD de 0,4 unida-

des. El cultivo se dejó 30 minutos en agua con hielo para detener el metabolismo bac-

teriano. Luego, las células se sedimentaron por centrifugación a 1.000 x g durante 15

minutos a 4'. Las bacterias se resuspendieron en 250 mL de agua bidestilada, estéril

y fría. Posteriormente, las bacterias se sedimentaron a la misma velocidad durante 20

minutos y luego se resuspendieron en 125 mL de glicerol al 10% , estéril y frío. Las

bacterias se lavaron por centrifugación y resuspensión en 2,5 mL de 10% glicerol, esté-

ril y frío. Finalmente, se centrifugaron a 1.000 x g durante 20 minutos y luego se resus-

pendieron en 500 #L de GYT. La concentración final de bacterias fue de 2 x 1010 célu-

las por mL, que se midió por absorbancia a 600nm.

Las bacterias finalmente se dividieron en alícuotas de 40 #L en microtubos de 0,6

mL y luego almacendas a -63'.

2.2.6.2. Extracción de DNA plasmidial

Los plasmidios enviados a secuenciar se purificaon por el método de lisis alcalina

documentado en Sambrook y Russell, 2001.

2.2.6.3. Análisis de DNA

El DNA genómico, plasmidios, fragmentos de digestión y productos de PCR se ana-

lizó por electroforesis en geles de agarosa en amortiguador TBE 0,5X, siguiendo las

instrucciones documentadas en Sambrook y Russell, 2001. Los geles posteriormente

se tiñieron con bromuro de etidio y las bandas se visualizaron en un transiluminador

con luz UV. El DNA fue cuantificado mediante absorbancia a 260 (1 OD equivale a 50

#g/mL de DNA de doble hebra) y su pureza fue determinada por la razón de absorban-

cias de 260/280.

31

2.2.6.4. Marcación de sondas

Las sondas usadas se obtuvieron a través de la amplificación por PCR de cada uno

de los marcadores generados en el estudio de cDNA-AFLP. El programa de temperatu-

ra utilizado contenía una etapa a 94' durante 5 minutos, 30 ciclos de amplificación y

una etapa final a 72' durante 5 minutos. Cada ciclo de amplificación estaba compues-

to por una etapa de desnaturación a 94' durante 30 segundos, una etapa de alinea-

miento de 35 segundos, que variaba entre 52' y 56' según la sonda, y una etapa de

extensión a 72' durante 1 minuto.

Las sondas usadas en la hibridación con la genoteca genómica se sintetizaron utili-

zando [!32P] dCTP. Cada reacción contenía 500 ng del TDF, 0,2 mM de dATP, dGTP y

dTTP, 1 #L de [!32P] dCTP, MgCl2 0,75 mM, 1X de amortiguador Green GoTaq Flexi,

0,25 #M de cada partidor y 5 U de GoTaq Flexi en un volumen final de 50 #L.

Las sondas utilizadas en el Southern Blot de DNA de bacteriófagos se sintetizaron

usando partidores marcados. La reacción de marcación estaba compuesta por 100

pmoles de partidor, 1X del amortiguador de reacción, 10 U de T4 polinucleótido quina-

sa y 2 #L de [&32P] ATP, en un volumen final de 10 #L, y se realizó durante 30 minutos a

37'. Posteriormente, la reacción de PCR se hizo utilizando 4 #L de reacción de mar-

cación de cada uno de los partidores y manteniendo la misma composición que la des-

crita anteriormente, a excepción del [!32P] dCTP, el que fue sustituido por dCTP a una

concentración final de 0,2 mM.

32

3. RESULTADOS

3.1. Identificación de bacteriófagos.

Utilizando los marcadores encontrados por la técnica de cDNA-AFLP (Tabla 2 de

“Materiales y Metodología”), se generaron sondas marcadas radiactivamente para hi-

bridar cerca de 6.000 clones de la genoteca genómica de C. subvermispora, previa-

mente construida en el vector Lambda GEM-11.

A partir de cada sonda, se obtuvieron al menos seis bacteriófagos que almacenaban

un segmento del gDNA de C. subvermispora que contenía los genes que responden a

Mn2+. A cada uno de ellos se les nombró con la sonda con que habían sido identifica-

dos seguido de una letra. Estos bacteriófagos fueron amplificados en medio líquido y

luego almacenados para posteriormente comprobar si habían sido identificados correc-

tamente.

3.2. Comprobación de las hibridaciones de los bacteriófagos seleccionados

Para comprobar si los bacteriófagos seleccionados contenían regiones genómicas

de interés, se realizaron hibridaciones utilizando su DNA digerido y las mismas sondas

empleadas con la genoteca genómica de C. subvermispora.

El DNA de todos los bacteriófagos seleccionados se extrajo y luego se analizó por

electroforesis (Figura 6). Posteriormente, el DNA obtenido se digirió con combinaciones

de las endonucleasas de corte infrecuente EcoRI, PstI y HindIII, para generar fragmen-

tos de alto peso molecular. El objetivo de esta digestión era disminuir la probabilidad de

que la secuencia blanco de la sonda fuera interrumpida muchas veces. Finalmente se

obtuvieron fragmentos en el rango de 2 a 23 kpb (Figura 7a).

Los productos de la digestión del DNA se transfirieron a una membrana de nylon y

luego se hibridaron con las sondas específicas, permitiendo la identificación de al me-

nos un bacteriófago que contenía el segmento de interés para cada una de las sondas

(Figura 7b).

Los fragmentos que fueron reconocidos por la sonda variaban entre 4kpb y 15 kpb,

disminuyendo la probabilidad de obtener secuencias reguladoras. Por esta razón se

propuso secuenciar completamente cada segmento genómico de C. subvermispora.

