VERENA MACEDO SANTOS
Avaliaccedilatildeo da participaccedilatildeo dos micro-organismos da Classe Mollicutes
na microbiota intestinal de mulheres eutroacuteficas e obesas
Dissertaccedilatildeo apresentada ao Programa de Poacutes-
Graduaccedilatildeo em Microbiologia do Instituto de
Ciecircncias Biomeacutedicas da Universidade de Satildeo
Paulo para obtenccedilatildeo do Tiacutetulo de Mestre em
Ciecircncias
Satildeo Paulo 2015
VERENA MACEDO SANTOS
Avaliaccedilatildeo da participaccedilatildeo dos micro-organismos da Classe Mollicutes
na microbiota intestinal de mulheres eutroacuteficas e obesas
Dissertaccedilatildeo apresentada ao Programa de Poacutes-
Graduaccedilatildeo em Microbiologia do Instituto de Ciecircncias
Biomeacutedicas da Universidade de Satildeo Paulo para
obtenccedilatildeo do Tiacutetulo de Mestre em Ciecircncias
Aacuterea de concentraccedilatildeo Microbiologia
Orientador Prof Dr Jorge Timenetsky
Versatildeo original
Satildeo Paulo 2015
UNIVERSIDADE DE SAtildeO PAULO
INSTITUTO DE CIEcircNCIAS BIOMEacuteDICAS ____________________________________________________________________________
Candidato(a) Verena Macedo Santos
Tiacutetulo da Dissertaccedilatildeo Avaliaccedilatildeo da participaccedilatildeo dos micro-organismos da Classe
Mollicutes na microbiota intestinal de mulheres eutroacuteficas e obesas
Orientador (a) Prof Dr Jorge Timenetsky
A Comissatildeo Julgadora dos trabalhos de Defesa da Dissertaccedilatildeo de Mestrado
em sessatildeo puacuteblica realizada a considerou
( ) Aprovado(a) ( ) Reprovado(a)
Examinador(a) Assinatura
Nome
Instituiccedilatildeo
Examinador(a) Assinatura
Nome
Instituiccedilatildeo
Presidente Assinatura
Nome
Instituiccedilatildeo
ldquoHoje lembrando-me dela me vendo nos olhos dela sei que o
tinha de ser se deu Por que era ela por que era eurdquo
Chico Buarque
Agrave minha matildee Maria Bernardete meu anjo de luz Dedico
AGRADECIMENTO ESPECIAL
Agrave Fundaccedilatildeo de Amparo agrave Pesquisa do Estado de Satildeo Paulo (FAPESP) agrave Fundaccedilatildeo de
Amparo agrave Pesquisa do Estado da Bahia (FAPESB) e agrave Coordenaccedilatildeo de
Aperfeiccediloamento de Pessoal de Niacutevel Superior (Capes) pelo apoio financeiro sem o
qual este estudo natildeo seria realizado
AGRADECIMENTOS
Agrave Deus e todos meus espiacuteritos de luz em vida e desencarnados por tudo que me
representam por me permitirem cruzar essa jornada com sabedoria resignaccedilatildeo feacute e
discernimento e por me mostrarem que os ldquoSinais seguem o que creemrdquo Ofereccedilo
Agrave melhor matildee que Deus poderia me permitir nascer que me mostrou a vida e me
ensinou os verdadeiros valores de amor perdatildeo caridade humildade e perseveranccedila
aleacutem de me mostrar que as barreiras da vida satildeo transponiacuteveis e que na verdade
devem ser encaradas como fronteiras Obrigada por continuar olhando por mim e me
incentivando mesmo de outro plano espiritual Sem o seu amor tudo isso seria
impossiacutevel A ti dedico
Agrave meu pai Oriston meu exemplo de vida e companheiro fiel por entender o meu
propoacutesito e me apoiar mesmo nas dificuldades Vocecirc me ensina mais a cada dia sobre
a leveza da vida e em como me tornar uma pessoa melhor uma filha melhor obrigada
Agrave meu irmatildeo Breno e minha cunhada Ariela pelo apoio e por me permitir ser a tia mais
feliz e amada desse mundo
Aos meus sobrinhos queridos Lulu Lis e Miguel por me mostrarem a pureza da vida e
do amor em sua essecircncia mais pura
Agrave Evinha minha ldquomatildee adotivardquo desde os meus 2 dias de vida por todo amor e
dedicaccedilatildeo Minha gratidatildeo seraacute eterna
Ao professor Jorge Timenetsky meu querido orientador por ter aceitado me orientar
natildeo soacute no planejamento e execuccedilatildeo do trabalho mas tambeacutem na vida Minha sincera
gratidatildeo pela orientaccedilatildeo dedicaccedilatildeo e competecircncia profissional
Ao professor Lucas meu mentor na vida e no trabalho pai matildee amigo e eterno
orientador Obrigada Marques por ter acreditado que essa semente um dia iria brotar
Sem o seu apoio e incentivo eu realmente natildeo conseguiria Ter vocecirc em meu caminho
eacute uma honra e um previleacutegio
Agrave Aricelma um dos maiores presentes que pude receber em minha trajetoacuteria pelo
amor conselhos carinhos e abraccedilos Vocecirc foi fundamental para eu me manter firme no
propoacutesito
Ao departamento de endocrinologia do HC-FMUSP e aos professores Alfredo Halpern e
Marcio Mancinni por abrirem as portas para a realizaccedilatildeo das coletas e por acreditarem
no trabalho
Aos funcionaacuterios do departamento de endocrinologia da HC-FMUSP sem os quais
seria inviaacutevel a realizaccedilatildeo das coletas
Aos pacientes por participarem deste estudo e me permitir aprender mais a cada
coleta
Ao professor Djanilson pelo auxiacutelio nas anaacutelises estatiacutesticas e por me apresentar
Jerusa um verdadeiro anjo sem a qual seria inviaacutevel as anaacutelises de consumo
alimentar
Agrave amiga e companheira de trajetoacuteria Aline Teixeira pela preciosa colaboraccedilatildeo nas
anaacutelises estatiacutesticas e por ser minha dupla imbatiacutevel
Ao amigo-irmatildeo Filipe Bezerra pela preciosa contribuiccedilatildeo nas adaptaccedilotildees das
ilustraccedilotildees e pela honra de sua amizade
Ao melhor grupo de pesquisa que jaacute sonhei fazer parte pelos ensinamentos e amizade
incondicional Juntos somos uma famiacutelia obrigada meus amigos
Agrave todos os amigos que passaram pelo aptdeg 63 ao longo desses anos vocecircs foram
fundamentais em todos os momentos dessa jornada
Aos funcionaacuterios do ICB II indispensaacuteveis no meu dia a dia pelo apoio amizade cafeacutes
e carinho
Agrave meus amigos-irmatildeos e suas respectivas famiacutelias por me ensinarem que amizade eacute o
sentimento que imanta as almas suave expressatildeo do ser que necessita intercambiar as
forccedilas da emoccedilatildeo sob os estiacutemulos do entendimento fraternal inspiradora de coragem
e de abnegaccedilatildeo que enfloresce as almas abenccediloando-as com resistecircncias para as
lutas Amo vocecircs gratidatildeo
Agrave todos que cruzaram meu caminho nesta jornada e que trouxeram consigo
ensinamentos que me transformaram em algueacutem melhor que outrora o meu muito
obrigada
Soacute o conhecimento vivido
O conhecimento de dentro para fora
Aquele que natildeo eacute aprendido nos livros nem na fria observaccedilatildeo
do fino repoacuterter de faro infaliacutevel
Soacute aquele conhecimento que se viveu dia a dia minuto a minuto
no erro e no acerto ()
Possibilita a criaccedilatildeo
Jorge Amado
18
RESUMO
SANTOS V M Avaliaccedilatildeo da participaccedilatildeo dos micro-organismos da Classe Mollicutes na microbiota intestinal de mulheres eutroacuteficas e obesas 2015 147 f Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Microbiologia) ndash Instituto de Ciecircncias Biomeacutedicas Universidade de Satildeo Paulo Satildeo Paulo 2015
A obesidade possui causas multifatoriais sendo caracterizada como um excesso de gordura
corporal acumulada no tecido adiposo causando impactos agrave sauacutede Estudos quanto agrave interaccedilatildeo
geneacutetica do indiviacuteduo com o ambiente mostram que alguns indiviacuteduos satildeo mais propensos ao ganho
de peso do que os outros em ambientes similares Satildeo muitas as evidecircncias de que o metabolismo
da microbiota intestinal facilita a extraccedilatildeo de calorias da dieta ajudam a estocaacute-las no tecido
adiposo aleacutem de prover energia e nutrientes para o crescimento microbiano Nesse contexto a
ocorrecircncia e participaccedilatildeo dos Mollicutes na microbiota intestinal eacute praticamente desconhecida
sendo necessaacuterios portanto o desenvolvimento de estudos que avaliem as implicaccedilotildees e
relevacircncia desses microrganismos nas respostas adaptativas da microbiota intestinal humana
Deste modo o objetivo do presente estudo foi analisar a participaccedilatildeo dos micro-organismos da
Classe Mollicutes e dos Filos Firmicutes e Bacteroidetes na microbiota intestinal de mulheres
obesas e eutroacuteficas Para a realizaccedilatildeo do estudo a casuiacutestica foi de 20 mulheres diagnosticadas
com obesidade (IMCgt 30kgm2) e 20 mulheres em eutrofia (IMC entre 185 e 249 kgm2 Foram
obtidas amostras de fezes sangue Foi aplicado um questionaacuterio semiestruturado sobre fatores
relacionados com obesidade e possiacutevel associaccedilatildeo com microbiota intestinal e ambiente aleacutem de
avaliaccedilatildeo antropomeacutetrica atraveacutes de Bioimpedacircncia e questionaacuterio de frequecircncia alimentar
Desenvolveu-se um ensaio quantitativo por meio de TaqMan PCR para a detecccedilatildeo de Mollicutes
nas amostras de fezes A metodologia foi especiacutefica sensiacutevel reprodutiacutevel e gerou dados
quantitativos para a detecccedilatildeo desses microrganismos nas fezes humanas Constatou-se no
presente estudo que o grupo caso apresentou consumo energeacutetico inferior ao recomendado e que
ambos os grupos apresentaram consumo superior de gorduras saturadas e inferior de fibras Em
relaccedilatildeo a determinaccedilatildeo do estado nutricional os dois grupos se apresentaram acima da meacutedia
referecircncia indicando excesso de gordura corporal Na determinaccedilatildeo da microbiota intestinal
constatou-se uma diferenccedila estatisticamente significante entre as meacutedias do nuacutemero dos micro-
organismos da classe Mollicutes entre os grupos caso e controle Detectou-se uma associaccedilatildeo
positiva estatisticamente significante entre a presenccedila de Mollicutes e mulheres obesas (OR= 115
IC= 242-554) Na quantificaccedilatildeo da presenccedila dos Filos Firmicutes e Bacteroidetes e Bacteacuterias
totais na microbiota natildeo foram observadas diferenccedilas estatisticamente significantes quanto a sua
quantidade entre as mulheres do grupo caso e controle No entanto foi observada maior proporccedilatildeo
de FirmicutesBacteroidetes na microbiota intestinal das mulheres obesas em relaccedilatildeo agraves eutroacuteficas
do grupo controle Os resultados obtidos permitiram obter evidecircncias importantes da participaccedilatildeo
dos micro-organismos da classe Mollicutes As alteraccedilotildees da microbiota intestinal tambeacutem
contribuiacuteram na definiccedilatildeo de subconjuntos de indiviacuteduos com diferentes perfis de risco metaboacutelico e
a da heterogeneidade associada a fenoacutetipos humanos relacionados com a adiposidade
Palavras-chave Obesidade Microbiota intestinal Mollicutes qPCR
ABSTRACT
SANTOS V M Evaluation of Mollicutes microorganismrsquos participation in the gut microbiota of obese and normal weight women 2015 147 p Masters thesis (Microbiology) ndash Instituto de Ciecircncias Biomeacutedicas Universidade de Satildeo Paulo Satildeo Paulo 2015
Obesity has multifactorial causes and it is characterized as an excess of corporal fat accumulated in adipose tissue causing health impacts Studies on the genetic interaction of the individual with the environment shows that some individuals are more prone to weight gain than others in similar environments There are many evidences that the gut microbiota metabolism facilitates the harvest of energy derived from ingested nutrients it help to store them in adipose tissue and provide energy and nutrients for microbial growth In this context the occurrence and participation of Mollicutes in the gut microbiota is pratically unknown requiring the development of studies to evaluate the implications and relevance of these microorganisms in the adaptive responses of the human gut microbiota Thus the aim of this study was to analyze the participation of the Class Mollicutes and Firmicutes and Bacteroidetes phylos in the gut microbiota of obese and normal weight women For the study it was collected samples of 20 women diagnosed with obesity (BMIgt 30 kg m2) and 20 women of normal weight (BMI between 185 and 249 kg m2) it was collected stool samples blood semi-structured questionnaire on etiological factors predisposing and associated with obesity and possible association with gut microbiota and the environment and anthropometric measurements using bioelectrical impedance A quantitative assay was developed through of TaqMan PCR for the detection of Mollicutes in stool samples from patients with the methodology specific sensitive reproducible and quantitative for the detection of these microorganisms in human stools It was found in this study that the case group had a lower energy consumption than recommended and that both groups had a higher intake of saturated fats and less fiber For determining the nutritional status of the two groups presented above average reference indicating excess body fat Regarding the determination of the intestinal microbiota of the study population there was a statistically significant difference between the mean of microorganisms of Mollicutes class between the case and control groups And it was detected a statistically significant positive association between the presence of Mollicutes and obese women (OR = 115 CI = 242 to 554) Regarding the analysis about the participation of phylos Firmicutes and Bacteroidetes and total bacteria in the microbiota of the study population no statistically significant differences observed for the microbial amount among women of the case and control group However there was a higher proportion of Firmicutes Bacteroidetes the gut microbiota of obese women compared to the control group normal weight women Analysis of the results provide important evidence about the participation of almost unknown Mollicutes class in the gut microbiota of the population studied as well as changes and interactions in intestinal microbiota can define subsets of individuals with different metabolic risk profiles and thus contribute to investigation of the heterogeneity associated phenotypes related to adiposity
Keywords Obesity Gut microbiota Mollicutes qPCR
LISTA DE ABREVIATURAS SIGLAS E SIacuteMBOLOS
A ndash Adenina
AEAndash N-araquidonoil etanolamina anandamida
AFndash Niacutevel de atividade fiacutesica
AGCCndash Aacutecidos graxos de cadeia curta
AgRPndash Peptiacutedeo Relacionado ao Agouti
AIDSndash Siacutendrome da imunodeficiecircncia adquirida
AIndash Adequate Intake
AMPndash Adenosina monofosfato
AMPKndash Adenosina proteiacutena quinase
AMPsndash Peptiacutedeos antimicrobianos bacterianos
APC ndash Ceacutelula apresentadora de antiacutegeno
APRILLndash Ligante indutor de proliferaccedilatildeo
atm ndash Atmosfera
ATP ndash Adenosina tri-fosfato
C ndash Citosina
C+G ndash Conteuacutedo citosina e guanina
Cb-1ndash Receptores canabinoacuteides
CCKndash Colecistocinina
CH4ndash Metano
CHOsndash Carboidratos
ChREBP ndash Carbohydrate response element-binding protein
CO2 ndash Gaacutes carbocircnico
CPT1ndash Carnitina palmitoil transferase 1
Ct ndash Cycle Treshold (Sinal de fluorescecircncia que pode ser
detectado)
CV ndash Coeficiente de variaccedilatildeo
DAG lipasendash sn-1-diacilglicerol lipase seletiva
DCs ndash Ceacutelulas Dendriacuteticas
DNA ndash Aacutecido Desoxirribonucleico
DRI ndash Dietary References Intakes
DP ndash Desvio padratildeo
dNTP ndash Deoxinucleotiacutedeo trifosfato
EAR ndash Estimated Average Requirements
EDTA ndash Aacutecido Etilenodiamino Tetra-aceacutetico
ELISA ndash Enzyme-Linked Immunoabsorbent Assay
EIndash Enzimas citoplasmaacuteticas do sistema PTS
EPIndash Equipamento de Proteccedilatildeo Individual
EROndash Espeacutecies reativas de oxigecircnio
FAAHndash Fatty acid amide hydrolase
FABFndash Fator de ativaccedilatildeo de ceacutelulas β
FFARndash Free fatty acids receptors
FIAFndash Fasting Induced Adipocyte Factor
g ndash Gramas
G ndash Guanina
GERndash Gasto energeacutetico de repouso
GETndash Gasto energeacutetico total
GLP-1ndash Peptiacutedeo semelhante ao glucagon
GPRndash Receptor acoplado agrave proteiacutena G
H2ndash Hidrogecircnio
HDLndash Lipoproteiacutena de alta densidade
HPRndash Enzimas citoplasmaacuteticas do sistema PTS
IBGEndash Instituto brasileiro de Geografia e Estatiacutestica
IC ndash Intervalo de Confianccedila
IECsndash Ceacutelulas epiteliais intestinais)
IFN-α ndash Interferon α
IFN-β ndash Interferon β
IFN-γ ndash Interferon gama
IgA ndash Imunoglobulina A
IL ndash Interleucina
IL-10 ndash Interleucina 10
IL-1β ndash Interleucina 1Beta
IL-25 ndash Interleucina 25
IL-33 ndash Interleucina 33
IL-6 ndash Interleucina 6
IMC ndash Iacutendice de massa corporal
IPAQ ndash International Physical Activity Questionnaire
kgndash Quilogramas
Kpb ndash Kilopares de bases
LPLndash Lipase lipoproteacuteica
LPSndash Lipopolissacariacutedeos
MAGndash Monoacilglicerol lipase
MAMPsndash Padrotildees moleculares associados agrave micro-organismos
MC4R ndash Receptor da Melanocortina 4
MDa ndash Megadaltons
mg ndash Miligramas
min ndash Minuto
mL ndash Mililitro
mm ndash Miliacutemetro
mM ndash Milimolar
mRNAndash RNA mensageiro
MSndash Ministeacuterio da Sauacutede
NAPE-PLDndash N-acil fostatidiletanolamida-fosfolipase D seletiva
NF-KBndash Fator nuclear Kappa B
NK ndash Natural Killers
nm ndash Nanocircmetro
NODndash Receptores de domiacutenio de digomerizaccedilatildeo de ligaccedilatildeo de
nucleotiacutedeos
NPYndash Neuropeptiacutedeo Y
ordm C ndash Graus Celsius
OMS (WHO) ndash Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede
OR ndash Odds Ratio
pb ndash Pares de base
PC1 ndash Proacute-hormocircnio Convertase 1
PCR ndash Reaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase
PGC-1ndash Peroxisome proliferator-activated receptor-gamma
coactivator 1 alpha
PGCndash Porcentagem de gordura corporal
pH ndash Potencial de hidrogecircnio iocircnico
pmol ndash Picomol
POFndash Pesquisa dos Orccedilamentos Familiares
POMCndash Proacute-oacutepio melanocortina
PPARndash Receptor Ativado por Proliferadores de Peroxissoma
PPI ndash Perda de peso intencional
PPLO ndash Pleuropneumonia-like Organisms
PTSndash Sistema fosfotransferase
PYYndash Peptiacutedeo tirosina-tirosina
QFAndash Questionaacuterio de frequecircncia alimentar
qPCR ndash PCR quantitativa ou PCR em tempo real
r2 ndash R da curva
RA ndash Aacutecido retinoacuteico
RCQndash Relaccedilatildeo cintura-quadril
REGIIIβndash Proteiacutenas antimicrobianas intestinais
REGIIIγndash Proteiacutenas antimicrobianas intestinais
RNA ndash Aacutecido ribonucleacuteico
rpm ndash Rotaccedilotildees por minuto
rRNA ndash RNA ribossocircmico
s ndash Segundo
SNCndash Sistema nervoso central
SREBP-1ndash Liver sterol response element binding protein type-1
SOCS-1 ndash Proteiacutenas supressora da sinalizaccedilatildeo de citocina-1
SOCS-3 ndash Proteiacutenas supressora da sinalizaccedilatildeo de citocina-3
T ndash Timina
TAndash Tecido adiposo
TCLE ndash Termo de Consentimento Livre e Esclarecido
TGF-β ndash Fator de crescimento tumoral-β
TGIndash Trato gastrintestinal
TLR ndash Toll-like receptor
TMndash Tecido muscular
TMBndash Taxa de metabolismo basal
TNF-α ndash Fator de Necrose Tumoral alfa
Tregndash Ceacutelulas T regulatoacuterias
tRNA ndash RNA transportador
TSLPndash Linfopoietina estromal tiacutemica
U ndash Unidade
UFC ndash Unidade Formadora de Colocircnia
UFCmicroL ndash Unidade Formadora de Colocircnia por microlitro
USDAndash United States Departament of Agriculture
VETndash Valor energeacutetico Total
X ndash Vezes
ZO-1ndash Zocircnula de oclusatildeo-1
α ndash Alfa
β ndash Beta
χ2 ndash Teste Qui-quadrado
ndash Por cento
microL ndash Microlitro
microm ndash Microcircmetros
microms ndash Microcircmetros por segundo
2-AGndash 2-araquidonoil glicerol
IacuteNDICE DE FIGURAS
Figura 1 ndash Fatores envolvidos no estabelecimento da microbiota humana ao longo da
vida 37
Figura 2 ndash Interaccedilatildeo funcional entre a microbiota intestinal humana e o sistema
imunoloacutegico 42
Figura 3 ndash Doenccedilas influenciadas pelo metabolismo microbiano
intestinal46
Figura 4 ndash Crescimento de M hominis em meio SP4 com a produccedilatildeo de colocircnia em
forma de ldquoovo fritordquo (aumento 40X) 55
Figura 5 ndash Comparaccedilatildeo entre as meacutedias de consumo de macronutrientes dos Grupos
Caso e Controle com a Faixa de Distribuiccedilatildeo Aceitaacutevel de macronutrientes (AMDRDRI)
e AI (Adequate Intake) para a faixa etaacuteria de 20 a 70 anos Satildeo Paulo SP 2013-
201484
Figura 6 ndash Comparaccedilatildeo entre as meacutedias de consumo das Vitaminas A C E e folato
dos Grupos Caso e Controle com a Faixa de Distribuiccedilatildeo Aceitaacutevel de macronutrientes
(AMDRDRI) e AI (Adequate Intake) para a faixa etaacuteria de 20 a 70 anos Satildeo Paulo
SP 2013-201485
Figura 7 ndash Comparaccedilatildeo entre as meacutedias de consumo das Vitaminas B1 B2 B6 B12
D Niacina e Aacutecido pantotecircnico dos Grupos Caso e Controle com a Faixa de
Distribuiccedilatildeo Aceitaacutevel de macronutrientes (AMDRDRI)e AI (Adequate Intake) para a
faixa etaacuteria de 20 a 70 anos Satildeo Paulo SP 2013-201486
Figura 8 ndash Comparaccedilatildeo entre as meacutedias de consumo de Sais Minerais dos Grupos
Caso e Controle com a Faixa de Distribuiccedilatildeo Aceitaacutevel de macronutrientes
(AMDRDRI)e AI (Adequate Intake) para a faixa etaacuteria de 20 a 70 anos Satildeo Paulo SP
2013-2014 87
Figura 9 ndash Comparaccedilatildeo entre as meacutedias de consumo de Sais Minerais e outros
nutrientes dos Grupos Caso e Controle com a Faixa de Distribuiccedilatildeo Aceitaacutevel de
macronutrientes (AMDRDRI)e AI (Adequate Intake) para a faixa etaacuteria de 20 a 70
anos Satildeo Paulo SP 2013-2014 87
Figura 10ndash Curva-padratildeo gerada a partir dos pontos de Ct obtidos com o graacutefico de
amplificaccedilatildeo de diluiccedilotildees seriadas do controle positivo Mycoplasma hominis calculado
pelo software StepOne 21 (Applied Biosystems Life Technologies Corporation) Satildeo
Paulo SP 2013-201490
Figura 11 ndash Quantificaccedilatildeo por qPCR de Mollicutes (UFCmicrol) a partir das amostras de
fezes nos grupos caso e controle Satildeo Paulo SP 2013-2014 92
Figura 12 ndash Quantificaccedilatildeo por qPCR de Firmicutes Bacteroidetes e Eubacterias
(UFCmicrol) a partir das amostras de fezes nos grupos caso e controle Satildeo Paulo SP
2013-201493
Figura 13 ndash Quantificaccedilatildeo de IL-1β IL-10 IL17-A e TNF-α (pgmL) no plasma
sanguiacuteneo por meio do ELISA nos grupos caso e controle da populaccedilatildeo estudada
Satildeo Paulo SP 2013-201496
IacuteNDICE DE QUADROS
Quadro 1 ndash Criteacuterios utilizados na estimativa da frequecircncia diaacuteria de consumo dos
alimentos incluiacutedos no Questionaacuterio de Frequecircncia Alimentar 61
Quadro 2 ndash Sequecircncias dos iniciadores utilizados para amplificaccedilatildeo do gene 16S rRNA
para Mollicutes 66
Quadro 3 ndash Sequecircncias dos iniciadores utilizados para amplificaccedilatildeo do gene 16S rRNA
para Firmicutes Bacteroidetes e Bacteacuterias Totais69
IacuteNDICE DE TABELAS
Tabela 1 ndash Determinaccedilatildeo do perfil da populaccedilatildeo estudada referente agrave Seccedilatildeo 1 Dados
socioeconocircmicos Satildeo Paulo SP 2013-201472
Tabela 2 ndash Determinaccedilatildeo do perfil da populaccedilatildeo estudada referente agrave Seccedilatildeo 2 Histoacuteria
Familiar Satildeo Paulo SP 2013-201472
Tabela 3 ndash Determinaccedilatildeo do perfil da populaccedilatildeo estudada referente agrave Seccedilatildeo 3 Histoacuteria
Cliacutenica Satildeo Paulo SP 2013-2014 73
Tabela 4 ndash Determinaccedilatildeo do perfil da populaccedilatildeo estudada referente agrave Seccedilatildeo 4 Histoacuteria
Obsteacutetrica Satildeo Paulo SP 2013-2014 74
Tabela 5 ndash Determinaccedilatildeo do perfil da populaccedilatildeo estudada referente agrave Seccedilatildeo 5 Histoacuteria
Ginecoloacutegica Satildeo Paulo SP 2013-2014 75
Tabela 6 ndash Determinaccedilatildeo do perfil da populaccedilatildeo estudada referente agrave Seccedilatildeo 6
Consumo atual de tabaco Satildeo Paulo SP 2013-2014 75
Tabela 7ndash Determinaccedilatildeo do perfil da populaccedilatildeo estudada referente agrave Seccedilatildeo 7
Consumo atual de aacutelcool Satildeo Paulo SP 2013-2014 76
Tabela 8 ndash Tabela de determinaccedilatildeo do perfil da populaccedilatildeo estudada referente agrave Seccedilatildeo
8 Atividade Fiacutesica (IPAQ versatildeo curta) Satildeo Paulo SP 2013-2014 76
Tabela 9 ndash Tabela de determinaccedilatildeo do perfil da populaccedilatildeo estudada referente agrave Seccedilatildeo
9 Mudanccedilas recentes nos haacutebitos alimentares Satildeo Paulo SP 2013-2014 77
Tabela 10 ndash Participaccedilatildeo dos alimentos nos grupos meacutedias de consumo por dia dos
alimentos consumidos pela populaccedilatildeo estudada Satildeo Paulo SP 2013-2014 144
Tabela 11 ndash Definiccedilatildeo dos grupos alimentares derivados do Questionaacuterio de Frequecircncia
Alimentar (QFA) e percentual de consumo da populaccedilatildeo estudada Satildeo Paulo SP
2013-201479
Tabela 12 ndash Anaacutelise de consumo de energia e nutrientes da populaccedilatildeo estudada Satildeo
Paulo SP 2013-2014 81
Tabela 13 ndash Comparaccedilatildeo das variaacuteveis dieteacuteticas relacionadas agraves razotildees de ingestatildeo e
Valor Energeacutetico Total (VET) da populaccedilatildeo estudada Satildeo Paulo SP 2013-2014 83
Tabela 14 ndash Comparaccedilatildeo de variaacuteveis antropomeacutetricas da populaccedilatildeo estudada 89
Tabela 15 ndash Repetibilidade intra-ensaio e inter-ensaio da qPCR para Mollicutes Satildeo
Paulo SP 2013-2014 91
Tabela 16 ndash Comparaccedilatildeo entre os resultados obtidos no teste de sensibilidade pelas
teacutecnicas de PCR convencional e qPCR para detecccedilatildeo de Mollicutes Satildeo Paulo SP
2013-201491
Tabela 17 ndash Nuacutemero meacutedio de coacutepias e percentual dos grupos Mollicutes estudados
frente ao Filo Firmicutes na populaccedilatildeo estudada Satildeo Paulo SP 2013-2014 94
Tabela 18 ndash Nuacutemero meacutedio de coacutepias e percentual dos grupos de bacterianos
estudados frente agraves bacteacuterias totais na populaccedilatildeo estudada Satildeo Paulo SP 2013-
201495
Tabela 19 ndash Proporccedilatildeo de Firmicutes em relaccedilatildeo agrave Bacteroidetes na populaccedilatildeo
estudada Satildeo Paulo SP 2013-201495
SUMAacuteRIO
1 INTRODUCcedilAtildeO 26
2 REFERENCIAL TEOacuteRICO 29
21 Obesidade 29
22 Microbiota Intestinal 31
221 Microbiota intestinal uma peccedila chave na sauacutede e na doenccedila31
222 Colonizaccedilatildeo e composiccedilatildeo da microbiota intestinal32
223 Fatores que influenciam a composiccedilatildeo da microbiota intestinal 34
2231 Fases da vida 34
2232 Tipo de parto 34
2233 Tipo de aleitamento 35
2234 Uso de antibioacutetico 35
2235 Dieta 36
224 Microbiota intestinal e a fisiologia do hospedeiro 38
2241 Nutriccedilatildeo e Metabolismo 38
2242 Proteccedilatildeo 39
22421 Competiccedilatildeo direta de nutrientes 39
22422 Imunomodulaccedilatildeo 40
2243 Funccedilatildeo Troacutefica 43
2244 Regulaccedilatildeo da adiposidade 43
225 Microbiota intestinal e disbiose44
226 Microbiota Intestinal e obesidade47
227 Mecanismos pelos quais a microbiota intestinal contribui para a obesidade49
2271 Extraccedilatildeo de energia adicional da dieta49
2272 Induccedilatildeo da inflamaccedilatildeo por meio da alteraccedilatildeo da permeabilidade intestinal51
23 MOLLICUTES 52
231 Caracteriacutesticas Gerais dos Mollicutes52
232 Mollicutes Microbiota Intestinal e Obesidade56
3 OBJETIVOS 58
31 Objetivo geral 58
32 Objetivos especiacuteficos 58
4 MATERIAL E MEacuteTODOS 59
41 Protocolo do estudo 59
42 Casuiacutestica 59
43 Delineamento experimental 60
44 Determinaccedilatildeo do estado nutricional 60
441 Avaliaccedilatildeo qualitativa do consumo alimentar 60
442 Avaliaccedilatildeo antropomeacutetrica do estado nutricional 62
4421 Anaacutelise da Composiccedilatildeo Corporal pelo Meacutetodo de Bioimpedacircncia 63
45 Coleta das amostras cliacutenicas 64
46 Determinaccedilatildeo da microbiota intestinal 65
461 Padronizaccedilatildeo de reaccedilatildeo de PCR quantitativo (qPCR) por meio de TaqMan para a detecccedilatildeo de
Mollicutes 65
4611 Cepas bacterianas e condiccedilotildees de cultura 65
4612 Desenvolvimento de primers e sonda para a detecccedilatildeo de Mollicutes pela PCR quantitativa 65
4613 PCR quantitativa 66
4614 Especificidade da qPCR e repetibilidade intra e inter-ensaios 67
462 Reaccedilatildeo em cadeia da polimerase (PCR) convencional 68
463 Detecccedilatildeo de micro-organismos dos filos Firmicutes e Bacteroidetes e bacteacuterias totais (Eubacterias)
por PCR em tempo Real (qPCR) 68
47 Dosagem de citocinas do soro sanguiacuteneo 69
48 Anaacutelises Estatiacutesticas 70
5 RESULTADOS 71
51 Perfil da populaccedilatildeo estudada 71
52 Determinaccedilatildeo do estado nutricional 78
521 Avaliaccedilatildeo qualitativa do consumo alimentar 78
522 Avaliaccedilatildeo antropomeacutetrica do estado nutricional 88
53 Determinaccedilatildeo da microbiota intestinal 90
531 Padronizaccedilatildeo de reaccedilatildeo de PCR quantitativo (qPCR) por meio de TaqMan para a detecccedilatildeo de
Mollicutes 90
532 Detecccedilatildeo de micro-organismos dos filos Firmicutes e Bacteroidetes aleacutem de bacteacuterias totais
(Eubacterias) por PCR em tempo Real (qPCR) 93
54 Dosagem de citocinas do soro sanguiacuteneo 96
6 DISCUSSAtildeO 97
7 CONCLUSOtildeES 107
REFEREcircNCIAS 108
APEcircNDICE A ndash TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO 127
APEcircNDICE B ndash QUESTIONAacuteRIO 131
APEcircNDICE C- TABELA 10 143
26
1 INTRODUCcedilAtildeO
A obesidade eacute definida pela Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede (WHO 2002)
como o excesso de gordura corporal acumulada no tecido adiposo com implicaccedilotildees
para a sauacutede Algumas estimativas globais recentes indicam que em 2013 mais de
600 milhotildees da populaccedilatildeo mundial adulta (com 18 anos ou mais) eram obesos com
11 dos homens e 15 das mulheres (MARIE 2014) No Brasil em 2014 estimou-
se que na populaccedilatildeo adulta (20 anos ou mais) 105 milhotildees satildeo obesos com 124
dos homens e 169 das mulheres (IBGE 2014) Nesse contexto atualmente a
obesidade estaacute entre os maiores problemas de sauacutede puacuteblica e distuacuterbio da nutriccedilatildeo
A obesidade eacute considerada atualmente uma epidemia (BACON APHRAMOR 2011
OLSHANSKY et al 2005) As alteraccedilotildees nos padrotildees dieteacuteticos e nutricionais da
populaccedilatildeo brasileira tecircm sido analisadas no processo da transiccedilatildeo nutricional (KAC
VELAacuteSQUEZ-MELEacuteNDEZ 2003)
Neste processo verificou-se que ocorreu inversatildeo nos padrotildees de distribuiccedilatildeo
das alteraccedilotildees nutricionais A alta incidecircncia de sobrepeso e obesidade na
populaccedilatildeo implica no aumento da ocorrecircncia de doenccedilas cardiovasculares cacircncer
diabetes mellitus e hipertensatildeo arterial (AMUNA ZOTOR 2008 ARAI et al 2009
DUNCAN et al 1993 GIGANTE et al 1997 JIRTLE SKINNER 2007 KAC
VELAacuteSQUEZ-MELEacuteNDEZ 2003 LESSA 1998 MONDINI MONTEIRO 1998
POPKIN et al 2006) Na obesidade ocorre basicamente o balanccedilo energeacutetico
positivo cuja patogecircnese natildeo estaacute completamente elucidada estando associada a
fatores comportamentais culturais e bioloacutegicos A regulaccedilatildeo do balanccedilo energeacutetico e
do estoque de energia corporal satildeo influenciados pela susceptibilidade individual e
seu contexto social e econocircmico demograacutefico cultural educacional ambiental e
familiar aleacutem de fatores hormonais e de heranccedila geneacutetica (GORAN 2000 VEIGA
SICHIERI 2006)
O mapa gecircnico da obesidade humana estaacute constantemente em mudanccedila pela
identificaccedilatildeo de novos genes e regiotildees cromossocircmicas associadas com a
obesidade As alteraccedilotildees do comportamento alimentar e os haacutebitos sedentaacuterios
indicam ser os principais fatores de interferecircncia nos genes de susceptibilidade a
obesidade e consequentemente no aumento da obesidade mundial Eacute provaacutevel
27
portanto que a obesidade ocorra como a resultante de fatores poligecircnicos
complexos e um ambiente obesogecircnico (dieta e sedentarismo) (BAJZER SEELEY
2006 BOUCHARD 2000 CANI et al 2007 DERAM VILLARES 2009 DUNCAN et
al 2008 TURNBAUGH et al 2009)
A captaccedilatildeo de energia pode justificar em parte o metabolismo de alguns
pacientes obesos que natildeo apresentam ingestatildeo alimentar excessiva sugerindo que
a microbiota intestinal pode predispor o indiviacuteduo agrave obesidade (BACKHED 2004)
Alguns estudos tecircm demonstrado que o desenvolvimento da obesidade em
humanos pode ser determinado pelas proporccedilotildees relativas de dois filos principais de
bacteacuterias da microbiota intestinal humana Bacteroidetes e Firmicutes que diferem
consideravelmente entre indiviacuteduos eutroacuteficos e obesos (DUNCAN et al 2008 LEY
et al 2005 2006 TENNYSON FRIEDMAN 2008) Estudos comparativos
mostraram que ratos obesos possuem significativamente niacuteveis mais baixos de
micro-organismos do Filo Bacteroidetes e niacuteveis mais elevados de Firmicutes Este
uacuteltimo estaacute associado com um aumento de absorccedilatildeo de energia da dieta
(BACKHED 2004 CANI DELZENNE 2009 DIBAISE et al 2012 LEY et al 2005
RAOULT 2008 TURNBAUGH et al 2006) Turnbaugh et al (2008) obtiveram
resultados semelhantes em ratos com obesidade induzida por dieta Curiosamente
embora as alteraccedilotildees nos niacuteveis de Firmicutes e Bacteroidetes foram observadas
nos camundongos obesos por dieta induzida a diferenccedila foi relacionada
principalmente as bacteacuterias da classe dos Mollicutes
As espeacutecies do Filo Bacteriodetes pertencem agrave microbiota intestinal humana e
animal Estas bacteacuterias satildeo bacilos ou cocobacilos gram-negativos anaeroacutebios
obrigatoacuterios heterotroacuteficos mesoacutefilos sacaroliacuteticos natildeo formadores de esporos
imoacuteveis Satildeo resistentes agrave bile natildeo produzem pigmentos Tecircm como principais
produtos finais do metabolismo da glicose os aacutecidos succiacutenico e aceacutetico
(JOHANSSON PETTERSON 2002 MANILOFF 2002) O Filo Firmicutes
encontrado em maior proporccedilatildeo no trato gastrintestinal humano satildeo micro-
organismos Gram positivos na maioria Na classificaccedilatildeo atual o filo divide-se
tipicamente em trecircs classes Bacilli - aeroacutebios facultativos ou obrigatoacuterios Clostridia -
organismos anaeroacutebios e Erysipelotrichia Mollicutes eacute a uacutenica classe do filo
Tenericutes anteriormente classificada dentro do filo Firmicutes (BERGEYrsquos 2009
2010 LUDWIG KLENK 2001 RAZIN et al 1998)
28
Os estudos das interaccedilotildees de Bacteroidetes e Firmicutes na microbiota
intestinal e sua associaccedilatildeo com a obesidade tecircm aumentado No entanto a
participaccedilatildeo dos Mollicutes eacute praticamente desconhecida O gecircnero Mycoplasma foi
introduzido em 1929 para designar micro-organismos atualmente classificados
como membros da famiacutelia Mycoplasmataceae ordem Mycoplasmatales da classe
dos Mollicutes (Mollis = mole cuacutetis = pele) (RAZIN 1992) Os Mollicutes possuem
um genoma pequeno sendo que algumas espeacutecies apresentam o menor genoma
entre os procariotos e em consequecircncia apresentam metabolismo reduzido
(MILES NICHOLAS 1998 NEIMARK 1986 RAZIN TULLY 1983) Distinguem-se
de outros procariotos pela simplicidade celular genoma e metabolismo reduzido A
ausecircncia natural da parede celular confere resistecircncia aos antibioacuteticos beta-
lactamicos Incluem-se as sulfas e rimfapicina respectivamente pela ausecircncia da
siacutentese de aacutecido foacutelico e possuir uma polimerase diferente Com aproximadamente
200 espeacutecies estes micro-organismos infectam humanos animais insetos e
plantas Considerados em geral como oportunistas por excelecircncia colonizam
ldquopreferencialmenterdquo a superfiacutecie de mucosas de mamiacuteferos mas tecircm potencial de
causar infecccedilotildees sistecircmicas dependendo do hospedeiro (DYBVIG 1990 RAZIN
YOGEV NAOT 1998)
29
2 REFERENCIAL TEOacuteRICO
21 Obesidade
A prevalecircncia da obesidade tem crescido rapidamente e representa um dos
principais desafios de sauacutede puacuteblica neste seacuteculo A Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede
(OMS) estima que pelo menos 28 milhotildees de pessoas morrem em decorrecircncia da
obesidade (IMC ge 30 kgm2) A prevalecircncia mundial quase duplicou entre 1980 e
2008 com uma transiccedilatildeo de 5 dos homens e 8 das mulheres em 1980 para
10 dos homens e 14 das mulheres (WHO 2014) A obesidade pode ser definida
como o grau de armazenamento de gordura no organismo associada ao ganho
excessivo de peso corporal total Eacute portanto considerada uma doenccedila crocircnica
podendo acarretar em consequecircncias para a sauacutede devido agraves suas relaccedilotildees com
diversas complicaccedilotildees metaboacutelicas (MS 2006)
A pesquisa dos Orccedilamentos Familiares (POF IBGE 2010) nos uacuteltimos seis
anos indicou que a frequecircncia de pessoas com excesso de peso aumentou em mais
de um ponto percentual ao ano Desta maneira em dez anos o excesso de peso
poderia alcanccedilar dois terccedilos da populaccedilatildeo adulta do Brasil magnitude idecircntica agrave
encontrada na populaccedilatildeo dos Estados Unidos Estimativas de inqueacuteritos nacionais e
internacionais das uacuteltimas deacutecadas indicam que a obesidade em 2025 alcance 40
da populaccedilatildeo nos EUA 30 na Inglaterra e 20 no Brasil (HU 2008)
O excesso de peso e a obesidade na populaccedilatildeo expressam essencialmente
o desequiliacutebrio entre ingestatildeo e utilizaccedilatildeo de calorias A justificativa estaacute na
mudanccedila dos padrotildees de alimentaccedilatildeo e de atividade fiacutesica Em 2002-2003 revelou-
se tendecircncia crescente de substituiccedilatildeo de alimentos baacutesicos e tradicionais na dieta
brasileira (como arroz feijatildeo e hortaliccedilas) por bebidas e alimentos industrializados
(como refrigerantes biscoitos carnes processadas e comida pronta) Caracteriza-se
portanto o aumento na densidade energeacutetica das refeiccedilotildees e padrotildees de
alimentaccedilatildeo capazes de comprometer a auto-regulaccedilatildeo do balanccedilo energeacutetico dos
indiviacuteduos e aumentar o risco de obesidade (LEVY-COSTA et al 2005)
Aleacutem disto em consequecircncia agrave obesidade tem sido observado aumento
consideraacutevel da prevalecircncia de doenccedilas crocircnicas natildeo transmissiacuteveis como doenccedilas
cardiovasculares cacircncer diabetes mellitus e hipertensatildeo arterial Pelo longo tempo
30
de evoluccedilatildeo destas doenccedilas ocorrem lesotildees irreversiacuteveis de intensidade variada
resultando no aumento de incapacidade ou oacutebito vecircm ocupando um maior espaccedilo
no perfil de morbimortalidade de populaccedilotildees latino americanas (DUNCAN et al 1993
LESSA 1998) Em importante estudo entre 1958 e 1951 envolvendo cinco mil
indiviacuteduos de 35 a 75 anos por periacuteodo de ateacute 44 anos a obesidade (IMC gt 30Kgm2)
foi independentemente associada ao maior risco para hipertensatildeo (mulheres
RR=26 IC95 22-31) diabetes tipo 2 (mulheres RR=14 IC95 1-18) e doenccedila
cardiovascular mulheres RR=14 IC95 11-17) (WILSON et al 2002) Os ganhos
na diminuiccedilatildeo das taxas de tabagismo ao longo do seacuteculo XX e as expectativas no
aumento de tempo de vida podem ser neutralizadas pelas prespectivas do aumento
da obesidade (STEWART et al 2009) Especialmente em paiacuteses em
desenvolvimento como o Brasil o custo anual para o Sistema Uacutenico de Sauacutede para
atender as doenccedilas relacionadas ao sobrepeso eacute estimado em US$ 20152102171
(BAHIA et al 2012)
O ganho de peso ocorre pela menor utilizaccedilatildeo de gordura como fonte de
energia do que oxidar carboidratos elevando o coeficiente respiratoacuterio obtido
atraveacutes da razatildeo entre a produccedilatildeo de gaacutes carbocircnico resultante da oxidaccedilatildeo de
carboidratos e o consumo de oxigecircnio determinado atraveacutes de calorimetria (MARRA
et al 2004) Seis lesotildees monogecircnicas principais produzem desordens endoacutecrinas
que resultam na obesidade Deficiecircncia congecircnita de Leptina defeitos no receptor
de Leptina deficiecircncia no proacute-hormocircnio convertase 1(PC1) deficiecircncia em proacute-oacutepio-
melanocortina (POMC) defeitos no receptor da Melanocortina 4 (MC4R) e defeitos
no Receptor Ativado por Proliferadores de Peroxissoma (PPAR) O controle da
ingestatildeo alimentar a curto prazo eacute controlado principalmente por vias de
sinalizaccedilatildeo que emanam do trato gastrintestinal incluindo o peptiacutedeo orexiacutegenico
grelina que ativa os sinais de fome e os peptiacutedeos anorexigecircnicos
colecistoquinina (CCK) peptiacutedeo similar ao glucagon 1- glucagon-like peptide 1
(GLP-1) e peptiacutedeo tirosina-tirosina (PYY) que geram sinais de saciedade Para o
controle da ingestatildeo agrave longo prazo parecem ser primordiais os sinais que emanam a
partir do tecido adiposo (leptina) e pacircncreas (insulina) liberados em resposta agrave
ingestatildeo de alimentos e depoacutesitos de gordura corporal (KONTUREK et al 2004)
Tem sido amplamente documentado na literatura o reganho de peso
sucessivo agraves dietas pois sabe-se que cerca de um a dois terccedilos do peso perdido
31
tendem a ser recuperados no ano seguinte sendo a recuperaccedilatildeo quase total ao final
de cinco anos (GOODRICK et al 1996) A partir disso tem sido questionado o
efeito das dietas restritivas sobre a biologia humana e sua contribuiccedilatildeo para tornar a
obesidade uma condiccedilatildeo que possivelmente se autoperpetua e se agrava de
maneira progressiva Diversos trabalhos mostram que a ciclagem de peso (ou efeito
sanfona) pode aumentar a suscetibilidade para o ganho de massa corporal no
futuro (KORKEILA et al1999 NEUMARK-SZTAINER et al 2006 2007)
22 Microbiota Intestinal
221 Microbiota intestinal uma peccedila chave na sauacutede e na doenccedila
Nas deacutecadas passadas acreditava-se que todos os micro-organismos da
microbiota possuiacuteam potencial de causar infecccedilotildees O estudo da interaccedilatildeo entre
micro-organismos e o desenvolvimento de enfermidades eacute um tema crescente na
justificativa de certas doenccedilas (DETHLEFSEN et al 2007) O termo microbiota
refere-se ao conjunto de micro-organismos no hospedeiro sadio e o termo
microbioma eacute o conjunto de genes microbianos (BACKHED 2004 LANGA 2006
VRIEZE 2010) O estudo da diversidade e distribuiccedilatildeo da microbiota e sua interaccedilatildeo
com hospedeiro tem contribuiacutedo na justificativa de algumas doenccedilas (LEY et al
2008 VENTURA et al 2008) A microbiota do trato gastrintestinal humano eacute o
ecossistema mais complexo constituiacutedo por diversas espeacutecies de micro-organismos
As bacteacuterias constituem o grupo com maior diversidade e abundacircncia Assim como o
genoma de cada indiviacuteduo eacute uma impressatildeo digital a composiccedilatildeo da microbiota
intestinal tambeacutem parece ser (LEY et al 2006 RAJILIĆ-STOJANOVIĆ SMIDT DE
VOS 2007 XU GORDON 2003)
O comensalismo e a simbiose bacteriana refletem uma ldquocorrida dinacircmicardquo
que se inicia no encontro da bacteacuteria com o hospedeiro vulneraacutevel e prossegue com
respostas adaptativas entre os dois organismos Em alguns casos a coevoluccedilatildeo
atenua a virulecircncia e conduz a uma coexistecircncia paciacutefica com ou sem franca
codependecircncia Em outras circunstacircncias a relaccedilatildeo patogecircnica eacute mantida por meio
da superaccedilatildeo dos mecanismos de defesas inatas ou adaptativas do hospedeiro
pelas bacteacuterias (GORDON HOOPER 2001) Estima-se que a microbiota intestinal eacute
composta por mais de 1000 espeacutecies bacterianas O nuacutemero de ceacutelulas microbianas
32
no luacutemen intestinal eacute de 10 vezes maior que as ceacutelulas eucarioacuteticas do organismo
representando em torno de 1 kg de peso corporal (SCARPELLINI 2010) Aleacutem
disso o microbioma eacute 100 vezes maior que o genoma humano podendo-se assim
considerar a microbiota intestinal como um oacutergatildeo virtual exteriorizado
metabolicamente adaptaacutevel e flexiacutevel aleacutem de rapidamente renovaacutevel o que
contribui para metabolismo e desempenha importante papel na obtenccedilatildeo de energia
da dieta (FRANCcedilOIS-PIERRE 2009)
A microbiota intestinal eacute crucial para a vida humana com impacto na fisiologia
e na nutriccedilatildeo do hospedeiro (HATTORI TAYLOR 2008) Considera-se que
humanos satildeo ldquosuperorganismosrdquo com metabolismo mediado pelos atributos
humanos e microbianos (GILL et al 2006) O conceito de ldquosuperorganismordquo
representa importante mudanccedila de paradigma no entendimento da biologia humana
e pode ter impacto expressivo na prevenccedilatildeo e na terapia de doenccedilas no futuro
(NICHOLSON 2006)
222 Colonizaccedilatildeo e composiccedilatildeo da microbiota intestinal
O trato gastrintestinal fetal eacute considerado praticamente esteacuteril No nascimento
eacute rapidamente colonizado por micro-organismos da matildee e do ambiente hospitalar
(PALMER et al 2007) Sugere-se que de trecircs a quatro semanas apoacutes o nascimento
a microbiota intestinal comeccedila a se estabilizar aumentando gradualmente a sua
complexidade Apoacutes um ano assemelha-se agrave microbiota de um adulto (MACKIE et
al 1999 PALMER et al 2007 SCHEacuteLE et al 2013) Contrapondo-se agrave percepccedilatildeo
da ausecircncia de micro-organismos no feto demonstrou-se a presenccedila de DNA
bacteriano na placenta e no cordatildeo umbilical (JIMEacuteNEZ et al 2005 SATOKARI et
al 2009) Aleacutem disso a identificaccedilatildeo de algumas bacteacuterias no mecocircnio explica a
origem dos primeiros micro-organismos colonizadores do intestino antes mesmo do
nascimento possivelmente como um mecanismo adaptativo para o desenvolvimento
do intestino fetal fora do organismo materno (JIMEacuteNEZ et al 2008)
Os micro-organismos presentes no trato gastrintestinal podem ser autoacutectones
ou aloacutectones Linhagens autoacutectones tecircm longa associaccedilatildeo com o hospedeiro e
formam uma populaccedilatildeo estaacutevel de tamanho caracteriacutestico em uma regiatildeo do
intestino Os organismos aloacutectones satildeo adquiridos principalmente atraveacutes dos
alimentos ingeridos e do ecossistema oral Eacute difiacutecil determinar se um organismo eacute
33
um autoacutectone verdadeiro Contudo as bacteacuterias aloacutectones natildeo persistem no
ecossistema e satildeo detectaacuteveis apenas por um periacuteodo limitado (GORDON
HOOPER 2001 LEY et al 2006 WALTER 2008)
Os micro-organismos satildeo encontrados em todo o trato gastrintestinal no
entanto as mudanccedilas nas condiccedilotildees fisioloacutegicas implicam diferenccedilas na
composiccedilatildeo de micro-organismos nos diversos locais No trato gastrintestinal
inferior o fluxo do conteuacutedo torna-se mais lento e o ambiente conteacutem menos
substacircncias antimicrobianas favorecendo a colonizaccedilatildeo microbiana e o
estabelecimento de maior densidade de micro-organismos (QIN et al 2010
ZOETENDAL et al 2006) A partir da cavidade oral ao acircnus tem sido observado o
aumento da densidade microbiana no jejuno iacuteleo e no intestino grosso em
comparaccedilatildeo com o estocircmago e duodeno O coacutelon refere-se a um ecossistema
complexo com ampla diversidade microbiana e presenccedila de diversos gecircneros
bacterianos O pH neutro e a abundacircncia relativa de nutrientes como os
carboidratos natildeo digeriacuteveis e outros componentes alimentares que escapam do
processo digestivo tornam o coacutelon um ambiente favoraacutevel agrave proliferaccedilatildeo microbiana
O coacutelon eacute a regiatildeo do TGI que apresenta maior densidade microbiana podendo
alcanccedilar 1014UFCg-1 Dados tem mostrado que cada indiviacuteduo carrega mais de
1000 filotipos que representam mais de 7000 linhagens (AZAD et al 2013
ECKBURG et al 2005 FRANK et al 2007 HOLZAPFEL 2006 KLEEREBEZEM
VAUGHAN 2009 LEY et al 2008 QUIGLEY 2013 ZOETENDAL et al 2006)
Aproximadamente 99 dos genes identificados por metagenoma do intestino
humano satildeo bacterianos Na maioria dos indiviacuteduos cerca de 90 dos filos satildeo
Firmicutes e Bacteroidetes seguidos por Actinobacterias (famiacutelia Bifidobacteriaceae)
e Proteobacterias (famiacutelia Enterobacteriaceae) O filo mais abundante refere-se ao
Firmicutes apresentando como principais integrantes as classes Bacilli Clostridia e
Molicutes e dos Bacteroidetes as classes Bacteroides Flavobacteria e
Sphingobacterias Os filos Actinobacterias e Proteobacterias se apresentam em
menor proporccedilatildeo (ARUMUGAM et al 2011 DE FILIPPO et al 2010
HUTTENHOWER et al 2012 QIN et al 2010 QUIGLEY 2013 VILLANUEVA-
MILLAacuteN et al 2015 VRIEZE 2010 ZOETENDAL et al 2006)
34
223 Fatores que influenciam a composiccedilatildeo da microbiota intestinal
A microbiota do TGI humano eacute uma comunidade complexa cuja composiccedilatildeo
eacute inconstante diferindo inter e intra-individualmente definida por uma seacuterie de
fatores como geneacutetica do hospedeiro alimentaccedilatildeo sucessatildeo bacteriana funccedilatildeo
imune e estado de sauacutede (LEY et al 2008 EVERARD et al 2011 2014)
2231 Fases da vida
A diversidade bacteriana no intestino infantil eacute inicialmente muito baixa ateacute os
dois anos ao contraacuterio da microbiota de adulto (GAREAU et al 2010 HAJELA et al
2015) A baixa diversidade de bacteacuterias na primeira infacircncia inibe a maturaccedilatildeo
regular da microbiota intestinal e maturaccedilatildeo tardia da mucosa do sistema
imunoloacutegico implicando em riscos do aumento da resposta imune assim como
doenccedilas aleacutergicas Neste contexto envolve o desenvolvimento da toleracircncia oral e a
susceptibilidade da crianccedila a alergias e inflamaccedilatildeo A microbiota sofre portanto
mudanccedilas substanciais nos extremos da vida essas ramificaccedilotildees ainda estatildeo sendo
exploradas (AURELI et al 2011 HAJELA et al 2015 SHERIDAN et al 2014
SMITH et al 2013)
2232 Tipo de parto
A microbiota maternal eacute uma fonte de micro-organismos para a colonizaccedilatildeo do
TGI do receacutem-nascido As bacteacuterias residentes no canal vaginal e na regiatildeo perineal
tambeacutem ganham acesso ao TGI de receacutem-nascidos (BRY et al 1996 MACKIE et
al 1999) Ocorrem diferenccedilas entre o microbioma de um bebecirc receacutem-nascido por
parto normal em comparaccedilatildeo ao bebecirc receacutem-nascido por parto cesaacuterea No parto
vaginal o bebecirc eacute colonizado por bacteacuterias vaginais e fecais maternas cujas
composiccedilatildeo microbiana reflete a microbiota intestinal materna composta
predominantemente pelos gecircneros Lactobacillus Prevotella Atopobium e Sneathia
As amostras fecais de bebecircs nascidos de parto cesariana apresentaram gecircneros
tiacutepicos de microbiota da pele e do ambiente hospitalar predominantemente
Staphylococcus e C difficile Estes bebecircs tambeacutem apresentaram niacuteveis
significativamente mais baixos de Bifidobacterium e diversidade bacteriana menor do
que os bebecircs nascidos por parto normal Estas diferenccedilas podem justificar o
aumento do risco de doenccedilas especiacuteficas em bebecircs receacutem-nascidos por parto
35
cesariana agrave longo prazo (AZAD et al 2013 BELLO et al 2010 COLLADO et al
2012 DOMINGUEZ- PENDERS et al 2006 PRINCE et al 2014)
As diferenccedilas no processo de colonizaccedilatildeo intestinal decorrentes do tipo de
parto poderiam refletir-se no desenvolvimento do sistema imunoloacutegico visto que os
micro-organismos gastrintestinais influenciam esse processo por meio do envio de
importantes sinais regulatoacuterios necessaacuterios para o desenvolvimento da adequada
toleracircncia ao ambiente (BIASUCCI et al 2008 CARDWELL et al 2008
DOMINGUEZ-BELLO et al 2010 KOENIG et al 2011 MORELLI et al 2008
RENZ-POLSTER et al 2005)
2233 Tipo de aleitamento
O leite materno humano eacute considerado um dos principais fatores da iniciaccedilatildeo e
no desenvolvimento da microbiota do neonato uma vez que conteacutem substratos
(prebioacuteticos) para estimular o crescimento bacteriano e tambeacutem eacute fonte de micro-
organismos Estima-se que o consumo de 800 ml de leite materno por dia
proporcione 1 x 105 a 1 x 107 micro-organismos comensais durante a amamentaccedilatildeo
(MARTIN et al 2004) Desta maneira a contagem de Bifidobacterium aumenta
drasticamente Lactobacillus e Bacteroides aumentam em menor proporccedilatildeo e
enterobacteacuterias e enterococos diminuem Espeacutecies de Bifidobacterium
correspondem de 80 a 90 do total dos componentes da microbiota fecal infantil
presentes em bebecircs amamentados por leite materno Jaacute em receacutem-nascidos
alimentados com foacutermulas infantis a microbiota tem demonstrado ser muito mais
complexa sendo composta por Bifidobacterium Bacteroides Clostridium e
Streptococcus (ADLERBERTH WOLD 2009 CUMMINS THOMPSON 1997 DE
SANTA BARBARA et al 2003 DONOVAN ODIE 1994 DONOVAN 2006 MACKIE
et al 1999 MARQUES et al 2010 MCCRACKEN LORENZ 2001 PALMER
2011 POROYKO et al 2010)
2234 Uso de antibioacutetico
A eventual antibioticoterapia interfere tambeacutem no equiliacutebrio da microbiota A
disbiose (alteraccedilatildeo da microbiota) depende de fatores como espectro de accedilatildeo da
droga idade e dieta do indiviacuteduo dosagem e duraccedilatildeo do tratamento via de
administraccedilatildeo propriedades farmacocineacuteticas e farmacodinacircmicas aleacutem de grau de
36
resistecircncia da comunidade (LEY 2000 SULLIVAN et al 2001) A seleccedilatildeo de
bacteacuterias resistentes a drogas pela antibioticoterapia eacute um problema mundial Os
genes de resistecircncia passam para diversos gecircneros bacterianos no intestino A
aquisiccedilatildeo de genes de resistecircncia confere benefiacutecios a determinada espeacutecie
bacteriana diante da pressatildeo seletiva exercida pelo antibioacutetico Quando essa
pressatildeo seletiva eacute suspensa a cepa resistente apresenta menor desempenho em
comparaccedilatildeo com a espeacutecie susceptiacutevel No entanto esse clone menos competitivo
pode compensar essa perda de desempenho pela aquisiccedilatildeo de mutaccedilotildees
compensatoacuterias (JERNBERG et al 2010) No intestino os antibioacuteticos aleacutem de
selecionarem bacteacuterias resistentes tambeacutem aumentam o nuacutemero de transferecircncias
do pool de genes de ceacutelulas resistentes (DETHJEFSEN et al 2008 KARAMI et al
2007 YANG et al 2009)
2235 Dieta
Muitos estudos tem sido realizados no intuito de compreender a relaccedilatildeo entre o
consumo alimentar e a composiccedilatildeo da microbiota intestinal principalmente no
sentido de uma dieta ocidentalizada baseada em alimentos ricos em carboidratos
simples lipiacutedios e proteiacutenas de origem animal sal e poucos alimentos in natura
como frutas e hortaliccedilas ao comparar se com a dietas dos nossos antepassados
caracterizada pelo consumo de grandes quantidades de amido fibras e
polissacaacuteridos vegetais aleacutem de pequenas quantidades de gordura e proteiacutena
animal Em modelos murinos de obesidade induzida por padratildeo de dieta ocidental
no qual animais geneticamente idecircnticos que herdaram microbiotas semelhantes a
relaccedilatildeo entre dieta e representantes microbianos eacute dinacircmica e ajustaacutevel impactando
a capacidade da microbiota de promover a adiposidade no hospedeiro (CARMODY
et al 2015 DAVID et al 2014 DE FILIPPO et al 2010 FLEISSNER et al 2010
HILDEBRANDT et al 2009 LEY et al 2008 MENDONCcedilA ANJOS 2004 WALKER
et al 2011 WONG et al 2012 WU et al 2011)
Uma vez que a microbiota foi estabelecida nestes primeiros anos observa-se
um aumento na composiccedilatildeo microbiana tanto na diversidade quanto na riqueza
atingindo a mais alta complexidade em adultos com vaacuterias centenas de filotipos e
niacuteveis de espeacutecie Cada indiviacuteduo humano atinge um cliacutemax de composiccedilatildeo
homeostaacutetico o que provavelmente permanece relativamente estaacutevel durante a
37
maior parte da vida de um adulto saudaacutevel Nas fases tardias da vida a composiccedilatildeo
da microbiota torna-se novamente menos diversificada e mais dinacircmica
caracterizada por uma maior proporccedilatildeo de Bacteroidetes para Firmicutes aumento
de Proteobacteria e diminuiccedilatildeo da Bifidobacterium (MACKIE 1999 OTTMAN et al
2012 RAUTAVA et al 2012 VILLANUEVA-MILLAacuteN et al 2015) (Figura 1)
Figura 1 ndash Fatores envolvidos no estabelecimento da microbiota humana ao longo
da vida
Adaptado de MJ Villanueva-Millaacuten et al 2015
38
224 Microbiota intestinal e a fisiologia do hospedeiro
O intestino representa a interface natural entre microbiota intestinal e o
hospedeiro sendo a mucosa intestinal a localizaccedilatildeo principal para a interaccedilatildeo de
micro-organismos e antiacutegenos com o hospedeiro por meio de intenso cross-talk
(KINROSS et al 2011) Os achados de estudos cliacutenicos e experimentais tecircm
evidenciado que a interaccedilatildeo microbiotahospedeiro pode influenciar favoravelmente
a sauacutede do hospedeiro de diversas maneiras Ateacute agora as principais funccedilotildees
conhecidas da microbiota podem ser classificadas em quatro grupos metaboacutelica
(nutriccedilatildeo e digestatildeo) proteccedilatildeo (proteccedilatildeo contra agentes patogecircnicos
imunomodulaccedilatildeo) troacutefica (controle da proliferaccedilatildeo de ceacutelulas epiteliais e
diferenciaccedilatildeo) e regulaccedilatildeo da adiposidade
2241 Nutriccedilatildeo e Metabolismo
A microbiota intestinal eacute um importante fator que afeta a extraccedilatildeo de energia a
partir da dieta e do armazenamento de energia no hospedeiro A fim de realizar
estas funccedilotildees as enzimas metaboacutelicas da microbiota intestinal como as glicosidases
e polissacaridases tecircm a capacidade de extrair energia a partir de nutrientes
inacessiacuteveis uma vez que estas enzimas satildeo capazes de clivar ligaccedilotildees glicosiacutedicas
presentes em alguns polissacariacutedeos de plantas e fibras dieteacuteticas (BACKHED et al
2004 2005 GUARNER MALAGELADA 2003) Os polissacariacutedeos natildeo digeriacuteveis
como a oligofrutose (inulina) satildeo metabolizados pela microbiota colocircnica em
oligossacariacutedeos e monossacariacutedeos e entatildeo fermentados a aacutecidos graxos de
cadeia curta (AGCC) particularmente acetato propionato e butirato Estes AGCC
satildeo rapidamente absorvidos O Butirato fornece energia para o metabolismo celular
enquanto acetato e propionato seguem para a corrente sanguiacutenea sendo
transportados para o fiacutegado e oacutergatildeos perifeacutericos onde podem atuar como substratos
para a gliconeogecircnese e lipogecircnese (SHEN et al 2013 ZAIBI et al 2010)
A microbiota intestinal tambeacutem induz a expressatildeo do peptiacutedeo YY (PYY)
anorexigecircnico que geram sinais de saciedade atraveacutes de um mecanismo
dependente do receptor GPR41 Assim a produccedilatildeo de AGCC pela microbiota
intestinal estaacute associada com um aumento na saciedade e uma reduccedilatildeo na ingestatildeo
de alimentos no hospedeiro o qual por sua vez controla o ganho de peso corporal
(CLUNY et al 2015 SHEN et al 2013 ZAIBI et al 2010) Outros mecanismos
39
pelos quais as bacteacuterias do intestino podem influenciar metabolismo do colesterol
satildeo induzidos atraveacutes de Fasting Induced Adipocyte Factor (FIAF) que eacute
seletivamente suprimida no epiteacutelio intestinal pela microbiota intestinal (MARTINEZ
et al 2009)
Tambeacutem tem sido relatado o envolvimento da microbiota intestinal na
metabolizaccedilatildeo de polifenoacuteis que contribuem para o seu potencial antioxidante e
accedilotildees beneacuteficas aleacutem de siacutentese de algumas vitaminas como B12 e K aleacutem da
induccedilatildeo da expressatildeo do receptor de vitamina D pelos AGCC aumentando a sua
absorccedilatildeo e regulando o metabolismo do caacutelcio (BRENCHLEY DOUEK 2012
GUARNER MALAGELADA 2003 KIM et al 1998 MANACH DONOVAN 2004
RESTA 2009 SCALBERT WILLIAMSON 2000) Finalmente a microbiota intestinal
tambeacutem eacute capaz de executar uma seacuterie de biotransformaccedilotildees em xenobioacuteticos
como drogas e seus metaboacutelitos em formas que podem afetar sua absorccedilatildeo e
biodisponibilidade (WILSON NICHOLSON 2009) Neste contexto tem sido
demonstrado que a microbiota intestinal metaboliza toacutexicos e compostos
potencialmente canceriacutegenos tais como pirolisatos (BRENCHLEY DOUEK 2012)
2242 Proteccedilatildeo
Tem sido observado que a ausecircncia da microbiota intestinal torna o organismo
suscetiacutevel agrave infecccedilatildeo Alguns dos mecanismos envolvidos nessas accedilotildees protetoras
incluem competiccedilatildeo direta de nutrientes limitados e a modulaccedilatildeo de respostas
imunoloacutegicas no hospedeiro (GUARNER MALAGELADA 2003 KAMADA et al
2013 SEKIROV et al 2010)
22421 Competiccedilatildeo direta de nutrientes
Vaacuterios mecanismos tecircm sido implicados na resistecircncia agrave colonizaccedilatildeo do trato
gastrintestinal por patoacutegenos A camada de muco intestinal eacute capaz de manter
mutualismos mantendo as bacteacuterias no compartimento e restringindo estimulaccedilatildeo
imunoloacutegica ostensiva O hospedeiro fornece ativamente os nutrientes que a
microbiota precisa e a microbiota indica a quantidade de nutrientes que satildeo
necessaacuterios para o hospedeiro Esta relaccedilatildeo impede superproduccedilatildeo indesejada do
nutriente o que favoreceria a intrusatildeo de micro-organismos competitivos com
potencial de patogenicidade Finalmente as bacteacuterias podem inibir o crescimento
40
dos seus concorrentes produzindo peptiacutedeos antimicrobianos ou proteiacutenas
conhecidas como bacteriocinas que satildeo sintetizadas em ribossomos (GUARNER
MALAGELADA 2003 MONTALTO et al 2009 PURCHIARONI et al 2013
SEKIROV et al 2010)
22422 Imunomodulaccedilatildeo
As interaccedilotildees entre micro-organismos e ceacutelulas epiteliais e imunes baseiam-se
no reconhecimento de padrotildees moleculares associados agrave micro-organismos
(MAMPs) sendo mediado por receptores de reconhecimento padratildeo representados
pelos receptores do tipo toll (TLR) encontrados na superfiacutecie de ceacutelulas epiteliais e
imunes e pelos receptores de domiacutenio de digomerizaccedilatildeo de ligaccedilatildeo de nucleotiacutedeos
(NOD) que se encontram no citoplasma Esses receptores desempenham um
importante papel na gecircnese e na modulaccedilatildeo da resposta inflamatoacuteria (FRANCHI et
al 2009 MARANDUBA et al 2014 MONTALTO et al 2009 PURCHIARONI et al
2013)
A interaccedilatildeo funcional entre microbiota intestinal e sistema imunoloacutegico inicia-
se com a promoccedilatildeo de um ambiente anti-inflamatoacuterio pelas bacteacuterias (Figura 2) Em
um contexto simbioacutetico MAMPs estimulam continuamente atraveacutes das IECs (ceacutelulas
epiteliais intestinais) a secreccedilatildeo das proteiacutenas antimicrobianas intestinais REGIIIγ
para o luacutemen aleacutem de linfopoietina estromal tiacutemica (TSLP) IL-33 IL-25 e o fator de
crescimento tumoral-β (TGF-β) sob o epiteacutelio Esses mediadores imunoloacutegicos
induzem o desenvolvimento de macroacutefagos tolerogecircnicos e ceacutelulas dendriacuteticas
(DCs) tolerogecircnicas (KAMADA et al 2013 MAYNARD et al 2012)
Ceacutelulas Dendriacuteticas (DCs) tolerogecircnicas produzem TGF-β e aacutecido retinoacuteico
(RA) que estimulam o desenvolvimento de Ceacutelulas T regulatoacuterias (Treg) Assim
atraveacutes das ceacutelulas Treg (que utilizam diversos mecanismos de regulaccedilatildeo)
macroacutefagos (que produzem IL-10) e DCs tolerogecircncicos o sistema imunoloacutegico
intestinal eacute capaz de estabelecer e manter um ambiente anti-inflamatoacuterio Aleacutem dos
papeacuteis reguladores essenciais de TGF-β esta citocina tem sido associada com
outras substacircncias derivadas do epiteacutelio tais como fator de ativaccedilatildeo de ceacutelulas β
(FABF) e ligante indutor de proliferaccedilatildeo (APRILL) com o intuito de induzir o
desenvolvimento de ceacutelulas produtoras de IgA (plasmoacutecitos) (FAGARASAN et al
2010) Esta imunoglobulina eacute capaz de prevenir a ligaccedilatildeo de bacteacuterias comensais no
41
epiteacutelio do hospedeiro estando portanto envolvida na formaccedilatildeo da microbiota
intestinal (MACPHERSON et al 2012)
Aleacutem disto tem sido relatada que a produccedilatildeo de alguns tipos de peptiacutedeos
antimicrobianos bacterianos (AMPs) como a secreccedilatildeo das proteiacutenas
