8/15/2019 4. Medios de Cultivo
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Nutrición y Medios de cultivo
AGM -MGSeptiembre de 2014.
MEDIOS DE CULTIVO
OBJETIVOS
Uso adecuado de la terminología.Relacionar los conceptos químicos con la microbiología.Estudiar las diferentes clasificaciones de los medios decultivo.Relacionar la composición química de los medios decultivo con el tipo nutricional de los microorganismos.Hacer los cálculos químicos correspondientes para laformulación de los medios de cultivo.Describir los cuidados en la preparación de los medios.Determinar los puntos del Control de Calidad.Aplicar los conocimientos adquiridos.
MEDIOS DE CULTIVO
Se pueden emplear parael análisis de:
AlimentosMuestras clínicasProductos farmacéuticosZonas arqueológicasMuestras ambientales(aire, suelo, agua), etc.
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BACTERIAS LEVADURAS MOHOS
ALGASPROTOZOOS
MEDIOS DE CULTIVO
Hay para elcrecimientode losdiversosgruposmicrobianosy seempleanparaestudiarlosen ellaboratorio.
DEFINICIÓN
Los medios de cultivo sonuna mezcla equilibradade nutrientes(compuestos orgánicos /inorgánicas) quepermiten el desarrollo delos microorganismos “ in
vitro ”.
DEFINICIÓN
En concentracionesadecuadas y encondiciones físicasóptimas permiten unbuen crecimiento delos microorganismosCULTIVABLES.
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SUSTANCIAS EMPLEADAS EN LA ELABORACIÓN DE MEDIOS
ELEMENTO COMPUESTO FORMA UTILIZADA EN MEDIOS DECULTIVOCarbono (C) CO 2, compuestos orgánicos Almidón, Glucosa, malato, acetato,
piruvato, peptonas,
Hidrógeno (H) H2O, compuestos orgánicos H 2O, compuestos orgánicosOxígeno (O) H 2O, O2, compuestos
orgánicosH2O, O2, compuestos orgánicos
Nitrógeno (N)NH3, NO3-, NO2-, compuestosorgánicos nitrogenados
N2Inorgánicos: NH4Cl, (NH4)2SO4, KNO3,Orgánicos: aminoácidos basesnitrogenadas, etc.
Fósforo (P) PO43- KH2PO4, Na2HPO4Azufre (S) H2S, S2-, SO42- compuestos
orgánicos azufradosNa 2SO4, Na2S2O3, Na 2S,Compuestos orgánicos azufrados:aa
Potasio (K) K+ KCl, KH2PO4Magnesio (Mg) Mg 2+ MgCl2, MgSO4Sodio (Na) Na + NaClCalcio (Ca) Ca 2+ CaCl 2Hierro (Fe) Fe2+ o Fe3+, o FeS FeCl3, FeSO4
FUNCIÓN DE LOS COMPONENTES DELOS MEDIOS DE CULTIVO
Component Amount Function of componentBeef extract 1.5 g Source of vitamins and other
growth factorsYeast extract 3.0 g Source of vitamins and other
growth factorsPeptone 6.0 Source of amino acids, N, S,
and PGlucose 1.0 g C and energy sourceAgar 15.0 g inert solidifying agentWater 1000mlpH 6.6
MEDIOS DE CULTIVO
Generalmente se presenta en forma depolvo seco, fino o granular.
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MEDIOS DE CULTIVO
Puede presentarse también pre-hidratados o listospara usarse.
CLASIFICACIÓN
Medio sintético oquímicamentedefinido: Lacomposiciónquímica seconoce, tantocualitativamentecomocuantitativamente.
Ej. gNaNO3 1.5K2HPO4 3H2O 0.04CaCl2 2H2O 0.075 Acido cítrico 0.006Na2CO3 0.02 Agua destilada 1000 mL
pH final 7.4
Ej: Agar nutritivoPeptona de carne 5 g
Extracto de carne 3 gAgua destilada 1000 mL
pH 7.4 ± 0.2
CLASIFICACIÓN
Mmmmmmmmmmmmmmmmmmm
Medio natural, complejo
o químicamenteindefinido: Se preparacon componentescomplejos, cuyacomposición nutritivaexacta no se conoce yno se puede controlar.Ej. Medios con Peptonas
¿C, N, P, S, ….?
