ANÁLISIS DE LEGIONELLA, CUANTIFICACIÓN DE VIABLES POR BIOLOGÍA MOLECULAR (v‐qPCR):
UNA REALIDAD
Marta Brull FontserèAlbert Manero Camps
Mina Pública d’Aigües de Terrassa, SA
1842 constitución de la empresa 1998 Certificación UNE‐EN ISO 9002 (y posterior ISO 9001) 1999 Creación de la Fundación Mina 2000 Certificación UNE‐EN ISO 14.001 2001 Verificación Reglamento (CE) EMAS 761/2001 2002 Acreditación UNE‐EN ISO 17025 ENAC (Laboratorio) 2002‐2012 Ampliación Alcance Certificaciones 2012 Sello Europeo de Excelencia en la Gestión Empresarial
EFQM 400+ 2014 Renovación Sello EFQM 400+
HISTORIA
Anterior a 1950 primer Laboratorio de control 1976 ‐1985 Ampliación Técnicas Analíticas 1986 Establiment Tècnic Auxiliar de la Junta de Sanejament
(actual ACA) 1992‐1999 Técnicas Instrumentales 1996 Registro Laboratorios de Salud Ambiental y
Alimentaria – Registro Laboratorio DARP Generalitat de Catalunya
1998 Creación Unidad de Microbiología 2002 Acreditación por ENAC 2004 Técnicas de Biología Molecular
CRONOLOGIA
Métodos
Marco legal
Real Decreto 865/2003
ISO 11731 Parte 1
Decret 352/2004
Artículo 28: métodos oficialmente aprobados o
recomendados internacionalmente
Guías Ministerio
ISO 11731 Parte 1
Limitaciones
ISO 11731
Sin tratamiento Tratamiento ácido Tratamiento térmico
NO DETERMINABLE
“La abundante presencia de flora interferente no permite realizar la detección i cuantificación de Legionella”
Limitaciones
ISO 11731
Sin tratamiento Tratamiento ácido Tratamiento térmico
NO CONCLUYENTE
“La abundante presencia de flora interferente puede haber enmascarado la posible presencia de colonias de Legionella, pudiendo tratarse de un resultado falso negativo”
Recuperación baja
ISO 11731
NT 32 ENAC
PRECISIÓN
EXACTITUD RECUPERACIÓN
E. coli, coliformes, C. perfringens…
65‐85%
Legionella ISO 11731
20‐30%
Normalización qPCR
NF T 90‐471: Détection et quantification des Legionella et/ou L. pneumophila par concentration et amplification génique par PCR‐RT.
ISO/TS 12869: Water quality ‐ Detection and quantification of Legionella spp. and/or L. pneumophila by concentration and genic amplification by quantitativepolymerase chain reaction (qPCR).
Concentración PMA. Temperatura y tiempo de contacto. Características de la Fotoactivación. Tamaño del amplicón. Uso de tampones.
Factores eficiencia PMA
2,7 log 4,2 log
Pendiente qPCR i V‐qPCR: niveles de alerta recomendados para valorar el riesgo.
V‐qPCR
Pros:• Rapidez• Sensible• Específico• Diferencia viables=riesgo sanitario• …
Contras:• No se aísla la bacteria, no serotipado.• Precio reactivos PCR (no PMA).• Personal altamente cualificado.• Interferencias fotoactivación PMA• …
Cada método proporciona diferentes informaciones y en muchos escenarios no presentan una buena correlación.
Es importante conocer los pros y contras de cada método para hacer correcta interpretación de resultados (valorar riesgo sanitario real).
Cada método será más o menos adecuado según el objetivo, la matriz, etc...
Conclusiones
Muchas [email protected]@aiguesdeterrassa.com