antimicrobianas intestinais REGIIIγ REGIIIβ e angiogenina-4 eacute influenciada pela
micro-organismos comensais via TLR MyD88 (FRANCHI et al 2009 GOTO
IVANOV 2013 VAN VLIET et al 2010) Desse modo verifica-se que no intestino
humano saudaacutevel a microbiota promove constante exposiccedilatildeo de ligantes aos TLR
garantindo a ativaccedilatildeo basal contiacutenua de vias de sinalizaccedilatildeo resultando em
inflamaccedilatildeo fisioloacutegica de baixa intensidade Aleacutem disso micro-organismos
comensais tambeacutem satildeo capazes de suprimir respostas inflamatoacuterias intensas (VAN
VLIET et al 2010)
42
Figura 2 ndash Interaccedilatildeo funcional entre a microbiota intestinal humana e o sistema
imunoloacutegico
Legenda ndash O equiliacutebrio evolutivo eacute formado ao longo do tempo sendo modulado por pressatildeo ambiental A
microbiota intestinal e o ambiente intestinal satildeo desenvolvidas em conjunto sendo necessaacuterio para o benefiacutecio de ambos tolerar um ao outro O sistema imunoloacutegico monitora essa interaccedilatildeo garantindo a homeostase e contribuindo para a simbiose No entanto o desequiliacutebrio causado na presenccedila de disbiose pode causar a reaccedilatildeo do sistema imunoloacutegico Simbiose e disbiose dependem de equiliacutebrio entre bacteacuterias comensais e patogecircnicas Bacteacuterias comensais promovem um ambiente anti-inflamatoacuterio Em um contexto de simbiose MAMPs estimulam continuamente as IECs a secretarem moleacuteculas que atuam protegendo o epiteacutelio e produzindo um ambiente tolerogecircnico Em disbiose haacute uma liberaccedilatildeo significativa de MAMPs que podem induzir IECs DCs ativadas e macroacutefagos a secretar citocinas inflamatoacuterias Consequentemente haacute um desenvolvimento de efetores imunoloacutegicos IL-22 eacute produzida em ambas as situaccedilotildees mas a contribuiccedilatildeo para a remodelaccedilatildeo da barreira epitelial eacute controlada por regulaccedilatildeo imune M macroacutefago Com bacteacuterias comensais Pato bacteacuterias patogecircnicas
Adaptado de MARANDUBA et al 2014
43
2243 Funccedilatildeo Troacutefica
A microbiota intestinal desempenha funccedilotildees troacuteficas modulando a proliferaccedilatildeo
e diferenciaccedilatildeo de ceacutelulas epiteliais do coacutelon atraveacutes dos AGCC produzidos na
fermentaccedilatildeo de hidratos de carbono natildeo digeriacuteveis Neste contexto o butirato eacute
considerado o AGCC com maior efeito pois promove o crescimento e o turnover das
ceacutelulas epiteliais acelerando a maturaccedilatildeo intestinal da mucosa durante o seu
desenvolvimento ou para induzir seu reparo apoacutes uma lesatildeo O butirato eacute capaz de
aumentar proliferaccedilatildeo diferenciaccedilatildeo e maturaccedilatildeo aleacutem de reduzir apoptose de
enteroacutecitos normais no intestino delgado atraveacutes de sua influecircncia sobre a
expressatildeo de genes e a siacutentese de proteiacutenas (GUILLOTEAU et al 2010 HAMER et
al 2008)
O butirato parece exercer um efeito troacutefico em ceacutelulas epiteliais do iacuteleo e do
jejuno atraveacutes de um mecanismo de neuro-hormonal sugerindo um efeito indireto
No coacutelon a ausecircncia de butirato induziu apoptose massiva nos colonoacutecitos podendo
ser explicado pelo fato de que o butirato eacute a fonte principal de energia para estas
ceacutelulas aleacutem de estimular a liberaccedilatildeo de peacuteptidos gastrointestinais eou fatores de
crescimento que desempenham um papel fundamental na proliferaccedilatildeo celular
(GUILLOTEAU et al 2010 HAMER et al 2008)
2244 Regulaccedilatildeo da adiposidade
Tem sido evidenciado que a microbiota intestinal influecircncia a adiposidade do
hospedeiro A primeira evidecircncia do papel da microbiota intestinal na regulaccedilatildeo da
homeostase energeacutetica e adiposidade do hospedeiro foi demonstrada por Backhed
et al (2004) em estudo que foi demonstrado que ratos germ-free apresentavam
menor conteuacutedo de gordura corporal do que ratos convencionais mesmo ao
consumirem a mesma quantidade de alimentos Diferentes mecanismos tecircm sido
propostos para explicar a relaccedilatildeo entre microbiota intestinal e a adiposidade Assim
dependendo da sua composiccedilatildeo a microbiota pode aumentar a extraccedilatildeo energeacutetica
da dieta a partir de polissacariacutedeos natildeo digeriacuteveis com menor conteuacutedo de energia
disponiacutevel nas fezes aleacutem de maiores niacuteveis de AGCC no intestino Propotildee-se
ainda que a microbiota intestinal seja capaz de induzir a regulaccedilatildeo de genes do
hospedeiro que modulam o metabolismo energeacutetico (MUSSO et al 2011)
44
225 Microbiota intestinal e disbiose
Em condiccedilotildees saudaacuteveis existe um equiliacutebrio entre todos os micro-organismos
presentes no intestino estando as bacteacuterias beneacuteficas em maior quantidade
(eubiose) Entretanto pode ocorrer desequiliacutebrio na microbiota com consequente
predomiacutenio das bacteacuterias potencialmente patogecircnicas sobre as beneacuteficas Esse
desequiliacutebrio eacute definido como disbiose e pode comprometer a sauacutede do hospedeiro
uma vez que se associa agrave patogecircnese de vaacuterias doenccedilas (HAWRELAK MYERS
2004)
O uso de antibioacuteticos anti-inflamatoacuterios hormonais e natildeo hormonais abuso de
laxantes consumo excessivo de alimentos processados baixo consumo de
alimentos crus excessiva exposiccedilatildeo a toxinas ambientais incluindo alguns metais
pesados doenccedilas consumptivas como cacircncer e siacutendrome da imunodeficiecircncia
adquirida (AIDS) disfunccedilotildees hepatopancreaacuteticas estresse divertiacuteculos idade
tempo de tracircnsito e pH intestinal disponibilidade de material fermentaacutevel estado
imunoloacutegico do hospedeiro e infecccedilotildees satildeo fatores importantes para promover
alteraccedilatildeo da microbiota acarretando em disbiose intestinal e consequentemente
modificando vaacuterias funccedilotildees do TGI incluindo a digestatildeo a
biodisponibilidadeabsorccedilatildeo eliminaccedilatildeo desintoxicaccedilatildeo e funccedilatildeo imunoloacutegica
(ALMEIDA et al 2009 HAWRELA MYERS 2004 SEARS GENUIS 2012)
Em um contexto de disbiose (Figura 2) a presenccedila de agentes patogeacutenicos
pode perturbar a regulaccedilatildeo do ambiente anti-inflamatoacuterio Quando patoacutegenos
enteacutericos superam as bacteacuterias comensais o desequiliacutebrio entre comensais e
bacteacuterias patogecircnicas provoca uma liberaccedilatildeo significativa de MAMPs Este aumento
pode induzir IECs DCs e macroacutefagos ativados a secretar citocinas inflamatoacuterias
como a IL-1β IL-6 IL-12 e IL-23 Estas citocinas estimulam o desenvolvimento de
ceacutelulas CD4+ T auxiliares (T helper - TH1) e ceacutelulas TH17 (produzem IL-17A IL-
17F e IL-22) resultando na inflamaccedilatildeo crocircnica (MAYNARD et al 2012)
Na vigecircncia da disbiose intestinal pode ocorrer perda de funccedilotildees importantes
da microbiota do hospedeiro As alteraccedilotildees qualitativas e quantitativas na microbiota
intestinal aleacutem das alteraccedilotildees nas atividades metaboacutelicas e na distribuiccedilatildeo dos
micro-organismos ao longo do intestino associam-se a diversas condiccedilotildees tais
como diarreias deacuteficits nutricionais doenccedila celiacuteaca cacircncer colorretal doenccedilas
45
inflamatoacuterias intestinais siacutendrome do coacutelon irritaacutevel e supercrescimento bacteriano
(ALMEIDA et al 2009 HAWRELAK MYERS 2004)
A disbiose pode provocar aumento da permeabilidade intestinal alterando uma
importante funccedilatildeo da mucosa intestinal que eacute a atividade de barreira Assim
moleacuteculas antigecircnicas ou toacutexicas e micro-organismos nocivos podem se translocar
atraveacutes da barreira promovendo a passagem destas substacircncias atraveacutes da mucosa
epitelial para o sangue ou sistema linfaacutetico gerando uma resposta inflamatoacuteria
sistecircmica A ligaccedilatildeo entre disbiose e desenvolvimento de doenccedilas como obesidade
diabetes e doenccedilas cardiovasculares vem sendo explorada A obesidade representa
uma das doenccedilas mais estudadas associadas agrave perturbaccedilotildees na microbiota
intestinal no entanto requer mais estudos (Figura 3) (ALMEIDA et al 2009
HAWRELAK MYERS 2004 KINROSS et al 2011)
46
Figura 3 ndash Doenccedilas influenciadas pelo metabolismo microbiano intestinal
Legenda ndash A variedade de doenccedilas sistecircmicas que satildeo diretamente influenciadas pelo metabolismo da microbiota intestinal e a sua influecircncia sobre outras vias em mamiacuteferos tais como o sistema imunitaacuterio inato tem sido demonstradas Especificamente em destaque incluem as vias metaboacutelicas envolvidas com o metabolismo de drogas e a obesidade que satildeo diretamente influenciados pelo teor microbiano intestinal Ags antigeacutenios C bolteae Clostridium Bolteae DCs ceacutelulas dendriacuteticas AGCC aacutecidos graxos de cadeia curta TLR receptor Toll-like
Adaptado de Kinross et al 2011
47
226 Microbiota Intestinal e obesidade
A partir de 2004 mais um fator ambiental passou a ser apontado como
importante para o controle do peso e da homeostase energeacutetica a microbiota
intestinal As primeiras evidecircncias da relaccedilatildeo microbiota intestinal versus obesidade
foram constatadas em animais germ-free convencionalizados Esses animais
demonstraram que mesmo ao consumir uma menor quantidade de dieta e portanto
menos calorias em comparaccedilatildeo aos animais germ-free apresentaram aumento da
quantidade de gordura corporal (BACKHED et al 2004)
Especificamente tem-se observado que a microbiota de ratos obesos tem uma
maior capacidade de extraccedilatildeo de energia da dieta e esta caracteriacutestica pode ser
transmissiacutevel atraveacutes da colonizaccedilatildeo de ratos germ-free com a microbiota fecal de
doadores obesos resultando em um aumento significativamente maior no percentual
de gordura corporal total com o intuito de armazenar os lipiacutedeos produzidos Estes
estudos demonstraram que microbiota intestinal eacute um potencial fator de contribuiccedilatildeo
adicional agrave fisiopatologia da obesidade (BACKHED et al 2004 HARRIS et al 2012
LEY et al 2005 TURNBAUGH et al 2006)
A definiccedilatildeo da alteraccedilatildeo na composiccedilatildeo da microbiota intestinal de obesos
ainda permanece controversa na literatura tanto no que se refere agrave abordagem em
niacutevel de filo quanto de espeacutecies em humanos (LYRA et al 2010) Aleacutem destes
estudos realizados com animais germ-free outros observaram associaccedilotildees
importantes entre obesidade e mudanccedilas na composiccedilatildeo da microbiota intestinal tal
como uma diversidade bacteriana reduzida (no filo eou outros niacuteveis) eou
representaccedilatildeo alterada de genes e vias metaboacutelicas bacterianas (DE LA SERRE et
al 2010 LEY et al 2006 TURNBAUGH et al 2006)
Em geral vaacuterios autores tecircm demonstrado associaccedilotildees entre obesidade e
mudanccedilas na abundacircncia relativa dos dois filos bacterianos dominantes
Bacteroidetes e Firmicutes Mais especificamente um aumento do filo Firmicutes e
uma diminuiccedilatildeo do filo Bacteroidetes em modelos de ratos obesos e pacientes tecircm
sido observado Aleacutem disso indiviacuteduos magros e pessoas que perderam peso
apresentaram maior abundacircncia do filo Bacteroidetes (ABDALLAH et al 2011
BACKHED et al 2007 CANI et al 2008 LEY et al 2005 2006 TURNBAUGH et
al 2006 VERDAM et al 2013)
48
O aumento da razatildeo FirmicutesBacteroidetes em ratos obesos pode estar
associada com possiacuteveis mediaccedilotildees de respostas adaptativas pelo hospedeiro para
limitar a absorccedilatildeo de armazenamento de energia eou para promover a adiposidade
(LEY et al 2005) Embora os resultados dos estudos demonstrem diferenccedilas na
proporccedilatildeo de grupos bacterianos entre indiviacuteduos eutroacuteficos e obesos ainda natildeo se
sabe se algum grupo de micro-organismos em especial contribui de maneira direta
para o desenvolvimento da obesidade e de alteraccedilotildees metaboacutelicas Associaccedilotildees
entre tipos de bacteacuteria e as variaacuteveis metaboacutelicas tecircm sido observadas seja em
humanos ou em modelo animal indicando que a modulaccedilatildeo de determinados
grupos bacterianos possa exercer efeito no contexto da obesidade Os desafios
enfrentados agora se referem ao entendimento dos mecanismos pelos quais grupos
bacterianos influenciam paracircmetros metaboacutelicos e se intervenccedilotildees dieteacuteticas ou
medicamentosas utilizadas para modular a proporccedilatildeo desses grupos bacterianos
podem melhorar o perfil metaboacutelico ou ao contraacuterio agravaacute-lo (TURNBAUGH et al
2009)
Em relaccedilatildeo agrave composiccedilatildeo da microbiota intestinal seguida agrave perda de peso de
acordo com estudos de coorte a proporccedilatildeo de Bacteroidetes aumentou enquanto o
nuacutemero de Firmicutes diminuiu parecendo restaurar a relaccedilatildeo
FirmicutesBacteroides que estava inicialmente aumentada em indiviacuteduos obesos
Na verdade apoacutes 10 semanas de restriccedilatildeo energeacutetica e de exerciacutecio os
participantes que perderam mais de quatro quilogramas (kg) de peso corporal
mostraram um aumento significativo na populaccedilatildeo de Grupo B fragilis bem como
um aumento na proporccedilatildeo BacteroidesPrevotella positivamente correlacionada com
a perda de peso (HARRIS et al 2012 NADAL et al 2009 SANTACRUZ et al
2009)
No que se diz respeito aos efeitos do exerciacutecio fiacutesico na microbiota intestinal
Evans et al (2014) demonstraram que o exerciacutecio teve efeitos significativos tanto em
camundongos eutroacuteficos quanto em camundongos obesos que ingeriam dieta rica
em gordura sobre o equiliacutebrio relativo dos principais filos bacterianos juntamente
com a prevenccedilatildeo de obesidade e normalizaccedilatildeo da toleracircncia agrave glicose induzida por
dieta De fato a distacircncia percorrida eacute proporcional agrave diminuiccedilatildeo observada para a
razatildeo FirmicutesBacteroides (EVANS et al 2014) Tambeacutem eacute importante ressaltar
que o exerciacutecio aumentou significativamente a proporccedilatildeo relativa de bacteacuterias
49
produtoras de butirato tais como Bacteroidales S24-7 que estatildeo associados com a
sauacutede da ceacutelula epitelial intestinal Aleacutem disso o exerciacutecio fiacutesico aumentou a
diversidade da microbiota intestinal apenas em ratinhos alimentados com uma dieta
rica em gordura No entanto sugere-se que o exerciacutecio pode agir de forma
independente da microbiota intestinal aumentando a utilizaccedilatildeo de energia apesar
de um consumo de uma dieta rica em gordura
227 Mecanismos pelos quais a microbiota intestinal contribui para a obesidade
2271 Extraccedilatildeo de energia adicional da dieta
A noccedilatildeo de que a microbiota intestinal fornece energia para o hospedeiro eacute
suportada por achados em ratos germ-free natildeo naturalmente colonizados com
micro-organismos que apresentaram um menor ganho de peso quando alimentados
com uma dieta rica em gordura do que os ratos germ-free controles (BACKHED et
al 2007 CAESAR et al 2012 DING et al 2010 TREMAROLI BACKHED 2012)
Esses resultados evidenciam que na ausecircncia da microbiota o consumo de uma
dieta obesogecircnica parece natildeo estimular o desenvolvimento da obesidade A
Microbiota intestinal pode afetar ambos os lados da equaccedilatildeo do balanccedilo energeacutetico
natildeo apenas como um fator que influencia a colheita de energia a partir de
componentes da dieta mas tambeacutem como um fator que afeta genes do hospedeiro
que regulam o gasto de energia eou de armazenamento (BACKHED et al 2004
GILL et al 2006 WOLEVER et al 1991)
A fermentaccedilatildeo de polissacariacutedeos pela microbiota pode gerar um aumento no
fluxo de monossacariacutedeos para o fiacutegado e adipoacutecitos favorecendo a lipogecircnese de
novo atraveacutes da ativaccedilatildeo da expressatildeo de dois reguladores nucleares de enzimas
lipogecircnicas- carbohydrate response element-binding protein (ChREBP) e liver sterol
response element binding protein type-1 (SREBP-1) - os quais ativam as enzimas
lipogecircnicas acetil-CoA carboxilase e aacutecido graxo sintase (BACKHED et al 2004
MUSSO et al 2011 TSUKUMO et al 2009) Nesse contexto o menor acuacutemulo de
gordura corporal demonstrado em animais germ-free que consumiram dieta
hiperlipiacutedica e apresentaram absorccedilatildeo semelhante aos animais convencionalizados
indica que a microbiota pode exercer efeito sobre o fluxo de lipiacutedios entre os tecidos
reduzindo o acuacutemulo de gordura (BACKHED et al 2007)
50
A proteiacutena Fasting Induced Adipose Factor (FIAF) eacute suprimida pela presenccedila
de microbiota sendo um inibidor da lipase lipoproteacuteica (LPL) produzido pelo
intestino fiacutegado e tecido adiposo limitando a captaccedilatildeo de aacutecidos graxos e
favorecendo o acuacutemulo de triacilgriceroacuteis nesse tecido Tem sido demonstrado que
animais germ-free apresentaram uma maior expressatildeo de FIAF e fenoacutetipo resistente
agrave obesidade (BACKHED et al 2004 2005 2007) A participaccedilatildeo de FIAF no
metabolismo lipiacutedico foi reforccedilada atraveacutes de estudos com ratos germ-free que
diferiram apenas na expressatildeo dessa proteiacutena (FIAF ++ versus FIAF --) onde
verificou-se que a deficiecircncia dessa proteiacutena induzida geneticamente natildeo eacute um fator
protetor para animais germ-free contra o ganho de peso promovido pela dieta
hiperlipiacutedica (BACKHED et al 2007)
Aleacutem de promover a lipogecircnese (atraveacutes das enzimas lipogecircnicas e inibiccedilatildeo da
FIAF) a microbiota tambeacutem desempenha um papel importante no gasto de energia
obtida a partir da dieta Mais especificamente a microbiota de obesos parece
favorecer uma inibiccedilatildeo de oxidaccedilatildeo de aacutecidos graxos (que por sua vez favorecem a
deposiccedilatildeo e armazenamento de lipiacutedios no tecido adiposo fiacutegado eou tecido
muscular) por mecanismos complementares mas independentes (HARDIE
SAKAMOTO 2006 PUIGSERVER SPIEGELMAN 2003 RABOT et al 2010)
A microbiota tambeacutem pode influenciar a homeostase energeacutetica por meio da
sinalizaccedilatildeo exercida pelos aacutecidos graxos de cadeia curta (AGCC) Os AGCC agem
natildeo apenas como fonte de energia mas tambeacutem como moleacuteculas de sinalizaccedilatildeo
atraveacutes de receptores acoplados agrave proteiacutena G (GPRs) GPRs satildeo um grupo de
receptores transmembracircnicos intestinais que respondem aos aacutecidos graxos Entre
os receptores dessa famiacutelia os receptores Gpr41 e Gpr43 satildeo fundamentais sendo
expressos abundantemente no intestino delgado distal no coacutelon e nos adipoacutecitos
Essa ligaccedilatildeo resulta na ativaccedilatildeo desses receptores induzindo a secreccedilatildeo de
polipeptiacutedeo YY (PYY) e leptina hormocircnios que influenciam nas funccedilotildees intestinais
e na regulaccedilatildeo do apetite (BELLAHCENE et al 2013 BINDELS et al 2013
HARDIE SAKAMOTO 2006 INOUE et al 2014 MUSSO et al 2011 ZAIBI et al
2010)
51
2272 Induccedilatildeo da inflamaccedilatildeo por meio da alteraccedilatildeo da permeabilidade intestinal
As concentraccedilotildees sanguiacuteneas de lipopolissacariacutedeos (LPS) sofrem significativa
influecircncia da microbiota intestinal Principalmente as bacteacuterias Gram-negativas
apresentam em sua superfiacutecie celular os LPS que funcionam como antiacutegenos
estimulando a resposta imune do hospedeiro Assim a microbiota intestinal
representa um grande reservatoacuterio dessa endotoxina especialmente naqueles
indiviacuteduos que habitualmente consomem dieta com alto teor de gorduras
(HOTAMISLIGIL 2010)
A principal via de sinalizaccedilatildeo do LPS envolve o fator nuclear Kappa B (NF-KB)
O LPS pode aumentar os niacuteveis circulantes de resistina espeacutecies reativas de
oxigecircnio (ERO) e proteiacutenas supressoras da sinalizaccedilatildeo de citocinas-1 e 3 (SOCS-1 e
SOCS-3) A elevaccedilatildeo de citocinas proacute-inflamatoacuterias como interferon-gama (IFN-α)
TNF- α interleucina (IL)-6 e IL-1β geralmente observada em pacientes obesos
pode ser originada de macroacutefagos no tecido adiposo ou da interaccedilatildeo do LPS com
seu receptor O aumento dessas citocinas pode contribuir para a translocaccedilatildeo de
LPS favorecendo a ocorrecircncia de endotoxemia metaboacutelica e consequentemente
potencializar a inflamaccedilatildeo subcliacutenica por meio da reduccedilatildeo da expressatildeodistribuiccedilatildeo
de proteiacutenas formadoras de junccedilotildees oclusivas (tight junctions) como zocircnula de
oclusatildeo-1 (ZO-1) e ocludina aumentando a permeabilidade intestinal (CANI et al
2008 LAM et al 2012)
Aleacutem da reduccedilatildeo da expressatildeo das junccedilotildees oclusivas intestinais haacute tambeacutem
uma evidecircncia de que a microbiota intestinal pode regular a permeabilidade
intestinal atraveacutes do sistema endocanabinoacuteide Em um estudo realizado por Muccioli
et al (2010) a modulaccedilatildeo da composiccedilatildeo microbiana do intestino seja por
colonizaccedilatildeo em ratos germ-free ou por tratamento com antibioacuteticos reduziu a
expressatildeo dos receptores canabinoacuteides (Cb-1) tanto do coacutelon quanto do tecido
adiposo enquanto em animais alimentados com uma dieta rica em gordura foi
observado aumento da expressatildeo Cb1 (EVERARD et al 2013 GEURTS et al
2011 MUCCIOLI et al 2010)
52
23 MOLLICUTES
231 Caracteriacutesticas Gerais dos Mollicutes
Os micoplasmas foram primeiramente isolados por Norcard e Roux em 1898
que estudavam a Pleuropneumonia Bovina doenccedila descrita haacute mais de um seacuteculo
na Europa e na Aacutefrica Em seguida micro-organismos semelhantes isolados de
humanos e de animais foram descritos por outros pesquisadores e denominados de
PPLO ndash ldquoPleuropneumonia-Like Organismsrdquo (MOROWITZ 2002 RAZIN JACOBS
1992)
O termo ldquomicoplasmardquo foi usado para denominar os micro-organismos da
Classe Mollicutes (Mollis = mole cuacutetis = pele) mas sugeriu-se o uso do termo
geneacuterico molicutes como nome trivial para designar qualquer microrganismo desta
classe O termo micoplasma aplica-se apenas aos membros do gecircnero Mycoplasma
Recentemente algumas riqueacutetsias e outras bacteacuterias de taxonomia indefinida foram
incluiacutedas aos Mollicutes A classe eacute composta por quatro ordens (Mycoplasmatales
Entomoplasmatales Acholeplasmatales Anaeroplasmatales) sete famiacutelias
(Mycoplasmataceae Incertae sedis (ordem Mycoplasmatales)
Entomoplasmataceae Spiroplasmataceae Acholeplasmataceae Incertae sedis
(ordem Acholeplasmatales) e Anaeroplasmataceae) 11 gecircneros (Mycoplasma
Ureaplasma Eperythozoon Haemobartonella Entomoplasma Mesoplasma
Spiroplasma Acholeplasma Phytoplasma Anaeroplasma Asteroplasma) e mais de
200 espeacutecies A famiacutelia Mycoplasmataceae conteacutem os principais micro-organismos
de interesse meacutedico dentre os quais estatildeo os gecircneros Mycoplasma Os molicutes
compreendem aproximadamente 200 espeacutecies distribuiacutedas ente plantas insetos
animais e humanos (BERGEYrsquos 2010 RAZIN 1992 RAZIN YOGEV NAOT
1998)
Mollicutes eacute a uacutenica classe do filo Tenericutes sendo anteriormente
classificado dentro do filo Firmicutes tendo essa mudanccedila justificada em parte
pela anaacutelise de uma seacuterie de marcadores filogeneacuteticos conservados Esta
classificaccedilatildeo eacute ainda apoiada pela ausecircncia de parede celular caracteriacutestica desses
micro-organismos As sequecircncias do gene 16S rRNA contribuem para sua
classificaccedilatildeo em grupos filogeneacuteticos sendo essa sequecircncia obrigatoacuteria para a
caracterizaccedilatildeo de novas espeacutecies Aleacutem disso a atribuiccedilatildeo de espeacutecie aos grupos eacute
53
feita principalmente por hibridaccedilatildeo DNA-DNA sorologia e semelhanccedila na sequecircncia
do gene 16rRNA Algumas espeacutecies foram atribuiacutedas individualmente a grupos
filogeneacuteticos clusters e subclusters que tambeacutem compartilham outras
caracteriacutesticas (BERGEYrsquos 2009 2010 BROWN WHITCOMB BRADBURY 2007
WEISBURG et al 1989)
A natureza dos molicutes tem representado um desafio na compreensatildeo da
sua biologia classificaccedilatildeo e taxonomia Por muito tempo os micoplasmas foram
considerados viacuterus devido a capacidade de transpor filtros que bloqueavam a
passagem de bacteacuterias (RAZIN 1992) Os membros da classe Mollicutes satildeo
caracterizadas pelo genoma de tamanho reduzido (058 - 22 Mb) ausecircncia de
parede celular (RAZIN 1998) e por apresentarem requerimentos nutricionais
diferenciados quando comparados agrave maioria das bacteacuterias de interesse veterinaacuterio e
humano Aminoaacutecidos nucleotiacutedeos e esteroacuteis exoacutegenos satildeo utilizados para seu
crescimento in vitro O esterol presente no soro ou ceacutelulas do hospedeiro eacute
incorporado pela membrana da maioria das espeacutecies Este composto contribui na
fluidez necessaacuteria agrave membrana e confere resistecircncia parcial agrave lise osmoacutetica
(RUHNKE ROSENDAL 1994)
A membrana dos micoplasmas tem composiccedilatildeo semelhante agraves das eubacteacuterias
e estaacute exposta ao ambiente com exceccedilatildeo de poucas espeacutecies que possuem
glicocaacutelice (WIESLANDER et al 1992) Localizam-se principalmente nas ceacutelulas de
mucosas e com potencial de invasatildeo (VOELKER DYBVIG 1996) As mutaccedilotildees tecircm
sido mencionadas como estrateacutegia de sobrevivecircncia que podem ter ocorrido em
funccedilatildeo da evoluccedilatildeo associada a perdas genocircmicas (DAVID et al 2002)
Natildeo apresentam flagelos entretanto algumas espeacutecies exibem deslizamento
sobre superfiacutecies liacutequidas Alguns micoplasmas possuem um tipo de estrutura ou
prolongamento polar em sua superfiacutecie onde haacute alta concentraccedilatildeo de moleacuteculas de
adesatildeo que permitem a sua aderecircncia agrave ceacutelula hospedeira (RAZIN 1992) Acredita-
se que estas estruturas em algumas espeacutecies como Mycolasma penetrans de
origem humana estejam envolvidas na invasatildeo celular (LO et al 1992)
Os molicutes exibem estrita relaccedilatildeo aos hospedeiros e especificidade a tecidos
e oacutergatildeos que reflete as suas caracteriacutesticas nutricionais e adaptaccedilatildeo parasitaacuteria
Estas bacteacuterias podem ocorrer em hospedeiros e tecidos diferentes de seu ldquohabitatrdquo
normal entretanto como observado por Goulet et al (1995) existem variaccedilotildees e
54
eventualmente eacute possiacutevel isolar espeacutecies de siacutetios e hospedeiros diferentes
daqueles habituais (ERICKSON ROSS BOVE 1988 HORNOK et al 2012 ISO et
al 2013 RAZIN 1992 RAZIN YOGEV NAOT 1998 WAITES et al 1987)
A maioria dos molicutes vivem como comensais e em muitos artroacutepodes
podem mesmo ser considerados simbiontes Infecccedilotildees com micoplasmas
patogecircnicos satildeo raramente agudas e usualmente seguem um curso crocircnico (RAZIN
YOGEV NAOT 1998) Os Mollicutes principalmente as espeacutecies encontradas em
mamiacuteferos apesentam-se como parasitas ideais geralmente vivendo em harmonia
com seu hospedeiro mas por outro lado satildeo tambeacutem considerados como
ldquooportunistas ideaisrdquo Diversas doenccedilas nos seus respectivos hospedeiros satildeo
causadas ou associadas aos Mollicutes (RAZIN YOGEV NAOT 1998) Estas
bacteacuterias parecem preferir estabelecerem-se em nichos com ceacutelulas em constante
renovaccedilatildeo favorecendo a sua adesatildeo (GABRIDGE CHANDLER DANIELS 1985)
Micoplasmas em especial as espeacutecies com os menores genomas tecircm altas
taxas de mutaccedilatildeo o que sugere que eles estatildeo em um estado de evoluccedilatildeo raacutepida
Esses dados foram confirmados por estudos de sequecircncias de genes 5S rRNA que
incluiu uma seacuterie de acholeplasmas anaeroplasmas micoplasmas ureaplasmas e
Clostridium innocuum (BOVEacute 1999 RAZIN 1995 ROGERS et al 1985)
Quanto ao seu metabolismo os Mollicutes podem ser divididos em
fermentadores e natildeo-fermentadores Os fermentadores produzem aacutecidos por meio
da metabolizaccedilatildeo de glicose e de outros carboidratos diminuindo o pH do meio de
cultivo e os natildeo- fermentadores possuem a via da arginina-deidrolase para
obtenccedilatildeo de ATP aumentando o pH (RAZIN 1978 2004) Quando ambas as vias
ocorrem os aacutecidos produzidos da glicoacutelise podem mascarar a alcalinizaccedilatildeo do caldo
causada pela hidroacutelise da arginina (BASEMAN TULLY 1997 OLSON et al 1993
RAZIN 2004)
Um dos maiores empecilhos na pesquisa e no diagnoacutestico laboratorial das
infecccedilotildees causadas por molicutes tem sido a dificuldade em cultivaacute-los in vitro
Apresentam crescimento lento mesmo utilizando-se o meio de cultivo adequado
(RAZIN 1994) A temperatura de aproximadamente 37 ordmC eacute indicativa do ldquohabitatrdquo
natural dos molicutes que corresponde agrave dos mamiacuteferos reacutepteis peixes artroacutepodes
e plantas O crescimento e sobrevivecircncia dos molicutes em meio de cultura satildeo
dependentes do pH Para espeacutecies originaacuterias de plantas e vertebrados o pH oacutetimo
55
eacute de 74 e o crescimento ocorre entre pH 65 a 80 (RAZIN et al 1978) A inibiccedilatildeo
do crescimento pode ocorrer pela excessiva produccedilatildeo de aacutecidos ou aacutelcalis gerados
pelo metabolismo microbiano primaacuterio
Esses micro-organismos apresentam colocircnias de 50 ndash 500 μm de diacircmetro
usualmente em forma de ldquoovo fritordquo quando cultivados em meio soacutelido visualizadas
com o auxiacutelio de microscoacutepio estereoscoacutepio (Figura 4) Em meio liacutequido o
crescimento geralmente natildeo causa turvaccedilatildeo provocando somente alteraccedilatildeo no pH
revelado por um indicador presente no meio de cultura (MILES 1992 RAZIN 1998)
A complexidade dos requerimentos nutricionais a variaccedilatildeo na forma celular e a
fragilidade osmoacutetica fazem com que os Mollicutes estejam sob constantes
investigaccedilotildees quanto a sua fisiologia para relatar seu crescimento e ecologia As
condiccedilotildees sob as quais eles crescem podem influenciar na estrutura e
funcionamento das ceacutelulas hospedeiras sendo importante natildeo somente para os
fisiologistas como tambeacutem para todos micoplasmologistas envolvidos em estudos
quantitativos (BALABANOV et al 2006 MILLES 1992 RAZIN et al 1978
RODWELL 1983 TULLY 1985)
Figura 4 ndash Crescimento de M hominis em meio SP4 com a produccedilatildeo de colocircnia em forma de ldquoovo fritordquo (aumento 40X)
Fonte Arquivo pessoal
56
232 Mollicutes Microbiota Intestinal e Obesidade
A ocorrecircncia e participaccedilatildeo da classe Mollicutes na microbiota intestinal e sua
relaccedilatildeo com a obesidade ainda eacute praticamente desconhecida No entanto
Turnbaugh et al (2008) investigaram a relaccedilatildeo dieta ecologia microbiana intestinal e
o balanccedilo energeacutetico a partir de um modelo murino de obesidade induzido por meio
do consumo de uma dieta ocidental Observou-se que a dieta ocidental estimulou o
crescimento de organismos da classe Mollicutes que posteriormente foram
reduzidos por subsequentes manipulaccedilotildees dieteacuteticas para limitar o ganho de peso
O transplante de microbiota de ratos com obesidade induzida por dieta para
destinataacuterios germ-free promoveu uma maior deposiccedilatildeo de gordura do que em
animais que receberam o transplante a partir de doadores eutroacuteficos Metagenocircmica
e anaacutelises bioquiacutemicas do microbioma intestinal em conjunto com sequenciamento e
reconstruccedilotildees metaboacutelicas associadas ao intestino humano revelaram que a
bacteacuteria Eubacterium dolichum) (um membro da classe Mollicutes) apresenta
caracteriacutesticas que podem fornecer uma vantagem competitiva aos membros desse
ramo em relaccedilatildeo aos nutrientes da dieta ocidental Essas vantagens relacionam-se
com a importaccedilatildeo e transformaccedilatildeo de accediluacutecares simples atraveacutes do Sistema
fosfotransferase (PTS)
Sistemas fosfotransferase (PTS) satildeo uma classe de sistemas de transporte
envolvidas na absorccedilatildeo e na fosforilaccedilatildeo de uma grande variedade de hidratos de
carbono (DEUTSCHER et al 2006) Cada transportador envolve trecircs enzimas de
ligaccedilatildeo que atuam como receptores e doadores de grupos fosforil duas enzimas
citoplasmaacuteticas que atuam em todos os hidratos de carbono PTS importados (HPR e
EI) e o outro eacute um complexo de hidratos de carbono especiacutefico (EII)
compreendendo um ou dois domiacutenios integrais de membrana hidrofoacutebicos (EIIC D)
e dois domiacutenios hidrofiacutelicos (EIIA B) (DEUTSCHER et al 2006) Fosfoenolpiruvato
embora produzidos atraveacutes da glicoacutelise pode ser usado para gerar ATP (atraveacutes da
piruvatoquinase) ou usado para conduzir a importaccedilatildeo de accediluacutecares adicionais
atraveacutes da transferecircncia de um grupo fosfato para EI do PTS
Genes PTS satildeo encontrados em vaacuterias divisotildees de bacteacuterias incluindo
Proteobacterias tais como E coli bem como vaacuterios Firmicutes e Mollicutes
sequenciados (Por exemplo Mycoplasma genitalium M pneumoniae M pulmonis
M penetrans M gallisepticum M mycoides M mobile M hyopneumoniae M
57
synoviae e M capricolum) (KANEHISA et al 2004) O PTS tambeacutem desempenha
um papel na regulaccedilatildeo da expressatildeo do gene microbiano atraveacutes da repressatildeo
cataboacutelica permitindo que a ceacutelula passe a importar preferencialmente accediluacutecares
simples em relaccedilatildeo a outros hidratos de carbono (DEUTSCHER et al 2006)
Muacuteltiplos componentes do PTS estatildeo presentes no microbioma da dieta ocidental (EI
e HPr mais EII) o que poderia permitir a importaccedilatildeo de accediluacutecares simples (por
exemplo glicose e frutose que juntos formam sacarose um componente abundante
da dieta ocidental) bem como accediluacutecares associados com a mucosa do intestino do
hospedeiro (N-acetil-galactosamina) O microbioma da dieta ocidental tambeacutem
conteacutem genes que suportam o metabolismo destes accediluacutecares fosforilados para vaacuterios
produtos finais de fermentaccedilatildeo anaeroacutebia (por exemplo lactato e a cadeia curta de
aacutecidos graxos butirato e acetato (DEUTSCHER et al 2006)
58
3 OBJETIVOS
31 Objetivo geral
Analisar a participaccedilatildeo da Classe Mollicutes e dos Filos Firmicutes e Bacteroidetes
na microbiota intestinal de mulheres obesas e eutroacuteficas
32 Objetivos especiacuteficos
Determinar o estado nutricional das mulheres obesas do grupo caso e
eutroacuteficas do grupo controle
Determinar o consumo alimentar das mulheres obesas do grupo caso e
eutroacuteficas do grupo controle
Desenvolver um ensaio quantitativo por meio de TaqMan PCR para a
detecccedilatildeo de Mollicutes na microbiota intestinal de mulheres obesas e
eutroacuteficas
Quantificar os micro-organismos da Classe Mollicutes e dos Filos Firmicutes e
Bacteroidetes aleacutem de Bacteacuterias Totais por meio da PCR em tempo real em
amostras de fezes de mulheres obesas e eutroacuteficas
Analisar a liberaccedilatildeo de citocinas proacute-inflamatoacuterias IL-1 IL6 IL17-A e TNF-α
em amostras de sangue coletadas de mulheres obesas e eutroacuteficas
59
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
41 Protocolo do estudo
O presente estudo foi desenvolvido no laboratoacuterio de Micoplasmas do
Departamento de Microbiologia do Instituto de Ciecircncias Biomeacutedicas da Universidade
de Satildeo Paulo (ICB IIUSP) com o Ambulatoacuterio de Obesidade e Siacutendrome Metaboacutelica
do Serviccedilo de Endocrinologia do Hospital das Cliacutenicas da Universidade de Satildeo
Paulo (HC-FMUSP) O estudo foi aprovado pela Comissatildeo de Eacutetica em Pesquisa
Envolvendo Seres Humanos (CEPSH) do Instituto de Ciecircncias Biomeacutedicas da
Universidade de Satildeo Paulo (ICBUSP) (protocolo de pesquisa ndeg 110713) e pela
Comissatildeo de Eacutetica da Instituiccedilatildeo HC-FMUSP Todas as mulheres foram recrutadas a
partir da demanda espontacircnea do serviccedilo tendo sido inseridas no protocolo apoacutes
explicaccedilatildeo sucinta e individual do mesmo e assinatura do Termo de Consentimento
Livre e Esclarecido (TCLE) conforme preconiza a resoluccedilatildeo 19606 do Conselho
Nacional de Sauacutede
42 Casuiacutestica
As coletas foram realizadas entre os meses de Outubro de 2013 agrave Dezembro
de 2014 Para obtenccedilatildeo de resultados pela metodologia proposta para este estudo
a casuiacutestica foi de 40 mulheres sendo 20 diagnosticadas com obesidade
apresentando Iacutendice de massa corporal (IMCgt 30 kgm2) e 20 mulheres em eutrofia
(IMC entre 185 e 249 kgm2) As mulheres diagnosticadas com obesidade foram
recrutadas no grupo de Obesidade e Siacutendrome Metaboacutelica do serviccedilo de
Endocrinologia do Hospital das Cliacutenicas da Universidade de Satildeo Paulo (HC-
FMUSP)
Foram utilizados como criteacuterios de exclusatildeo para esse grupo a presenccedila de
quadros infecciosos com sinais cliacutenicos uso de antibioacuteticos (3 meses antes do
estudo) quimioterapia radioterapia gravidez uso de probioacuteticos cirurgias preacutevias
no Trato Gastrointestinal doenccedilas do Trato Gastrointestinal como Doenccedila de Crohn
e Siacutendrome do Coacutelon Irritaacutevel Devido ao fato de haver dificuldade para distinccedilatildeo de
alimentos classificados como prebioacuteticos a ingestatildeo destes natildeo foi incluiacuteda como
criteacuterio de exclusatildeo do estudo O grupo controle foi composto por mulheres adultas
60
eutroacuteficas recrutadas na comunidade sem nenhuma enfermidade aparente tendo
sido fixados os mesmos criteacuterios de exclusatildeo adotados para o grupo controle
43 Delineamento experimental
As mulheres foram submetidas agrave coleta de material fecal e de sangue aleacutem de
questionaacuterio semiestruturado como instrumento de coleta Tal instrumento foi
construiacutedo atraveacutes de consulta em perioacutedicos cientiacuteficos e livros acadecircmicos que
descrevem preditores importantes em relaccedilatildeo a fatores etioloacutegicos predisponentes e
mantedenores da obesidade e possiacutevel associaccedilatildeo com microbiota intestinal e
ambiente Foram consideradas questotildees que avaliavam histoacuteria familiar cliacutenica
obsteacutetrica ginecoloacutegica consumo de aacutelcool e tabaco aleacutem de questotildees que
avaliavam os haacutebitos alimentares como a praacutetica de dietas para emagrecer e
nuacutemero de refeiccedilotildees realizadas Foi utilizado para esse estudo o IPAQ (International
Physical Activity Questionnaire) versatildeo curta originalmente desenvolvido com
finalidade de estimar o niacutevel de praacutetica habitual de atividade fiacutesica de populaccedilotildees de
diferentes paiacuteses (BARROS NAHAS 2000) O questionaacuterio foi elaborado de modo a
facilitar a obtenccedilatildeo de informaccedilotildees durante a consulta com os pacientes e realizadas
por indiviacuteduos previamente instruiacutedos para o desenvolvimento do estudo tendo as
variaacuteveis sido agrupadas em 9 Seccedilotildees que representam a subcategorizaccedilatildeo das
variaacuteveis independentes para determinaccedilatildeo do perfil da populaccedilatildeo estudada (Anexo
B)
44 Determinaccedilatildeo do estado nutricional
441 Avaliaccedilatildeo qualitativa do consumo alimentar
Para investigar possiacuteveis relaccedilotildees entre alimentos e nutrientes da dieta e
microbiota intestinal utilizou-se o questionaacuterio de frequecircncia alimentar semi-quantitativo
(QFA) composto por 62 itens alimentares proposto por Fisberg et al (2008) que
desenvolveram um QFA para utilizaccedilatildeo em estudos epidemioloacutegicos com indiviacuteduos
adultos desenhados para testar hipoacuteteses epidemioloacutegicas e nutricionais em estudos
conduzidos primariamente em Satildeo Paulo para estimar o teor de nutrientes da dieta
61
habitual o que eacute de fundamental importacircncia para estimar a medida de exposiccedilatildeo aos
fatores dieteacuteticos e investigar as possiacuteveis associaccedilotildees com desfechos de interesse
Representou-se a frequecircncia de consumo alimentar em 8 categorias a saber
diaacuterio (mais de trecircs vezes por dia duas a trecircs vezes por dia uma vez por dia) semanal
(cinco a seis vezes por semana duas a quatro vezes por semana uma vez por
semana) mensal (uma a trecircs vezes por mecircs) e nunca ou quase nunca Os dados sobre
o consumo alimentar foram inseridos em planilha eletrocircnica com auxiacutelio do estudo de
Giacomello et al (2008) Inicialmente converteu-se a frequecircncia de consumo de cada
alimento em frequecircncia diaacuteria como proposto por Coelho et al (2011) Para tanto
atribuiu-se ao alimento valor 1 (um) quando consumido 1 vez ao dia Caso o alimento
fosse consumido mais de uma vez ao dia multiplicava-se o valor 1 pelo intervalo da
frequecircncia diaacuteria relatada Para as opccedilotildees que contemplaram intervalos de tempo
semanal e mensal utilizou-se a meacutedia do intervalo das frequecircncias dividido pelo
periacuteodo se semanal (7) e mensal (30) conforme descritos no Quadro 01
Quadro 01ndash Criteacuterios utilizados na estimativa da frequecircncia diaacuteria de consumo dos alimentos incluiacutedos no Questionaacuterio de Frequecircncia Alimentar
Frequecircncia Relatada Frequecircncia diaacuteria
3 ou mais vezesdia 31=3
2 a 3 vezesdia 251= 25
1 vezdia 11= 1
5 a 6 vezessemana 557= 079
2 a 4 vezessemana 37= 043
1vezsemana 17= 014
1 a 3 vezesmecircs 230= 007
1 vezmecircs 130= 003
NuncaQuase nunca 0
COELHO et al 2011
62
Posteriormente foram construiacutedos os grupos dos alimentos segundo o registro do
QFA Adotou-se como criteacuterio para a inclusatildeo do alimento no respectivo grupo o
consumo igual ou maior a 10 e as caracteriacutesticas nutricionais (HAIR et al 2005)
Considerando este criteacuterio foram construiacutedos 16 grupos de alimentos (1) massas (2)
preparaccedilotildees (3) carne vermelha e ovos (4) embutidos (5) carne branca (6) leite e
derivados (7) leguminosas (8) cereais raiacutezes e tubeacuterculos (9) hortaliccedilas (10) frutas
(11) industrializados (12) infusatildeo (13) bebida alcooacutelica (14) oacuteleos e gorduras (15)
lanches (16) accediluacutecares e doces
Os dados referentes ao QFA tambeacutem foram utilizados para calcular o consumo
energeacutetico e de nutrientes Primeiramente estes foram transformados em gramas
utilizando-se uma tabela para avaliaccedilatildeo de consumo alimentar em medidas caseiras
(PINHEIRO et al 2002) e em seguida lanccedilados no Software Excel para digitaccedilatildeo dos
dados do consumo alimentar e para o caacutelculo de consumo de macro e micronutrientes
Para preencher o banco de dados do Software com alimentos e preparaccedilotildees
consumidas pelas participantes foram utilizadas as Tabelas de composiccedilatildeo de
alimentos PHILIPPI (2002) e TACO (2006) com a Tabela de medidas caseiras
(PINHEIRO et al 2005) aleacutem de dados adicionais de Composiccedilatildeo quiacutemica de alimentos
compilados da Tabela de Composiccedilatildeo de Alimentos da Fundaccedilatildeo Instituto brasileiro de
Geografia e Estatiacutestica (IBGE) Os valores obtidos foram comparados com os valores de
recomendaccedilatildeo propostos pelo United States Departament of Agriculture (USDA) em
seus documentos Dietary References Intakes (DRI) referentes aos valores de Estimated
Average Requirements (EAR) e para os nutrientes que ainda natildeo possuem esse valor
definido utilizou-se como paracircmetro valores de Adequate Intake (AI)
442 Avaliaccedilatildeo antropomeacutetrica do estado nutricional
A mensuraccedilatildeo do peso corporal em quilogramas (kg) foi realizada em
duplicata considerando-se o peso meacutedio Para tal foi utilizada uma balanccedila digital
Filizolareg com capacidade maacutexima para 150 kg e precisatildeo de 100 g estando as
participantes da pesquisa descalccedilas e com roupas leves A estatura em centiacutemetros
(cm) foi realizada em duplicata considerando-se a estatura meacutedia As medidas
foram determinadas por meio de um estadiocircmetro graduado em centiacutemetros com
precisatildeo de 10 mm apresentando barra de madeira vertical e fixa com esquadro
moacutevel para posicionamento sobre a cabeccedila do indiviacuteduo quando os mesmos
63
estavam descalccedilos em posiccedilatildeo ereta com os peacutes paralelos calcanhares
panturrilhas gluacuteteos ombros e cabeccedila encostados no estadiocircmetro olhando-se
para frente
O Iacutendice de Massa Corpoacuterea (IMC) foi calculado pelo peso e estatura a partir
das quais foi determinada a relaccedilatildeo entre o peso e altura em metros ao quadrado e
avaliado segundo os pontos de corte preconizados pela OMS assim designados
baixo peso (IMC lt 185 Kgaltura2) eutrofia (IMC= 185 a 249 kgaltura2) sobrepeso
(IMC= 25 a 299 Kgaltura2) e obesidade (IMC gt30 Kg altura2) (WHO 1998)
4421 Anaacutelise da Composiccedilatildeo Corporal pelo Meacutetodo de Bioimpedacircncia
O aparelho de bioimpedacircncia eleacutetrica utilizado para a avaliaccedilatildeo da composiccedilatildeo
corporal foi o InBody 720 (Biospace Coreia) que consiste em bioimpedacircncia
octopolar atraveacutes de oito pontos de contato pelos quais passa a corrente eleacutetrica na
extremidade dos quatro membros determinando a porcentagem de gordura e massa
magra em cada membro assim como no tronco
A avaliaccedilatildeo foi realizada respeitando os procedimentos apresentados no
respectivo manual de uso do aparelho atendendo as seguintes condiccedilotildees de preacute-
teste (1) estar em jejum (2) natildeo consumir aacutelcool 48 horas antes do teste (3) natildeo
realizar exerciacutecio de intensidade moderada a elevada nas 12 horas antes da
avaliaccedilatildeo (4) natildeo efetuar o exame perante em estado febril ou de desidrataccedilatildeo (5)
natildeo utilizar bijuterias metaacutelicas ou implantes dentaacuterios com metal (6) natildeo ingerir cafeacute
e (7) realizar a avaliaccedilatildeo com roupa de banho ou roupas iacutentimas
O relatoacuterio da bioimpedacircncia Octopolar eacute dividido em quatro partes
informativas de dados obtidos
1 Anaacutelise da Composiccedilatildeo Corporal identifica como estaacute distribuiacuteda a aacutegua
corporal total percentual de massa magra e massa de gordura livre
2 Anaacutelise Muacutesculo-gordura mostra em kg o peso a massa de muacutesculo
esqueleacutetico e a massa de gordura
3 Diagnoacutestico da obesidade discrimina o IMC PGC (porcentagem de
gordura corporal) e RCQ (relaccedilatildeo cintura-quadril)
4 Aacuterea de Gordura Visceral informa a aacuterea de gordura visceral em cm2
64
45 Coleta das amostras cliacutenicas
Para a obtenccedilatildeo das amostras de fezes as mulheres foram previamente
instruiacutedas de acordo com o National Committee for Clinical Laboratory Standards
NCCCLS (2007) evacuando diretamente no coletor plaacutestico esteacuteril fornecido
juntamente com luvas espaacutetula coletora e etiqueta de identificaccedilatildeo O material foi
acondicionado em caixa isoteacutermica resfriada com gelo e transportado
imediatamente ao Laboratoacuterio de Micoplasmas ICBUSP As amostras de fezes
foram distribuiacutedas em aliquotas (180-200 ug) em microtubos e acondicionadas -80oC
ateacute a anaacutelise laboratorial
Para a realizaccedilatildeo da coleta do material sanguiacuteneo o operador munido de EPIs
realizou punccedilatildeo venosa perifeacuterica preferencialmente em membro superior natildeo
dominante Foram coletados cerca de 5 mL de sangue por tubopaciente tendo sido
utilizados tubos natildeo-heparinizados que foram conservados de forma similar aos
coletores em caixa isoteacutermica refrigerada O material obtido foi levado ateacute o
Laboratoacuterio de Micoplasmas ICBUSP onde as amostras foram centrifugadas a
3500 rpm para obtenccedilatildeo do soro seguido de sua distribuiccedilatildeo em aliacutequotas de cerca
de 1 mL e estocados a -80 degC ateacute o uso
65
46 Determinaccedilatildeo da microbiota intestinal
461 Padronizaccedilatildeo de reaccedilatildeo de PCR quantitativo (qPCR) por meio de TaqMan para a detecccedilatildeo de Mollicutes
4611 Cepas bacterianas e condiccedilotildees de cultura
Como controle positivo utilizou-se a cepa ATCC 23114 (PG-21) de M hominis
Tambeacutem foram utilizados como controle os seguintes micro-organismos obtidos da
coleccedilatildeo do Laboratoacuterio de Micoplasmas ICBUSP Mycoplasma bovis Donetta M
arginini G230 M dispar M2979 M pneumoniae M pulmonis PG34 M
gallisepticum PG31 M synoviae WUU1853 M penetrans ATCC 55252 (GTU 54)
M fermentans PG18 M pulmonis PG34 M hyorhinis M genitalium ATCC 33530
(G37) M buccale M edwardii PG24 M gateae M faucium M felis CO M bovis
Spiroplasma mirum (SMCA) Acholeplasma laidlawii PG38 Ureaplasma diversum
ATCC 449782 U urealyticum T960 Escherichia coli ATCC 25922 Klebsiella
pneumoniae ATCC 13883 Streptococcus pyogenes ATCC 12345 Salmonella
typhimurium C5 CIP Pseudomonas aeruginosa ATCC 10145 Staphylococcus
aureus ATCC 25293 e Bacillus cereus As cepas referentes aos micro-organismos
Bacteroides fragilis C45A AUS 00306 e Clostridium perfringens foram cedidas pelo
Professor Dr Jorge Luiz Melo Sampaio pesquisador associado do Instituto Fleury
As espeacutecies de Ureaplasmas foram cultivadas em meio UB especiacutefico para
ureaplasma com 5 de CMRL-1066 (com glutamina e sem bicarbonato) enquanto
as espeacutecies de Micoplasmas foram cultivadas em meio de cultura SP4 como
descrito por Tully et al (1995) As bacteacuterias com parede celular incluiacutedas como
controles foram cultivadas em meio de infusatildeo de ceacuterebro-coraccedilatildeo (BHI) Destas
cepas o DNA foi extraiacutedo a partir de culturas em fase logariacutetmica por meio do kit
Pure Linktrade Genomic DNA da Invitrogenreg
4612 Desenvolvimento de primers e sonda para a detecccedilatildeo de Mollicutes pela PCR quantitativa
Os oligonucleotiacutedeos iniciadores e as sondas foram selecionadas com base no
fragmento conservado do gene 16S rRNA especiacutefico para a classe Mollicutes As
sequecircncias do gene 16S rRNA de micoplasmas foram alinhadas utilizando o
algoritmo ClustalW do Software MEGA4 As regiotildees variaacuteveis foram selecionadas
66
manualmente para o sequencionamento dos iniciadores e sondas utilizadas neste
ensaio Propriedades dos oligonucleotiacutedeos foram tambeacutem analisadas pelo Software
Primer Express ver 30 (Applied Biosystems Life Technologies Corporation
Carlsbad CA EUA) A especificidade dos iniciadores e da sonda foi testada ldquoin
silicordquo utilizando algoritmos BLAST
O quadro 02 mostra as sequecircncias forward e reverse selecionadas para
amplificar um fragmento conservado do gene 16S rRNA especiacutefico de Mollicutes A
sonda TaqMan especiacutefica para o fragmento amplificado foi desenvolvida por uma
fonte comercial (Applied Biosystems Life Technologies Corporation)
Quadro 2 - Sequecircncias dos iniciadores utilizados para amplificaccedilatildeo do gene 16S rRNA para Mollicutes
Iniciadores Sequecircncia
Molli1 5 GCA TTA GAT GAT CCG CCT GAG T 3
Molli2 5 GTC CCC GTC AAT TCC TTT AAG TT 3
Sonda 5 GTC CCC GTC AAT TCC TTT AAG TT 3
4613 PCR quantitativa
Ensaios de quantificaccedilatildeo absoluta do DNA alvo foram realizados com sistema
de PCR em tempo real (qPCR) StepOne (Applied Biosystems Life Technologies
Corporation) Diferentes concentraccedilotildees de cada primer iniciador e sonda foram
testados para aprimorar a reaccedilatildeo de qPCR Considerou-se ideal as seguintes
caracteriacutesticas r2 ge 0950 eficiecircncia entre 95 a 105 e slope proacuteximo de -332
A melhor reaccedilatildeo obtida foi a partir de 625 microl de Universal PCR Master Mix
(Applied Biosystems) 1 microM de cada iniciador 05 microM de sonda TaqMan MGB
marcada com corante fluorescente 25 microl de DNA extraiacutedo e aacutegua sem RNase para
o volume final de 125 microl As condiccedilotildees de amplificaccedilatildeo foram 50 degC por 10 min 95
degC por 10 min e 45 ciclos de desnaturaccedilatildeo a 95 degC durante 15 s anelamento a 59
degC durante 1 min Todas as reaccedilotildees foram realizadas em duplicata no aparelho
PCR em tempo real StepOnePlus (Applied Biosystems)
67
Para a construccedilatildeo de padrotildees de DNA para a quantificaccedilatildeo absoluta utilizou-
se como controle positivo a cepa de referecircncia ndash M hominis ATCC 23114 (PG-21)
que foi inicialmente cultivada em 1 ml de caldo SP4 a 37 degC e expandidos ateacute 100
ml Na fase de crescimento logariacutetmico (com base em alteraccedilotildees colorimeacutetricas) a
cultura foi centrifugada a 20600 rpm durante 30 minutos a 25 degC O DNA foi extraiacutedo
usando o kit PureLinktrade Genomic DNA Mini O nuacutemero de coacutepias de DNA genocircmico
foi calculado por espectrofotometria (NanoDrop ND -1000 WITec Ag Littau Suiacuteccedila)
Diluiccedilotildees decimais (107- 1 coacutepiasl) do DNA de M hominis para curva padratildeo foram
preparadas e analisadas
Os dados foram obtidos durante a etapa de anelamento e analisados pelo
Software StepOne 21 (Applied Biosystems Life Technologies Corporation) O limiar
foi ajustado manualmente dentro da curva logariacutetmica acima do niacutevel de detecccedilatildeo
basal e abaixo da fase linear e do platocirc O ciclo limiar (Ct-threshold cycle) das
diluiccedilotildees do genoma foi plotado contra o nuacutemero de log de coacutepias do genoma e
utilizado como entrada para criar a curva padratildeo Anaacutelises de regressatildeo linear foram
aplicadas para calcular os valores de r2 e do slope Assumindo a eficiecircncia de 100
se o molde de DNA eacute duplicado em cada ciclo a eficiecircncia da PCR foi calculada
como E= 10 (-1slope) - 1 onde E eacute a eficiecircncia da PCR
4614 Especificidade da qPCR e repetibilidade intra e inter-ensaios
O DNA dos micro-organismos utilizados como controles foi testado para
verificar a especificidade dos ensaios de qPCR (descrito em cepas bacterianas) A
repetibilidade intra-ensaio foi determinada executando cinco repeticcedilotildees das diluiccedilotildees
do genoma de M hominis (107 a 1 coacutepia do genoma bacterianoreaccedilatildeo) na mesma
reaccedilatildeo A curva padratildeo foi gerada utilizando o software StepOne 21 (Applied
Biosystems Life Technologies Corporation) A repetibilidade inter-ensaio foi obtida
por reaccedilotildees em triplicatas com a mesma diluiccedilatildeo do genoma em trecircs ensaios
diferentes em dias separados e consecutivos Estas repeticcedilotildees foram aplicadas
para determinar a meacutedia o desvio padratildeo e o coeficiente de variaccedilatildeo em valores de
Ct para cada diluiccedilatildeo do genoma
68
462 Reaccedilatildeo em cadeia da polimerase (PCR) convencional
As amostras cliacutenicas tambeacutem foram submetidas a PCR convencional para a
detecccedilatildeo da Classe Mollicutes utilizando-se dos os iniciadores descritos por Van
Kuppeveld et al (1992) Aacutegua livre de nuclease foi utilizada como controle negativo
em ambos os ensaios Os produtos amplificados foram analisados em gel de
agarose a 15 com brometo de etiacutedio 05 mmmL e tampatildeo TAE (Trisacetate 40
mM EDTA 2 mM pH 80) Os produtos foram visualizados e foto documentados sob
luz ultravioleta utilizando um sistema foto documentador (Vilber Lourmat Marne-la-
Vallee Franccedila)
463 Detecccedilatildeo de micro-organismos dos filos Firmicutes e Bacteroidetes e bacteacuterias totais (Eubacterias) por PCR em tempo Real (qPCR)
Para a construccedilatildeo de padrotildees de DNA para a quantificaccedilatildeo absoluta de
Firmicutes e Bacteroidetes utilizou-se como controles positivos as cepas de
referecircncias ndash Clostridium perfringens e Bacteroides fragilis respectivamente Para a
quantificaccedilatildeo de Bacteacuterias Totais (Eubacteacuterias) foi utilizado como controle positivo
Clostridium perfringens Os controles foram submetidos agrave extraccedilatildeo de DNA por meio
do kit QIAamp DNA stool ndash QIAGEN baseado no protocolo de extraccedilatildeo sugerido
pelo fabricante Para os filos Firmicutes Bacteroidetes assim como Bacteacuterias totais
foram utilizadas sequencias de iniciadores descritos por Guo et al (2008)
apresentadas no quadro 3
69
Quadro 3 ndash Sequecircncias dos iniciadores utilizados para amplificaccedilatildeo do gene 16S rRNA para Firmicutes Bacteroidetes e Bacteacuterias Totais (Eubacteacuterias)
Iniciadores Sequecircncia Referecircncia
Firm934F 5 GGA GYA TGT GGT TTA ATT CGA AGC A 3 GUO et al 2008
Firm1060R 5 AGC TGA CGA CAA CCA TGC AC 3
Bact934F 5 GGA RCA TGT GGT TTA ATT CGA TGA T 3 GUO et al 2008
Bact1060R 5 AGC TGA CGA CAA CCA TGC AG 3
Eub338F 5 ACT CCT ACG GGA GGC AGC AG 3 FIERER et al 2005
Eub518R 5 ATT ACC GCG GCT GCT GG 3
Os micro-organismos foram quantificados de modo absoluto baseando-se em
curva padratildeo previamente estabelecida Para cada reaccedilatildeo finalizada uma nova
curva padratildeo foi adicionada e paracircmetros de qualidade foram adotados na anaacutelise
sendo estes r2 ge 0950 eficiecircncia da reaccedilatildeo variando de 95 a 105 e slope
proacuteximo de -332
As reaccedilotildees de qPCR foram realizadas em volume final de 125 μL com 625
μL da mistura universal SYBR Green (Applied Biosystems Satildeo Paulo SP Brasil)
0 25 μM de cada primer especiacutefico 45μL de aacutegua e 125 μl de DNA extraiacutedo com
volume final de 125 μL As quantificaccedilotildees foram realizadas utilizando-se a
plataforma Applied Biosystems (Life Technologies Corporation) com os seguintes
paracircmetros 50 degC por 10 minutos 95 degC por 10 minutos seguidos de 45 ciclos de
95 degC por 15 segundos e 60degC por 1 minuto seguidas da curva de melting (15
segundos a 95 degC 1 minuto a 60 degC 15 segundos a 95 degC e 15 segundos e 60 degC)
47 Dosagem de citocinas do soro sanguiacuteneo
A dosagem das citocinas IL-1β TNF-α IL-10 e IL17-A foram realizadas
utilizando-se kit de ELISA de captura (eBioscience San Diego C A Estados
Unidos) em placas de poliestireno com 96 orifiacutecios e alta absorccedilatildeo de acordo com
protocolo indicado pelo fabricante Apoacutes padronizaccedilatildeo da curva padratildeo a aliacutequota
de 100 microL do sobrenadante das ceacutelulas foi utilizada para dosar as citocinas IL-1β
TNF-α IL-10 e IL17-A A leitura foi realizada com instrumento leitor de ELISA Vivid
70
Vision com comprimento de onda de 450 nm Os dados obtidos em absorbacircncia
foram transformados em picomols por meio de foacutermula matemaacutetica
48 Anaacutelises Estatiacutesticas
As anaacutelises estatiacutesticas da presenccedila dos microrganismos da classe Mollicutes
detectados nas amostras cliacutenicas e dos dados obtidos dos questionaacuterios foram
avaliados por meio do software SPSS 200 (SPSSreg Inc Chicago Estados Unidos)
Para comparar variaacuteveis de consumo alimentar e as variaacuteveis relacionadas ao perfil
da populaccedilatildeo estudada entre os grupos caso e controle foi aplicado Teste de qui-
quadrado de Pearson ou Teste Exato de Fisher tendo sido considerado plt005 e IC
95 O teste t que compara meacutedia entre grupos foi utilizado para verificar a
existecircncia de associaccedilatildeo entre as variaacuteveis desfecho (mulheres obesas x mulheres
eutroacuteficas) e as variaacuteveis Mollicutes (presenccedila x ausecircncia) com o consumo
alimentar dos macronutrientes carboidratos proteiacutenas lipiacutedeos e fibras (p le 005)
Unidos) Aleacutem disso para verificaccedilatildeo de associaccedilatildeo entre as variaacuteveis desfecho e a
presenccedila de Mollicutes foi aplicado Teste de qui-quadrado de Pearson ou Teste
Exato de Fisher tendo sido calculada a razatildeo de chances (odds ratio) (IC 95)
com o objetivo de verificar o poder da associaccedilatildeo entre as variaacuteveis supracitadas
Para verificar as distribuiccedilotildees de cargas dos micro-organismos estudados em
ambos os grupos avaliados inicialmente foi utilizado o teste de normalidade de
Shapiro-Wilk que demonstrou natildeo satisfazer a preacute-suposiccedilatildeo para utilizaccedilatildeo de um
teste parameacutetrico A partir desse resultado foi utilizado o teste natildeo-parameacutetrico de
Mann-Whitney amplamente utilizado para amostras pareadas que natildeo seguem
distribuiccedilatildeo normal As anaacutelises foram realizadas utilizando o programa estatiacutestico
GraphPad Prism versatildeo 500 (GraphPad Software San Diego California USA)
sendo estabelecida a existecircncia de significacircncia estatiacutestica quando o valor de p le
005 em todas as anaacutelises
Para anaacutelise dos dados de quantificaccedilatildeo das citocinas tambeacutem foi utilizado o
programa GraphPad Prism versatildeo 500 (GraphPad Software San Diego California
USA) tendo sido realizado o teste natildeo-parameacutetrico de Mann-Whitney
71
5 RESULTADOS
51 Perfil da populaccedilatildeo estudada
A amostragem do estudo envolveu 40 mulheres sendo 20 classificadas com
obesidade (IMC gt30 Kgm2) e 20 em eutrofia (IMC 185 - 249 Kgm2) com meacutedia de
idade de 38 anos para todas as mulheres 44 anos (DP 93 Amplitude 28-57) para
as mulheres obesas do grupo caso e 33 anos (DP 1204 Amplitude22-66) para as
mulheres eutroacuteficas do grupo controle
No presente estudo as variaacuteveis foram agrupadas em 9 Seccedilotildees com
resultados descritivos representados nas tabelas de 1 a 9 que representam a
subcategorizaccedilatildeo das variaacuteveis independentes para determinaccedilatildeo do perfil da
populaccedilatildeo estudada
O grupo das mulheres obesas foi caracterizado pela maioria de cor preta
parda ou indiacutegena (70) onde as moleacutestias atuais associadas mais frequentes
foram hipertensatildeo (30) dispneia (35) constipaccedilatildeo (35) refluxo (35) e
alteraccedilatildeo menstrual (55) A maioria das mulheres nasceram de parto normal
(75) foram amamentadas (90) jaacute tiveram filhos (70) e foram classificadas
como fisicamente ativas (60) Aleacutem disso 13 (65) das mulheres do grupo caso
referiram fazer trecircs ou mais refeiccedilotildees por dia Em relaccedilatildeo ao grupo das mulheres
eutroacuteficas esse foi caracterizado pela maioria de cor branca ou amarela (55) onde
as moleacutestias atuais associadas mais frequentes foram hipercolesterolemia (5)
dispneia (5) gastrite (15) e constipaccedilatildeo (20) Metade das mulheres nasceram
de parto normal (50) e foram amamentadas (85) enquanto 2 (10) tiveram
filhos e 9 (55) foram classificadas como fisicamente ativas Assim como o grupo
caso 13 (65) das mulheres do grupo controle referiram fracionar sua refeiccedilatildeo em
trecircs ou mais por dia
Aleacutem disso observa-se com base nos resultados estatiacutesticos que houve
variaccedilatildeo significativa na comparaccedilatildeo das variaacuteveis relacionadas ao perfil da
populaccedilatildeo estudada Em relaccedilatildeo agrave Seccedilatildeo 1 Histoacuteria Cliacutenica foram encontradas
variaccedilotildees significativas para as variaacuteveis associadas ao trato gastrintestinal
flatulecircncia (p=0008) refluxo (p=0018) azia (p=0008) e para as variaacuteveis
associadas agrave Moleacutestia atual hipertensatildeo (p=0008) dispneacuteia (p=0008) e alteraccedilatildeo
menstrual (p=0000) Em relaccedilatildeo agrave Seccedilatildeo 4 Histoacuteria Obsteacutetrica foi encontrada
72
variaccedilatildeo significativa para a variaacutevel gestaccedilatildeo (p=0000) Para a Seccedilatildeo 5 Histoacuteria
ginecoloacutegica observou-se variaccedilatildeo estatiacutestica para a variaacutevel menopausa (p=0038)
Tabela 1 ndash Determinaccedilatildeo do perfil da populaccedilatildeo estudada referente agrave Seccedilatildeo 1 Dados socioeconocircmicos Satildeo Paulo SP 2013-2014
Nota n= 20 mulheresa ndash Considerou-se como valor de Salaacuterio Miacutenimo (R$ 67800) ndash Significacircncia estatiacutestica quando p-valor le 005
Tabela 2 ndash Determinaccedilatildeo do perfil da populaccedilatildeo estudada referente agrave Seccedilatildeo 2 Histoacuteria Familiar Satildeo Paulo SP 2013-2014
Nota n= 20 mulheres a ndash Referente agrave parentes de primeiro grau paternos e maternos aleacutem de irmatildeos ndash Significacircncia estatiacutestica quando p-valor le 005
Variaacuteveis
Grupo Caso n ()
Grupo Controle n ()
IC 95 P
Raccedilacor
009-128 0110 PretaPardaIndiacutegena BrancaAmarela
14 (70) 6 (30)
9 (45) 11 (55)
Escolaridade
096-128 0147 lt Ensino Meacutedio ge Ensino Meacutedio
1 (5) 19(95)
0 (0) 20 (100)
Relaccedilatildeo Estaacutevel
023-283 0752 Sim Natildeo
11 (55) 9 (45)
10 (50) 10 (50)
Renda familiar
010-155 0185 lt 2 salaacuterios miacutenimosa ge 2 salaacuterios miacutenimosa
