Aplicaciones Biológicas de la Espectrometría de Masa
Matías Möller
2
MS/MS
Espectrometría en Tándem: Secuenciación de péptidos
Espectrometría de masa
3
MS/MS: Espectrometría en Tándem
Espectrometría de masa
Seleccionar uno de los iones de la muestra, fragmentarlo y estudiar la formación de iones “hijos”
mp+ md
+ + mn0
Aplicaciones:Identificación de moléculas
Secuenciación de péptidos “al vuelo”
Modificaciones posttraduccionales
4
MS/MS: Espectrometría en Tandem
Espectrometría de masa
ESI-QQ1Q2Q3: Triple Cuadrupolo. Q1 y Q3 separan iones moleculares,mientras Q2 sirve de cámara de colisión: Se introduce un gas para que los iones acelerados choquen y se fragmentenCID: Collision Induced Dissociation
Se usa mucho para realizar cuantificaciones por LC-MS-MS
MassAnalysis
peptides
protein
peptides
++
+
+
++++
IonizationDigestion
m/z
MS
Ionization Isolation Fragmentation MassAnalysis
protein
peptidefragments
Digestion
peptides
+++
+
++
++ ++
+++
+
+
++++ +
m/zm/z
MS MS/MS
m/z
Isolation
MS/MS
Select Parent Fragment Analyse Fragment
Masses
Analyse Parent Masses
MS
Tandem en el espacio
8
MS/MSSecuenciación peptídica
Espectro MS/MS:masa de los fragmentos
Mezcla de péptidos
MS/MS+
+
+
++
+
1 péptido seleccionado para MS/MS
Espectro MS
Carlos Cerveñansky
9
MS/MS: Espectrometría en Tandem
ESI-ITIT: Trampa de IonesLa trampa de iones puede analizar los iones de una muestra MS
También puede seleccionar uno, y concentrarlo en la trampa
Luego se introduce Helio para que los iones acelerados choquen y se fragmenten
Luego se analizan los iones hijo
CID: Collision Induced Dissociation
Las trampas de iones tienen capacidad de hacer MSn se seleccionan iones hijo se fragmentan, analizan, seleccionan uno fragmentan, analizan, seleccionan uno hasta que les de la sensibilidad
MS2
Fragment 426.7
Isolate Parent Ion
Intact ions
Intact ion
Daughters
This analysis/isolation/fragmentation can be carried out in an ion trap
Tandem en el tiempo
11
MS/MS: Espectrometría en Tandem
Espectrometría de masa
MALDI-TOFIones moleculares que se fragmentan durante el vuelo llegan juntos al “reflector” y pueden ser analizados por el mismo. PSD: Post Source Decay
ESQUEMA:
Instrumento de tecnología MALDI-TOF
Camera
Laser
plate
Pumping Pumping
Beam guide
Timed ion selector Reflector
Linear detector
Extractiongrids
Reflectordetector
H2N CH C
R1
O
HN CH C
R2
O
HN CH C
R3
OH
O
b1
y2
b2
y1
N-terminal
C-terminal
y ionsb ions
b1
b2
b3
b4
y4
y3
y2
y1
http://db.systemsbiology.net:8080/proteomicsToolkit/FragIonServlet.html
b1
b2
b3
y1
y2
