Aplicaciones de la PCR en el diagnóstico genético
Dr. Carlos Ruiz Lafora
Director Técnico
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PCRReacción de Cadena de la Polimerasa
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Aplicaciones
de la PCR
➢ Es una técnica de amplificación enzimática “in vitro”. Permite amplificar un fragmento
específico de ADN situado entre dos regiones de secuencia conocida.
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PCRReacción de cadena de la polimerasa
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Aplicaciones
de la PCR
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SSR
AFLPS
SNP
RAPD
RFLP
ISSR
IRAP
Secuencias de ADN polimórficas
Permiten realizar mapas genéticos y estudios indirectos
Aplicaciones
de la PCR
Marcadores moleculares
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...AGTCCTGGCCTGAACACCACCAC...CACCACCACTCCTTAACTGGT...
...TCAGGACCGGACTTGTGGTGGTG...GTGGTGGTGAGGAATTGACCA...
REGIÓN MICROSATELITE
( CAC)n
➢ Regiones del genoma que son repeticiones en tandem de secuencias cortas de nucleótidos ( cac, gaca, ta, gt, ctt,... )
➢ No están asociados a ninguna patología
➢Mediante marcadores polimórficos “etiquetamos” cada uno de los genes
➢ Hacemos haplotipos y análisis de ligamiento
➢Estudios indirectos
Aplicaciones
de la PCR
Microsatélites (SSR)
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I:1 I:2
II:1 II:2II:3
III:1 III:2 III:3 III:4 III:5 III:6
II:4
III:7 III:8III:9
IV :1 IV :2 IV :3 IV :4 IV :5 IV :6
III:10
IV :7 IV :8
III:11
IV :9
III:12
IV :10
7q32.2
I:1117 119157 155222 214276 276220 198104 102151 153
D7S680D7S514D7S635
D7S2501D7S1875D7S530
D7S2544
I:1123 119157 155220 214276 276212 198100 102151 153
D7S680D7S514D7S635
D7S2501D7S1875
D7S530D7S2544
I:2125 119153 157214 218274 266202 200100 100153 153
?
II:1119 119155 157214 218276 266198 200102 100153 153
D7S680D7S514D7S635
D7S2501D7S1875
D7S530D7S2544
ADN-2089
IMEGEN-198
ADN-2081
IMEGEN-197
ADN-2080
IMEGEN-196
ADN-2094
IMEGEN-195
Distrofia muscular de cinturas
Autosómica dominante
ligada a la región 7q32.2
I:1117 119157 155222 214276 276220 198104 102151 153
D7S680D7S514D7S635
D7S2501D7S1875D7S530
D7S2544
I:1123 119157 155220 214276 276212 198100 102151 153
D7S680D7S514D7S635
D7S2501D7S1875
D7S530D7S2544
I:2125 119153 157214 218274 266202 200100 100153 153
?
II:1119 119155 157214 218276 266198 200102 100153 153
D7S680D7S514D7S635
D7S2501D7S1875
D7S530D7S2544
ADN-2089
IMEGEN-198
ADN-2081
IMEGEN-197
ADN-2080
IMEGEN-196
ADN-2094
IMEGEN-195
Aplicaciones
de la PCR
Análisis de ligamiento
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I:1246 242193 197146 146130 126
D15S646D15S128D15S122D15S210
I:2242 244195 199142 148130 128
?