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SUSTANCIAS EMPLEADOS EN LA FORMULACIÓN DELOS MEDIOS DE CULTIVO
Peptonas:Productos de la
digestión (con ácidos ocon enzimas) dematerial proteico(carne, caseína,gelatina, etc.). Deacuerdo a la proteína yal método de digestiónusado, se obtienendiferentes tipos depeptonas. Ej. Peptonade caseína.
SUSTANCIAS EMPLEADAS EN LA FORMULACIÓN DELOS MEDIOS DE CULTIVO
Extracto de carne:• Digerido acuoso de carne magra de res.• Disponible en pasta o polvo.• Contiene carbohidratos, compuestos denitrógeno orgánico, vitaminas y sales minerales.
SUSTANCIAS EMPLEADOS EN LA FORMULACIÓN DELOS MEDIOS DE CULTIVO
Extracto de levadura:Extracto acuoso de células delevadura. Comercialmentedisponible en polvo. Una fuentemuy rica en vitaminas delcomplejo B; también contienenitrógeno orgánico, vitaminas ycompuestos de carbono.
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SUSTANCIAS EMPLEADOS EN LA FORMULACIÓN DELOS MEDIOS DE CULTIVO
Elagar es originario de Japón, aunque el nombrecorresponde a una palabra malaya que significa
"alga marina".Japón es el primer productor mundial de agar.
SUSTANCIAS EMPLEADOS EN LA FORMULACIÓN DELOS MEDIOS DE CULTIVO
El agar es una mezcla de carbohidratos complejos, que seobtiene a partir de diversas especies de algas rojas de losgéneros: Gelidium y Gracilaria . Estas algas se suelen recolectar enla playa, durante la marea baja, aunque las de mejor calidad sonlas que se obtienen a mayor profundidad.
Químicamentees un polímerosulfatadocompuesto porD-galactosa,3,6-anhidro-L-galactosa yácido D-glucorónico.
AGAR
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AGARCaracterísticas:
No aporta ningún nutriente.
Es el agente gelificante más empleado enlos laboratorios de microbiología.La mayoría de los microorganismos no lo
degrada.No tiene sabor ni aroma y carece de color.Es un hidrocoloide completamente soluble
en agua a 100 ° C.Al contacto con agua fría se hincha y
puede aumentar hasta 20 veces suvolumen.Es un gel termoreversible.Sólidifica entre 35 ° C y 43° C y se funde entre
85° C y 95° C.
Clasificación
ESTADO FÍSICOLíquidos
Semisólidos(agar 0.2 a 0.7 %)
Sólidos(agar 1.5 a 2.0%)
MEDIOS DE CULTIVO LÍQUIDOS
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MEDIOS DE CULTIVO LÍQUIDOS
También conocidos como caldos.Por lo general todos sus
componentes son solubles en agua.Son útiles en:a) la propagación de
microorganismos,b) activación yc) evaluación de ciertas
actividades metabólicas.
Desventaja• No se ven los contaminantes.
MEDIOS DE CULTIVO SEMISÓLIDOS
• Contienen alrededor de0.2 a 0.8 % de agar. Seemplean para observar lamovilidad de algunosmicroorganismos, asícomo la determinacióndel tipo de metabolismo.Ej.SIM, O/F
MEDIOS DE CULTIVO SEMISÓLIDOS
Algunos de ellos seemplean como medio detransporte.Sirven para llevar losespecímenes quecontienen a losmicroorganismos,del sitio de la toma delproducto hasta ellaboratorio donde va aefectuarse el estudio.
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MEDIOS DE CULTIVO SEMISÓLIDOS
Estos medios impiden que se altere la
proporción original de la flora microbiana enlos especímenesEj. Stuart
MEDIOS DE CULTIVO SÓLIDOS
Contienen entre 1.5 y 2.0 %de agar, la concentraciónesta en función de sugrado de pureza.Esta cantidad permite queel medio tenga unaconsistencia dura.Estos medios están en:
• cajas Petri o en• tubos (medio inclinado).
CULTIVO EN AGAR INCLINADO(PICO DE FLAUTA)
•Se emplea para conservar microorganismos .
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MEDIOS DE CULTIVO SÓLIDOS
Los medios sólidos en caja se emplean para:a) obtener crecimiento en la superficie del medio
(colonias).
MEDIOS DE CULTIVO SÓLIDOS
Los medios sólidos en caja se emplean para:a) obtener crecimiento en la superficie del medio(colonias).
MEDIOS DE CULTIVO SÓLIDOS
Se emplean para:b) cuantificar microorganismos.