33

Figura 6. Extracción de DNA de bacte-

riófagos. En la fotografía se muestran las

bandas correspondientes al DNA de algunos

de los bacteriófagos seleccionados. En cada

bolsillo (2-7), se cargaron 10 #g de DNA.

Carril 1: Marcador de peso molecular

(Lambda / Hind III: 0,5 #g); Carril 2: DNA de

2AC2 a; Carril 3: DNA de 2AC2 c; Carril 4:

DNA de 2AC2 d Carril 5: DNA de 2AF2 b

Carril 6: DNA de 2AF2 a Carril 7: DNA de

2AC2 b.

Figura 7. Resultados de la

técnica de Southern Blot para la

comprobación de las hibridacio-

nes. a. Gel de agarosa preparativo,

que muestra los fragmentos obte-

nidos por digestión del DNA de

cuatro bacteriófagos seleccionados

con la sonda 2AF2. En cada bolsi-

llo se cargaron 10 #g de DNA dige-

rido. M: Marcador de peso molecu-

lar (Lambda/HindIII: 0,5 #g); A:

EcoRI + HindIII; B: HindIII + PstI; C:

EcoRI + PstI; D: EcoRI; C1: DNA

de 2AC2; C2: DNA de 2AF2 a; P:

plasmidio que contiene la sonda

2AF2. b. En la figura se muestran

los resultados de las hibridaciones

positivas de las sondas con el DNA

digerido de los bacteriófagos aisla-

dos. Las letras corresponden a las

enzimas utilizadas, descritas ante-

riormente.

34

1 2 3 4 5 6 7

23,13 kpb

4,36 kpb

A B C D A B C D A B C D A B C D

2AF2 a 2AF2 f2AF2 b 2AF2 e

M C1 C2 P

a.

2AF1 a 2AF1 b 2AF2 a

2AB1 e 2AC2 a 2AC2 c A B C D A B C D A B C D

A B C D A B C D A B C D

b.

4 kpb

15 kpb

4 kpb

15 kpb

3.3. Subclonamiento del DNA de los bacteriófagos

El secuenciamiento de los segmentos genómicos contenidos en el DNA de los bac-

teriófagos se realizó a través del subclonamiento de los fragmentos obtenidos por la

digestión de éstos con la enzima Sau3AI. Para esto, se diseñó un protocolo que permi-

tiera generar fragmentos que contuvieran secuencias que pudieran posteriormente ser

superpuestas y así lograr ensamblar los segmentos genómicos de C. subvermispora.

El protocolo consistía en digerir el DNA del bacteriófago con la enzima Sau3AI con

distintas diluciones (Figura 8). Finalmente, la dilución escogida para realizar la diges-

tión del DNA de los bacteriófagos fue la de 1:10.

Figura 8. Ensayo de digestión de DNA de bacteriófago con Sau3AI. La

fotografía muestra la digestión del DNA del bacteriófago 2AC2 a, usando

distintas diluciones de la enzima Sau3AI. En cada bolsillo (2-8), se cargaron 10

#g de DNA totales. Carril 1: Marcador de peso molecular (1kpb DNA Ladder: 0,5

#g); Carril 2: Dilución 1:10; Carril 3: Dilución 1:100; Carril 4: Dilución 1:200; Ca-

rril 5: Dilución 1:400; Carril 6: Dilución 1:800; Carril 7: Dilución 1:1000; Carril 8:

Control sin digerir.

35

1 2 3 4 5 6 7 8

1 kpb

3 kpb

10 kpb

6 kpb

250 pb

De esta manera se obtuvieron los productos de digestión parcial del DNA de los

bacteriófagos y estos posteriormente se ligaron al vector pBluescript KS II en el sitio

BamHI. Luego, una alícuota de la mezcla de reacción fue transformada en E.coli DH5!.

Finalmente, las bacterias se plaquearon en medios de agar LB, suplementados con

Amp, X-GAL e IPTG

A partir de las bacterias transformadas, se obtuvieron colonias positivas y estas se

seleccionaron y luego se les extrajo el vector, que contenía los fragmentos parciales.

Los vectores obtenidos se enviaron a secuenciar a la empresa Macrogen Inc (Seúl, Co-

rea).

De un total de 40 secuencias obtenidas, sólo siete contenían información distinta a

secuencias propias de bacteriófago y de E. coli. La presencia de las secuencias ante-

riormente señaladas, sugirió que podrían haber ocurrido eventos de recombinación en-

tre el segmento de gDNA de C. subvermispora clonado en el bacteriófago y el DNA de

E. coli. Por otro lado, las secuencias obtenidas no pudieron ser ensambladas, pues no

presentaban secuencias superponibles.

En vista del bajo porcentaje de secuencias obtenidas y los problemas descritos, se

optó modificar la estrategia de subclonamiento, incorporando una etapa previa que

consistía en la amplificación selectiva del segmento de genoma de C. suvermispora

contenido en el DNA del bacteriófago. Con esta estrategia, se evitaba obtener gDNA de

bacteriófago a partir de la amplificación en medio de cultivo líquido.

La amplificación del segmento específico del DNA de C. subvermispora se realizó

utilizando partidores diseñados en las zonas de los brazos del bacteriófago que flan-

queaban el fragmento de interés. Debido a que este fragmento varía entre 14 y 24 kpb,

se utilizó la enzima LongAmp Taq DNA polymerase, capaz de amplificar hasta 40 kpb.

Con esta enzima se lograron obtener amplicones de aproximadamente 12 kpb (Figura

9).

