© Javier Señoráns
Análisis Instrumental y Sensorial de Alimentos
Grado en Nutrición Humana y Dietética 1
Tema 2.
La preparación de la muestra
F. Javier Señoráns RodríguezSección Departamental de Ciencias de la AlimentaciónM - 08 – despacho 502
E-mail: [email protected]
Página web: www.uam.es/javier.senorans
Asignatura de Análisis Instrumental y Sensorial de AlimentosGrado en Nutrición Humana y Dietética
Tema 2. La preparación de la muestra
Aislamiento y concentración de compuestos en alimentos.
Técnicas de muestreo de la fase vapor: el análisis del espacio de cabeza (método estático y método dinámico). Técnicas actuales de concentración del espacio de cabeza.
La microextracción en fase sólida (SPME).
La extracción en fase sólida (SPE).
La extracción supercrítica analítica (SFE).
La extracción acelerada con disolventes (ASE).
La extracción asistida por microondas (MAE). Aplicaciones al análisis del aroma de alimentos y al análisis de residuos.
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� La mayoría de las muestras de alimentos que se
analizan por métodos instrumentales de separación son demasiado complejas, están demasiado diluidas o son incompatibles con el sistema cromatográfico, lo que impide su introducción directa
Nuevas técnicas de preparación de la muestra
se necesita preparar la muestra antes de su introducción en el sistema,mediante fraccionamiento, extracción o pre-separación.
Consecuencia:
PREPARACIÓNDE MUESTRA
PROBLEMA PREPARACIÓN
DE MUESTRA
CROMATOGRAFÍA DE GASES CON COLUMNAS CAPILARES
ALTA RESOLUCIÓN
MUESTRA GC
MUESTRA GC
Nuevas técnicas de preparación de la muestra
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Problemas actuales de métodos oficiales y tradicionales:
• lentitud y laboriosidad• empleo de grandes cantidades de disolventes tóxicos
• poca selectividad• poco rendimiento
Métodos tradicionales de preparación de la muestra:-más de 2/3 del tiempo del analista-responsable de al menos 1/3 del error en el análisis-enorme volumen de disolventes
Necesidad de nuevas técnicas de preparación demuestras de alimentos
posibilidad de automatización
técnicas limpias y selectivas
mayor rapidez y eficacia
fiabilidad
Metas
Idealmente, además, baratas, sencillas, sin
disolventes tóxicos
Creciente demanda de :
mayor productividad en los laboratoriosanálisis más rápidosmétodos más automatizados
Necesidad de nuevas técnicas de preparación demuestras de alimentos
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Posibilidades clásicas:
Cristalización
Destilación
Precipitación
Extracción con disolventesLLE, Soxhlet, etc.
Otras: Diálisis y microdiálisis
Filtración
Ultrafiltración
Separaciones con membranas
Técnicas instrumentales de preparación de muestrasde alimentos
Cromatografía en capa fina (TLC)
Cromatografía en columnas abiertas (flash)
LC prep. cromatografía preparativa
Acoplamiento LC-GC
SFC preparativa
Técnicas instrumentales de preparación de muestrasde alimentos
Técnicas basadas en la cromatografía:
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Extracción Sólido-liquido
Extracción Líquido-líquido
Extracciones modernas (ASE, MAE, SFE, etc.)
SPE, SPME, etc.
Técnicas instrumentales de preparación de muestrasde alimentos
Técnicas basadas en la extracción
Fundamento
La cromatografía en capa fina al igual que otras técnicas
cromatográficas se basa en la retención y elución debido
a la diferente interacción del analito entre una fase sólida
y otra líquida.
La placa se introduce en un recipiente que contiene la
fase móvil y alineada con una tira de papel adsorbente. El
disolvente asciende por capilaridad y la separación se
basa en la diferente velocidad a la que los distintos
analitos presentes en la muestra ascienden por la placa.
Fundamentos de la Cromatografía en capa fina(TLC, Thin Layer Chromatography)
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Cálculo de los Factores de Retención (RF)Para ello se emplea la siguiente formula
siendo DA la distancia recorrida por el analito y DS la distancia recorrida por el disolvente o frente del disolvente.
