Gentica y Biologa Molecular en BioqumicaRicardo Fujita, Ph.D.Centro de Gentica y Biologa MolecularInstituto de InvestigacinFacultad de Medicina USMPPrimera parte: DNA
Informacin Gentica
2 X 1014 clulas adulto2X1023 60 aos
Clulas madreFertilizacinInformacin Gentica
Qu molcula pasa informacin gentica?Tiene que ser compleja, hereditaria: Carbohidratos: azcares, polisacridos Lpidos: cidos grasos, cerasAcidos nucleicos: 4 nucletidos, 1 azcar, fsforoProtenas: 20 aminocidosmas complejocandidato
Antecedentes caracterizacin del material hereditarioTeora celular: Omnis cellula ex cellulaMendel (informacin gentica)Teora cromosmica de la herenciaComposicin qumica de la clula
Composicin qumica del ncleoFriedrich Miescher, 1869: ncleos y esperma citoplasma: sustancia fosfrica poco proteicaPhoebus Levene, 1920s[P] = [D-ribosa] = [4 bases nitrogenadas]P:D-ribosa:base => nucleotidoExtraccin fibrilar => cadena.Robert Feulgen, 1920, tincin nuclear especfica, cuantitativa= gametos 1/2 de otras clulas.ProtenasFsforo
Neumococos: Streptococcus neumonieRugosa (R) (inocua)mutante no producemucopolicridosLisa (smooth S)(patgena)Proteccin cpsulamucopolisacridos Cepas en placa PetriInformacin Gentica del Principio TransformanteRS
Transformacin SVirulentaRinocuainocuaR vivas + S muertas = transformacin virulentaGriffith, 1928S muertas
Avery, McLeod y McCarty (1944)
Es DNAEn la poca (1944) se pensaba que por su complejidad, solo las protenas podran ser el material gentico
Alfred Hershey y Marta Chase(1952).Virus bacteriofago (protena y DNA)
- Marcacin con radioactividad = 32P : DNA, 35S : protenas
- Infeccin a bacterias: introduccin de material gentico
Anlisis de interior bacteriano: 35S si protenas. 32P si DNA.
Solo se encuentran bacterias con interior marcado en P32P (rojo)35S (rojo)
CONCLUSION: corrobora DNA es material gentico
Carbonos de la desoxi/oxi ribosa1 Base nitrogenada2 H (ADN) / OH (ARN)3 OH-Interaccion con P (5) de otro nucletido45 PPP- interaccion con OH (3) de otro nucletido
La formacin de nucletidos de DNAfosfato + desoxirribosa + base nitrogenada = Deoxinucletido513
123456789123456Bases Nitrogenadas
R. Franklin y M. Wilkins, 1953Estudios de Difraccion de rayos X
- Hlice- bases perpendiculares al eje- 0.34 nanometros (nm)/base-peldao- 1 vuelta completa ~ 3.4 nm => 10 bases / vuelta- 2 nm (20 Amstrong) de anchoFOTO 51
Qumica del ADN Distancias (rayos X) Helice (1, 2, 3?) Esqueleto ribosa-fosfato Bases perpendiculares Chargaff [A]=[T], [C]=[G]
Modelos moleculares(Rompecabezas con fierros y cartulinas) doble cadena
Para tener 2 nm de ancho solo se puede arreglar de una forma: antiparalela
A frente a T (2 enlaces de Hidrgeno)G frente a C (3 enlaces de hidrgeno)
DOBLE CADENA ANTIPARALELA
Las 2 bases complementarias soncoplanares: pares de basesLos esqueletos azucar-fosfato estanal exterior-barandas- (cido) y las bases al interior-peldaos.
Las cadenas complementarias, antiparalelas forman la doble hliceCada cromosoma cientos de millones de pares de bases. Barandas repeticiones idnticas, secuencia de bases: informacin gentica
El DNA es doble cadena antiparalelaSi se conoce una hebra se conoce la otra
Toda la informacin gentica se escribe en una secuencia 4 letras de DNA:
Inicio de replicacin Estructura del cromosoma: telmero, centrmero Gen: Exones/intrones Inicio y final de trascripcin Regiones promotoras Regiones reguladoras
Secuencia Parcial del Gen de la Insulina
Qu somosdepende cmo estamos escritosATTTGCAGTTCCAGTCATTGCAATTGCCATTGCCAAC
Propiedades fisicoqumicas del DNADoble cadena complementaria antiparalelaA:T 2 enlaces de hidrgeno, G:C 3 (mas fuerte)Denaturacin: apertura de doble cadenaRenaturacin: cierre de doble cadenaHibridacin: una hebra se aparea con otra complementaria
DenaturacinAgentes qumicos (hidrxidos), alta temperatura (> 90C), baja salinidad
Secuencias ricas en AT (doble enlace) ms fciles de denaturar que las ricas en GC (triple enlace)Se rompen los enlaces de hidrgeno y se separan las cadenas5`353
Dos cadenas se aparean por reconocimiento de bases y vuelven a formar enlaces de hidrgenoRenaturacinRENATURACIN
Hibridacin renaturacin o apareamiento con otras molculas externas complementarias de DNAcompetencia con hebra complementaria
Apareamiento 1 vs. ?5 ACCCTAATTTAACAAAC 35 GGCCACCACGGCCC 35 GTTTGTTAAATTAGGGT 35 TGGGATTAAATTGTTTG 3123
3CAAACAATTTAATCCCA 55 GTTTGTTAAATTAGGGT 35 GTTTGTTAAATTACAGC 35 GTTTGTTACATTAGGGT 3Apareamientos perfectos e imperfectos