36

Figura 9. Amplificación del segmento del genoma de C. subvermispora

clonado en el vector LambdaGEM 11. La fotografía muestra los productos de

PCR obtenidos a partir del DNA de los bacteriófagos seleccionados. En cada

bolsillo se cargaron 5 #L de reacción de PCR. Carril 1: Marcador de peso mole-

cular (1kpb DNA ladder: 0,5 #g); Carril 2: 2AB1 e; Carril 3: 2AC2 a; Carril

4:2AF1 b; Carril 5: 2AC2 c; Carril 6:2AF1 a; Carril 7: 2AF2 a.

A partir de los productos de PCR obtenidos, se continuó con el subclonamiento de

los segmentos genómicos. Estos productos se fragmentaron usando dos enzimas de

digestión alternativas: Sau3AI y CviJI. La incorporación de esta segunda enzima se

debe a que esta endonucleasa reconoce y corta en sus respectivos sitios de corte, co-

rrespondientes a RGCY (R: A o G, Y: C o T) con mayor frecuencia que Sau3AI, por lo

que aumenta la probabilidad de generar fragmentos cuya secuencia sea superponible y

así se facilita el ensamblaje de los segmentos (Fitzgerald et al., 1992). Utilizando estas

enzimas, se probaron digestiones a distintos tiempos con una cantidad de enzima ini-

cial constante en todas las reacciones, para el segmento genómico 2AF2a (Figura 10a

y 10b).

La alternativa con CviJI generó fragmentos de tamaños apropiados para el subclo-

namiento, los que se ligaron directamente al vector pBluescript KSII. Sin embargo, al

transformar alícuotas de la reacción de ligación, se obtuvieron pocas colonias, muchas

de las cuales no contenían fragmentos de interés.

Finalmente se optó por la estrategia de digestión con Sau3AI para generar los frag-

mentos adecuados para el secuenciamiento (Figura 10c).

37

1 2 3 4 5 6 7

10 kpb

Figura 10. Digestión de los amplicones obtenidos a partir del DNA de

los bacteriófagos. La fotografía muestra los tiempos de digestión estudiados

para Sau3AI (a) y CviJI (b), y la digestión de todos los productos de PCR de los

segmentos genómicos (c). En cada bolsillo se cargaron 10 #g de DNA digerido.

a. Carril 1: Marcador de peso molecular (1kpb DNA Ladder: 0,5 #g); Carril 2: 30

minutos; Carril 3: 45 minutos; Carril 4: 60 minutos; Carril 5: 90 minutos; Carril 6:

120 minutos; Carril 7: 150 minutos; Carril 8: 180 minutos; Carril 9: digestión

completa; Carril 10: 2AF1 a sin digerir. b. Carril 1: Marcador de peso molecular

(1kpb DNA Ladder: 0,5 #g); Carril 2: 60 minutos; Carril 3: 90 minutos; Carril 4:

120 minutos; Carril 5: 150 minutos; Carril 6: 165 minutos; Carril 7: digestión

completa. c. Carril 1: Marcador de peso molecular (1kpb DNA Ladder: 0,5 #g);

Carril 2: 2AC2 c; Carril 3: 2AC2 a; Carril 4: 2AB1 e; Carril 5: 2AF2 a; Carril 6:

2AF1 a; Carril 7: 2AF1 b.

Para facilitar el clonamiento de los fragmentos, se propuso amplificar estos produc-

tos de digestión con Taq DNA polimerasa. Esto facilitaba la etapa de ligación, permi-

tiendo el uso del vector pCR2.1-TOPO, que posee un sistema rápido y eficiente para

clonar fragmentos de interés. La amplificación de los fragmentos obtenidos por Sau3AI

requería la ligación previa de adaptadores (BaUp:BaDown) que permitieran introducir

secuencias conocidas para anclar los partidores necesarios para la amplificación.

Finalmente, a partir de la amplificación realizada con el partidor BaDown se obtuvie-

ron fragmentos amplificados entre 300 y 1500 pb aproximadamente (Figura 11).

38

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 7 a. b. c.

1 2 3 4 5 6 7

Figura 11. Amplificación de los fragmentos generados por digestión

con Sau3AI. La fotografía muestra el resultado de los productos de PCR obte-

nidos usando el partidor BaDown para amplificar los fragmentos generados por

Sau3AI, obtenidos a partir de los productos de PCR de los segmentos genómi-

cos. En cada bolsillo se cargaron 5 #L de la reacción de PCR. Carril 1: Marca-

dor de peso molecular (1kpb DNA Ladder: 0,5 #g); Carril 2: 2AB1 e; Carril 3:

2AF1 b; Carril 4: 2AC2 c; Carril 5: 2AF1 a; Carril 6: 2AF2 a; Carril 7:2AC2 a.

Los productos de amplificación obtenidos, correspondientes a los fragmentos de

segmento genómico generado previamente por PCR, se ligaron al vector

pCR®2.1-TOPO y luego se transformaron por electroporación en E.coli DH5'.

Posteriormente, se seleccionaron 30 colonias para cada segmento genómico sub-

clonado, las que luego fueron amplificadas para la extracción del vector. Los vectores

que contenían fragmentos de interés fueron enviados para su secuenciamiento a Ma-

crogen Inc (Seúl, Corea).

39

1 2 3 4 5 6 7

250 pb

500 pb

1 kpb1,5 kpb

3.4. Reconstrucción de las secuencias de los segmentos genómicos de C. sub-

vermispora.

Las secuencias obtenidas en el punto anterior fueron analizadas utilizando el paque-

te de programas computacionales Lasergene DNA Star para determinar la calidad y el

estado de cada una de ellas. Luego de eliminar las secuencias contaminantes, como

restos de vectores y adaptadores, se realizó el ensamblaje de las secuencias, utilizan-

do la herramienta SeqMan, que viene incluida en el conjunto de programas.