9 (45) 11 (55)
5 (25) 15 (75 )
Variaacuteveis
Grupo Caso n ()
Grupo Controle n ()
IC 95 P
Famiacutelia hipertensatildeo
006-120 0077 Sim Natildeo
17 (85) 3 (15)
12 (60) 8 (40)
Famiacutelia diabetesa
013-157 0206 Sim Natildeo
12 (60) 8 (40)
8 (40) 12 (60)
Famiacutelia obesidadea
007-106 0058 Sim Natildeo
13 (65) 7(35)
7 (35) 13 (65)
Famiacutelia hipercolesterolemiaa
035-430 0749 Sim Natildeo
11 (55) 9 (45)
12 (60) 8 (40)
Famiacutelia Doenccedilas Caacuterdio-vasculares (DCV)a
029-345 1000 Sim Natildeo
10 (50) 10 (50)
10 (50) 10 (50)
73
Tabela 3 ndash Determinaccedilatildeo do perfil da populaccedilatildeo estudada referente agrave Seccedilatildeo 3 Histoacuteria Cliacutenica Satildeo Paulo SP 2013-2014
Nota n=20 mulheres a- Histoacuterico cliacutenico das pacientes em relaccedilatildeo agrave alteraccedilotildees gastrintestinais moleacutestia atual e uso de laxantes- Diferenccedila estatiacutestica natildeo computada pois a variaacutevel eacute uma constante
Variaacuteveis
Grupo Caso n ()
Grupo Controle n ()
IC 95 P
TGI constipaccedilatildeoa
003-115 0058 Sim Natildeo
7 (35) 13 (65)
2 (10) 18 (90)
TGI flatulecircnciaa
107-190 0008 Sim Natildeo
6 (30) 14 (70)
0 (0) 20 (100)
TGI refluxoa
001-089 0018 Sim Natildeo
7 (35) 13 (65)
1 (5) 19 (95)
TGI aziaa
107-190 0008 Sim Natildeo
6 (30) 14 (70)
0 (0) 20 (100)
TGI uacutelceraa
095-116 0311 Sim Natildeo
1 (5) 19 (95)
0 00) 20 (100)
TGI gastritea Sim Natildeo
2 (10)
18 (90)
3 (15)
17 (85) 023-107 0633
TGI naacuteuseasa Sim Natildeo
3 (15)
17(85)
1 (5)
19 (95) 002-314 0292
TGI vocircmitosa Sim Natildeo
1 (5)
19 (95)
0 (0)
20 (100) 095-116 0311
TGI diarreacuteiaa Sim Natildeo
0 (0)
20(100)
0 (0)
20 (100)
Moleacutestia atual hipertensatildeoa Sim Natildeo
6 (30)
14 (70)
0 (0)
20 (100) 107-190 0008
Moleacutestia atual diabetesa Sim Natildeo
0 (0)
20 (100)
0 (0)
20 (100)
Moleacutestia atual hipercolesterolemiaa Sim Natildeo
5 (25)
15 (75)
1 (5)
19 (95) 001-150 0077
Moleacutestia atual DCVa Sim Natildeo
2 (10)
18 (90)
0 (0)
20 (100) 096-128 0147
Moleacutestia atual Dispneacuteiaa Sim Natildeo
7 (35)
13 (65)
1 (5)
19 (95) 001-089 0018
Moleacutestia atual alteraccedilatildeo menstruala Sim Natildeo
11 (55)
9 (45)
0 (0)
20 (100) 136-360 0000
Uso de laxantesa Sim Natildeo
3 (15)
17 (85)
0 (0)
20 (100) 097-141 0072
74
Tabela 4 ndash Determinaccedilatildeo do perfil da populaccedilatildeo estudada referente agrave Seccedilatildeo 4 Histoacuteria Obsteacutetrica Satildeo Paulo SP 2013-2014
Nota n= 20 mulheres andash Foram considerados aspectos relacionados as pacientes em seu nascimento e na maternidade ndash Significacircncia estatiacutestica quando p-valor le 005
Variaacuteveis
Grupo Caso n ()
Grupo controle n ()
IC 95 P
Nascimento por parto cesaacutereaa
078-1144 0102 Sim Natildeo
5 (25) 15(75)
10 (50) 10 (50)
Nascimento por parto normala
008-127 0102 Sim Natildeo
15 (75) 5 (25)
10 (50) 10 (50)
Foi amamentadaa
009-424 0633 Sim Natildeo
18 (90) 2 (30)
17 (85) 3 (15)
Teve alguma gestaccedilatildeoa
0008-0273 0000 Sim Natildeo
14 (70) 6 (30)
2 (10) 18 (90)
Sofreu algum abortoa Sim Natildeo
2 (10)
18 (90)
2 (10)
18 (90) 096-128 0147
75
Tabela 5 ndash Determinaccedilatildeo do perfil da populaccedilatildeo estudada referente agrave Seccedilatildeo 5 Histoacuteria Ginecoloacutegica Satildeo Paulo SP 2013-2014
Nota n= 20 mulheres andash Idade meacutedia em que todas as mulheres estudadas comeccedilaram a ingerir
contraceptivo 22 anos ndash Significacircncia estatiacutestica quando p-valor le 0005
Tabela 6 ndash Determinaccedilatildeo do perfil da populaccedilatildeo estudada referente agrave Seccedilatildeo 6 Consumo atual de tabaco Satildeo Paulo SP 2013-2014
Nota n= 20 mulheres ndash Significacircncia estatiacutestica quando p-valor le 005
Variaacuteveis
Grupo Caso n ()
Grupo Controle n ()
IC 95 P
Menopausa
004-097 0038 Sim Natildeo
9 (45) 11(55)
3 (15) 17 (85)
Usou ou estaacute usando contraceptivo
021-470 1000 Sim Natildeo
16 (80) 4 (20)
16 (80) 14 (20)
Contraceptivo hormonal
041-633 0490 Sim Natildeo
13 (65) 7 (35)
15 (75) 5 (25)
Contraceptivo natildeo hormonal
002-314 0292 Sim Natildeo
3 (15) 17(85)
1 (5) 19 (95)
Idade que comeccedilou a ingerir ge 22 anosa
011-156 0197 Sim Natildeo
10 (50) 10 (50)
6 (30) 14 (70)
Idade que comeccedilou a ingerir lt 22 anosa Sim Natildeo
2 (10)
18 (90)
2 (10)
18 (90) 063-853 0197
Variaacuteveis
Grupo Caso n ()
Grupo Controle n ()
IC 95 P
Consumo atual de tabaco
002-207 0151 Sim Natildeo
4 (20) 16 (80)
1 (5) 19 (95)
Jaacute consumiu tabaco
023-418 1000 Sim Natildeo
5 (25) 15 (75)
5 (25) 15 (75)
76
Tabela 7 ndash Determinaccedilatildeo do perfil da populaccedilatildeo estudada referente agrave Seccedilatildeo 7 Consumo atual de aacutelcool Satildeo Paulo SP 2013-2014
Nota n= 20 mulheres ndash Significacircncia estatiacutestica quando p-valor le 005
Tabela 8 ndash Tabela de determinaccedilatildeo do perfil da populaccedilatildeo estudada referente agrave Seccedilatildeo 8 Atividade Fiacutesica (IPAQ versatildeo curta) Satildeo Paulo SP 2013-2014
Nota n= 20 mulheres andash Para a classificaccedilatildeo foi utilizado o IPAQ (International Physical Activity Questionnaire) versatildeo curta Irregularmente ativa Irregularmente ativa A e B ndash Significacircncia estatiacutestica quando p-valor le 005
Variaacuteveis
Grupo Caso n ()
Grupo Controle n ()
IC 95 P
Consumo atual de aacutelcool
052-643 0342 Sim Natildeo
8 (40) 12 (60)
11 (55) 9 (45)
Variaacuteveis
Grupo Caso n ()
Grupo Controle
IC 95 P
Niacutevel de atividade fiacutesica
015-191 0342 Ativaa Irregularmente ativaa
12 (60) 8 (40)
9 (45) 11 (55)
77
Tabela 9 ndash Tabela de determinaccedilatildeo do perfil da populaccedilatildeo estudada referente agrave Seccedilatildeo 9 Mudanccedilas recentes nos haacutebitos alimentares Satildeo Paulo SP 2013-2014
Nota n= 20 mulheres andash Meacutedia de refeiccedilotildees diaacuterias 3 refeiccedilotildees - Diferenccedila estatiacutestica natildeo
computada pois a variaacutevel eacute uma constante ndash Significacircncia estatiacutestica quando p-valor le 005
Variaacuteveis
Grupo Caso n ()
Grupo Controle
n ()
IC 95 P
Mudou haacutebitos alimentares recentemente
007-151 0144 Sim Natildeo
7 (35) 13 (65)
3 (15) 17 (85)
Mudou haacutebitos alimentares recentemente para perda de peso
007-151 0144 Sim Natildeo
7 (35) 13 (65)
3 (15) 17 (85)
Mudou haacutebitos alimentares recentemente para dieta vegetariana ou restriccedilatildeo de consumo carne
Sim Natildeo
0(0) 20(100)
0(0) 20(100)
Mudou haacutebitos alimentares recentemente restriccedilatildeo de consumo sal
Sim Natildeo
0(0) 20(100)
0(0) 20(100)
Mudou haacutebitos alimentares recentemente para reduccedilatildeo do colesterol
Sim Natildeo
0(0) 20(100)
0(0) 20(100)
ge refeiccedilotildeesdiaa
Sim Natildeo
13(65) 7(35)
14(70) 6(30)
033-473 0736
lt refeiccedilotildeesdiaa
Sim Natildeo
7(35)
13(65) 7(35)
13(65) 027-366 1000
Desjejum diariamente
051-900 0288 Sim Natildeo
13 (35) 7(65)
16 (80) 4 (20)
Costuma beliscar entre as refeiccedilotildees
035-430 0749 Sim Natildeo
11 (55) 9 (45)
12 (60) 8 (40)
Costuma ingerir liacutequidos durante as refeiccedilotildees
009-154 0168 Sim Natildeo
16 (80) 4 (20)
12 (60) 8 (40)
Costuma fazer refeiccedilotildees fora de casa
112-933 0018 Sim Natildeo
12 (60) 8 (40)
19 (95) 1 (5)
78
52 Determinaccedilatildeo do estado nutricional
521 Avaliaccedilatildeo qualitativa do consumo alimentar
Na Tabela 10 (apecircndice) encontra-se a participaccedilatildeo dos alimentos nos grupos
e meacutedias de consumo diaacuterio dos alimentos pela populaccedilatildeo estudada Os alimentos
mais consumidos e que apresentaram frequecircncia diaacuteria de uma vez ao dia ou mais
em relaccedilatildeo ao grupo caso foram feijatildeo arroz alface tomate e oacuteleo azeite ou
vinagre para tempero de salada Em relaccedilatildeo ao grupo controle os que apresentaram
consumo diaacuterio de uma vez ou mais foram arroz e patildeo francecircs patildeo de forma
integral patildeo doce ou torrada
O percentual de consumo dos 16 grupos alimentares identificados derivados
do QFA (Tabela 11) em relaccedilatildeo ao grupo caso que foram consumidos por 80 ou
mais da populaccedilatildeo foram massas carne vermelha e ovos embutidos carne branca
cereais raiacutezes e tubeacuterculos hortaliccedilas e frutas No mesmo grupo populacional os
grupos alimentares de menor consumo foram bebida alcooacutelica leite e derivados e
preparaccedilotildees com percentuais de consumo de 30 493 e 525
respectivamente Os grupos que apresentaram consumo intermediaacuterio foram
Infusatildeo Oacuteleos e gorduras accediluacutecar e doces lanches leguminosas e alimentos
industrializados com percentuais de consumo de 60 616 65 783 783 e
79 respectivamente No grupo controle os grupos alimentares que apresentaram
consumo de 80 ou mais da populaccedilatildeo foram massa carne vermelha e ovos carne
branca cereais raiacutezes e tubeacuterculos hortaliccedilas lanches e accediluacutecar e doces Ainda
nesse grupo populacional os grupos alimentares de menor consumo assim como no
grupo caso foram bebida alcooacutelica preparaccedilotildees e leite e derivados com
percentuais de consumo de 45 45 e 486 respectivamente Os grupos que
apresentaram consumo intermediaacuterio foram oacuteleos e gorduras Infusatildeo alimentos
embutidos leguminosas alimentos industrializados e frutas com percentuais de
consumo de 616 65 65 65 657 731 respectivamente
79
Tabela 11 ndash Definiccedilatildeo dos grupos alimentares derivados do Questionaacuterio de Frequecircncia Alimentar (QFA) e percentual de consumo da populaccedilatildeo estudada Satildeo Paulo SP 2013-2014
Grupo Alimentar
Grupo Consumo Alimentos
Massas
Caso 90 Macarratildeo com molho sem carne macarratildeo com molho com
carne lasanha nhoque pizza e panqueca Controle 916
Preparaccedilatildeo Caso
525 Sopas polenta cozida ou frita
Controle 45
Carne vermelha e ovos
Caso 888 Carne bovina Carne de porco carne de sol bacon e ovo
Controle 813
Embutidos Caso 825 Linguiccedila e embutidos (presunto mortadela salsicha)
Controle 65
Carne branca Caso 975 Frango peixe e frutos do mar
Controle 95
Leite e derivados
Caso 493 Leite integral leite desnatado leite semi-desnatado iogurte
natural iogurte com frutas queijo mussarela queijo prato
parmesatildeo provolone queijo minas e ricota
Controle 486
Leguminosas
Caso 783 Feijatildeo lentilha ervilha seca gratildeo de bico soja feijoada feijatildeo tropeiro
Controle 65
Cereais raiacutezes e tubeacuterculos
Caso
813
Arroz branco integral cozido com oacuteleo e temperos batata frita
mandioca frita batata cozida mandioca cozida inhame purecirc
de batatas ou mandioca farinha de mandioca farofa cuscuz
tapioca aveia patildeo francecircs patildeo de forma torrada biscoito
sem recheio doce e salgado biscoito recheado biscoito
amanteigado waffer bolo simples bolo recheado
Controle
887
Hortaliccedilas
Caso 964 Alface tomate cenoura outros legumes (abobrinha berinjela chuchu pepino) outras verduras cruas (acelga ruacutecula agriatildeo) outras verduras cozidas (acelga espinafre escarola couve) broacutecolis couve-flor e repolho
Controle 926
Frutas Caso 825 Laranja mexerica abacaxi banana maccedila pecircra melatildeo
melancia mamatildeo goiaba abacate suco natural Controle 731
Industrializados
Caso
79
Maionese condimentos molho para salada patecirc chantilly suco industrializado refrigerante comum diet e light hambuacuterguer nuggets almondegas Controle 657
Infusatildeo Caso 60 Chaacute e cafeacute sem accediluacutecar chaacute e cafeacute com accediluacutecar
Controle 65
Bebida alcooacutelica Caso 30 Cerveja
Controle 45
Oacuteleos e gorduras Caso 616 Oacuteleo azeite vinagre manteiga ou margarina comum
manteiga ou margarina light Controle 616
Lanches Caso 783 Salgados fritos salgados assados sanduiacuteche
Controle 833
Aacutecuacutecar e doces Caso 65 Chocolate bombom brigadeiro chocolate em poacute sobremesas doces tortas e pudins accediluacutecar mel geleacuteia Controle 888
80
Todos os indiviacuteduos da pesquisa foram avaliados quanto a ingestatildeo dieteacutetica
Os dados dieteacuteticos obtidos foram traduzidos em energia macro e micronutrientes
(Tabela 12) Observa-se com base nos resultados estatiacutesticos que natildeo houve
variaccedilatildeo significativa no consumo alimentar das mulheres estudadas tendo sido
semelhante entre os grupos caso e controle Aleacutem disso ao realizar-se o teste t
comparando as meacutedias de consumo dos macronutrientes carboidratos proteiacutenas
lipiacutedios e fibras com as variaacuteveis desfecho (mulheres obesas x mulheres eutroacuteficas)
tambeacutem natildeo foram observadas associaccedilotildees estatisticamente significantes
Analisando a razatildeo de ingestatildeo quilocaloriasquilograma de peso corporal
tem-se que o grupo caso teve meacutedia de ingestatildeo energeacutetica de 199 kcalkgdia e o
grupo controle 279 kcalkgdia (Tabela 13) O grupo controle evidenciou consumo
compatiacutevel para a manutenccedilatildeo do seu peso (faixa de recomendaccedilatildeo 25-30
kcalkgdia) enquanto o grupo caso apresentou um niacutevel meacutedio de ingestatildeo abaixo
do valor de manutenccedilatildeo a ingestatildeo energeacutetica foi 204 menor do que a
recomendaccedilatildeo considerando-se o limite inferior de 25 kcalkgdia
Outra razatildeo de ingestatildeo gramas de proteiacutenasquilograma de peso corporal eacute
utilizada para caacutelculo e recomendaccedilatildeo de consumo proteacuteico sem prejuiacutezo da funccedilatildeo
renal (recomendaccedilatildeo de ingestatildeo 06 a 08 g de proteiacutenaskg de pesodia) O grupo
controle apresentou ingestatildeo proteacuteica acima do recomendado 12 g de proteiacutenaskg
de pesodia enquanto o grupo caso apresentou um niacutevel meacutedio de consumo
compatiacutevel com a recomendaccedilatildeo 078 g de proteiacutenaskg de pesodia apresentando-
se no limite maacuteximo preconizado (Tabela 13)
81
Tabela 12 ndash Anaacutelise de consumo de energia e nutrientes da populaccedilatildeo estudada Satildeo Paulo SP 2013-2014
Variaacuteveis Grupo Meacutedia de consumo
Desvio Padratildeo
IC 95 P
Energiadia (kcal)
Caso 18571 93622 (137401 ndash 205869) 093
Controle 1692 98334 (120438 ndash 217822)
Carboidratodia (g)
Caso 24345 16826 (16706 ndash 25787)
090 Controle 20785
10997 (15402 ndash 26294)
Gordura totaldia (g)
Caso
658
276
(5205 ndash 7926) 086
Controle
627
4714 (3998 ndash 8673)
Gordura polinsaturadadia
(g)
Caso 795 416 (617 ndash 937) 048
Controle 85 675 (575 ndash 1237)
Gordura monoinsaturadadia
(g)
Caso 206 925 (1640 ndash 2553)
059 Controle 182 1598
(1077 ndash 2651)
Gordura saturadadia (g)
Caso 2185 1149 (1670 ndash 2808)
075 Controle 204 1698 (1239 ndash 2924)
Proteiacutenadia (g) Caso 7355 3508 (5531 ndash 8905)
091 Controle 7285 4985 (4914 ndash 9849)
Fibra totaldia (g) Caso 168 902 (1247 ndash 1953)
027 Controle 1265 765 (944 ndash1699)
Fibra soluacuteveldia (g) Caso 4 332 (273 ndash 563)
029 Controle 285 23 (215 ndash 437)
Fibra insoluacuteveldia (g)
Caso 56 391 (404 ndash 703) 025
Controle 395 232 (338 ndash 562)
Colesteroldia (g) Caso 23635 13965 (17127 ndash 30877)
077 Controle 26105 26790 (12780 ndash 39313)
Vitamina Adia (UI) Caso 95885 55538 (70451 ndash 124904)
055 Controle 872 47033 (64231 ndash 110801)
Vitamina Cdia (mg) Caso 2105 18857 (11025 ndash 29152)
011 Controle 12035 8752 (7936 ndash 16565)
Vitamina B1dia (mg)
Caso 13 117 (131 ndash 204) 072
Controle 13 166 (104 ndash 260)
Vitamina B2dia (mg)
Caso 08 083 (107 ndash 174) 079
Controle 105 089 (103 ndash 193)
82
Tabela 12 ndash Anaacutelise de consumo de energia e nutrientes da populaccedilatildeo estudada Satildeo Paulo SP 2013-2014
(Continuaccedilatildeo)
Variaacuteveis Grupo Meacutedia
de consumo Desvio Padratildeo
IC 95 P
Vitamina B6dia (ug)
Caso 110 102 (121 ndash 197)
085 Controle 105 088 (110 ndash 197)
Vitamina B12dia (ug)
Caso 38 253 (309 ndash 562) 096
Controle 385 285 (302 ndash 578)
Vitamina Ddia (mg)
Caso 915 1620 (211 ndash 1803) 012
Controle 23 3357 (733 ndash 4061)
Niacinadia (mg)
Caso 19 1005 (1402 ndash 2191)
059 Controle 193
1303 (1339 ndash 2641)
Folatodia (mg)
Caso
24010
11621
(17758 ndash 28351) 054
Controle 20495 12117 (14708 ndash 26684)
Aacutecido pantotecircnicodia
(mg)
Caso 35 216 (292 ndash 443) 074
Controle 29 251 (220 ndash 469)
VitaminaEdia (mg)
Caso 1155 651 (894 ndash 1309) 079
Controle 99 625 (738 ndash 1368)
Iododia (mg) Caso 547 4984 (3206 ndash 8098)
049 Controle 4515 3674 (2814 ndash 6439)
Soacutediodia (mg) Caso 230285 159724 (155816 ndash 246261)
099 Controle 201715 148254 (127647 ndash 274446)
Caacutelciodia (mg) Caso 69045 42353 (47627 ndash 89502)
068 Controle 62645 33992 (46373 ndash 79973)
Magneacutesiodia (mg)
Caso 2325 10339 (17818 ndash 25995) 044
Controle 1947 9452 (14888 ndash 24255)
Zincodia (mg) Caso 85 523 (617 ndash 1115)
086 Controle 78 476 (603 ndash 1068)
Manganecircsdia (mg)
Caso 6 85 (206 ndash 1045) 064
Controle 1095 2019 (148 ndash 1446)
Potaacutessiodia (mg)
Caso 271955 117073 (208408 ndash 3131423) 029
Controle 220685 115874 (164415 ndash 279085)
Foacutesforodia (mg)
Caso 9754 44188 (73698 ndash 1151535) 086
Controle 9085 56939 (63379 ndash 119689)
83
Tabela 12 ndash Anaacutelise de consumo de energia e nutrientes da populaccedilatildeo estudada Satildeo Paulo SP 2013-2014
(Continuaccedilatildeo)
Variaacuteveis Grupo Meacutedia
de consumo Desvio Padratildeo
IC 95 P
Ferrodia (mg) Caso 137 859
(996 ndash 1538)
069
Controle 1145 616 (885 ndash 1492)
Cobredia (mg) Caso 1 0 917 (1 ndash 167)
090 Controle 085 109 (094 ndash 167)
Selecircniodia (ug) Caso 33475 21854 (23251 ndash 44777)
068 Controle 400 5844 (11179 ndash 69057)
Nota significacircncia estatiacutestica quando p-valor le 005
Tabela 13 ndash Comparaccedilatildeo das variaacuteveis dieteacuteticas relacionadas agraves razotildees de ingestatildeo e Valor Energeacutetico Total (VET) da populaccedilatildeo estudada Satildeo Paulo SP 2013-2014
Variaacuteveis Grupo Caso
Grupo controle
Energia (Kcal) 18571
1692
Kcalkgdia 199
279
Carboidrato (g) 24345
20785
Carboidrato (VET) 5241
4913
Proteiacutena (g) 7355
7285
Grama de proteiacutenakgdia
078
12
Proteiacutena (VET) 1584
1722
Lipiacutedeo (g) 658
627
Lipiacutedeo ( VET) 3188
3335
84
A partir de dados de meacutedia de ingestatildeo de macronutrientes comparou-se a
porcentagem que cada um deles carboidratos proteiacutenas e lipiacutedeos (Tabela 13)
representa no Valor Energeacutetico total (VET) ingerido com o intervalo de
balanceamento dieteacutetico proposto pelas Dietary References Intake (DRI) Assim
tem-se que os grupos caso e controle balancearam suas dietas conforme o intervalo
de distribuiccedilatildeo energeacutetica recomendado visualizado na figura 5 Em relaccedilatildeo ao
consumo de fibras foi observado que ambos os grupos apresentaram um consumo
inferior ao Adequate Intake (AI) com consumo de 168 e 1265 para os grupos
caso e controle respectivamente Em relaccedilatildeo ao consumo de lipiacutedios o consumo de
gordura saturada mostrou-se maior que os 7 recomendado pela Sociedade
Brasileira de Cardiologia (2007) em consonacircncia com a National Heart Lung e Blood
Institute dos Estados Unidos tanto no grupo caso quanto no grupo controle de
1058 e 1085 respectivamente
Figura 5 ndash Comparaccedilatildeo entre as meacutedias de consumo de macronutrientes dos Grupos Caso e Controle com a Faixa de Distribuiccedilatildeo Aceitaacutevel de macronutrientes (AMDRDRI) e AI (Adequate Intake) para a faixa etaacuteria de 20 a 70 anos Satildeo Paulo SP 2013-2014
Legenda ndash A recomendaccedilatildeo de consumo de macronutrientes para tal faixa etaacuteria eacute
para Carboidratos 45 a 65 do VET (Valor Energeacutetico Total) Proteiacutenas 10 a 35 do VET Lipiacutedeos 20 a 35 do VET e Fibras 21 a 26 gramasdia
85
A comparaccedilatildeo da meacutedia da ingestatildeo das vitaminas A C E e folato dos
grupos caso e controle com as recomendaccedilotildees de ingestatildeo mostrou que a meacutedia de
consumo dos grupos foi semelhante e de acordo com a recomendaccedilatildeo exceto para
folato e vitamina E em que ambos os grupos mostraram meacutedias de ingestatildeo abaixo
do recomendado (Figura 6)
Figura 6 ndash Comparaccedilatildeo entre as meacutedias de consumo das Vitaminas A C E e folato dos Grupos Caso e Controle com a Faixa de Distribuiccedilatildeo Aceitaacutevel de macronutrientes (AMDRDRI) e AI (Adequate Intake) para a faixa etaacuteria de 20 a 70 anos Satildeo Paulo SP 2013-2014
A comparaccedilatildeo da meacutedia das ingestotildees das Vitaminas B1 B2 B6 B12 D
Niacina e Aacutecido pantotecircnico dos grupos caso e controle com as recomendaccedilotildees de
ingestatildeo demonstrou que a meacutedia de consumo em relaccedilatildeo agraves vitaminas B1 e B12
estavam acima do recomendado nos dois grupos As vitaminas B6 e aacutecido
pantotecircnico apresentaram ingestatildeo inferior ao preconizado nos grupos caso e
controle Ambos os grupos estudados apresentaram consumo em concordacircncia com
as recomendaccedilotildees em relaccedilatildeo agrave niacina No entanto as vitaminas B2 e D
apresentaram consumo pelo grupo caso inferior enquanto o grupo controle
apresentou-se de acordo com a recomendaccedilatildeo (Figura 7)
86
Figura 7 ndash Comparaccedilatildeo entre as meacutedias de consumo das Vitaminas B1 B2 B6 B12 D Niacina e Aacutecido pantotecircnico dos Grupos Caso e Controle com a Faixa de Distribuiccedilatildeo Aceitaacutevel de macronutrientes (AMDRDRI)e AI (Adequate Intake) para a faixa etaacuteria de 20 a 70 anos Satildeo Paulo SP 2013-2014
Para os minerais foacutesforo e selecircnio a ingestatildeo dos grupos Caso e Controle
tambeacutem foi adequada Exceto para iodo caacutelcio e magneacutesio que tiveram a ingestatildeo
menor que a recomendaccedilatildeo e o cobre que apresentou uma ingestatildeo inferior ao
preconizado no grupo controle enquanto o grupo caso demonstrou uma ingestatildeo
adequada dentro dos limites de recomendaccedilatildeo (Figura 8)
87
Figura 8 ndash Comparaccedilatildeo entre as meacutedias de consumo de Sais Minerais dos Grupos Caso e Controle com a Faixa de Distribuiccedilatildeo Aceitaacutevel de macronutrientes (AMDRDRI)e AI (Adequate Intake) para a faixa etaacuteria de 20 a 70 anos Satildeo Paulo SP 2013-2014
Para os minerais e nutrientes soacutedio manganecircs e potaacutessio a ingestatildeo dos
grupos Caso e Controle foi adequada Exceto para ferro que apresentou ingestatildeo
menor que a recomendaccedilatildeo e o zinco que apresentou ingestatildeo um pouco inferior ao
preconizado no grupo controle enquanto o grupo caso demonstrou ingestatildeo
adequada dentro dos limites de recomendaccedilatildeo (Figura 9)
Figura 9 ndash Comparaccedilatildeo entre as meacutedias de consumo de Sais Minerais e outros nutrientes dos Grupos Caso e Controle com a Faixa de Distribuiccedilatildeo Aceitaacutevel de macronutrientes (AMDRDRI)e AI (Adequate Intake) para a faixa etaacuteria de 20 a 70 anos Satildeo Paulo SP 2013-2014
88
522 Avaliaccedilatildeo antropomeacutetrica do estado nutricional
Os resultados da avaliaccedilatildeo antropomeacutetrica estatildeo apresentados na tabela 14
Foi observado que as mulheres estudadas do grupo caso apresentaram meacutedia de
IMC (Iacutendice de massa corporal) de 365 kgm2 (DP 441 Amplitude 306-449) Ao
classificar as pacientes em classes de obesidade de acordo com os criteacuterios
determinados pela OMS (Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede) (1995) verificou-se que
nove (45) das mulheres apresentam obesidade grau I (IMC 30-3499 kgm2) sete
(35) apresentam obesidade grau II (IMC 35-3999 kgm2) e quatro (20) das
mulheres apresentam obesidade grau III (IMC ge 40 kgm2) As mulheres do grupo
controle apresentaram IMC meacutedio de 224 kgm2 (DP 204 Amplitude 188-249)
Em relaccedilatildeo ao percentual de gordura observou-se a meacutedia de 4535 (DP
518 Amplitude 354-534) de gordura corporal no grupo caso e 3004 (DP 671
Amplitude 113-404) no grupo controle indicando um excesso de gordura corporal
em ambos os grupos de acordo com LOHMAN (1992) Em relaccedilatildeo agrave essa
classificaccedilatildeo no grupo caso todas as mulheres apresentam riscos de doenccedilas
associadas agrave obesidade apresentando um percentual de gordura corporal maior que
32 Das mulheres do grupo controle 2 (10) apresentaram-se abaixo da meacutedia 1
(5) na meacutedia 8 (40) acima da meacutedia e 9 (45) apresentaram risco de
desenvolvimento de doenccedilas relacionadas com a obesidade
A avaliaccedilatildeo da Razatildeo cintura-quadril (RCQ) importante indicador de
obesidade central Comparando-se os resultados obtidos com o ponto de corte
recomendado pela OMS (Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede 1995) de 085 para
mulheres observou-se que todas as pacientes avaliadas do grupo caso apresentam-
se acima do recomendado com a meacutedia de RCQ de 099 (DP 0074 Amplitude
087-119) enquanto as mulheres do grupo controle apresentaram uma razatildeo meacutedia
de 083 (DP 0047 Amplitude 077-096) onde sete (35) mulheres apresentaram
a RCQ acima do valor referecircncia preconizado pela OMS No entanto ao avaliar a
Razatildeo cintura quadril de acordo com os pontos de corte propostos por LOHMAN et
al (1988) em relaccedilatildeo ao risco de desenvolvimento de doenccedilas associadas agrave
Siacutendrome Metaboacutelica (Doenccedilas cardiovasculares hipertensatildeo dislipidemia e
alteraccedilatildeo no metabolismo de carboidratos) os resultados demonstraram que em
relaccedilatildeo ao grupo caso 18 (90) das mulheres apresentaram alto risco para o
desenvolvimento dessas doenccedilas enquanto 2 (10) apresentaram risco moderado
89
Em relaccedilatildeo ao grupo controle foi observado que 3 (15) natildeo apresentaram riscos
13 (65) apresentaram baixo risco 1(5) apresentou risco moderado e 3 (15)
apresentaram alto risco para o desenvolvimento dessas doenccedilas
Tabela 14 ndash Comparaccedilatildeo de variaacuteveis antropomeacutetricas da populaccedilatildeo estudada
Variaacuteveis Grupo Meacutedia
Desvio Padratildeo
Miacutenimo Maacuteximo
Peso (kg) Caso 9329 105 7574 1075
Controle 6054 787 4575 7422
Estatura (m2) Caso 160 007 149 172
Controle 164 007 151 18
IMC (Kgm2) Caso 3645 452 306 449
Controle 2241 204 188 249
Razatildeo cintura-quadril (RCQ)
Caso 099 007 088 119
Controle 083 005 077 096
Gordura corporal total
()
Caso
4535
519
354
531
Controle
30035
671
113 404
90
53 Determinaccedilatildeo da microbiota intestinal
531 Padronizaccedilatildeo de reaccedilatildeo de PCR quantitativo (qPCR) por meio de TaqMan para a detecccedilatildeo de Mollicutes
Pela qPCR quantificou-se carga de Mollicutes representadas por unidades
formadoras de colocircnias (UFCmicrol) nas amostras de fezes O ensaio de qPCR
demonstrou eficiecircncia de reaccedilatildeo de E= 1033 (r2= 095) A sensibilidade do teste
foi de detecccedilatildeo de no miacutenimo dez coacutepias de genomareaccedilatildeo quando utilizados os
padrotildees de nuacutemero de coacutepias de DNA genocircmico diluiacutedo (Figura 10)
Figura 10 ndash Curva-padratildeo gerada a partir dos pontos de Ct obtidos com o graacutefico de amplificaccedilatildeo de diluiccedilotildees seriadas do controle positivo Mycoplasma hominis calculado pelo software StepOne 21 (Applied Biosystems Life Technologies Corporation) Satildeo Paulo SP 2013-2014
A repetibilidade testada por meio dos testes intra-ensaio e inter-ensaio da
qPCR estaacute apresentada na tabela 15 O ensaio foi especiacutefico para Mollicutes natildeo
tendo sido visualizada amplificaccedilatildeo dos controles microbianos de outros micro-
organismos utilizados
91
Tabela 15 ndash Repetibilidade intra-ensaio e inter-ensaio da qPCR para Mollicutes Satildeo Paulo SP 2013-2014
Nordm de coacutepias do Genoma
Repetibilidade intra-ensaio Repetibilidade inter-ensaio
Genoma bacteriano diluiacutedo
em 1times TE Genoma bacteriano diluiacutedo
em 1times TE
Ponto meacutedio de corte
(Ct plusmn SD) CV ()
Ponto meacutedio de corte (Ct plusmn SD)
CV ()
10 3537 plusmn 015 045 3494 plusmn 045 129
102 3425 plusmn 017 050 3379plusmn 029 087
103 3099 plusmn 021 070 3074 plusmn 039 128
104 2739 plusmn 023 084 2739 plusmn 038 142
105 2356 plusmn 012 054 2291plusmn 025 110
106 1874 plusmn 066 352 1915 plusmn 077 403
CV coeficiente de variaccedilatildeo
A PCR geneacuterica para Mollicutes foi positiva em 17 (85) das amostras
cliacutenicas do grupo caso e 8 (40) das amostras do grupo controle obtidas No
entanto nem todas as amostras positivas em cPCR para Mollicutes foram positivas
em qPCR 13 (65) das amostras do grupo caso e trecircs (15) do grupo controle
foram positivas em qPCR (Tabela 16)
Tabela 16 ndash Comparaccedilatildeo entre os resultados obtidos no teste de sensibilidade pelas teacutecnicas de PCR convencional e qPCR para detecccedilatildeo de Mollicutes Satildeo Paulo SP 2013-2014
Amostra
Grupo PCR convencional qPCR
n () n ()
Positivaa Caso 17 (85) 13 (65) Negativab 3 (15) 7 (35)
Positivaa
Negativab Controle 8 (40)
12 (60) 3 (15) 17 (85)
Nota n= 20 mulheres aPositiva - Detecccedilatildeo de produto de DNA esperado bNegativa - Ausecircncia de produto de DNA esperado
92
Por meio da PCR em tempo real foi possiacutevel quantificar o DNA e
consequentemente a carga do microrganismo representada por unidades
formadoras de colocircnias - ufcmicrol nas amostras de fezes coletadas Os resultados da
qPCR demonstraram uma carga meacutedia de Mollicutes nas amostras de fezes
analisadas referentes ao grupo caso de 584 x 103 ufcmicrol e de 156 ufcmicrol referentes
ao grupo controle Observa-se na figura 11 graacutefico de dispersatildeo referente agraves
cargas meacutedias das amostras positivas com detecccedilotildees de aproximadamente 101 a
103 UFCml de Mollicutes Contudo as meacutedias das dosagens foram maiores nas
mulheres do grupo caso E apoacutes anaacutelise estatiacutestica por Mann-Whitney foi possiacutevel
observar diferenccedila estatisticamente significante para a espeacutecie Mollicutes (p =
00023) Em seguida foi testada atraveacutes do teste de Odds Ratio a associaccedilatildeo
epidemioloacutegica entre as variaacuteveis desfecho (mulheres obesas x mulheres eutroacuteficas)
e as variaacuteveis Mollicutes (presenccedila x ausecircncia) tendo sido detectada uma
associaccedilatildeo positiva estatisticamente significante entre a presenccedila de Mollicutes e
mulheres obesas (OR= 115 IC= 242-554) Aleacutem disso ao realizar-se o teste t
comparando as meacutedias de consumo dos macronutrientes carboidratos proteiacutenas
lipiacutedios e fibras com as variaacuteveis Mollicutes (presenccedila x ausecircncia) natildeo foram
observadas associaccedilotildees estatisticamente significantes
Figura 11 - Quantificaccedilatildeo por qPCR de Mollicutes (UFCmicrol) a partir das amostras de fezes nos grupos caso e controle Satildeo Paulo SP 2013-2014
Legenda ndash Concentraccedilatildeo meacutedia de Mollicutes entre as mulheres do grupo caso (~584 x 103 UFC
microL) e controle (~156 UFC microL) estudadas e positivas para Mollicutes pelo qPCR (p-valor=00023)
Mediana e desvio padratildeo indicadas por linhas soacutelidas no graacutefico Anaacutelise estatiacutestica realizada por
Mann Whitney assumindo p-valor le 005
93
532 Detecccedilatildeo de micro-organismos dos filos Firmicutes e Bacteroidetes aleacutem de bacteacuterias totais (Eubacterias) por PCR em tempo Real (qPCR)
Todas as amostras 40 (100) foram positivas para Firmicutes e Bacteroidetes
na qPCR tanto para o grupo caso como para o controle Natildeo foram observadas
diferenccedilas estatisticamente significantes para as cargas de Firmicutes Bacteroidetes
e Bacteacuterias totais entre as mulheres do grupo caso e controle No entanto as cargas
meacutedias de Firmicutes e Eubacteacuterias no grupo caso foram maiores que no grupo
controle enquanto Bacteroidetes apresentou uma maior carga no grupo controle A
figura 12 representa os graacuteficos de dispersatildeo referentes agraves cargas meacutedias das
amostras de fezes para esses micro-organismos
Figura 12 - Quantificaccedilatildeo por qPCR de Firmicutes Bacteroidetes e Eubacterias (UFCmicrol) a partir das amostras de fezes nos grupos caso e controle Satildeo Paulo SP 2013-2014
Legenda ndash (a) Concentraccedilatildeo de Firmicutes (UFCmicroL) entre as mulheres do grupo caso (~869 x 1018 UFCmicrol) e controle (~504 x 1014 UFCmicrol) (b) Concentraccedilatildeo de Bacteroidetes (UFCmicroL) entre as mulheres do grupo caso (~879 x 108 UFCmicrol) e controle (~146 x 109 UFCmicrol) (c) Concentraccedilatildeo de Eubacterias (UFCmicroL) entre as mulheres do grupo caso (~731 x 1024 UFCmicrol) e controle (~619 x 1021 UFCmicrol) Mediana e amplitude interquartiacutelica indicadas por linhas soacutelidas no graacutefico Anaacutelise estatiacutestica realizada por Mann Whitney assumindo p-valor le 005
94
Com o intuito de verificar o percentual de micro-organismos da classe
Mollicutes frente agrave carga meacutedia de Firmicutes foi realizada a anaacutelise do percentual
meacutedio dos referidos micro-organismos onde verificou-se que Mollicutes representam
424 do nuacutemero meacutedio de Firmicutes detectados na qPCR especiacutefica para o
mesmo nas amostras analisadas no grupo caso e 25 x 10-4 no grupo controle
(Tabela 17)
Tabela 17 ndash Nuacutemero meacutedio de coacutepias e percentual dos grupos Mollicutes estudados frente ao Filo Firmicutes na populaccedilatildeo estudada Satildeo Paulo SP 2013-2014
Nota Meacutedia de coacutepiasgrama de fezes Percentual de coacutepias de Mollicutes em relaccedilatildeo ao Filo Firmicutes
Os resultados da qPCR demonstraram carga meacutedia de Bacteacuterias totais
(Eubacteacuterias) nas amostras de fezes analisadas do grupo caso (~731 x 1024 UFCmicrol)
e controle (~619 x 1021 UFCmicrol) As anaacutelises de percentual entre a carga meacutedia de
Bacteroidetes Firmicutes e Mollicutes e a carga meacutedia de bacteacuterias totais estatildeo
representadas na Tabela 18
Grupo Firmicutes Mollicutes
Meacutedia coacutepias g de fezes
Meacutedia coacutepias g de fezes
Caso 869x1018
584x103
424
Controle 504x1014
16
25x10-4
95
Tabela 18 ndash Nuacutemero meacutedio de coacutepias e percentual dos grupos de bacterianos estudados frente agraves bacteacuterias totais na populaccedilatildeo estudada Satildeo Paulo SP 2013-2014
Nota Meacutedia de coacutepiasgrama de fezes Percentual de coacutepias de cada bacteacuteria em relaccedilatildeo agraves bacteacuterias totais
Foi calculada a proporccedilatildeo de Firmicutes em relaccedilatildeo aos Bacteroidetes na
microbiota intestinal das mulheres estudadas tendo sido observada maior proporccedilatildeo
na microbiota intestinal das mulheres obesas em relaccedilatildeo agraves eutroacuteficas do grupo
controle (Tabela 19) A relaccedilatildeo entre o percentual de Firmicutes e Bacteroidetes na
microbiota intestinal das mulheres do grupo caso foi cerca de 29 x 107 maior entre
as mulheres obesas do grupo caso em comparaccedilatildeo com o grupo controle
Tabela 19 ndash Proporccedilatildeo de Firmicutes em relaccedilatildeo agrave Bacteroidetes na populaccedilatildeo estudada Satildeo Paulo SP 2013-2014
Nota Meacutedia de coacutepiasgrama de fezes
Grupo Bacteacuterias totais
Firmicutes Bacteroidetes Mollicutes
Meacutedia coacutepias g de fezes
Meacutedia coacutepias g de
fezes
Meacutedia coacutepias g de
fezes
Meacutedia coacutepias g de fezes
Caso 731x 1024
869x1018
442x105
879x108
718x10-2
584x103
28x 10-2
Controle 619x 1021
504x1014
171x105
146x109
624x102 16
22x10-11
Grupo Firmicutes Bacteroidetes Proporccedilatildeo FirmicutesBacteroidetes
Meacutedia coacutepias g de fezes
Meacutedia coacutepias g de fezes
Meacutedia coacutepias g de fezes
Caso 869x1018 879x108
134x1013
Controle 504x1014
146x109
45x 105
96
54 Dosagem de citocinas do soro sanguiacuteneo
Ao serem quantificadas as citocinas IL-1β IL-10 IL17-A e TNF-α pela
teacutecnica de ELISA no plasma sanguiacuteneo das mulheres natildeo foi observada diferenccedila
estatisticamente significante entre os grupos caso e controle para nenhuma das
citocinas avaliadas IL-1β (p= 02249) IL-10 (p=1) IL17-A (p=03169) e TNF-α
(p=02235) (Figura 13)
Figura 13 ndash Quantificaccedilatildeo de IL-1β IL-10 IL17-A e TNF-α (pgmL) no plasma sanguiacuteneo por meio do ELISA nos grupos caso e controle da populaccedilatildeo estudada Satildeo Paulo SP 2013-2014
Legenda- (a) Concentraccedilatildeo de IL-1β (pgml) no plasma sanguiacuteneo das mulheres casos e controles (b) Concentraccedilatildeo de IL-10 (pgml) no plasma sanguiacuteneo das mulheres casos e controles (c) Concentraccedilatildeo de TNF-α (pgml) no plasma sanguiacuteneo das mulheres casos e controles (d) Concentraccedilatildeo de IL17-A (pgml) no plasma sanguiacuteneo das mulheres casos e controles Desvio padratildeo e meacutedia indicados por linhas soacutelidas no graacutefico Anaacutelise estatiacutestica por Mann Whitney p lt 005
97
6 DISCUSSAtildeO
A microbiota intestinal eacute um ecossistema complexo que desempenha um
importante papel na gecircnese da obesidade associada com o desenvolvimento das
respostas imunoloacutegicas aleacutem do estado nutricional do hospedeiro Projetos
mundiais de pesquisa estatildeo em desenvolvimento para compreender esta
complexidade microbiana na sauacutede humana (SHETTY et al 2013) O presente
estudo avaliou a participaccedilatildeo dos micro-organismos da Classe Mollicutes e dos Filos
Firmicutes e Bacteroidetes na microbiota intestinal de mulheres obesas e eutroacuteficas
Na diversidade das populaccedilotildees humanas e a ocorrecircncia da obesidade eacute
importante estudar a distribuiccedilatildeo da microbiota intestinal fazendo-se necessaacuterio e
imprescindiacutevel a caracterizaccedilatildeo da populaccedilatildeo estudada em relaccedilatildeo agrave preditores
importantes associados com a obesidade microbiota intestinal e ambiente
(KALLIOMAKI et al 2008 PENDERS et al 2006) No presente estudo observou-
se variaccedilatildeo estatiacutestica em relaccedilatildeo agrave variaacutevel gestaccedilatildeo onde 14 (70) das mulheres
do grupo caso e 2 (10) do controle relataram jaacute terem tido filhos Aagaard et al
(2012) verificaram que o microbioma era semelhante em mulheres gravidas ou natildeo
No entanto as mulheres graacutevidas apresentaram microbioma menos diversificado
Sugeriu-se que entre as mulheres em idade reprodutiva o microbioma permanece
como uma comunidade dinacircmica na vida reprodutiva do adulto e que a estrutura da
comunidade natildeo-graacutevida pode retornar em alguma medida nas uacuteltimas semanas de
gestaccedilatildeo Aleacutem disso alguns autores tecircm sugerido que o acuacutemulo de gordura
corporal na obesidade pode acarretar vaacuterias consequecircncias agrave sauacutede como diabetes
mellitus tipo 2 hipertensatildeo arterial dispneacuteia cacircncer dislipidemia doenccedilas
cardiacuteacas doenccedilas hepatobiliares osteoartrite alteraccedilotildees gastrintestinais e
distuacuterbios psicossociais o que corrobora com os achados em relaccedilatildeo agrave histoacuteria
cliacutenica das mulheres estudadas (FRANCISCHI et al 2000 PEREIRA et al 2003
SILVA 2005)
Para as mulheres em especial a menopausa tem sido associada como
colaboradora para o desenvolvimento de obesidade e acuacutemulo de gordura corporal
(SOWERS et al 2007) No presente estudo encontraram-se diferenccedilas estatiacutesticas
em relaccedilatildeo agrave variaacutevel menopausa onde 9 (45) das mulheres obesas do grupo
caso e 3 (15) das mulheres do grupo controle relataram ter entrado na
98
menopausa Entretanto Sternfeld et al (2004) em estudo de coorte feminina entre
42-52 anos de idade nos EUA natildeo encontraram associaccedilatildeo entre a menopausa e o
aumento de circunferecircncia da cintura bem como aumento do peso dessa forma
sugerindo que somente um fator pode natildeo ser o responsaacutevel pelo desenvolvimento
de obesidade No presente trabalho observou-se que 75 das mulheres do grupo
caso e 50 do grupo controle nasceram de parto normal Tem sido evidenciado na
literatura que o tipo de parto pode interferir na composiccedilatildeo da microbiota pela forma
de colonizaccedilatildeo do receacutem-nascido O parto via cesariana aumentaria o risco de
obesidade em relaccedilatildeo ao parto normal (HUH et al 2012 PEI et al 2014) Nesse
sentido Ajslev et al (2011) em estudo longitudinal prospectivo na infacircncia com
acompanhamento ateacute os sete anos observaram que uma combinaccedilatildeo de
exposiccedilotildees precoces que inclui o tipo de parto o IMC maternal preacute-gestacional e
uso de antibioacuteticos na primeira infacircncia (lt6 meses) influenciaram o risco de excesso
de peso
Existem diversos estudos em relaccedilatildeo aos fatores dieteacuteticos e a gecircnese da
obesidade (DAILEY 2014 ISOMAA et al 2001 MORENO-INDIAS et al 2014
PEREIRA et al 2002 ROMERO ZANESCO 2006 SANTOS et al 2006) No
entanto no presente estudo o valor energeacutetico encontrado em relaccedilatildeo ao grupo
caso ao analisar-se a razatildeo quilocaloriasquilograma de peso corporal foi inferior agrave
recomendaccedilatildeo caracterizando alimentaccedilatildeo insuficiente em energia (WHO 2003)
Da mesma maneira que no presente estudo Pereira et al (2012) natildeo encontraram
diferenccedilas significativas entre o consumo energeacutetico entre indiviacuteduos eutroacuteficos e
obesos Souza et al (2010) estudaram a ingestatildeo alimentar e balanccedilo energeacutetico da
populaccedilatildeo adulta de Niteroacutei- RJ e encontraram que a ingestatildeo energeacutetica mostrou-
se decrescente com o aumento do IMC para as mulheres A ingestatildeo energeacutetica em
menor quantidade parece indicar que embora o corpo esteja obeso os tecidos vitais
satildeo inadequadamente nutridos pois a alimentaccedilatildeo insuficiente fornece poucos
nutrientes (HUTSON et al 1965) Sawaya et al (2003) em estudo com mulheres
realizado em Maceioacute tambeacutem observaram que a ingestatildeo energeacutetica entre os
grupos eutroacutefico e obesos natildeo apresentou diferenccedila significativa Em outro estudo
com mulheres no Rio Grande do Sul tambeacutem foi verificado que o consumo alimentar
energeacutetico natildeo apresentou diferenccedila significativa (p=0157) entre os grupos (baixo
peso eutroacutefico e excesso de pesoobesidade) (FRANKE et al 2007) Com isto
99
provavelmente a ingestatildeo energeacutetica natildeo seja a causa da obesidade nas mulheres
estudadas sendo que a baixa ingestatildeo aliada a algumas deficiecircncias nutricionais e
predisposiccedilatildeo geneacutetica possa criar mecanismos de adaptaccedilatildeo levando a um ciclo
metaboacutelico cujo o desfecho seja o armazenamento de gordura na regiatildeo abdominal
(BALAMURUGAN et al 2010 CANI DELZENNE 2009 DAVID et al 2014
HANSON et al 2009 JIMENEZ MARTIN-MORENO 1995) Nesse contexto
devem ser considerados outros fatores de economia energeacutetica tais como o
desequiliacutebrio na microbiota intestinal aleacutem da adaptaccedilatildeo dos mecanismos de
consumo energeacutetico acarretando maior rendimento das calorias absorvidas
BALAMURUGAN et al 2010 CANI DELZENNE 2009 DAVID et al 2014
DEWULF et al 2013 DIBAISE FRANK MATHUR 2012 FRANKE 2007 GRAF et
al 2015 KOENIGA et al 2011 LE CHATELIER et al 2013 LEY et al 2006
PATIL et al 2012 RAOULT 2008 SAWAYA et al 2003 WICHMANN et al
2013)
Analisando a contribuiccedilatildeo do consumo dos macronutrientes e das fibras os
resultados do presente estudo demonstraram que este consumo estaacute dentro dos
criteacuterios exceto para o consumo de fibras que foi abaixo da recomendaccedilatildeo em
ambos os grupos Aleacutem disso comparando-se as meacutedias de consumo dos
macronutrientes e das fibras com as variaacuteveis desfecho (obesas x eutroacuteficas)
tambeacutem natildeo houve associaccedilotildees estatisticamente significantes Em Satildeo Paulo
observou-se que 295 dos indiviacuteduos entrevistados relataram ingestatildeo inferior agraves
necessidades fisioloacutegicas dos quais 58 eram indiviacuteduos obesos (SALVO
GIMENO 2002) Em outro estudo realizado com trabalhadores adultos de ambos os
sexos tambeacutem no Estado de Satildeo Paulo para avaliaccedilatildeo da ingestatildeo alimentar e
consumo de fibras dieteacuteticas foi encontrado que o consumo individual de fibras
dieteacuteticas diaacuteria variou 587 g a 2957 g sendo o consumo meacutedio da populaccedilatildeo
1461 g (PASSOS SHEID 2008) Fisberg et al (2009) em estudo realizado sobre
iacutendice de qualidade da dieta observaram padratildeo dieteacutetico com alto conteuacutedo de
gorduras totais colesterol e accediluacutecar refinado e com baixo teor de fibra alimentar
Estes resultados diferem em parte do padratildeo alimentar da populaccedilatildeo estudada no
entanto demonstra a necessidade de estiacutemulo ao maior consumo de alimentos ricos
em fibra
100
A partir dos resultados do estudo evidencia-se a adequaccedilatildeo comprometida
na alimentaccedilatildeo devido agrave elevada ingestatildeo de lipiacutedios (gordura saturada) e ingestatildeo
reduzida de fibras em ambos os grupos estudados contribuindo tanto para a
obesidade quanto em relaccedilatildeo ao acuacutemulo de tecido adiposo nas mulheres obesas e
eutroacuteficas Esses dados estatildeo em conformidade com o presente estudo em relaccedilatildeo
agraves variaacuteveis antropomeacutetricas analisadas Percentual de gordura corporal e Razatildeo
cintura-quadril onde ambos os grupos se apresentaram acima da meacutedia referecircncia
indicando excesso de gordura corporal Assim como no presente estudo outros
trabalhos tecircm demonstrado limitaccedilotildees e evidenciado que natildeo existe correlaccedilatildeo
precisa entre o IMC e o porcentual de gordura corpoacuterea Isso explica o fato de
indiviacuteduos que apresentam IMC dentro do padratildeo de normalidade mas possuem
uma quantidade de gordura corporal acima do ideal confirmando relatos de que o
IMC natildeo eacute um bom indicador quantitativo de adiposidade corporal e que pode
subestimar o percentual de gordura e classificando de forma errocircnea indiviacuteduos com
excesso de adiposidade (COSTA et al 2007 GLANER 2005) Dessa forma o
aumento de gordura corporal principalmente na regiatildeo abdominal pode tornar a
utilizaccedilatildeo do IMC cada vez mais limitada na avaliaccedilatildeo do estado nutricional jaacute que
indiviacuteduos com sobrepeso ou ateacute mesmo eutroacuteficos podem apresentar risco de
alteraccedilotildees metaboacutelicas devido a valores elevados de circunferecircncia da cintura
(REZENDE 2010) Aleacutem disso nossos resultados evidenciaram valores elevados
para RCQ o que pode explicar a porcentagem de algumas moleacutestias atuais
associadas agrave obesidade encontradas em ambos os grupos no presente trabalho
(OMS 2002 DAcircMASO BERNARDES 2003 OCHS-BALCOM et al 2006)
Diversos estudos tambeacutem contribuiacuteram na melhor compreensatildeo entre as
influecircncias da nutriccedilatildeo e da composiccedilatildeo corporal na composiccedilatildeo da microbiota
intestinal (BALAMURUGAN et al 2010 DAVID et al 2014 DEWULF et al 2013
GRAF et al 2015 WICHMANN et al 2013) No entanto pouco se conhece sobre a
participaccedilatildeo dos micro-organismos da classe Mollicutes na microbiota
principalmente quando associadas com fatores dieteacuteticos e antropomeacutetricos
Constatou-se no presente estudo diferenccedila estatisticamente significante para micro-
organismos da classe dos Mollicutes (p = 00023) Foi detectada associaccedilatildeo
estatisticamente significante entre a presenccedila de Mollicutes e mulheres obesas
(OR= 115 IC= 242-554) Nesse contexto Turnbaugh et al (2008) avaliaram a
101
microbiota de modelos experimentais de ratos geneticamente idecircnticos de
obesidade induzida pelo consumo de dieta ocidentalizada caracterizada por alto teor
de gordura e accediluacutecar Todos os animais herdaram uma microbiota semelhante e no
estado de obesidade observou-se maior crescimento da bacteacuteria Eubacterium
dolichum (membro da classe Mollicutes) que foram posteriormente reduzidos por
subsequentes manipulaccedilotildees dieteacuteticas para limitar o ganho de peso Ainda neste
estudo observou-se que a abundacircncia da classe dos Mollicutes foi acompanhada
pela supressatildeo de toda a divisatildeo de Bacteroidetes indicando que a classe
Mollicutes teve aptidatildeo aumentada em relaccedilatildeo a Firmicutes e todos os outros
Bacteroidetes identificados na populaccedilatildeo estudada Os autores observaram que os
molicutes evoluiacuteram a capacidade para importar o tipo de hidratos de carbono
encontradas na dieta ocidental administrada nos modelos experimentais estando
essas vantagens principalmente relacionadas com o Sistema fosfotransferase (PTS)
De acordo com Deutscher et al (2006) o PTS desempenha um papel na regulaccedilatildeo
da expressatildeo do gene microbiano atraveacutes da repressatildeo cataboacutelica permitindo que a
ceacutelula passe a utilizar preferencialmente accediluacutecares simples em relaccedilatildeo a outros
hidratos de carbono Anaacutelises de fragmentos do gene 16S rRNA dos dados de
metagenocircmica confirmaram a presenccedila dos molicutes no microbioma cecal quando
associados agrave uma dieta ocidental Em contrapartida Hildebrandt et al (2009) por
meio de metagenocircmica de fezes de camundongos magros inicialmente submetidos
a dieta de raccedilatildeo padratildeo com posterior mudanccedila para dieta rica em gordura natildeo
relataram encontrar molicutes em dieta de alto teor de gordura
No presente estudo ao se comparar as meacutedias de consumo dos
macronutrientes carboidratos proteiacutenas lipiacutedios e fibras com as variaacuteveis Mollicutes
(presenccedila x ausecircncia) natildeo foram observadas associaccedilotildees estatisticamente
significantes No entanto foi observado alto consumo de gorduras saturadas nas
mulheres estudadas com diferenccedila estatisticamente significante entre a quantidade
de molicutes na microbiota intestinal Esses resultados associados com as
evidecircncias encontradas na literatura acerca da participaccedilatildeo desses micro-
organismos na microbiota de pessoas obesas fornecem importantes evidecircncias de
que natildeo apenas o consumo alimentar e o percentual de gordura ingerida possam
influenciar o aumento de molicutes na microbiota intestinal Mas que esse aumento
tambeacutem pode estar associado ao possiacutevel enriquecimento de rotas metaboacutelicas
102
envolvidas na utilizaccedilatildeo de accediluacutecares simples relacionadas ao sistema PTS Aleacutem
disso tem sido evidenciado na literatura que em experimentos com animais germ-
free o consumo de uma dieta obesogecircnica parece natildeo estimular o desenvolvimento
da obesidade e que sucessivas manipulaccedilotildees dieteacuteticas para limitar o ganho de
peso possivelmente promovam subsequentes variaccedilotildees em relaccedilatildeo agrave populaccedilatildeo
microbiana na microbiota intestinal (GOODMAN et al 2011 TURNBAUGH et al
2009 WALKER et al 2011 YI LI 2012) Este achado foi sustentado por um estudo
recente em camundongos que mostrou que a composiccedilatildeo microbiana do intestino
natildeo eacute determinada apenas pela dieta atual mas tambeacutem em parte pela histoacuteria
dieteacutetica Aleacutem disso um estudo em seres humanos concluiu que a mudanccedila no
padratildeo de consumo de fibras pode produzir fortes mudanccedilas na microbiota
intestinal mas que estas dependem da composiccedilatildeo inicial da microbiota intestinal do
indiviacuteduo (AAFKE et al 2015 CARMODY et al 2015)
Estudos recentes tecircm demonstrado que a microbiota intestinal humana pode
estar alterada em indiviacuteduos obesos Nesse contexto tem sido amplamente
discutida a participaccedilatildeo dos filos Firmicutes e Bacteroidetes na microbiota desses
indiviacuteduos Aleacutem disso tem sido evidenciado que o filo Firmicutes representam mais
de 90 das categorias filogeneacuteticas conhecidas dominando a microbiota distal
Nesse sentido a obesidade estaacute associada com as diferenccedilas da microbiota
intestinal em niacutevel filo com menor diversidade geral e maior proporccedilatildeo relativa de
Firmicutes em relaccedilatildeo agrave Bacteroidetes em indiviacuteduos obesos em comparaccedilatildeo com
indiviacuteduos eutroacuteficos (ECKBURG et al 2005 LEY et al 2006 MORAN
SHANAHAN 2014 TURNBAUGH et al 2009) Nesse contexto os resultados do
presente estudo demonstraram que a relaccedilatildeo entre o percentual de Firmicutes e
Bacteroidetes na microbiota intestinal das mulheres do grupo caso foi cerca de 29x
107 maior entre as mulheres obesas em comparaccedilatildeo com o grupo controle
Estudos demonstraram que a relaccedilatildeo entre percentual de Firmicutes e Bacteroidetes
na microbiota intestinal eacute de cerca de 7020 para os natildeo obesos e ateacute 855 para os
obesos O que significa cerca de cinco vezes maior em obesos em comparaccedilatildeo com
natildeo obesos (BALAMURUGAN et al 2010 ECKBURG et al 2005 KOENIGA et al
2011 LE CHATELIER et al 2013 PATIL et al 2012) Os nossos achados estatildeo
em conformidade com alguns resultados da literatura Em estudo realizado por
Ridaura et al (2013) transplantaram-se micro-organismos intestinais de humanos
103
obesos e eutroacuteficos em intestinos de ratos com peso meacutedio Aqueles que receberam
a microbiota de humanos obesos tornaram-se ratos obesos e aqueles que
receberam microbiota de humanos magros permaneceram magros Outro estudo
realizado por Remely et al (2015) que tambeacutem investigaram atraveacutes de qPCR a
microbiota de humanos obesos durante a intervenccedilatildeo dieteacutetica para perda de peso
induzida observaram diminuiccedilatildeo na proporccedilatildeo de FirmicutesBacteroidetes nos
obesos apoacutes a intervenccedilatildeo dieteacutetica
A proporccedilatildeo FirmicutesBacteroidetes tem sido associada como um marcador
de sauacutede para um indiviacuteduo e um desequiliacutebrio nesta proporccedilatildeo estaacute associada com
diferentes doenccedilas (MARIAT et al 2009) A mudanccedila na abundacircncia relativa destes
filos resulta no aumento da capacidade de captaccedilatildeo de energia a partir dos
alimentos aleacutem de induzir a inflamaccedilatildeo de baixo grau A reduccedilatildeo de Bacteroidetes
tem sido relacionada com dieta rica em gordura que pode resultar em aumento dos
niacuteveis plasmaacuteticos de LPS (CANI et al 2007 EVERARD CANI 2013) enquanto o
aumento Firmicutes tem sido associado com o consumo de carnes (EVERARD
CANI 2013) Aleacutem disso vaacuterios estudos tecircm mostrado mudanccedila da relaccedilatildeo de
FirmicutesBacteroidetes em pessoas obesas durante intervenccedilotildees dieteacuteticas para
perda de peso corporal sugerindo que as mudanccedilas na concentraccedilatildeo de bacteacuterias
nos indiviacuteduos obesos podem ser revertidas depois da perda de peso induzida por
dieta fazendo com que a microbiota do indiviacuteduo obeso se assemelhe ao indiviacuteduo
eutroacutefico (CLEMENTE et al 2012 DEWULF et al 2013 DIBAISE et al 2012
REMELY et al 2013 2015) Em contrapartida estes resultados natildeo satildeo universais
outros estudos demonstraram padrotildees variaacuteveis em mudanccedilas de niacutevel de filo
medidos na composiccedilatildeo da microbiota de indiviacuteduos obesos (MORAN SHANAHAN
2014 SCHWIERTZ et al 2010 ZHANG et al 2009) Duncan et al (2008) avaliaram
a relaccedilatildeo entre IMC perda de peso e a predominacircncia de grupos de bacteacuterias em
amostras fecais de pessoas obesas e natildeo obesas Estes indiviacuteduos foram
submetidos a duas dietas para perda de peso por quatro semanas Natildeo foi
encontrada diferenccedila entre Bacteroidetes nas amostras entre indiviacuteduos obesos e
natildeo obesos No entanto houve reduccedilotildees no grupo de Firmicutes em obesos
submetidos a dietas hipocaloacutericas Em outro estudo realizado por Schwiertz et al
(2010) tambeacutem natildeo foram observadas diferenccedilas nas contagens de Bacteroidetes e
Firmicutes entre os grupos de estudo Xiao et al (2014) em estudo com intervenccedilatildeo
104
dieteacutetica baseada em gratildeos integrais onde analisaram a microbiota intestinal de 123
voluntaacuterios obesos antes e depois da intervenccedilatildeo de 9 semanas seguida por um
periacuteodo de manutenccedilatildeo de 14 semanas tambeacutem natildeo observaram alteraccedilotildees
significativas na abundacircncia de Bacteroidetes e Firmicutes ou na proporccedilatildeo destes
dois filos durante a intervenccedilatildeo dieteacutetica mesmo quando os voluntaacuterios perderam
uma quantidade significativa de peso Estudos recentes do Projeto Microbioma
Humano natildeo encontraram associaccedilatildeo entre a proporccedilatildeo FirmicutesBacteroidetes e
obesidade ou Iacutendice de Massa Corporal (IMC) Nesse sentido tem sido sugerido por
alguns autores que a utilizaccedilatildeo dessa relaccedilatildeo como um biomarcador para a
obesidade permanece incerto devido a variabilidade dos dados na literatura
(FINUCANE et al 2014 MURPHY et al 2010)
Recentemente tem sido proposta uma nova hipoacutetese que associa a
microbiota intestinal com a homeostase metaboacutelica demonstrando-a como uma das
fontes potenciais de inflamaccedilatildeo de baixo grau (ARAKI et al 2005 OKAYASU et al
1990 RAKOFF-NAHOUM 2004 XIAO et al 2014 ZHAO 2013) Nesse contexto
tem sido demonstrado que dietas com alto teor de gordura tambeacutem podem aumentar
as concentraccedilotildees de LPS no plasma de humanos Estudo realizado por Cani et al
(2007) mostrou em camundongos que o maior consumo de gordura levou ao maior
aumento nas concentraccedilotildees de LPS no plasma A absorccedilatildeo de LPS reforccedilada pela
alta ingestatildeo de gordura pode estimular a secreccedilatildeo das citocinas TNF-α e IL-6
resultando em inflamaccedilatildeo sistecircmica de baixo grau dessa forma a microbiota
intestinal pode ter papel ativo na promoccedilatildeo eou inibiccedilatildeo da inflamaccedilatildeo e portanto
um efeito no metabolismo lipiacutedico (FLOCK GREEN KRIS-ETHERTON 2011) Os
resultados do presente estudo natildeo demonstraram diferenccedilas estatisticamente
significantes entre os grupos caso e controle para nenhuma das citocinas avaliadas
No entanto estudos in vitro mostraram que o consumo de aacutecidos graxos saturados
tambeacutem observado no presente estudo em ambos os grupos promovem processo
inflamatoacuterio com aumento da expressatildeo de IL-6 e TNF-α de TLR- 4 e consequente
aumento da ativaccedilatildeo da via NF-kβ (AJUWON SPURLOCK 2005 CALDER et al
2011 WEATHERILL et al 2005) Em estudos experimentais a dieta hiperlipiacutedica
rica em gordura saturada demonstrou promover obesidade com consequente
aumento de peso corporal adiposidade e marcadores inflamatoacuterios (FERNANDEZ-
REAL et al 2003 PEREIRA et al 2012) Esses achados podem explicar o fato de
105
que no presente estudo natildeo foram observadas diferenccedilas estatisticamente
significantes em relaccedilatildeo a liberaccedilatildeo de TNF-α e IL1-β entre os grupos estudados
Em relaccedilatildeo agrave liberaccedilatildeo da citocina IL-17 tambeacutem natildeo foram observadas diferenccedilas
estatisticamente significantes no entanto os achados da literatura teumlm sugerido
que no contexto de disbiose a presenccedila de agentes patogecircnicos pode perturbar a
regulaccedilatildeo do ambiente anti-inflamatoacuterio e que quando patoacutegenos enteacutericos superam
as bacteacuterias comensais o desequiliacutebrio entre comensais e bacteacuterias patogecircnicas
provocam liberaccedilatildeo significativa de MAMPs Este aumento pode induzir IECs DCs e
macroacutefagos ativados a secretar citocinas inflamatoacuterias como a IL-1β IL-6 IL-12 e
IL-23 Estas citocinas estimulam o desenvolvimento de ceacutelulas CD4+ T auxiliares
(T helper-TH1) e ceacutelulas TH17 (produzem IL-17A IL-17F e IL-22) resultando na
inflamaccedilatildeo crocircnica (MAYNARD et al 2012)
O estudo da influecircncia de diferentes elementos da dieta e composiccedilatildeo
corporal sobre a variaccedilatildeo da composiccedilatildeo da microbiota tornou-se uma aacuterea de
crescente interesse cientiacutefico Com efeito a relaccedilatildeo entre a microbiota intestinal e a
obesidade estaacute bastante reconhecida No entanto a participaccedilatildeo dos micro-
organismos da classe dos Mollicutes e alguns mecanismos subjacentes a essas
interaccedilotildees permanecem pouco estudados Em relaccedilatildeo agraves limitaccedilotildees do estudo
deve-se considerar o desenho transversal natildeo sendo possiacutevel estabelecer relaccedilatildeo
de causa e efeito No entanto o estudo mostra-se relevante destacando como
ponto forte o cuidado metodoloacutegico e a relevacircncia dos resultados encontrados
contribuindo para o avanccedilo dos estudos da relaccedilatildeo entre os molicutes microbiota
intestinal e obesidade Nesse contexto a importacircncia e validade de estudos como
este eacute apontar os possiacuteveis fatores de risco que contribuam para obesidade sendo
que a cuidadosa interpretaccedilatildeo dos resultados eacute importante para a geraccedilatildeo de
hipoacuteteses
Nesse contexto uma pesquisa acerca da relaccedilatildeo causa-efeito entre a
microbiota intestinal e a obesidade eacute altamente justificaacutevel uma vez que diferentes
espeacutecies de bacteacuterias podem desempenhar um papel significativo na safra de
energia humana e regulaccedilatildeo do peso corporal Aleacutem disso a consideraccedilatildeo de
fatores de estilo de vida em estudos da microbiota intestinal eacute altamente
recomendada uma vez que mudanccedilas no padratildeo alimentar e atividade fiacutesica podem
influenciar a composiccedilatildeo da microbiota intestinal para o desenvolvimento da
106
obesidade A partir disso o presente estudo fornece evidecircncias de que alteraccedilotildees e
interaccedilotildees na microbiota intestinal possam definir subconjuntos de indiviacuteduos com
diferentes perfis de risco metaboacutelico e assim contribuir para a investigaccedilatildeo da
heterogeneidade associada a fenoacutetipos relacionados com a adiposidade
especialmente em sociedades que estatildeo passando por transformaccedilotildees
socioeconocircmicas tecnoloacutegicas e culturais para um estilo de vida moderno
107
7 CONCLUSOtildeES
Os grupos caso e controle balancearam suas dietas conforme o intervalo de
distribuiccedilatildeo energeacutetica recomendado no entanto foi observado um consumo
de fibras inferior e de gorduras saturadas superior ao recomendado em
ambos os grupos
As mulheres de ambos os grupos apresentaram excesso de gordura corporal
Foi desenvolvido um ensaio de PCR em tempo real especiacutefico sensiacutevel
reprodutiacutevel e quantitativo para a detecccedilatildeo de Mollicutes nas fezes humanas
Foram encontradas associaccedilotildees estatisticamente significantes entre a
presenccedila de Mollicutes e mulheres obesas
Natildeo foram observadas associaccedilotildees estatisticamente significantes em relaccedilatildeo
as meacutedias de consumo dos macronutrientes carboidratos proteiacutenas lipiacutedios e
fibras com a presenccedila de Mollicutes
Natildeo foram observadas diferenccedilas estatisticamente significantes para as
cargas de Firmicutes Bacteroidetes e Bacteacuterias totais entre as mulheres do
grupo caso e controle
A proporccedilatildeo de Firmicutes em relaccedilatildeo aos Bacteroidetes foi maior na
microbiota intestinal das mulheres obesas em relaccedilatildeo agraves eutroacuteficas
Natildeo foi observada diferenccedila estatisticamente significante entre os grupos
caso e controle para nenhuma das citocinas avaliadas
108
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APEcircNDICE A ndash TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
128
Universidade de Satildeo Paulo
Instituto de Ciecircncias Biomeacutedicas
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
ESTUDO Avaliaccedilatildeo da participaccedilatildeo dos microrganismos da Classe Mollicutes na microbiota intestinal de mulheres eutroacuteficas e obesas
Vocecirc estaacute sendo convidado (a) a participar do projeto de pesquisa acima citado O documento
abaixo conteacutem todas as informaccedilotildees necessaacuterias sobre a pesquisa que estamos fazendo Sua
colaboraccedilatildeo neste estudo seraacute de muita importacircncia para noacutes mas se desistir a qualquer momento
isso natildeo causaraacute nenhum prejuiacutezo a vocecirc
Eu _________________________________________________________________ profissatildeo ____________________________
residente e domiciliado na
_______________________________________________________________________________________________________________
______________________________________________________________ portador da Ceacutedula de identidade RG
___________________________ e inscrito no CPFMF______________________________ nascido(a) em _____
_____ _______ abaixo assinado(a) concordo de livre e espontacircnea vontade em participar como
voluntaacuterio(a) do estudo ldquoAvaliaccedilatildeo da participaccedilatildeo dos microrganismos da Classe Mollicutes
na microbiota intestinal de mulheres eutroacuteficas e obesasrdquo Declaro que obtive todas as