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MEDIOS DE CULTIVO SÓLIDOS
Se emplean para hacer :c) pruebas de sensibilidad a antibióticos,
MEDIOS DE CULTIVO SÓLIDOS
Se emplean para hacer:d) muestreo de superficies, entre otros.
MEDIOS DE CULTIVO SÓLIDOS
Para que los resultados sean satisfactorios, ladureza del gel debe estar entre 300 y 500dinas/cm 2
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Clasificación de los medios
Por su uso:MínimosGeneralesSelectivosDiferencialesDe enriquecimientoEnriquecidosDe transportePerfil bioquímicoDe conservación
Medios mínimos
Contienen los nutrientes mínimo necesariospara la multiplicación microbiana.Se usan para determinar necesidadesnutricionales específicas.Ej. MM (base: NH4Cl, MgSO4, K2HPO4, agua),variar la fuente de carbono.
Son aquellos que permiten el desarrollo delos microorganismos más comunes.Ej. Agar nutritivo.
Medios generales
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Medios de cultivo selectivosSólo permiten el crecimiento de los microorganismosde interés e inhiben el desarrollo de los que no son deinterés para el estudio.
Ejemplos de inhibidores: Sales biliares, colorantes(cristal violeta), alta concentración de NaCl,antibióticos, pH* y temperatura*
Ej. Manitol sal agar Caldo bilisverdebrillante Agar Saboraud *
Buscar en: www.dibico.com[NaCl], 75 g/L
Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones
Bilis de buey deshidrat ada 20. 0 Suspender 40 g del polvo deshidratadopor litro de agua destilada. Disolver ydistribuir 10 ml por tubo con campanita deDurham. Preparar además, el medio adoble concentración.Esterilizar en autoclave a 121°C durante15 minutos.
Lactosa 10.0Peptona 10.0
Verde brillante 0.0133
pH final: 7.2 ± 0.2
Ej.
Caldo Bilis Verde Brillante 2% .Este medio está recomendado para el recuento de coliformes totales y fecales,por la técnica del número más probable.
FundamentoEn el medio de cultiv o, la peptona aporta los nutrientes necesarios para eladecuado desarrollo bacteriano, la bilis y el verde brillante son los agentesselectivos que inhiben el desarrollo de bacterias Gram positivas y Gram negativasa excepción de coliformes, y l a lactosa es el hidrato de carbono fermentable.Es una propiedad del grupo col iforme, la fermentación de la lactosa conproducción de ácido y gas.
Medios de cultivo diferencialesLa composición de estos sustra tos permite distingui r la
fisiologíaparticular de los microorganismos .La detección esta basada en características de desarrollomicrobiano, aparienc ia en el medio o por la adición dereveladores.
Ej.Agar LD Caseina (+)Agar EMB Agar almidón
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Medio de cultivo selectivo y diferencial
Hay medios de cultivo que pueden ser selectivos ydiferenciales a la vez.
Ej.
Manitol ( + )
37° C
24 h
Manitol (-)
G(+)
rojo defenol
MSA
Medio de cultivo selectivo y diferencial
Hay medios de cultivo que pueden ser selectivos ydiferenciales a la vez.Ej. Agar EMB
Lac ( + )
Lac ( - )
G(-)
Medio selectivo y diferencial
Lac ( + ) Lac ( - )G(-)
Agar Mac Conkey
http://images.google.com.mx/imgres?imgurl=http://212.128.140.24/web/fundacion/universitas/es/sistemas/microacua/Demo1/fotos/placasMaC/Mac1_g.jpg&imgrefurl=http://212.128.140.24/web/fundacion/universitas/es/sistemas/microacua/Demo1/shigella.html&h=436&w=450&sz=50&hl=es&start=14&tbnid=8ADrhe6wIjPUBM:&tbnh=123&tbnw=127&prev=/images%3Fq%3DAgar%2BMac%2BConkey%2B%26gbv%3D2%26svnum%3D10%26hl%3Des%26sa%3DGhttp://images.google.com.mx/imgres?imgurl=http://212.128.140.24/web/fundacion/universitas/es/sistemas/microacua/Demo1/fotos/placasMaC/Mac1_g.jpg&imgrefurl=http://212.128.140.24/web/fundacion/universitas/es/sistemas/microacua/Demo1/shigella.html&h=436&w=450&sz=50&hl=es&start=14&tbnid=8ADrhe6wIjPUBM:&tbnh=123&tbnw=127&prev=/images%3Fq%3DAgar%2BMac%2BConkey%2B%26gbv%3D2%26svnum%3D10%26hl%3Des%26sa%3DGhttp://212.128.140.24/web/fundacion/universitas/es/sistemas/microacua/Demo1/fotos/placasMaC/Mac2_g.jpghttp://images.google.com.mx/imgres?imgurl=http://212.128.140.24/web/fundacion/universitas/es/sistemas/microacua/Demo1/fotos/placasMaC/Mac1_g.jpg&imgrefurl=http://212.128.140.24/web/fundacion/universitas/es/sistemas/microacua/Demo1/shigella.html&h=436&w=450&sz=50&hl=es&start=14&tbnid=8ADrhe6wIjPUBM:&tbnh=123&tbnw=127&prev=/images%3Fq%3DAgar%2BMac%2BConkey%2B%26gbv%3D2%26svnum%3D10%26hl%3Des%26sa%3DG
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Medios de enriquecimientoTienen sustancias que permiten la recuperación demicroorganismos de diversas muestras, favorecen el desarrollo deun tipo microbiano y disminuyen la velocidad de crecimiento dela flora acompañante.