El ensamblaje parcial de los fragmentos generó secuencias de mayor peso melecu-

lar, denominadas “contigs”, y estos se analizaron a través de la herramienta BLAST,

resultando en la identificación de segmentos con homología a genes que han sido des-

critos en la homeostasis de Mn2+ en otros organismos (Tabla 3).

El marcador reprimido por Mn2+, 2AC2, fue identificado como un transportador de

fosfatos inorgánicos, el que ha sido caracterizado en la incorporación de este ion en S.

cerevisiae. El marcador 2AF2, que es inducido por Mn2+, mostró homología con un

transportador de oligopéptidos, los que componen una gran familia que incluye a los

transportadores de sideróforos, sugiriendo la existencia de un sistema de captación de

Mn2+ mediante estos compuestos. Por último, los marcadores inducidos por Mn2+ 2AF1

y 2AB1 identificaron conjuntamente una proteína hipotética con actividad epimerasa de

azúcares conjugados a nucleósidos difosfato, muy similar a la proteína de biosíntesis

de pared bacteriana WcaG. El segmento genómico anterior se obtuvo por el ensambla-

je de los fragmentos parciales de 2AF1 y 2AB1, pues presentaban secuencias super-

ponibles entre ellos. Esto sugiere que estos marcadores contienen parte importante del

dominio catalítico de las enzimas inicialmente identificadas por cDNA-AFLP.

Para cada segmento genómico se obtuvo más de un contig, de los cuales un alto

porcentaje contenían secuencias que no pudieron ser identificadas. Es posible que es-

tas secuencias correspondan a regiones intergénicas o intrones, pues en algunos ca-

sos el resultado obtenido con blastn muestra homología con genomas en proceso de

ensamblaje de diversas especies (resultados no mostrados).

40

41

Seg

men

to

gen

óm

ico

Res

ult

ado

sR

esu

ltad

os

Res

ult

ado

sR

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Seg

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ponente

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icados

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tabla

pert

enece

n a

hongos

basi

dio

mic

ete

s ce

rcanos.

Para lograr obtener más información de las secuencias de los genes identificados y

así poder determinar regiones promotoras, se implementó una estrategia de secuen-

ciamiento sobre el gDNA de C. subvermispora. Con este procedimiento se eliminaban

las incertidumbres acerca de si los segmentos genómicos almacenados en los bacte-

riófagos estaban intactos o habían ocurrido recombinaciones con el genoma de E.coli,

como se observó en el secuenciamiento inicial de los bacteriófagos.

3.5. Secuenciamiento de las regiones vecinas a los fragmentos parciales identifi-

cados

A partir de la secuencia de los contigs obtenidos, se diseñaron oligonucleótidos en

los extremos de ambas hebras, los que se orientaron hacia a fuera de estos fragmen-

tos, con el objetivo de conocer el contexto donde se localizaban. De esta manera, se

sintetizaron 30 oligonucleótidos, a partir de los cuales se seleccionaron sólo aquellos

derivados de las secuencias parciales del segmento 2AC2 (ver Tabla 1). Se escogió

uno de los segmentos genómicos con el objetivo de estandarizar y perfeccionar esta

estrategia.

Paralelamente, se extrajo el gDNA de C. subvermispora y luego se digirió con las

enzimas HindIII, BamHI y PstI. Los fragmentos obtenidos se ligaron a los adaptadores

diseñados para aparearse con los extremos cohesivos que deja el corte por estas en-

zimas (ver metodología).

Los fragmentos de gDNA ligados a los adaptadores se utilizaron como molde para

realizar una reacción de PCR. Esta reacción estaba compuesta por un oligonucleótido

utilizado para sintetizar uno de los adaptadores, y por un oligonucleótido diseñado a

partir de la secuencia de los contigs, que en este caso correspondían a la serie de par-

tidores del segmento 2AC2.

42

El resultado de las amplificaciones muestra perfiles de bandas con un amplio rango

de tamaño, y sólo en algunos casos es posible determinar la aparición de productos

más abundantes (Figura 12). Debido a que las enzimas utilizadas en la digestión son

de corte infrecuente, es probable la existencia de fragmentos generados exclusivamen-

te por el corte de una de las tres enzimas. Los fragmentos generados de esta forma

son amplificados sólo con el partidor diseñado para los adaptadores, generando un pa-

trón de bandas común en todas las reacciones, como se observa en la Figura 12, Carril

14.

Figura 12. Amplificación de los fragmentos de gDNA de C. subvermis-

pora con partidores de 2AC2 y PstRv. La fotografía muestra el resultado de

los productos de PCR, obtenidos a partir de los fragmentos de gDNA de C. sub-

vermispora generados por HindIII, PstI y BamHI. El partidor PsRv fue utilizado

en todas las reacciones. En cada bolsillo se cargaron 2 #L de reacción. La des-

cripción de los carriles señalan el partidor específico de 2AC2 utilizado (2-13).

Carril 1: Marcador de peso molecular (1kpb DNA Ladder: 0,5 #g); Carril 2:

C2FFw1; Carril 3: C2FFw2; Carril 4: C2FRv1; Carril 5: C2FRv2; Carril 6:

C22Fw1; Carril 7: C22Fw2 Carril 8: C22Rv1; Carril 9: C22Rv2; Carril 10:

C23Fw1; Carril 11: C23Fw2; Carril 12: C23Rv1; Carril 13 CR23Rv2; Carril 14:

PstRv sólo; Carril 15: sin partidores.

A partir de estas observaciones, sólo los productos mayoritarios, correspondientes a

amplificaciones específicas, se eluyeron desde el gel de agarosa y luego se re-amplifi-

caron para posteriormente secuenciarlos.