y3
LF
K
G
G L
K
F
Rela
t ive I
nte
nsit
y
m/z
F L G K++
F L G K++
F L G K++
CID
F L G K++
F L G K++
F L G K++
b1
b2
b3
y3
y2
y1 F L G K++
F L G K+
Peptide Fragmentation by MS/MS
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Rel
ativ
e A
bu
nd
ance
395.2
y9
b4
400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400
m/z
887.6
986.6
774.5
1186.7494.31168.7
1085.7607.4 1243.7
673.5
1006.6 1119.6779.5476.3 589.3984.6708.4
466.3
885.61184.7
772.5
y13
y12
y12*y11
y10
y8
y7
b13
b12b11
b10
b8
b7
b6
b5
b6*b5*
a5 a12
His-Gly-Thr-Val-Val-Leu-Thr-Ala-Leu-Gly-Gly-Ile -Leu-Lysb1 b4b3 b5 b6 b7 b8 b9 b10b2 b11 b12 b13
y13 y10y11 y9 y8 y7 y6 y5 y4y12 y3 y2 y1
17
18
19
MS/MS: Espectrometría en Tandem
Espectrometría de masa
Fragmentación peptídica
22
Identificación de proteínas
Peptide mass fingerprinting y proteomica
23
Identificación de proteínas
Mapeo peptídico por EM(Peptide Mass Fingerprinting/MS)
MEMEKEFEQIDKSGSWAAIYQDIRHEASDFPCRVAKLPKNKNRNRYRDVS
PFDHSRIKLHQEDNDYINASLIKMEEAQRSYILTQGPLPNTCGHFWEMVW
EQKSRGVVMLNRVMEKGSLKCAQYWPQKEEKEMIFEDTNLKLTLISEDIK
SYYTVRQLELENLTTQETREILHFHYTTWPDFGVPESPASFLNFLFKVRE
SGSLSPEHGPVVVHCSAGIGRSGTFCLADTCLLLMDKRKDPSSVDIKKVL
LEMRKFRMGLIQTADQLRFSYLAVIEGAKFIMGDSSVQDQWKELSHEDLE
PPPEHIPPPPRPPKRILEPHNGKCREFFPNHQWVKEETQEDKDCPIKEEK
GSPLNAAPYGIESMSQDTEVRSRVVGGSLRGAQAASPAKGEPSLPEKDED
HALSYWKPFLVNMCVATVLTAGAYLCYRFLFNSNT
proteína intacta enzima
proteolítica
péptidos
5000 7000 9000 11000 13000 15000
Mass (m/z)
0
6.0E+4
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
% I
nte
nsi
ty
Voyager Spec #1=>BC=>NF0.9[BP = 12364.9, 60367]
12366.46
6187.17
12583.58
12326.17
6292.68
12784.48
Espectro de masa del citocromo c de caballo
A. Molécula entera. Matriz: ácido sinapínico
1000 1160 1320 1480 1640 1800
Mass (m/z)
0
2.0E+4
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
% In
ten
sity
Voyager Spec #1=>MC=>BC[BP = 1633.6, 19883]
1168.61
1190.54
1212.53 1433.76
1655.591170.181213.531296.681152.361046.18 1631.621350.70
1478.821124.52 1230.50
1633.82
B. Molécula digerida con tripsina. Matriz: ácido -ciano hidroxicinámico
Masa Teorica (Da)
Masa Medida (Da)
Error (Da) Residuos Secuencia
1168.61 1168.61 0.00 28-38 TGPNLHGLFGR 1296.71 1296.68 0.03 28-39 TGPNLHGLFGRK 1350.72 1350.69 0.03 89-99 TEREDLIAYLK 1433.77 1433.76 0.01 26-38 HKTGPMLHGGLFGR 1470.68 1470.67 0.01 40-53 TGQAPGFTYTDANK 1478.82 1478.82 0.00 89-100 TEREDLIAYLKK 1478.82 1478.82 0.00 88-99 KTEREDLIAYLK 1633.81 1633.82 0.01 9-22 IFVQKCAQCHTVEK
Niveles de información……… en la caracterización de proteínas por MS.