Fundamentos de la Cromatografía en capa fina
Frente del disolvente
Posición del analito
tras la cromatografía
origen
DS
DARF =
Cromatografía en columna
Fundamento
La cromatografía en columna al igual que otras técnicas cromatográficas se basa en la
retención y elución debido a la diferente interacción del analito entre una fase sólida que
rellena una columna abierta y otra líquida (normalmente un disolvente orgánico o una mezcla
de disolventes).
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Esquema Tema 2. La preparación de la muestra
• Introducción a las técnicas de preparación de muestra
• Extracción líquido-líquido
• Extracción Asistida por Microondas (MAE, MicrowaveAssisted Extraction)
• Extracción Acelerada con Disolventes (ASE, AcceleratedSolvent Extraction)
• Cromatografía en capa fina y cromatografía en columna
• Extracción sólido-líquido
� Extracción en Fase Sólida (SPE, Solid Phase Extraction)
� Micro-Extracción en Fase Sólida (SPME, Solid PhaseMicro-Extraction)
Muestras sólidas de alimentos:
Componentes mayoritarios y minoritarios de todo tipo de alimentos(ej: vitaminas, carotenoides, polifenoles)
Residuos y contaminantes en alimentos
MAE
ASE
SFE
Aroma y compuestos volátilesde alimentos y bebidas cuyo aroma o sabor es importante:
vinos, quesos, aceites esenciales, etc
Espacio de cabeza
SPME
Diferentes técnicas para problemas distintos
Componentes naturales o contaminantes de alimentos líquidos:zumos y bebidas, aceites, leche, etc.
Extracción en fase sólida
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Determinación de compuestos
volátiles en muestras de
alimentos
Cromatografía de gases
Técnicas de aislamiento y concentración de compuestos
volátiles de la matriz
Problemas:
• trazas
• aislamiento compuestos volátiles del alimento o del producto a analizar
• se requieren grandes cantidades de producto para obtener la adecuada cantidad para análisis por CG o CG-EM
Técnicas de aislamiento y concentración de compuestos volátiles de la matriz
Nuevas técnicas basadas en el análisis del espacio de cabeza
- se basan en la preconcentración, para posterior análisis y determinación, de los compuestos volátiles que se desprenden del alimento sólido o líquido
Objetivos:
• extraer analitos de interés lo más concentrados posible
• elevada recuperación cuantitativa
• mínimas interferencias
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Micro-extracción en fase sólida (SPME)
Se basa en la adsorción de los compuestos orgánicos del
alimento por una fase sólida inmovilizada sobre una fibra de
sílice fundida.
Una vez alcanzado el equilibrio, los compuestos adsorbidos se
desorben térmicamente en el inyector de un cromatógrafo de
gases
La matriz puede ser aire, agua, muestras líquidas, etc.
Alternativamente, también se puede disolver el extracto en un
disolvente orgánico para analizarlo por HPLC.
Principios de la Técnica
Microextracción en fase sólida (SPME)
SPME es una nueva técnica de extracción para compuestos
orgánicos, que se basa en la adsorción de los analitos de la matriz
(aire, agua, muestras líquidas, etc.) por una fase sólida inmovilizada
sobre una fibra de sílice fundida.
Si se emplea un recubrimiento polimérico, la cantidad de analito
adsorbida por el recubrimiento en equilibrio está relacionada
directamente con la concentración en la muestra.
Principios de la Técnica
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Esquema del sistema
para SPME y detalle de
la fibra adsorbente.
La fibra es de sílice fundida recubierta de un polímero adsorbente selectivo.
Microextracción en fase sólida (SPME)
KfhVfVsCo
KfhVf+Vs
n =
n: masa de analito adsorbida por el recubrimiento
Vf,Vs: Volumen de recubrimiento y de muestra
K : coeficiente de reparto del analito entre el
recubrimiento y la muestra; [K = f ( T, fibra)]
Co: concentración inicial del analito en la muestra
Microextracción en fase sólida (SPME)
Principio Teórico
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Microextracción en fase sólida (SPME)
En relación al reparto de los analitos.......
Principales variables que influyen en el proceso de reparto:
• constante de distribución
• temperatura de la muestra y tipo de calentamiento
25 °C
130 °C
200 °C
Es una técnica rápida y relativamente sencilla
Existen diferentes fibras adsorbentes disponibles en el mercado que permiten cierta selectividad
Se puede acoplar fácilmente a otras técnicas de separación (GC y HPLC)
No requiere ningún disolvente
SPME es una técnica económica (reutilizable)
� Está limitada a muestras líquidas o compuestos volátiles (espacio de cabeza)
� No permite conservar el extracto para otros análisis
Ventajas y desventajas de la Microextracción en fasesólida
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• Detección de enranciamiento de aceites por SPME de aldehídos y otros subproductos de la oxidación
• Análisis de aromas naturales y extraños de alimentos
• Aromas de vinos, bebidas espirituosas, zumos y otras bebidas
• Diferenciación de tipos de café, origen, tueste, etc.
