[2]
Resumen
El alumno percibe como poco comprensible, apenas útil e independiente de las
situaciones de la vida real temas como: “Respiración celular como proceso
metabólico productor de energía”. En este sentido, el presente estudio tuvo como
objetivos: la elaboración de vino artesanal mediante las fermentaciones
tradicionales para promover el aprendizaje y motivación del alumnado al abordar los
tópicos de glucolisis y fermentación; observar y cuantificar la producción de etanol
empleando distintos tipos de uvas; evidenciar la producción de CO2 en la
elaboración de este producto a partir de microorganismos que llevan a cabo rutas
metabólicas y demostrar la utilidad de la comprensión de estos temas.
Se emplearon 500g de uva morada, verde, blanca, roja y orgánica, se molieron y
repartieron en frascos limpios (inóculo y preinóculo) al preinóculo se le adicionó 1gr
de levadura seca granulada Saccharomyces cerevisiae y al cabo de 3 días se juntó
el contenido del preinóculo e inoculo por dos semanas, se eliminaron las células de
la levadura mediante centrifugación y con el vino clarificado se determinó la
presencia de etanol para cada una de las muestras mediante una prueba
colorimétrica y para determinar el porcentaje de alcohol se utilizó un densímetro.
Los resultados mostraron que los aprendizajes adquiridos en el aula son útiles en la
vida cotidiana, el vino artesanal evidenció la producción de CO2 y etanol mediante
la prueba colorimétrica cualitativa y los porcentajes de etanol generados en los
distintos vinos artesanales son muy similares.
Finalmente se puede concluir que se aplicaron conocimientos biológicos y químicos
en la obtención de vino artesanal, Saccharomyces cerevisiae fue capaz de
metabolizar los glúcidos a través de la fermentación mostrando la presencia de
etanol y fue fácil de evidenciar la liberación del CO2 mediante el olor a uva madura
característico de los vinos. Los porcentajes de etanol generados en los distintos
vinos no muestran diferencia estadísticamente significativa y la elaboración de vino
demanda no solo conocimientos biológicos y químicos, también es necesario contar
con ingenio para llevar a cabo actividades prácticas y útiles con materiales
accesibles y de bajo costo para comprender temas considerados complejos.
[3]
Introducción
Marco teórico
La bebida resultante de la fermentación alcohólica del zumo de algunas frutas es el
vino, este se lleva a cabo por la compresión o no de diversos frutos y este es
realizado por las levaduras silvestres que se mezclan con los jugos ricos en azúcar
(Ferreyra et al., 2009).
Existen registros históricos que apuntan que hace aproximadamente 5,000 años
atrás, los seres humanos ya utilizaban la habilidad de las levaduras para fermentar
los azúcares de las frutas y obtener alcohol; de esta manera se producía cerveza y
vino de distintos tipos de manera comercial (Audesirk et al., 2018).
Las levaduras son hongos unicelulares oportunistas que pueden realizar la
respiración en presencia de oxígeno, pero en ausencia de este realizan la
fermentación alcohólica. Así, el vino debe fermentarse en toneles especiales que
eviten la entrada de oxígeno, pero que permitan que el dióxido de carbono producido
por las levaduras escape, para que los toneles no estallen.
Además de las levaduras silvestres responsables de la fermentación del vino se
encuentran algunas especies del género Saccharomyces en especial la especie
cerevisiae un organismo eucarionte muy estudiado por poseer un genoma
relativamente pequeño que se añade al mosto para iniciar la fermentación, los
azúcares contenidos en el mosto se convierten en alcohol (etanol) con
desprendimiento de CO2 (Alberts et al., 2016).
Saccharomyces cerevisiae comprende dimensiones aproximadas entre 2.5 y 10
micras de ancho y 4.5 a 21 micras de largo, con diversas formas desde cilíndricas
y filamentosas hasta redondas, ovoides y elipsoides con pared celular y núcleo
verdadero. Al ser un organismo eucarionte posee mitocondrias, ribosomas y en
algunas ocasiones vacuolas, cuando se forman colonias suelen presentar un color
crema o blanco, de apariencia húmeda y brillante, de bordes irregulares, la
temperatura adecuada para su crecimiento oscila entre los 25-30 °C y llega a
[4]
producir ascosporas cuando los nutrimentos son óptimos (Fajardo y Sarmiento,
2007).