informaccedilotildees necessaacuterias bem como todos os eventuais esclarecimentos quanto agraves duacutevidas por
mim apresentadas
Estou ciente que
I) O estudo se faz necessaacuterio para que se possam descobrir as possiacuteveis causas da doenccedila
denominada vaginoses bacterianas a ser estudada no projeto ldquoAvaliaccedilatildeo da
participaccedilatildeo dos microrganismos da Classe Mollicutes na microbiota intestinal de
mulheres eutroacuteficas e obesasrdquo
II) Seratildeo feitas uma coleta de 5ml de sangue e fezes em periacuteodo uacutenico
III) A participaccedilatildeo neste projeto natildeo tem objetivo de me submeter a um tratamento bem
como natildeo me acarretaraacute qualquer despesa financeira com relaccedilatildeo aos procedimentos
meacutedico-cliacutenico-terapecircuticos efetuados no estudo
129
IV) Tenho a liberdade de desistir ou de interromper a colaboraccedilatildeo neste estudo no momento
em que desejar sem necessidade de qualquer explicaccedilatildeo
V) A desistecircncia natildeo causaraacute nenhum prejuiacutezo agrave minha sauacutede ou bem estar fiacutesico Natildeo viraacute
interferir no atendimento ou tratamento meacutedico
VI) Os resultados obtidos durante este ensaio seratildeo mantidos em sigilo mas concordo que
sejam divulgados em publicaccedilotildees cientiacuteficas desde que meus dados pessoais natildeo sejam
mencionados
VII) Caso eu desejar poderei pessoalmente tomar conhecimento dos resultados ao final
desta pesquisa
( ) Desejo conhecer os resultados desta pesquisa
( ) Natildeo desejo conhecer os resultados desta pesquisa
VIII) Concordo que o material possa ser utilizado em outros projetos desde que autorizado
pela Comissatildeo de Eacutetica deste Instituto e pelo responsaacutevel por esta pesquisa Caso minha
manifestaccedilatildeo seja positiva poderei retirar essa autorizaccedilatildeo a qualquer momento sem
qualquer prejuiacutezo para mim
( ) Sim ou ( ) Natildeo
IX ) Poderei contatar a Secretaria da Comissatildeo de Eacutetica em Pesquisa com Seres Humanos ndash
ICBUSP - no Fone 30917733 (e-mail cepicbuspbr) ou (11 3091-7297 jotiuspbr)
para recursos ou reclamaccedilotildees em relaccedilatildeo ao presente estudo
X) O sujeito de pesquisa ou seu representante quando for o caso deveraacute rubricar todas as
folhas do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido ndash TCLE - apondo sua assinatura na uacuteltima
paacutegina do referido Termo
XI) O pesquisador responsaacutevel deveraacute da mesma forma rubricar todas as folhas do Termo de
Consentimento Livre e Esclarecido ndash TCLEndash apondo sua assinatura na uacuteltima paacutegina do
referido Termo
XII) Resoluccedilatildeo 19696 - Estou recebendo uma coacutepia deste Termo de Consentimento Livre e
Esclarecido
Satildeo Paulo___________de________________de 20_____ ( ) Paciente ( ) Responsaacutevel
Testemunha 1 _______________________________________________
Nome RG Telefone
130
Testemunha 2 ___________________________________________________
Nome RG Telefone
Responsaacutevel pelo Projeto _____________________________________________________
PROF DR JORGE TIMENETSKY
131
APEcircNDICE B ndash QUESTIONAacuteRIO
132
UNIVERSIDADE DE SAtildeO PAULO
INSTITUTO DE CIEcircNCIAS BIOMEacuteDICAS
MESTRADO EM MICROBIOLOGIA
Seccedilatildeo 1 IDENTIFICACcedilAtildeO E DADOS PESSOAIS
Nome Idade ID
Telefone Data
Profissatildeo
Estado civil 1 Casada 2 Solteira 3 Mora com companheiro 4 Viuacuteva 5 Divorciada
Raccedilacor 1 Branca 2 Preta 3 Amarela 4 Parda 5 Indiacutegena
Escolaridade 1 Analfabeto 2 1ordm grau incompleto 3 1ordm grau Completo
4 2ordm grau incompleto 5 2ordm grau completo 6 Superior incompleto 7 superior completo
Condiccedilatildeo Socioeconocircmica Indicar aproximadamente a renda domiciliarfamiliar mensal (soma de todos os ganhos
das pessoas que dividem as despesas) (valor SM R$ 67800)
ateacute 1 salaacuterio miacutenimo (ateacute R$ 61800)
1 a 2 salaacuterios miacutenimos (mais de R$ 61800 a R$ 123600)
2 a 5 salaacuterios miacutenimos (mais de R$ 123600 a R$ 309000)
5 a 10 salaacuterios miacutenimos (mais de R$ 309000 a R$ 618000)
mais de 10 salaacuterios miacutenimos (mais de R$ 618000)
Seccedilatildeo 2 HISTOacuteRIA FAMILIAR (parentes de 1ordm grau paternos e maternos e irmatildeos)
1 HAS 2 Diabetes 3 Obesidade 4 Hipercolesterolemia 5 DCV
Seccedilatildeo 3 HISTOacuteRIA CLIacuteNICA
133
Alteraccedilotildees gastrointestinais 1 Constipaccedilatildeo Flatulecircncia 3 Refluxo 4 Azia
5 Ulcera 6 Gastrite 7 Naacuteuseas 8 Vocircmitos
Como o intestino se comporta habitualmente 1 Normal 2 Constipaccedilatildeo 3 Diarreacuteia
Moleacutestia atual 1 HAS 2 Diabetes 3 Obesidade 4 Hipercolesterolemia
5 DCV 6 Dispneacuteia 7 Alteraccedilatildeo Menstrual
Uso de laxantes 1 Sim 2 Natildeo
Seccedilatildeo 4 HISTOacuteRIA OBSTEacuteTRICA
Tipo de parto 1 Normal 2 Cesaacuterea
Foi amamentada 1 Natildeo 2 1 a 3 meses 3 4 a 6 meses 4 7 a 9 meses
5 10 a 12 meses 6 gt12 meses
Teve alguma gestaccedilatildeo 1 Sim 2 Natildeo
Quantos filhos 1 1 a 2 2 3 a 4 3 ge5
Quantos partos foram normais 1 1 a 2 2 3 a 4 3 ge5
Quantos partos foram cesaacuterea 1 1 a 2 2 3 a 4 3 ge5
Tempo de amamentaccedilatildeo dos filhos 1 Natildeo 2 1 a 3 meses 3 4 a 6 meses 4 7 a 9 meses
5 10 a 12 meses 6 gt12 meses
Seccedilatildeo 5 HISTOacuteRIA GINECOLOacuteGICA
Usou ou estaacute usando algum anticoncepcional (adesivo piacutelula anel vaginal DIU de hormocircnio injetaacutevel ou
bastatildeo subcutacircneo) 1 Sim 2 Natildeo
Com que idade comeccedilou a tomar
Parou de usar por algum tempo
Por quanto tempo parou
Seccedilatildeo 6 CONSUMO DE TABACO
134
Jaacute fumou mais de 20 maccedilos de cigarro (cachimbo ou charuto) em toda sua vida
1 Natildeo 2 Sim e fumo atualmente 3 Sim mas parei de fumar 4 Natildeo sabe natildeo informa
Se fumafumou o faz haacute quanto tempo
Quantos cigarros em meacutedia fumafumava por dia
____cigarros
____cachimbos
____charutos
Se parou de fumar haacute quanto tempo ocorreu
Seccedilatildeo 7 CONSUMO DE AacuteLCOOL
Etilista 1 Sim 2 Natildeo
Frequencia de ingestatildeo
Tipo de bebida ingerida
Haacute quanto tempo ingere
Seccedilatildeo 8 ATIVIDADE FIacuteSICA (IPAQ versatildeo curta)
As perguntas estatildeo relacionadas ao tempo que vocecirc gasta fazendo atividade fiacutesica na UacuteLTIMA
semana As perguntas incluem as atividades que vocecirc faz no trabalho para ir de um lugar a outro
por lazer por esporte por exerciacutecio ou como parte das suas atividades em casa ou no jardim
Para responder as questotildees lembre que
atividades fiacutesicas VIGOROSAS satildeo aquelas que precisam de um grande esforccedilo fiacutesico e que fazem respirar MUITO mais forte que o normal
atividades fiacutesicas MODERADAS satildeo aquelas que precisam de algum esforccedilo fiacutesico e que fazem respirar UM POUCO mais forte que o normal
Para responder as perguntas pense somente nas atividades que vocecirc realiza por pelo menos 10
minutos contiacutenuos de cada vez
135
1a Em quantos dias da uacuteltima semana vocecirc caminhou por pelo menos 10 minutos contiacutenuos em casa
ou no trabalho como forma de transporte para ir de um lugar para outro por lazer por prazer ou
como forma de exerciacutecio dias _____ por SEMANA ( ) Nenhum
1b Nos dias em que vocecirc caminhou por pelo menos 10 minutos contiacutenuos quanto tempo no total
vocecirc gastou caminhando por dia horas ______ Minutos _____
2a Em quantos dias da uacuteltima semana vocecirc realizou atividades MODERADAS por pelo menos 10
minutos contiacutenuos como por exemplo pedalar leve na bicicleta nadar danccedilar fazer ginaacutestica
aeroacutebica leve jogar volei recreativo carregar pesos leves fazer serviccedilos domeacutesticos na casa no
quintal ou no jardim como varrer aspirar cuidar do jardim ou qualquer atividade que fez aumentar
moderadamente sua respiraccedilatildeo ou batimentos do coraccedilatildeo (POR FAVOR NAtildeO INCLUA CAMINHADA)
dias _____ por SEMANA ( ) Nenhum
2b Nos dias em que vocecirc fez essas atividades moderadas por pelo menos 10 minutos contiacutenuos
quanto tempo no total vocecirc gastou fazendo essas atividades por dia
horas ______ Minutos _____
3a Em quantos dias da uacuteltima semana vocecirc realizou atividades VIGOROSAS por pelo menos 10
minutos contiacutenuos como por exemplo correr fazer ginaacutestica aeroacutebica jogar futebol pedalar raacutepido
na bicicleta jogar basquete fazer serviccedilos domeacutesticos pesados em casa no quintal ou cavoucar no
jardim carregar pesos elevados ou qualquer atividade que fez aumentar MUITO sua respiraccedilatildeo ou
batimentos do coraccedilatildeo dias _____ por SEMANA ( ) Nenhum
3b Nos dias em que vocecirc fez essas atividades vigorosas por pelo menos 10 minutos contiacutenuos quanto
tempo no total vocecirc gastou fazendo essas atividades por dia
horas ______ Minutos _____
Seccedilatildeo 9 HAacuteBITOS ALIMENTARES
Vocecirc mudou seus haacutebitos alimentares recentemente ou estaacute fazendo dieta para emagrecer ou por qualquer
outro motivo
1 Natildeo 5 Sim para reduccedilatildeo de sal
2 Sim para perda de peso 6 Sim para reduccedilatildeo de colesterol
3 Sim por orientaccedilatildeo meacutedica
136
4 Sim para dieta vegetariana ou reduccedilatildeo do consumo de carne
Vocecirc estaacute tomando algo para suplementar sua dieta (vitaminas minerais e outros produtos)
1 Natildeo 2 Sim regularmente 3 Sim mas natildeo regularmente
Se a resposta da pergunta anterior for sim favor preencher o quadro abaixo
Suplemento
Nome comercial Dose
Frequencia
Nuacutemero de refeiccedilotildees que costuma fazer por dia
Costuma fazer desjejum diariamente 1 Sim 2 Natildeo
Costuma beliscar entre as refeiccedilotildees 1 Sim 2 Natildeo
Costuma ingerir liacutequidos durante as refeiccedilotildees 1 Sim 2 Natildeo
Quantas refeiccedilotildees costuma fazer fora de casa por semana
Em que local costuma fazer as refeiccedilotildees fora de casa
1 Restaurantes 5 Natildeo faz
2 Lanches raacutepidos 6 Outro
3 Marmita
4 No trabalho
137
As questotildees seguintes relacionam-se ao seu haacutebito alimentar usual no PERIacuteODO DE UM ANO Para cada quadro responda por favor a frequecircncia que melhor descreva QUANTAS VEZES vocecirc costuma comer cada item e a respectiva UNIDADE DE TEMPO (se por dia por semana por mecircs ou no ano) Depois responda qual a sua PORCcedilAtildeO INDIVIDUAL USUAL em relaccedilatildeo agrave porccedilatildeo meacutedia indicada ESCOLHA SOMENTE UM CIacuteRCULO PARA CADA COLUNA Muitos grupos de alimentos incluem exemplos Eles satildeo sugestotildees e vocecirc pode pode consumir todos os itens indicados Se vocecirc natildeo come ou raramente come um determinado iacutetem preeencha o ciacuterculo da primeira coluna (N=nunca come) NAtildeO DEIXE ITENS EM BRANCO
138
139
140
141
Por favor liste qualquer outro alimento ou preparaccedilatildeo importante que vocecirc costuma comer ou beber pelo menos UMA VEZ POR SEMANA que natildeo foram citados aqui (por exemplo leite-de-coco outros tipos de carnes receitas caseiras creme de leite leite condensado gelatina e outros doces etc )
Alimento Frequecircncia por semana Quantidade Consumida
Quando vocecirc come carne bovina ou suiacutena vocecirc costuma comer a gordura visiacutevel 1 nunca ou raramente 2 algumas vezes 3 sempre 4 natildeo sabe Quando vocecirc come frango ou peru vocecirc costuma comer a pele 1 nunca ou raramente 2 algumas vezes 3 sempre 4 natildeo sabe
142
Seccedilatildeo 10 DADOS ANTROPOMEacuteTRICOS
Peso
_____________Kg
_____________Kg
Estatura
_____________m
_____________m
IMC
__________Calcular IMC= peso em Kg altura em m2
Circunferecircncia Abdominal
_____________cm
_____________cm
Reactacircncia
Resistecircncia ___________MG
_____________MLG
Peso MG_________kg
Peso MGL_________kg
TMB __________
aacutegua de massa magra
143
APEcircNDICE C- TABELA 10
144
Tabela 10 Participaccedilatildeo dos alimentos nos grupos meacutedias de consumo por dia dos alimentos consumidos pela populaccedilatildeo estudada Satildeo Paulo SP 2013-2014
Grupo Alimentar
Alimentos Grupo Frequecircncia diaacuteria (dp)
Frequecircncia diaacuteria (amplitude)
Massas
Macarratildeo com molho sem carne
Caso
02 (05)
(0-25)
Controle
02 (02) (0-043)
Macarratildeo com molho com carne lasanha nhoque
Caso 01 (012) (0-043)
Controle
02 (02) (0-079)
Pizza panqueca
Caso 015 (022) (0-1)
Controle 02 (01) (003-043)
Preparaccedilatildeo
Sopas
Caso 015 (018) (0-043)
Controle 014 (02) (0-043)
Polenta cozida ou frita
Caso 003 (005) (0-014)
Controle 0008 (003) (0-014)
Carne vermelha e
ovos
Carne bovina
Caso 06 (06) (008-25)
Controle 05 (018) (014-079)
Carne de porco Caso 008 (009) (0-043)
Controle 02 (05) (0-25)
Carne seca carne do sol bacon
Caso 006 (005) (0-014)
Controle 004 (006) (0-014)
Ovos Caso 02 (02) (0-1)
Controle 03 (05) (0-25)
Embutidos
Linguiccedila
Caso 011 (009) (0-043)
Controle 02 (05) (0-25)
Embutidos (presunto mortadela salsicha)
Caso 015 (023) (0-1)
Controle 02 (02) (0-043)
Carne branca
Frango Caso 06 (09) (003-3)
Controle 05 (05) (014-25)
Peixe e frutos do mar Caso 01 (01) (0-043)
Controle 01 (02) (0-043)
Leite e derivados
Leite integral Caso 07 (09) (0-3)
Controle 04 (06) (0-25)
Leite desnatado Caso 04 (09) (0-3)
Controle 002 (005) (0-014)
Leite semi-desnatado Caso 03 (08) (0-25)
Controle 0004 (002) (0-008)
Iogurte natural Caso 05 (09) (0-25)
Controle 03 (03) (0-079)
Iogurte com frutas Caso 03 (08) (0-25)
Controle 02 (02) (0-079)
145
Tabela 10 Participaccedilatildeo dos alimentos nos grupos meacutedias de consumo ao dia dos alimentos consumidos pela populaccedilatildeo estudada Satildeo Paulo SP 2013-2014
(Continuaccedilatildeo)
Grupo Alimentar
Alimentos Grupo Frequecircncia diaacuteria (dp)
Frequecircncia diaacuteria
(amplitude)
Leite e derivados
Queijo mussarela prato parmesatildeo e provolone
Caso 05 (07) (0-25)
Controle 05 (06) (003-25)
Queijo minas e ricota Caso 04 (08) (0-25)
Controle 04 (06) (0-25)
Leguminosas
Feijatildeo Caso 12 (09) (014-25)
Controle 06 (05) (008-25)
Lentilha ervilha seca gratildeo de bico soja
Caso 005 (009) (0-043)
Controle 006 (01) (0-043)
Feijatildeo tropeiro e feijoada
Caso 003 (003) (0-014)
Controle 002 (004) (0-014)
Cereais raiacutezes e
tubeacuterculos
Arroz branco ou integral cozido com
oacuteleo e temperos
Caso 15 (09) (043-25)
Controle 14 (07) (043-25)
Batata frita ou mandioca frita
Caso 007 (01) (0-043)
Controle 02 (01) (003-043)
Batata mandioca inhame (cozida ou assada) purecirc
Caso 01 (012) (0-043)
Controle 02 (02) (0-043)
Farinha de mandioca farofa cuscuz aveia tapioca
Caso 02 (03) (0-1)
Controle 01 (02) (0-1)
Patildeo francecircs patildeo de forma integral patildeo doce torrada
Caso 07 (06) (014-3)
Controle 17 (08) (0-25)
Biscoito sem recheio (doce salgado) Caso 04 (06) (0-25)
Controle 05 (06) (0-25)
Biscoito recheado waffer amanteigado
Caso 01 (03) (0-1)
Controle 009 (02) (0-043)
Bolo (simples recheado) Caso 01 (013) (0-043)
Controle 01 (013) (0-043)
Hortaliccedilas
Alface
Caso 12 (09) (008-3)
Controle 08 (06) (014-25)
Tomate Caso 14 (107) (008-3)
Controle 08 (06) (003-25)
Cenoura Caso 06 (07) (008-25)
Controle 04 (02) (0-1)
Outros legumes (abobrinha berinjela chuchu pepino)
Caso 04 (03) (008-1)
Controle 05 (07) (0-25)
Outras verduras cruas (acelga ruacutecula agriatildeo)
Caso 04 (03) (008-1)
Controle 04 (02) (0-1)
146
Tabela 10 Participaccedilatildeo dos alimentos nos grupos meacutedias de consumo ao dia dos alimentos consumidos pela populaccedilatildeo estudada Satildeo Paulo SP 2013-2014
(Continuaccedilatildeo)
Grupo Alimentar Alimentos Grupo Frequecircncia diaacuteria (dp)
Frequecircncia diaacuteria
(amplitude)
Hortaliccedilas
Outras verduras cozidas (acelga espinafre escarola couve)
Caso 03 (02) (0-1)
Controle 03 (02) (0-079)
Broacutecolis couve-flor repolho Caso 02 (015) (0-043)
Controle 03 (03) (0-1)
Frutas
Laranja mexerica abacaxi Caso 08 (09) (0-3)
Controle 04 (05) (003-25)
Banana Caso 08 (09) (0-3)
Controle 04 (02) (008-1)
Maccedilatilde pecircra Caso 05 (07) (0-3)
Controle 03 (03) (0-1)
Melatildeo melancia Caso 03 (07) (0-1)
Controle 01 (01) (0-043)
Mamatildeo Caso 03 (03) (0-1)
Controle 008 (006) (0-014)
Goiaba Caso 01 (02) (0-1)
Controle 0008 (002) (0-008)
Abacate Caso 08 (02) (0-1)
Controle 007 (001) (0-003)
Suco natural Caso 07 (09) (0-3)
Controle 03 (02) (0-1)
Industrializados
Maionese molho para salada patecirc chantily
Caso 01 (016) (0-043)
Controle 01 (02) (0-1)
Condimentos
Caso 04 (06) (0-25)
Controle 02 (03) (0-079)
Hamburguer nuggets almocircndega Caso 006 (009) (0-043)
Controle 005 (009) (0-043)
Suco industrializado Caso 08 (105) (0-3)
Controle 05 (03) (0-1)
Refrigerante comum Caso 02 (02) (0-079)
Controle 02 (02) (0-043)
Refrigerante light diet Caso 0 0
Controle 007 (02) (0-043)
147
Tabela 10 Participaccedilatildeo dos alimentos nos grupos meacutedias de consumo ao dia dos alimentos consumidos pela populaccedilatildeo estudada Satildeo Paulo SP 2013-2014
(Continuaccedilatildeo)
Grupo Alimentar Alimentos Grupo Frequecircncia diaacuteria (dp)
Frequecircncia diaacuteria
(amplitude)
Infusatildeo
Chaacute e cafeacute sem accediluacutecar Caso 09 (1) (0-25)
Controle 06 (07) (0-25)
Chaacute e cafeacute com accediluacutecar Caso 08 (08) (0-25)
Controle 07 (08) (0-3)
Bebida alcooacutelica
Cerveja
Caso 003 (005) (0-014)
Controle 0074 (01) (0-043)
Oacuteleos e gorduras
Oacuteleo azeite ou vinagre para tempero de salada
Caso 1 (09) (0-25)
Controle 03 (03) (0-1)
Manteiga ou margarina comum Caso 09 (09) (0-25)
Controle 07 (07) (0-25)
Manteiga ou margarina light Caso 02 (06) (0-25)
Controle 007 (003) (0-014)
Lanches
Salgado frito Caso 02 (03) (0-1)
Controle 01 (01) (0-043)
Salgado assado Caso 014 (02) (0-1)
Controle 02 (02) (0-043)
Sanduiche Caso 006 (009) (0-043)
Controle 005 (004) (0-014)
Accediluacutecar e doces
Chocolate bombom brigadeiro Caso 04 (04) (0-1)
Controle 06 (04) (003-2)
Achocolatado em poacute (adicionado ao leite)
Caso 013 (03) (0-1)
Controle 02 (03) (0-1)
Sobremesas doces tortas e pudins
Caso 02 (03) (0-1)
Controle 03 (03) (003-1)
Accediluacutecar mel e geleacuteia Caso 05 (07) (0-3)
Controle 08 (1) (0-3)
VERENA MACEDO SANTOS
Avaliaccedilatildeo da participaccedilatildeo dos micro-organismos da Classe Mollicutes
na microbiota intestinal de mulheres eutroacuteficas e obesas
Dissertaccedilatildeo apresentada ao Programa de Poacutes-
Graduaccedilatildeo em Microbiologia do Instituto de Ciecircncias
Biomeacutedicas da Universidade de Satildeo Paulo para
obtenccedilatildeo do Tiacutetulo de Mestre em Ciecircncias
Aacuterea de concentraccedilatildeo Microbiologia
Orientador Prof Dr Jorge Timenetsky
Versatildeo original
Satildeo Paulo 2015
UNIVERSIDADE DE SAtildeO PAULO
INSTITUTO DE CIEcircNCIAS BIOMEacuteDICAS ____________________________________________________________________________
Candidato(a) Verena Macedo Santos
Tiacutetulo da Dissertaccedilatildeo Avaliaccedilatildeo da participaccedilatildeo dos micro-organismos da Classe
Mollicutes na microbiota intestinal de mulheres eutroacuteficas e obesas
Orientador (a) Prof Dr Jorge Timenetsky
A Comissatildeo Julgadora dos trabalhos de Defesa da Dissertaccedilatildeo de Mestrado
em sessatildeo puacuteblica realizada a considerou
( ) Aprovado(a) ( ) Reprovado(a)
Examinador(a) Assinatura
Nome
Instituiccedilatildeo
Examinador(a) Assinatura
Nome
Instituiccedilatildeo
Presidente Assinatura
Nome
Instituiccedilatildeo
ldquoHoje lembrando-me dela me vendo nos olhos dela sei que o
tinha de ser se deu Por que era ela por que era eurdquo
Chico Buarque
Agrave minha matildee Maria Bernardete meu anjo de luz Dedico
AGRADECIMENTO ESPECIAL
Agrave Fundaccedilatildeo de Amparo agrave Pesquisa do Estado de Satildeo Paulo (FAPESP) agrave Fundaccedilatildeo de
Amparo agrave Pesquisa do Estado da Bahia (FAPESB) e agrave Coordenaccedilatildeo de
Aperfeiccediloamento de Pessoal de Niacutevel Superior (Capes) pelo apoio financeiro sem o
qual este estudo natildeo seria realizado
AGRADECIMENTOS
Agrave Deus e todos meus espiacuteritos de luz em vida e desencarnados por tudo que me
representam por me permitirem cruzar essa jornada com sabedoria resignaccedilatildeo feacute e
discernimento e por me mostrarem que os ldquoSinais seguem o que creemrdquo Ofereccedilo
Agrave melhor matildee que Deus poderia me permitir nascer que me mostrou a vida e me
ensinou os verdadeiros valores de amor perdatildeo caridade humildade e perseveranccedila
aleacutem de me mostrar que as barreiras da vida satildeo transponiacuteveis e que na verdade
devem ser encaradas como fronteiras Obrigada por continuar olhando por mim e me
incentivando mesmo de outro plano espiritual Sem o seu amor tudo isso seria
impossiacutevel A ti dedico
Agrave meu pai Oriston meu exemplo de vida e companheiro fiel por entender o meu
propoacutesito e me apoiar mesmo nas dificuldades Vocecirc me ensina mais a cada dia sobre
a leveza da vida e em como me tornar uma pessoa melhor uma filha melhor obrigada
Agrave meu irmatildeo Breno e minha cunhada Ariela pelo apoio e por me permitir ser a tia mais
feliz e amada desse mundo
Aos meus sobrinhos queridos Lulu Lis e Miguel por me mostrarem a pureza da vida e
do amor em sua essecircncia mais pura
Agrave Evinha minha ldquomatildee adotivardquo desde os meus 2 dias de vida por todo amor e
dedicaccedilatildeo Minha gratidatildeo seraacute eterna
Ao professor Jorge Timenetsky meu querido orientador por ter aceitado me orientar
natildeo soacute no planejamento e execuccedilatildeo do trabalho mas tambeacutem na vida Minha sincera
gratidatildeo pela orientaccedilatildeo dedicaccedilatildeo e competecircncia profissional
Ao professor Lucas meu mentor na vida e no trabalho pai matildee amigo e eterno
orientador Obrigada Marques por ter acreditado que essa semente um dia iria brotar
Sem o seu apoio e incentivo eu realmente natildeo conseguiria Ter vocecirc em meu caminho
eacute uma honra e um previleacutegio
Agrave Aricelma um dos maiores presentes que pude receber em minha trajetoacuteria pelo
amor conselhos carinhos e abraccedilos Vocecirc foi fundamental para eu me manter firme no
propoacutesito
Ao departamento de endocrinologia do HC-FMUSP e aos professores Alfredo Halpern e
Marcio Mancinni por abrirem as portas para a realizaccedilatildeo das coletas e por acreditarem
no trabalho
Aos funcionaacuterios do departamento de endocrinologia da HC-FMUSP sem os quais
seria inviaacutevel a realizaccedilatildeo das coletas
Aos pacientes por participarem deste estudo e me permitir aprender mais a cada
coleta
Ao professor Djanilson pelo auxiacutelio nas anaacutelises estatiacutesticas e por me apresentar
Jerusa um verdadeiro anjo sem a qual seria inviaacutevel as anaacutelises de consumo
alimentar
Agrave amiga e companheira de trajetoacuteria Aline Teixeira pela preciosa colaboraccedilatildeo nas
anaacutelises estatiacutesticas e por ser minha dupla imbatiacutevel
Ao amigo-irmatildeo Filipe Bezerra pela preciosa contribuiccedilatildeo nas adaptaccedilotildees das
ilustraccedilotildees e pela honra de sua amizade
Ao melhor grupo de pesquisa que jaacute sonhei fazer parte pelos ensinamentos e amizade
incondicional Juntos somos uma famiacutelia obrigada meus amigos
Agrave todos os amigos que passaram pelo aptdeg 63 ao longo desses anos vocecircs foram
fundamentais em todos os momentos dessa jornada
Aos funcionaacuterios do ICB II indispensaacuteveis no meu dia a dia pelo apoio amizade cafeacutes
e carinho
Agrave meus amigos-irmatildeos e suas respectivas famiacutelias por me ensinarem que amizade eacute o
sentimento que imanta as almas suave expressatildeo do ser que necessita intercambiar as
forccedilas da emoccedilatildeo sob os estiacutemulos do entendimento fraternal inspiradora de coragem
e de abnegaccedilatildeo que enfloresce as almas abenccediloando-as com resistecircncias para as
lutas Amo vocecircs gratidatildeo
Agrave todos que cruzaram meu caminho nesta jornada e que trouxeram consigo
ensinamentos que me transformaram em algueacutem melhor que outrora o meu muito
obrigada
Soacute o conhecimento vivido
O conhecimento de dentro para fora
Aquele que natildeo eacute aprendido nos livros nem na fria observaccedilatildeo
do fino repoacuterter de faro infaliacutevel
Soacute aquele conhecimento que se viveu dia a dia minuto a minuto
no erro e no acerto ()
Possibilita a criaccedilatildeo
Jorge Amado
18
RESUMO
SANTOS V M Avaliaccedilatildeo da participaccedilatildeo dos micro-organismos da Classe Mollicutes na microbiota intestinal de mulheres eutroacuteficas e obesas 2015 147 f Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Microbiologia) ndash Instituto de Ciecircncias Biomeacutedicas Universidade de Satildeo Paulo Satildeo Paulo 2015
A obesidade possui causas multifatoriais sendo caracterizada como um excesso de gordura
corporal acumulada no tecido adiposo causando impactos agrave sauacutede Estudos quanto agrave interaccedilatildeo
geneacutetica do indiviacuteduo com o ambiente mostram que alguns indiviacuteduos satildeo mais propensos ao ganho
de peso do que os outros em ambientes similares Satildeo muitas as evidecircncias de que o metabolismo
da microbiota intestinal facilita a extraccedilatildeo de calorias da dieta ajudam a estocaacute-las no tecido
adiposo aleacutem de prover energia e nutrientes para o crescimento microbiano Nesse contexto a
ocorrecircncia e participaccedilatildeo dos Mollicutes na microbiota intestinal eacute praticamente desconhecida
sendo necessaacuterios portanto o desenvolvimento de estudos que avaliem as implicaccedilotildees e
relevacircncia desses microrganismos nas respostas adaptativas da microbiota intestinal humana
Deste modo o objetivo do presente estudo foi analisar a participaccedilatildeo dos micro-organismos da
Classe Mollicutes e dos Filos Firmicutes e Bacteroidetes na microbiota intestinal de mulheres
obesas e eutroacuteficas Para a realizaccedilatildeo do estudo a casuiacutestica foi de 20 mulheres diagnosticadas
com obesidade (IMCgt 30kgm2) e 20 mulheres em eutrofia (IMC entre 185 e 249 kgm2 Foram
obtidas amostras de fezes sangue Foi aplicado um questionaacuterio semiestruturado sobre fatores
relacionados com obesidade e possiacutevel associaccedilatildeo com microbiota intestinal e ambiente aleacutem de
avaliaccedilatildeo antropomeacutetrica atraveacutes de Bioimpedacircncia e questionaacuterio de frequecircncia alimentar
Desenvolveu-se um ensaio quantitativo por meio de TaqMan PCR para a detecccedilatildeo de Mollicutes
nas amostras de fezes A metodologia foi especiacutefica sensiacutevel reprodutiacutevel e gerou dados
quantitativos para a detecccedilatildeo desses microrganismos nas fezes humanas Constatou-se no
presente estudo que o grupo caso apresentou consumo energeacutetico inferior ao recomendado e que
ambos os grupos apresentaram consumo superior de gorduras saturadas e inferior de fibras Em
relaccedilatildeo a determinaccedilatildeo do estado nutricional os dois grupos se apresentaram acima da meacutedia
referecircncia indicando excesso de gordura corporal Na determinaccedilatildeo da microbiota intestinal
constatou-se uma diferenccedila estatisticamente significante entre as meacutedias do nuacutemero dos micro-
organismos da classe Mollicutes entre os grupos caso e controle Detectou-se uma associaccedilatildeo
positiva estatisticamente significante entre a presenccedila de Mollicutes e mulheres obesas (OR= 115
IC= 242-554) Na quantificaccedilatildeo da presenccedila dos Filos Firmicutes e Bacteroidetes e Bacteacuterias
totais na microbiota natildeo foram observadas diferenccedilas estatisticamente significantes quanto a sua
quantidade entre as mulheres do grupo caso e controle No entanto foi observada maior proporccedilatildeo
de FirmicutesBacteroidetes na microbiota intestinal das mulheres obesas em relaccedilatildeo agraves eutroacuteficas
do grupo controle Os resultados obtidos permitiram obter evidecircncias importantes da participaccedilatildeo
dos micro-organismos da classe Mollicutes As alteraccedilotildees da microbiota intestinal tambeacutem
contribuiacuteram na definiccedilatildeo de subconjuntos de indiviacuteduos com diferentes perfis de risco metaboacutelico e
a da heterogeneidade associada a fenoacutetipos humanos relacionados com a adiposidade
Palavras-chave Obesidade Microbiota intestinal Mollicutes qPCR
ABSTRACT
SANTOS V M Evaluation of Mollicutes microorganismrsquos participation in the gut microbiota of obese and normal weight women 2015 147 p Masters thesis (Microbiology) ndash Instituto de Ciecircncias Biomeacutedicas Universidade de Satildeo Paulo Satildeo Paulo 2015
Obesity has multifactorial causes and it is characterized as an excess of corporal fat accumulated in adipose tissue causing health impacts Studies on the genetic interaction of the individual with the environment shows that some individuals are more prone to weight gain than others in similar environments There are many evidences that the gut microbiota metabolism facilitates the harvest of energy derived from ingested nutrients it help to store them in adipose tissue and provide energy and nutrients for microbial growth In this context the occurrence and participation of Mollicutes in the gut microbiota is pratically unknown requiring the development of studies to evaluate the implications and relevance of these microorganisms in the adaptive responses of the human gut microbiota Thus the aim of this study was to analyze the participation of the Class Mollicutes and Firmicutes and Bacteroidetes phylos in the gut microbiota of obese and normal weight women For the study it was collected samples of 20 women diagnosed with obesity (BMIgt 30 kg m2) and 20 women of normal weight (BMI between 185 and 249 kg m2) it was collected stool samples blood semi-structured questionnaire on etiological factors predisposing and associated with obesity and possible association with gut microbiota and the environment and anthropometric measurements using bioelectrical impedance A quantitative assay was developed through of TaqMan PCR for the detection of Mollicutes in stool samples from patients with the methodology specific sensitive reproducible and quantitative for the detection of these microorganisms in human stools It was found in this study that the case group had a lower energy consumption than recommended and that both groups had a higher intake of saturated fats and less fiber For determining the nutritional status of the two groups presented above average reference indicating excess body fat Regarding the determination of the intestinal microbiota of the study population there was a statistically significant difference between the mean of microorganisms of Mollicutes class between the case and control groups And it was detected a statistically significant positive association between the presence of Mollicutes and obese women (OR = 115 CI = 242 to 554) Regarding the analysis about the participation of phylos Firmicutes and Bacteroidetes and total bacteria in the microbiota of the study population no statistically significant differences observed for the microbial amount among women of the case and control group However there was a higher proportion of Firmicutes Bacteroidetes the gut microbiota of obese women compared to the control group normal weight women Analysis of the results provide important evidence about the participation of almost unknown Mollicutes class in the gut microbiota of the population studied as well as changes and interactions in intestinal microbiota can define subsets of individuals with different metabolic risk profiles and thus contribute to investigation of the heterogeneity associated phenotypes related to adiposity
Keywords Obesity Gut microbiota Mollicutes qPCR
LISTA DE ABREVIATURAS SIGLAS E SIacuteMBOLOS
A ndash Adenina
AEAndash N-araquidonoil etanolamina anandamida
AFndash Niacutevel de atividade fiacutesica
AGCCndash Aacutecidos graxos de cadeia curta
AgRPndash Peptiacutedeo Relacionado ao Agouti
AIDSndash Siacutendrome da imunodeficiecircncia adquirida
AIndash Adequate Intake
AMPndash Adenosina monofosfato
AMPKndash Adenosina proteiacutena quinase
AMPsndash Peptiacutedeos antimicrobianos bacterianos
APC ndash Ceacutelula apresentadora de antiacutegeno
APRILLndash Ligante indutor de proliferaccedilatildeo
atm ndash Atmosfera
ATP ndash Adenosina tri-fosfato
C ndash Citosina
C+G ndash Conteuacutedo citosina e guanina
Cb-1ndash Receptores canabinoacuteides
CCKndash Colecistocinina
CH4ndash Metano
CHOsndash Carboidratos
ChREBP ndash Carbohydrate response element-binding protein
CO2 ndash Gaacutes carbocircnico
CPT1ndash Carnitina palmitoil transferase 1
Ct ndash Cycle Treshold (Sinal de fluorescecircncia que pode ser
detectado)
CV ndash Coeficiente de variaccedilatildeo
DAG lipasendash sn-1-diacilglicerol lipase seletiva
DCs ndash Ceacutelulas Dendriacuteticas
DNA ndash Aacutecido Desoxirribonucleico
DRI ndash Dietary References Intakes
DP ndash Desvio padratildeo
dNTP ndash Deoxinucleotiacutedeo trifosfato
EAR ndash Estimated Average Requirements
EDTA ndash Aacutecido Etilenodiamino Tetra-aceacutetico
ELISA ndash Enzyme-Linked Immunoabsorbent Assay
EIndash Enzimas citoplasmaacuteticas do sistema PTS
EPIndash Equipamento de Proteccedilatildeo Individual
EROndash Espeacutecies reativas de oxigecircnio
FAAHndash Fatty acid amide hydrolase
FABFndash Fator de ativaccedilatildeo de ceacutelulas β
FFARndash Free fatty acids receptors
FIAFndash Fasting Induced Adipocyte Factor
g ndash Gramas
G ndash Guanina
GERndash Gasto energeacutetico de repouso
GETndash Gasto energeacutetico total
GLP-1ndash Peptiacutedeo semelhante ao glucagon
GPRndash Receptor acoplado agrave proteiacutena G
H2ndash Hidrogecircnio
HDLndash Lipoproteiacutena de alta densidade
HPRndash Enzimas citoplasmaacuteticas do sistema PTS
IBGEndash Instituto brasileiro de Geografia e Estatiacutestica
IC ndash Intervalo de Confianccedila
IECsndash Ceacutelulas epiteliais intestinais)
IFN-α ndash Interferon α
IFN-β ndash Interferon β
IFN-γ ndash Interferon gama
IgA ndash Imunoglobulina A
IL ndash Interleucina
IL-10 ndash Interleucina 10
IL-1β ndash Interleucina 1Beta
IL-25 ndash Interleucina 25
IL-33 ndash Interleucina 33
IL-6 ndash Interleucina 6
IMC ndash Iacutendice de massa corporal
IPAQ ndash International Physical Activity Questionnaire
kgndash Quilogramas
Kpb ndash Kilopares de bases
LPLndash Lipase lipoproteacuteica
LPSndash Lipopolissacariacutedeos
MAGndash Monoacilglicerol lipase
MAMPsndash Padrotildees moleculares associados agrave micro-organismos
MC4R ndash Receptor da Melanocortina 4
MDa ndash Megadaltons
mg ndash Miligramas
min ndash Minuto
mL ndash Mililitro
mm ndash Miliacutemetro
mM ndash Milimolar
mRNAndash RNA mensageiro
MSndash Ministeacuterio da Sauacutede
NAPE-PLDndash N-acil fostatidiletanolamida-fosfolipase D seletiva
NF-KBndash Fator nuclear Kappa B
NK ndash Natural Killers
nm ndash Nanocircmetro
NODndash Receptores de domiacutenio de digomerizaccedilatildeo de ligaccedilatildeo de
nucleotiacutedeos
NPYndash Neuropeptiacutedeo Y
ordm C ndash Graus Celsius
OMS (WHO) ndash Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede
OR ndash Odds Ratio
pb ndash Pares de base
PC1 ndash Proacute-hormocircnio Convertase 1
PCR ndash Reaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase
PGC-1ndash Peroxisome proliferator-activated receptor-gamma
coactivator 1 alpha
PGCndash Porcentagem de gordura corporal
pH ndash Potencial de hidrogecircnio iocircnico
pmol ndash Picomol
POFndash Pesquisa dos Orccedilamentos Familiares
POMCndash Proacute-oacutepio melanocortina
PPARndash Receptor Ativado por Proliferadores de Peroxissoma
PPI ndash Perda de peso intencional
PPLO ndash Pleuropneumonia-like Organisms
PTSndash Sistema fosfotransferase
PYYndash Peptiacutedeo tirosina-tirosina
QFAndash Questionaacuterio de frequecircncia alimentar
qPCR ndash PCR quantitativa ou PCR em tempo real
r2 ndash R da curva
RA ndash Aacutecido retinoacuteico
RCQndash Relaccedilatildeo cintura-quadril
REGIIIβndash Proteiacutenas antimicrobianas intestinais
REGIIIγndash Proteiacutenas antimicrobianas intestinais
RNA ndash Aacutecido ribonucleacuteico
rpm ndash Rotaccedilotildees por minuto
rRNA ndash RNA ribossocircmico
s ndash Segundo
SNCndash Sistema nervoso central
SREBP-1ndash Liver sterol response element binding protein type-1
SOCS-1 ndash Proteiacutenas supressora da sinalizaccedilatildeo de citocina-1
SOCS-3 ndash Proteiacutenas supressora da sinalizaccedilatildeo de citocina-3
T ndash Timina
TAndash Tecido adiposo
TCLE ndash Termo de Consentimento Livre e Esclarecido
TGF-β ndash Fator de crescimento tumoral-β
TGIndash Trato gastrintestinal
TLR ndash Toll-like receptor
TMndash Tecido muscular
TMBndash Taxa de metabolismo basal
TNF-α ndash Fator de Necrose Tumoral alfa
Tregndash Ceacutelulas T regulatoacuterias
tRNA ndash RNA transportador
TSLPndash Linfopoietina estromal tiacutemica
U ndash Unidade
UFC ndash Unidade Formadora de Colocircnia
UFCmicroL ndash Unidade Formadora de Colocircnia por microlitro
USDAndash United States Departament of Agriculture
VETndash Valor energeacutetico Total
X ndash Vezes
ZO-1ndash Zocircnula de oclusatildeo-1
α ndash Alfa
β ndash Beta
χ2 ndash Teste Qui-quadrado
ndash Por cento
microL ndash Microlitro
microm ndash Microcircmetros
microms ndash Microcircmetros por segundo
2-AGndash 2-araquidonoil glicerol
IacuteNDICE DE FIGURAS
Figura 1 ndash Fatores envolvidos no estabelecimento da microbiota humana ao longo da
vida 37
Figura 2 ndash Interaccedilatildeo funcional entre a microbiota intestinal humana e o sistema
imunoloacutegico 42
Figura 3 ndash Doenccedilas influenciadas pelo metabolismo microbiano
intestinal46
Figura 4 ndash Crescimento de M hominis em meio SP4 com a produccedilatildeo de colocircnia em
forma de ldquoovo fritordquo (aumento 40X) 55
Figura 5 ndash Comparaccedilatildeo entre as meacutedias de consumo de macronutrientes dos Grupos
Caso e Controle com a Faixa de Distribuiccedilatildeo Aceitaacutevel de macronutrientes (AMDRDRI)
e AI (Adequate Intake) para a faixa etaacuteria de 20 a 70 anos Satildeo Paulo SP 2013-
201484
Figura 6 ndash Comparaccedilatildeo entre as meacutedias de consumo das Vitaminas A C E e folato
dos Grupos Caso e Controle com a Faixa de Distribuiccedilatildeo Aceitaacutevel de macronutrientes
(AMDRDRI) e AI (Adequate Intake) para a faixa etaacuteria de 20 a 70 anos Satildeo Paulo
SP 2013-201485
Figura 7 ndash Comparaccedilatildeo entre as meacutedias de consumo das Vitaminas B1 B2 B6 B12
D Niacina e Aacutecido pantotecircnico dos Grupos Caso e Controle com a Faixa de
Distribuiccedilatildeo Aceitaacutevel de macronutrientes (AMDRDRI)e AI (Adequate Intake) para a
faixa etaacuteria de 20 a 70 anos Satildeo Paulo SP 2013-201486
Figura 8 ndash Comparaccedilatildeo entre as meacutedias de consumo de Sais Minerais dos Grupos
Caso e Controle com a Faixa de Distribuiccedilatildeo Aceitaacutevel de macronutrientes
(AMDRDRI)e AI (Adequate Intake) para a faixa etaacuteria de 20 a 70 anos Satildeo Paulo SP
2013-2014 87
Figura 9 ndash Comparaccedilatildeo entre as meacutedias de consumo de Sais Minerais e outros
nutrientes dos Grupos Caso e Controle com a Faixa de Distribuiccedilatildeo Aceitaacutevel de
macronutrientes (AMDRDRI)e AI (Adequate Intake) para a faixa etaacuteria de 20 a 70
anos Satildeo Paulo SP 2013-2014 87
Figura 10ndash Curva-padratildeo gerada a partir dos pontos de Ct obtidos com o graacutefico de
amplificaccedilatildeo de diluiccedilotildees seriadas do controle positivo Mycoplasma hominis calculado
pelo software StepOne 21 (Applied Biosystems Life Technologies Corporation) Satildeo
Paulo SP 2013-201490
Figura 11 ndash Quantificaccedilatildeo por qPCR de Mollicutes (UFCmicrol) a partir das amostras de
fezes nos grupos caso e controle Satildeo Paulo SP 2013-2014 92
Figura 12 ndash Quantificaccedilatildeo por qPCR de Firmicutes Bacteroidetes e Eubacterias
(UFCmicrol) a partir das amostras de fezes nos grupos caso e controle Satildeo Paulo SP
2013-201493
Figura 13 ndash Quantificaccedilatildeo de IL-1β IL-10 IL17-A e TNF-α (pgmL) no plasma
sanguiacuteneo por meio do ELISA nos grupos caso e controle da populaccedilatildeo estudada
Satildeo Paulo SP 2013-201496
IacuteNDICE DE QUADROS
Quadro 1 ndash Criteacuterios utilizados na estimativa da frequecircncia diaacuteria de consumo dos
alimentos incluiacutedos no Questionaacuterio de Frequecircncia Alimentar 61
Quadro 2 ndash Sequecircncias dos iniciadores utilizados para amplificaccedilatildeo do gene 16S rRNA
para Mollicutes 66
Quadro 3 ndash Sequecircncias dos iniciadores utilizados para amplificaccedilatildeo do gene 16S rRNA
para Firmicutes Bacteroidetes e Bacteacuterias Totais69
IacuteNDICE DE TABELAS
Tabela 1 ndash Determinaccedilatildeo do perfil da populaccedilatildeo estudada referente agrave Seccedilatildeo 1 Dados
socioeconocircmicos Satildeo Paulo SP 2013-201472
Tabela 2 ndash Determinaccedilatildeo do perfil da populaccedilatildeo estudada referente agrave Seccedilatildeo 2 Histoacuteria
Familiar Satildeo Paulo SP 2013-201472
Tabela 3 ndash Determinaccedilatildeo do perfil da populaccedilatildeo estudada referente agrave Seccedilatildeo 3 Histoacuteria
Cliacutenica Satildeo Paulo SP 2013-2014 73
Tabela 4 ndash Determinaccedilatildeo do perfil da populaccedilatildeo estudada referente agrave Seccedilatildeo 4 Histoacuteria
Obsteacutetrica Satildeo Paulo SP 2013-2014 74
Tabela 5 ndash Determinaccedilatildeo do perfil da populaccedilatildeo estudada referente agrave Seccedilatildeo 5 Histoacuteria
Ginecoloacutegica Satildeo Paulo SP 2013-2014 75
Tabela 6 ndash Determinaccedilatildeo do perfil da populaccedilatildeo estudada referente agrave Seccedilatildeo 6
Consumo atual de tabaco Satildeo Paulo SP 2013-2014 75
Tabela 7ndash Determinaccedilatildeo do perfil da populaccedilatildeo estudada referente agrave Seccedilatildeo 7
Consumo atual de aacutelcool Satildeo Paulo SP 2013-2014 76
Tabela 8 ndash Tabela de determinaccedilatildeo do perfil da populaccedilatildeo estudada referente agrave Seccedilatildeo
8 Atividade Fiacutesica (IPAQ versatildeo curta) Satildeo Paulo SP 2013-2014 76
Tabela 9 ndash Tabela de determinaccedilatildeo do perfil da populaccedilatildeo estudada referente agrave Seccedilatildeo
9 Mudanccedilas recentes nos haacutebitos alimentares Satildeo Paulo SP 2013-2014 77
Tabela 10 ndash Participaccedilatildeo dos alimentos nos grupos meacutedias de consumo por dia dos
alimentos consumidos pela populaccedilatildeo estudada Satildeo Paulo SP 2013-2014 144
Tabela 11 ndash Definiccedilatildeo dos grupos alimentares derivados do Questionaacuterio de Frequecircncia
Alimentar (QFA) e percentual de consumo da populaccedilatildeo estudada Satildeo Paulo SP
2013-201479
Tabela 12 ndash Anaacutelise de consumo de energia e nutrientes da populaccedilatildeo estudada Satildeo
Paulo SP 2013-2014 81
Tabela 13 ndash Comparaccedilatildeo das variaacuteveis dieteacuteticas relacionadas agraves razotildees de ingestatildeo e
Valor Energeacutetico Total (VET) da populaccedilatildeo estudada Satildeo Paulo SP 2013-2014 83
Tabela 14 ndash Comparaccedilatildeo de variaacuteveis antropomeacutetricas da populaccedilatildeo estudada 89
Tabela 15 ndash Repetibilidade intra-ensaio e inter-ensaio da qPCR para Mollicutes Satildeo
Paulo SP 2013-2014 91
Tabela 16 ndash Comparaccedilatildeo entre os resultados obtidos no teste de sensibilidade pelas
teacutecnicas de PCR convencional e qPCR para detecccedilatildeo de Mollicutes Satildeo Paulo SP
2013-201491
Tabela 17 ndash Nuacutemero meacutedio de coacutepias e percentual dos grupos Mollicutes estudados
frente ao Filo Firmicutes na populaccedilatildeo estudada Satildeo Paulo SP 2013-2014 94
Tabela 18 ndash Nuacutemero meacutedio de coacutepias e percentual dos grupos de bacterianos
estudados frente agraves bacteacuterias totais na populaccedilatildeo estudada Satildeo Paulo SP 2013-
201495
Tabela 19 ndash Proporccedilatildeo de Firmicutes em relaccedilatildeo agrave Bacteroidetes na populaccedilatildeo
estudada Satildeo Paulo SP 2013-201495
SUMAacuteRIO
1 INTRODUCcedilAtildeO 26
2 REFERENCIAL TEOacuteRICO 29
21 Obesidade 29
22 Microbiota Intestinal 31
221 Microbiota intestinal uma peccedila chave na sauacutede e na doenccedila31
222 Colonizaccedilatildeo e composiccedilatildeo da microbiota intestinal32
223 Fatores que influenciam a composiccedilatildeo da microbiota intestinal 34
2231 Fases da vida 34
2232 Tipo de parto 34
2233 Tipo de aleitamento 35
2234 Uso de antibioacutetico 35
2235 Dieta 36
224 Microbiota intestinal e a fisiologia do hospedeiro 38
2241 Nutriccedilatildeo e Metabolismo 38
2242 Proteccedilatildeo 39
22421 Competiccedilatildeo direta de nutrientes 39
22422 Imunomodulaccedilatildeo 40
2243 Funccedilatildeo Troacutefica 43
2244 Regulaccedilatildeo da adiposidade 43
225 Microbiota intestinal e disbiose44
226 Microbiota Intestinal e obesidade47
227 Mecanismos pelos quais a microbiota intestinal contribui para a obesidade49
2271 Extraccedilatildeo de energia adicional da dieta49
2272 Induccedilatildeo da inflamaccedilatildeo por meio da alteraccedilatildeo da permeabilidade intestinal51
23 MOLLICUTES 52
231 Caracteriacutesticas Gerais dos Mollicutes52
232 Mollicutes Microbiota Intestinal e Obesidade56
3 OBJETIVOS 58
31 Objetivo geral 58
32 Objetivos especiacuteficos 58
4 MATERIAL E MEacuteTODOS 59
41 Protocolo do estudo 59
42 Casuiacutestica 59
43 Delineamento experimental 60
44 Determinaccedilatildeo do estado nutricional 60
441 Avaliaccedilatildeo qualitativa do consumo alimentar 60
442 Avaliaccedilatildeo antropomeacutetrica do estado nutricional 62
4421 Anaacutelise da Composiccedilatildeo Corporal pelo Meacutetodo de Bioimpedacircncia 63
45 Coleta das amostras cliacutenicas 64
46 Determinaccedilatildeo da microbiota intestinal 65
461 Padronizaccedilatildeo de reaccedilatildeo de PCR quantitativo (qPCR) por meio de TaqMan para a detecccedilatildeo de
Mollicutes 65
4611 Cepas bacterianas e condiccedilotildees de cultura 65
4612 Desenvolvimento de primers e sonda para a detecccedilatildeo de Mollicutes pela PCR quantitativa 65
4613 PCR quantitativa 66
4614 Especificidade da qPCR e repetibilidade intra e inter-ensaios 67
462 Reaccedilatildeo em cadeia da polimerase (PCR) convencional 68
463 Detecccedilatildeo de micro-organismos dos filos Firmicutes e Bacteroidetes e bacteacuterias totais (Eubacterias)
por PCR em tempo Real (qPCR) 68
47 Dosagem de citocinas do soro sanguiacuteneo 69
48 Anaacutelises Estatiacutesticas 70
5 RESULTADOS 71
51 Perfil da populaccedilatildeo estudada 71
52 Determinaccedilatildeo do estado nutricional 78
521 Avaliaccedilatildeo qualitativa do consumo alimentar 78
522 Avaliaccedilatildeo antropomeacutetrica do estado nutricional 88
53 Determinaccedilatildeo da microbiota intestinal 90
531 Padronizaccedilatildeo de reaccedilatildeo de PCR quantitativo (qPCR) por meio de TaqMan para a detecccedilatildeo de
Mollicutes 90
532 Detecccedilatildeo de micro-organismos dos filos Firmicutes e Bacteroidetes aleacutem de bacteacuterias totais
(Eubacterias) por PCR em tempo Real (qPCR) 93
54 Dosagem de citocinas do soro sanguiacuteneo 96
6 DISCUSSAtildeO 97
7 CONCLUSOtildeES 107
REFEREcircNCIAS 108
APEcircNDICE A ndash TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO 127
APEcircNDICE B ndash QUESTIONAacuteRIO 131
APEcircNDICE C- TABELA 10 143
26
1 INTRODUCcedilAtildeO
A obesidade eacute definida pela Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede (WHO 2002)
como o excesso de gordura corporal acumulada no tecido adiposo com implicaccedilotildees
para a sauacutede Algumas estimativas globais recentes indicam que em 2013 mais de
600 milhotildees da populaccedilatildeo mundial adulta (com 18 anos ou mais) eram obesos com
11 dos homens e 15 das mulheres (MARIE 2014) No Brasil em 2014 estimou-
se que na populaccedilatildeo adulta (20 anos ou mais) 105 milhotildees satildeo obesos com 124
dos homens e 169 das mulheres (IBGE 2014) Nesse contexto atualmente a
obesidade estaacute entre os maiores problemas de sauacutede puacuteblica e distuacuterbio da nutriccedilatildeo
A obesidade eacute considerada atualmente uma epidemia (BACON APHRAMOR 2011
OLSHANSKY et al 2005) As alteraccedilotildees nos padrotildees dieteacuteticos e nutricionais da
populaccedilatildeo brasileira tecircm sido analisadas no processo da transiccedilatildeo nutricional (KAC
VELAacuteSQUEZ-MELEacuteNDEZ 2003)
Neste processo verificou-se que ocorreu inversatildeo nos padrotildees de distribuiccedilatildeo
das alteraccedilotildees nutricionais A alta incidecircncia de sobrepeso e obesidade na
populaccedilatildeo implica no aumento da ocorrecircncia de doenccedilas cardiovasculares cacircncer
diabetes mellitus e hipertensatildeo arterial (AMUNA ZOTOR 2008 ARAI et al 2009
DUNCAN et al 1993 GIGANTE et al 1997 JIRTLE SKINNER 2007 KAC
VELAacuteSQUEZ-MELEacuteNDEZ 2003 LESSA 1998 MONDINI MONTEIRO 1998
POPKIN et al 2006) Na obesidade ocorre basicamente o balanccedilo energeacutetico
positivo cuja patogecircnese natildeo estaacute completamente elucidada estando associada a
fatores comportamentais culturais e bioloacutegicos A regulaccedilatildeo do balanccedilo energeacutetico e
do estoque de energia corporal satildeo influenciados pela susceptibilidade individual e
seu contexto social e econocircmico demograacutefico cultural educacional ambiental e
familiar aleacutem de fatores hormonais e de heranccedila geneacutetica (GORAN 2000 VEIGA
SICHIERI 2006)
O mapa gecircnico da obesidade humana estaacute constantemente em mudanccedila pela
identificaccedilatildeo de novos genes e regiotildees cromossocircmicas associadas com a
obesidade As alteraccedilotildees do comportamento alimentar e os haacutebitos sedentaacuterios
indicam ser os principais fatores de interferecircncia nos genes de susceptibilidade a
obesidade e consequentemente no aumento da obesidade mundial Eacute provaacutevel
27
portanto que a obesidade ocorra como a resultante de fatores poligecircnicos
complexos e um ambiente obesogecircnico (dieta e sedentarismo) (BAJZER SEELEY
2006 BOUCHARD 2000 CANI et al 2007 DERAM VILLARES 2009 DUNCAN et
al 2008 TURNBAUGH et al 2009)
A captaccedilatildeo de energia pode justificar em parte o metabolismo de alguns
pacientes obesos que natildeo apresentam ingestatildeo alimentar excessiva sugerindo que
a microbiota intestinal pode predispor o indiviacuteduo agrave obesidade (BACKHED 2004)
Alguns estudos tecircm demonstrado que o desenvolvimento da obesidade em
humanos pode ser determinado pelas proporccedilotildees relativas de dois filos principais de
bacteacuterias da microbiota intestinal humana Bacteroidetes e Firmicutes que diferem
consideravelmente entre indiviacuteduos eutroacuteficos e obesos (DUNCAN et al 2008 LEY
et al 2005 2006 TENNYSON FRIEDMAN 2008) Estudos comparativos
mostraram que ratos obesos possuem significativamente niacuteveis mais baixos de
micro-organismos do Filo Bacteroidetes e niacuteveis mais elevados de Firmicutes Este
uacuteltimo estaacute associado com um aumento de absorccedilatildeo de energia da dieta
(BACKHED 2004 CANI DELZENNE 2009 DIBAISE et al 2012 LEY et al 2005
RAOULT 2008 TURNBAUGH et al 2006) Turnbaugh et al (2008) obtiveram
resultados semelhantes em ratos com obesidade induzida por dieta Curiosamente
embora as alteraccedilotildees nos niacuteveis de Firmicutes e Bacteroidetes foram observadas
nos camundongos obesos por dieta induzida a diferenccedila foi relacionada
principalmente as bacteacuterias da classe dos Mollicutes
As espeacutecies do Filo Bacteriodetes pertencem agrave microbiota intestinal humana e
animal Estas bacteacuterias satildeo bacilos ou cocobacilos gram-negativos anaeroacutebios
obrigatoacuterios heterotroacuteficos mesoacutefilos sacaroliacuteticos natildeo formadores de esporos
imoacuteveis Satildeo resistentes agrave bile natildeo produzem pigmentos Tecircm como principais
produtos finais do metabolismo da glicose os aacutecidos succiacutenico e aceacutetico
(JOHANSSON PETTERSON 2002 MANILOFF 2002) O Filo Firmicutes
encontrado em maior proporccedilatildeo no trato gastrintestinal humano satildeo micro-
organismos Gram positivos na maioria Na classificaccedilatildeo atual o filo divide-se
tipicamente em trecircs classes Bacilli - aeroacutebios facultativos ou obrigatoacuterios Clostridia -
organismos anaeroacutebios e Erysipelotrichia Mollicutes eacute a uacutenica classe do filo
Tenericutes anteriormente classificada dentro do filo Firmicutes (BERGEYrsquos 2009
2010 LUDWIG KLENK 2001 RAZIN et al 1998)
28
Os estudos das interaccedilotildees de Bacteroidetes e Firmicutes na microbiota
intestinal e sua associaccedilatildeo com a obesidade tecircm aumentado No entanto a
participaccedilatildeo dos Mollicutes eacute praticamente desconhecida O gecircnero Mycoplasma foi
introduzido em 1929 para designar micro-organismos atualmente classificados
como membros da famiacutelia Mycoplasmataceae ordem Mycoplasmatales da classe
dos Mollicutes (Mollis = mole cuacutetis = pele) (RAZIN 1992) Os Mollicutes possuem
um genoma pequeno sendo que algumas espeacutecies apresentam o menor genoma
entre os procariotos e em consequecircncia apresentam metabolismo reduzido
(MILES NICHOLAS 1998 NEIMARK 1986 RAZIN TULLY 1983) Distinguem-se
de outros procariotos pela simplicidade celular genoma e metabolismo reduzido A
ausecircncia natural da parede celular confere resistecircncia aos antibioacuteticos beta-
lactamicos Incluem-se as sulfas e rimfapicina respectivamente pela ausecircncia da
siacutentese de aacutecido foacutelico e possuir uma polimerase diferente Com aproximadamente
200 espeacutecies estes micro-organismos infectam humanos animais insetos e
plantas Considerados em geral como oportunistas por excelecircncia colonizam
ldquopreferencialmenterdquo a superfiacutecie de mucosas de mamiacuteferos mas tecircm potencial de
causar infecccedilotildees sistecircmicas dependendo do hospedeiro (DYBVIG 1990 RAZIN
YOGEV NAOT 1998)
29
2 REFERENCIAL TEOacuteRICO
21 Obesidade
A prevalecircncia da obesidade tem crescido rapidamente e representa um dos
principais desafios de sauacutede puacuteblica neste seacuteculo A Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede
(OMS) estima que pelo menos 28 milhotildees de pessoas morrem em decorrecircncia da
obesidade (IMC ge 30 kgm2) A prevalecircncia mundial quase duplicou entre 1980 e
2008 com uma transiccedilatildeo de 5 dos homens e 8 das mulheres em 1980 para
10 dos homens e 14 das mulheres (WHO 2014) A obesidade pode ser definida
como o grau de armazenamento de gordura no organismo associada ao ganho
excessivo de peso corporal total Eacute portanto considerada uma doenccedila crocircnica
podendo acarretar em consequecircncias para a sauacutede devido agraves suas relaccedilotildees com
diversas complicaccedilotildees metaboacutelicas (MS 2006)
A pesquisa dos Orccedilamentos Familiares (POF IBGE 2010) nos uacuteltimos seis
anos indicou que a frequecircncia de pessoas com excesso de peso aumentou em mais
de um ponto percentual ao ano Desta maneira em dez anos o excesso de peso
poderia alcanccedilar dois terccedilos da populaccedilatildeo adulta do Brasil magnitude idecircntica agrave
encontrada na populaccedilatildeo dos Estados Unidos Estimativas de inqueacuteritos nacionais e
internacionais das uacuteltimas deacutecadas indicam que a obesidade em 2025 alcance 40
da populaccedilatildeo nos EUA 30 na Inglaterra e 20 no Brasil (HU 2008)
O excesso de peso e a obesidade na populaccedilatildeo expressam essencialmente
o desequiliacutebrio entre ingestatildeo e utilizaccedilatildeo de calorias A justificativa estaacute na
mudanccedila dos padrotildees de alimentaccedilatildeo e de atividade fiacutesica Em 2002-2003 revelou-
se tendecircncia crescente de substituiccedilatildeo de alimentos baacutesicos e tradicionais na dieta
brasileira (como arroz feijatildeo e hortaliccedilas) por bebidas e alimentos industrializados
(como refrigerantes biscoitos carnes processadas e comida pronta) Caracteriza-se
portanto o aumento na densidade energeacutetica das refeiccedilotildees e padrotildees de
alimentaccedilatildeo capazes de comprometer a auto-regulaccedilatildeo do balanccedilo energeacutetico dos
indiviacuteduos e aumentar o risco de obesidade (LEVY-COSTA et al 2005)
Aleacutem disto em consequecircncia agrave obesidade tem sido observado aumento
consideraacutevel da prevalecircncia de doenccedilas crocircnicas natildeo transmissiacuteveis como doenccedilas
cardiovasculares cacircncer diabetes mellitus e hipertensatildeo arterial Pelo longo tempo
30
de evoluccedilatildeo destas doenccedilas ocorrem lesotildees irreversiacuteveis de intensidade variada
resultando no aumento de incapacidade ou oacutebito vecircm ocupando um maior espaccedilo
no perfil de morbimortalidade de populaccedilotildees latino americanas (DUNCAN et al 1993
LESSA 1998) Em importante estudo entre 1958 e 1951 envolvendo cinco mil
indiviacuteduos de 35 a 75 anos por periacuteodo de ateacute 44 anos a obesidade (IMC gt 30Kgm2)
foi independentemente associada ao maior risco para hipertensatildeo (mulheres
RR=26 IC95 22-31) diabetes tipo 2 (mulheres RR=14 IC95 1-18) e doenccedila
cardiovascular mulheres RR=14 IC95 11-17) (WILSON et al 2002) Os ganhos
na diminuiccedilatildeo das taxas de tabagismo ao longo do seacuteculo XX e as expectativas no
aumento de tempo de vida podem ser neutralizadas pelas prespectivas do aumento
da obesidade (STEWART et al 2009) Especialmente em paiacuteses em
desenvolvimento como o Brasil o custo anual para o Sistema Uacutenico de Sauacutede para
atender as doenccedilas relacionadas ao sobrepeso eacute estimado em US$ 20152102171
(BAHIA et al 2012)
O ganho de peso ocorre pela menor utilizaccedilatildeo de gordura como fonte de
energia do que oxidar carboidratos elevando o coeficiente respiratoacuterio obtido
atraveacutes da razatildeo entre a produccedilatildeo de gaacutes carbocircnico resultante da oxidaccedilatildeo de
carboidratos e o consumo de oxigecircnio determinado atraveacutes de calorimetria (MARRA
et al 2004) Seis lesotildees monogecircnicas principais produzem desordens endoacutecrinas
que resultam na obesidade Deficiecircncia congecircnita de Leptina defeitos no receptor
de Leptina deficiecircncia no proacute-hormocircnio convertase 1(PC1) deficiecircncia em proacute-oacutepio-
melanocortina (POMC) defeitos no receptor da Melanocortina 4 (MC4R) e defeitos
no Receptor Ativado por Proliferadores de Peroxissoma (PPAR) O controle da
ingestatildeo alimentar a curto prazo eacute controlado principalmente por vias de
sinalizaccedilatildeo que emanam do trato gastrintestinal incluindo o peptiacutedeo orexiacutegenico
grelina que ativa os sinais de fome e os peptiacutedeos anorexigecircnicos
colecistoquinina (CCK) peptiacutedeo similar ao glucagon 1- glucagon-like peptide 1
(GLP-1) e peptiacutedeo tirosina-tirosina (PYY) que geram sinais de saciedade Para o
controle da ingestatildeo agrave longo prazo parecem ser primordiais os sinais que emanam a
partir do tecido adiposo (leptina) e pacircncreas (insulina) liberados em resposta agrave
ingestatildeo de alimentos e depoacutesitos de gordura corporal (KONTUREK et al 2004)
Tem sido amplamente documentado na literatura o reganho de peso
sucessivo agraves dietas pois sabe-se que cerca de um a dois terccedilos do peso perdido
31
tendem a ser recuperados no ano seguinte sendo a recuperaccedilatildeo quase total ao final
de cinco anos (GOODRICK et al 1996) A partir disso tem sido questionado o
efeito das dietas restritivas sobre a biologia humana e sua contribuiccedilatildeo para tornar a
obesidade uma condiccedilatildeo que possivelmente se autoperpetua e se agrava de
maneira progressiva Diversos trabalhos mostram que a ciclagem de peso (ou efeito
sanfona) pode aumentar a suscetibilidade para o ganho de massa corporal no
futuro (KORKEILA et al1999 NEUMARK-SZTAINER et al 2006 2007)
22 Microbiota Intestinal
221 Microbiota intestinal uma peccedila chave na sauacutede e na doenccedila
Nas deacutecadas passadas acreditava-se que todos os micro-organismos da
microbiota possuiacuteam potencial de causar infecccedilotildees O estudo da interaccedilatildeo entre
micro-organismos e o desenvolvimento de enfermidades eacute um tema crescente na
justificativa de certas doenccedilas (DETHLEFSEN et al 2007) O termo microbiota
refere-se ao conjunto de micro-organismos no hospedeiro sadio e o termo
microbioma eacute o conjunto de genes microbianos (BACKHED 2004 LANGA 2006
VRIEZE 2010) O estudo da diversidade e distribuiccedilatildeo da microbiota e sua interaccedilatildeo
com hospedeiro tem contribuiacutedo na justificativa de algumas doenccedilas (LEY et al
2008 VENTURA et al 2008) A microbiota do trato gastrintestinal humano eacute o
ecossistema mais complexo constituiacutedo por diversas espeacutecies de micro-organismos
As bacteacuterias constituem o grupo com maior diversidade e abundacircncia Assim como o
genoma de cada indiviacuteduo eacute uma impressatildeo digital a composiccedilatildeo da microbiota
intestinal tambeacutem parece ser (LEY et al 2006 RAJILIĆ-STOJANOVIĆ SMIDT DE
VOS 2007 XU GORDON 2003)
O comensalismo e a simbiose bacteriana refletem uma ldquocorrida dinacircmicardquo
que se inicia no encontro da bacteacuteria com o hospedeiro vulneraacutevel e prossegue com
respostas adaptativas entre os dois organismos Em alguns casos a coevoluccedilatildeo
atenua a virulecircncia e conduz a uma coexistecircncia paciacutefica com ou sem franca
codependecircncia Em outras circunstacircncias a relaccedilatildeo patogecircnica eacute mantida por meio
da superaccedilatildeo dos mecanismos de defesas inatas ou adaptativas do hospedeiro
pelas bacteacuterias (GORDON HOOPER 2001) Estima-se que a microbiota intestinal eacute
composta por mais de 1000 espeacutecies bacterianas O nuacutemero de ceacutelulas microbianas
32
no luacutemen intestinal eacute de 10 vezes maior que as ceacutelulas eucarioacuteticas do organismo
representando em torno de 1 kg de peso corporal (SCARPELLINI 2010) Aleacutem
disso o microbioma eacute 100 vezes maior que o genoma humano podendo-se assim
considerar a microbiota intestinal como um oacutergatildeo virtual exteriorizado
metabolicamente adaptaacutevel e flexiacutevel aleacutem de rapidamente renovaacutevel o que
contribui para metabolismo e desempenha importante papel na obtenccedilatildeo de energia
da dieta (FRANCcedilOIS-PIERRE 2009)
A microbiota intestinal eacute crucial para a vida humana com impacto na fisiologia
e na nutriccedilatildeo do hospedeiro (HATTORI TAYLOR 2008) Considera-se que
humanos satildeo ldquosuperorganismosrdquo com metabolismo mediado pelos atributos
humanos e microbianos (GILL et al 2006) O conceito de ldquosuperorganismordquo
representa importante mudanccedila de paradigma no entendimento da biologia humana
e pode ter impacto expressivo na prevenccedilatildeo e na terapia de doenccedilas no futuro
(NICHOLSON 2006)
222 Colonizaccedilatildeo e composiccedilatildeo da microbiota intestinal
O trato gastrintestinal fetal eacute considerado praticamente esteacuteril No nascimento
eacute rapidamente colonizado por micro-organismos da matildee e do ambiente hospitalar
(PALMER et al 2007) Sugere-se que de trecircs a quatro semanas apoacutes o nascimento
a microbiota intestinal comeccedila a se estabilizar aumentando gradualmente a sua
complexidade Apoacutes um ano assemelha-se agrave microbiota de um adulto (MACKIE et
al 1999 PALMER et al 2007 SCHEacuteLE et al 2013) Contrapondo-se agrave percepccedilatildeo
da ausecircncia de micro-organismos no feto demonstrou-se a presenccedila de DNA
bacteriano na placenta e no cordatildeo umbilical (JIMEacuteNEZ et al 2005 SATOKARI et
al 2009) Aleacutem disso a identificaccedilatildeo de algumas bacteacuterias no mecocircnio explica a
origem dos primeiros micro-organismos colonizadores do intestino antes mesmo do
nascimento possivelmente como um mecanismo adaptativo para o desenvolvimento
do intestino fetal fora do organismo materno (JIMEacuteNEZ et al 2008)
Os micro-organismos presentes no trato gastrintestinal podem ser autoacutectones
ou aloacutectones Linhagens autoacutectones tecircm longa associaccedilatildeo com o hospedeiro e
formam uma populaccedilatildeo estaacutevel de tamanho caracteriacutestico em uma regiatildeo do
intestino Os organismos aloacutectones satildeo adquiridos principalmente atraveacutes dos
alimentos ingeridos e do ecossistema oral Eacute difiacutecil determinar se um organismo eacute
33
um autoacutectone verdadeiro Contudo as bacteacuterias aloacutectones natildeo persistem no
ecossistema e satildeo detectaacuteveis apenas por um periacuteodo limitado (GORDON
HOOPER 2001 LEY et al 2006 WALTER 2008)
Os micro-organismos satildeo encontrados em todo o trato gastrintestinal no
entanto as mudanccedilas nas condiccedilotildees fisioloacutegicas implicam diferenccedilas na
composiccedilatildeo de micro-organismos nos diversos locais No trato gastrintestinal
inferior o fluxo do conteuacutedo torna-se mais lento e o ambiente conteacutem menos
substacircncias antimicrobianas favorecendo a colonizaccedilatildeo microbiana e o
estabelecimento de maior densidade de micro-organismos (QIN et al 2010