II:1242 244195 199142 148130 128
D15S646D15S128D15S122D15S210
Síndrome del Prader-Willi (15q11_13)
➢ Deleción en el cromosoma de origen paterno
➢ Disomia uniparental materna
➢ Defectos en el imprinting del cromosoma 15 paterno
D15S646
D15S128
D15S122
D15S210
REGIÓN PW/ ANG
Aplicaciones
de la PCR
Análisis de ligamiento
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(CAG)nHD, SCA
5’UTR 3’UTRExón Intrón
(CGG)nFRAXA
(CTG)nDM
(GAA)nAF
(GCG)nOPMD
Exón
➢ Regiones del genoma que son repeticiones
en tandem de secuencias cortas de
nucleótidos ( cac, gaca, ta, gt, gata,... )
➢ No están asociados a ninguna patología
Microsatelites (SSRs)
➢ Regiones del genoma que son repeticiones
en tandem de secuencias cortas de
nucleótidos ( tripletes CGG, CAG... )
➢ Están asociados a una patología
Mutaciones dinámicas
Aplicaciones
de la PCR
Mutaciones dinámicas
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Inestabilidad de repeticiones de tripletes en tándem
❑ Número de repeticiones es polimórfico en población
❑ Adquieren un tamaño patológico
❑ Inestabilidad Intergeneracional
❑ Fenómeno de anticipación
❑ Enfermedades neurológicas
ACTATATGCTAGCTAGCTAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGGACTGATCTAGCTGATCGT
ACGATCAGCTAGATCAGTCCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTAGCTAGCTAGCATATAGT
Núm. repeticiones = A - (B + C)
3
AB C
Aplicaciones
de la PCR
Mutaciones dinámicas
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(CAG)nHD
5’UTR 3’UTRExón Intrón Exón
Enfermedad de Huntington➢Alelos normales. 6-26 repeticiones
➢ Alelos intermedios: 27-35 repeticiones
➢Alelos asociados al HD: > 36 repeticiones.
Forma juvenil 60 rep
118 pb 17 rep197 pb 43 rep
127 pb 20 rep191 pb 41 rep
124 pb 19 rep
146 pb 26 rep
Aplicaciones
de la PCR
Mutaciones dinámicas
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5’UTR 3’UTRExón Intrón
(CTG)nDM
Exón
Distrofia Miotónica
➢Alelos normales. 5-34 repeticiones
➢ Alelos pre-mutados : 35-49 repeticiones
➢Alelos asociados a DM1 mínima : 50-150 repeticiones
➢Alelos asociados a DM1 clásica: ~100- ~1000 repeticiones
➢Alelos asociados a DM1 congénita: > 2000 repeticiones
91 pb 12 rep ¿ ?
66 pb 5 rep ¿ ?
66 pb 5 rep 94 pb 13 rep
88 pb 11 rep ~253 pb 66 rep
Aplicaciones
de la PCR
Mutaciones dinámicas
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TP-PCR (Triplet repeat primed PCR)
…ACTACGTAGCTGACTGCTGCTGCTGCTGCTG…CTGCTGCTGCTGCTGCACTGATGCTACGTG…
…TGATGCATCGACTGACGACGACGACGACGAC…GACGACGACGACGACGTGACTACGATGCAC…
Aplicaciones
de la PCR
Mutaciones dinámicas
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Distrofia Miotónica
Aplicaciones
de la PCR
Mutaciones dinámicas
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X Frágil (FMR1; Xq27.3) Interrupción de las repeticiones
Aplicaciones
de la PCR
Mutaciones dinámicas
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Detección de deleciones/ duplicaciones
MLPA CGH array
NGS
A pequeña escala A gran escala
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1 experimento permite la cuantificación relativa de hasta 48 secuencias distintas de ADN.
Es rápido, sencillo y.... barato
Aplicaciones
de la PCRMLPAMultiplex Ligation-dependent Probe Amplification
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3-PCR con los primers universales X e Y
2-Ligación
1-Hibridación
4-Electroforesis capilar
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Control
Paciente
5-Interpretación de los resultados
Aplicaciones
de la PCRMLPAMultiplex Ligation-dependent Probe Amplification
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➢ Detección de aneuploidías
➢Análisis de las regiones subteloméricas
➢ Detección de duplicaciones/ deleciones desde un exón a todo un gen
o región cromosómica (MLPA diseñado para más de 100 genes)
➢Detección de duplicaciones/ deleciones regiones cromosómicas (20
síndromes distintos de microdeleción)
Aplicaciones
de la PCRMLPAPrincipales indicaciones clínicas
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13-verde21-rojo
18-azulY-rojoX-verde
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Diagnóstico prenatal de aneuploidías (P095)
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➢Detección de aneuploidías.