• Compuestos azufrados en cerveza y otras bebidas alcohólicas
• Caracterización y control de calidad de alimentos de alto valor: jamones, trufas, patés, etc.
Microextracción en fase sólida (SPME)
Aplicaciones:
Micro-Extracción en Fase Sólida (SPME)
Ejemplo de análisis de compuestos volátiles en un zumo de fruta
sin usar ningún disolvente tóxico
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Muestras sólidas de alimentos:
Componentes mayoritarios y minoritarios de todo tipo de alimentos(ej: vitaminas, carotenoides, polifenoles)
Residuos y contaminantes en alimentos
MAE
ASE
SFE
Aroma y compuestos volátilesde alimentos y bebidas cuyo aroma o sabor es importante:
vinos, quesos, aceites esenciales, etc
Espacio de cabeza
SPME
Diferentes técnicas para problemas distintos
Componentes naturales o contaminantes de alimentos líquidos:zumos y bebidas, aceites, leche, etc.
Extracción en fase sólida
Técnicas de Purga y Trampa y Desorción Térmica
Procedimiento
• arrastre continuo de la muestra por medio de un flujo de gas
inerte (He o N2)
• captura o adsorción de los compuestos volátiles en una trampa
adsorbente
• desorción, mediante calentamiento, de los compuestos
retenidos
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Técnica de Purga y Trampa
Arrastre y captura:
1
3
2
4
5
MS GCP&T
• Gas inerte: para no alterar componentes de la muestra
• Temperatura ambiente
Técnica de Purga y Trampa
Realiza, de forma automática, las etapas de arrastre, captura y
desorción
Elevada reproducibilidad
Evita manipulación de muestra
No requiere ningún disolvente
Elevada sensibilidad
No existen interferencias de compuestos no volátiles de la matriz
� Optimización de todas las variables en conjunto
Ventajas y desventajas P&T:
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Muestras sólidas de alimentos:
Componentes mayoritarios y minoritarios de todo tipo de alimentos(ej: vitaminas, carotenoides, polifenoles)
Residuos y contaminantes en alimentos
MAE
ASE
SFE
Aroma y compuestos volátilesde alimentos y bebidas cuyo aroma o sabor es importante:
vinos, quesos, aceites esenciales, etc
Espacio de cabeza
SPME
Diferentes técnicas para problemas distintos
Componentes naturales o contaminantes de alimentos líquidos:zumos y bebidas, aceites, leche, etc.
Extracción en fase sólida
Esquema Tema 2. AISA
• Introducción a las técnicas de preparación de muestra
• Extracción líquido-líquido
• Extracción Asistida por Microondas (MAE, MicrowaveAssisted Extraction)
• Extracción Acelerada con Disolventes (ASE, AcceleratedSolvent Extraction)
• Cromatografía en capa fina y cromatografía en columna
• Extracción sólido-líquido
� Extracción en Fase Sólida (SPE, Solid Phase Extraction)
� Micro-Extracción en Fase Sólida (SPME, Solid PhaseMicro-Extraction)
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Aroma y compuestos volátilesde alimentos y bebidas cuyo aroma o sabor es importante:
vinos, quesos, aceites esenciales, etc
Espacio de cabeza
SPME
Diferentes técnicas para problemas distintos
Componentes naturales o contaminantes de alimentos líquidos:zumos y bebidas, aceites, leche, etc.