ZOETENDAL et al 2006) A partir da cavidade oral ao acircnus tem sido observado o
aumento da densidade microbiana no jejuno iacuteleo e no intestino grosso em
comparaccedilatildeo com o estocircmago e duodeno O coacutelon refere-se a um ecossistema
complexo com ampla diversidade microbiana e presenccedila de diversos gecircneros
bacterianos O pH neutro e a abundacircncia relativa de nutrientes como os
carboidratos natildeo digeriacuteveis e outros componentes alimentares que escapam do
processo digestivo tornam o coacutelon um ambiente favoraacutevel agrave proliferaccedilatildeo microbiana
O coacutelon eacute a regiatildeo do TGI que apresenta maior densidade microbiana podendo
alcanccedilar 1014UFCg-1 Dados tem mostrado que cada indiviacuteduo carrega mais de
1000 filotipos que representam mais de 7000 linhagens (AZAD et al 2013
ECKBURG et al 2005 FRANK et al 2007 HOLZAPFEL 2006 KLEEREBEZEM
VAUGHAN 2009 LEY et al 2008 QUIGLEY 2013 ZOETENDAL et al 2006)
Aproximadamente 99 dos genes identificados por metagenoma do intestino
humano satildeo bacterianos Na maioria dos indiviacuteduos cerca de 90 dos filos satildeo
Firmicutes e Bacteroidetes seguidos por Actinobacterias (famiacutelia Bifidobacteriaceae)
e Proteobacterias (famiacutelia Enterobacteriaceae) O filo mais abundante refere-se ao
Firmicutes apresentando como principais integrantes as classes Bacilli Clostridia e
Molicutes e dos Bacteroidetes as classes Bacteroides Flavobacteria e
Sphingobacterias Os filos Actinobacterias e Proteobacterias se apresentam em
menor proporccedilatildeo (ARUMUGAM et al 2011 DE FILIPPO et al 2010
HUTTENHOWER et al 2012 QIN et al 2010 QUIGLEY 2013 VILLANUEVA-
MILLAacuteN et al 2015 VRIEZE 2010 ZOETENDAL et al 2006)
34
223 Fatores que influenciam a composiccedilatildeo da microbiota intestinal
A microbiota do TGI humano eacute uma comunidade complexa cuja composiccedilatildeo
eacute inconstante diferindo inter e intra-individualmente definida por uma seacuterie de
fatores como geneacutetica do hospedeiro alimentaccedilatildeo sucessatildeo bacteriana funccedilatildeo
imune e estado de sauacutede (LEY et al 2008 EVERARD et al 2011 2014)
2231 Fases da vida
A diversidade bacteriana no intestino infantil eacute inicialmente muito baixa ateacute os
dois anos ao contraacuterio da microbiota de adulto (GAREAU et al 2010 HAJELA et al
2015) A baixa diversidade de bacteacuterias na primeira infacircncia inibe a maturaccedilatildeo
regular da microbiota intestinal e maturaccedilatildeo tardia da mucosa do sistema
imunoloacutegico implicando em riscos do aumento da resposta imune assim como
doenccedilas aleacutergicas Neste contexto envolve o desenvolvimento da toleracircncia oral e a
susceptibilidade da crianccedila a alergias e inflamaccedilatildeo A microbiota sofre portanto
mudanccedilas substanciais nos extremos da vida essas ramificaccedilotildees ainda estatildeo sendo
exploradas (AURELI et al 2011 HAJELA et al 2015 SHERIDAN et al 2014
SMITH et al 2013)
2232 Tipo de parto
A microbiota maternal eacute uma fonte de micro-organismos para a colonizaccedilatildeo do
TGI do receacutem-nascido As bacteacuterias residentes no canal vaginal e na regiatildeo perineal
tambeacutem ganham acesso ao TGI de receacutem-nascidos (BRY et al 1996 MACKIE et
al 1999) Ocorrem diferenccedilas entre o microbioma de um bebecirc receacutem-nascido por
parto normal em comparaccedilatildeo ao bebecirc receacutem-nascido por parto cesaacuterea No parto
vaginal o bebecirc eacute colonizado por bacteacuterias vaginais e fecais maternas cujas
composiccedilatildeo microbiana reflete a microbiota intestinal materna composta
predominantemente pelos gecircneros Lactobacillus Prevotella Atopobium e Sneathia
As amostras fecais de bebecircs nascidos de parto cesariana apresentaram gecircneros
tiacutepicos de microbiota da pele e do ambiente hospitalar predominantemente
Staphylococcus e C difficile Estes bebecircs tambeacutem apresentaram niacuteveis
significativamente mais baixos de Bifidobacterium e diversidade bacteriana menor do
que os bebecircs nascidos por parto normal Estas diferenccedilas podem justificar o
aumento do risco de doenccedilas especiacuteficas em bebecircs receacutem-nascidos por parto
35
cesariana agrave longo prazo (AZAD et al 2013 BELLO et al 2010 COLLADO et al
2012 DOMINGUEZ- PENDERS et al 2006 PRINCE et al 2014)
As diferenccedilas no processo de colonizaccedilatildeo intestinal decorrentes do tipo de
parto poderiam refletir-se no desenvolvimento do sistema imunoloacutegico visto que os
micro-organismos gastrintestinais influenciam esse processo por meio do envio de
importantes sinais regulatoacuterios necessaacuterios para o desenvolvimento da adequada
toleracircncia ao ambiente (BIASUCCI et al 2008 CARDWELL et al 2008
DOMINGUEZ-BELLO et al 2010 KOENIG et al 2011 MORELLI et al 2008
RENZ-POLSTER et al 2005)
2233 Tipo de aleitamento
O leite materno humano eacute considerado um dos principais fatores da iniciaccedilatildeo e
no desenvolvimento da microbiota do neonato uma vez que conteacutem substratos
(prebioacuteticos) para estimular o crescimento bacteriano e tambeacutem eacute fonte de micro-
organismos Estima-se que o consumo de 800 ml de leite materno por dia
proporcione 1 x 105 a 1 x 107 micro-organismos comensais durante a amamentaccedilatildeo
(MARTIN et al 2004) Desta maneira a contagem de Bifidobacterium aumenta
drasticamente Lactobacillus e Bacteroides aumentam em menor proporccedilatildeo e
enterobacteacuterias e enterococos diminuem Espeacutecies de Bifidobacterium
correspondem de 80 a 90 do total dos componentes da microbiota fecal infantil
presentes em bebecircs amamentados por leite materno Jaacute em receacutem-nascidos
alimentados com foacutermulas infantis a microbiota tem demonstrado ser muito mais
complexa sendo composta por Bifidobacterium Bacteroides Clostridium e
Streptococcus (ADLERBERTH WOLD 2009 CUMMINS THOMPSON 1997 DE
SANTA BARBARA et al 2003 DONOVAN ODIE 1994 DONOVAN 2006 MACKIE
et al 1999 MARQUES et al 2010 MCCRACKEN LORENZ 2001 PALMER
2011 POROYKO et al 2010)
2234 Uso de antibioacutetico
A eventual antibioticoterapia interfere tambeacutem no equiliacutebrio da microbiota A
disbiose (alteraccedilatildeo da microbiota) depende de fatores como espectro de accedilatildeo da
droga idade e dieta do indiviacuteduo dosagem e duraccedilatildeo do tratamento via de
administraccedilatildeo propriedades farmacocineacuteticas e farmacodinacircmicas aleacutem de grau de
36
resistecircncia da comunidade (LEY 2000 SULLIVAN et al 2001) A seleccedilatildeo de
bacteacuterias resistentes a drogas pela antibioticoterapia eacute um problema mundial Os
genes de resistecircncia passam para diversos gecircneros bacterianos no intestino A
aquisiccedilatildeo de genes de resistecircncia confere benefiacutecios a determinada espeacutecie
bacteriana diante da pressatildeo seletiva exercida pelo antibioacutetico Quando essa
pressatildeo seletiva eacute suspensa a cepa resistente apresenta menor desempenho em
comparaccedilatildeo com a espeacutecie susceptiacutevel No entanto esse clone menos competitivo
pode compensar essa perda de desempenho pela aquisiccedilatildeo de mutaccedilotildees
compensatoacuterias (JERNBERG et al 2010) No intestino os antibioacuteticos aleacutem de
selecionarem bacteacuterias resistentes tambeacutem aumentam o nuacutemero de transferecircncias
do pool de genes de ceacutelulas resistentes (DETHJEFSEN et al 2008 KARAMI et al
2007 YANG et al 2009)
2235 Dieta
Muitos estudos tem sido realizados no intuito de compreender a relaccedilatildeo entre o
consumo alimentar e a composiccedilatildeo da microbiota intestinal principalmente no
sentido de uma dieta ocidentalizada baseada em alimentos ricos em carboidratos
simples lipiacutedios e proteiacutenas de origem animal sal e poucos alimentos in natura
como frutas e hortaliccedilas ao comparar se com a dietas dos nossos antepassados
caracterizada pelo consumo de grandes quantidades de amido fibras e
polissacaacuteridos vegetais aleacutem de pequenas quantidades de gordura e proteiacutena
animal Em modelos murinos de obesidade induzida por padratildeo de dieta ocidental
no qual animais geneticamente idecircnticos que herdaram microbiotas semelhantes a
relaccedilatildeo entre dieta e representantes microbianos eacute dinacircmica e ajustaacutevel impactando
a capacidade da microbiota de promover a adiposidade no hospedeiro (CARMODY
et al 2015 DAVID et al 2014 DE FILIPPO et al 2010 FLEISSNER et al 2010
HILDEBRANDT et al 2009 LEY et al 2008 MENDONCcedilA ANJOS 2004 WALKER
et al 2011 WONG et al 2012 WU et al 2011)
Uma vez que a microbiota foi estabelecida nestes primeiros anos observa-se
um aumento na composiccedilatildeo microbiana tanto na diversidade quanto na riqueza
atingindo a mais alta complexidade em adultos com vaacuterias centenas de filotipos e
niacuteveis de espeacutecie Cada indiviacuteduo humano atinge um cliacutemax de composiccedilatildeo
homeostaacutetico o que provavelmente permanece relativamente estaacutevel durante a
37
maior parte da vida de um adulto saudaacutevel Nas fases tardias da vida a composiccedilatildeo
da microbiota torna-se novamente menos diversificada e mais dinacircmica
caracterizada por uma maior proporccedilatildeo de Bacteroidetes para Firmicutes aumento
de Proteobacteria e diminuiccedilatildeo da Bifidobacterium (MACKIE 1999 OTTMAN et al
2012 RAUTAVA et al 2012 VILLANUEVA-MILLAacuteN et al 2015) (Figura 1)
Figura 1 ndash Fatores envolvidos no estabelecimento da microbiota humana ao longo
da vida
Adaptado de MJ Villanueva-Millaacuten et al 2015
38
224 Microbiota intestinal e a fisiologia do hospedeiro
O intestino representa a interface natural entre microbiota intestinal e o
hospedeiro sendo a mucosa intestinal a localizaccedilatildeo principal para a interaccedilatildeo de
micro-organismos e antiacutegenos com o hospedeiro por meio de intenso cross-talk
(KINROSS et al 2011) Os achados de estudos cliacutenicos e experimentais tecircm
evidenciado que a interaccedilatildeo microbiotahospedeiro pode influenciar favoravelmente
a sauacutede do hospedeiro de diversas maneiras Ateacute agora as principais funccedilotildees
conhecidas da microbiota podem ser classificadas em quatro grupos metaboacutelica
(nutriccedilatildeo e digestatildeo) proteccedilatildeo (proteccedilatildeo contra agentes patogecircnicos
imunomodulaccedilatildeo) troacutefica (controle da proliferaccedilatildeo de ceacutelulas epiteliais e
diferenciaccedilatildeo) e regulaccedilatildeo da adiposidade
2241 Nutriccedilatildeo e Metabolismo
A microbiota intestinal eacute um importante fator que afeta a extraccedilatildeo de energia a
partir da dieta e do armazenamento de energia no hospedeiro A fim de realizar
estas funccedilotildees as enzimas metaboacutelicas da microbiota intestinal como as glicosidases
e polissacaridases tecircm a capacidade de extrair energia a partir de nutrientes
inacessiacuteveis uma vez que estas enzimas satildeo capazes de clivar ligaccedilotildees glicosiacutedicas
presentes em alguns polissacariacutedeos de plantas e fibras dieteacuteticas (BACKHED et al
2004 2005 GUARNER MALAGELADA 2003) Os polissacariacutedeos natildeo digeriacuteveis
como a oligofrutose (inulina) satildeo metabolizados pela microbiota colocircnica em
oligossacariacutedeos e monossacariacutedeos e entatildeo fermentados a aacutecidos graxos de
cadeia curta (AGCC) particularmente acetato propionato e butirato Estes AGCC
satildeo rapidamente absorvidos O Butirato fornece energia para o metabolismo celular
enquanto acetato e propionato seguem para a corrente sanguiacutenea sendo
transportados para o fiacutegado e oacutergatildeos perifeacutericos onde podem atuar como substratos
para a gliconeogecircnese e lipogecircnese (SHEN et al 2013 ZAIBI et al 2010)
A microbiota intestinal tambeacutem induz a expressatildeo do peptiacutedeo YY (PYY)
anorexigecircnico que geram sinais de saciedade atraveacutes de um mecanismo
dependente do receptor GPR41 Assim a produccedilatildeo de AGCC pela microbiota
intestinal estaacute associada com um aumento na saciedade e uma reduccedilatildeo na ingestatildeo
de alimentos no hospedeiro o qual por sua vez controla o ganho de peso corporal
(CLUNY et al 2015 SHEN et al 2013 ZAIBI et al 2010) Outros mecanismos
39
pelos quais as bacteacuterias do intestino podem influenciar metabolismo do colesterol
satildeo induzidos atraveacutes de Fasting Induced Adipocyte Factor (FIAF) que eacute
seletivamente suprimida no epiteacutelio intestinal pela microbiota intestinal (MARTINEZ
et al 2009)
Tambeacutem tem sido relatado o envolvimento da microbiota intestinal na
metabolizaccedilatildeo de polifenoacuteis que contribuem para o seu potencial antioxidante e
accedilotildees beneacuteficas aleacutem de siacutentese de algumas vitaminas como B12 e K aleacutem da
induccedilatildeo da expressatildeo do receptor de vitamina D pelos AGCC aumentando a sua
absorccedilatildeo e regulando o metabolismo do caacutelcio (BRENCHLEY DOUEK 2012
GUARNER MALAGELADA 2003 KIM et al 1998 MANACH DONOVAN 2004
RESTA 2009 SCALBERT WILLIAMSON 2000) Finalmente a microbiota intestinal
tambeacutem eacute capaz de executar uma seacuterie de biotransformaccedilotildees em xenobioacuteticos
como drogas e seus metaboacutelitos em formas que podem afetar sua absorccedilatildeo e
biodisponibilidade (WILSON NICHOLSON 2009) Neste contexto tem sido
demonstrado que a microbiota intestinal metaboliza toacutexicos e compostos
potencialmente canceriacutegenos tais como pirolisatos (BRENCHLEY DOUEK 2012)
2242 Proteccedilatildeo
Tem sido observado que a ausecircncia da microbiota intestinal torna o organismo
suscetiacutevel agrave infecccedilatildeo Alguns dos mecanismos envolvidos nessas accedilotildees protetoras
incluem competiccedilatildeo direta de nutrientes limitados e a modulaccedilatildeo de respostas
imunoloacutegicas no hospedeiro (GUARNER MALAGELADA 2003 KAMADA et al
2013 SEKIROV et al 2010)
22421 Competiccedilatildeo direta de nutrientes
Vaacuterios mecanismos tecircm sido implicados na resistecircncia agrave colonizaccedilatildeo do trato
gastrintestinal por patoacutegenos A camada de muco intestinal eacute capaz de manter
mutualismos mantendo as bacteacuterias no compartimento e restringindo estimulaccedilatildeo
imunoloacutegica ostensiva O hospedeiro fornece ativamente os nutrientes que a
microbiota precisa e a microbiota indica a quantidade de nutrientes que satildeo
necessaacuterios para o hospedeiro Esta relaccedilatildeo impede superproduccedilatildeo indesejada do
nutriente o que favoreceria a intrusatildeo de micro-organismos competitivos com
potencial de patogenicidade Finalmente as bacteacuterias podem inibir o crescimento
40
dos seus concorrentes produzindo peptiacutedeos antimicrobianos ou proteiacutenas
conhecidas como bacteriocinas que satildeo sintetizadas em ribossomos (GUARNER
MALAGELADA 2003 MONTALTO et al 2009 PURCHIARONI et al 2013
SEKIROV et al 2010)
22422 Imunomodulaccedilatildeo
As interaccedilotildees entre micro-organismos e ceacutelulas epiteliais e imunes baseiam-se
no reconhecimento de padrotildees moleculares associados agrave micro-organismos
(MAMPs) sendo mediado por receptores de reconhecimento padratildeo representados
pelos receptores do tipo toll (TLR) encontrados na superfiacutecie de ceacutelulas epiteliais e
imunes e pelos receptores de domiacutenio de digomerizaccedilatildeo de ligaccedilatildeo de nucleotiacutedeos
(NOD) que se encontram no citoplasma Esses receptores desempenham um
importante papel na gecircnese e na modulaccedilatildeo da resposta inflamatoacuteria (FRANCHI et
al 2009 MARANDUBA et al 2014 MONTALTO et al 2009 PURCHIARONI et al
2013)
A interaccedilatildeo funcional entre microbiota intestinal e sistema imunoloacutegico inicia-
se com a promoccedilatildeo de um ambiente anti-inflamatoacuterio pelas bacteacuterias (Figura 2) Em
um contexto simbioacutetico MAMPs estimulam continuamente atraveacutes das IECs (ceacutelulas
epiteliais intestinais) a secreccedilatildeo das proteiacutenas antimicrobianas intestinais REGIIIγ
para o luacutemen aleacutem de linfopoietina estromal tiacutemica (TSLP) IL-33 IL-25 e o fator de
crescimento tumoral-β (TGF-β) sob o epiteacutelio Esses mediadores imunoloacutegicos
induzem o desenvolvimento de macroacutefagos tolerogecircnicos e ceacutelulas dendriacuteticas
(DCs) tolerogecircnicas (KAMADA et al 2013 MAYNARD et al 2012)
Ceacutelulas Dendriacuteticas (DCs) tolerogecircnicas produzem TGF-β e aacutecido retinoacuteico
(RA) que estimulam o desenvolvimento de Ceacutelulas T regulatoacuterias (Treg) Assim
atraveacutes das ceacutelulas Treg (que utilizam diversos mecanismos de regulaccedilatildeo)
macroacutefagos (que produzem IL-10) e DCs tolerogecircncicos o sistema imunoloacutegico
intestinal eacute capaz de estabelecer e manter um ambiente anti-inflamatoacuterio Aleacutem dos
papeacuteis reguladores essenciais de TGF-β esta citocina tem sido associada com
outras substacircncias derivadas do epiteacutelio tais como fator de ativaccedilatildeo de ceacutelulas β
(FABF) e ligante indutor de proliferaccedilatildeo (APRILL) com o intuito de induzir o
desenvolvimento de ceacutelulas produtoras de IgA (plasmoacutecitos) (FAGARASAN et al
2010) Esta imunoglobulina eacute capaz de prevenir a ligaccedilatildeo de bacteacuterias comensais no
41
epiteacutelio do hospedeiro estando portanto envolvida na formaccedilatildeo da microbiota
intestinal (MACPHERSON et al 2012)
Aleacutem disto tem sido relatada que a produccedilatildeo de alguns tipos de peptiacutedeos
antimicrobianos bacterianos (AMPs) como a secreccedilatildeo das proteiacutenas
antimicrobianas intestinais REGIIIγ REGIIIβ e angiogenina-4 eacute influenciada pela
micro-organismos comensais via TLR MyD88 (FRANCHI et al 2009 GOTO
IVANOV 2013 VAN VLIET et al 2010) Desse modo verifica-se que no intestino
humano saudaacutevel a microbiota promove constante exposiccedilatildeo de ligantes aos TLR
garantindo a ativaccedilatildeo basal contiacutenua de vias de sinalizaccedilatildeo resultando em
inflamaccedilatildeo fisioloacutegica de baixa intensidade Aleacutem disso micro-organismos
comensais tambeacutem satildeo capazes de suprimir respostas inflamatoacuterias intensas (VAN
VLIET et al 2010)
42
Figura 2 ndash Interaccedilatildeo funcional entre a microbiota intestinal humana e o sistema
imunoloacutegico
Legenda ndash O equiliacutebrio evolutivo eacute formado ao longo do tempo sendo modulado por pressatildeo ambiental A
microbiota intestinal e o ambiente intestinal satildeo desenvolvidas em conjunto sendo necessaacuterio para o benefiacutecio de ambos tolerar um ao outro O sistema imunoloacutegico monitora essa interaccedilatildeo garantindo a homeostase e contribuindo para a simbiose No entanto o desequiliacutebrio causado na presenccedila de disbiose pode causar a reaccedilatildeo do sistema imunoloacutegico Simbiose e disbiose dependem de equiliacutebrio entre bacteacuterias comensais e patogecircnicas Bacteacuterias comensais promovem um ambiente anti-inflamatoacuterio Em um contexto de simbiose MAMPs estimulam continuamente as IECs a secretarem moleacuteculas que atuam protegendo o epiteacutelio e produzindo um ambiente tolerogecircnico Em disbiose haacute uma liberaccedilatildeo significativa de MAMPs que podem induzir IECs DCs ativadas e macroacutefagos a secretar citocinas inflamatoacuterias Consequentemente haacute um desenvolvimento de efetores imunoloacutegicos IL-22 eacute produzida em ambas as situaccedilotildees mas a contribuiccedilatildeo para a remodelaccedilatildeo da barreira epitelial eacute controlada por regulaccedilatildeo imune M macroacutefago Com bacteacuterias comensais Pato bacteacuterias patogecircnicas
Adaptado de MARANDUBA et al 2014
43
2243 Funccedilatildeo Troacutefica
A microbiota intestinal desempenha funccedilotildees troacuteficas modulando a proliferaccedilatildeo
e diferenciaccedilatildeo de ceacutelulas epiteliais do coacutelon atraveacutes dos AGCC produzidos na
fermentaccedilatildeo de hidratos de carbono natildeo digeriacuteveis Neste contexto o butirato eacute
considerado o AGCC com maior efeito pois promove o crescimento e o turnover das
ceacutelulas epiteliais acelerando a maturaccedilatildeo intestinal da mucosa durante o seu
desenvolvimento ou para induzir seu reparo apoacutes uma lesatildeo O butirato eacute capaz de
aumentar proliferaccedilatildeo diferenciaccedilatildeo e maturaccedilatildeo aleacutem de reduzir apoptose de
enteroacutecitos normais no intestino delgado atraveacutes de sua influecircncia sobre a
expressatildeo de genes e a siacutentese de proteiacutenas (GUILLOTEAU et al 2010 HAMER et
al 2008)
O butirato parece exercer um efeito troacutefico em ceacutelulas epiteliais do iacuteleo e do
jejuno atraveacutes de um mecanismo de neuro-hormonal sugerindo um efeito indireto
No coacutelon a ausecircncia de butirato induziu apoptose massiva nos colonoacutecitos podendo
ser explicado pelo fato de que o butirato eacute a fonte principal de energia para estas
ceacutelulas aleacutem de estimular a liberaccedilatildeo de peacuteptidos gastrointestinais eou fatores de
crescimento que desempenham um papel fundamental na proliferaccedilatildeo celular
(GUILLOTEAU et al 2010 HAMER et al 2008)
2244 Regulaccedilatildeo da adiposidade
Tem sido evidenciado que a microbiota intestinal influecircncia a adiposidade do
hospedeiro A primeira evidecircncia do papel da microbiota intestinal na regulaccedilatildeo da
homeostase energeacutetica e adiposidade do hospedeiro foi demonstrada por Backhed
et al (2004) em estudo que foi demonstrado que ratos germ-free apresentavam
menor conteuacutedo de gordura corporal do que ratos convencionais mesmo ao
consumirem a mesma quantidade de alimentos Diferentes mecanismos tecircm sido
propostos para explicar a relaccedilatildeo entre microbiota intestinal e a adiposidade Assim
dependendo da sua composiccedilatildeo a microbiota pode aumentar a extraccedilatildeo energeacutetica
da dieta a partir de polissacariacutedeos natildeo digeriacuteveis com menor conteuacutedo de energia
disponiacutevel nas fezes aleacutem de maiores niacuteveis de AGCC no intestino Propotildee-se
ainda que a microbiota intestinal seja capaz de induzir a regulaccedilatildeo de genes do
hospedeiro que modulam o metabolismo energeacutetico (MUSSO et al 2011)
44
225 Microbiota intestinal e disbiose
Em condiccedilotildees saudaacuteveis existe um equiliacutebrio entre todos os micro-organismos
presentes no intestino estando as bacteacuterias beneacuteficas em maior quantidade
(eubiose) Entretanto pode ocorrer desequiliacutebrio na microbiota com consequente
predomiacutenio das bacteacuterias potencialmente patogecircnicas sobre as beneacuteficas Esse
desequiliacutebrio eacute definido como disbiose e pode comprometer a sauacutede do hospedeiro
uma vez que se associa agrave patogecircnese de vaacuterias doenccedilas (HAWRELAK MYERS
2004)
O uso de antibioacuteticos anti-inflamatoacuterios hormonais e natildeo hormonais abuso de
laxantes consumo excessivo de alimentos processados baixo consumo de
alimentos crus excessiva exposiccedilatildeo a toxinas ambientais incluindo alguns metais
pesados doenccedilas consumptivas como cacircncer e siacutendrome da imunodeficiecircncia
adquirida (AIDS) disfunccedilotildees hepatopancreaacuteticas estresse divertiacuteculos idade
tempo de tracircnsito e pH intestinal disponibilidade de material fermentaacutevel estado
imunoloacutegico do hospedeiro e infecccedilotildees satildeo fatores importantes para promover
alteraccedilatildeo da microbiota acarretando em disbiose intestinal e consequentemente
modificando vaacuterias funccedilotildees do TGI incluindo a digestatildeo a
biodisponibilidadeabsorccedilatildeo eliminaccedilatildeo desintoxicaccedilatildeo e funccedilatildeo imunoloacutegica
(ALMEIDA et al 2009 HAWRELA MYERS 2004 SEARS GENUIS 2012)
Em um contexto de disbiose (Figura 2) a presenccedila de agentes patogeacutenicos
pode perturbar a regulaccedilatildeo do ambiente anti-inflamatoacuterio Quando patoacutegenos
enteacutericos superam as bacteacuterias comensais o desequiliacutebrio entre comensais e
bacteacuterias patogecircnicas provoca uma liberaccedilatildeo significativa de MAMPs Este aumento
pode induzir IECs DCs e macroacutefagos ativados a secretar citocinas inflamatoacuterias
como a IL-1β IL-6 IL-12 e IL-23 Estas citocinas estimulam o desenvolvimento de
ceacutelulas CD4+ T auxiliares (T helper - TH1) e ceacutelulas TH17 (produzem IL-17A IL-
17F e IL-22) resultando na inflamaccedilatildeo crocircnica (MAYNARD et al 2012)
Na vigecircncia da disbiose intestinal pode ocorrer perda de funccedilotildees importantes
da microbiota do hospedeiro As alteraccedilotildees qualitativas e quantitativas na microbiota
intestinal aleacutem das alteraccedilotildees nas atividades metaboacutelicas e na distribuiccedilatildeo dos
micro-organismos ao longo do intestino associam-se a diversas condiccedilotildees tais
como diarreias deacuteficits nutricionais doenccedila celiacuteaca cacircncer colorretal doenccedilas
45
inflamatoacuterias intestinais siacutendrome do coacutelon irritaacutevel e supercrescimento bacteriano
(ALMEIDA et al 2009 HAWRELAK MYERS 2004)
A disbiose pode provocar aumento da permeabilidade intestinal alterando uma
importante funccedilatildeo da mucosa intestinal que eacute a atividade de barreira Assim
moleacuteculas antigecircnicas ou toacutexicas e micro-organismos nocivos podem se translocar
atraveacutes da barreira promovendo a passagem destas substacircncias atraveacutes da mucosa
epitelial para o sangue ou sistema linfaacutetico gerando uma resposta inflamatoacuteria
sistecircmica A ligaccedilatildeo entre disbiose e desenvolvimento de doenccedilas como obesidade
diabetes e doenccedilas cardiovasculares vem sendo explorada A obesidade representa
uma das doenccedilas mais estudadas associadas agrave perturbaccedilotildees na microbiota
intestinal no entanto requer mais estudos (Figura 3) (ALMEIDA et al 2009
HAWRELAK MYERS 2004 KINROSS et al 2011)
46
Figura 3 ndash Doenccedilas influenciadas pelo metabolismo microbiano intestinal
Legenda ndash A variedade de doenccedilas sistecircmicas que satildeo diretamente influenciadas pelo metabolismo da microbiota intestinal e a sua influecircncia sobre outras vias em mamiacuteferos tais como o sistema imunitaacuterio inato tem sido demonstradas Especificamente em destaque incluem as vias metaboacutelicas envolvidas com o metabolismo de drogas e a obesidade que satildeo diretamente influenciados pelo teor microbiano intestinal Ags antigeacutenios C bolteae Clostridium Bolteae DCs ceacutelulas dendriacuteticas AGCC aacutecidos graxos de cadeia curta TLR receptor Toll-like
Adaptado de Kinross et al 2011
47
226 Microbiota Intestinal e obesidade
A partir de 2004 mais um fator ambiental passou a ser apontado como
importante para o controle do peso e da homeostase energeacutetica a microbiota
intestinal As primeiras evidecircncias da relaccedilatildeo microbiota intestinal versus obesidade
foram constatadas em animais germ-free convencionalizados Esses animais
demonstraram que mesmo ao consumir uma menor quantidade de dieta e portanto
menos calorias em comparaccedilatildeo aos animais germ-free apresentaram aumento da
quantidade de gordura corporal (BACKHED et al 2004)
Especificamente tem-se observado que a microbiota de ratos obesos tem uma
maior capacidade de extraccedilatildeo de energia da dieta e esta caracteriacutestica pode ser
transmissiacutevel atraveacutes da colonizaccedilatildeo de ratos germ-free com a microbiota fecal de
doadores obesos resultando em um aumento significativamente maior no percentual
de gordura corporal total com o intuito de armazenar os lipiacutedeos produzidos Estes
estudos demonstraram que microbiota intestinal eacute um potencial fator de contribuiccedilatildeo
adicional agrave fisiopatologia da obesidade (BACKHED et al 2004 HARRIS et al 2012
LEY et al 2005 TURNBAUGH et al 2006)
A definiccedilatildeo da alteraccedilatildeo na composiccedilatildeo da microbiota intestinal de obesos
ainda permanece controversa na literatura tanto no que se refere agrave abordagem em
niacutevel de filo quanto de espeacutecies em humanos (LYRA et al 2010) Aleacutem destes
estudos realizados com animais germ-free outros observaram associaccedilotildees
importantes entre obesidade e mudanccedilas na composiccedilatildeo da microbiota intestinal tal
como uma diversidade bacteriana reduzida (no filo eou outros niacuteveis) eou
representaccedilatildeo alterada de genes e vias metaboacutelicas bacterianas (DE LA SERRE et
al 2010 LEY et al 2006 TURNBAUGH et al 2006)
Em geral vaacuterios autores tecircm demonstrado associaccedilotildees entre obesidade e
mudanccedilas na abundacircncia relativa dos dois filos bacterianos dominantes
Bacteroidetes e Firmicutes Mais especificamente um aumento do filo Firmicutes e
uma diminuiccedilatildeo do filo Bacteroidetes em modelos de ratos obesos e pacientes tecircm
sido observado Aleacutem disso indiviacuteduos magros e pessoas que perderam peso
apresentaram maior abundacircncia do filo Bacteroidetes (ABDALLAH et al 2011
BACKHED et al 2007 CANI et al 2008 LEY et al 2005 2006 TURNBAUGH et
al 2006 VERDAM et al 2013)
48
O aumento da razatildeo FirmicutesBacteroidetes em ratos obesos pode estar
associada com possiacuteveis mediaccedilotildees de respostas adaptativas pelo hospedeiro para
limitar a absorccedilatildeo de armazenamento de energia eou para promover a adiposidade
(LEY et al 2005) Embora os resultados dos estudos demonstrem diferenccedilas na
proporccedilatildeo de grupos bacterianos entre indiviacuteduos eutroacuteficos e obesos ainda natildeo se
sabe se algum grupo de micro-organismos em especial contribui de maneira direta
para o desenvolvimento da obesidade e de alteraccedilotildees metaboacutelicas Associaccedilotildees
entre tipos de bacteacuteria e as variaacuteveis metaboacutelicas tecircm sido observadas seja em
humanos ou em modelo animal indicando que a modulaccedilatildeo de determinados
grupos bacterianos possa exercer efeito no contexto da obesidade Os desafios
enfrentados agora se referem ao entendimento dos mecanismos pelos quais grupos
bacterianos influenciam paracircmetros metaboacutelicos e se intervenccedilotildees dieteacuteticas ou
medicamentosas utilizadas para modular a proporccedilatildeo desses grupos bacterianos
podem melhorar o perfil metaboacutelico ou ao contraacuterio agravaacute-lo (TURNBAUGH et al
2009)
Em relaccedilatildeo agrave composiccedilatildeo da microbiota intestinal seguida agrave perda de peso de
acordo com estudos de coorte a proporccedilatildeo de Bacteroidetes aumentou enquanto o
nuacutemero de Firmicutes diminuiu parecendo restaurar a relaccedilatildeo
FirmicutesBacteroides que estava inicialmente aumentada em indiviacuteduos obesos
Na verdade apoacutes 10 semanas de restriccedilatildeo energeacutetica e de exerciacutecio os
participantes que perderam mais de quatro quilogramas (kg) de peso corporal
mostraram um aumento significativo na populaccedilatildeo de Grupo B fragilis bem como
um aumento na proporccedilatildeo BacteroidesPrevotella positivamente correlacionada com
a perda de peso (HARRIS et al 2012 NADAL et al 2009 SANTACRUZ et al
2009)
No que se diz respeito aos efeitos do exerciacutecio fiacutesico na microbiota intestinal
Evans et al (2014) demonstraram que o exerciacutecio teve efeitos significativos tanto em
camundongos eutroacuteficos quanto em camundongos obesos que ingeriam dieta rica
em gordura sobre o equiliacutebrio relativo dos principais filos bacterianos juntamente
com a prevenccedilatildeo de obesidade e normalizaccedilatildeo da toleracircncia agrave glicose induzida por
dieta De fato a distacircncia percorrida eacute proporcional agrave diminuiccedilatildeo observada para a
razatildeo FirmicutesBacteroides (EVANS et al 2014) Tambeacutem eacute importante ressaltar
que o exerciacutecio aumentou significativamente a proporccedilatildeo relativa de bacteacuterias
49
produtoras de butirato tais como Bacteroidales S24-7 que estatildeo associados com a
sauacutede da ceacutelula epitelial intestinal Aleacutem disso o exerciacutecio fiacutesico aumentou a
diversidade da microbiota intestinal apenas em ratinhos alimentados com uma dieta
rica em gordura No entanto sugere-se que o exerciacutecio pode agir de forma
independente da microbiota intestinal aumentando a utilizaccedilatildeo de energia apesar
de um consumo de uma dieta rica em gordura
227 Mecanismos pelos quais a microbiota intestinal contribui para a obesidade
2271 Extraccedilatildeo de energia adicional da dieta
A noccedilatildeo de que a microbiota intestinal fornece energia para o hospedeiro eacute
suportada por achados em ratos germ-free natildeo naturalmente colonizados com
micro-organismos que apresentaram um menor ganho de peso quando alimentados
com uma dieta rica em gordura do que os ratos germ-free controles (BACKHED et
al 2007 CAESAR et al 2012 DING et al 2010 TREMAROLI BACKHED 2012)
Esses resultados evidenciam que na ausecircncia da microbiota o consumo de uma
dieta obesogecircnica parece natildeo estimular o desenvolvimento da obesidade A
Microbiota intestinal pode afetar ambos os lados da equaccedilatildeo do balanccedilo energeacutetico
natildeo apenas como um fator que influencia a colheita de energia a partir de
componentes da dieta mas tambeacutem como um fator que afeta genes do hospedeiro
que regulam o gasto de energia eou de armazenamento (BACKHED et al 2004
GILL et al 2006 WOLEVER et al 1991)
A fermentaccedilatildeo de polissacariacutedeos pela microbiota pode gerar um aumento no
fluxo de monossacariacutedeos para o fiacutegado e adipoacutecitos favorecendo a lipogecircnese de
novo atraveacutes da ativaccedilatildeo da expressatildeo de dois reguladores nucleares de enzimas
lipogecircnicas- carbohydrate response element-binding protein (ChREBP) e liver sterol
response element binding protein type-1 (SREBP-1) - os quais ativam as enzimas
lipogecircnicas acetil-CoA carboxilase e aacutecido graxo sintase (BACKHED et al 2004
MUSSO et al 2011 TSUKUMO et al 2009) Nesse contexto o menor acuacutemulo de
gordura corporal demonstrado em animais germ-free que consumiram dieta
hiperlipiacutedica e apresentaram absorccedilatildeo semelhante aos animais convencionalizados
indica que a microbiota pode exercer efeito sobre o fluxo de lipiacutedios entre os tecidos
reduzindo o acuacutemulo de gordura (BACKHED et al 2007)
50
A proteiacutena Fasting Induced Adipose Factor (FIAF) eacute suprimida pela presenccedila
de microbiota sendo um inibidor da lipase lipoproteacuteica (LPL) produzido pelo
intestino fiacutegado e tecido adiposo limitando a captaccedilatildeo de aacutecidos graxos e
favorecendo o acuacutemulo de triacilgriceroacuteis nesse tecido Tem sido demonstrado que
animais germ-free apresentaram uma maior expressatildeo de FIAF e fenoacutetipo resistente
agrave obesidade (BACKHED et al 2004 2005 2007) A participaccedilatildeo de FIAF no
metabolismo lipiacutedico foi reforccedilada atraveacutes de estudos com ratos germ-free que
diferiram apenas na expressatildeo dessa proteiacutena (FIAF ++ versus FIAF --) onde
verificou-se que a deficiecircncia dessa proteiacutena induzida geneticamente natildeo eacute um fator
protetor para animais germ-free contra o ganho de peso promovido pela dieta
hiperlipiacutedica (BACKHED et al 2007)
Aleacutem de promover a lipogecircnese (atraveacutes das enzimas lipogecircnicas e inibiccedilatildeo da
FIAF) a microbiota tambeacutem desempenha um papel importante no gasto de energia
obtida a partir da dieta Mais especificamente a microbiota de obesos parece
favorecer uma inibiccedilatildeo de oxidaccedilatildeo de aacutecidos graxos (que por sua vez favorecem a
deposiccedilatildeo e armazenamento de lipiacutedios no tecido adiposo fiacutegado eou tecido
muscular) por mecanismos complementares mas independentes (HARDIE
SAKAMOTO 2006 PUIGSERVER SPIEGELMAN 2003 RABOT et al 2010)
A microbiota tambeacutem pode influenciar a homeostase energeacutetica por meio da
sinalizaccedilatildeo exercida pelos aacutecidos graxos de cadeia curta (AGCC) Os AGCC agem
natildeo apenas como fonte de energia mas tambeacutem como moleacuteculas de sinalizaccedilatildeo
atraveacutes de receptores acoplados agrave proteiacutena G (GPRs) GPRs satildeo um grupo de
receptores transmembracircnicos intestinais que respondem aos aacutecidos graxos Entre
os receptores dessa famiacutelia os receptores Gpr41 e Gpr43 satildeo fundamentais sendo
expressos abundantemente no intestino delgado distal no coacutelon e nos adipoacutecitos
Essa ligaccedilatildeo resulta na ativaccedilatildeo desses receptores induzindo a secreccedilatildeo de
polipeptiacutedeo YY (PYY) e leptina hormocircnios que influenciam nas funccedilotildees intestinais
e na regulaccedilatildeo do apetite (BELLAHCENE et al 2013 BINDELS et al 2013
HARDIE SAKAMOTO 2006 INOUE et al 2014 MUSSO et al 2011 ZAIBI et al
2010)
51
2272 Induccedilatildeo da inflamaccedilatildeo por meio da alteraccedilatildeo da permeabilidade intestinal
As concentraccedilotildees sanguiacuteneas de lipopolissacariacutedeos (LPS) sofrem significativa
influecircncia da microbiota intestinal Principalmente as bacteacuterias Gram-negativas
apresentam em sua superfiacutecie celular os LPS que funcionam como antiacutegenos
estimulando a resposta imune do hospedeiro Assim a microbiota intestinal
representa um grande reservatoacuterio dessa endotoxina especialmente naqueles
indiviacuteduos que habitualmente consomem dieta com alto teor de gorduras
(HOTAMISLIGIL 2010)
A principal via de sinalizaccedilatildeo do LPS envolve o fator nuclear Kappa B (NF-KB)
O LPS pode aumentar os niacuteveis circulantes de resistina espeacutecies reativas de
oxigecircnio (ERO) e proteiacutenas supressoras da sinalizaccedilatildeo de citocinas-1 e 3 (SOCS-1 e
SOCS-3) A elevaccedilatildeo de citocinas proacute-inflamatoacuterias como interferon-gama (IFN-α)
TNF- α interleucina (IL)-6 e IL-1β geralmente observada em pacientes obesos
pode ser originada de macroacutefagos no tecido adiposo ou da interaccedilatildeo do LPS com
seu receptor O aumento dessas citocinas pode contribuir para a translocaccedilatildeo de
LPS favorecendo a ocorrecircncia de endotoxemia metaboacutelica e consequentemente
potencializar a inflamaccedilatildeo subcliacutenica por meio da reduccedilatildeo da expressatildeodistribuiccedilatildeo
de proteiacutenas formadoras de junccedilotildees oclusivas (tight junctions) como zocircnula de
oclusatildeo-1 (ZO-1) e ocludina aumentando a permeabilidade intestinal (CANI et al
2008 LAM et al 2012)
Aleacutem da reduccedilatildeo da expressatildeo das junccedilotildees oclusivas intestinais haacute tambeacutem
uma evidecircncia de que a microbiota intestinal pode regular a permeabilidade
intestinal atraveacutes do sistema endocanabinoacuteide Em um estudo realizado por Muccioli
et al (2010) a modulaccedilatildeo da composiccedilatildeo microbiana do intestino seja por
colonizaccedilatildeo em ratos germ-free ou por tratamento com antibioacuteticos reduziu a
expressatildeo dos receptores canabinoacuteides (Cb-1) tanto do coacutelon quanto do tecido
adiposo enquanto em animais alimentados com uma dieta rica em gordura foi
observado aumento da expressatildeo Cb1 (EVERARD et al 2013 GEURTS et al
2011 MUCCIOLI et al 2010)
52
23 MOLLICUTES
231 Caracteriacutesticas Gerais dos Mollicutes
Os micoplasmas foram primeiramente isolados por Norcard e Roux em 1898
que estudavam a Pleuropneumonia Bovina doenccedila descrita haacute mais de um seacuteculo
na Europa e na Aacutefrica Em seguida micro-organismos semelhantes isolados de
humanos e de animais foram descritos por outros pesquisadores e denominados de
PPLO ndash ldquoPleuropneumonia-Like Organismsrdquo (MOROWITZ 2002 RAZIN JACOBS
1992)
O termo ldquomicoplasmardquo foi usado para denominar os micro-organismos da
Classe Mollicutes (Mollis = mole cuacutetis = pele) mas sugeriu-se o uso do termo
geneacuterico molicutes como nome trivial para designar qualquer microrganismo desta
classe O termo micoplasma aplica-se apenas aos membros do gecircnero Mycoplasma
Recentemente algumas riqueacutetsias e outras bacteacuterias de taxonomia indefinida foram
incluiacutedas aos Mollicutes A classe eacute composta por quatro ordens (Mycoplasmatales
Entomoplasmatales Acholeplasmatales Anaeroplasmatales) sete famiacutelias
(Mycoplasmataceae Incertae sedis (ordem Mycoplasmatales)
Entomoplasmataceae Spiroplasmataceae Acholeplasmataceae Incertae sedis
(ordem Acholeplasmatales) e Anaeroplasmataceae) 11 gecircneros (Mycoplasma
Ureaplasma Eperythozoon Haemobartonella Entomoplasma Mesoplasma
Spiroplasma Acholeplasma Phytoplasma Anaeroplasma Asteroplasma) e mais de
200 espeacutecies A famiacutelia Mycoplasmataceae conteacutem os principais micro-organismos
de interesse meacutedico dentre os quais estatildeo os gecircneros Mycoplasma Os molicutes
compreendem aproximadamente 200 espeacutecies distribuiacutedas ente plantas insetos
animais e humanos (BERGEYrsquos 2010 RAZIN 1992 RAZIN YOGEV NAOT
1998)
Mollicutes eacute a uacutenica classe do filo Tenericutes sendo anteriormente
classificado dentro do filo Firmicutes tendo essa mudanccedila justificada em parte
pela anaacutelise de uma seacuterie de marcadores filogeneacuteticos conservados Esta
classificaccedilatildeo eacute ainda apoiada pela ausecircncia de parede celular caracteriacutestica desses
micro-organismos As sequecircncias do gene 16S rRNA contribuem para sua
classificaccedilatildeo em grupos filogeneacuteticos sendo essa sequecircncia obrigatoacuteria para a
caracterizaccedilatildeo de novas espeacutecies Aleacutem disso a atribuiccedilatildeo de espeacutecie aos grupos eacute
53
feita principalmente por hibridaccedilatildeo DNA-DNA sorologia e semelhanccedila na sequecircncia
do gene 16rRNA Algumas espeacutecies foram atribuiacutedas individualmente a grupos
filogeneacuteticos clusters e subclusters que tambeacutem compartilham outras
caracteriacutesticas (BERGEYrsquos 2009 2010 BROWN WHITCOMB BRADBURY 2007
WEISBURG et al 1989)
A natureza dos molicutes tem representado um desafio na compreensatildeo da
sua biologia classificaccedilatildeo e taxonomia Por muito tempo os micoplasmas foram
considerados viacuterus devido a capacidade de transpor filtros que bloqueavam a
passagem de bacteacuterias (RAZIN 1992) Os membros da classe Mollicutes satildeo
caracterizadas pelo genoma de tamanho reduzido (058 - 22 Mb) ausecircncia de
parede celular (RAZIN 1998) e por apresentarem requerimentos nutricionais
diferenciados quando comparados agrave maioria das bacteacuterias de interesse veterinaacuterio e
humano Aminoaacutecidos nucleotiacutedeos e esteroacuteis exoacutegenos satildeo utilizados para seu
crescimento in vitro O esterol presente no soro ou ceacutelulas do hospedeiro eacute
incorporado pela membrana da maioria das espeacutecies Este composto contribui na
fluidez necessaacuteria agrave membrana e confere resistecircncia parcial agrave lise osmoacutetica
(RUHNKE ROSENDAL 1994)
A membrana dos micoplasmas tem composiccedilatildeo semelhante agraves das eubacteacuterias
e estaacute exposta ao ambiente com exceccedilatildeo de poucas espeacutecies que possuem
glicocaacutelice (WIESLANDER et al 1992) Localizam-se principalmente nas ceacutelulas de
mucosas e com potencial de invasatildeo (VOELKER DYBVIG 1996) As mutaccedilotildees tecircm
sido mencionadas como estrateacutegia de sobrevivecircncia que podem ter ocorrido em
funccedilatildeo da evoluccedilatildeo associada a perdas genocircmicas (DAVID et al 2002)
Natildeo apresentam flagelos entretanto algumas espeacutecies exibem deslizamento
sobre superfiacutecies liacutequidas Alguns micoplasmas possuem um tipo de estrutura ou
prolongamento polar em sua superfiacutecie onde haacute alta concentraccedilatildeo de moleacuteculas de
adesatildeo que permitem a sua aderecircncia agrave ceacutelula hospedeira (RAZIN 1992) Acredita-
se que estas estruturas em algumas espeacutecies como Mycolasma penetrans de
origem humana estejam envolvidas na invasatildeo celular (LO et al 1992)
Os molicutes exibem estrita relaccedilatildeo aos hospedeiros e especificidade a tecidos
e oacutergatildeos que reflete as suas caracteriacutesticas nutricionais e adaptaccedilatildeo parasitaacuteria
Estas bacteacuterias podem ocorrer em hospedeiros e tecidos diferentes de seu ldquohabitatrdquo
normal entretanto como observado por Goulet et al (1995) existem variaccedilotildees e
54
eventualmente eacute possiacutevel isolar espeacutecies de siacutetios e hospedeiros diferentes
daqueles habituais (ERICKSON ROSS BOVE 1988 HORNOK et al 2012 ISO et
al 2013 RAZIN 1992 RAZIN YOGEV NAOT 1998 WAITES et al 1987)
A maioria dos molicutes vivem como comensais e em muitos artroacutepodes
podem mesmo ser considerados simbiontes Infecccedilotildees com micoplasmas
patogecircnicos satildeo raramente agudas e usualmente seguem um curso crocircnico (RAZIN
YOGEV NAOT 1998) Os Mollicutes principalmente as espeacutecies encontradas em
mamiacuteferos apesentam-se como parasitas ideais geralmente vivendo em harmonia
com seu hospedeiro mas por outro lado satildeo tambeacutem considerados como
ldquooportunistas ideaisrdquo Diversas doenccedilas nos seus respectivos hospedeiros satildeo
causadas ou associadas aos Mollicutes (RAZIN YOGEV NAOT 1998) Estas
bacteacuterias parecem preferir estabelecerem-se em nichos com ceacutelulas em constante
renovaccedilatildeo favorecendo a sua adesatildeo (GABRIDGE CHANDLER DANIELS 1985)
Micoplasmas em especial as espeacutecies com os menores genomas tecircm altas
taxas de mutaccedilatildeo o que sugere que eles estatildeo em um estado de evoluccedilatildeo raacutepida
Esses dados foram confirmados por estudos de sequecircncias de genes 5S rRNA que
incluiu uma seacuterie de acholeplasmas anaeroplasmas micoplasmas ureaplasmas e
Clostridium innocuum (BOVEacute 1999 RAZIN 1995 ROGERS et al 1985)
Quanto ao seu metabolismo os Mollicutes podem ser divididos em
fermentadores e natildeo-fermentadores Os fermentadores produzem aacutecidos por meio
da metabolizaccedilatildeo de glicose e de outros carboidratos diminuindo o pH do meio de
cultivo e os natildeo- fermentadores possuem a via da arginina-deidrolase para
obtenccedilatildeo de ATP aumentando o pH (RAZIN 1978 2004) Quando ambas as vias
ocorrem os aacutecidos produzidos da glicoacutelise podem mascarar a alcalinizaccedilatildeo do caldo
causada pela hidroacutelise da arginina (BASEMAN TULLY 1997 OLSON et al 1993
RAZIN 2004)
Um dos maiores empecilhos na pesquisa e no diagnoacutestico laboratorial das
infecccedilotildees causadas por molicutes tem sido a dificuldade em cultivaacute-los in vitro
Apresentam crescimento lento mesmo utilizando-se o meio de cultivo adequado
(RAZIN 1994) A temperatura de aproximadamente 37 ordmC eacute indicativa do ldquohabitatrdquo
natural dos molicutes que corresponde agrave dos mamiacuteferos reacutepteis peixes artroacutepodes
e plantas O crescimento e sobrevivecircncia dos molicutes em meio de cultura satildeo
dependentes do pH Para espeacutecies originaacuterias de plantas e vertebrados o pH oacutetimo
55
eacute de 74 e o crescimento ocorre entre pH 65 a 80 (RAZIN et al 1978) A inibiccedilatildeo
do crescimento pode ocorrer pela excessiva produccedilatildeo de aacutecidos ou aacutelcalis gerados
pelo metabolismo microbiano primaacuterio
Esses micro-organismos apresentam colocircnias de 50 ndash 500 μm de diacircmetro
usualmente em forma de ldquoovo fritordquo quando cultivados em meio soacutelido visualizadas
com o auxiacutelio de microscoacutepio estereoscoacutepio (Figura 4) Em meio liacutequido o
crescimento geralmente natildeo causa turvaccedilatildeo provocando somente alteraccedilatildeo no pH
revelado por um indicador presente no meio de cultura (MILES 1992 RAZIN 1998)
A complexidade dos requerimentos nutricionais a variaccedilatildeo na forma celular e a
fragilidade osmoacutetica fazem com que os Mollicutes estejam sob constantes
investigaccedilotildees quanto a sua fisiologia para relatar seu crescimento e ecologia As
condiccedilotildees sob as quais eles crescem podem influenciar na estrutura e
funcionamento das ceacutelulas hospedeiras sendo importante natildeo somente para os
fisiologistas como tambeacutem para todos micoplasmologistas envolvidos em estudos
quantitativos (BALABANOV et al 2006 MILLES 1992 RAZIN et al 1978
RODWELL 1983 TULLY 1985)
Figura 4 ndash Crescimento de M hominis em meio SP4 com a produccedilatildeo de colocircnia em forma de ldquoovo fritordquo (aumento 40X)
Fonte Arquivo pessoal
56
232 Mollicutes Microbiota Intestinal e Obesidade
A ocorrecircncia e participaccedilatildeo da classe Mollicutes na microbiota intestinal e sua
relaccedilatildeo com a obesidade ainda eacute praticamente desconhecida No entanto
Turnbaugh et al (2008) investigaram a relaccedilatildeo dieta ecologia microbiana intestinal e
o balanccedilo energeacutetico a partir de um modelo murino de obesidade induzido por meio
do consumo de uma dieta ocidental Observou-se que a dieta ocidental estimulou o
crescimento de organismos da classe Mollicutes que posteriormente foram
reduzidos por subsequentes manipulaccedilotildees dieteacuteticas para limitar o ganho de peso
O transplante de microbiota de ratos com obesidade induzida por dieta para
destinataacuterios germ-free promoveu uma maior deposiccedilatildeo de gordura do que em
animais que receberam o transplante a partir de doadores eutroacuteficos Metagenocircmica
e anaacutelises bioquiacutemicas do microbioma intestinal em conjunto com sequenciamento e
reconstruccedilotildees metaboacutelicas associadas ao intestino humano revelaram que a
bacteacuteria Eubacterium dolichum) (um membro da classe Mollicutes) apresenta
caracteriacutesticas que podem fornecer uma vantagem competitiva aos membros desse
ramo em relaccedilatildeo aos nutrientes da dieta ocidental Essas vantagens relacionam-se
com a importaccedilatildeo e transformaccedilatildeo de accediluacutecares simples atraveacutes do Sistema
fosfotransferase (PTS)
Sistemas fosfotransferase (PTS) satildeo uma classe de sistemas de transporte
envolvidas na absorccedilatildeo e na fosforilaccedilatildeo de uma grande variedade de hidratos de
carbono (DEUTSCHER et al 2006) Cada transportador envolve trecircs enzimas de
ligaccedilatildeo que atuam como receptores e doadores de grupos fosforil duas enzimas
citoplasmaacuteticas que atuam em todos os hidratos de carbono PTS importados (HPR e
EI) e o outro eacute um complexo de hidratos de carbono especiacutefico (EII)
compreendendo um ou dois domiacutenios integrais de membrana hidrofoacutebicos (EIIC D)
e dois domiacutenios hidrofiacutelicos (EIIA B) (DEUTSCHER et al 2006) Fosfoenolpiruvato
embora produzidos atraveacutes da glicoacutelise pode ser usado para gerar ATP (atraveacutes da
piruvatoquinase) ou usado para conduzir a importaccedilatildeo de accediluacutecares adicionais
atraveacutes da transferecircncia de um grupo fosfato para EI do PTS
Genes PTS satildeo encontrados em vaacuterias divisotildees de bacteacuterias incluindo
Proteobacterias tais como E coli bem como vaacuterios Firmicutes e Mollicutes
sequenciados (Por exemplo Mycoplasma genitalium M pneumoniae M pulmonis
M penetrans M gallisepticum M mycoides M mobile M hyopneumoniae M
57
synoviae e M capricolum) (KANEHISA et al 2004) O PTS tambeacutem desempenha
um papel na regulaccedilatildeo da expressatildeo do gene microbiano atraveacutes da repressatildeo
cataboacutelica permitindo que a ceacutelula passe a importar preferencialmente accediluacutecares
simples em relaccedilatildeo a outros hidratos de carbono (DEUTSCHER et al 2006)
Muacuteltiplos componentes do PTS estatildeo presentes no microbioma da dieta ocidental (EI
e HPr mais EII) o que poderia permitir a importaccedilatildeo de accediluacutecares simples (por
exemplo glicose e frutose que juntos formam sacarose um componente abundante
da dieta ocidental) bem como accediluacutecares associados com a mucosa do intestino do
hospedeiro (N-acetil-galactosamina) O microbioma da dieta ocidental tambeacutem
conteacutem genes que suportam o metabolismo destes accediluacutecares fosforilados para vaacuterios
produtos finais de fermentaccedilatildeo anaeroacutebia (por exemplo lactato e a cadeia curta de
aacutecidos graxos butirato e acetato (DEUTSCHER et al 2006)
58
3 OBJETIVOS
31 Objetivo geral
Analisar a participaccedilatildeo da Classe Mollicutes e dos Filos Firmicutes e Bacteroidetes
na microbiota intestinal de mulheres obesas e eutroacuteficas
32 Objetivos especiacuteficos
Determinar o estado nutricional das mulheres obesas do grupo caso e
eutroacuteficas do grupo controle
Determinar o consumo alimentar das mulheres obesas do grupo caso e
eutroacuteficas do grupo controle
Desenvolver um ensaio quantitativo por meio de TaqMan PCR para a
detecccedilatildeo de Mollicutes na microbiota intestinal de mulheres obesas e
eutroacuteficas
Quantificar os micro-organismos da Classe Mollicutes e dos Filos Firmicutes e
Bacteroidetes aleacutem de Bacteacuterias Totais por meio da PCR em tempo real em
amostras de fezes de mulheres obesas e eutroacuteficas
Analisar a liberaccedilatildeo de citocinas proacute-inflamatoacuterias IL-1 IL6 IL17-A e TNF-α
em amostras de sangue coletadas de mulheres obesas e eutroacuteficas
59
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
41 Protocolo do estudo
O presente estudo foi desenvolvido no laboratoacuterio de Micoplasmas do
Departamento de Microbiologia do Instituto de Ciecircncias Biomeacutedicas da Universidade
de Satildeo Paulo (ICB IIUSP) com o Ambulatoacuterio de Obesidade e Siacutendrome Metaboacutelica
do Serviccedilo de Endocrinologia do Hospital das Cliacutenicas da Universidade de Satildeo
Paulo (HC-FMUSP) O estudo foi aprovado pela Comissatildeo de Eacutetica em Pesquisa
Envolvendo Seres Humanos (CEPSH) do Instituto de Ciecircncias Biomeacutedicas da
Universidade de Satildeo Paulo (ICBUSP) (protocolo de pesquisa ndeg 110713) e pela
Comissatildeo de Eacutetica da Instituiccedilatildeo HC-FMUSP Todas as mulheres foram recrutadas a
partir da demanda espontacircnea do serviccedilo tendo sido inseridas no protocolo apoacutes
explicaccedilatildeo sucinta e individual do mesmo e assinatura do Termo de Consentimento
Livre e Esclarecido (TCLE) conforme preconiza a resoluccedilatildeo 19606 do Conselho
Nacional de Sauacutede
42 Casuiacutestica
As coletas foram realizadas entre os meses de Outubro de 2013 agrave Dezembro
de 2014 Para obtenccedilatildeo de resultados pela metodologia proposta para este estudo
a casuiacutestica foi de 40 mulheres sendo 20 diagnosticadas com obesidade
apresentando Iacutendice de massa corporal (IMCgt 30 kgm2) e 20 mulheres em eutrofia
(IMC entre 185 e 249 kgm2) As mulheres diagnosticadas com obesidade foram
recrutadas no grupo de Obesidade e Siacutendrome Metaboacutelica do serviccedilo de
Endocrinologia do Hospital das Cliacutenicas da Universidade de Satildeo Paulo (HC-
FMUSP)
Foram utilizados como criteacuterios de exclusatildeo para esse grupo a presenccedila de
quadros infecciosos com sinais cliacutenicos uso de antibioacuteticos (3 meses antes do
estudo) quimioterapia radioterapia gravidez uso de probioacuteticos cirurgias preacutevias
no Trato Gastrointestinal doenccedilas do Trato Gastrointestinal como Doenccedila de Crohn
e Siacutendrome do Coacutelon Irritaacutevel Devido ao fato de haver dificuldade para distinccedilatildeo de
alimentos classificados como prebioacuteticos a ingestatildeo destes natildeo foi incluiacuteda como
criteacuterio de exclusatildeo do estudo O grupo controle foi composto por mulheres adultas
60
eutroacuteficas recrutadas na comunidade sem nenhuma enfermidade aparente tendo
sido fixados os mesmos criteacuterios de exclusatildeo adotados para o grupo controle
43 Delineamento experimental
As mulheres foram submetidas agrave coleta de material fecal e de sangue aleacutem de
questionaacuterio semiestruturado como instrumento de coleta Tal instrumento foi
construiacutedo atraveacutes de consulta em perioacutedicos cientiacuteficos e livros acadecircmicos que
descrevem preditores importantes em relaccedilatildeo a fatores etioloacutegicos predisponentes e
mantedenores da obesidade e possiacutevel associaccedilatildeo com microbiota intestinal e
ambiente Foram consideradas questotildees que avaliavam histoacuteria familiar cliacutenica
obsteacutetrica ginecoloacutegica consumo de aacutelcool e tabaco aleacutem de questotildees que
avaliavam os haacutebitos alimentares como a praacutetica de dietas para emagrecer e
nuacutemero de refeiccedilotildees realizadas Foi utilizado para esse estudo o IPAQ (International
Physical Activity Questionnaire) versatildeo curta originalmente desenvolvido com
finalidade de estimar o niacutevel de praacutetica habitual de atividade fiacutesica de populaccedilotildees de
diferentes paiacuteses (BARROS NAHAS 2000) O questionaacuterio foi elaborado de modo a
facilitar a obtenccedilatildeo de informaccedilotildees durante a consulta com os pacientes e realizadas
por indiviacuteduos previamente instruiacutedos para o desenvolvimento do estudo tendo as
variaacuteveis sido agrupadas em 9 Seccedilotildees que representam a subcategorizaccedilatildeo das
variaacuteveis independentes para determinaccedilatildeo do perfil da populaccedilatildeo estudada (Anexo
B)
44 Determinaccedilatildeo do estado nutricional
441 Avaliaccedilatildeo qualitativa do consumo alimentar
Para investigar possiacuteveis relaccedilotildees entre alimentos e nutrientes da dieta e
microbiota intestinal utilizou-se o questionaacuterio de frequecircncia alimentar semi-quantitativo
(QFA) composto por 62 itens alimentares proposto por Fisberg et al (2008) que
desenvolveram um QFA para utilizaccedilatildeo em estudos epidemioloacutegicos com indiviacuteduos
adultos desenhados para testar hipoacuteteses epidemioloacutegicas e nutricionais em estudos
conduzidos primariamente em Satildeo Paulo para estimar o teor de nutrientes da dieta
61
habitual o que eacute de fundamental importacircncia para estimar a medida de exposiccedilatildeo aos
fatores dieteacuteticos e investigar as possiacuteveis associaccedilotildees com desfechos de interesse
Representou-se a frequecircncia de consumo alimentar em 8 categorias a saber
diaacuterio (mais de trecircs vezes por dia duas a trecircs vezes por dia uma vez por dia) semanal
(cinco a seis vezes por semana duas a quatro vezes por semana uma vez por
semana) mensal (uma a trecircs vezes por mecircs) e nunca ou quase nunca Os dados sobre
o consumo alimentar foram inseridos em planilha eletrocircnica com auxiacutelio do estudo de
Giacomello et al (2008) Inicialmente converteu-se a frequecircncia de consumo de cada
alimento em frequecircncia diaacuteria como proposto por Coelho et al (2011) Para tanto
atribuiu-se ao alimento valor 1 (um) quando consumido 1 vez ao dia Caso o alimento
fosse consumido mais de uma vez ao dia multiplicava-se o valor 1 pelo intervalo da
frequecircncia diaacuteria relatada Para as opccedilotildees que contemplaram intervalos de tempo
semanal e mensal utilizou-se a meacutedia do intervalo das frequecircncias dividido pelo
periacuteodo se semanal (7) e mensal (30) conforme descritos no Quadro 01
Quadro 01ndash Criteacuterios utilizados na estimativa da frequecircncia diaacuteria de consumo dos alimentos incluiacutedos no Questionaacuterio de Frequecircncia Alimentar
Frequecircncia Relatada Frequecircncia diaacuteria
3 ou mais vezesdia 31=3
2 a 3 vezesdia 251= 25
1 vezdia 11= 1
5 a 6 vezessemana 557= 079
2 a 4 vezessemana 37= 043
1vezsemana 17= 014
1 a 3 vezesmecircs 230= 007
1 vezmecircs 130= 003
NuncaQuase nunca 0
COELHO et al 2011
62
Posteriormente foram construiacutedos os grupos dos alimentos segundo o registro do
QFA Adotou-se como criteacuterio para a inclusatildeo do alimento no respectivo grupo o
consumo igual ou maior a 10 e as caracteriacutesticas nutricionais (HAIR et al 2005)
Considerando este criteacuterio foram construiacutedos 16 grupos de alimentos (1) massas (2)
preparaccedilotildees (3) carne vermelha e ovos (4) embutidos (5) carne branca (6) leite e
derivados (7) leguminosas (8) cereais raiacutezes e tubeacuterculos (9) hortaliccedilas (10) frutas
(11) industrializados (12) infusatildeo (13) bebida alcooacutelica (14) oacuteleos e gorduras (15)
lanches (16) accediluacutecares e doces
Os dados referentes ao QFA tambeacutem foram utilizados para calcular o consumo
energeacutetico e de nutrientes Primeiramente estes foram transformados em gramas
utilizando-se uma tabela para avaliaccedilatildeo de consumo alimentar em medidas caseiras
(PINHEIRO et al 2002) e em seguida lanccedilados no Software Excel para digitaccedilatildeo dos
dados do consumo alimentar e para o caacutelculo de consumo de macro e micronutrientes
Para preencher o banco de dados do Software com alimentos e preparaccedilotildees
consumidas pelas participantes foram utilizadas as Tabelas de composiccedilatildeo de
alimentos PHILIPPI (2002) e TACO (2006) com a Tabela de medidas caseiras
(PINHEIRO et al 2005) aleacutem de dados adicionais de Composiccedilatildeo quiacutemica de alimentos
compilados da Tabela de Composiccedilatildeo de Alimentos da Fundaccedilatildeo Instituto brasileiro de
Geografia e Estatiacutestica (IBGE) Os valores obtidos foram comparados com os valores de
recomendaccedilatildeo propostos pelo United States Departament of Agriculture (USDA) em
seus documentos Dietary References Intakes (DRI) referentes aos valores de Estimated
Average Requirements (EAR) e para os nutrientes que ainda natildeo possuem esse valor
definido utilizou-se como paracircmetro valores de Adequate Intake (AI)
442 Avaliaccedilatildeo antropomeacutetrica do estado nutricional
A mensuraccedilatildeo do peso corporal em quilogramas (kg) foi realizada em
duplicata considerando-se o peso meacutedio Para tal foi utilizada uma balanccedila digital
Filizolareg com capacidade maacutexima para 150 kg e precisatildeo de 100 g estando as
participantes da pesquisa descalccedilas e com roupas leves A estatura em centiacutemetros
(cm) foi realizada em duplicata considerando-se a estatura meacutedia As medidas
foram determinadas por meio de um estadiocircmetro graduado em centiacutemetros com
precisatildeo de 10 mm apresentando barra de madeira vertical e fixa com esquadro
moacutevel para posicionamento sobre a cabeccedila do indiviacuteduo quando os mesmos
63
estavam descalccedilos em posiccedilatildeo ereta com os peacutes paralelos calcanhares
panturrilhas gluacuteteos ombros e cabeccedila encostados no estadiocircmetro olhando-se
para frente
O Iacutendice de Massa Corpoacuterea (IMC) foi calculado pelo peso e estatura a partir
das quais foi determinada a relaccedilatildeo entre o peso e altura em metros ao quadrado e
avaliado segundo os pontos de corte preconizados pela OMS assim designados
baixo peso (IMC lt 185 Kgaltura2) eutrofia (IMC= 185 a 249 kgaltura2) sobrepeso
(IMC= 25 a 299 Kgaltura2) e obesidade (IMC gt30 Kg altura2) (WHO 1998)
4421 Anaacutelise da Composiccedilatildeo Corporal pelo Meacutetodo de Bioimpedacircncia
O aparelho de bioimpedacircncia eleacutetrica utilizado para a avaliaccedilatildeo da composiccedilatildeo
corporal foi o InBody 720 (Biospace Coreia) que consiste em bioimpedacircncia
octopolar atraveacutes de oito pontos de contato pelos quais passa a corrente eleacutetrica na
extremidade dos quatro membros determinando a porcentagem de gordura e massa
magra em cada membro assim como no tronco
A avaliaccedilatildeo foi realizada respeitando os procedimentos apresentados no
respectivo manual de uso do aparelho atendendo as seguintes condiccedilotildees de preacute-
teste (1) estar em jejum (2) natildeo consumir aacutelcool 48 horas antes do teste (3) natildeo
realizar exerciacutecio de intensidade moderada a elevada nas 12 horas antes da
avaliaccedilatildeo (4) natildeo efetuar o exame perante em estado febril ou de desidrataccedilatildeo (5)
natildeo utilizar bijuterias metaacutelicas ou implantes dentaacuterios com metal (6) natildeo ingerir cafeacute
e (7) realizar a avaliaccedilatildeo com roupa de banho ou roupas iacutentimas
O relatoacuterio da bioimpedacircncia Octopolar eacute dividido em quatro partes
informativas de dados obtidos
1 Anaacutelise da Composiccedilatildeo Corporal identifica como estaacute distribuiacuteda a aacutegua
corporal total percentual de massa magra e massa de gordura livre
2 Anaacutelise Muacutesculo-gordura mostra em kg o peso a massa de muacutesculo
esqueleacutetico e a massa de gordura
3 Diagnoacutestico da obesidade discrimina o IMC PGC (porcentagem de
gordura corporal) e RCQ (relaccedilatildeo cintura-quadril)
4 Aacuterea de Gordura Visceral informa a aacuterea de gordura visceral em cm2
64
45 Coleta das amostras cliacutenicas
Para a obtenccedilatildeo das amostras de fezes as mulheres foram previamente
instruiacutedas de acordo com o National Committee for Clinical Laboratory Standards
NCCCLS (2007) evacuando diretamente no coletor plaacutestico esteacuteril fornecido