Estos medios son útiles cuando los microorganismos estánsometidos a condiciones de estrés (congelamiento, refrigeracióndesecación, tratamiento químico o físico)
Caldo SelenitoRecuperación de Salmonellaa partir de alimentos.
Ej
Medios de enriquecimiento
Agua alcalina para recuperara V. cholerae de mariscos
Ej
pH=9
Medios enriquecidosSe utilizan para microorganismos que tienengrandes exigencias nutricionales (fastidiosos).Tienen un exceso de nutrientes y/o se le adicionaun extra de suplementos (sangre [NAD y hemina],huevo, vitaminas, entre otros.)Ej.
Sangre de carnero yema de huevo
Agar Baird ParkerAgar sangre
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Medio enriquecido y diferencial
Enriquecido: sangreDiferencial: hemólisis (alfa, beta y/o gamma)
Agar sangre
Medios de transporte
Son sustratos que se emplean para trasladar las muestras sinalterar la viabilidad y la proporción de microorganismos. Tienenconsistencia semisólida, con amortiguador de pH y estánreducidos en nutrientes para preservar la viabilidad de losmicroorganismos por varias horas.
Para pruebas bioquímicas
Son medios de cultivo con sustratos específicos para poner enevidencia la actividad enzimática o v ía metabólica de unmicroorganismo puro. Para visualizar su perfil bioquímico sesuele emplear reveladores y/o indicadores .
H2S citritasa
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Nutrición y Medios de cultivo
Para pruebas bioquímicas
Utilizados en la identificación del fenotipobioquímico del microorganismo.
Medios de conservación
Algunos medios de cultivo son empleados para la conservacióntemporal de microorganismos, como son:
• Medio de agar inclinado a 4ºC (hasta 2 semanas), con sello deglicerol estéril a 4ºC (varios meses dependiendo delmicroorganismo).
Medios de conservación
Se usan viales con microorganismos y sealmacenan a temperaturas inferiores a cero gradoscentígrados.La leche descremada se emplea en la liofilización,conserva a los microorganismos por mas de diezaños.
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Nutrición y Medios de cultivo
¡¡Necesitamos un descanso!!
• El medio está en función delmicroorganismo (s) en estudio y de lacomposición química de la célula, que esreflejo de los nutrientes que necesita.
• Ver el procedimiento.• Revisar si es un medio para hidratar o para
preparar por componentes.
FACTORES QUE INTERVIENENEN LA PREPARACIÓN
Usar material de vidrio limpio y seco.• Emplear agua destilada.• Ajustar el pH.• Contar con equipo adecuado.• Distribuir el medio en recipientes adecuados• CONTROL DE CALIDAD
FACTORES QUE INTERVIENENEN LA PREPARACIÓN
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PREPARACIÓN EN DIFERENTES AMBIENTES
DURANTE LA PREPARACIÓN ISeleccionar materias primas: medios de cultivodeshidratados, pureza de reactivos ysuplementos.Registrar todos los detalles de la preparación(peso, volumen, fecha, operador, etc.)Utilizar agua destilada de calidad apropiada.Verificar la calidad del agua empleada (cargabacteriana, presencia de inhibidores, etc.)Seleccionar material adecuado: matraces,tubos, cajas.Usar matraces de por lo menos 2 veces másdel volumen del medio a preparar
DURANTE LA PREPARACIÓN II
Leer las instrucciones del marbete.Pesar exactamente la cantidad solicitada.Uso de probetas adecuadas.Hidratar antes de disolver.Ajustar y registrar el pH (utilizar instrumentaladecuado y calibrado)Disolver completamente el medio, aplicarcalor si contiene agar.Agitar el medio mientras se disuelve.Tener cuidado de no sobrecalentar elmedio.Esterilizar***
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CONTROL DE MATERIAS PRIMAS
El agua es la materia prima másimportante.