➢Análisis de las regiones subteloméricas
➢Detección de duplicaciones/ deleciones desde un exón a todo un gen o
región cromosómica (MLPA diseñado para más de 100 genes)
➢Detección de duplicaciones/ deleciones regiones cromosómicas (20
síndromes distintos de microdeleción)
Aplicaciones
de la PCRMLPAPrincipales indicaciones clínicas
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Reordenamientos subtelomericos submicroscopicos
Chr 8
Chr 16
Traslocación 8:16
Aplicaciones
de la PCRMLPAPrincipales indicaciones clínicas
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ControlControl
Deleción 18q
Aborto espontaneo: 46, XY, (18) (18:20) (q21:p13) mat
Madre: 46, XX, t(18:20) (q21:p13)
Duplicación 20p
Aplicaciones
de la PCRMLPAPrincipales indicaciones clínicas
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➢ Detección de aneuploidías
➢Análisis de las regiones subteloméricas
➢Detección de duplicaciones/deleciones desde un exón a todo un gen o
región cromosómica (MLPA diseñado para más de 100 genes)
➢Detección de duplicaciones/deleciones regiones cromosómicas (20
síndromes distintos de microdeleción)
Aplicaciones
de la PCRMLPAPrincipales indicaciones clínicas
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DMD
Limitaciones: No es posible detectar duplicaionesNi mujeres portadoras de deleciones
Distrofia Muscular de Duchenne
Aplicaciones
de la PCRMLPAPrincipales indicaciones clínicas
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64
65 66 67
Control
Paciente con DMD
Diagnóstico de DMD/DMB (P034/P035)
Aplicaciones
de la PCRMLPAPrincipales indicaciones clínicas
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Control
Paciente con DMD; dup2-7
Aplicaciones
de la PCRMLPAPrincipales indicaciones clínicas
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PMP22
Duplicación= CMT1A
Deleción= HNPP
Multiplex-A Multiplex-B
CONTROL NEGATIVO
CHMT- 1A
HNPP
D17S1356D17S1357
D17S261
D17S955D17S261
D17S261 D17S1358D17S921
D17S1356 D17S261
D17S955 D17S1357
D17S1356D17S261 D17S955
D17S1357
D17S1358D17S921D17S261D17S261
D17S261 D17S261D17S921
D17S1358
Limitaciones: Marcadores no informativos. A veces difícil interpretación
Duplicación / Deleciónde la región 17p11
Aplicaciones
de la PCRMLPAPrincipales indicaciones clínicas
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Salsa Mix P033
Control
HNPP
CMT1A
Aplicaciones
de la PCRMLPAPrincipales indicaciones clínicas
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➢ Detección de aneuploidías
➢Análisis de las regiones subteloméricas
➢Detección de duplicaciones/ deleciones desde un exón a todo un gen o región cromosómica (MLPA diseñado para más de 100 genes)
➢Detección de duplicaciones/ deleciones regiones cromosómicas (20 síndromes distintos de microdeleción)
Aplicaciones
de la PCRMLPAPrincipales indicaciones clínicas
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1p36 deletion syndrome*
2p16 microdeletion
3q29 microdeletion
9q22.3 microdeletion
15q24 deletion syndrome*
17q21 microdeletion*
22q13 / Phelan-McDermid*
Cri du Chat syndrome, 5p15*
DiGeorge syndrome 22q11*
DiGeorge region 2, 10p15
Langer-Giedion syndrome, 8q
Miller-Dieker syndrome, 17p*
NF1 microdeletion syndrome
Prader-Willi / Angelman*
MECP2 / Xq28 duplication*
Rubinstein-Taybi syndrome
Smith-Magenis syndrome*
Sotos syndrome 5q35.3*
Wagr syndrome
Williams syndrome*
Wolf-Hirschhorn 4p16.3*
Aplicaciones
de la PCRMLPAPrincipales indicaciones clínicas
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dup 7q11
no por FISH
pero…
si por MLPA
Aplicaciones
de la PCRMLPAPrincipales indicaciones clínicas
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Aplicaciones
de la PCRMLPAPrincipales indicaciones clínicas
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3-PCR
2-Ligación
1-Hibridación
Falso positivo: Presencia de una mutación puntual en una
zona de unión de la sonda
Aplicaciones
de la PCRMLPAPrincipales indicaciones clínicas
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PCR a tiempo real
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Aplicaciones
de la PCR
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PCR a tiempo real
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Aplicaciones
de la PCR
Nº de ciclos
Log [ADN]
Detección
en agarosa
1. Exponencial: En cada ciclo se duplica la cantidad inicial del ADN diana
(asumiendo un 100% de eficiencia).