juntamente com luvas espaacutetula coletora e etiqueta de identificaccedilatildeo O material foi
acondicionado em caixa isoteacutermica resfriada com gelo e transportado
imediatamente ao Laboratoacuterio de Micoplasmas ICBUSP As amostras de fezes
foram distribuiacutedas em aliquotas (180-200 ug) em microtubos e acondicionadas -80oC
ateacute a anaacutelise laboratorial
Para a realizaccedilatildeo da coleta do material sanguiacuteneo o operador munido de EPIs
realizou punccedilatildeo venosa perifeacuterica preferencialmente em membro superior natildeo
dominante Foram coletados cerca de 5 mL de sangue por tubopaciente tendo sido
utilizados tubos natildeo-heparinizados que foram conservados de forma similar aos
coletores em caixa isoteacutermica refrigerada O material obtido foi levado ateacute o
Laboratoacuterio de Micoplasmas ICBUSP onde as amostras foram centrifugadas a
3500 rpm para obtenccedilatildeo do soro seguido de sua distribuiccedilatildeo em aliacutequotas de cerca
de 1 mL e estocados a -80 degC ateacute o uso
65
46 Determinaccedilatildeo da microbiota intestinal
461 Padronizaccedilatildeo de reaccedilatildeo de PCR quantitativo (qPCR) por meio de TaqMan para a detecccedilatildeo de Mollicutes
4611 Cepas bacterianas e condiccedilotildees de cultura
Como controle positivo utilizou-se a cepa ATCC 23114 (PG-21) de M hominis
Tambeacutem foram utilizados como controle os seguintes micro-organismos obtidos da
coleccedilatildeo do Laboratoacuterio de Micoplasmas ICBUSP Mycoplasma bovis Donetta M
arginini G230 M dispar M2979 M pneumoniae M pulmonis PG34 M
gallisepticum PG31 M synoviae WUU1853 M penetrans ATCC 55252 (GTU 54)
M fermentans PG18 M pulmonis PG34 M hyorhinis M genitalium ATCC 33530
(G37) M buccale M edwardii PG24 M gateae M faucium M felis CO M bovis
Spiroplasma mirum (SMCA) Acholeplasma laidlawii PG38 Ureaplasma diversum
ATCC 449782 U urealyticum T960 Escherichia coli ATCC 25922 Klebsiella
pneumoniae ATCC 13883 Streptococcus pyogenes ATCC 12345 Salmonella
typhimurium C5 CIP Pseudomonas aeruginosa ATCC 10145 Staphylococcus
aureus ATCC 25293 e Bacillus cereus As cepas referentes aos micro-organismos
Bacteroides fragilis C45A AUS 00306 e Clostridium perfringens foram cedidas pelo
Professor Dr Jorge Luiz Melo Sampaio pesquisador associado do Instituto Fleury
As espeacutecies de Ureaplasmas foram cultivadas em meio UB especiacutefico para
ureaplasma com 5 de CMRL-1066 (com glutamina e sem bicarbonato) enquanto
as espeacutecies de Micoplasmas foram cultivadas em meio de cultura SP4 como
descrito por Tully et al (1995) As bacteacuterias com parede celular incluiacutedas como
controles foram cultivadas em meio de infusatildeo de ceacuterebro-coraccedilatildeo (BHI) Destas
cepas o DNA foi extraiacutedo a partir de culturas em fase logariacutetmica por meio do kit
Pure Linktrade Genomic DNA da Invitrogenreg
4612 Desenvolvimento de primers e sonda para a detecccedilatildeo de Mollicutes pela PCR quantitativa
Os oligonucleotiacutedeos iniciadores e as sondas foram selecionadas com base no
fragmento conservado do gene 16S rRNA especiacutefico para a classe Mollicutes As
sequecircncias do gene 16S rRNA de micoplasmas foram alinhadas utilizando o
algoritmo ClustalW do Software MEGA4 As regiotildees variaacuteveis foram selecionadas
66
manualmente para o sequencionamento dos iniciadores e sondas utilizadas neste
ensaio Propriedades dos oligonucleotiacutedeos foram tambeacutem analisadas pelo Software
Primer Express ver 30 (Applied Biosystems Life Technologies Corporation
Carlsbad CA EUA) A especificidade dos iniciadores e da sonda foi testada ldquoin
silicordquo utilizando algoritmos BLAST
O quadro 02 mostra as sequecircncias forward e reverse selecionadas para
amplificar um fragmento conservado do gene 16S rRNA especiacutefico de Mollicutes A
sonda TaqMan especiacutefica para o fragmento amplificado foi desenvolvida por uma
fonte comercial (Applied Biosystems Life Technologies Corporation)
Quadro 2 - Sequecircncias dos iniciadores utilizados para amplificaccedilatildeo do gene 16S rRNA para Mollicutes
Iniciadores Sequecircncia
Molli1 5 GCA TTA GAT GAT CCG CCT GAG T 3
Molli2 5 GTC CCC GTC AAT TCC TTT AAG TT 3
Sonda 5 GTC CCC GTC AAT TCC TTT AAG TT 3
4613 PCR quantitativa
Ensaios de quantificaccedilatildeo absoluta do DNA alvo foram realizados com sistema
de PCR em tempo real (qPCR) StepOne (Applied Biosystems Life Technologies
Corporation) Diferentes concentraccedilotildees de cada primer iniciador e sonda foram
testados para aprimorar a reaccedilatildeo de qPCR Considerou-se ideal as seguintes
caracteriacutesticas r2 ge 0950 eficiecircncia entre 95 a 105 e slope proacuteximo de -332
A melhor reaccedilatildeo obtida foi a partir de 625 microl de Universal PCR Master Mix
(Applied Biosystems) 1 microM de cada iniciador 05 microM de sonda TaqMan MGB
marcada com corante fluorescente 25 microl de DNA extraiacutedo e aacutegua sem RNase para
o volume final de 125 microl As condiccedilotildees de amplificaccedilatildeo foram 50 degC por 10 min 95
degC por 10 min e 45 ciclos de desnaturaccedilatildeo a 95 degC durante 15 s anelamento a 59
degC durante 1 min Todas as reaccedilotildees foram realizadas em duplicata no aparelho
PCR em tempo real StepOnePlus (Applied Biosystems)
67
Para a construccedilatildeo de padrotildees de DNA para a quantificaccedilatildeo absoluta utilizou-
se como controle positivo a cepa de referecircncia ndash M hominis ATCC 23114 (PG-21)
que foi inicialmente cultivada em 1 ml de caldo SP4 a 37 degC e expandidos ateacute 100
ml Na fase de crescimento logariacutetmico (com base em alteraccedilotildees colorimeacutetricas) a
cultura foi centrifugada a 20600 rpm durante 30 minutos a 25 degC O DNA foi extraiacutedo
usando o kit PureLinktrade Genomic DNA Mini O nuacutemero de coacutepias de DNA genocircmico
foi calculado por espectrofotometria (NanoDrop ND -1000 WITec Ag Littau Suiacuteccedila)
Diluiccedilotildees decimais (107- 1 coacutepiasl) do DNA de M hominis para curva padratildeo foram
preparadas e analisadas
Os dados foram obtidos durante a etapa de anelamento e analisados pelo
Software StepOne 21 (Applied Biosystems Life Technologies Corporation) O limiar
foi ajustado manualmente dentro da curva logariacutetmica acima do niacutevel de detecccedilatildeo
basal e abaixo da fase linear e do platocirc O ciclo limiar (Ct-threshold cycle) das
diluiccedilotildees do genoma foi plotado contra o nuacutemero de log de coacutepias do genoma e
utilizado como entrada para criar a curva padratildeo Anaacutelises de regressatildeo linear foram
aplicadas para calcular os valores de r2 e do slope Assumindo a eficiecircncia de 100
se o molde de DNA eacute duplicado em cada ciclo a eficiecircncia da PCR foi calculada
como E= 10 (-1slope) - 1 onde E eacute a eficiecircncia da PCR
4614 Especificidade da qPCR e repetibilidade intra e inter-ensaios
O DNA dos micro-organismos utilizados como controles foi testado para
verificar a especificidade dos ensaios de qPCR (descrito em cepas bacterianas) A
repetibilidade intra-ensaio foi determinada executando cinco repeticcedilotildees das diluiccedilotildees
do genoma de M hominis (107 a 1 coacutepia do genoma bacterianoreaccedilatildeo) na mesma
reaccedilatildeo A curva padratildeo foi gerada utilizando o software StepOne 21 (Applied
Biosystems Life Technologies Corporation) A repetibilidade inter-ensaio foi obtida
por reaccedilotildees em triplicatas com a mesma diluiccedilatildeo do genoma em trecircs ensaios
diferentes em dias separados e consecutivos Estas repeticcedilotildees foram aplicadas
para determinar a meacutedia o desvio padratildeo e o coeficiente de variaccedilatildeo em valores de
Ct para cada diluiccedilatildeo do genoma
68
462 Reaccedilatildeo em cadeia da polimerase (PCR) convencional
As amostras cliacutenicas tambeacutem foram submetidas a PCR convencional para a
detecccedilatildeo da Classe Mollicutes utilizando-se dos os iniciadores descritos por Van
Kuppeveld et al (1992) Aacutegua livre de nuclease foi utilizada como controle negativo
em ambos os ensaios Os produtos amplificados foram analisados em gel de
agarose a 15 com brometo de etiacutedio 05 mmmL e tampatildeo TAE (Trisacetate 40
mM EDTA 2 mM pH 80) Os produtos foram visualizados e foto documentados sob
luz ultravioleta utilizando um sistema foto documentador (Vilber Lourmat Marne-la-
Vallee Franccedila)
463 Detecccedilatildeo de micro-organismos dos filos Firmicutes e Bacteroidetes e bacteacuterias totais (Eubacterias) por PCR em tempo Real (qPCR)
Para a construccedilatildeo de padrotildees de DNA para a quantificaccedilatildeo absoluta de
Firmicutes e Bacteroidetes utilizou-se como controles positivos as cepas de
referecircncias ndash Clostridium perfringens e Bacteroides fragilis respectivamente Para a
quantificaccedilatildeo de Bacteacuterias Totais (Eubacteacuterias) foi utilizado como controle positivo
Clostridium perfringens Os controles foram submetidos agrave extraccedilatildeo de DNA por meio
do kit QIAamp DNA stool ndash QIAGEN baseado no protocolo de extraccedilatildeo sugerido
pelo fabricante Para os filos Firmicutes Bacteroidetes assim como Bacteacuterias totais
foram utilizadas sequencias de iniciadores descritos por Guo et al (2008)
apresentadas no quadro 3
69
Quadro 3 ndash Sequecircncias dos iniciadores utilizados para amplificaccedilatildeo do gene 16S rRNA para Firmicutes Bacteroidetes e Bacteacuterias Totais (Eubacteacuterias)
Iniciadores Sequecircncia Referecircncia
Firm934F 5 GGA GYA TGT GGT TTA ATT CGA AGC A 3 GUO et al 2008
Firm1060R 5 AGC TGA CGA CAA CCA TGC AC 3
Bact934F 5 GGA RCA TGT GGT TTA ATT CGA TGA T 3 GUO et al 2008
Bact1060R 5 AGC TGA CGA CAA CCA TGC AG 3
Eub338F 5 ACT CCT ACG GGA GGC AGC AG 3 FIERER et al 2005
Eub518R 5 ATT ACC GCG GCT GCT GG 3
Os micro-organismos foram quantificados de modo absoluto baseando-se em
curva padratildeo previamente estabelecida Para cada reaccedilatildeo finalizada uma nova
curva padratildeo foi adicionada e paracircmetros de qualidade foram adotados na anaacutelise
sendo estes r2 ge 0950 eficiecircncia da reaccedilatildeo variando de 95 a 105 e slope
proacuteximo de -332
As reaccedilotildees de qPCR foram realizadas em volume final de 125 μL com 625
μL da mistura universal SYBR Green (Applied Biosystems Satildeo Paulo SP Brasil)
0 25 μM de cada primer especiacutefico 45μL de aacutegua e 125 μl de DNA extraiacutedo com
volume final de 125 μL As quantificaccedilotildees foram realizadas utilizando-se a
plataforma Applied Biosystems (Life Technologies Corporation) com os seguintes
paracircmetros 50 degC por 10 minutos 95 degC por 10 minutos seguidos de 45 ciclos de
95 degC por 15 segundos e 60degC por 1 minuto seguidas da curva de melting (15
segundos a 95 degC 1 minuto a 60 degC 15 segundos a 95 degC e 15 segundos e 60 degC)
47 Dosagem de citocinas do soro sanguiacuteneo
A dosagem das citocinas IL-1β TNF-α IL-10 e IL17-A foram realizadas
utilizando-se kit de ELISA de captura (eBioscience San Diego C A Estados
Unidos) em placas de poliestireno com 96 orifiacutecios e alta absorccedilatildeo de acordo com
protocolo indicado pelo fabricante Apoacutes padronizaccedilatildeo da curva padratildeo a aliacutequota
de 100 microL do sobrenadante das ceacutelulas foi utilizada para dosar as citocinas IL-1β
TNF-α IL-10 e IL17-A A leitura foi realizada com instrumento leitor de ELISA Vivid
70
Vision com comprimento de onda de 450 nm Os dados obtidos em absorbacircncia
foram transformados em picomols por meio de foacutermula matemaacutetica
48 Anaacutelises Estatiacutesticas
As anaacutelises estatiacutesticas da presenccedila dos microrganismos da classe Mollicutes
detectados nas amostras cliacutenicas e dos dados obtidos dos questionaacuterios foram
avaliados por meio do software SPSS 200 (SPSSreg Inc Chicago Estados Unidos)
Para comparar variaacuteveis de consumo alimentar e as variaacuteveis relacionadas ao perfil
da populaccedilatildeo estudada entre os grupos caso e controle foi aplicado Teste de qui-
quadrado de Pearson ou Teste Exato de Fisher tendo sido considerado plt005 e IC
95 O teste t que compara meacutedia entre grupos foi utilizado para verificar a
existecircncia de associaccedilatildeo entre as variaacuteveis desfecho (mulheres obesas x mulheres
eutroacuteficas) e as variaacuteveis Mollicutes (presenccedila x ausecircncia) com o consumo
alimentar dos macronutrientes carboidratos proteiacutenas lipiacutedeos e fibras (p le 005)
Unidos) Aleacutem disso para verificaccedilatildeo de associaccedilatildeo entre as variaacuteveis desfecho e a
presenccedila de Mollicutes foi aplicado Teste de qui-quadrado de Pearson ou Teste
Exato de Fisher tendo sido calculada a razatildeo de chances (odds ratio) (IC 95)
com o objetivo de verificar o poder da associaccedilatildeo entre as variaacuteveis supracitadas
Para verificar as distribuiccedilotildees de cargas dos micro-organismos estudados em
ambos os grupos avaliados inicialmente foi utilizado o teste de normalidade de
Shapiro-Wilk que demonstrou natildeo satisfazer a preacute-suposiccedilatildeo para utilizaccedilatildeo de um
teste parameacutetrico A partir desse resultado foi utilizado o teste natildeo-parameacutetrico de
Mann-Whitney amplamente utilizado para amostras pareadas que natildeo seguem
distribuiccedilatildeo normal As anaacutelises foram realizadas utilizando o programa estatiacutestico
GraphPad Prism versatildeo 500 (GraphPad Software San Diego California USA)
sendo estabelecida a existecircncia de significacircncia estatiacutestica quando o valor de p le
005 em todas as anaacutelises
Para anaacutelise dos dados de quantificaccedilatildeo das citocinas tambeacutem foi utilizado o
programa GraphPad Prism versatildeo 500 (GraphPad Software San Diego California
USA) tendo sido realizado o teste natildeo-parameacutetrico de Mann-Whitney
71
5 RESULTADOS
51 Perfil da populaccedilatildeo estudada
A amostragem do estudo envolveu 40 mulheres sendo 20 classificadas com
obesidade (IMC gt30 Kgm2) e 20 em eutrofia (IMC 185 - 249 Kgm2) com meacutedia de
idade de 38 anos para todas as mulheres 44 anos (DP 93 Amplitude 28-57) para
as mulheres obesas do grupo caso e 33 anos (DP 1204 Amplitude22-66) para as
mulheres eutroacuteficas do grupo controle
No presente estudo as variaacuteveis foram agrupadas em 9 Seccedilotildees com
resultados descritivos representados nas tabelas de 1 a 9 que representam a
subcategorizaccedilatildeo das variaacuteveis independentes para determinaccedilatildeo do perfil da
populaccedilatildeo estudada
O grupo das mulheres obesas foi caracterizado pela maioria de cor preta
parda ou indiacutegena (70) onde as moleacutestias atuais associadas mais frequentes
foram hipertensatildeo (30) dispneia (35) constipaccedilatildeo (35) refluxo (35) e
alteraccedilatildeo menstrual (55) A maioria das mulheres nasceram de parto normal
(75) foram amamentadas (90) jaacute tiveram filhos (70) e foram classificadas
como fisicamente ativas (60) Aleacutem disso 13 (65) das mulheres do grupo caso
referiram fazer trecircs ou mais refeiccedilotildees por dia Em relaccedilatildeo ao grupo das mulheres
eutroacuteficas esse foi caracterizado pela maioria de cor branca ou amarela (55) onde
as moleacutestias atuais associadas mais frequentes foram hipercolesterolemia (5)
dispneia (5) gastrite (15) e constipaccedilatildeo (20) Metade das mulheres nasceram
de parto normal (50) e foram amamentadas (85) enquanto 2 (10) tiveram
filhos e 9 (55) foram classificadas como fisicamente ativas Assim como o grupo
caso 13 (65) das mulheres do grupo controle referiram fracionar sua refeiccedilatildeo em
trecircs ou mais por dia
Aleacutem disso observa-se com base nos resultados estatiacutesticos que houve
variaccedilatildeo significativa na comparaccedilatildeo das variaacuteveis relacionadas ao perfil da
populaccedilatildeo estudada Em relaccedilatildeo agrave Seccedilatildeo 1 Histoacuteria Cliacutenica foram encontradas
variaccedilotildees significativas para as variaacuteveis associadas ao trato gastrintestinal
flatulecircncia (p=0008) refluxo (p=0018) azia (p=0008) e para as variaacuteveis
associadas agrave Moleacutestia atual hipertensatildeo (p=0008) dispneacuteia (p=0008) e alteraccedilatildeo
menstrual (p=0000) Em relaccedilatildeo agrave Seccedilatildeo 4 Histoacuteria Obsteacutetrica foi encontrada
72
variaccedilatildeo significativa para a variaacutevel gestaccedilatildeo (p=0000) Para a Seccedilatildeo 5 Histoacuteria
ginecoloacutegica observou-se variaccedilatildeo estatiacutestica para a variaacutevel menopausa (p=0038)
Tabela 1 ndash Determinaccedilatildeo do perfil da populaccedilatildeo estudada referente agrave Seccedilatildeo 1 Dados socioeconocircmicos Satildeo Paulo SP 2013-2014
Nota n= 20 mulheresa ndash Considerou-se como valor de Salaacuterio Miacutenimo (R$ 67800) ndash Significacircncia estatiacutestica quando p-valor le 005
Tabela 2 ndash Determinaccedilatildeo do perfil da populaccedilatildeo estudada referente agrave Seccedilatildeo 2 Histoacuteria Familiar Satildeo Paulo SP 2013-2014
Nota n= 20 mulheres a ndash Referente agrave parentes de primeiro grau paternos e maternos aleacutem de irmatildeos ndash Significacircncia estatiacutestica quando p-valor le 005
Variaacuteveis
Grupo Caso n ()
Grupo Controle n ()
IC 95 P
Raccedilacor
009-128 0110 PretaPardaIndiacutegena BrancaAmarela
14 (70) 6 (30)
9 (45) 11 (55)
Escolaridade
096-128 0147 lt Ensino Meacutedio ge Ensino Meacutedio
1 (5) 19(95)
0 (0) 20 (100)
Relaccedilatildeo Estaacutevel
023-283 0752 Sim Natildeo
11 (55) 9 (45)
10 (50) 10 (50)
Renda familiar
010-155 0185 lt 2 salaacuterios miacutenimosa ge 2 salaacuterios miacutenimosa
9 (45) 11 (55)
5 (25) 15 (75 )
Variaacuteveis
Grupo Caso n ()
Grupo Controle n ()
IC 95 P
Famiacutelia hipertensatildeo
006-120 0077 Sim Natildeo
17 (85) 3 (15)
12 (60) 8 (40)
Famiacutelia diabetesa
013-157 0206 Sim Natildeo
12 (60) 8 (40)
8 (40) 12 (60)
Famiacutelia obesidadea
007-106 0058 Sim Natildeo
13 (65) 7(35)
7 (35) 13 (65)
Famiacutelia hipercolesterolemiaa
035-430 0749 Sim Natildeo
11 (55) 9 (45)
12 (60) 8 (40)
Famiacutelia Doenccedilas Caacuterdio-vasculares (DCV)a
029-345 1000 Sim Natildeo
10 (50) 10 (50)
10 (50) 10 (50)
73
Tabela 3 ndash Determinaccedilatildeo do perfil da populaccedilatildeo estudada referente agrave Seccedilatildeo 3 Histoacuteria Cliacutenica Satildeo Paulo SP 2013-2014
Nota n=20 mulheres a- Histoacuterico cliacutenico das pacientes em relaccedilatildeo agrave alteraccedilotildees gastrintestinais moleacutestia atual e uso de laxantes- Diferenccedila estatiacutestica natildeo computada pois a variaacutevel eacute uma constante
Variaacuteveis
Grupo Caso n ()
Grupo Controle n ()
IC 95 P
TGI constipaccedilatildeoa
003-115 0058 Sim Natildeo
7 (35) 13 (65)
2 (10) 18 (90)
TGI flatulecircnciaa
107-190 0008 Sim Natildeo
6 (30) 14 (70)
0 (0) 20 (100)
TGI refluxoa
001-089 0018 Sim Natildeo
7 (35) 13 (65)
1 (5) 19 (95)
TGI aziaa
107-190 0008 Sim Natildeo
6 (30) 14 (70)
0 (0) 20 (100)
TGI uacutelceraa
095-116 0311 Sim Natildeo
1 (5) 19 (95)
0 00) 20 (100)
TGI gastritea Sim Natildeo
2 (10)
18 (90)
3 (15)
17 (85) 023-107 0633
TGI naacuteuseasa Sim Natildeo
3 (15)
17(85)
1 (5)
19 (95) 002-314 0292
TGI vocircmitosa Sim Natildeo
1 (5)
19 (95)
0 (0)
20 (100) 095-116 0311
TGI diarreacuteiaa Sim Natildeo
0 (0)
20(100)
0 (0)
20 (100)
Moleacutestia atual hipertensatildeoa Sim Natildeo
6 (30)
14 (70)
0 (0)
20 (100) 107-190 0008
Moleacutestia atual diabetesa Sim Natildeo
0 (0)
20 (100)
0 (0)
20 (100)
Moleacutestia atual hipercolesterolemiaa Sim Natildeo
5 (25)
15 (75)
1 (5)
19 (95) 001-150 0077
Moleacutestia atual DCVa Sim Natildeo
2 (10)
18 (90)
0 (0)
20 (100) 096-128 0147
Moleacutestia atual Dispneacuteiaa Sim Natildeo
7 (35)
13 (65)
1 (5)
19 (95) 001-089 0018
Moleacutestia atual alteraccedilatildeo menstruala Sim Natildeo
11 (55)
9 (45)
0 (0)
20 (100) 136-360 0000
Uso de laxantesa Sim Natildeo
3 (15)
17 (85)
0 (0)
20 (100) 097-141 0072
74
Tabela 4 ndash Determinaccedilatildeo do perfil da populaccedilatildeo estudada referente agrave Seccedilatildeo 4 Histoacuteria Obsteacutetrica Satildeo Paulo SP 2013-2014
Nota n= 20 mulheres andash Foram considerados aspectos relacionados as pacientes em seu nascimento e na maternidade ndash Significacircncia estatiacutestica quando p-valor le 005
Variaacuteveis
Grupo Caso n ()
Grupo controle n ()
IC 95 P
Nascimento por parto cesaacutereaa
078-1144 0102 Sim Natildeo
5 (25) 15(75)
10 (50) 10 (50)
Nascimento por parto normala
008-127 0102 Sim Natildeo
15 (75) 5 (25)
10 (50) 10 (50)
Foi amamentadaa
009-424 0633 Sim Natildeo
18 (90) 2 (30)
17 (85) 3 (15)
Teve alguma gestaccedilatildeoa
0008-0273 0000 Sim Natildeo
14 (70) 6 (30)
2 (10) 18 (90)
Sofreu algum abortoa Sim Natildeo
2 (10)
18 (90)
2 (10)
18 (90) 096-128 0147
75
Tabela 5 ndash Determinaccedilatildeo do perfil da populaccedilatildeo estudada referente agrave Seccedilatildeo 5 Histoacuteria Ginecoloacutegica Satildeo Paulo SP 2013-2014
Nota n= 20 mulheres andash Idade meacutedia em que todas as mulheres estudadas comeccedilaram a ingerir
contraceptivo 22 anos ndash Significacircncia estatiacutestica quando p-valor le 0005
Tabela 6 ndash Determinaccedilatildeo do perfil da populaccedilatildeo estudada referente agrave Seccedilatildeo 6 Consumo atual de tabaco Satildeo Paulo SP 2013-2014
Nota n= 20 mulheres ndash Significacircncia estatiacutestica quando p-valor le 005
Variaacuteveis
Grupo Caso n ()
Grupo Controle n ()
IC 95 P
Menopausa
004-097 0038 Sim Natildeo
9 (45) 11(55)
3 (15) 17 (85)
Usou ou estaacute usando contraceptivo
021-470 1000 Sim Natildeo
16 (80) 4 (20)
16 (80) 14 (20)
Contraceptivo hormonal
041-633 0490 Sim Natildeo
13 (65) 7 (35)
15 (75) 5 (25)
Contraceptivo natildeo hormonal
002-314 0292 Sim Natildeo
3 (15) 17(85)
1 (5) 19 (95)
Idade que comeccedilou a ingerir ge 22 anosa
011-156 0197 Sim Natildeo
10 (50) 10 (50)
6 (30) 14 (70)
Idade que comeccedilou a ingerir lt 22 anosa Sim Natildeo
2 (10)
18 (90)
2 (10)
18 (90) 063-853 0197
Variaacuteveis
Grupo Caso n ()
Grupo Controle n ()
IC 95 P
Consumo atual de tabaco
002-207 0151 Sim Natildeo
4 (20) 16 (80)
1 (5) 19 (95)
Jaacute consumiu tabaco
023-418 1000 Sim Natildeo
5 (25) 15 (75)
5 (25) 15 (75)
76
Tabela 7 ndash Determinaccedilatildeo do perfil da populaccedilatildeo estudada referente agrave Seccedilatildeo 7 Consumo atual de aacutelcool Satildeo Paulo SP 2013-2014
Nota n= 20 mulheres ndash Significacircncia estatiacutestica quando p-valor le 005
Tabela 8 ndash Tabela de determinaccedilatildeo do perfil da populaccedilatildeo estudada referente agrave Seccedilatildeo 8 Atividade Fiacutesica (IPAQ versatildeo curta) Satildeo Paulo SP 2013-2014
Nota n= 20 mulheres andash Para a classificaccedilatildeo foi utilizado o IPAQ (International Physical Activity Questionnaire) versatildeo curta Irregularmente ativa Irregularmente ativa A e B ndash Significacircncia estatiacutestica quando p-valor le 005
Variaacuteveis
Grupo Caso n ()
Grupo Controle n ()
IC 95 P
Consumo atual de aacutelcool
052-643 0342 Sim Natildeo
8 (40) 12 (60)
11 (55) 9 (45)
Variaacuteveis
Grupo Caso n ()
Grupo Controle
IC 95 P
Niacutevel de atividade fiacutesica
015-191 0342 Ativaa Irregularmente ativaa
12 (60) 8 (40)
9 (45) 11 (55)
77
Tabela 9 ndash Tabela de determinaccedilatildeo do perfil da populaccedilatildeo estudada referente agrave Seccedilatildeo 9 Mudanccedilas recentes nos haacutebitos alimentares Satildeo Paulo SP 2013-2014
Nota n= 20 mulheres andash Meacutedia de refeiccedilotildees diaacuterias 3 refeiccedilotildees - Diferenccedila estatiacutestica natildeo
computada pois a variaacutevel eacute uma constante ndash Significacircncia estatiacutestica quando p-valor le 005
Variaacuteveis
Grupo Caso n ()
Grupo Controle
n ()
IC 95 P
Mudou haacutebitos alimentares recentemente
007-151 0144 Sim Natildeo
7 (35) 13 (65)
3 (15) 17 (85)
Mudou haacutebitos alimentares recentemente para perda de peso
007-151 0144 Sim Natildeo
7 (35) 13 (65)
3 (15) 17 (85)
Mudou haacutebitos alimentares recentemente para dieta vegetariana ou restriccedilatildeo de consumo carne
Sim Natildeo
0(0) 20(100)
0(0) 20(100)
Mudou haacutebitos alimentares recentemente restriccedilatildeo de consumo sal
Sim Natildeo
0(0) 20(100)
0(0) 20(100)
Mudou haacutebitos alimentares recentemente para reduccedilatildeo do colesterol
Sim Natildeo
0(0) 20(100)
0(0) 20(100)
ge refeiccedilotildeesdiaa
Sim Natildeo
13(65) 7(35)
14(70) 6(30)
033-473 0736
lt refeiccedilotildeesdiaa
Sim Natildeo
7(35)
13(65) 7(35)
13(65) 027-366 1000
Desjejum diariamente
051-900 0288 Sim Natildeo
13 (35) 7(65)
16 (80) 4 (20)
Costuma beliscar entre as refeiccedilotildees
035-430 0749 Sim Natildeo
11 (55) 9 (45)
12 (60) 8 (40)
Costuma ingerir liacutequidos durante as refeiccedilotildees
009-154 0168 Sim Natildeo
16 (80) 4 (20)
12 (60) 8 (40)
Costuma fazer refeiccedilotildees fora de casa
112-933 0018 Sim Natildeo
12 (60) 8 (40)
19 (95) 1 (5)
78
52 Determinaccedilatildeo do estado nutricional
521 Avaliaccedilatildeo qualitativa do consumo alimentar
Na Tabela 10 (apecircndice) encontra-se a participaccedilatildeo dos alimentos nos grupos
e meacutedias de consumo diaacuterio dos alimentos pela populaccedilatildeo estudada Os alimentos
mais consumidos e que apresentaram frequecircncia diaacuteria de uma vez ao dia ou mais
em relaccedilatildeo ao grupo caso foram feijatildeo arroz alface tomate e oacuteleo azeite ou
vinagre para tempero de salada Em relaccedilatildeo ao grupo controle os que apresentaram
consumo diaacuterio de uma vez ou mais foram arroz e patildeo francecircs patildeo de forma
integral patildeo doce ou torrada
O percentual de consumo dos 16 grupos alimentares identificados derivados
do QFA (Tabela 11) em relaccedilatildeo ao grupo caso que foram consumidos por 80 ou
mais da populaccedilatildeo foram massas carne vermelha e ovos embutidos carne branca
cereais raiacutezes e tubeacuterculos hortaliccedilas e frutas No mesmo grupo populacional os
grupos alimentares de menor consumo foram bebida alcooacutelica leite e derivados e
preparaccedilotildees com percentuais de consumo de 30 493 e 525
respectivamente Os grupos que apresentaram consumo intermediaacuterio foram
Infusatildeo Oacuteleos e gorduras accediluacutecar e doces lanches leguminosas e alimentos
industrializados com percentuais de consumo de 60 616 65 783 783 e
79 respectivamente No grupo controle os grupos alimentares que apresentaram
consumo de 80 ou mais da populaccedilatildeo foram massa carne vermelha e ovos carne
branca cereais raiacutezes e tubeacuterculos hortaliccedilas lanches e accediluacutecar e doces Ainda
nesse grupo populacional os grupos alimentares de menor consumo assim como no
grupo caso foram bebida alcooacutelica preparaccedilotildees e leite e derivados com
percentuais de consumo de 45 45 e 486 respectivamente Os grupos que
apresentaram consumo intermediaacuterio foram oacuteleos e gorduras Infusatildeo alimentos
embutidos leguminosas alimentos industrializados e frutas com percentuais de
consumo de 616 65 65 65 657 731 respectivamente
79
Tabela 11 ndash Definiccedilatildeo dos grupos alimentares derivados do Questionaacuterio de Frequecircncia Alimentar (QFA) e percentual de consumo da populaccedilatildeo estudada Satildeo Paulo SP 2013-2014
Grupo Alimentar
Grupo Consumo Alimentos
Massas
Caso 90 Macarratildeo com molho sem carne macarratildeo com molho com
carne lasanha nhoque pizza e panqueca Controle 916
Preparaccedilatildeo Caso
525 Sopas polenta cozida ou frita
Controle 45
Carne vermelha e ovos
Caso 888 Carne bovina Carne de porco carne de sol bacon e ovo
Controle 813
Embutidos Caso 825 Linguiccedila e embutidos (presunto mortadela salsicha)
Controle 65
Carne branca Caso 975 Frango peixe e frutos do mar
Controle 95
Leite e derivados
Caso 493 Leite integral leite desnatado leite semi-desnatado iogurte
natural iogurte com frutas queijo mussarela queijo prato
parmesatildeo provolone queijo minas e ricota
Controle 486
Leguminosas
Caso 783 Feijatildeo lentilha ervilha seca gratildeo de bico soja feijoada feijatildeo tropeiro
Controle 65
Cereais raiacutezes e tubeacuterculos
Caso
813
Arroz branco integral cozido com oacuteleo e temperos batata frita
mandioca frita batata cozida mandioca cozida inhame purecirc
de batatas ou mandioca farinha de mandioca farofa cuscuz
tapioca aveia patildeo francecircs patildeo de forma torrada biscoito
sem recheio doce e salgado biscoito recheado biscoito
amanteigado waffer bolo simples bolo recheado
Controle
887
Hortaliccedilas
Caso 964 Alface tomate cenoura outros legumes (abobrinha berinjela chuchu pepino) outras verduras cruas (acelga ruacutecula agriatildeo) outras verduras cozidas (acelga espinafre escarola couve) broacutecolis couve-flor e repolho
Controle 926
Frutas Caso 825 Laranja mexerica abacaxi banana maccedila pecircra melatildeo
melancia mamatildeo goiaba abacate suco natural Controle 731
Industrializados
Caso
79
Maionese condimentos molho para salada patecirc chantilly suco industrializado refrigerante comum diet e light hambuacuterguer nuggets almondegas Controle 657
Infusatildeo Caso 60 Chaacute e cafeacute sem accediluacutecar chaacute e cafeacute com accediluacutecar
Controle 65
Bebida alcooacutelica Caso 30 Cerveja
Controle 45
Oacuteleos e gorduras Caso 616 Oacuteleo azeite vinagre manteiga ou margarina comum
manteiga ou margarina light Controle 616
Lanches Caso 783 Salgados fritos salgados assados sanduiacuteche
Controle 833
Aacutecuacutecar e doces Caso 65 Chocolate bombom brigadeiro chocolate em poacute sobremesas doces tortas e pudins accediluacutecar mel geleacuteia Controle 888
80
Todos os indiviacuteduos da pesquisa foram avaliados quanto a ingestatildeo dieteacutetica
Os dados dieteacuteticos obtidos foram traduzidos em energia macro e micronutrientes
(Tabela 12) Observa-se com base nos resultados estatiacutesticos que natildeo houve
variaccedilatildeo significativa no consumo alimentar das mulheres estudadas tendo sido
semelhante entre os grupos caso e controle Aleacutem disso ao realizar-se o teste t
comparando as meacutedias de consumo dos macronutrientes carboidratos proteiacutenas
lipiacutedios e fibras com as variaacuteveis desfecho (mulheres obesas x mulheres eutroacuteficas)
tambeacutem natildeo foram observadas associaccedilotildees estatisticamente significantes
Analisando a razatildeo de ingestatildeo quilocaloriasquilograma de peso corporal
tem-se que o grupo caso teve meacutedia de ingestatildeo energeacutetica de 199 kcalkgdia e o
grupo controle 279 kcalkgdia (Tabela 13) O grupo controle evidenciou consumo
compatiacutevel para a manutenccedilatildeo do seu peso (faixa de recomendaccedilatildeo 25-30
kcalkgdia) enquanto o grupo caso apresentou um niacutevel meacutedio de ingestatildeo abaixo
do valor de manutenccedilatildeo a ingestatildeo energeacutetica foi 204 menor do que a
recomendaccedilatildeo considerando-se o limite inferior de 25 kcalkgdia
Outra razatildeo de ingestatildeo gramas de proteiacutenasquilograma de peso corporal eacute
utilizada para caacutelculo e recomendaccedilatildeo de consumo proteacuteico sem prejuiacutezo da funccedilatildeo
renal (recomendaccedilatildeo de ingestatildeo 06 a 08 g de proteiacutenaskg de pesodia) O grupo
controle apresentou ingestatildeo proteacuteica acima do recomendado 12 g de proteiacutenaskg
de pesodia enquanto o grupo caso apresentou um niacutevel meacutedio de consumo
compatiacutevel com a recomendaccedilatildeo 078 g de proteiacutenaskg de pesodia apresentando-
se no limite maacuteximo preconizado (Tabela 13)
81
Tabela 12 ndash Anaacutelise de consumo de energia e nutrientes da populaccedilatildeo estudada Satildeo Paulo SP 2013-2014
Variaacuteveis Grupo Meacutedia de consumo
Desvio Padratildeo
IC 95 P
Energiadia (kcal)
Caso 18571 93622 (137401 ndash 205869) 093
Controle 1692 98334 (120438 ndash 217822)
Carboidratodia (g)
Caso 24345 16826 (16706 ndash 25787)
090 Controle 20785
10997 (15402 ndash 26294)
Gordura totaldia (g)
Caso
658
276
(5205 ndash 7926) 086
Controle
627
4714 (3998 ndash 8673)
Gordura polinsaturadadia
(g)
Caso 795 416 (617 ndash 937) 048
Controle 85 675 (575 ndash 1237)
Gordura monoinsaturadadia
(g)
Caso 206 925 (1640 ndash 2553)
059 Controle 182 1598
(1077 ndash 2651)
Gordura saturadadia (g)
Caso 2185 1149 (1670 ndash 2808)
075 Controle 204 1698 (1239 ndash 2924)
Proteiacutenadia (g) Caso 7355 3508 (5531 ndash 8905)
091 Controle 7285 4985 (4914 ndash 9849)
Fibra totaldia (g) Caso 168 902 (1247 ndash 1953)
027 Controle 1265 765 (944 ndash1699)
Fibra soluacuteveldia (g) Caso 4 332 (273 ndash 563)
029 Controle 285 23 (215 ndash 437)
Fibra insoluacuteveldia (g)
Caso 56 391 (404 ndash 703) 025
Controle 395 232 (338 ndash 562)
Colesteroldia (g) Caso 23635 13965 (17127 ndash 30877)
077 Controle 26105 26790 (12780 ndash 39313)
Vitamina Adia (UI) Caso 95885 55538 (70451 ndash 124904)
055 Controle 872 47033 (64231 ndash 110801)
Vitamina Cdia (mg) Caso 2105 18857 (11025 ndash 29152)
011 Controle 12035 8752 (7936 ndash 16565)
Vitamina B1dia (mg)
Caso 13 117 (131 ndash 204) 072
Controle 13 166 (104 ndash 260)
Vitamina B2dia (mg)
Caso 08 083 (107 ndash 174) 079
Controle 105 089 (103 ndash 193)
82
Tabela 12 ndash Anaacutelise de consumo de energia e nutrientes da populaccedilatildeo estudada Satildeo Paulo SP 2013-2014
(Continuaccedilatildeo)
Variaacuteveis Grupo Meacutedia
de consumo Desvio Padratildeo
IC 95 P
Vitamina B6dia (ug)
Caso 110 102 (121 ndash 197)
085 Controle 105 088 (110 ndash 197)
Vitamina B12dia (ug)
Caso 38 253 (309 ndash 562) 096
Controle 385 285 (302 ndash 578)
Vitamina Ddia (mg)
Caso 915 1620 (211 ndash 1803) 012
Controle 23 3357 (733 ndash 4061)
Niacinadia (mg)
Caso 19 1005 (1402 ndash 2191)
059 Controle 193
1303 (1339 ndash 2641)
Folatodia (mg)
Caso
24010
11621
(17758 ndash 28351) 054
Controle 20495 12117 (14708 ndash 26684)
Aacutecido pantotecircnicodia
(mg)
Caso 35 216 (292 ndash 443) 074
Controle 29 251 (220 ndash 469)
VitaminaEdia (mg)
Caso 1155 651 (894 ndash 1309) 079
Controle 99 625 (738 ndash 1368)
Iododia (mg) Caso 547 4984 (3206 ndash 8098)
049 Controle 4515 3674 (2814 ndash 6439)
Soacutediodia (mg) Caso 230285 159724 (155816 ndash 246261)
099 Controle 201715 148254 (127647 ndash 274446)
Caacutelciodia (mg) Caso 69045 42353 (47627 ndash 89502)
068 Controle 62645 33992 (46373 ndash 79973)
Magneacutesiodia (mg)
Caso 2325 10339 (17818 ndash 25995) 044
Controle 1947 9452 (14888 ndash 24255)
Zincodia (mg) Caso 85 523 (617 ndash 1115)
086 Controle 78 476 (603 ndash 1068)
Manganecircsdia (mg)
Caso 6 85 (206 ndash 1045) 064
Controle 1095 2019 (148 ndash 1446)
Potaacutessiodia (mg)
Caso 271955 117073 (208408 ndash 3131423) 029
Controle 220685 115874 (164415 ndash 279085)
Foacutesforodia (mg)
Caso 9754 44188 (73698 ndash 1151535) 086
Controle 9085 56939 (63379 ndash 119689)
83
Tabela 12 ndash Anaacutelise de consumo de energia e nutrientes da populaccedilatildeo estudada Satildeo Paulo SP 2013-2014
(Continuaccedilatildeo)
Variaacuteveis Grupo Meacutedia
de consumo Desvio Padratildeo
IC 95 P
Ferrodia (mg) Caso 137 859
(996 ndash 1538)
069
Controle 1145 616 (885 ndash 1492)
Cobredia (mg) Caso 1 0 917 (1 ndash 167)
090 Controle 085 109 (094 ndash 167)
Selecircniodia (ug) Caso 33475 21854 (23251 ndash 44777)
068 Controle 400 5844 (11179 ndash 69057)
Nota significacircncia estatiacutestica quando p-valor le 005
Tabela 13 ndash Comparaccedilatildeo das variaacuteveis dieteacuteticas relacionadas agraves razotildees de ingestatildeo e Valor Energeacutetico Total (VET) da populaccedilatildeo estudada Satildeo Paulo SP 2013-2014
Variaacuteveis Grupo Caso
Grupo controle
Energia (Kcal) 18571
1692
Kcalkgdia 199
279
Carboidrato (g) 24345
20785
Carboidrato (VET) 5241
4913
Proteiacutena (g) 7355
7285
Grama de proteiacutenakgdia
078
12
Proteiacutena (VET) 1584
1722
Lipiacutedeo (g) 658
627
Lipiacutedeo ( VET) 3188
3335
84
A partir de dados de meacutedia de ingestatildeo de macronutrientes comparou-se a
porcentagem que cada um deles carboidratos proteiacutenas e lipiacutedeos (Tabela 13)
representa no Valor Energeacutetico total (VET) ingerido com o intervalo de
balanceamento dieteacutetico proposto pelas Dietary References Intake (DRI) Assim
tem-se que os grupos caso e controle balancearam suas dietas conforme o intervalo
de distribuiccedilatildeo energeacutetica recomendado visualizado na figura 5 Em relaccedilatildeo ao
consumo de fibras foi observado que ambos os grupos apresentaram um consumo
inferior ao Adequate Intake (AI) com consumo de 168 e 1265 para os grupos
caso e controle respectivamente Em relaccedilatildeo ao consumo de lipiacutedios o consumo de
gordura saturada mostrou-se maior que os 7 recomendado pela Sociedade
Brasileira de Cardiologia (2007) em consonacircncia com a National Heart Lung e Blood
Institute dos Estados Unidos tanto no grupo caso quanto no grupo controle de
1058 e 1085 respectivamente
Figura 5 ndash Comparaccedilatildeo entre as meacutedias de consumo de macronutrientes dos Grupos Caso e Controle com a Faixa de Distribuiccedilatildeo Aceitaacutevel de macronutrientes (AMDRDRI) e AI (Adequate Intake) para a faixa etaacuteria de 20 a 70 anos Satildeo Paulo SP 2013-2014
Legenda ndash A recomendaccedilatildeo de consumo de macronutrientes para tal faixa etaacuteria eacute
para Carboidratos 45 a 65 do VET (Valor Energeacutetico Total) Proteiacutenas 10 a 35 do VET Lipiacutedeos 20 a 35 do VET e Fibras 21 a 26 gramasdia
85
A comparaccedilatildeo da meacutedia da ingestatildeo das vitaminas A C E e folato dos
grupos caso e controle com as recomendaccedilotildees de ingestatildeo mostrou que a meacutedia de
consumo dos grupos foi semelhante e de acordo com a recomendaccedilatildeo exceto para
folato e vitamina E em que ambos os grupos mostraram meacutedias de ingestatildeo abaixo
do recomendado (Figura 6)
Figura 6 ndash Comparaccedilatildeo entre as meacutedias de consumo das Vitaminas A C E e folato dos Grupos Caso e Controle com a Faixa de Distribuiccedilatildeo Aceitaacutevel de macronutrientes (AMDRDRI) e AI (Adequate Intake) para a faixa etaacuteria de 20 a 70 anos Satildeo Paulo SP 2013-2014
A comparaccedilatildeo da meacutedia das ingestotildees das Vitaminas B1 B2 B6 B12 D
Niacina e Aacutecido pantotecircnico dos grupos caso e controle com as recomendaccedilotildees de
ingestatildeo demonstrou que a meacutedia de consumo em relaccedilatildeo agraves vitaminas B1 e B12
estavam acima do recomendado nos dois grupos As vitaminas B6 e aacutecido
pantotecircnico apresentaram ingestatildeo inferior ao preconizado nos grupos caso e
controle Ambos os grupos estudados apresentaram consumo em concordacircncia com
as recomendaccedilotildees em relaccedilatildeo agrave niacina No entanto as vitaminas B2 e D
apresentaram consumo pelo grupo caso inferior enquanto o grupo controle
apresentou-se de acordo com a recomendaccedilatildeo (Figura 7)
86
Figura 7 ndash Comparaccedilatildeo entre as meacutedias de consumo das Vitaminas B1 B2 B6 B12 D Niacina e Aacutecido pantotecircnico dos Grupos Caso e Controle com a Faixa de Distribuiccedilatildeo Aceitaacutevel de macronutrientes (AMDRDRI)e AI (Adequate Intake) para a faixa etaacuteria de 20 a 70 anos Satildeo Paulo SP 2013-2014
Para os minerais foacutesforo e selecircnio a ingestatildeo dos grupos Caso e Controle
tambeacutem foi adequada Exceto para iodo caacutelcio e magneacutesio que tiveram a ingestatildeo
menor que a recomendaccedilatildeo e o cobre que apresentou uma ingestatildeo inferior ao
preconizado no grupo controle enquanto o grupo caso demonstrou uma ingestatildeo
adequada dentro dos limites de recomendaccedilatildeo (Figura 8)
87
Figura 8 ndash Comparaccedilatildeo entre as meacutedias de consumo de Sais Minerais dos Grupos Caso e Controle com a Faixa de Distribuiccedilatildeo Aceitaacutevel de macronutrientes (AMDRDRI)e AI (Adequate Intake) para a faixa etaacuteria de 20 a 70 anos Satildeo Paulo SP 2013-2014
Para os minerais e nutrientes soacutedio manganecircs e potaacutessio a ingestatildeo dos
grupos Caso e Controle foi adequada Exceto para ferro que apresentou ingestatildeo
menor que a recomendaccedilatildeo e o zinco que apresentou ingestatildeo um pouco inferior ao
preconizado no grupo controle enquanto o grupo caso demonstrou ingestatildeo
adequada dentro dos limites de recomendaccedilatildeo (Figura 9)
Figura 9 ndash Comparaccedilatildeo entre as meacutedias de consumo de Sais Minerais e outros nutrientes dos Grupos Caso e Controle com a Faixa de Distribuiccedilatildeo Aceitaacutevel de macronutrientes (AMDRDRI)e AI (Adequate Intake) para a faixa etaacuteria de 20 a 70 anos Satildeo Paulo SP 2013-2014
88
522 Avaliaccedilatildeo antropomeacutetrica do estado nutricional
Os resultados da avaliaccedilatildeo antropomeacutetrica estatildeo apresentados na tabela 14
Foi observado que as mulheres estudadas do grupo caso apresentaram meacutedia de
IMC (Iacutendice de massa corporal) de 365 kgm2 (DP 441 Amplitude 306-449) Ao
classificar as pacientes em classes de obesidade de acordo com os criteacuterios
determinados pela OMS (Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede) (1995) verificou-se que
nove (45) das mulheres apresentam obesidade grau I (IMC 30-3499 kgm2) sete
(35) apresentam obesidade grau II (IMC 35-3999 kgm2) e quatro (20) das
mulheres apresentam obesidade grau III (IMC ge 40 kgm2) As mulheres do grupo
controle apresentaram IMC meacutedio de 224 kgm2 (DP 204 Amplitude 188-249)
Em relaccedilatildeo ao percentual de gordura observou-se a meacutedia de 4535 (DP
518 Amplitude 354-534) de gordura corporal no grupo caso e 3004 (DP 671
Amplitude 113-404) no grupo controle indicando um excesso de gordura corporal
em ambos os grupos de acordo com LOHMAN (1992) Em relaccedilatildeo agrave essa
classificaccedilatildeo no grupo caso todas as mulheres apresentam riscos de doenccedilas
associadas agrave obesidade apresentando um percentual de gordura corporal maior que
32 Das mulheres do grupo controle 2 (10) apresentaram-se abaixo da meacutedia 1
(5) na meacutedia 8 (40) acima da meacutedia e 9 (45) apresentaram risco de
desenvolvimento de doenccedilas relacionadas com a obesidade
A avaliaccedilatildeo da Razatildeo cintura-quadril (RCQ) importante indicador de
obesidade central Comparando-se os resultados obtidos com o ponto de corte
recomendado pela OMS (Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede 1995) de 085 para
mulheres observou-se que todas as pacientes avaliadas do grupo caso apresentam-
se acima do recomendado com a meacutedia de RCQ de 099 (DP 0074 Amplitude
087-119) enquanto as mulheres do grupo controle apresentaram uma razatildeo meacutedia
de 083 (DP 0047 Amplitude 077-096) onde sete (35) mulheres apresentaram
a RCQ acima do valor referecircncia preconizado pela OMS No entanto ao avaliar a
Razatildeo cintura quadril de acordo com os pontos de corte propostos por LOHMAN et
al (1988) em relaccedilatildeo ao risco de desenvolvimento de doenccedilas associadas agrave
Siacutendrome Metaboacutelica (Doenccedilas cardiovasculares hipertensatildeo dislipidemia e
alteraccedilatildeo no metabolismo de carboidratos) os resultados demonstraram que em
relaccedilatildeo ao grupo caso 18 (90) das mulheres apresentaram alto risco para o
desenvolvimento dessas doenccedilas enquanto 2 (10) apresentaram risco moderado
89
Em relaccedilatildeo ao grupo controle foi observado que 3 (15) natildeo apresentaram riscos
13 (65) apresentaram baixo risco 1(5) apresentou risco moderado e 3 (15)
apresentaram alto risco para o desenvolvimento dessas doenccedilas
Tabela 14 ndash Comparaccedilatildeo de variaacuteveis antropomeacutetricas da populaccedilatildeo estudada
Variaacuteveis Grupo Meacutedia
Desvio Padratildeo
Miacutenimo Maacuteximo
Peso (kg) Caso 9329 105 7574 1075
Controle 6054 787 4575 7422
Estatura (m2) Caso 160 007 149 172
Controle 164 007 151 18
IMC (Kgm2) Caso 3645 452 306 449
Controle 2241 204 188 249
Razatildeo cintura-quadril (RCQ)
Caso 099 007 088 119
Controle 083 005 077 096
Gordura corporal total
()
Caso
4535
519
354
531
Controle
30035
671
113 404
90
53 Determinaccedilatildeo da microbiota intestinal
531 Padronizaccedilatildeo de reaccedilatildeo de PCR quantitativo (qPCR) por meio de TaqMan para a detecccedilatildeo de Mollicutes
Pela qPCR quantificou-se carga de Mollicutes representadas por unidades
formadoras de colocircnias (UFCmicrol) nas amostras de fezes O ensaio de qPCR
demonstrou eficiecircncia de reaccedilatildeo de E= 1033 (r2= 095) A sensibilidade do teste
foi de detecccedilatildeo de no miacutenimo dez coacutepias de genomareaccedilatildeo quando utilizados os
padrotildees de nuacutemero de coacutepias de DNA genocircmico diluiacutedo (Figura 10)
Figura 10 ndash Curva-padratildeo gerada a partir dos pontos de Ct obtidos com o graacutefico de amplificaccedilatildeo de diluiccedilotildees seriadas do controle positivo Mycoplasma hominis calculado pelo software StepOne 21 (Applied Biosystems Life Technologies Corporation) Satildeo Paulo SP 2013-2014
A repetibilidade testada por meio dos testes intra-ensaio e inter-ensaio da
qPCR estaacute apresentada na tabela 15 O ensaio foi especiacutefico para Mollicutes natildeo
tendo sido visualizada amplificaccedilatildeo dos controles microbianos de outros micro-
organismos utilizados
91
Tabela 15 ndash Repetibilidade intra-ensaio e inter-ensaio da qPCR para Mollicutes Satildeo Paulo SP 2013-2014
Nordm de coacutepias do Genoma
Repetibilidade intra-ensaio Repetibilidade inter-ensaio
Genoma bacteriano diluiacutedo
em 1times TE Genoma bacteriano diluiacutedo
em 1times TE
Ponto meacutedio de corte
(Ct plusmn SD) CV ()
Ponto meacutedio de corte (Ct plusmn SD)
CV ()
10 3537 plusmn 015 045 3494 plusmn 045 129
102 3425 plusmn 017 050 3379plusmn 029 087
103 3099 plusmn 021 070 3074 plusmn 039 128
104 2739 plusmn 023 084 2739 plusmn 038 142
105 2356 plusmn 012 054 2291plusmn 025 110
106 1874 plusmn 066 352 1915 plusmn 077 403
CV coeficiente de variaccedilatildeo
A PCR geneacuterica para Mollicutes foi positiva em 17 (85) das amostras
cliacutenicas do grupo caso e 8 (40) das amostras do grupo controle obtidas No
entanto nem todas as amostras positivas em cPCR para Mollicutes foram positivas
em qPCR 13 (65) das amostras do grupo caso e trecircs (15) do grupo controle
foram positivas em qPCR (Tabela 16)
Tabela 16 ndash Comparaccedilatildeo entre os resultados obtidos no teste de sensibilidade pelas teacutecnicas de PCR convencional e qPCR para detecccedilatildeo de Mollicutes Satildeo Paulo SP 2013-2014
Amostra
Grupo PCR convencional qPCR
n () n ()
Positivaa Caso 17 (85) 13 (65) Negativab 3 (15) 7 (35)
Positivaa
Negativab Controle 8 (40)
12 (60) 3 (15) 17 (85)
Nota n= 20 mulheres aPositiva - Detecccedilatildeo de produto de DNA esperado bNegativa - Ausecircncia de produto de DNA esperado
92
Por meio da PCR em tempo real foi possiacutevel quantificar o DNA e
consequentemente a carga do microrganismo representada por unidades
formadoras de colocircnias - ufcmicrol nas amostras de fezes coletadas Os resultados da
qPCR demonstraram uma carga meacutedia de Mollicutes nas amostras de fezes
analisadas referentes ao grupo caso de 584 x 103 ufcmicrol e de 156 ufcmicrol referentes
ao grupo controle Observa-se na figura 11 graacutefico de dispersatildeo referente agraves
cargas meacutedias das amostras positivas com detecccedilotildees de aproximadamente 101 a
103 UFCml de Mollicutes Contudo as meacutedias das dosagens foram maiores nas
mulheres do grupo caso E apoacutes anaacutelise estatiacutestica por Mann-Whitney foi possiacutevel
observar diferenccedila estatisticamente significante para a espeacutecie Mollicutes (p =
00023) Em seguida foi testada atraveacutes do teste de Odds Ratio a associaccedilatildeo
epidemioloacutegica entre as variaacuteveis desfecho (mulheres obesas x mulheres eutroacuteficas)
e as variaacuteveis Mollicutes (presenccedila x ausecircncia) tendo sido detectada uma
associaccedilatildeo positiva estatisticamente significante entre a presenccedila de Mollicutes e
mulheres obesas (OR= 115 IC= 242-554) Aleacutem disso ao realizar-se o teste t
comparando as meacutedias de consumo dos macronutrientes carboidratos proteiacutenas
lipiacutedios e fibras com as variaacuteveis Mollicutes (presenccedila x ausecircncia) natildeo foram
observadas associaccedilotildees estatisticamente significantes
Figura 11 - Quantificaccedilatildeo por qPCR de Mollicutes (UFCmicrol) a partir das amostras de fezes nos grupos caso e controle Satildeo Paulo SP 2013-2014
Legenda ndash Concentraccedilatildeo meacutedia de Mollicutes entre as mulheres do grupo caso (~584 x 103 UFC
microL) e controle (~156 UFC microL) estudadas e positivas para Mollicutes pelo qPCR (p-valor=00023)
Mediana e desvio padratildeo indicadas por linhas soacutelidas no graacutefico Anaacutelise estatiacutestica realizada por
Mann Whitney assumindo p-valor le 005
93
532 Detecccedilatildeo de micro-organismos dos filos Firmicutes e Bacteroidetes aleacutem de bacteacuterias totais (Eubacterias) por PCR em tempo Real (qPCR)
Todas as amostras 40 (100) foram positivas para Firmicutes e Bacteroidetes
na qPCR tanto para o grupo caso como para o controle Natildeo foram observadas
diferenccedilas estatisticamente significantes para as cargas de Firmicutes Bacteroidetes
e Bacteacuterias totais entre as mulheres do grupo caso e controle No entanto as cargas
meacutedias de Firmicutes e Eubacteacuterias no grupo caso foram maiores que no grupo
controle enquanto Bacteroidetes apresentou uma maior carga no grupo controle A
figura 12 representa os graacuteficos de dispersatildeo referentes agraves cargas meacutedias das
amostras de fezes para esses micro-organismos
Figura 12 - Quantificaccedilatildeo por qPCR de Firmicutes Bacteroidetes e Eubacterias (UFCmicrol) a partir das amostras de fezes nos grupos caso e controle Satildeo Paulo SP 2013-2014
Legenda ndash (a) Concentraccedilatildeo de Firmicutes (UFCmicroL) entre as mulheres do grupo caso (~869 x 1018 UFCmicrol) e controle (~504 x 1014 UFCmicrol) (b) Concentraccedilatildeo de Bacteroidetes (UFCmicroL) entre as mulheres do grupo caso (~879 x 108 UFCmicrol) e controle (~146 x 109 UFCmicrol) (c) Concentraccedilatildeo de Eubacterias (UFCmicroL) entre as mulheres do grupo caso (~731 x 1024 UFCmicrol) e controle (~619 x 1021 UFCmicrol) Mediana e amplitude interquartiacutelica indicadas por linhas soacutelidas no graacutefico Anaacutelise estatiacutestica realizada por Mann Whitney assumindo p-valor le 005
94
Com o intuito de verificar o percentual de micro-organismos da classe
Mollicutes frente agrave carga meacutedia de Firmicutes foi realizada a anaacutelise do percentual
meacutedio dos referidos micro-organismos onde verificou-se que Mollicutes representam
424 do nuacutemero meacutedio de Firmicutes detectados na qPCR especiacutefica para o
mesmo nas amostras analisadas no grupo caso e 25 x 10-4 no grupo controle
(Tabela 17)
Tabela 17 ndash Nuacutemero meacutedio de coacutepias e percentual dos grupos Mollicutes estudados frente ao Filo Firmicutes na populaccedilatildeo estudada Satildeo Paulo SP 2013-2014
Nota Meacutedia de coacutepiasgrama de fezes Percentual de coacutepias de Mollicutes em relaccedilatildeo ao Filo Firmicutes
Os resultados da qPCR demonstraram carga meacutedia de Bacteacuterias totais
(Eubacteacuterias) nas amostras de fezes analisadas do grupo caso (~731 x 1024 UFCmicrol)
e controle (~619 x 1021 UFCmicrol) As anaacutelises de percentual entre a carga meacutedia de
Bacteroidetes Firmicutes e Mollicutes e a carga meacutedia de bacteacuterias totais estatildeo
representadas na Tabela 18
Grupo Firmicutes Mollicutes
Meacutedia coacutepias g de fezes
Meacutedia coacutepias g de fezes
Caso 869x1018
584x103
424
Controle 504x1014
16
25x10-4
95
Tabela 18 ndash Nuacutemero meacutedio de coacutepias e percentual dos grupos de bacterianos estudados frente agraves bacteacuterias totais na populaccedilatildeo estudada Satildeo Paulo SP 2013-2014
Nota Meacutedia de coacutepiasgrama de fezes Percentual de coacutepias de cada bacteacuteria em relaccedilatildeo agraves bacteacuterias totais
Foi calculada a proporccedilatildeo de Firmicutes em relaccedilatildeo aos Bacteroidetes na
microbiota intestinal das mulheres estudadas tendo sido observada maior proporccedilatildeo
na microbiota intestinal das mulheres obesas em relaccedilatildeo agraves eutroacuteficas do grupo
controle (Tabela 19) A relaccedilatildeo entre o percentual de Firmicutes e Bacteroidetes na
microbiota intestinal das mulheres do grupo caso foi cerca de 29 x 107 maior entre
as mulheres obesas do grupo caso em comparaccedilatildeo com o grupo controle
Tabela 19 ndash Proporccedilatildeo de Firmicutes em relaccedilatildeo agrave Bacteroidetes na populaccedilatildeo estudada Satildeo Paulo SP 2013-2014
Nota Meacutedia de coacutepiasgrama de fezes
Grupo Bacteacuterias totais
Firmicutes Bacteroidetes Mollicutes
Meacutedia coacutepias g de fezes
Meacutedia coacutepias g de
fezes
Meacutedia coacutepias g de
fezes
Meacutedia coacutepias g de fezes
Caso 731x 1024
869x1018
442x105
879x108
718x10-2
584x103
28x 10-2
Controle 619x 1021
504x1014
171x105
146x109
624x102 16
22x10-11
Grupo Firmicutes Bacteroidetes Proporccedilatildeo FirmicutesBacteroidetes
Meacutedia coacutepias g de fezes
Meacutedia coacutepias g de fezes
Meacutedia coacutepias g de fezes
Caso 869x1018 879x108
134x1013
Controle 504x1014
146x109
45x 105
96
54 Dosagem de citocinas do soro sanguiacuteneo
Ao serem quantificadas as citocinas IL-1β IL-10 IL17-A e TNF-α pela
teacutecnica de ELISA no plasma sanguiacuteneo das mulheres natildeo foi observada diferenccedila
estatisticamente significante entre os grupos caso e controle para nenhuma das
citocinas avaliadas IL-1β (p= 02249) IL-10 (p=1) IL17-A (p=03169) e TNF-α
(p=02235) (Figura 13)
Figura 13 ndash Quantificaccedilatildeo de IL-1β IL-10 IL17-A e TNF-α (pgmL) no plasma sanguiacuteneo por meio do ELISA nos grupos caso e controle da populaccedilatildeo estudada Satildeo Paulo SP 2013-2014
Legenda- (a) Concentraccedilatildeo de IL-1β (pgml) no plasma sanguiacuteneo das mulheres casos e controles (b) Concentraccedilatildeo de IL-10 (pgml) no plasma sanguiacuteneo das mulheres casos e controles (c) Concentraccedilatildeo de TNF-α (pgml) no plasma sanguiacuteneo das mulheres casos e controles (d) Concentraccedilatildeo de IL17-A (pgml) no plasma sanguiacuteneo das mulheres casos e controles Desvio padratildeo e meacutedia indicados por linhas soacutelidas no graacutefico Anaacutelise estatiacutestica por Mann Whitney p lt 005
97
6 DISCUSSAtildeO
A microbiota intestinal eacute um ecossistema complexo que desempenha um
importante papel na gecircnese da obesidade associada com o desenvolvimento das
respostas imunoloacutegicas aleacutem do estado nutricional do hospedeiro Projetos
mundiais de pesquisa estatildeo em desenvolvimento para compreender esta
complexidade microbiana na sauacutede humana (SHETTY et al 2013) O presente
estudo avaliou a participaccedilatildeo dos micro-organismos da Classe Mollicutes e dos Filos
Firmicutes e Bacteroidetes na microbiota intestinal de mulheres obesas e eutroacuteficas
Na diversidade das populaccedilotildees humanas e a ocorrecircncia da obesidade eacute
importante estudar a distribuiccedilatildeo da microbiota intestinal fazendo-se necessaacuterio e
imprescindiacutevel a caracterizaccedilatildeo da populaccedilatildeo estudada em relaccedilatildeo agrave preditores
importantes associados com a obesidade microbiota intestinal e ambiente
(KALLIOMAKI et al 2008 PENDERS et al 2006) No presente estudo observou-
se variaccedilatildeo estatiacutestica em relaccedilatildeo agrave variaacutevel gestaccedilatildeo onde 14 (70) das mulheres
do grupo caso e 2 (10) do controle relataram jaacute terem tido filhos Aagaard et al
(2012) verificaram que o microbioma era semelhante em mulheres gravidas ou natildeo
No entanto as mulheres graacutevidas apresentaram microbioma menos diversificado
Sugeriu-se que entre as mulheres em idade reprodutiva o microbioma permanece
como uma comunidade dinacircmica na vida reprodutiva do adulto e que a estrutura da
comunidade natildeo-graacutevida pode retornar em alguma medida nas uacuteltimas semanas de
gestaccedilatildeo Aleacutem disso alguns autores tecircm sugerido que o acuacutemulo de gordura
corporal na obesidade pode acarretar vaacuterias consequecircncias agrave sauacutede como diabetes
mellitus tipo 2 hipertensatildeo arterial dispneacuteia cacircncer dislipidemia doenccedilas
cardiacuteacas doenccedilas hepatobiliares osteoartrite alteraccedilotildees gastrintestinais e
distuacuterbios psicossociais o que corrobora com os achados em relaccedilatildeo agrave histoacuteria
cliacutenica das mulheres estudadas (FRANCISCHI et al 2000 PEREIRA et al 2003
SILVA 2005)
Para as mulheres em especial a menopausa tem sido associada como
colaboradora para o desenvolvimento de obesidade e acuacutemulo de gordura corporal
(SOWERS et al 2007) No presente estudo encontraram-se diferenccedilas estatiacutesticas
em relaccedilatildeo agrave variaacutevel menopausa onde 9 (45) das mulheres obesas do grupo
caso e 3 (15) das mulheres do grupo controle relataram ter entrado na
98
menopausa Entretanto Sternfeld et al (2004) em estudo de coorte feminina entre
42-52 anos de idade nos EUA natildeo encontraram associaccedilatildeo entre a menopausa e o
aumento de circunferecircncia da cintura bem como aumento do peso dessa forma
sugerindo que somente um fator pode natildeo ser o responsaacutevel pelo desenvolvimento
de obesidade No presente trabalho observou-se que 75 das mulheres do grupo
caso e 50 do grupo controle nasceram de parto normal Tem sido evidenciado na
literatura que o tipo de parto pode interferir na composiccedilatildeo da microbiota pela forma
de colonizaccedilatildeo do receacutem-nascido O parto via cesariana aumentaria o risco de
obesidade em relaccedilatildeo ao parto normal (HUH et al 2012 PEI et al 2014) Nesse
sentido Ajslev et al (2011) em estudo longitudinal prospectivo na infacircncia com
acompanhamento ateacute os sete anos observaram que uma combinaccedilatildeo de
exposiccedilotildees precoces que inclui o tipo de parto o IMC maternal preacute-gestacional e
uso de antibioacuteticos na primeira infacircncia (lt6 meses) influenciaram o risco de excesso
de peso
Existem diversos estudos em relaccedilatildeo aos fatores dieteacuteticos e a gecircnese da
obesidade (DAILEY 2014 ISOMAA et al 2001 MORENO-INDIAS et al 2014
PEREIRA et al 2002 ROMERO ZANESCO 2006 SANTOS et al 2006) No
entanto no presente estudo o valor energeacutetico encontrado em relaccedilatildeo ao grupo
caso ao analisar-se a razatildeo quilocaloriasquilograma de peso corporal foi inferior agrave
recomendaccedilatildeo caracterizando alimentaccedilatildeo insuficiente em energia (WHO 2003)
Da mesma maneira que no presente estudo Pereira et al (2012) natildeo encontraram
diferenccedilas significativas entre o consumo energeacutetico entre indiviacuteduos eutroacuteficos e
obesos Souza et al (2010) estudaram a ingestatildeo alimentar e balanccedilo energeacutetico da
populaccedilatildeo adulta de Niteroacutei- RJ e encontraram que a ingestatildeo energeacutetica mostrou-
se decrescente com o aumento do IMC para as mulheres A ingestatildeo energeacutetica em
menor quantidade parece indicar que embora o corpo esteja obeso os tecidos vitais
satildeo inadequadamente nutridos pois a alimentaccedilatildeo insuficiente fornece poucos
nutrientes (HUTSON et al 1965) Sawaya et al (2003) em estudo com mulheres
realizado em Maceioacute tambeacutem observaram que a ingestatildeo energeacutetica entre os
grupos eutroacutefico e obesos natildeo apresentou diferenccedila significativa Em outro estudo
com mulheres no Rio Grande do Sul tambeacutem foi verificado que o consumo alimentar
energeacutetico natildeo apresentou diferenccedila significativa (p=0157) entre os grupos (baixo
peso eutroacutefico e excesso de pesoobesidade) (FRANKE et al 2007) Com isto
99
provavelmente a ingestatildeo energeacutetica natildeo seja a causa da obesidade nas mulheres
estudadas sendo que a baixa ingestatildeo aliada a algumas deficiecircncias nutricionais e
predisposiccedilatildeo geneacutetica possa criar mecanismos de adaptaccedilatildeo levando a um ciclo
metaboacutelico cujo o desfecho seja o armazenamento de gordura na regiatildeo abdominal
(BALAMURUGAN et al 2010 CANI DELZENNE 2009 DAVID et al 2014
HANSON et al 2009 JIMENEZ MARTIN-MORENO 1995) Nesse contexto
devem ser considerados outros fatores de economia energeacutetica tais como o
desequiliacutebrio na microbiota intestinal aleacutem da adaptaccedilatildeo dos mecanismos de
consumo energeacutetico acarretando maior rendimento das calorias absorvidas
BALAMURUGAN et al 2010 CANI DELZENNE 2009 DAVID et al 2014
DEWULF et al 2013 DIBAISE FRANK MATHUR 2012 FRANKE 2007 GRAF et
al 2015 KOENIGA et al 2011 LE CHATELIER et al 2013 LEY et al 2006
PATIL et al 2012 RAOULT 2008 SAWAYA et al 2003 WICHMANN et al
2013)
Analisando a contribuiccedilatildeo do consumo dos macronutrientes e das fibras os
resultados do presente estudo demonstraram que este consumo estaacute dentro dos
criteacuterios exceto para o consumo de fibras que foi abaixo da recomendaccedilatildeo em
ambos os grupos Aleacutem disso comparando-se as meacutedias de consumo dos
macronutrientes e das fibras com as variaacuteveis desfecho (obesas x eutroacuteficas)
tambeacutem natildeo houve associaccedilotildees estatisticamente significantes Em Satildeo Paulo
observou-se que 295 dos indiviacuteduos entrevistados relataram ingestatildeo inferior agraves
necessidades fisioloacutegicas dos quais 58 eram indiviacuteduos obesos (SALVO
GIMENO 2002) Em outro estudo realizado com trabalhadores adultos de ambos os
sexos tambeacutem no Estado de Satildeo Paulo para avaliaccedilatildeo da ingestatildeo alimentar e
consumo de fibras dieteacuteticas foi encontrado que o consumo individual de fibras
dieteacuteticas diaacuteria variou 587 g a 2957 g sendo o consumo meacutedio da populaccedilatildeo
1461 g (PASSOS SHEID 2008) Fisberg et al (2009) em estudo realizado sobre
iacutendice de qualidade da dieta observaram padratildeo dieteacutetico com alto conteuacutedo de
gorduras totais colesterol e accediluacutecar refinado e com baixo teor de fibra alimentar
Estes resultados diferem em parte do padratildeo alimentar da populaccedilatildeo estudada no
entanto demonstra a necessidade de estiacutemulo ao maior consumo de alimentos ricos
em fibra
100
A partir dos resultados do estudo evidencia-se a adequaccedilatildeo comprometida
na alimentaccedilatildeo devido agrave elevada ingestatildeo de lipiacutedios (gordura saturada) e ingestatildeo
reduzida de fibras em ambos os grupos estudados contribuindo tanto para a
obesidade quanto em relaccedilatildeo ao acuacutemulo de tecido adiposo nas mulheres obesas e
eutroacuteficas Esses dados estatildeo em conformidade com o presente estudo em relaccedilatildeo
agraves variaacuteveis antropomeacutetricas analisadas Percentual de gordura corporal e Razatildeo
cintura-quadril onde ambos os grupos se apresentaram acima da meacutedia referecircncia
indicando excesso de gordura corporal Assim como no presente estudo outros
trabalhos tecircm demonstrado limitaccedilotildees e evidenciado que natildeo existe correlaccedilatildeo
precisa entre o IMC e o porcentual de gordura corpoacuterea Isso explica o fato de
indiviacuteduos que apresentam IMC dentro do padratildeo de normalidade mas possuem
uma quantidade de gordura corporal acima do ideal confirmando relatos de que o
IMC natildeo eacute um bom indicador quantitativo de adiposidade corporal e que pode
subestimar o percentual de gordura e classificando de forma errocircnea indiviacuteduos com
excesso de adiposidade (COSTA et al 2007 GLANER 2005) Dessa forma o
aumento de gordura corporal principalmente na regiatildeo abdominal pode tornar a
utilizaccedilatildeo do IMC cada vez mais limitada na avaliaccedilatildeo do estado nutricional jaacute que
indiviacuteduos com sobrepeso ou ateacute mesmo eutroacuteficos podem apresentar risco de
alteraccedilotildees metaboacutelicas devido a valores elevados de circunferecircncia da cintura
(REZENDE 2010) Aleacutem disso nossos resultados evidenciaram valores elevados
para RCQ o que pode explicar a porcentagem de algumas moleacutestias atuais
associadas agrave obesidade encontradas em ambos os grupos no presente trabalho
(OMS 2002 DAcircMASO BERNARDES 2003 OCHS-BALCOM et al 2006)
Diversos estudos tambeacutem contribuiacuteram na melhor compreensatildeo entre as
influecircncias da nutriccedilatildeo e da composiccedilatildeo corporal na composiccedilatildeo da microbiota
intestinal (BALAMURUGAN et al 2010 DAVID et al 2014 DEWULF et al 2013
GRAF et al 2015 WICHMANN et al 2013) No entanto pouco se conhece sobre a
participaccedilatildeo dos micro-organismos da classe Mollicutes na microbiota
principalmente quando associadas com fatores dieteacuteticos e antropomeacutetricos
Constatou-se no presente estudo diferenccedila estatisticamente significante para micro-
organismos da classe dos Mollicutes (p = 00023) Foi detectada associaccedilatildeo
estatisticamente significante entre a presenccedila de Mollicutes e mulheres obesas