Existe una amplia variedad de nutrimentos a través de los cuales la respiración
celular puede extraer energía, en el caso de Saccharomyces cerevisiae que utiliza
la fermentación alcohólica el piruvato producido mediante la glucólisis se convierte
en etanol y CO2; la glucólisis genera dos ATP y dos NADH por cada molécula de
glucosa metabolizada sin oxígeno, no hay aceptor final para los electrones
acumulados por el NAD+ para formar NADH. De esta forma, al existir la fermentación
el NADH generado en la glucólisis vuelve a formar NAD+, lo que evita que la
glucólisis se detenga, continúe la formación de energía y de esta manera la levadura
permanezca viva y pueda producir etanol en forma de vino partiendo de los
azucares de las frutas y CO2 como desecho de manera gaseosa (Alberts et al.,
2016).
Objetivos
Mostrar que los aprendizajes adquiridos en el aula son útiles en la vida cotidiana del
estudiante a partir del tema respiración celular para que obtenga vino artesanal
mediante el uso de microorganismos empleando la biotecnología.
Observar cómo la fermentación de Saccharomyces cerevisiae metaboliza los
azúcares naturales de la uva hasta producir etanol y CO2.
Cuantificar la producción de etanol en el vino con base en la fermentación de
Saccharomyces cerevisiae empleando distintos tipos de uvas.
Problema
El alumno percibe como poco comprensible, apenas útil e independiente de las
situaciones de la vida real o de las practicas sociales de la cultura a la que pertenece
temas como: “Respiración celular como proceso metabólico productor de energía”.
En este sentido, se pretende la elaboración de vino artesanal mediante las
fermentaciones tradicionales para promover el aprendizaje y motivación del
alumnado al abordar los tópicos de glucolisis y fermentación, para que observe la
[5]
producción de etanol y CO2 en la elaboración de este producto a partir de
microorganismos que llevan a cabo rutas metabólicas y evidencie la utilidad de
comprender estos temas.
Hipótesis
Los teóricos de la enseñanza consideran que parte del fracaso de las instituciones
educativas para promover el aprendizaje e interés de los alumnos es, que lo que se
enseña en las aulas proporciona una insuficiente motivación y se percibe como poco
comprensible y difícilmente útil, sobre todo en aquellos temas bioquímicos como
glucolisis y fermentación, puesto que no se pueden establecer asociaciones
coherentes con respecto a las representaciones científicas mostradas de manera
verbal, en el pizarrón o diapositivas acerca del tema, entonces, si se emplean
situaciones educativas como la elaboración de productos como el vino artesanal
empleando microorganismos que llevan a cabo dichas vías metabólicas, en las
cuales, el alumno sea participe, aprenda en contextos pertinentes para desarrollar
sus potencialidades, el conocimiento o producto del aprendizaje sea el resultado de
la actividad del aprendiente en interacción con sus pares, será posible que este
ambiente y aprendizaje de creación y representación sea significativo para el
estudiante, tomando como premisa que aprender y hacer son acciones
inseparables.
Desarrollo
El vino es una bebida producida por fermentación alcohólica utilizando la levadura
Saccharomyces cerevisiae en condiciones enológicas de variedades de uvas Vitis
vinífera, el cultivo de estas vides cubre actualmente el 90% de las superficies de los
viñedos en el mundo, mientras que el 10% restante son variedades no viníferas
utilizadas generalmente como frutas de mesa (Miño et al., 2015), tomando como
referencia este acontecimiento, se decidió obtener vino a partir de distintas uvas:
morada, verde, blanca, roja y orgánica, cuantificar la producción etanol y observar
la producción de CO2.
[6]
Con este fin, se emplearon 500g de cada una de las uvas, lavadas con abundante
agua y desinfectadas con cloro, se molieron y fueron repartidas de manera
equitativa cada tipo de uva en dos frascos limpios (inóculo y preinóculo
respectivamente) cuidando no superar las ¾ de volumen del mismo, se cerraron las
tapas al llegue y se les colocó una camisa de papel aluminio para esterilizarlos en
autoclave de 115 a 120°C durante 10 minutos (figura 1), se dejó enfriar a
temperatura ambiente y al frasco nombrado preinóculo se le adicionó 1gr de
levadura seca granulada Saccharomyces cerevisiae pesada cuidadosamente con
ayuda de un vidrio de reloj y una balanza analítica en la campana de extracción para
evitar la contaminación con algún organismo patógeno y se incubó a 37°C por 3
días (figura 2), el frasco nombrado inóculo se mantuvo en refrigeración por el mismo
lapso de tiempo.