Diagnstico gentico glaucoma familia AndahuaylasGuevara-Fujita, Perez-Grosman, Estrada, Pawar, Vargas, Richards & Fujita (2008). Journal of Glaucoma 17:1 67-72Normal (perfecto)
Afectado (imperfecto/heterocigoto)CSGE-Conformational Sensitive Gel electroforesisdetecta mutaciones apareamiento imperfecto AC
El patrn CSGE de los miembros de la familia muestra una sola banda para los no afectados y muestra control (ctD), mientras los afectados muestan doble banda, as como tambin el paciente 203 portador asintomtico de la mutacin
CSGE familiaG
ReplicacinPrincipio UniversalReproduccin individuo, preservacin especie Objetivo: 2 copias exactas para 2 clulas hijas. De cigoto a indivduo (1014) vida (1023). Alta fidelidad, verificacin y reparacin: estabilidad gentica individuo y especieFase S ciclo celular Semiconservativa, bidireccionalVarias DNA polimerasas (varias: replicacin, reparacin, ambas)Otras protenas reconocen DNA, estructura, mutaciones, protenas entorno celular, etc.) Una cadena continua y la otra discontinua (Okazaki en eucariotes cada tira tiene distinta polimerasas y protenas)Fallas en replicacin: enfermedades degenerativas, cncerhttp://www.ucm.es/info/genetica/grupod/Replicacion/Replicacion.htm
Replicacin necesita:Deoxinucletidos trifosfato (dNTPs): dATP, dCTP, dGTP, dTTP Origen de replicacin (secuencia especfica). Reconocimiento 200-300 bp una cadena rica en A yTs. DNA polimerasa: siempre sintetiza 5 -> 3 varias replicacin, reparacin. Procariota/eucariota. Mitocondrial/nuclear. Primer (iniciador): necesita 3OH para iniciar. RNA cebador, DNA (virus), telomerasa, protenas (virus). Complejo con otras protenas: ligasas, helicasa, SSB, primasa, topoisomerasa, etc.
Origen de Replicacin
Esquema de las burbujas de replicacin en eucariotas(E. coli) 1 sola horquilla de replicacin 30 Genoma 4.5 millones bp (4.5 Mb)Genoma humano (3, 200 millones de pares de bases), cuanto tiempo? 500 horas (20 das?). Linfocitos en cultivo 20 horas => varios puntos a la vez, 20,000 puntos, 150 kb c/u
Incorporacin de BrdU en distintos momentos
primer RNASSB (RP-A)topoisomerasashelicasasDireccin deldesenrrollamientoEsquema general de la replicacin(cadena contnua)(cadena discontnua)
Antibiticos y replicacinActan en precursores o maquinariaSulfonamidas: inhibe cido flico bacterianoAgentes alquilantes: ciclofosfamidas, mitomicinaArabinsidos: imita ribosa (no tiene 3OH) en nucletido. Citarabina (antileucmicos), ara A (antiviral). Primasa y DNA Polimerasa afectados Inhibicin topoisomerasas: quinolonas bacterianas, ciprofloxacina, norfloxacina. Irinotecn cncer. Mitosis: Taxol, vinblastina, mitomicina
IrinotecanTopoisomerasa
Tipos de mutaciones a nivel molecular
AACGTTGACCC
Sustituciones: AACGTCGACCC
Deleciones: AACGTACCC
Inserciones: AACGTTAAGTGACCC
Repeticiones AACGTTGTTGTTGACCCTG
Causas de MutacionesInternas (espontneas): oxidacin, metilacin, desaminacin, depurinacin, depirimidinacin.
Externas (inducidas): radiacin: X, g, UV,policclicos aromticos (benzopireno, humo, brea, naftalina)
ReparacinIntegridad de la informacin genticaFuncionamiento normalTransmisin de los caracteresChequeo:Replicacin: DNA polimerasa 3endonucleassaReparacin de daoProblemas de reparacin: enfermedades degenerativas (envejecimiento celular) y cncer
Sistema de reparacinMs de 150 genes conocidosVarios complejos proteicos en sistema de recombinacin (sensores moleculares)Homologa de genes de reparacin conservada en evolucinPasos: reconocimiento, endonucleasa, exonucleasa/helicasa, DNA polimerasa, ligasa
Reparacin por desigualdad
Si la nueva hebra est equivocada, cmo reconocemos la correcta, (antigua?)
5 CCATTGATTATT 33 GGTACCTAATAA 5
Defecto de apareamiento
hebra antigua es metilado, nueva todava
(BER) Escisin de 1 base-Depurinacin (rotura de enlace glucosdico) espontnea-Desaminacin de A y C yremocin por N-glucosidadasa
(NER) Reparacin por escicin de nucletidos- Dao a varias bases(hasta ~ 30)-UV: dmeros de timina,- Dao con distorsin fsica - Xeroderma pigmentosa Sndrome de Cockayne
Double strand breakNon homologousEnd joining Secuencia parecidaSecuencia idnticaTraslocacin, inversinRecombinacin homloga y NO homloga
Xeroderma pigmentosaTricotiodistrofiaSndrome de Cockayne
Sndromes debidos a fallas en reparacin (1)
Sndromes debidos a fallas en reparacin (2)hMSH2, MLH1, PMS1, 2: reconoce mal apareamiento (mismatch)BRCA: reconocimiento mutaciones doble hebra y supresor de tumor (paro ciclo celular)
Mutaciones asociadas a XP, CS y TTD3p259q22.313q225q12.311
Fig. 5.4. Genes conocidos, cuyas mutaciones se asociana xeroderma pigmentoso (XP) y sndrome de Cockayne (CS).
***