8/16/2019 02-Tècniques de Cultiu (I)
1/16
2. TÈCNIQUES DE CULTIUS (I)
1. Condicions físiques
1.1. Temperatura d'incubació
1.2. pH
1.3. Constitució fase gasosa
1.4. Pressió osmòtica
1.5. Tipus de substrat
1.6. Tipus de flascons
2. Condicions biològiques
2.1. Constituents del medi
2.2. Solucions salines equilibrades
2.3. Medis definits
3. Esterilització
4. Laboratori de cultius1
8/16/2019 02-Tècniques de Cultiu (I)
2/16
1. Condicions físiques
1.1. Temperatura d’incubació
-Temperatura del cos de l’organisme original
-mamífers: 36,5-37ºC
-aus: 38,5ºC
-poiquiloterms: tº ambient –2ºC
-Millor constància que exactitud Excés morenFred conserva
2
8/16/2019 02-Tècniques de Cultiu (I)
3/16
1.2. pH
-pH fisiològic (7,0 - 7,7; la majoria a 7,4)
-Línies transformades 7,0 - 7,4-Control amb indicador de pH (roig de fenol)
- Problemes
- Acidificació
- Basificació
- Solució
- Cultius tamponats
NaHCO3–CO2 (bicarbonat)
HPO42--H2PO4 (fosfats)
HEPES (tòxic [])3
8/16/2019 02-Tècniques de Cultiu (I)
4/16
1.3. Constitució fase gasosa
-N2 : 78%
-O2: 21%
-CO2:
8/16/2019 02-Tècniques de Cultiu (I)
5/16
1.3. Constitució fase gasosa
Re l a c ió CO 2 i p H
-CO2 regula pH del medi, el CO2 es dissolt en H2O en funció Tº
H2O + CO2 H2CO3 H+ + HCO3- (1)
CO2 atmos no dissolució pH = 7,4
CO2 atmosf dissolució pH
-Per evitar disminució de pH podem afegir tampons (bicarbonat)
NaHCO3 Na+ + HCO3- (2)
NaOH + H2CO3 NaHCO3 + H2O Na+ + HCO3- + H2O (3)
-L'addició de NaHCO3 o NaOH fa augmentar la quantitat de HCO3- il’equació (1) es desplaça a l’esquerra, equilibrant el pH a 7,4
5
8/16/2019 02-Tècniques de Cultiu (I)
6/16
1.4. Pressió osmòtica
1 osmol de solutOsmolaritat= = osmols/litre
1 l. de solvent
1 osmol de solutOsmolalitat= = osmols/Kg
1 Kg. de solvent
osmol: unitat estàndard de pressió osmòtica basada en unaconcentració 1 molal d'un ió en una dissolució.
Cultius: entre 260 - 320 mOsm/Kg
- superior medi hipertònic
- inferior medi hipotònic
6
8/16/2019 02-Tècniques de Cultiu (I)
7/16
1.5. Tipus de substrat
-Cèl·lules en suspensió
-Línies hematopoiètiques, alguns tumors, gàmetes,...-Cèl·lules adherides al substrat
-Majoria
-
Semisòlid col·lagen, agar, gelatina-Sòlid vidre, plàstic
-Cèl·lules en cocultiu
-Amb altres tipus cel·lulars subministren GF, nutrients
Cel epitelitals
Cel epitelialscocultiu
Cel epitelials
cocultiu
Amb matriuSense matriu
Placa doble
7
8/16/2019 02-Tècniques de Cultiu (I)
8/16
1.6. Tipus de flascons
Tubs: sang
8
8/16/2019 02-Tècniques de Cultiu (I)
9/16
2. Condicions biològiques
2 . 1 . Co n s t i t u e n t p r i n c i p a l d e l m e d i
-H2O destil·lada i desionitzada
2 .2 . So l u c io n s s a l i n e s e q u i l i b r a d e s
-H2O + sals inorgàniques-Manteniment cèl·lules màxim 4 h. (transport, manipulació
9
8/16/2019 02-Tècniques de Cultiu (I)
10/16
2 .3 . M e d i s d e f i n i t s
-De més simples (MEM) a molt complexes
-MEM
-M199
-RPMI 1640
-Ham’s F10 i Ham’s F12
10
8/16/2019 02-Tècniques de Cultiu (I)
11/16
2.3.1. Aminoàcids:
- essencials: no síntesi a la cèl·lula
- Cisteina: in vitro no intercanviable per Met- Tirosina: in vitro no transformable de Phe
- Glutamina: font extra carboni i energia
2.3.2. Vitamines:- Grup B, actuen com a cofactors
2.3.3. Sals:
-
Na+
, K+
, Ca2+
, Cl-
: potencial membrana- HCO3
-, PO43-, SO4
2: requeriments matriu, precursors macromolèc,regulació carrega intracel·lular
- Ca2+: adhesió cèl·lules i unions
- HCO3-: tampó de pH, paper nutricional- Fe2+: necessari pels citocroms
- PO43-: síntesi d'ATP
2.3.4. Carbohidrats2.3.5. Suplements orgànics
11
2 3 6 Sè
8/16/2019 02-Tècniques de Cultiu (I)
12/16
2.3.6. Sèrum:- fetal calf serum- new born calf s.- calf serum- horse serum- human cord s.- human serum
12
Inactivació del sèrum
8/16/2019 02-Tècniques de Cultiu (I)
13/16
M ed i s q u ím i cam e n t d e f i n i t s
-Medis sense sèrum
-Només funcionen en alguns tipus cel·lulars
-Addició
-Factors adhesió
-Inhibidors proteases
-Hormones
-GF
-Nutrients
-Proteïnes i poliamides
13
8/16/2019 02-Tècniques de Cultiu (I)
14/16
3. Esterilització
-Tipus de contaminació
-Fongs, bacteris, micoplasmes i virus
-Mètodes d’esterilització
-Forn Pasteur: vidre, plàstic, metall
-Autocalu: vidre, plàstic, metall, sol salines
-Filtració: medis, sol salines, altres líquids
-Raig : plàstics
-Òxid etilé: plàstics
Forn PasteurFiltracióAutoclau
14
ó
8/16/2019 02-Tècniques de Cultiu (I)
15/16
3. EsterilitzacióLloc treball: Cambra de flux vertical o horitzontal
15
b i d l i
8/16/2019 02-Tècniques de Cultiu (I)
16/16
4. Laboratori de cultius
16