(OR= 115 IC= 242-554) Nesse contexto Turnbaugh et al (2008) avaliaram a
101
microbiota de modelos experimentais de ratos geneticamente idecircnticos de
obesidade induzida pelo consumo de dieta ocidentalizada caracterizada por alto teor
de gordura e accediluacutecar Todos os animais herdaram uma microbiota semelhante e no
estado de obesidade observou-se maior crescimento da bacteacuteria Eubacterium
dolichum (membro da classe Mollicutes) que foram posteriormente reduzidos por
subsequentes manipulaccedilotildees dieteacuteticas para limitar o ganho de peso Ainda neste
estudo observou-se que a abundacircncia da classe dos Mollicutes foi acompanhada
pela supressatildeo de toda a divisatildeo de Bacteroidetes indicando que a classe
Mollicutes teve aptidatildeo aumentada em relaccedilatildeo a Firmicutes e todos os outros
Bacteroidetes identificados na populaccedilatildeo estudada Os autores observaram que os
molicutes evoluiacuteram a capacidade para importar o tipo de hidratos de carbono
encontradas na dieta ocidental administrada nos modelos experimentais estando
essas vantagens principalmente relacionadas com o Sistema fosfotransferase (PTS)
De acordo com Deutscher et al (2006) o PTS desempenha um papel na regulaccedilatildeo
da expressatildeo do gene microbiano atraveacutes da repressatildeo cataboacutelica permitindo que a
ceacutelula passe a utilizar preferencialmente accediluacutecares simples em relaccedilatildeo a outros
hidratos de carbono Anaacutelises de fragmentos do gene 16S rRNA dos dados de
metagenocircmica confirmaram a presenccedila dos molicutes no microbioma cecal quando
associados agrave uma dieta ocidental Em contrapartida Hildebrandt et al (2009) por
meio de metagenocircmica de fezes de camundongos magros inicialmente submetidos
a dieta de raccedilatildeo padratildeo com posterior mudanccedila para dieta rica em gordura natildeo
relataram encontrar molicutes em dieta de alto teor de gordura
No presente estudo ao se comparar as meacutedias de consumo dos
macronutrientes carboidratos proteiacutenas lipiacutedios e fibras com as variaacuteveis Mollicutes
(presenccedila x ausecircncia) natildeo foram observadas associaccedilotildees estatisticamente
significantes No entanto foi observado alto consumo de gorduras saturadas nas
mulheres estudadas com diferenccedila estatisticamente significante entre a quantidade
de molicutes na microbiota intestinal Esses resultados associados com as
evidecircncias encontradas na literatura acerca da participaccedilatildeo desses micro-
organismos na microbiota de pessoas obesas fornecem importantes evidecircncias de
que natildeo apenas o consumo alimentar e o percentual de gordura ingerida possam
influenciar o aumento de molicutes na microbiota intestinal Mas que esse aumento
tambeacutem pode estar associado ao possiacutevel enriquecimento de rotas metaboacutelicas
102
envolvidas na utilizaccedilatildeo de accediluacutecares simples relacionadas ao sistema PTS Aleacutem
disso tem sido evidenciado na literatura que em experimentos com animais germ-
free o consumo de uma dieta obesogecircnica parece natildeo estimular o desenvolvimento
da obesidade e que sucessivas manipulaccedilotildees dieteacuteticas para limitar o ganho de
peso possivelmente promovam subsequentes variaccedilotildees em relaccedilatildeo agrave populaccedilatildeo
microbiana na microbiota intestinal (GOODMAN et al 2011 TURNBAUGH et al
2009 WALKER et al 2011 YI LI 2012) Este achado foi sustentado por um estudo
recente em camundongos que mostrou que a composiccedilatildeo microbiana do intestino
natildeo eacute determinada apenas pela dieta atual mas tambeacutem em parte pela histoacuteria
dieteacutetica Aleacutem disso um estudo em seres humanos concluiu que a mudanccedila no
padratildeo de consumo de fibras pode produzir fortes mudanccedilas na microbiota
intestinal mas que estas dependem da composiccedilatildeo inicial da microbiota intestinal do
indiviacuteduo (AAFKE et al 2015 CARMODY et al 2015)
Estudos recentes tecircm demonstrado que a microbiota intestinal humana pode
estar alterada em indiviacuteduos obesos Nesse contexto tem sido amplamente
discutida a participaccedilatildeo dos filos Firmicutes e Bacteroidetes na microbiota desses
indiviacuteduos Aleacutem disso tem sido evidenciado que o filo Firmicutes representam mais
de 90 das categorias filogeneacuteticas conhecidas dominando a microbiota distal
Nesse sentido a obesidade estaacute associada com as diferenccedilas da microbiota
intestinal em niacutevel filo com menor diversidade geral e maior proporccedilatildeo relativa de
Firmicutes em relaccedilatildeo agrave Bacteroidetes em indiviacuteduos obesos em comparaccedilatildeo com
indiviacuteduos eutroacuteficos (ECKBURG et al 2005 LEY et al 2006 MORAN
SHANAHAN 2014 TURNBAUGH et al 2009) Nesse contexto os resultados do
presente estudo demonstraram que a relaccedilatildeo entre o percentual de Firmicutes e
Bacteroidetes na microbiota intestinal das mulheres do grupo caso foi cerca de 29x
107 maior entre as mulheres obesas em comparaccedilatildeo com o grupo controle
Estudos demonstraram que a relaccedilatildeo entre percentual de Firmicutes e Bacteroidetes
na microbiota intestinal eacute de cerca de 7020 para os natildeo obesos e ateacute 855 para os
obesos O que significa cerca de cinco vezes maior em obesos em comparaccedilatildeo com
natildeo obesos (BALAMURUGAN et al 2010 ECKBURG et al 2005 KOENIGA et al
2011 LE CHATELIER et al 2013 PATIL et al 2012) Os nossos achados estatildeo
em conformidade com alguns resultados da literatura Em estudo realizado por
Ridaura et al (2013) transplantaram-se micro-organismos intestinais de humanos
103
obesos e eutroacuteficos em intestinos de ratos com peso meacutedio Aqueles que receberam
a microbiota de humanos obesos tornaram-se ratos obesos e aqueles que
receberam microbiota de humanos magros permaneceram magros Outro estudo
realizado por Remely et al (2015) que tambeacutem investigaram atraveacutes de qPCR a
microbiota de humanos obesos durante a intervenccedilatildeo dieteacutetica para perda de peso
induzida observaram diminuiccedilatildeo na proporccedilatildeo de FirmicutesBacteroidetes nos
obesos apoacutes a intervenccedilatildeo dieteacutetica
A proporccedilatildeo FirmicutesBacteroidetes tem sido associada como um marcador
de sauacutede para um indiviacuteduo e um desequiliacutebrio nesta proporccedilatildeo estaacute associada com
diferentes doenccedilas (MARIAT et al 2009) A mudanccedila na abundacircncia relativa destes
filos resulta no aumento da capacidade de captaccedilatildeo de energia a partir dos
alimentos aleacutem de induzir a inflamaccedilatildeo de baixo grau A reduccedilatildeo de Bacteroidetes
tem sido relacionada com dieta rica em gordura que pode resultar em aumento dos
niacuteveis plasmaacuteticos de LPS (CANI et al 2007 EVERARD CANI 2013) enquanto o
aumento Firmicutes tem sido associado com o consumo de carnes (EVERARD
CANI 2013) Aleacutem disso vaacuterios estudos tecircm mostrado mudanccedila da relaccedilatildeo de
FirmicutesBacteroidetes em pessoas obesas durante intervenccedilotildees dieteacuteticas para
perda de peso corporal sugerindo que as mudanccedilas na concentraccedilatildeo de bacteacuterias
nos indiviacuteduos obesos podem ser revertidas depois da perda de peso induzida por
dieta fazendo com que a microbiota do indiviacuteduo obeso se assemelhe ao indiviacuteduo
eutroacutefico (CLEMENTE et al 2012 DEWULF et al 2013 DIBAISE et al 2012
REMELY et al 2013 2015) Em contrapartida estes resultados natildeo satildeo universais
outros estudos demonstraram padrotildees variaacuteveis em mudanccedilas de niacutevel de filo
medidos na composiccedilatildeo da microbiota de indiviacuteduos obesos (MORAN SHANAHAN
2014 SCHWIERTZ et al 2010 ZHANG et al 2009) Duncan et al (2008) avaliaram
a relaccedilatildeo entre IMC perda de peso e a predominacircncia de grupos de bacteacuterias em
amostras fecais de pessoas obesas e natildeo obesas Estes indiviacuteduos foram
submetidos a duas dietas para perda de peso por quatro semanas Natildeo foi
encontrada diferenccedila entre Bacteroidetes nas amostras entre indiviacuteduos obesos e
natildeo obesos No entanto houve reduccedilotildees no grupo de Firmicutes em obesos
submetidos a dietas hipocaloacutericas Em outro estudo realizado por Schwiertz et al
(2010) tambeacutem natildeo foram observadas diferenccedilas nas contagens de Bacteroidetes e
Firmicutes entre os grupos de estudo Xiao et al (2014) em estudo com intervenccedilatildeo
104
dieteacutetica baseada em gratildeos integrais onde analisaram a microbiota intestinal de 123
voluntaacuterios obesos antes e depois da intervenccedilatildeo de 9 semanas seguida por um
periacuteodo de manutenccedilatildeo de 14 semanas tambeacutem natildeo observaram alteraccedilotildees
significativas na abundacircncia de Bacteroidetes e Firmicutes ou na proporccedilatildeo destes
dois filos durante a intervenccedilatildeo dieteacutetica mesmo quando os voluntaacuterios perderam
uma quantidade significativa de peso Estudos recentes do Projeto Microbioma
Humano natildeo encontraram associaccedilatildeo entre a proporccedilatildeo FirmicutesBacteroidetes e
obesidade ou Iacutendice de Massa Corporal (IMC) Nesse sentido tem sido sugerido por
alguns autores que a utilizaccedilatildeo dessa relaccedilatildeo como um biomarcador para a
obesidade permanece incerto devido a variabilidade dos dados na literatura
(FINUCANE et al 2014 MURPHY et al 2010)
Recentemente tem sido proposta uma nova hipoacutetese que associa a
microbiota intestinal com a homeostase metaboacutelica demonstrando-a como uma das
fontes potenciais de inflamaccedilatildeo de baixo grau (ARAKI et al 2005 OKAYASU et al
1990 RAKOFF-NAHOUM 2004 XIAO et al 2014 ZHAO 2013) Nesse contexto
tem sido demonstrado que dietas com alto teor de gordura tambeacutem podem aumentar
as concentraccedilotildees de LPS no plasma de humanos Estudo realizado por Cani et al
(2007) mostrou em camundongos que o maior consumo de gordura levou ao maior
aumento nas concentraccedilotildees de LPS no plasma A absorccedilatildeo de LPS reforccedilada pela
alta ingestatildeo de gordura pode estimular a secreccedilatildeo das citocinas TNF-α e IL-6
resultando em inflamaccedilatildeo sistecircmica de baixo grau dessa forma a microbiota
intestinal pode ter papel ativo na promoccedilatildeo eou inibiccedilatildeo da inflamaccedilatildeo e portanto
um efeito no metabolismo lipiacutedico (FLOCK GREEN KRIS-ETHERTON 2011) Os
resultados do presente estudo natildeo demonstraram diferenccedilas estatisticamente
significantes entre os grupos caso e controle para nenhuma das citocinas avaliadas
No entanto estudos in vitro mostraram que o consumo de aacutecidos graxos saturados
tambeacutem observado no presente estudo em ambos os grupos promovem processo
inflamatoacuterio com aumento da expressatildeo de IL-6 e TNF-α de TLR- 4 e consequente
aumento da ativaccedilatildeo da via NF-kβ (AJUWON SPURLOCK 2005 CALDER et al
2011 WEATHERILL et al 2005) Em estudos experimentais a dieta hiperlipiacutedica
rica em gordura saturada demonstrou promover obesidade com consequente
aumento de peso corporal adiposidade e marcadores inflamatoacuterios (FERNANDEZ-
REAL et al 2003 PEREIRA et al 2012) Esses achados podem explicar o fato de
105
que no presente estudo natildeo foram observadas diferenccedilas estatisticamente
significantes em relaccedilatildeo a liberaccedilatildeo de TNF-α e IL1-β entre os grupos estudados
Em relaccedilatildeo agrave liberaccedilatildeo da citocina IL-17 tambeacutem natildeo foram observadas diferenccedilas
estatisticamente significantes no entanto os achados da literatura teumlm sugerido
que no contexto de disbiose a presenccedila de agentes patogecircnicos pode perturbar a
regulaccedilatildeo do ambiente anti-inflamatoacuterio e que quando patoacutegenos enteacutericos superam
as bacteacuterias comensais o desequiliacutebrio entre comensais e bacteacuterias patogecircnicas
provocam liberaccedilatildeo significativa de MAMPs Este aumento pode induzir IECs DCs e
macroacutefagos ativados a secretar citocinas inflamatoacuterias como a IL-1β IL-6 IL-12 e
IL-23 Estas citocinas estimulam o desenvolvimento de ceacutelulas CD4+ T auxiliares
(T helper-TH1) e ceacutelulas TH17 (produzem IL-17A IL-17F e IL-22) resultando na
inflamaccedilatildeo crocircnica (MAYNARD et al 2012)
O estudo da influecircncia de diferentes elementos da dieta e composiccedilatildeo
corporal sobre a variaccedilatildeo da composiccedilatildeo da microbiota tornou-se uma aacuterea de
crescente interesse cientiacutefico Com efeito a relaccedilatildeo entre a microbiota intestinal e a
obesidade estaacute bastante reconhecida No entanto a participaccedilatildeo dos micro-
organismos da classe dos Mollicutes e alguns mecanismos subjacentes a essas
interaccedilotildees permanecem pouco estudados Em relaccedilatildeo agraves limitaccedilotildees do estudo
deve-se considerar o desenho transversal natildeo sendo possiacutevel estabelecer relaccedilatildeo
de causa e efeito No entanto o estudo mostra-se relevante destacando como
ponto forte o cuidado metodoloacutegico e a relevacircncia dos resultados encontrados
contribuindo para o avanccedilo dos estudos da relaccedilatildeo entre os molicutes microbiota
intestinal e obesidade Nesse contexto a importacircncia e validade de estudos como
este eacute apontar os possiacuteveis fatores de risco que contribuam para obesidade sendo
que a cuidadosa interpretaccedilatildeo dos resultados eacute importante para a geraccedilatildeo de
hipoacuteteses
Nesse contexto uma pesquisa acerca da relaccedilatildeo causa-efeito entre a
microbiota intestinal e a obesidade eacute altamente justificaacutevel uma vez que diferentes
espeacutecies de bacteacuterias podem desempenhar um papel significativo na safra de
energia humana e regulaccedilatildeo do peso corporal Aleacutem disso a consideraccedilatildeo de
fatores de estilo de vida em estudos da microbiota intestinal eacute altamente
recomendada uma vez que mudanccedilas no padratildeo alimentar e atividade fiacutesica podem
influenciar a composiccedilatildeo da microbiota intestinal para o desenvolvimento da
106
obesidade A partir disso o presente estudo fornece evidecircncias de que alteraccedilotildees e
interaccedilotildees na microbiota intestinal possam definir subconjuntos de indiviacuteduos com
diferentes perfis de risco metaboacutelico e assim contribuir para a investigaccedilatildeo da
heterogeneidade associada a fenoacutetipos relacionados com a adiposidade
especialmente em sociedades que estatildeo passando por transformaccedilotildees
socioeconocircmicas tecnoloacutegicas e culturais para um estilo de vida moderno
107
7 CONCLUSOtildeES
Os grupos caso e controle balancearam suas dietas conforme o intervalo de
distribuiccedilatildeo energeacutetica recomendado no entanto foi observado um consumo
de fibras inferior e de gorduras saturadas superior ao recomendado em
ambos os grupos
As mulheres de ambos os grupos apresentaram excesso de gordura corporal
Foi desenvolvido um ensaio de PCR em tempo real especiacutefico sensiacutevel
reprodutiacutevel e quantitativo para a detecccedilatildeo de Mollicutes nas fezes humanas
Foram encontradas associaccedilotildees estatisticamente significantes entre a
presenccedila de Mollicutes e mulheres obesas
Natildeo foram observadas associaccedilotildees estatisticamente significantes em relaccedilatildeo
as meacutedias de consumo dos macronutrientes carboidratos proteiacutenas lipiacutedios e
fibras com a presenccedila de Mollicutes
Natildeo foram observadas diferenccedilas estatisticamente significantes para as
cargas de Firmicutes Bacteroidetes e Bacteacuterias totais entre as mulheres do
grupo caso e controle
A proporccedilatildeo de Firmicutes em relaccedilatildeo aos Bacteroidetes foi maior na
microbiota intestinal das mulheres obesas em relaccedilatildeo agraves eutroacuteficas
Natildeo foi observada diferenccedila estatisticamente significante entre os grupos
caso e controle para nenhuma das citocinas avaliadas
108
De acordo com ASSOCIACcedilAcircO BRASILEIRA DE NORMAS TEacuteCNICAS NBR 6023 informaccedilatildeo e documentaccedilatildeo referecircncias elaboraccedilatildeo Rio de Janeiro 2002
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ZHANG H DIBIASE J K ZUCCOLO A KUDRNA D BRAIDOTTI M YU Y PARAMESWARAN P CROWELL M D WING R RITTMANN B E KRAJMALNIK-BROWNA R Human gut microbiota in obesity and after gastric bypass Proc Natl Acad Sci U S A v106 n7 p 2365ndash2370 2009
ZOETENDAL E G VAUGHAN E E DE VOS W M A microbial world within us Mol Microbiol v59 n6 p1636-1650 2006
127
APEcircNDICE A ndash TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
128
Universidade de Satildeo Paulo
Instituto de Ciecircncias Biomeacutedicas
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
ESTUDO Avaliaccedilatildeo da participaccedilatildeo dos microrganismos da Classe Mollicutes na microbiota intestinal de mulheres eutroacuteficas e obesas
Vocecirc estaacute sendo convidado (a) a participar do projeto de pesquisa acima citado O documento
abaixo conteacutem todas as informaccedilotildees necessaacuterias sobre a pesquisa que estamos fazendo Sua
colaboraccedilatildeo neste estudo seraacute de muita importacircncia para noacutes mas se desistir a qualquer momento
isso natildeo causaraacute nenhum prejuiacutezo a vocecirc
Eu _________________________________________________________________ profissatildeo ____________________________
residente e domiciliado na
_______________________________________________________________________________________________________________
______________________________________________________________ portador da Ceacutedula de identidade RG
___________________________ e inscrito no CPFMF______________________________ nascido(a) em _____
_____ _______ abaixo assinado(a) concordo de livre e espontacircnea vontade em participar como
voluntaacuterio(a) do estudo ldquoAvaliaccedilatildeo da participaccedilatildeo dos microrganismos da Classe Mollicutes
na microbiota intestinal de mulheres eutroacuteficas e obesasrdquo Declaro que obtive todas as
informaccedilotildees necessaacuterias bem como todos os eventuais esclarecimentos quanto agraves duacutevidas por
mim apresentadas
Estou ciente que
I) O estudo se faz necessaacuterio para que se possam descobrir as possiacuteveis causas da doenccedila
denominada vaginoses bacterianas a ser estudada no projeto ldquoAvaliaccedilatildeo da
participaccedilatildeo dos microrganismos da Classe Mollicutes na microbiota intestinal de
mulheres eutroacuteficas e obesasrdquo
II) Seratildeo feitas uma coleta de 5ml de sangue e fezes em periacuteodo uacutenico
III) A participaccedilatildeo neste projeto natildeo tem objetivo de me submeter a um tratamento bem
como natildeo me acarretaraacute qualquer despesa financeira com relaccedilatildeo aos procedimentos
meacutedico-cliacutenico-terapecircuticos efetuados no estudo
129
IV) Tenho a liberdade de desistir ou de interromper a colaboraccedilatildeo neste estudo no momento
em que desejar sem necessidade de qualquer explicaccedilatildeo
V) A desistecircncia natildeo causaraacute nenhum prejuiacutezo agrave minha sauacutede ou bem estar fiacutesico Natildeo viraacute
interferir no atendimento ou tratamento meacutedico
VI) Os resultados obtidos durante este ensaio seratildeo mantidos em sigilo mas concordo que
sejam divulgados em publicaccedilotildees cientiacuteficas desde que meus dados pessoais natildeo sejam
mencionados
VII) Caso eu desejar poderei pessoalmente tomar conhecimento dos resultados ao final
desta pesquisa
( ) Desejo conhecer os resultados desta pesquisa
( ) Natildeo desejo conhecer os resultados desta pesquisa
VIII) Concordo que o material possa ser utilizado em outros projetos desde que autorizado
pela Comissatildeo de Eacutetica deste Instituto e pelo responsaacutevel por esta pesquisa Caso minha
manifestaccedilatildeo seja positiva poderei retirar essa autorizaccedilatildeo a qualquer momento sem
qualquer prejuiacutezo para mim
( ) Sim ou ( ) Natildeo
IX ) Poderei contatar a Secretaria da Comissatildeo de Eacutetica em Pesquisa com Seres Humanos ndash
ICBUSP - no Fone 30917733 (e-mail cepicbuspbr) ou (11 3091-7297 jotiuspbr)
para recursos ou reclamaccedilotildees em relaccedilatildeo ao presente estudo
X) O sujeito de pesquisa ou seu representante quando for o caso deveraacute rubricar todas as
folhas do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido ndash TCLE - apondo sua assinatura na uacuteltima
paacutegina do referido Termo
XI) O pesquisador responsaacutevel deveraacute da mesma forma rubricar todas as folhas do Termo de
Consentimento Livre e Esclarecido ndash TCLEndash apondo sua assinatura na uacuteltima paacutegina do
referido Termo
XII) Resoluccedilatildeo 19696 - Estou recebendo uma coacutepia deste Termo de Consentimento Livre e
Esclarecido
Satildeo Paulo___________de________________de 20_____ ( ) Paciente ( ) Responsaacutevel
Testemunha 1 _______________________________________________
Nome RG Telefone
130
Testemunha 2 ___________________________________________________
Nome RG Telefone
Responsaacutevel pelo Projeto _____________________________________________________
PROF DR JORGE TIMENETSKY
131
APEcircNDICE B ndash QUESTIONAacuteRIO
132
UNIVERSIDADE DE SAtildeO PAULO
INSTITUTO DE CIEcircNCIAS BIOMEacuteDICAS
MESTRADO EM MICROBIOLOGIA
Seccedilatildeo 1 IDENTIFICACcedilAtildeO E DADOS PESSOAIS
Nome Idade ID
Telefone Data
Profissatildeo
Estado civil 1 Casada 2 Solteira 3 Mora com companheiro 4 Viuacuteva 5 Divorciada
Raccedilacor 1 Branca 2 Preta 3 Amarela 4 Parda 5 Indiacutegena
Escolaridade 1 Analfabeto 2 1ordm grau incompleto 3 1ordm grau Completo
4 2ordm grau incompleto 5 2ordm grau completo 6 Superior incompleto 7 superior completo
Condiccedilatildeo Socioeconocircmica Indicar aproximadamente a renda domiciliarfamiliar mensal (soma de todos os ganhos
das pessoas que dividem as despesas) (valor SM R$ 67800)
ateacute 1 salaacuterio miacutenimo (ateacute R$ 61800)
1 a 2 salaacuterios miacutenimos (mais de R$ 61800 a R$ 123600)
2 a 5 salaacuterios miacutenimos (mais de R$ 123600 a R$ 309000)
5 a 10 salaacuterios miacutenimos (mais de R$ 309000 a R$ 618000)
mais de 10 salaacuterios miacutenimos (mais de R$ 618000)
Seccedilatildeo 2 HISTOacuteRIA FAMILIAR (parentes de 1ordm grau paternos e maternos e irmatildeos)
1 HAS 2 Diabetes 3 Obesidade 4 Hipercolesterolemia 5 DCV
Seccedilatildeo 3 HISTOacuteRIA CLIacuteNICA
133
Alteraccedilotildees gastrointestinais 1 Constipaccedilatildeo Flatulecircncia 3 Refluxo 4 Azia
5 Ulcera 6 Gastrite 7 Naacuteuseas 8 Vocircmitos
Como o intestino se comporta habitualmente 1 Normal 2 Constipaccedilatildeo 3 Diarreacuteia
Moleacutestia atual 1 HAS 2 Diabetes 3 Obesidade 4 Hipercolesterolemia
5 DCV 6 Dispneacuteia 7 Alteraccedilatildeo Menstrual
Uso de laxantes 1 Sim 2 Natildeo
Seccedilatildeo 4 HISTOacuteRIA OBSTEacuteTRICA
Tipo de parto 1 Normal 2 Cesaacuterea
Foi amamentada 1 Natildeo 2 1 a 3 meses 3 4 a 6 meses 4 7 a 9 meses
5 10 a 12 meses 6 gt12 meses
Teve alguma gestaccedilatildeo 1 Sim 2 Natildeo
Quantos filhos 1 1 a 2 2 3 a 4 3 ge5
Quantos partos foram normais 1 1 a 2 2 3 a 4 3 ge5
Quantos partos foram cesaacuterea 1 1 a 2 2 3 a 4 3 ge5
Tempo de amamentaccedilatildeo dos filhos 1 Natildeo 2 1 a 3 meses 3 4 a 6 meses 4 7 a 9 meses
5 10 a 12 meses 6 gt12 meses
Seccedilatildeo 5 HISTOacuteRIA GINECOLOacuteGICA
Usou ou estaacute usando algum anticoncepcional (adesivo piacutelula anel vaginal DIU de hormocircnio injetaacutevel ou
bastatildeo subcutacircneo) 1 Sim 2 Natildeo
Com que idade comeccedilou a tomar
Parou de usar por algum tempo
Por quanto tempo parou
Seccedilatildeo 6 CONSUMO DE TABACO
134
Jaacute fumou mais de 20 maccedilos de cigarro (cachimbo ou charuto) em toda sua vida
1 Natildeo 2 Sim e fumo atualmente 3 Sim mas parei de fumar 4 Natildeo sabe natildeo informa
Se fumafumou o faz haacute quanto tempo
Quantos cigarros em meacutedia fumafumava por dia
____cigarros
____cachimbos
____charutos
Se parou de fumar haacute quanto tempo ocorreu
Seccedilatildeo 7 CONSUMO DE AacuteLCOOL
Etilista 1 Sim 2 Natildeo
Frequencia de ingestatildeo
Tipo de bebida ingerida
Haacute quanto tempo ingere
Seccedilatildeo 8 ATIVIDADE FIacuteSICA (IPAQ versatildeo curta)
As perguntas estatildeo relacionadas ao tempo que vocecirc gasta fazendo atividade fiacutesica na UacuteLTIMA
semana As perguntas incluem as atividades que vocecirc faz no trabalho para ir de um lugar a outro
por lazer por esporte por exerciacutecio ou como parte das suas atividades em casa ou no jardim
Para responder as questotildees lembre que
atividades fiacutesicas VIGOROSAS satildeo aquelas que precisam de um grande esforccedilo fiacutesico e que fazem respirar MUITO mais forte que o normal
atividades fiacutesicas MODERADAS satildeo aquelas que precisam de algum esforccedilo fiacutesico e que fazem respirar UM POUCO mais forte que o normal
Para responder as perguntas pense somente nas atividades que vocecirc realiza por pelo menos 10
minutos contiacutenuos de cada vez
135
1a Em quantos dias da uacuteltima semana vocecirc caminhou por pelo menos 10 minutos contiacutenuos em casa
ou no trabalho como forma de transporte para ir de um lugar para outro por lazer por prazer ou
como forma de exerciacutecio dias _____ por SEMANA ( ) Nenhum
1b Nos dias em que vocecirc caminhou por pelo menos 10 minutos contiacutenuos quanto tempo no total
vocecirc gastou caminhando por dia horas ______ Minutos _____
2a Em quantos dias da uacuteltima semana vocecirc realizou atividades MODERADAS por pelo menos 10
minutos contiacutenuos como por exemplo pedalar leve na bicicleta nadar danccedilar fazer ginaacutestica
aeroacutebica leve jogar volei recreativo carregar pesos leves fazer serviccedilos domeacutesticos na casa no
quintal ou no jardim como varrer aspirar cuidar do jardim ou qualquer atividade que fez aumentar
moderadamente sua respiraccedilatildeo ou batimentos do coraccedilatildeo (POR FAVOR NAtildeO INCLUA CAMINHADA)
dias _____ por SEMANA ( ) Nenhum
2b Nos dias em que vocecirc fez essas atividades moderadas por pelo menos 10 minutos contiacutenuos
quanto tempo no total vocecirc gastou fazendo essas atividades por dia
horas ______ Minutos _____
3a Em quantos dias da uacuteltima semana vocecirc realizou atividades VIGOROSAS por pelo menos 10
minutos contiacutenuos como por exemplo correr fazer ginaacutestica aeroacutebica jogar futebol pedalar raacutepido
na bicicleta jogar basquete fazer serviccedilos domeacutesticos pesados em casa no quintal ou cavoucar no
jardim carregar pesos elevados ou qualquer atividade que fez aumentar MUITO sua respiraccedilatildeo ou
batimentos do coraccedilatildeo dias _____ por SEMANA ( ) Nenhum
3b Nos dias em que vocecirc fez essas atividades vigorosas por pelo menos 10 minutos contiacutenuos quanto
tempo no total vocecirc gastou fazendo essas atividades por dia
horas ______ Minutos _____
Seccedilatildeo 9 HAacuteBITOS ALIMENTARES
Vocecirc mudou seus haacutebitos alimentares recentemente ou estaacute fazendo dieta para emagrecer ou por qualquer
outro motivo
1 Natildeo 5 Sim para reduccedilatildeo de sal
2 Sim para perda de peso 6 Sim para reduccedilatildeo de colesterol
3 Sim por orientaccedilatildeo meacutedica
136
4 Sim para dieta vegetariana ou reduccedilatildeo do consumo de carne
Vocecirc estaacute tomando algo para suplementar sua dieta (vitaminas minerais e outros produtos)
1 Natildeo 2 Sim regularmente 3 Sim mas natildeo regularmente
Se a resposta da pergunta anterior for sim favor preencher o quadro abaixo
Suplemento
Nome comercial Dose
Frequencia
Nuacutemero de refeiccedilotildees que costuma fazer por dia
Costuma fazer desjejum diariamente 1 Sim 2 Natildeo
Costuma beliscar entre as refeiccedilotildees 1 Sim 2 Natildeo
Costuma ingerir liacutequidos durante as refeiccedilotildees 1 Sim 2 Natildeo
Quantas refeiccedilotildees costuma fazer fora de casa por semana
Em que local costuma fazer as refeiccedilotildees fora de casa
1 Restaurantes 5 Natildeo faz
2 Lanches raacutepidos 6 Outro
3 Marmita
4 No trabalho
137
As questotildees seguintes relacionam-se ao seu haacutebito alimentar usual no PERIacuteODO DE UM ANO Para cada quadro responda por favor a frequecircncia que melhor descreva QUANTAS VEZES vocecirc costuma comer cada item e a respectiva UNIDADE DE TEMPO (se por dia por semana por mecircs ou no ano) Depois responda qual a sua PORCcedilAtildeO INDIVIDUAL USUAL em relaccedilatildeo agrave porccedilatildeo meacutedia indicada ESCOLHA SOMENTE UM CIacuteRCULO PARA CADA COLUNA Muitos grupos de alimentos incluem exemplos Eles satildeo sugestotildees e vocecirc pode pode consumir todos os itens indicados Se vocecirc natildeo come ou raramente come um determinado iacutetem preeencha o ciacuterculo da primeira coluna (N=nunca come) NAtildeO DEIXE ITENS EM BRANCO
138
139
140
141
Por favor liste qualquer outro alimento ou preparaccedilatildeo importante que vocecirc costuma comer ou beber pelo menos UMA VEZ POR SEMANA que natildeo foram citados aqui (por exemplo leite-de-coco outros tipos de carnes receitas caseiras creme de leite leite condensado gelatina e outros doces etc )
Alimento Frequecircncia por semana Quantidade Consumida
Quando vocecirc come carne bovina ou suiacutena vocecirc costuma comer a gordura visiacutevel 1 nunca ou raramente 2 algumas vezes 3 sempre 4 natildeo sabe Quando vocecirc come frango ou peru vocecirc costuma comer a pele 1 nunca ou raramente 2 algumas vezes 3 sempre 4 natildeo sabe
142
Seccedilatildeo 10 DADOS ANTROPOMEacuteTRICOS
Peso
_____________Kg
_____________Kg
Estatura
_____________m
_____________m
IMC
__________Calcular IMC= peso em Kg altura em m2
Circunferecircncia Abdominal
_____________cm
_____________cm
Reactacircncia
Resistecircncia ___________MG
_____________MLG
Peso MG_________kg
Peso MGL_________kg
TMB __________
aacutegua de massa magra
143
APEcircNDICE C- TABELA 10
144
Tabela 10 Participaccedilatildeo dos alimentos nos grupos meacutedias de consumo por dia dos alimentos consumidos pela populaccedilatildeo estudada Satildeo Paulo SP 2013-2014
Grupo Alimentar
Alimentos Grupo Frequecircncia diaacuteria (dp)
Frequecircncia diaacuteria (amplitude)
Massas
Macarratildeo com molho sem carne
Caso
02 (05)
(0-25)
Controle
02 (02) (0-043)
Macarratildeo com molho com carne lasanha nhoque
Caso 01 (012) (0-043)
Controle
02 (02) (0-079)
Pizza panqueca
Caso 015 (022) (0-1)
Controle 02 (01) (003-043)
Preparaccedilatildeo
Sopas
Caso 015 (018) (0-043)
Controle 014 (02) (0-043)
Polenta cozida ou frita
Caso 003 (005) (0-014)
Controle 0008 (003) (0-014)
Carne vermelha e
ovos
Carne bovina
Caso 06 (06) (008-25)
Controle 05 (018) (014-079)
Carne de porco Caso 008 (009) (0-043)
Controle 02 (05) (0-25)
Carne seca carne do sol bacon
Caso 006 (005) (0-014)
Controle 004 (006) (0-014)
Ovos Caso 02 (02) (0-1)
Controle 03 (05) (0-25)
Embutidos
Linguiccedila
Caso 011 (009) (0-043)
Controle 02 (05) (0-25)
Embutidos (presunto mortadela salsicha)
Caso 015 (023) (0-1)
Controle 02 (02) (0-043)
Carne branca
Frango Caso 06 (09) (003-3)
Controle 05 (05) (014-25)
Peixe e frutos do mar Caso 01 (01) (0-043)
Controle 01 (02) (0-043)
Leite e derivados
Leite integral Caso 07 (09) (0-3)
Controle 04 (06) (0-25)
Leite desnatado Caso 04 (09) (0-3)
Controle 002 (005) (0-014)
Leite semi-desnatado Caso 03 (08) (0-25)
Controle 0004 (002) (0-008)
Iogurte natural Caso 05 (09) (0-25)
Controle 03 (03) (0-079)
Iogurte com frutas Caso 03 (08) (0-25)
Controle 02 (02) (0-079)
145
Tabela 10 Participaccedilatildeo dos alimentos nos grupos meacutedias de consumo ao dia dos alimentos consumidos pela populaccedilatildeo estudada Satildeo Paulo SP 2013-2014
(Continuaccedilatildeo)
Grupo Alimentar
Alimentos Grupo Frequecircncia diaacuteria (dp)
Frequecircncia diaacuteria
(amplitude)
Leite e derivados
Queijo mussarela prato parmesatildeo e provolone
Caso 05 (07) (0-25)
Controle 05 (06) (003-25)
Queijo minas e ricota Caso 04 (08) (0-25)
Controle 04 (06) (0-25)
Leguminosas
Feijatildeo Caso 12 (09) (014-25)
Controle 06 (05) (008-25)
Lentilha ervilha seca gratildeo de bico soja
Caso 005 (009) (0-043)
Controle 006 (01) (0-043)
Feijatildeo tropeiro e feijoada
Caso 003 (003) (0-014)
Controle 002 (004) (0-014)
Cereais raiacutezes e
tubeacuterculos
Arroz branco ou integral cozido com
oacuteleo e temperos
Caso 15 (09) (043-25)
Controle 14 (07) (043-25)
Batata frita ou mandioca frita
Caso 007 (01) (0-043)
Controle 02 (01) (003-043)
Batata mandioca inhame (cozida ou assada) purecirc
Caso 01 (012) (0-043)
Controle 02 (02) (0-043)
Farinha de mandioca farofa cuscuz aveia tapioca
Caso 02 (03) (0-1)
Controle 01 (02) (0-1)
Patildeo francecircs patildeo de forma integral patildeo doce torrada
Caso 07 (06) (014-3)
Controle 17 (08) (0-25)
Biscoito sem recheio (doce salgado) Caso 04 (06) (0-25)
Controle 05 (06) (0-25)
Biscoito recheado waffer amanteigado
Caso 01 (03) (0-1)
Controle 009 (02) (0-043)
Bolo (simples recheado) Caso 01 (013) (0-043)
Controle 01 (013) (0-043)
Hortaliccedilas
Alface
Caso 12 (09) (008-3)
Controle 08 (06) (014-25)
Tomate Caso 14 (107) (008-3)
Controle 08 (06) (003-25)
Cenoura Caso 06 (07) (008-25)
Controle 04 (02) (0-1)
Outros legumes (abobrinha berinjela chuchu pepino)
Caso 04 (03) (008-1)
Controle 05 (07) (0-25)
Outras verduras cruas (acelga ruacutecula agriatildeo)
Caso 04 (03) (008-1)
Controle 04 (02) (0-1)
146
Tabela 10 Participaccedilatildeo dos alimentos nos grupos meacutedias de consumo ao dia dos alimentos consumidos pela populaccedilatildeo estudada Satildeo Paulo SP 2013-2014
(Continuaccedilatildeo)
Grupo Alimentar Alimentos Grupo Frequecircncia diaacuteria (dp)
Frequecircncia diaacuteria
(amplitude)
Hortaliccedilas
Outras verduras cozidas (acelga espinafre escarola couve)
Caso 03 (02) (0-1)
Controle 03 (02) (0-079)
Broacutecolis couve-flor repolho Caso 02 (015) (0-043)
Controle 03 (03) (0-1)
Frutas
Laranja mexerica abacaxi Caso 08 (09) (0-3)
Controle 04 (05) (003-25)
Banana Caso 08 (09) (0-3)
Controle 04 (02) (008-1)
Maccedilatilde pecircra Caso 05 (07) (0-3)
Controle 03 (03) (0-1)
Melatildeo melancia Caso 03 (07) (0-1)
Controle 01 (01) (0-043)
Mamatildeo Caso 03 (03) (0-1)
Controle 008 (006) (0-014)
Goiaba Caso 01 (02) (0-1)
Controle 0008 (002) (0-008)
Abacate Caso 08 (02) (0-1)
Controle 007 (001) (0-003)
Suco natural Caso 07 (09) (0-3)
Controle 03 (02) (0-1)
Industrializados
Maionese molho para salada patecirc chantily
Caso 01 (016) (0-043)
Controle 01 (02) (0-1)
Condimentos
Caso 04 (06) (0-25)
Controle 02 (03) (0-079)
Hamburguer nuggets almocircndega Caso 006 (009) (0-043)
Controle 005 (009) (0-043)
Suco industrializado Caso 08 (105) (0-3)
Controle 05 (03) (0-1)
Refrigerante comum Caso 02 (02) (0-079)
Controle 02 (02) (0-043)
Refrigerante light diet Caso 0 0
Controle 007 (02) (0-043)
147
Tabela 10 Participaccedilatildeo dos alimentos nos grupos meacutedias de consumo ao dia dos alimentos consumidos pela populaccedilatildeo estudada Satildeo Paulo SP 2013-2014
(Continuaccedilatildeo)
Grupo Alimentar Alimentos Grupo Frequecircncia diaacuteria (dp)
Frequecircncia diaacuteria
(amplitude)
Infusatildeo
Chaacute e cafeacute sem accediluacutecar Caso 09 (1) (0-25)
Controle 06 (07) (0-25)
Chaacute e cafeacute com accediluacutecar Caso 08 (08) (0-25)
Controle 07 (08) (0-3)
Bebida alcooacutelica
Cerveja
Caso 003 (005) (0-014)
Controle 0074 (01) (0-043)
Oacuteleos e gorduras
Oacuteleo azeite ou vinagre para tempero de salada
Caso 1 (09) (0-25)
Controle 03 (03) (0-1)
Manteiga ou margarina comum Caso 09 (09) (0-25)
Controle 07 (07) (0-25)
Manteiga ou margarina light Caso 02 (06) (0-25)
Controle 007 (003) (0-014)
Lanches
Salgado frito Caso 02 (03) (0-1)
Controle 01 (01) (0-043)
Salgado assado Caso 014 (02) (0-1)
Controle 02 (02) (0-043)
Sanduiche Caso 006 (009) (0-043)
Controle 005 (004) (0-014)
Accediluacutecar e doces
Chocolate bombom brigadeiro Caso 04 (04) (0-1)
Controle 06 (04) (003-2)
Achocolatado em poacute (adicionado ao leite)
Caso 013 (03) (0-1)
Controle 02 (03) (0-1)
Sobremesas doces tortas e pudins
Caso 02 (03) (0-1)
Controle 03 (03) (003-1)
Accediluacutecar mel e geleacuteia Caso 05 (07) (0-3)
Controle 08 (1) (0-3)
UNIVERSIDADE DE SAtildeO PAULO
INSTITUTO DE CIEcircNCIAS BIOMEacuteDICAS ____________________________________________________________________________
Candidato(a) Verena Macedo Santos
Tiacutetulo da Dissertaccedilatildeo Avaliaccedilatildeo da participaccedilatildeo dos micro-organismos da Classe
Mollicutes na microbiota intestinal de mulheres eutroacuteficas e obesas
Orientador (a) Prof Dr Jorge Timenetsky
A Comissatildeo Julgadora dos trabalhos de Defesa da Dissertaccedilatildeo de Mestrado
em sessatildeo puacuteblica realizada a considerou
( ) Aprovado(a) ( ) Reprovado(a)
Examinador(a) Assinatura
Nome
Instituiccedilatildeo
Examinador(a) Assinatura
Nome
Instituiccedilatildeo
Presidente Assinatura
Nome
Instituiccedilatildeo
ldquoHoje lembrando-me dela me vendo nos olhos dela sei que o
tinha de ser se deu Por que era ela por que era eurdquo
Chico Buarque
Agrave minha matildee Maria Bernardete meu anjo de luz Dedico
AGRADECIMENTO ESPECIAL
Agrave Fundaccedilatildeo de Amparo agrave Pesquisa do Estado de Satildeo Paulo (FAPESP) agrave Fundaccedilatildeo de
Amparo agrave Pesquisa do Estado da Bahia (FAPESB) e agrave Coordenaccedilatildeo de
Aperfeiccediloamento de Pessoal de Niacutevel Superior (Capes) pelo apoio financeiro sem o
qual este estudo natildeo seria realizado
AGRADECIMENTOS
Agrave Deus e todos meus espiacuteritos de luz em vida e desencarnados por tudo que me
representam por me permitirem cruzar essa jornada com sabedoria resignaccedilatildeo feacute e
discernimento e por me mostrarem que os ldquoSinais seguem o que creemrdquo Ofereccedilo
Agrave melhor matildee que Deus poderia me permitir nascer que me mostrou a vida e me
ensinou os verdadeiros valores de amor perdatildeo caridade humildade e perseveranccedila
aleacutem de me mostrar que as barreiras da vida satildeo transponiacuteveis e que na verdade
devem ser encaradas como fronteiras Obrigada por continuar olhando por mim e me
incentivando mesmo de outro plano espiritual Sem o seu amor tudo isso seria
impossiacutevel A ti dedico
Agrave meu pai Oriston meu exemplo de vida e companheiro fiel por entender o meu
propoacutesito e me apoiar mesmo nas dificuldades Vocecirc me ensina mais a cada dia sobre
a leveza da vida e em como me tornar uma pessoa melhor uma filha melhor obrigada
Agrave meu irmatildeo Breno e minha cunhada Ariela pelo apoio e por me permitir ser a tia mais
feliz e amada desse mundo
Aos meus sobrinhos queridos Lulu Lis e Miguel por me mostrarem a pureza da vida e
do amor em sua essecircncia mais pura
Agrave Evinha minha ldquomatildee adotivardquo desde os meus 2 dias de vida por todo amor e
dedicaccedilatildeo Minha gratidatildeo seraacute eterna
Ao professor Jorge Timenetsky meu querido orientador por ter aceitado me orientar
natildeo soacute no planejamento e execuccedilatildeo do trabalho mas tambeacutem na vida Minha sincera
gratidatildeo pela orientaccedilatildeo dedicaccedilatildeo e competecircncia profissional
Ao professor Lucas meu mentor na vida e no trabalho pai matildee amigo e eterno
orientador Obrigada Marques por ter acreditado que essa semente um dia iria brotar
Sem o seu apoio e incentivo eu realmente natildeo conseguiria Ter vocecirc em meu caminho
eacute uma honra e um previleacutegio
Agrave Aricelma um dos maiores presentes que pude receber em minha trajetoacuteria pelo
amor conselhos carinhos e abraccedilos Vocecirc foi fundamental para eu me manter firme no
propoacutesito
Ao departamento de endocrinologia do HC-FMUSP e aos professores Alfredo Halpern e
Marcio Mancinni por abrirem as portas para a realizaccedilatildeo das coletas e por acreditarem
no trabalho
Aos funcionaacuterios do departamento de endocrinologia da HC-FMUSP sem os quais
seria inviaacutevel a realizaccedilatildeo das coletas
Aos pacientes por participarem deste estudo e me permitir aprender mais a cada
coleta
Ao professor Djanilson pelo auxiacutelio nas anaacutelises estatiacutesticas e por me apresentar
Jerusa um verdadeiro anjo sem a qual seria inviaacutevel as anaacutelises de consumo
alimentar
Agrave amiga e companheira de trajetoacuteria Aline Teixeira pela preciosa colaboraccedilatildeo nas
anaacutelises estatiacutesticas e por ser minha dupla imbatiacutevel
Ao amigo-irmatildeo Filipe Bezerra pela preciosa contribuiccedilatildeo nas adaptaccedilotildees das
ilustraccedilotildees e pela honra de sua amizade
Ao melhor grupo de pesquisa que jaacute sonhei fazer parte pelos ensinamentos e amizade
incondicional Juntos somos uma famiacutelia obrigada meus amigos
Agrave todos os amigos que passaram pelo aptdeg 63 ao longo desses anos vocecircs foram
fundamentais em todos os momentos dessa jornada
Aos funcionaacuterios do ICB II indispensaacuteveis no meu dia a dia pelo apoio amizade cafeacutes
e carinho
Agrave meus amigos-irmatildeos e suas respectivas famiacutelias por me ensinarem que amizade eacute o
sentimento que imanta as almas suave expressatildeo do ser que necessita intercambiar as
forccedilas da emoccedilatildeo sob os estiacutemulos do entendimento fraternal inspiradora de coragem
e de abnegaccedilatildeo que enfloresce as almas abenccediloando-as com resistecircncias para as
lutas Amo vocecircs gratidatildeo
Agrave todos que cruzaram meu caminho nesta jornada e que trouxeram consigo
ensinamentos que me transformaram em algueacutem melhor que outrora o meu muito
obrigada
Soacute o conhecimento vivido
O conhecimento de dentro para fora
Aquele que natildeo eacute aprendido nos livros nem na fria observaccedilatildeo
do fino repoacuterter de faro infaliacutevel
Soacute aquele conhecimento que se viveu dia a dia minuto a minuto
no erro e no acerto ()
Possibilita a criaccedilatildeo
Jorge Amado
18
RESUMO
SANTOS V M Avaliaccedilatildeo da participaccedilatildeo dos micro-organismos da Classe Mollicutes na microbiota intestinal de mulheres eutroacuteficas e obesas 2015 147 f Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Microbiologia) ndash Instituto de Ciecircncias Biomeacutedicas Universidade de Satildeo Paulo Satildeo Paulo 2015
A obesidade possui causas multifatoriais sendo caracterizada como um excesso de gordura
corporal acumulada no tecido adiposo causando impactos agrave sauacutede Estudos quanto agrave interaccedilatildeo
geneacutetica do indiviacuteduo com o ambiente mostram que alguns indiviacuteduos satildeo mais propensos ao ganho
de peso do que os outros em ambientes similares Satildeo muitas as evidecircncias de que o metabolismo
da microbiota intestinal facilita a extraccedilatildeo de calorias da dieta ajudam a estocaacute-las no tecido
adiposo aleacutem de prover energia e nutrientes para o crescimento microbiano Nesse contexto a
ocorrecircncia e participaccedilatildeo dos Mollicutes na microbiota intestinal eacute praticamente desconhecida
sendo necessaacuterios portanto o desenvolvimento de estudos que avaliem as implicaccedilotildees e
relevacircncia desses microrganismos nas respostas adaptativas da microbiota intestinal humana
Deste modo o objetivo do presente estudo foi analisar a participaccedilatildeo dos micro-organismos da
Classe Mollicutes e dos Filos Firmicutes e Bacteroidetes na microbiota intestinal de mulheres
obesas e eutroacuteficas Para a realizaccedilatildeo do estudo a casuiacutestica foi de 20 mulheres diagnosticadas
com obesidade (IMCgt 30kgm2) e 20 mulheres em eutrofia (IMC entre 185 e 249 kgm2 Foram
obtidas amostras de fezes sangue Foi aplicado um questionaacuterio semiestruturado sobre fatores
relacionados com obesidade e possiacutevel associaccedilatildeo com microbiota intestinal e ambiente aleacutem de
avaliaccedilatildeo antropomeacutetrica atraveacutes de Bioimpedacircncia e questionaacuterio de frequecircncia alimentar
Desenvolveu-se um ensaio quantitativo por meio de TaqMan PCR para a detecccedilatildeo de Mollicutes
nas amostras de fezes A metodologia foi especiacutefica sensiacutevel reprodutiacutevel e gerou dados
quantitativos para a detecccedilatildeo desses microrganismos nas fezes humanas Constatou-se no
presente estudo que o grupo caso apresentou consumo energeacutetico inferior ao recomendado e que
ambos os grupos apresentaram consumo superior de gorduras saturadas e inferior de fibras Em
relaccedilatildeo a determinaccedilatildeo do estado nutricional os dois grupos se apresentaram acima da meacutedia
referecircncia indicando excesso de gordura corporal Na determinaccedilatildeo da microbiota intestinal
constatou-se uma diferenccedila estatisticamente significante entre as meacutedias do nuacutemero dos micro-
organismos da classe Mollicutes entre os grupos caso e controle Detectou-se uma associaccedilatildeo
positiva estatisticamente significante entre a presenccedila de Mollicutes e mulheres obesas (OR= 115
IC= 242-554) Na quantificaccedilatildeo da presenccedila dos Filos Firmicutes e Bacteroidetes e Bacteacuterias
totais na microbiota natildeo foram observadas diferenccedilas estatisticamente significantes quanto a sua
quantidade entre as mulheres do grupo caso e controle No entanto foi observada maior proporccedilatildeo
de FirmicutesBacteroidetes na microbiota intestinal das mulheres obesas em relaccedilatildeo agraves eutroacuteficas
do grupo controle Os resultados obtidos permitiram obter evidecircncias importantes da participaccedilatildeo
dos micro-organismos da classe Mollicutes As alteraccedilotildees da microbiota intestinal tambeacutem
contribuiacuteram na definiccedilatildeo de subconjuntos de indiviacuteduos com diferentes perfis de risco metaboacutelico e
a da heterogeneidade associada a fenoacutetipos humanos relacionados com a adiposidade
Palavras-chave Obesidade Microbiota intestinal Mollicutes qPCR
ABSTRACT
SANTOS V M Evaluation of Mollicutes microorganismrsquos participation in the gut microbiota of obese and normal weight women 2015 147 p Masters thesis (Microbiology) ndash Instituto de Ciecircncias Biomeacutedicas Universidade de Satildeo Paulo Satildeo Paulo 2015
Obesity has multifactorial causes and it is characterized as an excess of corporal fat accumulated in adipose tissue causing health impacts Studies on the genetic interaction of the individual with the environment shows that some individuals are more prone to weight gain than others in similar environments There are many evidences that the gut microbiota metabolism facilitates the harvest of energy derived from ingested nutrients it help to store them in adipose tissue and provide energy and nutrients for microbial growth In this context the occurrence and participation of Mollicutes in the gut microbiota is pratically unknown requiring the development of studies to evaluate the implications and relevance of these microorganisms in the adaptive responses of the human gut microbiota Thus the aim of this study was to analyze the participation of the Class Mollicutes and Firmicutes and Bacteroidetes phylos in the gut microbiota of obese and normal weight women For the study it was collected samples of 20 women diagnosed with obesity (BMIgt 30 kg m2) and 20 women of normal weight (BMI between 185 and 249 kg m2) it was collected stool samples blood semi-structured questionnaire on etiological factors predisposing and associated with obesity and possible association with gut microbiota and the environment and anthropometric measurements using bioelectrical impedance A quantitative assay was developed through of TaqMan PCR for the detection of Mollicutes in stool samples from patients with the methodology specific sensitive reproducible and quantitative for the detection of these microorganisms in human stools It was found in this study that the case group had a lower energy consumption than recommended and that both groups had a higher intake of saturated fats and less fiber For determining the nutritional status of the two groups presented above average reference indicating excess body fat Regarding the determination of the intestinal microbiota of the study population there was a statistically significant difference between the mean of microorganisms of Mollicutes class between the case and control groups And it was detected a statistically significant positive association between the presence of Mollicutes and obese women (OR = 115 CI = 242 to 554) Regarding the analysis about the participation of phylos Firmicutes and Bacteroidetes and total bacteria in the microbiota of the study population no statistically significant differences observed for the microbial amount among women of the case and control group However there was a higher proportion of Firmicutes Bacteroidetes the gut microbiota of obese women compared to the control group normal weight women Analysis of the results provide important evidence about the participation of almost unknown Mollicutes class in the gut microbiota of the population studied as well as changes and interactions in intestinal microbiota can define subsets of individuals with different metabolic risk profiles and thus contribute to investigation of the heterogeneity associated phenotypes related to adiposity
Keywords Obesity Gut microbiota Mollicutes qPCR
LISTA DE ABREVIATURAS SIGLAS E SIacuteMBOLOS
A ndash Adenina
AEAndash N-araquidonoil etanolamina anandamida
AFndash Niacutevel de atividade fiacutesica
AGCCndash Aacutecidos graxos de cadeia curta
AgRPndash Peptiacutedeo Relacionado ao Agouti
AIDSndash Siacutendrome da imunodeficiecircncia adquirida
AIndash Adequate Intake
AMPndash Adenosina monofosfato
AMPKndash Adenosina proteiacutena quinase
AMPsndash Peptiacutedeos antimicrobianos bacterianos
APC ndash Ceacutelula apresentadora de antiacutegeno
APRILLndash Ligante indutor de proliferaccedilatildeo
atm ndash Atmosfera
ATP ndash Adenosina tri-fosfato
C ndash Citosina
C+G ndash Conteuacutedo citosina e guanina
Cb-1ndash Receptores canabinoacuteides
CCKndash Colecistocinina
CH4ndash Metano
CHOsndash Carboidratos
ChREBP ndash Carbohydrate response element-binding protein
CO2 ndash Gaacutes carbocircnico
CPT1ndash Carnitina palmitoil transferase 1
Ct ndash Cycle Treshold (Sinal de fluorescecircncia que pode ser
detectado)
CV ndash Coeficiente de variaccedilatildeo
DAG lipasendash sn-1-diacilglicerol lipase seletiva
DCs ndash Ceacutelulas Dendriacuteticas
DNA ndash Aacutecido Desoxirribonucleico
DRI ndash Dietary References Intakes
DP ndash Desvio padratildeo
dNTP ndash Deoxinucleotiacutedeo trifosfato
EAR ndash Estimated Average Requirements
EDTA ndash Aacutecido Etilenodiamino Tetra-aceacutetico
ELISA ndash Enzyme-Linked Immunoabsorbent Assay
EIndash Enzimas citoplasmaacuteticas do sistema PTS
EPIndash Equipamento de Proteccedilatildeo Individual
EROndash Espeacutecies reativas de oxigecircnio
FAAHndash Fatty acid amide hydrolase
FABFndash Fator de ativaccedilatildeo de ceacutelulas β
FFARndash Free fatty acids receptors
FIAFndash Fasting Induced Adipocyte Factor
g ndash Gramas
G ndash Guanina
GERndash Gasto energeacutetico de repouso
GETndash Gasto energeacutetico total
GLP-1ndash Peptiacutedeo semelhante ao glucagon
GPRndash Receptor acoplado agrave proteiacutena G
H2ndash Hidrogecircnio
HDLndash Lipoproteiacutena de alta densidade
HPRndash Enzimas citoplasmaacuteticas do sistema PTS
IBGEndash Instituto brasileiro de Geografia e Estatiacutestica
IC ndash Intervalo de Confianccedila
IECsndash Ceacutelulas epiteliais intestinais)
IFN-α ndash Interferon α
IFN-β ndash Interferon β
IFN-γ ndash Interferon gama
IgA ndash Imunoglobulina A
IL ndash Interleucina
IL-10 ndash Interleucina 10
IL-1β ndash Interleucina 1Beta
IL-25 ndash Interleucina 25
IL-33 ndash Interleucina 33
IL-6 ndash Interleucina 6
IMC ndash Iacutendice de massa corporal
IPAQ ndash International Physical Activity Questionnaire
kgndash Quilogramas
Kpb ndash Kilopares de bases
LPLndash Lipase lipoproteacuteica
LPSndash Lipopolissacariacutedeos
MAGndash Monoacilglicerol lipase
MAMPsndash Padrotildees moleculares associados agrave micro-organismos
MC4R ndash Receptor da Melanocortina 4
MDa ndash Megadaltons
mg ndash Miligramas
min ndash Minuto
mL ndash Mililitro
mm ndash Miliacutemetro
mM ndash Milimolar
mRNAndash RNA mensageiro
MSndash Ministeacuterio da Sauacutede
NAPE-PLDndash N-acil fostatidiletanolamida-fosfolipase D seletiva
NF-KBndash Fator nuclear Kappa B
NK ndash Natural Killers
nm ndash Nanocircmetro
NODndash Receptores de domiacutenio de digomerizaccedilatildeo de ligaccedilatildeo de
nucleotiacutedeos
NPYndash Neuropeptiacutedeo Y
ordm C ndash Graus Celsius
OMS (WHO) ndash Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede
OR ndash Odds Ratio
pb ndash Pares de base
PC1 ndash Proacute-hormocircnio Convertase 1
PCR ndash Reaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase
PGC-1ndash Peroxisome proliferator-activated receptor-gamma
coactivator 1 alpha
PGCndash Porcentagem de gordura corporal
pH ndash Potencial de hidrogecircnio iocircnico
pmol ndash Picomol
POFndash Pesquisa dos Orccedilamentos Familiares
POMCndash Proacute-oacutepio melanocortina
PPARndash Receptor Ativado por Proliferadores de Peroxissoma
PPI ndash Perda de peso intencional
PPLO ndash Pleuropneumonia-like Organisms
PTSndash Sistema fosfotransferase
PYYndash Peptiacutedeo tirosina-tirosina
QFAndash Questionaacuterio de frequecircncia alimentar
qPCR ndash PCR quantitativa ou PCR em tempo real
r2 ndash R da curva
RA ndash Aacutecido retinoacuteico
RCQndash Relaccedilatildeo cintura-quadril
REGIIIβndash Proteiacutenas antimicrobianas intestinais
REGIIIγndash Proteiacutenas antimicrobianas intestinais
RNA ndash Aacutecido ribonucleacuteico
rpm ndash Rotaccedilotildees por minuto
rRNA ndash RNA ribossocircmico
s ndash Segundo
SNCndash Sistema nervoso central
SREBP-1ndash Liver sterol response element binding protein type-1
SOCS-1 ndash Proteiacutenas supressora da sinalizaccedilatildeo de citocina-1
SOCS-3 ndash Proteiacutenas supressora da sinalizaccedilatildeo de citocina-3
T ndash Timina
TAndash Tecido adiposo
TCLE ndash Termo de Consentimento Livre e Esclarecido
TGF-β ndash Fator de crescimento tumoral-β
TGIndash Trato gastrintestinal
TLR ndash Toll-like receptor
TMndash Tecido muscular
TMBndash Taxa de metabolismo basal
TNF-α ndash Fator de Necrose Tumoral alfa
Tregndash Ceacutelulas T regulatoacuterias
tRNA ndash RNA transportador
TSLPndash Linfopoietina estromal tiacutemica
U ndash Unidade
UFC ndash Unidade Formadora de Colocircnia
UFCmicroL ndash Unidade Formadora de Colocircnia por microlitro
USDAndash United States Departament of Agriculture
VETndash Valor energeacutetico Total
X ndash Vezes
ZO-1ndash Zocircnula de oclusatildeo-1
α ndash Alfa
β ndash Beta
χ2 ndash Teste Qui-quadrado
ndash Por cento
microL ndash Microlitro
microm ndash Microcircmetros
microms ndash Microcircmetros por segundo
2-AGndash 2-araquidonoil glicerol
IacuteNDICE DE FIGURAS
Figura 1 ndash Fatores envolvidos no estabelecimento da microbiota humana ao longo da
vida 37
Figura 2 ndash Interaccedilatildeo funcional entre a microbiota intestinal humana e o sistema
imunoloacutegico 42
Figura 3 ndash Doenccedilas influenciadas pelo metabolismo microbiano
intestinal46
Figura 4 ndash Crescimento de M hominis em meio SP4 com a produccedilatildeo de colocircnia em
forma de ldquoovo fritordquo (aumento 40X) 55
Figura 5 ndash Comparaccedilatildeo entre as meacutedias de consumo de macronutrientes dos Grupos
Caso e Controle com a Faixa de Distribuiccedilatildeo Aceitaacutevel de macronutrientes (AMDRDRI)
e AI (Adequate Intake) para a faixa etaacuteria de 20 a 70 anos Satildeo Paulo SP 2013-
201484
Figura 6 ndash Comparaccedilatildeo entre as meacutedias de consumo das Vitaminas A C E e folato
dos Grupos Caso e Controle com a Faixa de Distribuiccedilatildeo Aceitaacutevel de macronutrientes
(AMDRDRI) e AI (Adequate Intake) para a faixa etaacuteria de 20 a 70 anos Satildeo Paulo
SP 2013-201485
Figura 7 ndash Comparaccedilatildeo entre as meacutedias de consumo das Vitaminas B1 B2 B6 B12
D Niacina e Aacutecido pantotecircnico dos Grupos Caso e Controle com a Faixa de
Distribuiccedilatildeo Aceitaacutevel de macronutrientes (AMDRDRI)e AI (Adequate Intake) para a
faixa etaacuteria de 20 a 70 anos Satildeo Paulo SP 2013-201486
Figura 8 ndash Comparaccedilatildeo entre as meacutedias de consumo de Sais Minerais dos Grupos
Caso e Controle com a Faixa de Distribuiccedilatildeo Aceitaacutevel de macronutrientes
(AMDRDRI)e AI (Adequate Intake) para a faixa etaacuteria de 20 a 70 anos Satildeo Paulo SP
2013-2014 87
Figura 9 ndash Comparaccedilatildeo entre as meacutedias de consumo de Sais Minerais e outros
nutrientes dos Grupos Caso e Controle com a Faixa de Distribuiccedilatildeo Aceitaacutevel de
macronutrientes (AMDRDRI)e AI (Adequate Intake) para a faixa etaacuteria de 20 a 70
anos Satildeo Paulo SP 2013-2014 87
Figura 10ndash Curva-padratildeo gerada a partir dos pontos de Ct obtidos com o graacutefico de
amplificaccedilatildeo de diluiccedilotildees seriadas do controle positivo Mycoplasma hominis calculado
pelo software StepOne 21 (Applied Biosystems Life Technologies Corporation) Satildeo
Paulo SP 2013-201490
Figura 11 ndash Quantificaccedilatildeo por qPCR de Mollicutes (UFCmicrol) a partir das amostras de
fezes nos grupos caso e controle Satildeo Paulo SP 2013-2014 92
Figura 12 ndash Quantificaccedilatildeo por qPCR de Firmicutes Bacteroidetes e Eubacterias
(UFCmicrol) a partir das amostras de fezes nos grupos caso e controle Satildeo Paulo SP
2013-201493
Figura 13 ndash Quantificaccedilatildeo de IL-1β IL-10 IL17-A e TNF-α (pgmL) no plasma
sanguiacuteneo por meio do ELISA nos grupos caso e controle da populaccedilatildeo estudada
Satildeo Paulo SP 2013-201496
IacuteNDICE DE QUADROS
Quadro 1 ndash Criteacuterios utilizados na estimativa da frequecircncia diaacuteria de consumo dos
alimentos incluiacutedos no Questionaacuterio de Frequecircncia Alimentar 61
Quadro 2 ndash Sequecircncias dos iniciadores utilizados para amplificaccedilatildeo do gene 16S rRNA
para Mollicutes 66
Quadro 3 ndash Sequecircncias dos iniciadores utilizados para amplificaccedilatildeo do gene 16S rRNA
para Firmicutes Bacteroidetes e Bacteacuterias Totais69
IacuteNDICE DE TABELAS
Tabela 1 ndash Determinaccedilatildeo do perfil da populaccedilatildeo estudada referente agrave Seccedilatildeo 1 Dados
socioeconocircmicos Satildeo Paulo SP 2013-201472
Tabela 2 ndash Determinaccedilatildeo do perfil da populaccedilatildeo estudada referente agrave Seccedilatildeo 2 Histoacuteria
Familiar Satildeo Paulo SP 2013-201472
Tabela 3 ndash Determinaccedilatildeo do perfil da populaccedilatildeo estudada referente agrave Seccedilatildeo 3 Histoacuteria
Cliacutenica Satildeo Paulo SP 2013-2014 73
Tabela 4 ndash Determinaccedilatildeo do perfil da populaccedilatildeo estudada referente agrave Seccedilatildeo 4 Histoacuteria
Obsteacutetrica Satildeo Paulo SP 2013-2014 74
Tabela 5 ndash Determinaccedilatildeo do perfil da populaccedilatildeo estudada referente agrave Seccedilatildeo 5 Histoacuteria
Ginecoloacutegica Satildeo Paulo SP 2013-2014 75
Tabela 6 ndash Determinaccedilatildeo do perfil da populaccedilatildeo estudada referente agrave Seccedilatildeo 6
Consumo atual de tabaco Satildeo Paulo SP 2013-2014 75
Tabela 7ndash Determinaccedilatildeo do perfil da populaccedilatildeo estudada referente agrave Seccedilatildeo 7
Consumo atual de aacutelcool Satildeo Paulo SP 2013-2014 76
Tabela 8 ndash Tabela de determinaccedilatildeo do perfil da populaccedilatildeo estudada referente agrave Seccedilatildeo
8 Atividade Fiacutesica (IPAQ versatildeo curta) Satildeo Paulo SP 2013-2014 76
Tabela 9 ndash Tabela de determinaccedilatildeo do perfil da populaccedilatildeo estudada referente agrave Seccedilatildeo
9 Mudanccedilas recentes nos haacutebitos alimentares Satildeo Paulo SP 2013-2014 77
Tabela 10 ndash Participaccedilatildeo dos alimentos nos grupos meacutedias de consumo por dia dos
alimentos consumidos pela populaccedilatildeo estudada Satildeo Paulo SP 2013-2014 144
Tabela 11 ndash Definiccedilatildeo dos grupos alimentares derivados do Questionaacuterio de Frequecircncia
Alimentar (QFA) e percentual de consumo da populaccedilatildeo estudada Satildeo Paulo SP
2013-201479
Tabela 12 ndash Anaacutelise de consumo de energia e nutrientes da populaccedilatildeo estudada Satildeo
Paulo SP 2013-2014 81
Tabela 13 ndash Comparaccedilatildeo das variaacuteveis dieteacuteticas relacionadas agraves razotildees de ingestatildeo e
Valor Energeacutetico Total (VET) da populaccedilatildeo estudada Satildeo Paulo SP 2013-2014 83
Tabela 14 ndash Comparaccedilatildeo de variaacuteveis antropomeacutetricas da populaccedilatildeo estudada 89
Tabela 15 ndash Repetibilidade intra-ensaio e inter-ensaio da qPCR para Mollicutes Satildeo
Paulo SP 2013-2014 91
Tabela 16 ndash Comparaccedilatildeo entre os resultados obtidos no teste de sensibilidade pelas
teacutecnicas de PCR convencional e qPCR para detecccedilatildeo de Mollicutes Satildeo Paulo SP
2013-201491
Tabela 17 ndash Nuacutemero meacutedio de coacutepias e percentual dos grupos Mollicutes estudados
frente ao Filo Firmicutes na populaccedilatildeo estudada Satildeo Paulo SP 2013-2014 94
Tabela 18 ndash Nuacutemero meacutedio de coacutepias e percentual dos grupos de bacterianos
estudados frente agraves bacteacuterias totais na populaccedilatildeo estudada Satildeo Paulo SP 2013-
201495
Tabela 19 ndash Proporccedilatildeo de Firmicutes em relaccedilatildeo agrave Bacteroidetes na populaccedilatildeo
estudada Satildeo Paulo SP 2013-201495
SUMAacuteRIO
1 INTRODUCcedilAtildeO 26
2 REFERENCIAL TEOacuteRICO 29
21 Obesidade 29
22 Microbiota Intestinal 31
221 Microbiota intestinal uma peccedila chave na sauacutede e na doenccedila31
222 Colonizaccedilatildeo e composiccedilatildeo da microbiota intestinal32
223 Fatores que influenciam a composiccedilatildeo da microbiota intestinal 34
2231 Fases da vida 34
2232 Tipo de parto 34
2233 Tipo de aleitamento 35
2234 Uso de antibioacutetico 35
2235 Dieta 36
224 Microbiota intestinal e a fisiologia do hospedeiro 38
2241 Nutriccedilatildeo e Metabolismo 38
2242 Proteccedilatildeo 39
22421 Competiccedilatildeo direta de nutrientes 39
22422 Imunomodulaccedilatildeo 40
2243 Funccedilatildeo Troacutefica 43
2244 Regulaccedilatildeo da adiposidade 43
225 Microbiota intestinal e disbiose44
226 Microbiota Intestinal e obesidade47
227 Mecanismos pelos quais a microbiota intestinal contribui para a obesidade49
2271 Extraccedilatildeo de energia adicional da dieta49
2272 Induccedilatildeo da inflamaccedilatildeo por meio da alteraccedilatildeo da permeabilidade intestinal51
23 MOLLICUTES 52
231 Caracteriacutesticas Gerais dos Mollicutes52
232 Mollicutes Microbiota Intestinal e Obesidade56
3 OBJETIVOS 58
31 Objetivo geral 58
32 Objetivos especiacuteficos 58
4 MATERIAL E MEacuteTODOS 59
41 Protocolo do estudo 59
42 Casuiacutestica 59
43 Delineamento experimental 60
44 Determinaccedilatildeo do estado nutricional 60
441 Avaliaccedilatildeo qualitativa do consumo alimentar 60
442 Avaliaccedilatildeo antropomeacutetrica do estado nutricional 62
4421 Anaacutelise da Composiccedilatildeo Corporal pelo Meacutetodo de Bioimpedacircncia 63
45 Coleta das amostras cliacutenicas 64
46 Determinaccedilatildeo da microbiota intestinal 65
461 Padronizaccedilatildeo de reaccedilatildeo de PCR quantitativo (qPCR) por meio de TaqMan para a detecccedilatildeo de
Mollicutes 65
4611 Cepas bacterianas e condiccedilotildees de cultura 65
4612 Desenvolvimento de primers e sonda para a detecccedilatildeo de Mollicutes pela PCR quantitativa 65
4613 PCR quantitativa 66
4614 Especificidade da qPCR e repetibilidade intra e inter-ensaios 67
462 Reaccedilatildeo em cadeia da polimerase (PCR) convencional 68
463 Detecccedilatildeo de micro-organismos dos filos Firmicutes e Bacteroidetes e bacteacuterias totais (Eubacterias)
por PCR em tempo Real (qPCR) 68
47 Dosagem de citocinas do soro sanguiacuteneo 69
48 Anaacutelises Estatiacutesticas 70
5 RESULTADOS 71
51 Perfil da populaccedilatildeo estudada 71
52 Determinaccedilatildeo do estado nutricional 78
521 Avaliaccedilatildeo qualitativa do consumo alimentar 78
522 Avaliaccedilatildeo antropomeacutetrica do estado nutricional 88
53 Determinaccedilatildeo da microbiota intestinal 90
531 Padronizaccedilatildeo de reaccedilatildeo de PCR quantitativo (qPCR) por meio de TaqMan para a detecccedilatildeo de
Mollicutes 90
532 Detecccedilatildeo de micro-organismos dos filos Firmicutes e Bacteroidetes aleacutem de bacteacuterias totais
(Eubacterias) por PCR em tempo Real (qPCR) 93
54 Dosagem de citocinas do soro sanguiacuteneo 96
6 DISCUSSAtildeO 97
7 CONCLUSOtildeES 107
REFEREcircNCIAS 108
APEcircNDICE A ndash TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO 127
APEcircNDICE B ndash QUESTIONAacuteRIO 131
APEcircNDICE C- TABELA 10 143
26
1 INTRODUCcedilAtildeO
A obesidade eacute definida pela Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede (WHO 2002)
como o excesso de gordura corporal acumulada no tecido adiposo com implicaccedilotildees
para a sauacutede Algumas estimativas globais recentes indicam que em 2013 mais de