Figura 1. Etiquetado de frascos inóculo, preinóculo y montado de camisas de aluminio para la esterilización.
Una vez transcurrido el tiempo mencionado se junto el contenido del preinóculo e
inoculo en una botella plástica de 1L, previamente lavada y desinfectada con cloro,
se procedió a agitar la botella y a desenroscar la tapa dos o tres veces al día durante
dos semanas sin abrir, para liberar de manera controlada el dióxido de carbono y
evitar que reventara la botella.
[7]
Figura 2. Adición de 1gr de la levadura Saccharomyces cerevisiae e incubación a 37°C durante 3 días.
Terminado el tiempo de fermentación se coló el mosto con un colador de cocina
convencional y el vino clarificado se centrifugó a 4000rpm por 15 minutos, se
eliminaron las células de la levadura que se depositaron en el fondo con los residuos
de las uvas dentro de los tubos de la centrifuga y fueron apartados como desechos
biológicos.
Se determinó la presencia de etanol para cada una de las muestras mediante una
prueba colorimétrica que consistió en poner a baño maría durante 10 minutos en un
tubo de ensayo 1:1 (mililitros) vino: solución sulfocrómica; etanol absoluto: solución
sulfocrómica y agua: solución sulfocrómica como testigo o muestra control para
evidenciar la presencia de etanol en el vino artesanal.
Para determinar la concentración de alcohol se utilizó una probeta de vidrio de
250ml lavada y desinfectada la cual se llenó del mosto obtenido de cada una de las
uvas sin fermentar (gravedad original) y después de la fermentación (gravedad final)
con ayuda de un densímetro el cual fue introducido en la probeta, se registraron
ambos resultados antes y después de la fermentación masa volúmica g/mL para
después ser convertidos en porcentaje de etanol producido mediante la siguiente
formula:
[8]
GO – GF= _____________x 131.25= ______________%.
(Gravedad original) – (Gravedad final) x (constante de alcohol/ volumen) = (Porcentaje de alcohol)
Resultados
Con la finalidad de mostrar que los aprendizajes adquiridos en el aula son útiles en
la vida cotidiana, el estudiante elaboró vino artesanal en conjunto con la adquisición
de conocimientos conceptuales, procedimentales y actitudinales sobre el tema
respiración celular como proceso metabólico productor de energía, utilizando
levaduras y diferentes tipos de uva para adentrarse al mundo de la biotecnología
(figura 3).
Figura 3. Alumnos mostrando la elaboración del vino artesanal.
Una vez obtenido el vino artesanal, éste fue utilizado para evidenciar la producción
de etanol a partir de los azucares de las uvas en presencia de Saccharomyces
cerevisiae mediante la fermentación con una prueba colorimétrica cualitativa. Se
pueden observar de izquierda a derecha tres tubos de ensayo (figura 4): en el
[9]
primero se muestra la solución sulfocrómica con agua (control negativo) de color
marrón, en el segundo tubo se aprecia el vino artesanal con la solución sulfocrómica
de color verde (grupo experimental) y finalmente en el tercer tubo se presenta el
etanol absoluto mezclado con la solución sulfocrómica de color azul (control
positivo) todos en la misma proporción 1:1 a baño maría durante 10 minutos.
Figura 4. Prueba colorimétrica cualitativa para evidenciar la producción de etanol. De izquierda a derecha agua, vino artesanal y etanol absoluto con solución sulfocrómica en proporción 1:1.
Para dar testimonio de la producción de CO2 mediante la fermentación de
Saccharomyces cerevisiae al metabolizar los azúcares naturales de la uva se
observó la botella casi a reventar en todas las muestras y en cada una de las
agitaciones durante las dos semanas siguientes después de juntar el inóculo y el
preinóculo en la misma botella y al girar la taparrosca se podía escuchar la salida
del gas y el olor a uva madura característico de los vinos.
