Avances en el Diagnóstico de las Infecciones por Bacterias Multirresistentes
Málaga, 14 de noviembre de 2017
Luis Martínez MartínezServicio de Microbiología
Hospital Universitario Reina SofíaDepartamento de Microbiología
Univ. de Córdoba
• Identificación
Antibiograma
• Tipificación
PRINCIPALES ÁREAS DE INNOVACIÓN,
DESARROLLO E IMPLEMENTACIÓN
MALDI-TOF:
Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization
Time Of Flight
[MS: Mass Spectrometry]
[RAE] Desorción. 1. f. Tecnol. Emisión de un fluido previamente absorbido por un material.
Tipificación molecular
Determinación de sensibilidad/resistencia
Detección de factores de virulencia
Detección de compuestos no proteicos (LPS)
Virología
Diagnóstico Indirecto
Instrumento muy caro
Base de datos mejorable
Dificultad para aplicar a muestras clínicas directas
Cantidad mínima de microorganismos para el análisis
Variaciones de espectro para algunas especies
[No ofrece] información sobre resistencia
MALDI-TOF PARA IDENTIFICACIÓN. LIMITACIONES
Rápido
Equipo compacto
Versátil (bacterias, levaduras, hongos)
Manejo sencillo
Fiable y reproducible.
Bajo coste de reactivos
Gestión: Menos productos comerciales para
identificación. Muy pocos consumibles
MALDI-TOF PARA IDENTIFICACIÓN. VENTAJAS
Seguro: Elimina las decisiones terapéuticas erróneas
Asequible: Para su compra y uso en cualquier región
Rápido: <30 minutos desde la toma de la
muestra hasta el resultado
Fácil de usar: Uso e interpretación sin tecnología compleja
Desarrollable: Plan para fabricación y distribución
Seguro: Más riesgos que beneficios
Conectable: Capacidad almacenar y transmitir los datos
Prototipo: >=3 copias disponibles para ensayos clínicos
REGLAS
£10m
Enterobacteria, Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter spp.
Reference Method: Broth Microdilution (ISO-20776; [basically the
same that CLSI guidelines])
a. Cation-adjusted Mueller-Hinton Broth
b. No additives (in particular, no polysorbate-80 or other surfactants) for testing
c. Microdilution trays must be made of plain (not treated) polystyrene
d. Sulphate salts of polymyxins must be used (DO NOT use colistin
methanesulfonate: inactive in vitro)
INCONVENIENCE: DIFFICULTIES FOR IMPLEMENTATION IN ROUTINE WORK
STUDIES IN PROGRESS FOR VALIDATION OF:
DISK DIFFUSION
GRADIENT DIFFUSION
AGAR DILUTION
JPBWG: COLISTIN TESTING
• Métodos fenotípicos convencionales
• Inmunocromatografía
• Ensayos colorimétricos
• Citometría de flujo
• Bioluminiscencia
• Dispositivos de microfluídica
• Métodos Proteómicos:
MALDI-Tof
Espectrometría Raman
• Métodos genómicos
PCR [muestra directa]
Fragmentación de ADN bacteriano
PCR-microarrays
Secuenciación masiva
NUEVOS MÉTODOS
• INÓCULO NO ESTANDARIZADO
• INÓCULOS POLIMICROBIANOS NO CONTROLADOS
• pH DE LA MUESTRA
• MUESTRA QUE YA CONTIENE ANTIMICROBIANO(S)
• “NO APLICABLE” A MUESTRA DIRECTA DE SANGRE
• INCUBACIÓN SIMILAR A LOS MÉTODOS
CONVENCIONALES
ANTIBIOGRAMA A PARTIR DE MUESTRA DIRECTA
EUCAST disc diffusion
ROSCO ESBL and carbapenemase detection kits
Mast Carbapenemase Activity Test (CAT-ID) disc
Inhibition zones:
Digital photo images (6 h)
Standard reading (18 h)
Reading 6 h:
Accurate method for ESBL-Enterobacteriaceae
Carbapenemase detection not reliable
Other antimicrobials: Only preliminary reports
CURVAS DE CRECIMIENTO DE CADA CÉLULA BACTERIANA
MEDIANTE SEGUIMIENTO CON MICROSCOPIA COMPUTARIZADA
ANÁLISIS DE LOS CAMBIOS EN LA MASA, LA MORFOLOGÍA Y LA
VELOCIDAD DE DIISIÓN BACTERIANA
EL PATRÓN DE CADA AISLAMIENTO SE COMPARA CON LOS
PATRONES DE UNA BASE DE DATOS (… DE LA EMPRESA)
P. aeruginosaCIPROFLOXACINO
MEDIDA DE LA MASA BACTERIANA
Ultraresolución de la medida de la masa
bacteriana por la oscilación en el cambio de
frecuencia de un dispositivo de microfluídica
Se requieren 104 bacterias/ml
Hemocultivos, muestras de orina
TIPIFICACIÓN MOLECULAR
ANÁLISIS DE LA RELACIÓN CLONAL
Modelo de transmisión
Detección de reservorios
Expansión de brotes
Eficacia de medidas
• Identificación [ de nuevos
microorganismos]
• Detección de genes de resistencia
• Detección de genes de virulencia
• Tipificación molecular
• Evolución bacteriana
• Metagenómica (m.o. no cultivables)
• Desarrollo de nuevas herramientas
para el diagnóstico microbiológico
Secuenciación masiva: Aplicaciones
Greub G Clin Microbiol Infect 2013, 19:781-782
TIPIFICACIÓN BASADA EN SECUENCIACIÓN DE
GENOMAS COMPLETOS
Pérez-Vázquez M et al, JAC 2016 , 3392-3399
K. pneumoniae OXA-48
España, CNM
XDR, MDR, and epidemic high-risk clones
(ST-111, ST-175, ST-235)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
XDR MDR ModR MultiS
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
XDR MDR ModR MultiS
% h
igh
-ris
k c
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Clo
nal
div
ers
ity
Cabot et al AAC 2012