43

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

Las secuencias obtenidas se procesaron como se describió anteriormente y luego

se realizó el ensamblaje a los contigs del segmento genómico 2AC2. Finalmente se

logró ensamblar dos de las secuencias y estas permitieron incrementar la información

del contig de 1315 pb a 1723 pb.

3.6. Identificación de elementos de respuesta a metales

Las secuencias obtenidas en los experimentos anteriores permitieron identificar par-

te importante de genes involucrados en la respuesta a Mn2+. Sin embargo, aún falta por

conocer la secuencia completa de cada uno de estos genes para poder definir la región

codificante y los elementos reguladores. En vista de estos resultados, se optó por reali-

zar un estudio informático de las secuencias de promotores de genes eucariontes, cu-

ya regulación por Mn2+ ha sido documentada.

Se realizó una búsqueda de genes que son regulados por Mn2+ en el sitio web de

Comparative Toxicogenomics Database (CTD) (http://ctd.mdibl.org/). Este servidor al-

macena una extensa base de datos que registra interacciones entre moléculas y ge-

nes, en donde se documenta el tipo de relación que existe entre ambos. Para el man-

ganeso se identificaron siete genes cuya expresión se induce y siete que se reprimen

por efecto de este ion, descritos en humanos (Homo sapiens), rata (Rattus norvegicus)

y ratón (Mus musculus).

Posteriormente, se realizó una búsqueda de estos genes en el sitio del NCBI

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) y a través de la herramienta de Sequence Viewer, se ob-

tuvieron alrededor de 400 pb de secuencia río arriba de cada uno de estos genes. A la

búsqueda realizada se agregaron los promotores de los genes de MnP de basidiomice-

tes ligninolíticos, como P. chrysosporium y T. versicolor, que se activan en presencia de

Mn2+ y además el promotor de MnP Csmnp1 de C. subvermispora.

Utilizando todas estas regiones reguladoras, se realizó un análisis bioinformático en

búsqueda de elementos comunes entre las secuencias. Los programas escogidos para

realizar este análisis fueron GADEM y MEME (Figura 13a y 13b, respectivamente). Es-

tos programas son ampliamente utilizados para el descubrimiento de nuevos dominios

de unión de factores transcripcionales (Bailey et al., 2006; Li, 2009). En los resultados

se puede observar que la secuencia identificada por el programa MEME es muy similar

44

a la hebra complementaria del resultado obtenido por GADEM. Al realizar el alinea-

miento múltiple de las 17 secuencias identificadas entre ambos análisis, se obtuvo un

consenso que corresponde al motivo GnGnGGGnGGnGC (Figura 13c). Al considerar

sólo las posiciones más conservadas (3,6,7,9,10 y 12) el elemento queda finalmente

descrito por la secuencia GnnGGnGGnR.

Tanto las secuencias identificadas por los distintos programas, así como los consen-

sos determinados, fueron consultadas en la base de datos de factores transcripciona-

les TESS (Transcription Element Search System) del sitio Computational Biology Labo-

ratory (http://www.cbil.upenn.edu/) de la Universidad de Pensilvania, para establecer si

existían secuencias o factores transcripcionales documentados relacionados con los

elementos aquí identificados. Finalmente no se encontró ningún tipo de registro aso-

ciado a esta secuencia.

Figura 13. Resultado del análisis bioinformático de promotores de ge-

nes que responden a Mn2+. La figura muestra el resultado de la búsqueda

bioinformática realizada con los programas GADEM y MEME (a y b, respecti-

vamente). La parte c muestra el consenso de ambas secuencias y las posicio-

nes relativas de los nucleótidos. La altura de cada columna refleja la conserva-

ción de las bases en cada posición. La altura de cada letra representa la fre-

cuencia de la base en esa posición.

45

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

4. DISCUSIÓN

4.1. Caracterización de la respuesta fisiológica de C. subvermispora a Mn2+.

El estudio previo de la respuesta a Mn2+ de C. subvermispora mediante cDNA-AFLP,

ha derivado en la caracterización de los componentes de la homeostasis de este metal

en este hongo. A partir de las secuencias genómicas obtenidas la investigación aquí

presentada, se pudo predecir la funcionalidad de los genes contenidos en estas regio-

nes, lo que es fundamental para comprender la respuesta a Mn2+. La identificación ini-

cial de estos genes se realizó utilizando el programa blastn, que permite determinar la

homología secuencias obtenidas con genomas de diversos organismos. Sin embargo,

y como se observa en la Tabla 3, el análisis a través de esta herramienta no siempre

resulta significativo. Una de las razones de este resultado se relaciona con la preferen-

cia codogénica que posee el hongo, pues puede contener información que origina pro-

teínas similares a las de otros organismos, pero esta información está contenida en

una secuencia de DNA que no presenta homología con la secuencia de los genes de

estos organismos. Para estimar una identidad significativa, se utilizaron los programas

blastx y tblastx, que permiten realizar una estimación de la homología a nivel de proteí-

na. A través los 3 tipos de programas mencionados anteriormente, se logró determinar

una identidad para cada uno de los segmentos genómicos, lo que permitió establecer

una función para cada gen encontrado en la respuesta a Mn2+ (Figura 14).

En un primer caso, se quiso evaluar el hallazgo determinado para el TDF 2AC2, que

inicialmente se aisló como un marcador reprimido por Mn2+. Este marcador había sido

propuesto como un control para el estudio de la activación transcripcional inducida por

el ion Mn2+. El análisis de la secuencia del segmento 2AC2 permitió la identificación de

un gen con alta homología a un transportador de fosfatos, muy similar a PHO84 de S.

cerevisiae, lo que establece la existencia de una vía específica de incorporación de

Mn2+ en C. subvermispora. Al haber sido identificado como un marcador reprimido por

Mn2+, nosotros postulamos que este transportador corresponde a una de las vías prin-

cipales de la incorporación de este ion cuando éste es escaso en el medio.