2. Lineal: Los componentes de la reacción empiezan a consumirse, la reacción
es mas lenta y algunos de los reactivos o enzimas empiezan a degradarse
3. Plateau: La amplificación está parada, no se producen nuevos productos.
Algunos productos de PCR se pueden degradar. Esta fase es la que se detecta
en la PCR tradicional.
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PCR a tiempo real
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Aplicaciones
de la PCR
Plateau
Lineal
Exponencial
Ciclos
Pro
ducto
PC
R
Análisis a tiempo final en gel de agarosa
o ?
Ct
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PCR a tiempo real
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Aplicaciones
de la PCR
Análisis en fase exponencial Análisis en tiempo final
◼ Alta concentración/Alta Eficiencia
◼ Alta concentración/Baja Eficiencia
◼ Baja concentración/Alta Eficiencia
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PCR a tiempo real
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Aplicaciones
de la PCR
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PCR a tiempo real
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Aplicaciones
de la PCR
Sondas TaqMan
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Hibridación de primers y sonda
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Hibridación de primers y sonda
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Hibridación de primers y sonda
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Amplificación y degradación de la sonda
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Amplificación y degradación de la sonda
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Amplificación y degradación de la sonda
© 2015 IMEGEN – Información confidencial. Todos los derechos reservados.
Amplificación y degradación de la sonda
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Amplificación y degradación de la sonda
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Amplificación y degradación de la sonda
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Amplificación y degradación de la sonda
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• Detección mediante dos sondas Taqman de los alelos diana.
• Técnica muy rápida e interpretación de los resultados sencilla
-Preparación de la PCR
-Amplificación PCR a tiempo real
-Interpretación de los resultados (máxima precisión y fiabilidad)
Detección de mutaciones
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Aplicaciones
de la PCR
Factores de coagulación
Homocigoto normal Heterocigoto Homocigoto mutante
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PCR a tiempo real
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Aplicaciones
de la PCR
Sondas FRET
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Aplicaciones
de la PCR
Análisis curvas de melting
Mismatch
Perfect match
Temperatura
baja media alta
Detección de mutaciones
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Aplicaciones
de la PCR
Policitemia vera JAK2 (p.Val617Phe )
Método semicuantitativo
Tmaa
(p.Val617Phe)Genotipo
59ºC - Val / ValHomocigoto
normal
59ºC 63ºC Val / Phe Heterocigoto
- 63ºC Phe / PheHomocigoto
mutante
Detección de mutaciones
60
Aplicaciones
de la PCR
Fundamentos de la Cuantificación mediante PCR en Tiempo Real
Cuantificación mediante PCR a tiempo real
▪ Dependiendo de la concentración inicial se detectará antes o después la
fluorescencia
▪ En el termociclador se detecta, en tiempo real, la cantidad de amplificado
existente
2x105 copias
2x104 copias
Nn =No x E n
- Nn es la concentración de una
muestra en un número de ciclos dado
- No es la concentración de partida de
la muestra
- E es la eficiencia de la reacción
- n es el número de ciclos
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Aplicaciones
de la PCR
Fundamentos de la Cuantificación mediante PCR en Tiempo Real
Cuantificación mediante PCR a tiempo real
❑ Con una serie de patrones sepuede realizar una recta deregresión, empleando estarecta se puede cuantificar unamuestra
❑ Para cuantificar una muestra debemos obtener el nº de ciclo en el quese detecta la fluorescencia y comparar con un estándar con cantidadesconocidas del analito
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Aplicaciones
de la PCR
Reordenamientos en Oncohematología: BCR-ABL p210
Cuantificación mediante PCR a tiempo real
➢ Cuantificación Enfermedad Mínima Residual
➢ Análisis reordenamiento y gen de referencia
➢ Límite de Cuantificación 0,01%
ABLBCR-ABL
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Aplicaciones
de la PCR
Cuantificación de Quimeras Hematopoyéticas
Cuantificación mediante PCR a tiempo real
ENFERMEDAD MINIMA RESIDUAL
64
Aplicaciones
de la PCR
Cuantificación de Quimeras Hematopoyéticas
Cuantificación mediante PCR a tiempo real
➢ Cuantificación polimorfismos de inserción/deleción y alelos nulos
➢ Análisis InDel y gen de referencia
➢ Comparación frente a un calibrador (muestra pre-trasplante)
➢ Límite de Cuantificación 0,1%
➢ Límite detección 0,01%
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Aplicaciones
de la PCR
PCR Digital
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PCR Digital
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de la PCR
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Aplicaciones
de la PCR
PCR Digital
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Aplicaciones
de la PCR
PCR Digital
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La PCR a tiempo real basa su resultado en la estimación de un Ct
Mediante PCR digital se obtienen resultados en copias por ml.