Para cuantificar la producción de etanol en el vino se utilizó el densímetro en el
mosto de cada una de las muestras, antes de la fermentación se obtuvo una
gravedad original de 1.01 en todos estos, una vez transcurridos los 14 días de la
fermentación se observaron gravedades finales muy similares en cada uno de los
[10]
mostos de las diferentes uvas morada, verde, roja, blanca y orgánica (0.992, 0.993,
0.993, 0.994,0.992; respectivamente (figura 5).
Figura 5. Gravedad original y final del mosto de las distintas uvas antes y después de 14 días de
fermentación en presencia de la levadura Saccharomyces cerevisiae.
Finalmente se muestra en la figura 6 una grafica comparativa de la producción de
etanol a partir de los azucares metabolizados por Saccharomyces cerevisiae de las
uvas seleccionadas a través de la fermentación alcohólica, aplicando la formula
antes mencionada y utilizando las gravedades originales y finales para obtener el
porcentaje de etanol en los diferentes vinos artesanales elaborados (figura 6).
[11]
Figura 6. Porcentajes de etanol producidos por la levadura Saccharomyces cerevisiae al fermentar los azucares de las distintas uvas durante 14 días.
Análisis e interpretación de resultados
A través del uso de la biotecnología se pueden utilizar microorganismos para
producir bienes y servicios, de la gran inmensidad de estos se encuentran las
bebidas alcohólicas, estas pueden ser divididas en dos categorías: bebidas
fermentadas (vino, cerveza) y bebidas destiladas (whisky, ron, brandy, etc.). Las
bebidas fermentadas se elaboran utilizando un microorganismo (levadura) que
transforme el azúcar del jugo de la fruta en alcohol a través del proceso de
fermentación, con este proceso solo se obtienen bebidas con un contenido máximo
de alcohol equivalente a 14 grados que es la tolerancia máxima de la levadura
(Freile, 2011).
Con la ayuda del proceso de fermentación alcohólica se puede obtener además del
vino, una diversidad de productos a partir de sustratos no frutales, tales como la
cerveza africana, hecha a base de sorgo; la cerveza tradicional, elaborada a partir
de cebada; el pulque, producido con el jugo extraído del agave; el arroz, con el cual
se fabrica el “Sake” japonés (Freile, 2011).
[12]
Se nombra “vino” exclusivamente al liquido obtenido de la fermentación alcohólica
total o parcial del zumo de uvas, sin adición de sustancia alguna. Por otro lado,
cuando se emplea otro tipo de fruta, el producto siempre se denomina vino, pero
seguido del nombre de la fruta, por ejemplo: vino de naranja, vino de manzana, etc.,
(Ferreyra et al., 2009)
En este sentido, la producción de vino artesanal a partir de los distintos tipos de uva
y los contenidos del tema respiración celular (glucolisis y fermentación) apoyaron la
herramienta propuesta en este trabajo debido a que se observó el entusiasmo de
los estudiantes, al demostrar que les agrada que la clase sea distinta, las
actividades de este tema tan complejo incida en algo que forme parte de su realidad,
esto permitió que el estudiante se viera motivado a aprender al cambiar sus
estrategias de aprendizaje y cuestionar el contenido que observa. Sumado a esto,
el docente promovió un ambiente de confianza para que el alumno interactuara con
el objeto de conocimiento.
Tan importantes son los logros de los contenidos conceptuales como los
procedimentales y actitudinales que nuestra propuesta promovió destrezas
técnicas, manipulación de material respetando las normas de uso, la realización de
la actividad utilizando instrucciones, identificación y partes de cada una de las
etapas, descripción de gráficos y reacciones, todos ellos elementos que de acuerdo
con de Pro (2013) ayudan a crecer intelectualmente al estudiante, desarrollar sus
potencialidades, capacidades personales y colectivas que forman parte de una
enseñanza en las ciencias integral.
Esto produjo emotividad y generó sentimientos favorables hacia el aprendizaje,
estimulando la atención, receptividad del aprendiz, trabajo colaborativo y el sentido
de pertenencia a un grupo donde el compromiso de los estudiantes incrementó y el
ambiente de aprendizaje mejoró al fomentar el dialogo entre los alumnos, la
discusión de los distintos puntos de vista y la convivencia con los demás (figura 3).