Parámetros que deben controlarse:Iones Cu 2+Conductividad= 15 mSpH= ligeramente ácida (no menora 5.5)Cajas petri (
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SUSTANCIAS ADICIONALESAlgunos medios deben tener, además de losmacroelementos, microelementos y agua; lassiguientes sustancias, algunas de el las se adicionandespués de esterilizar.
Ejms.• Agentes selectivos: cloruro de sodio en altasconcentraciones.• Factores de crecimiento: aa, vitaminas.• Ácidos orgánicos : ácido tartarico.• Colorantes: eosina, rojo neutro.• Inhibidores: Antibióticos.• Indicadores de pH: azul de bromotimol.• Agentes reductores : tioglicolato• Indicadores de oxido-reducción: resarzurina.• Agentes solidificantes: Agar, sangre, huevo y/o
gelatina.
[NaCl]
MICROSISTEMAS
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Sistema Petrifilm™
Son medios de cultivo deshidratados sobre películas plásticas de tamaño ygrosor similar al de una tarjeta de crédito. El medio deshidratado contieneun componente que permite la gelificación en frio y colorantes para latincion de las colonias desarrolladas,facilitando su identificación y recuento.
La principal ventaja del metodo Petrifilm consiste en que no requiere lapreparación previa de los medios de cultivo, lo que reduce costos ytiempo de preparación.
http://www.3m.com/cms/mx/es/0-253/kRecrFS/view.html
Medios cromogénicos y fluorogénicos
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Nutrición y Medios de cultivo
Medios cromogénicos y fluorogénicos
Mezcla de nutrientes (carbohidratos, peptonas,extracto de levadura, etc) y sustratoscromogénicos y/o fluorogénicos que permiten ladetección rápida de microorganismos (24 a 48 h).Los sustratos cromogénicos son derivados del fenol(ONP) o del indol (5-bromo-4 cloro-3-indoxilo).
OH
N+
O-
O
NH
Br
ClOH
Los sustratos fluorogénicos son derivadosde la cumarina (4-metilumbeliferona)
O
CH 3
OOH
Medios de cultivo cromogénicos yfluorogénicos
Los sustratos cromogénicos o fluorogénicos estan unidos
a un azúcar o aminoácido específico.Cuando son hidrolizados por enzimas presentes en lasbacterias, se genera un color o fluorescencia.
O
O
OH
OH
OH
OH
N+
O-
O
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Nutrición y Medios de cultivo
Medios de cultivo cromogénicosy fluorogénicos
Aplicaciones
Áreas: Clínica, Alimentos, Farmacia,Ecología, etc.
Cuantificación o búsqueda debacterias, hongos y levaduras.
Búsqueda de algunos microorganismospatógenos.
Medios de cultivo cromogénicos yfluorogénicos
VentajasSensibles (1 célula).Específicos.Rápidos.No se requierenpruebas bioquímicasadicionalesUtilizan poco materialDetectan variosmicroorganismos enuna sola placa.
DesventajasCostoSolubilidad delcompuestofluorescente
Medios de cultivo cromogénicos yfluorogénicos
Ventajas
Desventajas
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Nutrición y Medios de cultivo
ESTUDIODE LOS
MICROORGANISMOS
Identificación Distribuidos en lanaturaleza
Reproducción Relaciones conotros seres
FisiologíaEfectos
benéficos y/operjudiciales
MetabolismoAlteraciones físicas
y químicas queprovocan en su
medio
MEDIO DE CULTIVO
BIBLIOGRAFÍA
**CONTROL DE CALIDADNORMATIVIDAD:NOM-065-SSA1-1993 AGM/ agosto /2014.
Ejercicio
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LactosaPeptona de gelatinaPeptona especialCristal violetasales biliaresrojo neutroNaClaguaagar
Ejercicio