46

Figura 14. Modelo integrativo del posible funcionamiento de los compo-

nentes identificados en la respuesta a Mn2+ en C. subvermispora. El esquema

representa los mecanismos propuestos de C. subvermispora para el control de las

concentraciones del ion Mn2+ y su relación con la degradación de la lignina. En la

figura se muestran los transportadores de fosfato (PHO84) y de oligopéptidos

(OPT) que participarían en el ingreso de Mn2+ al interior del hongo. PHO84 se re-

prime en altas concentraciones de Mn2+, por lo que representa una vía de incorpo-

ración en condiciones normales de crecimiento. El transportador OPT se induce en

altas concentraciones de Mn2+, por lo que podría funcionar controlando tanto el

ingreso de Mn2+ como la producción de radicales hidroxilo, generados por reaccio-

nes de tipo Fenton por este ion. Además, este transportador participaría en el con-

trol de la actividad ligninolítica al quelar el Mn2+, que es requerido por la MnP. El

Mn2+ que entra a la célula sería capaz de modular la expresión génica en el núcleo

a través de la unión de un factor transcripcional que se una al motivo propuesto.

Las especies radicalarias generadas por Mn2+ al interior de la célula, podrían ser

controladas a través de la vía de las pentosas fosfato, donde se encontraría la

epimerasa identificada en este estudio, mediante mecanismos aún no determina-

dos. Estas especies reactivas del oxígeno también podrían activar un factor trans-

cripcional tipo yAP-1 en C. subvermispora para aumentar la expresión de sistemas

de control de ROS.

47

La homología encontrada para 2AF2 con un transportador de oligopéptidos (OPT)

sugiere la existencia de un sistema de transporte de Mn2+ a través de sideróforos. Esta

afirmación es sustentada por los transportadores de oligopéptidos descritos en plantas,

los que movilizan los complejos formados por fitosideróforos y Mn2+ al interior de estos

organismos (Koike et al., 2004; Wintz et al., 2003). Otro argumento de particular interés

que sustenta la propuesta es que se han identificado y caracterizado sideróforos en

basidiomicetes ligninolíticos cercanos, como P. chrysosporium y T. versicolor (Minussi

et al., 2001). Esta evidencia resulta paradójica, pues induce un mecanismo de incorpo-

ración de Mn2+ mientras más alta es la concentración de este ion en el medio de culti-

vo, según muestra el comportamiento del TDF identificado por cDNA-AFLP (ver Tabla

2).

En Gloeophyllum trabeum, un basidiomicete de pudrición café, se ha documentado

que estos sideróforos son capaces de reducir Fe3+ a pH ácidos (Goodell. et al., 1997).

La generación de Fe2+ dará lugar a reacciones de tipo Fenton, produciéndose especies

radicalarias capaces de atacar compuestos fenólicos. El ion Mn3+ también sería capaz

de ser reducido por este sideróforo y actuar de un modo similar. De esta forma los side-

róforos podrían fomentar la actividad ligninolítica mediante la producción del radical hi-

droxilo. Por lo tanto, el transportador de oligopéptidos encontrado podría actuar regu-

lando la producción de especies radicalarias a través de la incorporación de Mn2+, y

posiblemente Fe2+, al interior de C. subvermispora. Además, representaría un impor-

tante mecanismo de control de la actividad ligninolítica.

En el caso de los segmentos 2AF1 y 2AB1 se encontró homología con una proteína

hipotética, muy similar a WcaG, la que corresponde a una enzima que participa en la

biosíntesis de la pared celular de E. coli (Thoden et al., 1997). La actividad descrita pa-

ra la proteína hipotética en Laccaria bicolor corresponde a una epimerasa de azúcares

conjugados con nucleótidos difosfato, dependiente de NAD+. En hongos, estos inter-

mediarios pueden participar en diversos procesos como glicólisis o biosíntesis de pa-

red, por lo que es difícil determinar una relación funcional de estos segmentos genómi-

cos con la respuesta a Mn2+. Sin embargo, aparentemente esta enzima podría estar

involucrada en el control del estrés oxidativo a través de la vía de las pentosas fosfato.

El estudio de mutantes de S. cerevisiae que presentan una función alterada de enzi-

mas pertenecientes a esta ruta metabólica, tales como glucosa-6-fosfato deshidroge-

48

nasa, transcetolasas y transaldolasas, además de la ribulosa-5-fosfato epimerasa, pre-

sentan un fenotipo sensible a peróxido de hidrógeno (Juhnke et al., 1996).

En S. cerevisiae, existe un sistema de control transcripcional que se activa en res-

puesta al estrés oxidativo, mediado por los factores tipo AP-1 (genes yAP-1: Yeast like

AP-1) (Toone et al., 2001), homólogos del AP-1 descrito en mamíferos. En el promotor

de Csmnp1 se encontraron elementos posibles para la unión de AP-1 (Tello et al.,

2000). Estos antecedentes, en conjunto con la inducción de un posible sistema de con-

trol de especies radicalarias, permite postular que Csmnp1 se reprime mediante estí-

mulos de estrés oxidativo inducidos por Mn2+. Así, el balance entre Mn2+ y el estrés

oxidativo sería fundamental en el control de la expresión de este gen.