Extracción en fase sólida
Muestras sólidas de alimentos:
Componentes mayoritarios y minoritarios de todo tipo de alimentos(ej: vitaminas, carotenoides, polifenoles)
Residuos y contaminantes en alimentos
MAE
ASE
SFE
Extracción sólido-líquido: Extracción de alimentossólidos con disolventes
Método tradicional de extracción
disolvente orgánico (líquido) caliente, en ebullición, en contacto conmuestra de alimento (sólido)
(ej. Soxhlet)
Temperatura máxima del Disolvente== Punto de ebullición (60-80ºC)
Disolvente
Disolvente+ extracto
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Necesidad de nuevas técnicas de extracción dealimentos sólidos
Métodos tradicionales de extracción sólido-líquido : líquido en ebullición en contacto con muestra sólida
difusividad del disolvente lentaintercambio de energía poco eficaz
procesos estáticos o semi-estáticos
Extracción lenta y poco eficaz
disolventes convencionales calor como única energía
Extracción lenta y poco selectiva
Pasos previos:
Homogeneizar la muestra
Reducir su tamaño
Evitar cambios en la muestra:
Inactivación enzimática
Protección de lípidos
Inhibición del crecimiento microbiano
Cambios físicos, agua, estructura, etc.
Congelación, secado, tratamiento térmico, conservantes
químicos (o una combinación de varios de ellos)
Técnicas instrumentales de preparación de muestrasde alimentos
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Extractor Soxhlet
• Método tradicional, muy aceptado y extendido
• Lento
Esquema Tema 2. La preparación de la muestra
• Introducción a las técnicas de preparación de muestra
• Extracción líquido-líquido
• Extracción Asistida por Microondas (MAE, MicrowaveAssisted Extraction)
• Extracción Acelerada con Disolventes (ASE, AcceleratedSolvent Extraction)
• Cromatografía en capa fina y cromatografía en columna
• Extracción sólido-líquido
� Extracción en Fase Sólida (SPE, Solid Phase Extraction)
� Micro-Extracción en Fase Sólida (SPME, Solid PhaseMicro-Extraction)
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Principios comunes a las nuevas técnicas de extracción:
Extracción asistida por microondas (MAE).
Extracción acelerada con disolventes (ASE).
Extracción supercrítica analítica (SFE).
Se emplean disolventes de alta difusividad elevando la temperatura
y controlando la presión
Debido a los mayores coeficientes de difusión, las extracciones se
aceleran considerablemente
Técnicas instrumentales de extracción de muestras sólidas de alimentos
Extracciones de sólidoscon mayor rapidez y eficacia
Líquidos a alta TªFluidos Supercríticos
SFE ASEMAE
Presiónelevada
Energía localizada
selectividad rendimiento
Técnicas avanzadas de preparación de muestrasde alimentos sólidos
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Principios de la Extracción Asistida porMicroondas (MAE)
Se extrae la muestra aplicando energía de microondas en un
disolvente adecuado.
Energía de microondas:
� calienta selectivamente unas especies químicas frente a otras
� produce extracciones rápidas y con cierta selectividad.
El calentamiento producido depende de la naturaleza química de la
matriz y del disolvente
Cuanto mayor es la constante dieléctrica, mayor es la absorción de
energía.
Extracción Asistida por Microondas (MAE)
Cuando el disolvente absorbe energía microondas:
� La muestra se coloca en un recipiente cerrado
� se calienta a temperaturas mayores que su punto de
ebullición durante un tiempo muy corto (aumenta la presión)
�después se enfría y se despresuriza
�se separa o filtra el extracto
Procedimiento habitual
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Extracción Asistida por Microondas (MAE)
Esquema de una celda comercial con control de presión y de temperatura para MAE
Equipo necesario:• Microondas• Celdas apropiadas
Características de las celdas no absorber microondas,
ser inertes,
fáciles de abrir y cerrar
reutilizables
resistentes a altas P y temperaturas
Extracción Asistida por Microondas (MAE)
Principales variables:
Relativas a la muestra
Tiempo de irradiación y extracción
Potencia de irradiación
Caudal de disolvente (en procesos continuos)
Disolvente: composición y propiedadesconstante dieléctrica
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Extracción Asistida por Microondas (MAE)
� MAE es más rápida (30 seg.-10 min) y emplea menos disolvente (1-15 mL) que la extracción líquida tradicional
� La energía esta localizada y se aprovecha mejor (menor consumo)
� El tamaño de muestra puede ser muy variado
� MAE es una técnica robusta y fácil de usar
� Se pueden extraer varias muestras a la vez
� No hace falta deshidratar o procesar la muestra
Ventajas
Extracción Asistida por Microondas (MAE)
� MAE depende de la matriz y limita los disolventes que se pueden utilizar
� MAE plantea problemas de seguridad
� El extracto queda en contacto con la muestra al acabar la extracción y necesita una posterior filtración o separación
� MAE es difícil de automatizar o acoplar a técnicas de análisis
� Degradación de compuestos térmicamente lábiles
� Poca selectividad en la extracción
Desventajas
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Extracción Asistida por Microondas (MAE)
Esquema de un extractor asistido por microondas
Extracción de grasa de carne, huevo y sólidos lácteos
Extracción de oleorresina de pimentón
Extracción de monoterpenoles de mostos para análisis por GC
Extracción de contaminantes (residuos de pesticidas, PAHs, PCBs, etc.)