Continuando con nuestros objetivos para poder observar cómo la fermentación de
Saccharomyces cerevisiae metaboliza los azúcares naturales de la uva hasta
producir etanol y CO2, se utilizó la prueba colorimétrica cualitativa con la solución
[13]
sulfocrómica (Hernández, s/f) ya que es conocido que esta solución cambia de color
cuando se reduce (gana electrones), estas reacciones de oxido-reducción ocurren
también en los alcoholes ya que se oxidan (perdida de electrones) al estar en
contacto con agentes oxidantes fuertes como lo es la solución sulfocrómica. En
virtud de ello, pudimos observar el cambio de coloración a simple vista (figura 4) ya
que, al mezclarse el etanol producido en el vino artesanal, la oxidación del etanol
en el medio ácido implica la pérdida de uno o más hidrógenos que tiene el grupo
OH y dependiendo del tipo de alcohol si es primario, secundario o terciario será el
producto obtenido. En este caso, es un alcohol primario (etanol) que solo posee dos
hidrógenos y puede perder uno para generar un aldehído. Al poner los tubos a baño
maría a 100°C, esto aseguró que el etanol generado reaccionara con la solución
sulfocrómica ocasionando un cambio de coloración virando del naranja-rojizo, al
amarillo-verdoso y finalmente al azul esto debido a la concentración de alcohol del
menos concentrado o nulo hasta el más concentrado (figura 4).
En lo que respecta a la producción de CO2, este gas fue fácil de apreciar ya que se
observaron las botellas muy infladas debido al burbujeo y liberación del gas que en
los primeros días fue pequeña, aumentó de manera dramática en la fase tumultuosa
con el trascurrir de los días y finalmente decayó al filo de los 13 y 14 días de
fermentación, realizadas con el mosto de cada una de las diferentes uvas en
presencia de las levaduras Saccharomyces cerevisiae, también al girar la
taparrosca se podía escuchar la salida del gas y el olor a uva madura característico
de los vinos, hasta que el sonido de la liberación del gas fue casi imperceptible,
debido a la degradación y transformación de los azucares en productos de excreción
celular como etanol y en este caso en particular CO2.
Para cuantificar la producción de etanol en el vino artesanal existen diversos
métodos, uno de ellos es comparar la densidad del líquido antes y después de
fermentar, es decir obtener la gravedad específica introduciendo el densímetro en
la probeta que contiene el líquido y una vez inmóvil efectuar la lectura de la masa
volúmica por la parte superior del menisco, que es una comparación de la densidad
de un líquido con respecto al agua pura (García y Xirau, 2006). La densidad del
agua pura es 1, dado que 1 kilogramo de agua tiene un volumen de 1 litro. De esta
[14]
manera, un líquido azucarado (como el mosto) tendrá una densidad siempre mayor
a 1.
Tomando en consideración lo anterior, se observó que en todos los casos del vino
artesanal la densidad del mosto de las distintas uvas antes de la fermentación
(gravedad original) fue de 1.01, una vez transcurridos los catorce días de
fermentación la segunda lectura tomada (gravedad final) arrojó distintos resultados:
0.992 uva morada, 0.993 para la uva verde, para la uva roja se obtuvo 0.993, para
la blanca 0.994 y finalmente para la uva orgánica se 0.992 masa volúmica
respectivamente, esta densidad indica la evolución de la fermentación alcohólica
para saber si el vino contiene o no azúcares residuales. La fermentación se
considera completa cuando la densidad en los vinos tintos se sitúa alrededor de
0,992 a 0,994 g/l y los vinos blancos 0,990 a 0,992 g/l (Pszczólkowski y Ceppi,
2001), como en los presentes resultados (figura 5).
La variación en ambas lecturas tiene dos razones, la primera de ellas es porque
Saccharomyces cerevisiae ha consumido los azucares que se encuentran en el
mosto y la segunda es porque ya se encuentra un volumen de alcohol en el líquido,
por ello la segunda lectura es menor, recordemos que el alcohol es menos denso
que el agua 0.79Kg/L.
Por último, una vez aplicada la formula mencionada en el desarrollo y utilizando
ambas gravedades, se puede observar en la gráfica de la figura 6, que los
porcentajes de etanol generados al fermentar los glúcidos del mosto en los distintos
vinos artesanales son muy similares y no existió diferencia estadísticamente
significativa entre el etanol obtenido esto debido a que, de acuerdo con García y
Xirau, (2006) las distintas uvas contienen de un 15 a un 25% de glucosa y fructosa.