Por otra parte, la evidencia de la activación de un posible sistema de control de ROS

a través de la epimerasa identificada (2AF1 y 2AB1), y la inducción del transportador

de oligopéptidos (2AF2), sugiere que el Mn2+ podría ejercer un control concertado so-

bre sistemas que permitan su autoregulación y el control del estrés oxidativo en C.

subvermispora, de forma de promover un manejo eficiente de los efectos inducidos por

este ion.

4.2. Comparación entre los resultados obtenidos por cDNA-AFLP y el estudio de

los segmentos genómicos relacionados con la respuesta a Mn2+

El secuenciamiento de los segmentos genómicos de C. subvermispora ha permitido

identificar componentes cuya participación en la respuesta a Mn2+ es más evidente. Si

bien los TDFs identificados por cDNA-AFLP provienen del mRNA total, estos marcado-

res son de un tamaño que varía entre los 230 a 430 pb, por lo que podrían contener

codificado una pequeña parte de algún dominio conservado requerido para una activi-

dad enzimática específica. En el caso de los marcadores 2AC2 y 2AF2, que inicialmen-

te fueron descritos como transportadores, corresponden a proteínas muy distintas

comparadas con las que aquí se proponen (ver Tabla 4). Estos resultados reflejan que

posiblemente se identificó algún dominio transmembrana característico de los transpor-

tadores en el cDNA-AFLP.

Con relación a los marcadores 2AF1 y 2AB1, el hallazgo resultó interesante, pues

los marcadores identificaron funciones distintas, lo que finalmente resultó en la identifi-

49

50

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cación de una sola enzima con actividad epimerasa. Inicialmente 2AB1 había sido

identificado como una Acetil Co-A deshidrogenasa, mientras que 2AF1 mostró alta ho-

mología a Nbp35, que es una enzima que se encarga del ensamblaje de proteínas con

complejos Hierro-Azufre en el citoplasma. La epimerasa identificada posee un dominio

de deshidrogenasa y un dominio de unión a ATP, por lo que estos TDFs pueden conte-

ner parte importante de estos dominios catalíticos, dando lugar a la identificación de

dos enzimas independientes a través de BLAST

Otro aspecto a destacar es el significativo incremento de la información a nivel de

secuencia de los genes identificados a través de los marcadores, el que fue al menos

el doble en todos los casos (ver Tabla 4). Sin embargo, de forma particular el segmento

2AF2 contiene contigs de tamaños relativamente pequeños, y esto se debe a que en

su secuenciamiento se encontró una gran población de clones que contenían DNA de

E.coli. Aún con estos resultados, se determinó que gran parte de la secuencia del con-

tig de 179 pb muestra una alta homología con la proteína hipotética identificada, lo que

sugiere que este fragmento puede corresponder a parte de un exón del gen del trans-

portador de oligopéptidos.

El objetivo inicial del secuenciamiento de los segmentos genómicos era obtener las

regiones promotoras de los genes identificados para luego realizar la búsqueda de un

nuevo motivo específico para la respuesta a Mn2+. La información obtenida de los

sgmentos genómicos no fue suficiente para definir las regiones regulatorias asociadas

a estos genes. La estrategia para extender las secuencias de los contigs pretendía re-

solver este punto, sin embargo, los fragmentos obtenidos sólo pudieron ser parcialmen-

te ensamblados con los contigs de 2AC2, sin poder determinar la organización del gen

identificado como transportador. Los resultados obtenidos se deben principalmente a

que al obtener secuencias de forma aleatoria, no es posible contar con algún punto de

referencia para determinar la ubicación relativa en el gen, dificultando el proceso de

búsqueda de su respectivo promotor. Una alternativa que se había planteado inicial-

mente era rescatar algún fragmento de digestión identificado por Southern Blot, y pos-

teriormente secuenciarlo. De esta manera se obtendría gran parte de la secuencia del

segmento genómico. Sin embargo, esta estrategia hubiese presentado dificultades si-

milares a las que se observaron en la estrategia empleada en esta tesis para buscar el

51

promotor del gen de transportador de fosfatos, pues se trataba de secuenciar fragmen-

tos por sobre los 4 kpb.

Para resolver este punto, se propone el uso de la técnica de PCR inverso para ob-

tener secuencias río arriba del inicio de transcripción. Esto requeriría la búsqueda de

los segmentos parciales aquí obtenidos en la genoteca de cDNA de C. subvermispora.

Luego de secuenciar el mRNA de cada uno de los genes identificados, se podría reali-

zar la técnica sugerida con el gDNA de este hongo.

4.3. Elemento de respuesta a Mn2+

El descubrimiento de nuevos motivos reguladores de la expresión génica ha sido el

principal desafío de la bioinformática en el último tiempo. Este objetivo ha requerido el

desarrollo de complejos algoritmos, capaces de “interpretar” la funcionalidad de una

secuencia determinada de 5 a 20 pb, a partir de la presencia de ésta en promotores de

genes que responden a un mismo estímulo (Das y Dai, 2007).

Aquí se presenta evidencia de un posible elemento de respuesta a Mn2+ que ha sido

identificado a partir del uso de estos algoritmos sobre secuencias correspondientes a

regiones promotoras de genes cuya expresión se ve alterada por este ion. Este ele-

mento proviene de la aplicación del algoritmo MM a través de dos estrategias distintas

que ofrecen los programas GADEM y MEME. Los resultados obtenidos muestran que

este elemento corresponde a una secuencia no descrita hasta ahora que posee un alto

contenido de guaninas. Al buscar este elemento en la secuencia de los promotores de

los genes de MnP de los basidiomicetes ligninolíticos aquí citados, se encuentran al

menos 4 motivos que difieren sólo en un nucleótido de la secuencia consenso en cada

uno de ellos (resultados no mostrados). El promotor de Csmnp1 contiene 5 de estos

motivos, siendo 2 de ellos muy conservados respecto al modelo (Figura 15a)

Al comparar este elemento con el que reconoce el represon MntR de bacterias, no

se observa similitud alguna, lo que sugiere que este elemento pudo haber evoluciona-

do en organismos eucariontes (resultados no mostrados). Sin embargo, existe un seg-

mento de la secuencia de 33 pb del promotor de mnp1 de P. chrysosporium identificada

por Ma et al., el 2004, que es muy similar a la secuencia consenso definida (Figura

52

15b). En el trabajo citado, los investigadores demuestran que el segmento de 33 pb es

fundamental en la respuesta observada para Mn2+.