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Resultado Método Variabilidad
La PCR a tiempo real permite realizar cuantificaciones relativas
Mediante PCR digital se pueden obtener resultados absolutos sin necesidad de estándares
La PCR a tiempo real se ve afectada por la eficiencia de la reacción, el equipo empleado, el material de referencia, inhibición en el ADN
PCR Digital
Aplicaciones
de la PCR
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PCR Digital
Aplicaciones
de la PCR
dPCR
AVG
1.75
SD
0.74
AVG
3.25
SD
0.86
AVG
1.75
SD
0.1
AVG
3.25
SD
0.3
dPCR
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Policitemia vera JAK2 (p.Val617Phe )
Método semicuantitativo
Aplicaciones
de la PCR
PCR Digital
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➢Enfermedad neuromuscular infantil
➢Autosómica recesiva
➢Frecuencia de portadores 1/50
➢Gen SMN1 (5q13)
➢Gen SMN2 Modificador del fenotipo
Aplicaciones
de la PCR
Atrofia muscular espinal
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❑ Estudios de ligamiento
❑ PCR a tiempo real
❑ MLPA
❑ PCR digital
• Gen normalizador
• Cuantificación de SMN1
• Cuantificación de SMN2
Aplicaciones
de la PCR
Atrofia muscular espinal
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❑ Estudios de ligamiento
❑ PCR a tiempo real
❑ MLPA
❑ PCR digital
1 1 2 2
1 x SMN1
2 x SMN2
Aplicaciones
de la PCR
Atrofia muscular espinal
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4 x SMN1
0 x SMN2
Aplicaciones
de la PCR
Atrofia muscular espinal
1 1 2 2
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3 x SMN1
1 x SMN2
Aplicaciones
de la PCR
Atrofia muscular espinal
1 1 2 2
© 2015 IMEGEN – Información confidencial. Todos los derechos reservados.
❑ Estudios de ligamiento
❑ PCR a tiempo real
❑ MLPA
❑ PCR digital
Aplicaciones
de la PCR
Atrofia muscular espinal
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➢ Cuantificación polimorfismos de inserción/deleción y alelos nulos
➢ Análisis InDel y gen de referencia
➢ Comparación frente a un calibrador (muestra pre-trasplante)
➢ Límite de Cuantificación 0,1%
➢ Límite detección 0,01%
Aplicaciones
de la PCRCuantificación de Quimeras hematopoyéticas
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Receptor 49,87%Donante 0%Quimera 0,32%Quimera 3,79%
Aplicaciones
de la PCRCuantificación de Quimeras hematopoyéticas
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Aplicaciones
de la PCRCuantificación de Quimeras hematopoyéticas
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Sample Informative marker FAM/VIC* Het Conversion
XXX-T1 Q116-3i 1.04% 2.07%
XXX-T1 Q116-7i 1.04% 2.08%
XXX-T1 Q116-32i 1.05% 2.10%
XXX-T2 Q116-3i 16.63% 33.26%
XXX-T2 Q116-7i 16.64% 33.28%
XXX-T2 Q116-32i 16.32% 32.63%
XXX-T3 Q116-3i 35.87% 71.75%
XXX-T3 Q116-7i 36.92% 73.83%
XXX-T3 Q116-32i 34.33% 68.66%
XXX-T1
XXX-T2
XXX-T3
83
Aplicaciones
de la PCRCuantificación de Quimeras hematopoyéticas
A-pre A-post
Q116-11i; 1.23%
Q116-10d; 1.37%
Average*2 (Heterozygous correction): 2.60% | STD DEV: 0.14%
Q116-10d, Negative Control
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Clinical Chemistry 59:12 (2013)
Detección de DNA libre circulante post-transplante de hígado
Aplicaciones
de la PCRCuantificación de Quimeras hematopoyéticas