No olvidemos que la glucosa(C6H12O6) o dextrosa, es el azúcar principal de la uva
que es convertida en alcohol por la levadura, estas reacciones llevadas a cabo a
nivel micro-celular por la levadura convierten cada molécula de glucosa en dos
moléculas de alcohol etílico (CH3CH2OH) y dos moléculas de dióxido de carbono
(CO2), debido a que las levaduras fermentan preferentemente la glucosa no
importando si la uva es morada, verde, roja, blanca u orgánica.
[15]
Si bien es cierto que los vinos artesanales elaborados, en promedio produjeron un
porcentaje de 2.25% de alcohol volumen, en comparación con los vinos comerciales
que producen entre 10 y 14% se deben tomar en cuenta diversos factores que
pudieron afectar la producción de etanol: a) se utilizaron uvas comerciales que no
están particularmente destinadas a hacer vino como sí lo son: Vitis vinífera o Vitis
labrusca (Miño et al., 2015); b) no se agregó al mosto, azúcar (sacarosa) la
denominada “chaptalización” una práctica muy controvertida que es utilizada para
conseguir el grado alcohólico deseado cuando la cantidad de azúcar en la fruta no
es suficiente, una práctica permitida en los vinos de algunos países como Francia,
Alemania o Brasil y prohibida en otros como Argentina o Chile (Muñoz, 2008); c) se
utilizó una botella plástica para llevar a cabo la fermentación, mientras que en los
vinos comerciales se utilizan barricas o toneles de roble francés o americano que
filtran a través de sus poros una microoxigenación controlada sobre los taninos del
vino y aportan sabores y aromas que lo enriquecen, así como la alteración del color
(Boudet, 2013) y d) el tiempo de fermentación que fue de catorce días en
comparación con los vinos comerciales que deben permanecer entre seis y
veinticuatro meses de reposo en la barrica en sitios cercanos al mar (Boudet, 2013).
A pesar de las limitantes mencionadas el vino obtenido tenia un sabor agradable al
paladar, un delicioso aroma y lo más importante puntualizar que la aplicación de los
conocimientos adquiridos en el aula en temas tan complejos como respiración
celular son de utilidad en esta estrecha relación que guarda la ciencia, tecnología y
sociedad.
La enseñanza de la biotecnología en la preparación de vino artesanal es un tema
multidisciplinario que exige no solo comprender procesos metabólicos aerobios o
anaerobios, conocimientos en tópicos relacionados con crecimiento de poblaciones
microbianas, factores limitantes, fermentación láctica, acética, alcohólica, oxido-
reducción, viraje, volumetría, ecología, entre otros, sino que además demanda
conocimientos químicos, biológicos y una buena dosis de ingenio para llevar a cabo
actividades prácticas y útiles con materiales simples y de bajo costo.
[16]
Conclusiones
La aplicación de los conocimientos biológicos y químicos adquiridos con el tema
respiración celular a partir de la enseñanza de la biotecnología con
microorganismos, fue de utilidad para el alumno ya que obtuvo vino artesanal que
presentó un sabor agradable al paladar y un delicioso aroma, evidenciando que lo
aprendido en el aula es útil en la vida cotidiana.
Se observó de manera clara como Saccharomyces cerevisiae fue capaz de
metabolizar los glúcidos a través de la fermentación, ya que la prueba colorimétrica
da evidencia contundente de la presencia de etanol al virar la muestra control de
color marrón al verde en el grupo experimental (vino artesanal).
La producción de CO2 fue fácil de apreciar debido al burbujeo, liberación del gas
que hincho la botella, así como al girar la taparrosca se podía escuchar el escape
de gas y olor a uva madura característico de los vinos.
Los porcentajes de etanol generados al fermentar los glúcidos del mosto en los
distintos vinos artesanales fueron muy similares y no existió diferencia
estadísticamente significativa entre los diferentes tipos de uva.
Vale la pena resaltar que la enseñanza de la biotecnología en la preparación de vino
artesanal es un tema multidisciplinario que demanda no solo conocimientos
biológicos y químicos, también es necesario contar con ingenio para llevar a cabo
actividades prácticas y útiles con materiales accesibles y de bajo costo para
comprender temas considerados complejos.
[17]
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