Ejemplos de Aplicaciones:
Extracción de esencias de vainilla, menta, ginseng, cítricos, etc.
Ejemplo de Extracción Asistida por Microondas (MAE)
Extracción de grasa de carne, huevo y sólidos lácteos
Homogeneización de la muestra
Se añade el disolvente: éter de petróleo o hexano
La muestra se coloca en un recipiente abierto adecuado
Se irradia a 300 W durante 60 + 90 segundos
El extracto se filtra a vacío para separar la muestra del disolvente
Se concentra el extracto, evaporando el disolvente en rotavapor
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Extracciones de sólidoscon mayor rapidez y eficacia
Líquidos a alta TªFluidos Supercríticos
SFE ASEMAE
Presiónelevada
Energía localizada
selectividad rendimiento
Técnicas avanzadas de preparación de muestrasde alimentos sólidos
Extracción Acelerada con Disolventes (ASE)
• nueva técnica de extracción • disolventes habituales • presiones y temperaturas elevadas • extracciones rápidas y efectivas de muestras sólidas
Principios de la Técnica
Temperaturas: 30 - 200 ºC
Presiones: 100 - 140 atm
Disolventes: orgánicos, agua, mezclas, etc.
Muestras: sólidas
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Extracción Acelerada con Disolventes (ASE)
• nueva técnica de extracción • disolventes habituales • presiones y temperaturas elevadas • extracciones rápidas y efectivas de muestras sólidas
Principios de la Técnica
Efectos interesantes que se producen a temperaturas elevadas: • mejores solubilidades de los analitos en líquidos • aumento de las cinéticas de desorción de los compuestos de la matriz
Extracción Acelerada con Disolventes (ASE)
• La muestra sólida se coloca en un recipiente que se sella
• Se llena con disolvente y se calienta a temperatura mayor
que el punto de ebullición del disolvente, provocando un
gran aumento de la presión en la celda.
• Durante el tiempo de extracción parte del líquido es
liberado y recogido en un vial.
• Al final de la extracción, el extracto se expulsa de la celda
con nitrógeno y se transfiere automáticamente a un vial.
Procedimiento
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Principales variables:
• Relativas a la muestra
• Tiempo de extracción
• Temperatura de extracción
• Número de ciclos
• Disolvente o mezcla de disolventes
Extracción Acelerada con Disolventes (ASE)
Disolvente
Bomba
Nitrógeno
Válvula de purga
Vial colector
Horno
Celda de Extracción
Válvula Estática
Vial de desecho
Válvula de presión
Salidaaire
Extracción Acelerada con Disolventes (ASE)
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Imagen de un extractor con disolventes presurizados (ASE)
Extracción de grasa de carne, huevo y sólidos lácteos
Pesticidas en harinas, piensos, etc.
Micotoxinas en cereales y frutos secos
Extracción de contaminantes (residuos de pesticidas, dioxinas, PCBs, etc.)
Ejemplos de Aplicaciones:
Extracción de productos naturales
Extracción Acelerada con Disolventes (ASE)
Extracción Acelerada con Disolventes (ASE)de alimentos
� ASETM es más rápida que los procedimientos de extracción líquida tradicionales <15 min frente a 2-24 h
� ASE emplea menos disolvente <15 mL para 10 g de muestra vs. 50-500 mL
� ASE es más eficaz independientemente de la matriz
� ASE es automatizable y puede extraer muestras secuencialmente
� El desarrollo de métodos es mucho más sencillo
Ventajas
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Extracción Acelerada con Disolventes (ASE)de alimentos
� Las extracciones son más completas, pero menos selectivas
� ASE requiere el empleo de temperaturas más altas que en SFE
� El equipo tiene un precio elevado
Desventajas
Extracciones de sólidoscon mayor rapidez y eficacia
Líquidos a alta TªFluidos Supercríticos
SFE ASEMAE
Presiónelevada
Energía localizada
selectividad rendimiento
Técnicas avanzadas de preparación de muestrasde alimentos sólidos
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Extracción Analítica con Fluidos Supercríticos (SFE)
Se extrae con un fluido a presiones y temperaturas mayores que las de su punto crítico
� extrae rápida y selectivamente algunos compuestos
Variando la presión (la densidad del fluido) se controla la solubilidad de los analitos en dicho fluido.