• medida de masa de una molécula entera 1 valor experimental
• medidas de masas en mapeo peptídico 5-20 valores experimentales
• secuenciado de péptidos por MS/MS más de 100 valores experimentales
…mejora en cantidad y calidad de la información
Peptide fragmentation fingerprinting
Enzymaticdigestion
In-silicodigestion
Protein(s) Peptides340.695086676.96063498.8283545.5641171.967066261.107346342.51458456.727405363.268365
MS/MS spectra of peptides
Ions peaklists
…MAIILAGGHSVRFGPKAFAEVNGETFYSRVITLESTNMFNEIIISTNAQLATQFKYPNVVIDDENHNDKGPLAGIYTIMKQHPEEELFFVVSVDTPMITGKAVSTLYQFLV …
- MAIILAGGHSVR- FGPK- AFAEVNGETFYSR- VITLESTNMFNEIIIK- YPNVVIDDENNDK…
Sequence database entry
361.107346338.695086676.96063498.82831045.5641171.967066342.51458457.827405263.268453
Theoretical peaklist
Theoretical proteolytic peptides
Match
Result: ranked list of peptide
and protein
candidates
Theoretical fragmented
peptides
-MAIILAG-MAIILA-MAIIL-MAII-MAI-M-M-AIILAG
In-silicofragmentation
PFF = ion search MS/MS database matching
Proteoma
• Producto final del genoma más variedad• Es una entidad dinámica Fenotipo• Modificaciones posttraduccionales• No todos los genes se expresan como proteínas
en todos los estadios/tipos celulares
1 gen = 1proteina?
• 1 gen ya no equivale a una proteina
• La definición de gen es debatible (ORF, promotor, pseudogen, producto de gen, etc)
• 1 gen = cuántas proteinas? (no sabemos)
Sujetos de estudio de la Proteómica
• Identificación de Proteínas (pept mass fingerprint)• Comparación de niveles de expresión de Proteinas• Función de Proteinas• Modificaciones posttraduccionales de Proteinas• Localización y Compartimentalización de Proteinas • Interacciones Proteina-Proteina
Quantitative proteomics
Quantitative proteomics
Identificación de sitios de modificación
Oxidación de citocromo c
Y74
Y67
Y48Y97
Y74
Y67
Y48Y97
Located in mitochondria, plays an important role in apoptosis intrinsic pathway and has been linked to oxidative stress responses
[H2O2]
37°C,1 Hr
aPLPC
TOCL
sh_2025_MM_102010p_alpha_PLPC #3206 RT: 29.05 AV: 1 NL: 6.69E2F: ITMS + c NSI d Full ms2 [email protected] [125.00-1510.00]
200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200m/z
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
85
90
95
100
Rela
tive A
bundance
744.39567.35
638.40
415.40
480.27
631.47
857.32751.40
376.42
358.72 620.49 815.44235.14319.73 684.20484.34
265.93 928.57489.64 1220.79216.16783.42 996.71859.49 1108.26
b10y9
b8
b7
b6
y5
y4
b5y7(2+)
y5(2+)
y6(2+)
b7-CO(2+)
y12 y11 y10 y9 y8 y7 y6 y5 y4 y3 y2 y1T---E---R---E---D---L---I---A---Y*--L---K---Kb1 b2 b3 b4 b5 b6 b7 b8 b9 b10 b11 b12
Y+16
GAPDHReaction withNitro-oleic acid
Batthyany J.Biol.Chem. 2006, p.20450
MS-Imaging
MS-Imaging
• Mass is given as m/z which is the mass of the ion divided by its charge
• Monoisotopic mass is the mass of an ion for a given empirical formula calculated using the exact mass of the most abundant isotope of each element (C=12.00000, H=1.007825 etc)
• Average mass is the mass of an ion for a given empirical formula calculated using the average exact mass for each element (C=12.01115, H=1.00797 etc)
• Nominal mass is the mass of an ion for a given empirical formula calculated using the integer mass of the most abundant isotope for each element (C=12, H=1 etc)
Electrospray Ionisation and Charge
Substance P
300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300
Da/e0
100
%
674.7
666.1600.4462.8
685.7
693.6 1347.7
[M+2H]2 +
[M+H] +
520 521 522 523 524 525 526 527 528 5290
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
85
90
95
100
Rel
ativ
e A
bund
ance
524.3
525.3
526.2
Determining Charge State
Double Charge StateDelta = 0.5 amu
Determining Charge State
Delta = 0.5 amu
258 259 260 261 262 263 264 265 266 2670
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
85
90
95
100
Rel
ativ
e A
bund
ance
262.6
263.1
263.6
Delta = 0.5 amu