Figura 15. Identificación del elemento de respuesta a Mn2+ en los pro-

motores de MnP de C. subvermispora y P. chrysosporium.

a. La figura muestra un esquema que contiene los 5 motivos identificados en el

promotor de Csmnp1 (rectángulos plomos). La secuencia se muestra en los ca-

sos de los elementos más conservados. b. Identificación de la secuencia

consenso en el elemento de 33 pb del promotor de mnp1 de P. chrysosporium.

La evidencia presentada hasta ahora, sugiere la existencia de un sistema específico

para la homeostasis de Mn2+ en C. subvermispora, compuesto por proteínas que de

forma selectiva median su transporte, y a la vez son reguladas transcripcionalmente

por la presencia de este ion. Por otra parte, el promotor del gen que codifica la MnP,

enzima que depende absolutamente del ion Mn2+, presenta elementos únicos aquí

descritos, que también pueden encontrarse en otros genes que son regulados por

Mn2+. A partir de estos antecedentes se postula la existencia de un factor transcripcio-

nal capaz de responder de forma específica a variaciones en la concentración del ion

Mn2+, de la misma forma como se ha descrito en procariontes. Este elemento podría

funcionar como activador o represor de genes, según lo que describe el comportamien-

to de los marcadores identificados por cDNA-AFLP. La variación de la respuesta obser-

vada podría atribuirse a la existencia de otros motivos funcionales presentes en los

promotores de los genes regulados por Mn2+, que podrían funcionar de forma concer-

tada para la expresión de aquellos.

53

a.

b.

Elemento del promotor de mnp1 de P. chrysosporium

CCCTTGCGTTGGGCTTGGCGTTGGGTCCACGGT

GnGGnGGGnGConsenso:

Finalmente, la identificación de este factor representaría un argumento robusto para

sustentar el papel que tiene el Mn2+ como regulador de la expresión génica en la célu-

la.

54

5. CONCLUSIONES

Se logró identificar cerca de treinta clones de la genoteca genómica de C. subver-

mispora que contienen los genes que participan en la respuesta a Mn2+, utilizando los

cuatro marcadores seleccionados a partir del estudio de regulación transcripcional por

Mn2+ a través de la técnica de cDNA-AFLP.

El análisis por la técnica de Southern Blot de los clones seleccionados de la genote-

ca genómica permitió validar la identificación de al menos un bacteriófago aislado por

cada marcador.

El segmento genómico de C. subvermispora, almacenado en los clones selecciona-

dos de la genoteca genómica, pudo ser selectivamente aislado mediante PCR. El

producto obtenido se logró fragmentar y luego subclonar, permitiendo su posterior

secuenciamiento.

Los fragmentos parciales de los segmentos genómicos contenidos en los bacterió-

fagos seleccionados se pudieron ensamblar mediante herramientas bioinformáticas.

El uso del algoritmo computacional BLAST, permitió la identificación de genes que

codifican para un transportador de fosfatos, un transportador de oligopéptidos y una

proteína hipotética con actividad epimerasa.

Los transportadores identificados mostraron alta homología con transportadores es-

pecíficos de Mn2+ de organismos modelo como S. cerevisiae y A. thaliana, en los que

se ha caracterizado la homeostasis de este ion.

Ambas herramientas bioinformáticas utilizadas para el análisis de promotores de

genes que responden a Mn2+ de distintos organismos, lograron identificar un motivo

definido. El motivo encontrado pudo ser identificado en promotores de los genes de

MnP de C. subvermispora y además mostró alta similitud al elemento de 33 pb, des-

crito en el promotor de mnp1 de P. chrysosporium que se asocia a la activación me-

diada por el ion Mn2+. Estas evidencias sugieren que el ion Mn2+ podría controlar di-

rectamente la expresión génica a través de esta secuencia de regulación específica,

pudiendo activar o reprimir genes, dependiendo del contexto en el que se encuentre.

Este contexto estará formado por la combinación de otros elementos de unión a pro-

teínas.

55

6. PROYECCIONES

A través del secuenciamiento de los promotores de los genes que responden a Mn2+

en C. subvermispora se podrá verificar la existencia del elemento encontrado. Para

esto se propone el uso de PCR inverso sobre el gDNA de C. subvermispora, luego de

caracterizar adecuadamente los genes de este hongo. De forma alternativa, se podrá

realizar la búsqueda bioinformática del elemento identificado en el genoma completo

de C. subvermispora, pues pronto estará disponible.

El elemento validado puede ser utilizado para buscar un factor transcripcional espe-

cífico, capaz de unir el ion Mn2+, lo que explicaría la regulación transcripcional obser-

vada en C. subvermispora .

La identificación de todos los componentes de la respuesta a Mn2+, permitirá esta-

blecer los mecanismos que controlan la homeostasis de este ion en C. subvermispo-

ra. Este conocimiento permitirá establecer la relación entre el ion Mn2+ y la actividad

ligninolítica de este hongo.

56

7. BIBLIOGRAFÍA

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