Principios de la Técnica
Diagrama de fases
Presión
Temperatura
Líquido
Gas
Sólido
FluidoSupercrítico
¿Qué es un Fluido Supercrítico?
Punto
Crítico
(Para CO2 es
31.3ºC y
72.9 atm)
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• Moderadas presión (72.9 atm) y temperatura (31.3ºC)
críticas
• Gas a temperatura ambiente, no deja residuos
• No es tóxico ni inflamable
• Precio moderado y sin problemas de eliminación
• Baja polaridad, se pueden añadir modificadores en
pequeña proporción para extraer compuestos polares
Propiedades del dióxido de carbono
Extracción Analítica con Fluidos Supercríticos (SFE)
El fluido supercrítico más utilizado es el dióxido de carbono (CO2)
Muestras sólidas de alimentos:
Componentes mayoritarios y minoritarios de todo tipo de alimentos(ej: vitaminas, carotenoides, polifenoles)
Residuos y contaminantes en alimentos
MAE
ASE
SFE
Aroma y compuestos volátilesde alimentos y bebidas cuyo flavor es importante:
vinos, quesos, aceites esenciales, etc
Espacio de cabeza
SPME
Componentes naturales o contaminantes de alimentos líquidos:zumos y bebidas, aceites, leche, etc.
Extracción en fase sólida
Diferentes técnicas para problemas distintos
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Fundamentos de la Extracción Líquido-Líquido
Partición de los componentes
de una mezcla
entre dos líquidos inmiscibles
de diferente densidad
Extracción en fase sólida (SPE)
SPE es una técnica de extracción que se basa en la
retención sobre un adsorbente sólido de los compuestos
deseados disueltos en una muestra líquida.
La adición de un eluyente permite eliminar los componentes
de la matriz que interfieren, para después eluir y concentrar
los analitos de interés.
La extracción en fase sólida sustituye a la extracción
líquido-líquido clásica.
Principios de la Técnica
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Procedimiento de la Extracción en Fase Sólida (SPE)
Muestra Acondicio-namiento
Adición de muestra
Lavado Elución del analito
Extracción en Fase Sólida (SPE)
Ejemplos de Aplicaciones:
• Eliminación de pigmentos de
vegetales y hortalizas
• Retención de antocianinas y otras
interferencias en análisis de
pesticidas en vinos
• Vitaminas en zumos
• Residuos de antibióticos en leches
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Extracción en Fase Sólida (SPE)
Imagen de un colector
múltiple para SPE con aspiración a vacío.
Permite la extracción
simultánea de 20 tubos con muestra.
Equipo automático para SPE con microplacas de 96 / 384
Ventajas y desventajas de SPE
� Es una técnica muy sencilla y rápida
� Existen numerosos adsorbentes disponibles en el mercado para SPE
� Se puede acoplar a otras técnicas de separación
� Emplea poco o ningún disolvente
� SPE es muy efectiva para extraer compuestos polares o apolares de muestras líquidas
� Se puede automatizar
� Está limitada a muestras líquidas
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Sumario de propiedades de nuevas técnicas deextracción
Rápidas: tiempos de extracción de 1 - 30 minutos
Ninguna técnica es ideal para todos los analitos de todas las matrices
Las nuevas técnicas son cada vez más comunes y van a continuar su expansión debido a sus numerosas ventajas
Posibilidad de automatización
Eficaces y selectivas
• Libros sobre Análisis Instrumental incluyendo preparación de muestra:
Rubinson K.A., Rubinson J.F. (2001). Análisis Instrumental.Prentice Hall-Pearson. Madrid.
Matissek R., Schnepel F.M., Steiner G. (1998). Análisis de losAlimentos. Fundamentos, Métodos, Aplicaciones. Acribia.Zaragoza.
Skoog D.A., Holler F.J., Nieman T.A. (2001). Principios de AnálisisInstrumental. [Quinta Edición] McGraw-Hill. Madrid.
Bibliografía recomendada