600 milhotildees da populaccedilatildeo mundial adulta (com 18 anos ou mais) eram obesos com
11 dos homens e 15 das mulheres (MARIE 2014) No Brasil em 2014 estimou-
se que na populaccedilatildeo adulta (20 anos ou mais) 105 milhotildees satildeo obesos com 124
dos homens e 169 das mulheres (IBGE 2014) Nesse contexto atualmente a
obesidade estaacute entre os maiores problemas de sauacutede puacuteblica e distuacuterbio da nutriccedilatildeo
A obesidade eacute considerada atualmente uma epidemia (BACON APHRAMOR 2011
OLSHANSKY et al 2005) As alteraccedilotildees nos padrotildees dieteacuteticos e nutricionais da
populaccedilatildeo brasileira tecircm sido analisadas no processo da transiccedilatildeo nutricional (KAC
VELAacuteSQUEZ-MELEacuteNDEZ 2003)
Neste processo verificou-se que ocorreu inversatildeo nos padrotildees de distribuiccedilatildeo
das alteraccedilotildees nutricionais A alta incidecircncia de sobrepeso e obesidade na
populaccedilatildeo implica no aumento da ocorrecircncia de doenccedilas cardiovasculares cacircncer
diabetes mellitus e hipertensatildeo arterial (AMUNA ZOTOR 2008 ARAI et al 2009
DUNCAN et al 1993 GIGANTE et al 1997 JIRTLE SKINNER 2007 KAC
VELAacuteSQUEZ-MELEacuteNDEZ 2003 LESSA 1998 MONDINI MONTEIRO 1998
POPKIN et al 2006) Na obesidade ocorre basicamente o balanccedilo energeacutetico
positivo cuja patogecircnese natildeo estaacute completamente elucidada estando associada a
fatores comportamentais culturais e bioloacutegicos A regulaccedilatildeo do balanccedilo energeacutetico e
do estoque de energia corporal satildeo influenciados pela susceptibilidade individual e
seu contexto social e econocircmico demograacutefico cultural educacional ambiental e
familiar aleacutem de fatores hormonais e de heranccedila geneacutetica (GORAN 2000 VEIGA
SICHIERI 2006)
O mapa gecircnico da obesidade humana estaacute constantemente em mudanccedila pela
identificaccedilatildeo de novos genes e regiotildees cromossocircmicas associadas com a
obesidade As alteraccedilotildees do comportamento alimentar e os haacutebitos sedentaacuterios
indicam ser os principais fatores de interferecircncia nos genes de susceptibilidade a
obesidade e consequentemente no aumento da obesidade mundial Eacute provaacutevel
27
portanto que a obesidade ocorra como a resultante de fatores poligecircnicos
complexos e um ambiente obesogecircnico (dieta e sedentarismo) (BAJZER SEELEY
2006 BOUCHARD 2000 CANI et al 2007 DERAM VILLARES 2009 DUNCAN et
al 2008 TURNBAUGH et al 2009)
A captaccedilatildeo de energia pode justificar em parte o metabolismo de alguns
pacientes obesos que natildeo apresentam ingestatildeo alimentar excessiva sugerindo que
a microbiota intestinal pode predispor o indiviacuteduo agrave obesidade (BACKHED 2004)
Alguns estudos tecircm demonstrado que o desenvolvimento da obesidade em
humanos pode ser determinado pelas proporccedilotildees relativas de dois filos principais de
bacteacuterias da microbiota intestinal humana Bacteroidetes e Firmicutes que diferem
consideravelmente entre indiviacuteduos eutroacuteficos e obesos (DUNCAN et al 2008 LEY
et al 2005 2006 TENNYSON FRIEDMAN 2008) Estudos comparativos
mostraram que ratos obesos possuem significativamente niacuteveis mais baixos de
micro-organismos do Filo Bacteroidetes e niacuteveis mais elevados de Firmicutes Este
uacuteltimo estaacute associado com um aumento de absorccedilatildeo de energia da dieta
(BACKHED 2004 CANI DELZENNE 2009 DIBAISE et al 2012 LEY et al 2005
RAOULT 2008 TURNBAUGH et al 2006) Turnbaugh et al (2008) obtiveram
resultados semelhantes em ratos com obesidade induzida por dieta Curiosamente
embora as alteraccedilotildees nos niacuteveis de Firmicutes e Bacteroidetes foram observadas
nos camundongos obesos por dieta induzida a diferenccedila foi relacionada
principalmente as bacteacuterias da classe dos Mollicutes
As espeacutecies do Filo Bacteriodetes pertencem agrave microbiota intestinal humana e
animal Estas bacteacuterias satildeo bacilos ou cocobacilos gram-negativos anaeroacutebios
obrigatoacuterios heterotroacuteficos mesoacutefilos sacaroliacuteticos natildeo formadores de esporos
imoacuteveis Satildeo resistentes agrave bile natildeo produzem pigmentos Tecircm como principais
produtos finais do metabolismo da glicose os aacutecidos succiacutenico e aceacutetico
(JOHANSSON PETTERSON 2002 MANILOFF 2002) O Filo Firmicutes
encontrado em maior proporccedilatildeo no trato gastrintestinal humano satildeo micro-
organismos Gram positivos na maioria Na classificaccedilatildeo atual o filo divide-se
tipicamente em trecircs classes Bacilli - aeroacutebios facultativos ou obrigatoacuterios Clostridia -
organismos anaeroacutebios e Erysipelotrichia Mollicutes eacute a uacutenica classe do filo
Tenericutes anteriormente classificada dentro do filo Firmicutes (BERGEYrsquos 2009
2010 LUDWIG KLENK 2001 RAZIN et al 1998)
28
Os estudos das interaccedilotildees de Bacteroidetes e Firmicutes na microbiota
intestinal e sua associaccedilatildeo com a obesidade tecircm aumentado No entanto a
participaccedilatildeo dos Mollicutes eacute praticamente desconhecida O gecircnero Mycoplasma foi
introduzido em 1929 para designar micro-organismos atualmente classificados
como membros da famiacutelia Mycoplasmataceae ordem Mycoplasmatales da classe
dos Mollicutes (Mollis = mole cuacutetis = pele) (RAZIN 1992) Os Mollicutes possuem
um genoma pequeno sendo que algumas espeacutecies apresentam o menor genoma
entre os procariotos e em consequecircncia apresentam metabolismo reduzido
(MILES NICHOLAS 1998 NEIMARK 1986 RAZIN TULLY 1983) Distinguem-se
de outros procariotos pela simplicidade celular genoma e metabolismo reduzido A
ausecircncia natural da parede celular confere resistecircncia aos antibioacuteticos beta-
lactamicos Incluem-se as sulfas e rimfapicina respectivamente pela ausecircncia da
siacutentese de aacutecido foacutelico e possuir uma polimerase diferente Com aproximadamente
200 espeacutecies estes micro-organismos infectam humanos animais insetos e
plantas Considerados em geral como oportunistas por excelecircncia colonizam
ldquopreferencialmenterdquo a superfiacutecie de mucosas de mamiacuteferos mas tecircm potencial de
causar infecccedilotildees sistecircmicas dependendo do hospedeiro (DYBVIG 1990 RAZIN
YOGEV NAOT 1998)
29
2 REFERENCIAL TEOacuteRICO
21 Obesidade
A prevalecircncia da obesidade tem crescido rapidamente e representa um dos
principais desafios de sauacutede puacuteblica neste seacuteculo A Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede
(OMS) estima que pelo menos 28 milhotildees de pessoas morrem em decorrecircncia da
obesidade (IMC ge 30 kgm2) A prevalecircncia mundial quase duplicou entre 1980 e
2008 com uma transiccedilatildeo de 5 dos homens e 8 das mulheres em 1980 para
10 dos homens e 14 das mulheres (WHO 2014) A obesidade pode ser definida
como o grau de armazenamento de gordura no organismo associada ao ganho
excessivo de peso corporal total Eacute portanto considerada uma doenccedila crocircnica
podendo acarretar em consequecircncias para a sauacutede devido agraves suas relaccedilotildees com
diversas complicaccedilotildees metaboacutelicas (MS 2006)
A pesquisa dos Orccedilamentos Familiares (POF IBGE 2010) nos uacuteltimos seis
anos indicou que a frequecircncia de pessoas com excesso de peso aumentou em mais
de um ponto percentual ao ano Desta maneira em dez anos o excesso de peso
poderia alcanccedilar dois terccedilos da populaccedilatildeo adulta do Brasil magnitude idecircntica agrave
encontrada na populaccedilatildeo dos Estados Unidos Estimativas de inqueacuteritos nacionais e
internacionais das uacuteltimas deacutecadas indicam que a obesidade em 2025 alcance 40
da populaccedilatildeo nos EUA 30 na Inglaterra e 20 no Brasil (HU 2008)
O excesso de peso e a obesidade na populaccedilatildeo expressam essencialmente
o desequiliacutebrio entre ingestatildeo e utilizaccedilatildeo de calorias A justificativa estaacute na
mudanccedila dos padrotildees de alimentaccedilatildeo e de atividade fiacutesica Em 2002-2003 revelou-
se tendecircncia crescente de substituiccedilatildeo de alimentos baacutesicos e tradicionais na dieta
brasileira (como arroz feijatildeo e hortaliccedilas) por bebidas e alimentos industrializados
(como refrigerantes biscoitos carnes processadas e comida pronta) Caracteriza-se
portanto o aumento na densidade energeacutetica das refeiccedilotildees e padrotildees de
alimentaccedilatildeo capazes de comprometer a auto-regulaccedilatildeo do balanccedilo energeacutetico dos
indiviacuteduos e aumentar o risco de obesidade (LEVY-COSTA et al 2005)
Aleacutem disto em consequecircncia agrave obesidade tem sido observado aumento
consideraacutevel da prevalecircncia de doenccedilas crocircnicas natildeo transmissiacuteveis como doenccedilas
cardiovasculares cacircncer diabetes mellitus e hipertensatildeo arterial Pelo longo tempo
30
de evoluccedilatildeo destas doenccedilas ocorrem lesotildees irreversiacuteveis de intensidade variada
resultando no aumento de incapacidade ou oacutebito vecircm ocupando um maior espaccedilo
no perfil de morbimortalidade de populaccedilotildees latino americanas (DUNCAN et al 1993
LESSA 1998) Em importante estudo entre 1958 e 1951 envolvendo cinco mil
indiviacuteduos de 35 a 75 anos por periacuteodo de ateacute 44 anos a obesidade (IMC gt 30Kgm2)
foi independentemente associada ao maior risco para hipertensatildeo (mulheres
RR=26 IC95 22-31) diabetes tipo 2 (mulheres RR=14 IC95 1-18) e doenccedila
cardiovascular mulheres RR=14 IC95 11-17) (WILSON et al 2002) Os ganhos
na diminuiccedilatildeo das taxas de tabagismo ao longo do seacuteculo XX e as expectativas no
aumento de tempo de vida podem ser neutralizadas pelas prespectivas do aumento
da obesidade (STEWART et al 2009) Especialmente em paiacuteses em
desenvolvimento como o Brasil o custo anual para o Sistema Uacutenico de Sauacutede para
atender as doenccedilas relacionadas ao sobrepeso eacute estimado em US$ 20152102171
(BAHIA et al 2012)
O ganho de peso ocorre pela menor utilizaccedilatildeo de gordura como fonte de
energia do que oxidar carboidratos elevando o coeficiente respiratoacuterio obtido
atraveacutes da razatildeo entre a produccedilatildeo de gaacutes carbocircnico resultante da oxidaccedilatildeo de
carboidratos e o consumo de oxigecircnio determinado atraveacutes de calorimetria (MARRA
et al 2004) Seis lesotildees monogecircnicas principais produzem desordens endoacutecrinas
que resultam na obesidade Deficiecircncia congecircnita de Leptina defeitos no receptor
de Leptina deficiecircncia no proacute-hormocircnio convertase 1(PC1) deficiecircncia em proacute-oacutepio-
melanocortina (POMC) defeitos no receptor da Melanocortina 4 (MC4R) e defeitos
no Receptor Ativado por Proliferadores de Peroxissoma (PPAR) O controle da
ingestatildeo alimentar a curto prazo eacute controlado principalmente por vias de
sinalizaccedilatildeo que emanam do trato gastrintestinal incluindo o peptiacutedeo orexiacutegenico
grelina que ativa os sinais de fome e os peptiacutedeos anorexigecircnicos
colecistoquinina (CCK) peptiacutedeo similar ao glucagon 1- glucagon-like peptide 1
(GLP-1) e peptiacutedeo tirosina-tirosina (PYY) que geram sinais de saciedade Para o
controle da ingestatildeo agrave longo prazo parecem ser primordiais os sinais que emanam a
partir do tecido adiposo (leptina) e pacircncreas (insulina) liberados em resposta agrave
ingestatildeo de alimentos e depoacutesitos de gordura corporal (KONTUREK et al 2004)
Tem sido amplamente documentado na literatura o reganho de peso
sucessivo agraves dietas pois sabe-se que cerca de um a dois terccedilos do peso perdido
31
tendem a ser recuperados no ano seguinte sendo a recuperaccedilatildeo quase total ao final
de cinco anos (GOODRICK et al 1996) A partir disso tem sido questionado o
efeito das dietas restritivas sobre a biologia humana e sua contribuiccedilatildeo para tornar a
obesidade uma condiccedilatildeo que possivelmente se autoperpetua e se agrava de
maneira progressiva Diversos trabalhos mostram que a ciclagem de peso (ou efeito
sanfona) pode aumentar a suscetibilidade para o ganho de massa corporal no
futuro (KORKEILA et al1999 NEUMARK-SZTAINER et al 2006 2007)
22 Microbiota Intestinal
221 Microbiota intestinal uma peccedila chave na sauacutede e na doenccedila
Nas deacutecadas passadas acreditava-se que todos os micro-organismos da
microbiota possuiacuteam potencial de causar infecccedilotildees O estudo da interaccedilatildeo entre
micro-organismos e o desenvolvimento de enfermidades eacute um tema crescente na
justificativa de certas doenccedilas (DETHLEFSEN et al 2007) O termo microbiota
refere-se ao conjunto de micro-organismos no hospedeiro sadio e o termo
microbioma eacute o conjunto de genes microbianos (BACKHED 2004 LANGA 2006
VRIEZE 2010) O estudo da diversidade e distribuiccedilatildeo da microbiota e sua interaccedilatildeo
com hospedeiro tem contribuiacutedo na justificativa de algumas doenccedilas (LEY et al
2008 VENTURA et al 2008) A microbiota do trato gastrintestinal humano eacute o
ecossistema mais complexo constituiacutedo por diversas espeacutecies de micro-organismos
As bacteacuterias constituem o grupo com maior diversidade e abundacircncia Assim como o
genoma de cada indiviacuteduo eacute uma impressatildeo digital a composiccedilatildeo da microbiota
intestinal tambeacutem parece ser (LEY et al 2006 RAJILIĆ-STOJANOVIĆ SMIDT DE
VOS 2007 XU GORDON 2003)
O comensalismo e a simbiose bacteriana refletem uma ldquocorrida dinacircmicardquo
que se inicia no encontro da bacteacuteria com o hospedeiro vulneraacutevel e prossegue com
respostas adaptativas entre os dois organismos Em alguns casos a coevoluccedilatildeo
atenua a virulecircncia e conduz a uma coexistecircncia paciacutefica com ou sem franca
codependecircncia Em outras circunstacircncias a relaccedilatildeo patogecircnica eacute mantida por meio
da superaccedilatildeo dos mecanismos de defesas inatas ou adaptativas do hospedeiro
pelas bacteacuterias (GORDON HOOPER 2001) Estima-se que a microbiota intestinal eacute
composta por mais de 1000 espeacutecies bacterianas O nuacutemero de ceacutelulas microbianas
32
no luacutemen intestinal eacute de 10 vezes maior que as ceacutelulas eucarioacuteticas do organismo
representando em torno de 1 kg de peso corporal (SCARPELLINI 2010) Aleacutem
disso o microbioma eacute 100 vezes maior que o genoma humano podendo-se assim
considerar a microbiota intestinal como um oacutergatildeo virtual exteriorizado
metabolicamente adaptaacutevel e flexiacutevel aleacutem de rapidamente renovaacutevel o que
contribui para metabolismo e desempenha importante papel na obtenccedilatildeo de energia
da dieta (FRANCcedilOIS-PIERRE 2009)
A microbiota intestinal eacute crucial para a vida humana com impacto na fisiologia
e na nutriccedilatildeo do hospedeiro (HATTORI TAYLOR 2008) Considera-se que
humanos satildeo ldquosuperorganismosrdquo com metabolismo mediado pelos atributos
humanos e microbianos (GILL et al 2006) O conceito de ldquosuperorganismordquo
representa importante mudanccedila de paradigma no entendimento da biologia humana
e pode ter impacto expressivo na prevenccedilatildeo e na terapia de doenccedilas no futuro
(NICHOLSON 2006)
222 Colonizaccedilatildeo e composiccedilatildeo da microbiota intestinal
O trato gastrintestinal fetal eacute considerado praticamente esteacuteril No nascimento
eacute rapidamente colonizado por micro-organismos da matildee e do ambiente hospitalar
(PALMER et al 2007) Sugere-se que de trecircs a quatro semanas apoacutes o nascimento
a microbiota intestinal comeccedila a se estabilizar aumentando gradualmente a sua
complexidade Apoacutes um ano assemelha-se agrave microbiota de um adulto (MACKIE et
al 1999 PALMER et al 2007 SCHEacuteLE et al 2013) Contrapondo-se agrave percepccedilatildeo
da ausecircncia de micro-organismos no feto demonstrou-se a presenccedila de DNA
bacteriano na placenta e no cordatildeo umbilical (JIMEacuteNEZ et al 2005 SATOKARI et
al 2009) Aleacutem disso a identificaccedilatildeo de algumas bacteacuterias no mecocircnio explica a
origem dos primeiros micro-organismos colonizadores do intestino antes mesmo do
nascimento possivelmente como um mecanismo adaptativo para o desenvolvimento
do intestino fetal fora do organismo materno (JIMEacuteNEZ et al 2008)
Os micro-organismos presentes no trato gastrintestinal podem ser autoacutectones
ou aloacutectones Linhagens autoacutectones tecircm longa associaccedilatildeo com o hospedeiro e
formam uma populaccedilatildeo estaacutevel de tamanho caracteriacutestico em uma regiatildeo do
intestino Os organismos aloacutectones satildeo adquiridos principalmente atraveacutes dos
alimentos ingeridos e do ecossistema oral Eacute difiacutecil determinar se um organismo eacute
33
um autoacutectone verdadeiro Contudo as bacteacuterias aloacutectones natildeo persistem no
ecossistema e satildeo detectaacuteveis apenas por um periacuteodo limitado (GORDON
HOOPER 2001 LEY et al 2006 WALTER 2008)
Os micro-organismos satildeo encontrados em todo o trato gastrintestinal no
entanto as mudanccedilas nas condiccedilotildees fisioloacutegicas implicam diferenccedilas na
composiccedilatildeo de micro-organismos nos diversos locais No trato gastrintestinal
inferior o fluxo do conteuacutedo torna-se mais lento e o ambiente conteacutem menos
substacircncias antimicrobianas favorecendo a colonizaccedilatildeo microbiana e o
estabelecimento de maior densidade de micro-organismos (QIN et al 2010
ZOETENDAL et al 2006) A partir da cavidade oral ao acircnus tem sido observado o
aumento da densidade microbiana no jejuno iacuteleo e no intestino grosso em
comparaccedilatildeo com o estocircmago e duodeno O coacutelon refere-se a um ecossistema
complexo com ampla diversidade microbiana e presenccedila de diversos gecircneros
bacterianos O pH neutro e a abundacircncia relativa de nutrientes como os
carboidratos natildeo digeriacuteveis e outros componentes alimentares que escapam do
processo digestivo tornam o coacutelon um ambiente favoraacutevel agrave proliferaccedilatildeo microbiana
O coacutelon eacute a regiatildeo do TGI que apresenta maior densidade microbiana podendo
alcanccedilar 1014UFCg-1 Dados tem mostrado que cada indiviacuteduo carrega mais de
1000 filotipos que representam mais de 7000 linhagens (AZAD et al 2013
ECKBURG et al 2005 FRANK et al 2007 HOLZAPFEL 2006 KLEEREBEZEM
VAUGHAN 2009 LEY et al 2008 QUIGLEY 2013 ZOETENDAL et al 2006)
Aproximadamente 99 dos genes identificados por metagenoma do intestino
humano satildeo bacterianos Na maioria dos indiviacuteduos cerca de 90 dos filos satildeo
Firmicutes e Bacteroidetes seguidos por Actinobacterias (famiacutelia Bifidobacteriaceae)
e Proteobacterias (famiacutelia Enterobacteriaceae) O filo mais abundante refere-se ao
Firmicutes apresentando como principais integrantes as classes Bacilli Clostridia e
Molicutes e dos Bacteroidetes as classes Bacteroides Flavobacteria e
Sphingobacterias Os filos Actinobacterias e Proteobacterias se apresentam em
menor proporccedilatildeo (ARUMUGAM et al 2011 DE FILIPPO et al 2010
HUTTENHOWER et al 2012 QIN et al 2010 QUIGLEY 2013 VILLANUEVA-
MILLAacuteN et al 2015 VRIEZE 2010 ZOETENDAL et al 2006)
34
223 Fatores que influenciam a composiccedilatildeo da microbiota intestinal
A microbiota do TGI humano eacute uma comunidade complexa cuja composiccedilatildeo
eacute inconstante diferindo inter e intra-individualmente definida por uma seacuterie de
fatores como geneacutetica do hospedeiro alimentaccedilatildeo sucessatildeo bacteriana funccedilatildeo
imune e estado de sauacutede (LEY et al 2008 EVERARD et al 2011 2014)
2231 Fases da vida
A diversidade bacteriana no intestino infantil eacute inicialmente muito baixa ateacute os
dois anos ao contraacuterio da microbiota de adulto (GAREAU et al 2010 HAJELA et al
2015) A baixa diversidade de bacteacuterias na primeira infacircncia inibe a maturaccedilatildeo
regular da microbiota intestinal e maturaccedilatildeo tardia da mucosa do sistema
imunoloacutegico implicando em riscos do aumento da resposta imune assim como
doenccedilas aleacutergicas Neste contexto envolve o desenvolvimento da toleracircncia oral e a
susceptibilidade da crianccedila a alergias e inflamaccedilatildeo A microbiota sofre portanto
mudanccedilas substanciais nos extremos da vida essas ramificaccedilotildees ainda estatildeo sendo
exploradas (AURELI et al 2011 HAJELA et al 2015 SHERIDAN et al 2014
SMITH et al 2013)
2232 Tipo de parto
A microbiota maternal eacute uma fonte de micro-organismos para a colonizaccedilatildeo do
TGI do receacutem-nascido As bacteacuterias residentes no canal vaginal e na regiatildeo perineal
tambeacutem ganham acesso ao TGI de receacutem-nascidos (BRY et al 1996 MACKIE et
al 1999) Ocorrem diferenccedilas entre o microbioma de um bebecirc receacutem-nascido por
parto normal em comparaccedilatildeo ao bebecirc receacutem-nascido por parto cesaacuterea No parto
vaginal o bebecirc eacute colonizado por bacteacuterias vaginais e fecais maternas cujas
composiccedilatildeo microbiana reflete a microbiota intestinal materna composta
predominantemente pelos gecircneros Lactobacillus Prevotella Atopobium e Sneathia
As amostras fecais de bebecircs nascidos de parto cesariana apresentaram gecircneros
tiacutepicos de microbiota da pele e do ambiente hospitalar predominantemente
Staphylococcus e C difficile Estes bebecircs tambeacutem apresentaram niacuteveis
significativamente mais baixos de Bifidobacterium e diversidade bacteriana menor do
que os bebecircs nascidos por parto normal Estas diferenccedilas podem justificar o
aumento do risco de doenccedilas especiacuteficas em bebecircs receacutem-nascidos por parto
35
cesariana agrave longo prazo (AZAD et al 2013 BELLO et al 2010 COLLADO et al
2012 DOMINGUEZ- PENDERS et al 2006 PRINCE et al 2014)
As diferenccedilas no processo de colonizaccedilatildeo intestinal decorrentes do tipo de
parto poderiam refletir-se no desenvolvimento do sistema imunoloacutegico visto que os
micro-organismos gastrintestinais influenciam esse processo por meio do envio de
importantes sinais regulatoacuterios necessaacuterios para o desenvolvimento da adequada
toleracircncia ao ambiente (BIASUCCI et al 2008 CARDWELL et al 2008
DOMINGUEZ-BELLO et al 2010 KOENIG et al 2011 MORELLI et al 2008
RENZ-POLSTER et al 2005)
2233 Tipo de aleitamento
O leite materno humano eacute considerado um dos principais fatores da iniciaccedilatildeo e
no desenvolvimento da microbiota do neonato uma vez que conteacutem substratos
(prebioacuteticos) para estimular o crescimento bacteriano e tambeacutem eacute fonte de micro-
organismos Estima-se que o consumo de 800 ml de leite materno por dia
proporcione 1 x 105 a 1 x 107 micro-organismos comensais durante a amamentaccedilatildeo
(MARTIN et al 2004) Desta maneira a contagem de Bifidobacterium aumenta
drasticamente Lactobacillus e Bacteroides aumentam em menor proporccedilatildeo e
enterobacteacuterias e enterococos diminuem Espeacutecies de Bifidobacterium
correspondem de 80 a 90 do total dos componentes da microbiota fecal infantil
presentes em bebecircs amamentados por leite materno Jaacute em receacutem-nascidos
alimentados com foacutermulas infantis a microbiota tem demonstrado ser muito mais
complexa sendo composta por Bifidobacterium Bacteroides Clostridium e
Streptococcus (ADLERBERTH WOLD 2009 CUMMINS THOMPSON 1997 DE
SANTA BARBARA et al 2003 DONOVAN ODIE 1994 DONOVAN 2006 MACKIE
et al 1999 MARQUES et al 2010 MCCRACKEN LORENZ 2001 PALMER
2011 POROYKO et al 2010)
2234 Uso de antibioacutetico
A eventual antibioticoterapia interfere tambeacutem no equiliacutebrio da microbiota A
disbiose (alteraccedilatildeo da microbiota) depende de fatores como espectro de accedilatildeo da
droga idade e dieta do indiviacuteduo dosagem e duraccedilatildeo do tratamento via de
administraccedilatildeo propriedades farmacocineacuteticas e farmacodinacircmicas aleacutem de grau de
36
resistecircncia da comunidade (LEY 2000 SULLIVAN et al 2001) A seleccedilatildeo de
bacteacuterias resistentes a drogas pela antibioticoterapia eacute um problema mundial Os
genes de resistecircncia passam para diversos gecircneros bacterianos no intestino A
aquisiccedilatildeo de genes de resistecircncia confere benefiacutecios a determinada espeacutecie
bacteriana diante da pressatildeo seletiva exercida pelo antibioacutetico Quando essa
pressatildeo seletiva eacute suspensa a cepa resistente apresenta menor desempenho em
comparaccedilatildeo com a espeacutecie susceptiacutevel No entanto esse clone menos competitivo
pode compensar essa perda de desempenho pela aquisiccedilatildeo de mutaccedilotildees
compensatoacuterias (JERNBERG et al 2010) No intestino os antibioacuteticos aleacutem de
selecionarem bacteacuterias resistentes tambeacutem aumentam o nuacutemero de transferecircncias
do pool de genes de ceacutelulas resistentes (DETHJEFSEN et al 2008 KARAMI et al
2007 YANG et al 2009)
2235 Dieta
Muitos estudos tem sido realizados no intuito de compreender a relaccedilatildeo entre o
consumo alimentar e a composiccedilatildeo da microbiota intestinal principalmente no
sentido de uma dieta ocidentalizada baseada em alimentos ricos em carboidratos
simples lipiacutedios e proteiacutenas de origem animal sal e poucos alimentos in natura
como frutas e hortaliccedilas ao comparar se com a dietas dos nossos antepassados
caracterizada pelo consumo de grandes quantidades de amido fibras e
polissacaacuteridos vegetais aleacutem de pequenas quantidades de gordura e proteiacutena
animal Em modelos murinos de obesidade induzida por padratildeo de dieta ocidental
no qual animais geneticamente idecircnticos que herdaram microbiotas semelhantes a
relaccedilatildeo entre dieta e representantes microbianos eacute dinacircmica e ajustaacutevel impactando
a capacidade da microbiota de promover a adiposidade no hospedeiro (CARMODY
et al 2015 DAVID et al 2014 DE FILIPPO et al 2010 FLEISSNER et al 2010
HILDEBRANDT et al 2009 LEY et al 2008 MENDONCcedilA ANJOS 2004 WALKER
et al 2011 WONG et al 2012 WU et al 2011)
Uma vez que a microbiota foi estabelecida nestes primeiros anos observa-se
um aumento na composiccedilatildeo microbiana tanto na diversidade quanto na riqueza
atingindo a mais alta complexidade em adultos com vaacuterias centenas de filotipos e
niacuteveis de espeacutecie Cada indiviacuteduo humano atinge um cliacutemax de composiccedilatildeo
homeostaacutetico o que provavelmente permanece relativamente estaacutevel durante a
37
maior parte da vida de um adulto saudaacutevel Nas fases tardias da vida a composiccedilatildeo
da microbiota torna-se novamente menos diversificada e mais dinacircmica
caracterizada por uma maior proporccedilatildeo de Bacteroidetes para Firmicutes aumento
de Proteobacteria e diminuiccedilatildeo da Bifidobacterium (MACKIE 1999 OTTMAN et al
2012 RAUTAVA et al 2012 VILLANUEVA-MILLAacuteN et al 2015) (Figura 1)
Figura 1 ndash Fatores envolvidos no estabelecimento da microbiota humana ao longo
da vida
Adaptado de MJ Villanueva-Millaacuten et al 2015
38
224 Microbiota intestinal e a fisiologia do hospedeiro
O intestino representa a interface natural entre microbiota intestinal e o
hospedeiro sendo a mucosa intestinal a localizaccedilatildeo principal para a interaccedilatildeo de
micro-organismos e antiacutegenos com o hospedeiro por meio de intenso cross-talk
(KINROSS et al 2011) Os achados de estudos cliacutenicos e experimentais tecircm
evidenciado que a interaccedilatildeo microbiotahospedeiro pode influenciar favoravelmente
a sauacutede do hospedeiro de diversas maneiras Ateacute agora as principais funccedilotildees
conhecidas da microbiota podem ser classificadas em quatro grupos metaboacutelica
(nutriccedilatildeo e digestatildeo) proteccedilatildeo (proteccedilatildeo contra agentes patogecircnicos
imunomodulaccedilatildeo) troacutefica (controle da proliferaccedilatildeo de ceacutelulas epiteliais e
diferenciaccedilatildeo) e regulaccedilatildeo da adiposidade
2241 Nutriccedilatildeo e Metabolismo
A microbiota intestinal eacute um importante fator que afeta a extraccedilatildeo de energia a
partir da dieta e do armazenamento de energia no hospedeiro A fim de realizar
estas funccedilotildees as enzimas metaboacutelicas da microbiota intestinal como as glicosidases
e polissacaridases tecircm a capacidade de extrair energia a partir de nutrientes
inacessiacuteveis uma vez que estas enzimas satildeo capazes de clivar ligaccedilotildees glicosiacutedicas
presentes em alguns polissacariacutedeos de plantas e fibras dieteacuteticas (BACKHED et al
2004 2005 GUARNER MALAGELADA 2003) Os polissacariacutedeos natildeo digeriacuteveis
como a oligofrutose (inulina) satildeo metabolizados pela microbiota colocircnica em
oligossacariacutedeos e monossacariacutedeos e entatildeo fermentados a aacutecidos graxos de
cadeia curta (AGCC) particularmente acetato propionato e butirato Estes AGCC
satildeo rapidamente absorvidos O Butirato fornece energia para o metabolismo celular
enquanto acetato e propionato seguem para a corrente sanguiacutenea sendo
transportados para o fiacutegado e oacutergatildeos perifeacutericos onde podem atuar como substratos
para a gliconeogecircnese e lipogecircnese (SHEN et al 2013 ZAIBI et al 2010)
A microbiota intestinal tambeacutem induz a expressatildeo do peptiacutedeo YY (PYY)
anorexigecircnico que geram sinais de saciedade atraveacutes de um mecanismo
dependente do receptor GPR41 Assim a produccedilatildeo de AGCC pela microbiota
intestinal estaacute associada com um aumento na saciedade e uma reduccedilatildeo na ingestatildeo
de alimentos no hospedeiro o qual por sua vez controla o ganho de peso corporal
(CLUNY et al 2015 SHEN et al 2013 ZAIBI et al 2010) Outros mecanismos
39
pelos quais as bacteacuterias do intestino podem influenciar metabolismo do colesterol
satildeo induzidos atraveacutes de Fasting Induced Adipocyte Factor (FIAF) que eacute
seletivamente suprimida no epiteacutelio intestinal pela microbiota intestinal (MARTINEZ
et al 2009)
Tambeacutem tem sido relatado o envolvimento da microbiota intestinal na
metabolizaccedilatildeo de polifenoacuteis que contribuem para o seu potencial antioxidante e
accedilotildees beneacuteficas aleacutem de siacutentese de algumas vitaminas como B12 e K aleacutem da
induccedilatildeo da expressatildeo do receptor de vitamina D pelos AGCC aumentando a sua
absorccedilatildeo e regulando o metabolismo do caacutelcio (BRENCHLEY DOUEK 2012
GUARNER MALAGELADA 2003 KIM et al 1998 MANACH DONOVAN 2004
RESTA 2009 SCALBERT WILLIAMSON 2000) Finalmente a microbiota intestinal
tambeacutem eacute capaz de executar uma seacuterie de biotransformaccedilotildees em xenobioacuteticos
como drogas e seus metaboacutelitos em formas que podem afetar sua absorccedilatildeo e
biodisponibilidade (WILSON NICHOLSON 2009) Neste contexto tem sido
demonstrado que a microbiota intestinal metaboliza toacutexicos e compostos
potencialmente canceriacutegenos tais como pirolisatos (BRENCHLEY DOUEK 2012)
2242 Proteccedilatildeo
Tem sido observado que a ausecircncia da microbiota intestinal torna o organismo
suscetiacutevel agrave infecccedilatildeo Alguns dos mecanismos envolvidos nessas accedilotildees protetoras
incluem competiccedilatildeo direta de nutrientes limitados e a modulaccedilatildeo de respostas
imunoloacutegicas no hospedeiro (GUARNER MALAGELADA 2003 KAMADA et al
2013 SEKIROV et al 2010)
22421 Competiccedilatildeo direta de nutrientes
Vaacuterios mecanismos tecircm sido implicados na resistecircncia agrave colonizaccedilatildeo do trato
gastrintestinal por patoacutegenos A camada de muco intestinal eacute capaz de manter
mutualismos mantendo as bacteacuterias no compartimento e restringindo estimulaccedilatildeo
imunoloacutegica ostensiva O hospedeiro fornece ativamente os nutrientes que a
microbiota precisa e a microbiota indica a quantidade de nutrientes que satildeo
necessaacuterios para o hospedeiro Esta relaccedilatildeo impede superproduccedilatildeo indesejada do
nutriente o que favoreceria a intrusatildeo de micro-organismos competitivos com
potencial de patogenicidade Finalmente as bacteacuterias podem inibir o crescimento
40
dos seus concorrentes produzindo peptiacutedeos antimicrobianos ou proteiacutenas
conhecidas como bacteriocinas que satildeo sintetizadas em ribossomos (GUARNER
MALAGELADA 2003 MONTALTO et al 2009 PURCHIARONI et al 2013
SEKIROV et al 2010)
22422 Imunomodulaccedilatildeo
As interaccedilotildees entre micro-organismos e ceacutelulas epiteliais e imunes baseiam-se
no reconhecimento de padrotildees moleculares associados agrave micro-organismos
(MAMPs) sendo mediado por receptores de reconhecimento padratildeo representados
pelos receptores do tipo toll (TLR) encontrados na superfiacutecie de ceacutelulas epiteliais e
imunes e pelos receptores de domiacutenio de digomerizaccedilatildeo de ligaccedilatildeo de nucleotiacutedeos
(NOD) que se encontram no citoplasma Esses receptores desempenham um
importante papel na gecircnese e na modulaccedilatildeo da resposta inflamatoacuteria (FRANCHI et
al 2009 MARANDUBA et al 2014 MONTALTO et al 2009 PURCHIARONI et al
2013)
A interaccedilatildeo funcional entre microbiota intestinal e sistema imunoloacutegico inicia-
se com a promoccedilatildeo de um ambiente anti-inflamatoacuterio pelas bacteacuterias (Figura 2) Em
um contexto simbioacutetico MAMPs estimulam continuamente atraveacutes das IECs (ceacutelulas
epiteliais intestinais) a secreccedilatildeo das proteiacutenas antimicrobianas intestinais REGIIIγ
para o luacutemen aleacutem de linfopoietina estromal tiacutemica (TSLP) IL-33 IL-25 e o fator de
crescimento tumoral-β (TGF-β) sob o epiteacutelio Esses mediadores imunoloacutegicos
induzem o desenvolvimento de macroacutefagos tolerogecircnicos e ceacutelulas dendriacuteticas
(DCs) tolerogecircnicas (KAMADA et al 2013 MAYNARD et al 2012)
Ceacutelulas Dendriacuteticas (DCs) tolerogecircnicas produzem TGF-β e aacutecido retinoacuteico
(RA) que estimulam o desenvolvimento de Ceacutelulas T regulatoacuterias (Treg) Assim
atraveacutes das ceacutelulas Treg (que utilizam diversos mecanismos de regulaccedilatildeo)
macroacutefagos (que produzem IL-10) e DCs tolerogecircncicos o sistema imunoloacutegico
intestinal eacute capaz de estabelecer e manter um ambiente anti-inflamatoacuterio Aleacutem dos
papeacuteis reguladores essenciais de TGF-β esta citocina tem sido associada com
outras substacircncias derivadas do epiteacutelio tais como fator de ativaccedilatildeo de ceacutelulas β
(FABF) e ligante indutor de proliferaccedilatildeo (APRILL) com o intuito de induzir o
desenvolvimento de ceacutelulas produtoras de IgA (plasmoacutecitos) (FAGARASAN et al
2010) Esta imunoglobulina eacute capaz de prevenir a ligaccedilatildeo de bacteacuterias comensais no
41
epiteacutelio do hospedeiro estando portanto envolvida na formaccedilatildeo da microbiota
intestinal (MACPHERSON et al 2012)
Aleacutem disto tem sido relatada que a produccedilatildeo de alguns tipos de peptiacutedeos
antimicrobianos bacterianos (AMPs) como a secreccedilatildeo das proteiacutenas
antimicrobianas intestinais REGIIIγ REGIIIβ e angiogenina-4 eacute influenciada pela
micro-organismos comensais via TLR MyD88 (FRANCHI et al 2009 GOTO
IVANOV 2013 VAN VLIET et al 2010) Desse modo verifica-se que no intestino
humano saudaacutevel a microbiota promove constante exposiccedilatildeo de ligantes aos TLR
garantindo a ativaccedilatildeo basal contiacutenua de vias de sinalizaccedilatildeo resultando em
inflamaccedilatildeo fisioloacutegica de baixa intensidade Aleacutem disso micro-organismos
comensais tambeacutem satildeo capazes de suprimir respostas inflamatoacuterias intensas (VAN
VLIET et al 2010)
42
Figura 2 ndash Interaccedilatildeo funcional entre a microbiota intestinal humana e o sistema
imunoloacutegico
Legenda ndash O equiliacutebrio evolutivo eacute formado ao longo do tempo sendo modulado por pressatildeo ambiental A
microbiota intestinal e o ambiente intestinal satildeo desenvolvidas em conjunto sendo necessaacuterio para o benefiacutecio de ambos tolerar um ao outro O sistema imunoloacutegico monitora essa interaccedilatildeo garantindo a homeostase e contribuindo para a simbiose No entanto o desequiliacutebrio causado na presenccedila de disbiose pode causar a reaccedilatildeo do sistema imunoloacutegico Simbiose e disbiose dependem de equiliacutebrio entre bacteacuterias comensais e patogecircnicas Bacteacuterias comensais promovem um ambiente anti-inflamatoacuterio Em um contexto de simbiose MAMPs estimulam continuamente as IECs a secretarem moleacuteculas que atuam protegendo o epiteacutelio e produzindo um ambiente tolerogecircnico Em disbiose haacute uma liberaccedilatildeo significativa de MAMPs que podem induzir IECs DCs ativadas e macroacutefagos a secretar citocinas inflamatoacuterias Consequentemente haacute um desenvolvimento de efetores imunoloacutegicos IL-22 eacute produzida em ambas as situaccedilotildees mas a contribuiccedilatildeo para a remodelaccedilatildeo da barreira epitelial eacute controlada por regulaccedilatildeo imune M macroacutefago Com bacteacuterias comensais Pato bacteacuterias patogecircnicas
Adaptado de MARANDUBA et al 2014
43
2243 Funccedilatildeo Troacutefica
A microbiota intestinal desempenha funccedilotildees troacuteficas modulando a proliferaccedilatildeo
e diferenciaccedilatildeo de ceacutelulas epiteliais do coacutelon atraveacutes dos AGCC produzidos na
fermentaccedilatildeo de hidratos de carbono natildeo digeriacuteveis Neste contexto o butirato eacute
considerado o AGCC com maior efeito pois promove o crescimento e o turnover das
ceacutelulas epiteliais acelerando a maturaccedilatildeo intestinal da mucosa durante o seu
desenvolvimento ou para induzir seu reparo apoacutes uma lesatildeo O butirato eacute capaz de
aumentar proliferaccedilatildeo diferenciaccedilatildeo e maturaccedilatildeo aleacutem de reduzir apoptose de
enteroacutecitos normais no intestino delgado atraveacutes de sua influecircncia sobre a
expressatildeo de genes e a siacutentese de proteiacutenas (GUILLOTEAU et al 2010 HAMER et
al 2008)
O butirato parece exercer um efeito troacutefico em ceacutelulas epiteliais do iacuteleo e do
jejuno atraveacutes de um mecanismo de neuro-hormonal sugerindo um efeito indireto
No coacutelon a ausecircncia de butirato induziu apoptose massiva nos colonoacutecitos podendo
ser explicado pelo fato de que o butirato eacute a fonte principal de energia para estas
ceacutelulas aleacutem de estimular a liberaccedilatildeo de peacuteptidos gastrointestinais eou fatores de
crescimento que desempenham um papel fundamental na proliferaccedilatildeo celular
(GUILLOTEAU et al 2010 HAMER et al 2008)
2244 Regulaccedilatildeo da adiposidade
Tem sido evidenciado que a microbiota intestinal influecircncia a adiposidade do
hospedeiro A primeira evidecircncia do papel da microbiota intestinal na regulaccedilatildeo da
homeostase energeacutetica e adiposidade do hospedeiro foi demonstrada por Backhed
et al (2004) em estudo que foi demonstrado que ratos germ-free apresentavam
menor conteuacutedo de gordura corporal do que ratos convencionais mesmo ao
consumirem a mesma quantidade de alimentos Diferentes mecanismos tecircm sido
propostos para explicar a relaccedilatildeo entre microbiota intestinal e a adiposidade Assim
dependendo da sua composiccedilatildeo a microbiota pode aumentar a extraccedilatildeo energeacutetica
da dieta a partir de polissacariacutedeos natildeo digeriacuteveis com menor conteuacutedo de energia
disponiacutevel nas fezes aleacutem de maiores niacuteveis de AGCC no intestino Propotildee-se
ainda que a microbiota intestinal seja capaz de induzir a regulaccedilatildeo de genes do
hospedeiro que modulam o metabolismo energeacutetico (MUSSO et al 2011)
44
225 Microbiota intestinal e disbiose
Em condiccedilotildees saudaacuteveis existe um equiliacutebrio entre todos os micro-organismos
presentes no intestino estando as bacteacuterias beneacuteficas em maior quantidade
(eubiose) Entretanto pode ocorrer desequiliacutebrio na microbiota com consequente
predomiacutenio das bacteacuterias potencialmente patogecircnicas sobre as beneacuteficas Esse
desequiliacutebrio eacute definido como disbiose e pode comprometer a sauacutede do hospedeiro
uma vez que se associa agrave patogecircnese de vaacuterias doenccedilas (HAWRELAK MYERS
2004)
O uso de antibioacuteticos anti-inflamatoacuterios hormonais e natildeo hormonais abuso de
laxantes consumo excessivo de alimentos processados baixo consumo de
alimentos crus excessiva exposiccedilatildeo a toxinas ambientais incluindo alguns metais
pesados doenccedilas consumptivas como cacircncer e siacutendrome da imunodeficiecircncia
adquirida (AIDS) disfunccedilotildees hepatopancreaacuteticas estresse divertiacuteculos idade
tempo de tracircnsito e pH intestinal disponibilidade de material fermentaacutevel estado
imunoloacutegico do hospedeiro e infecccedilotildees satildeo fatores importantes para promover
alteraccedilatildeo da microbiota acarretando em disbiose intestinal e consequentemente
modificando vaacuterias funccedilotildees do TGI incluindo a digestatildeo a
biodisponibilidadeabsorccedilatildeo eliminaccedilatildeo desintoxicaccedilatildeo e funccedilatildeo imunoloacutegica
(ALMEIDA et al 2009 HAWRELA MYERS 2004 SEARS GENUIS 2012)
Em um contexto de disbiose (Figura 2) a presenccedila de agentes patogeacutenicos
pode perturbar a regulaccedilatildeo do ambiente anti-inflamatoacuterio Quando patoacutegenos
enteacutericos superam as bacteacuterias comensais o desequiliacutebrio entre comensais e
bacteacuterias patogecircnicas provoca uma liberaccedilatildeo significativa de MAMPs Este aumento
pode induzir IECs DCs e macroacutefagos ativados a secretar citocinas inflamatoacuterias
como a IL-1β IL-6 IL-12 e IL-23 Estas citocinas estimulam o desenvolvimento de
ceacutelulas CD4+ T auxiliares (T helper - TH1) e ceacutelulas TH17 (produzem IL-17A IL-
17F e IL-22) resultando na inflamaccedilatildeo crocircnica (MAYNARD et al 2012)
Na vigecircncia da disbiose intestinal pode ocorrer perda de funccedilotildees importantes
da microbiota do hospedeiro As alteraccedilotildees qualitativas e quantitativas na microbiota
intestinal aleacutem das alteraccedilotildees nas atividades metaboacutelicas e na distribuiccedilatildeo dos
micro-organismos ao longo do intestino associam-se a diversas condiccedilotildees tais
como diarreias deacuteficits nutricionais doenccedila celiacuteaca cacircncer colorretal doenccedilas
45
inflamatoacuterias intestinais siacutendrome do coacutelon irritaacutevel e supercrescimento bacteriano
(ALMEIDA et al 2009 HAWRELAK MYERS 2004)
A disbiose pode provocar aumento da permeabilidade intestinal alterando uma
importante funccedilatildeo da mucosa intestinal que eacute a atividade de barreira Assim
moleacuteculas antigecircnicas ou toacutexicas e micro-organismos nocivos podem se translocar
atraveacutes da barreira promovendo a passagem destas substacircncias atraveacutes da mucosa
epitelial para o sangue ou sistema linfaacutetico gerando uma resposta inflamatoacuteria
sistecircmica A ligaccedilatildeo entre disbiose e desenvolvimento de doenccedilas como obesidade
diabetes e doenccedilas cardiovasculares vem sendo explorada A obesidade representa
uma das doenccedilas mais estudadas associadas agrave perturbaccedilotildees na microbiota
intestinal no entanto requer mais estudos (Figura 3) (ALMEIDA et al 2009
HAWRELAK MYERS 2004 KINROSS et al 2011)
46
Figura 3 ndash Doenccedilas influenciadas pelo metabolismo microbiano intestinal
Legenda ndash A variedade de doenccedilas sistecircmicas que satildeo diretamente influenciadas pelo metabolismo da microbiota intestinal e a sua influecircncia sobre outras vias em mamiacuteferos tais como o sistema imunitaacuterio inato tem sido demonstradas Especificamente em destaque incluem as vias metaboacutelicas envolvidas com o metabolismo de drogas e a obesidade que satildeo diretamente influenciados pelo teor microbiano intestinal Ags antigeacutenios C bolteae Clostridium Bolteae DCs ceacutelulas dendriacuteticas AGCC aacutecidos graxos de cadeia curta TLR receptor Toll-like
Adaptado de Kinross et al 2011
47
226 Microbiota Intestinal e obesidade
A partir de 2004 mais um fator ambiental passou a ser apontado como
importante para o controle do peso e da homeostase energeacutetica a microbiota
intestinal As primeiras evidecircncias da relaccedilatildeo microbiota intestinal versus obesidade
foram constatadas em animais germ-free convencionalizados Esses animais
demonstraram que mesmo ao consumir uma menor quantidade de dieta e portanto
menos calorias em comparaccedilatildeo aos animais germ-free apresentaram aumento da
quantidade de gordura corporal (BACKHED et al 2004)
Especificamente tem-se observado que a microbiota de ratos obesos tem uma
maior capacidade de extraccedilatildeo de energia da dieta e esta caracteriacutestica pode ser
transmissiacutevel atraveacutes da colonizaccedilatildeo de ratos germ-free com a microbiota fecal de
doadores obesos resultando em um aumento significativamente maior no percentual
de gordura corporal total com o intuito de armazenar os lipiacutedeos produzidos Estes
estudos demonstraram que microbiota intestinal eacute um potencial fator de contribuiccedilatildeo
adicional agrave fisiopatologia da obesidade (BACKHED et al 2004 HARRIS et al 2012
LEY et al 2005 TURNBAUGH et al 2006)
A definiccedilatildeo da alteraccedilatildeo na composiccedilatildeo da microbiota intestinal de obesos
ainda permanece controversa na literatura tanto no que se refere agrave abordagem em
niacutevel de filo quanto de espeacutecies em humanos (LYRA et al 2010) Aleacutem destes
estudos realizados com animais germ-free outros observaram associaccedilotildees
importantes entre obesidade e mudanccedilas na composiccedilatildeo da microbiota intestinal tal
como uma diversidade bacteriana reduzida (no filo eou outros niacuteveis) eou
representaccedilatildeo alterada de genes e vias metaboacutelicas bacterianas (DE LA SERRE et
al 2010 LEY et al 2006 TURNBAUGH et al 2006)
Em geral vaacuterios autores tecircm demonstrado associaccedilotildees entre obesidade e
mudanccedilas na abundacircncia relativa dos dois filos bacterianos dominantes
Bacteroidetes e Firmicutes Mais especificamente um aumento do filo Firmicutes e
uma diminuiccedilatildeo do filo Bacteroidetes em modelos de ratos obesos e pacientes tecircm
sido observado Aleacutem disso indiviacuteduos magros e pessoas que perderam peso
apresentaram maior abundacircncia do filo Bacteroidetes (ABDALLAH et al 2011
BACKHED et al 2007 CANI et al 2008 LEY et al 2005 2006 TURNBAUGH et
al 2006 VERDAM et al 2013)
48
O aumento da razatildeo FirmicutesBacteroidetes em ratos obesos pode estar
associada com possiacuteveis mediaccedilotildees de respostas adaptativas pelo hospedeiro para
limitar a absorccedilatildeo de armazenamento de energia eou para promover a adiposidade
(LEY et al 2005) Embora os resultados dos estudos demonstrem diferenccedilas na
proporccedilatildeo de grupos bacterianos entre indiviacuteduos eutroacuteficos e obesos ainda natildeo se
sabe se algum grupo de micro-organismos em especial contribui de maneira direta
para o desenvolvimento da obesidade e de alteraccedilotildees metaboacutelicas Associaccedilotildees
entre tipos de bacteacuteria e as variaacuteveis metaboacutelicas tecircm sido observadas seja em
humanos ou em modelo animal indicando que a modulaccedilatildeo de determinados
grupos bacterianos possa exercer efeito no contexto da obesidade Os desafios
enfrentados agora se referem ao entendimento dos mecanismos pelos quais grupos
bacterianos influenciam paracircmetros metaboacutelicos e se intervenccedilotildees dieteacuteticas ou
medicamentosas utilizadas para modular a proporccedilatildeo desses grupos bacterianos
podem melhorar o perfil metaboacutelico ou ao contraacuterio agravaacute-lo (TURNBAUGH et al
2009)
Em relaccedilatildeo agrave composiccedilatildeo da microbiota intestinal seguida agrave perda de peso de
acordo com estudos de coorte a proporccedilatildeo de Bacteroidetes aumentou enquanto o
nuacutemero de Firmicutes diminuiu parecendo restaurar a relaccedilatildeo
FirmicutesBacteroides que estava inicialmente aumentada em indiviacuteduos obesos
Na verdade apoacutes 10 semanas de restriccedilatildeo energeacutetica e de exerciacutecio os
participantes que perderam mais de quatro quilogramas (kg) de peso corporal
mostraram um aumento significativo na populaccedilatildeo de Grupo B fragilis bem como
um aumento na proporccedilatildeo BacteroidesPrevotella positivamente correlacionada com
a perda de peso (HARRIS et al 2012 NADAL et al 2009 SANTACRUZ et al
2009)
No que se diz respeito aos efeitos do exerciacutecio fiacutesico na microbiota intestinal
Evans et al (2014) demonstraram que o exerciacutecio teve efeitos significativos tanto em
camundongos eutroacuteficos quanto em camundongos obesos que ingeriam dieta rica
em gordura sobre o equiliacutebrio relativo dos principais filos bacterianos juntamente
com a prevenccedilatildeo de obesidade e normalizaccedilatildeo da toleracircncia agrave glicose induzida por
dieta De fato a distacircncia percorrida eacute proporcional agrave diminuiccedilatildeo observada para a
razatildeo FirmicutesBacteroides (EVANS et al 2014) Tambeacutem eacute importante ressaltar
que o exerciacutecio aumentou significativamente a proporccedilatildeo relativa de bacteacuterias
49
produtoras de butirato tais como Bacteroidales S24-7 que estatildeo associados com a
sauacutede da ceacutelula epitelial intestinal Aleacutem disso o exerciacutecio fiacutesico aumentou a
diversidade da microbiota intestinal apenas em ratinhos alimentados com uma dieta
rica em gordura No entanto sugere-se que o exerciacutecio pode agir de forma
independente da microbiota intestinal aumentando a utilizaccedilatildeo de energia apesar
de um consumo de uma dieta rica em gordura
227 Mecanismos pelos quais a microbiota intestinal contribui para a obesidade
2271 Extraccedilatildeo de energia adicional da dieta
A noccedilatildeo de que a microbiota intestinal fornece energia para o hospedeiro eacute
suportada por achados em ratos germ-free natildeo naturalmente colonizados com
micro-organismos que apresentaram um menor ganho de peso quando alimentados
com uma dieta rica em gordura do que os ratos germ-free controles (BACKHED et
al 2007 CAESAR et al 2012 DING et al 2010 TREMAROLI BACKHED 2012)
Esses resultados evidenciam que na ausecircncia da microbiota o consumo de uma
dieta obesogecircnica parece natildeo estimular o desenvolvimento da obesidade A
Microbiota intestinal pode afetar ambos os lados da equaccedilatildeo do balanccedilo energeacutetico
natildeo apenas como um fator que influencia a colheita de energia a partir de
componentes da dieta mas tambeacutem como um fator que afeta genes do hospedeiro
que regulam o gasto de energia eou de armazenamento (BACKHED et al 2004
GILL et al 2006 WOLEVER et al 1991)
A fermentaccedilatildeo de polissacariacutedeos pela microbiota pode gerar um aumento no
fluxo de monossacariacutedeos para o fiacutegado e adipoacutecitos favorecendo a lipogecircnese de
novo atraveacutes da ativaccedilatildeo da expressatildeo de dois reguladores nucleares de enzimas
lipogecircnicas- carbohydrate response element-binding protein (ChREBP) e liver sterol
response element binding protein type-1 (SREBP-1) - os quais ativam as enzimas
lipogecircnicas acetil-CoA carboxilase e aacutecido graxo sintase (BACKHED et al 2004
MUSSO et al 2011 TSUKUMO et al 2009) Nesse contexto o menor acuacutemulo de
gordura corporal demonstrado em animais germ-free que consumiram dieta
hiperlipiacutedica e apresentaram absorccedilatildeo semelhante aos animais convencionalizados
indica que a microbiota pode exercer efeito sobre o fluxo de lipiacutedios entre os tecidos
reduzindo o acuacutemulo de gordura (BACKHED et al 2007)
50
A proteiacutena Fasting Induced Adipose Factor (FIAF) eacute suprimida pela presenccedila
de microbiota sendo um inibidor da lipase lipoproteacuteica (LPL) produzido pelo
intestino fiacutegado e tecido adiposo limitando a captaccedilatildeo de aacutecidos graxos e
favorecendo o acuacutemulo de triacilgriceroacuteis nesse tecido Tem sido demonstrado que
animais germ-free apresentaram uma maior expressatildeo de FIAF e fenoacutetipo resistente
agrave obesidade (BACKHED et al 2004 2005 2007) A participaccedilatildeo de FIAF no
metabolismo lipiacutedico foi reforccedilada atraveacutes de estudos com ratos germ-free que
diferiram apenas na expressatildeo dessa proteiacutena (FIAF ++ versus FIAF --) onde
verificou-se que a deficiecircncia dessa proteiacutena induzida geneticamente natildeo eacute um fator
protetor para animais germ-free contra o ganho de peso promovido pela dieta
hiperlipiacutedica (BACKHED et al 2007)
Aleacutem de promover a lipogecircnese (atraveacutes das enzimas lipogecircnicas e inibiccedilatildeo da
FIAF) a microbiota tambeacutem desempenha um papel importante no gasto de energia
obtida a partir da dieta Mais especificamente a microbiota de obesos parece
favorecer uma inibiccedilatildeo de oxidaccedilatildeo de aacutecidos graxos (que por sua vez favorecem a
deposiccedilatildeo e armazenamento de lipiacutedios no tecido adiposo fiacutegado eou tecido
muscular) por mecanismos complementares mas independentes (HARDIE
SAKAMOTO 2006 PUIGSERVER SPIEGELMAN 2003 RABOT et al 2010)
A microbiota tambeacutem pode influenciar a homeostase energeacutetica por meio da
sinalizaccedilatildeo exercida pelos aacutecidos graxos de cadeia curta (AGCC) Os AGCC agem
natildeo apenas como fonte de energia mas tambeacutem como moleacuteculas de sinalizaccedilatildeo
atraveacutes de receptores acoplados agrave proteiacutena G (GPRs) GPRs satildeo um grupo de
receptores transmembracircnicos intestinais que respondem aos aacutecidos graxos Entre
os receptores dessa famiacutelia os receptores Gpr41 e Gpr43 satildeo fundamentais sendo
expressos abundantemente no intestino delgado distal no coacutelon e nos adipoacutecitos
Essa ligaccedilatildeo resulta na ativaccedilatildeo desses receptores induzindo a secreccedilatildeo de
polipeptiacutedeo YY (PYY) e leptina hormocircnios que influenciam nas funccedilotildees intestinais
e na regulaccedilatildeo do apetite (BELLAHCENE et al 2013 BINDELS et al 2013
HARDIE SAKAMOTO 2006 INOUE et al 2014 MUSSO et al 2011 ZAIBI et al
2010)
51
2272 Induccedilatildeo da inflamaccedilatildeo por meio da alteraccedilatildeo da permeabilidade intestinal
As concentraccedilotildees sanguiacuteneas de lipopolissacariacutedeos (LPS) sofrem significativa
influecircncia da microbiota intestinal Principalmente as bacteacuterias Gram-negativas
apresentam em sua superfiacutecie celular os LPS que funcionam como antiacutegenos
estimulando a resposta imune do hospedeiro Assim a microbiota intestinal
representa um grande reservatoacuterio dessa endotoxina especialmente naqueles
indiviacuteduos que habitualmente consomem dieta com alto teor de gorduras
(HOTAMISLIGIL 2010)
A principal via de sinalizaccedilatildeo do LPS envolve o fator nuclear Kappa B (NF-KB)
O LPS pode aumentar os niacuteveis circulantes de resistina espeacutecies reativas de
oxigecircnio (ERO) e proteiacutenas supressoras da sinalizaccedilatildeo de citocinas-1 e 3 (SOCS-1 e
SOCS-3) A elevaccedilatildeo de citocinas proacute-inflamatoacuterias como interferon-gama (IFN-α)
TNF- α interleucina (IL)-6 e IL-1β geralmente observada em pacientes obesos
pode ser originada de macroacutefagos no tecido adiposo ou da interaccedilatildeo do LPS com
seu receptor O aumento dessas citocinas pode contribuir para a translocaccedilatildeo de
LPS favorecendo a ocorrecircncia de endotoxemia metaboacutelica e consequentemente
potencializar a inflamaccedilatildeo subcliacutenica por meio da reduccedilatildeo da expressatildeodistribuiccedilatildeo
de proteiacutenas formadoras de junccedilotildees oclusivas (tight junctions) como zocircnula de
oclusatildeo-1 (ZO-1) e ocludina aumentando a permeabilidade intestinal (CANI et al
2008 LAM et al 2012)
Aleacutem da reduccedilatildeo da expressatildeo das junccedilotildees oclusivas intestinais haacute tambeacutem
uma evidecircncia de que a microbiota intestinal pode regular a permeabilidade
intestinal atraveacutes do sistema endocanabinoacuteide Em um estudo realizado por Muccioli
et al (2010) a modulaccedilatildeo da composiccedilatildeo microbiana do intestino seja por
colonizaccedilatildeo em ratos germ-free ou por tratamento com antibioacuteticos reduziu a
expressatildeo dos receptores canabinoacuteides (Cb-1) tanto do coacutelon quanto do tecido
adiposo enquanto em animais alimentados com uma dieta rica em gordura foi
observado aumento da expressatildeo Cb1 (EVERARD et al 2013 GEURTS et al
2011 MUCCIOLI et al 2010)
52
23 MOLLICUTES
231 Caracteriacutesticas Gerais dos Mollicutes
Os micoplasmas foram primeiramente isolados por Norcard e Roux em 1898
que estudavam a Pleuropneumonia Bovina doenccedila descrita haacute mais de um seacuteculo
na Europa e na Aacutefrica Em seguida micro-organismos semelhantes isolados de
humanos e de animais foram descritos por outros pesquisadores e denominados de
PPLO ndash ldquoPleuropneumonia-Like Organismsrdquo (MOROWITZ 2002 RAZIN JACOBS
1992)
O termo ldquomicoplasmardquo foi usado para denominar os micro-organismos da
Classe Mollicutes (Mollis = mole cuacutetis = pele) mas sugeriu-se o uso do termo
geneacuterico molicutes como nome trivial para designar qualquer microrganismo desta
classe O termo micoplasma aplica-se apenas aos membros do gecircnero Mycoplasma
Recentemente algumas riqueacutetsias e outras bacteacuterias de taxonomia indefinida foram
incluiacutedas aos Mollicutes A classe eacute composta por quatro ordens (Mycoplasmatales
Entomoplasmatales Acholeplasmatales Anaeroplasmatales) sete famiacutelias
(Mycoplasmataceae Incertae sedis (ordem Mycoplasmatales)
Entomoplasmataceae Spiroplasmataceae Acholeplasmataceae Incertae sedis
(ordem Acholeplasmatales) e Anaeroplasmataceae) 11 gecircneros (Mycoplasma
Ureaplasma Eperythozoon Haemobartonella Entomoplasma Mesoplasma
Spiroplasma Acholeplasma Phytoplasma Anaeroplasma Asteroplasma) e mais de
200 espeacutecies A famiacutelia Mycoplasmataceae conteacutem os principais micro-organismos
de interesse meacutedico dentre os quais estatildeo os gecircneros Mycoplasma Os molicutes
compreendem aproximadamente 200 espeacutecies distribuiacutedas ente plantas insetos
animais e humanos (BERGEYrsquos 2010 RAZIN 1992 RAZIN YOGEV NAOT
1998)
Mollicutes eacute a uacutenica classe do filo Tenericutes sendo anteriormente
classificado dentro do filo Firmicutes tendo essa mudanccedila justificada em parte
pela anaacutelise de uma seacuterie de marcadores filogeneacuteticos conservados Esta
classificaccedilatildeo eacute ainda apoiada pela ausecircncia de parede celular caracteriacutestica desses
micro-organismos As sequecircncias do gene 16S rRNA contribuem para sua
classificaccedilatildeo em grupos filogeneacuteticos sendo essa sequecircncia obrigatoacuteria para a
caracterizaccedilatildeo de novas espeacutecies Aleacutem disso a atribuiccedilatildeo de espeacutecie aos grupos eacute
53
feita principalmente por hibridaccedilatildeo DNA-DNA sorologia e semelhanccedila na sequecircncia
do gene 16rRNA Algumas espeacutecies foram atribuiacutedas individualmente a grupos
filogeneacuteticos clusters e subclusters que tambeacutem compartilham outras
caracteriacutesticas (BERGEYrsquos 2009 2010 BROWN WHITCOMB BRADBURY 2007
WEISBURG et al 1989)
A natureza dos molicutes tem representado um desafio na compreensatildeo da
sua biologia classificaccedilatildeo e taxonomia Por muito tempo os micoplasmas foram
considerados viacuterus devido a capacidade de transpor filtros que bloqueavam a
passagem de bacteacuterias (RAZIN 1992) Os membros da classe Mollicutes satildeo
caracterizadas pelo genoma de tamanho reduzido (058 - 22 Mb) ausecircncia de
parede celular (RAZIN 1998) e por apresentarem requerimentos nutricionais
diferenciados quando comparados agrave maioria das bacteacuterias de interesse veterinaacuterio e
humano Aminoaacutecidos nucleotiacutedeos e esteroacuteis exoacutegenos satildeo utilizados para seu
crescimento in vitro O esterol presente no soro ou ceacutelulas do hospedeiro eacute
incorporado pela membrana da maioria das espeacutecies Este composto contribui na
fluidez necessaacuteria agrave membrana e confere resistecircncia parcial agrave lise osmoacutetica
(RUHNKE ROSENDAL 1994)
A membrana dos micoplasmas tem composiccedilatildeo semelhante agraves das eubacteacuterias
e estaacute exposta ao ambiente com exceccedilatildeo de poucas espeacutecies que possuem
glicocaacutelice (WIESLANDER et al 1992) Localizam-se principalmente nas ceacutelulas de
mucosas e com potencial de invasatildeo (VOELKER DYBVIG 1996) As mutaccedilotildees tecircm
sido mencionadas como estrateacutegia de sobrevivecircncia que podem ter ocorrido em
funccedilatildeo da evoluccedilatildeo associada a perdas genocircmicas (DAVID et al 2002)
Natildeo apresentam flagelos entretanto algumas espeacutecies exibem deslizamento
sobre superfiacutecies liacutequidas Alguns micoplasmas possuem um tipo de estrutura ou
prolongamento polar em sua superfiacutecie onde haacute alta concentraccedilatildeo de moleacuteculas de
adesatildeo que permitem a sua aderecircncia agrave ceacutelula hospedeira (RAZIN 1992) Acredita-
se que estas estruturas em algumas espeacutecies como Mycolasma penetrans de
origem humana estejam envolvidas na invasatildeo celular (LO et al 1992)
Os molicutes exibem estrita relaccedilatildeo aos hospedeiros e especificidade a tecidos
e oacutergatildeos que reflete as suas caracteriacutesticas nutricionais e adaptaccedilatildeo parasitaacuteria
Estas bacteacuterias podem ocorrer em hospedeiros e tecidos diferentes de seu ldquohabitatrdquo
normal entretanto como observado por Goulet et al (1995) existem variaccedilotildees e
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eventualmente eacute possiacutevel isolar espeacutecies de siacutetios e hospedeiros diferentes
daqueles habituais (ERICKSON ROSS BOVE 1988 HORNOK et al 2012 ISO et
al 2013 RAZIN 1992 RAZIN YOGEV NAOT 1998 WAITES et al 1987)
A maioria dos molicutes vivem como comensais e em muitos artroacutepodes
podem mesmo ser considerados simbiontes Infecccedilotildees com micoplasmas
patogecircnicos satildeo raramente agudas e usualmente seguem um curso crocircnico (RAZIN
YOGEV NAOT 1998) Os Mollicutes principalmente as espeacutecies encontradas em
mamiacuteferos apesentam-se como parasitas ideais geralmente vivendo em harmonia
com seu hospedeiro mas por outro lado satildeo tambeacutem considerados como
ldquooportunistas ideaisrdquo Diversas doenccedilas nos seus respectivos hospedeiros satildeo
causadas ou associadas aos Mollicutes (RAZIN YOGEV NAOT 1998) Estas
bacteacuterias parecem preferir estabelecerem-se em nichos com ceacutelulas em constante
renovaccedilatildeo favorecendo a sua adesatildeo (GABRIDGE CHANDLER DANIELS 1985)
Micoplasmas em especial as espeacutecies com os menores genomas tecircm altas
taxas de mutaccedilatildeo o que sugere que eles estatildeo em um estado de evoluccedilatildeo raacutepida
Esses dados foram confirmados por estudos de sequecircncias de genes 5S rRNA que
incluiu uma seacuterie de acholeplasmas anaeroplasmas micoplasmas ureaplasmas e
Clostridium innocuum (BOVEacute 1999 RAZIN 1995 ROGERS et al 1985)
Quanto ao seu metabolismo os Mollicutes podem ser divididos em
fermentadores e natildeo-fermentadores Os fermentadores produzem aacutecidos por meio
da metabolizaccedilatildeo de glicose e de outros carboidratos diminuindo o pH do meio de
cultivo e os natildeo- fermentadores possuem a via da arginina-deidrolase para
obtenccedilatildeo de ATP aumentando o pH (RAZIN 1978 2004) Quando ambas as vias
ocorrem os aacutecidos produzidos da glicoacutelise podem mascarar a alcalinizaccedilatildeo do caldo
causada pela hidroacutelise da arginina (BASEMAN TULLY 1997 OLSON et al 1993
RAZIN 2004)
Um dos maiores empecilhos na pesquisa e no diagnoacutestico laboratorial das
infecccedilotildees causadas por molicutes tem sido a dificuldade em cultivaacute-los in vitro
Apresentam crescimento lento mesmo utilizando-se o meio de cultivo adequado
(RAZIN 1994) A temperatura de aproximadamente 37 ordmC eacute indicativa do ldquohabitatrdquo
natural dos molicutes que corresponde agrave dos mamiacuteferos reacutepteis peixes artroacutepodes
e plantas O crescimento e sobrevivecircncia dos molicutes em meio de cultura satildeo
dependentes do pH Para espeacutecies originaacuterias de plantas e vertebrados o pH oacutetimo
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eacute de 74 e o crescimento ocorre entre pH 65 a 80 (RAZIN et al 1978) A inibiccedilatildeo
do crescimento pode ocorrer pela excessiva produccedilatildeo de aacutecidos ou aacutelcalis gerados
pelo metabolismo microbiano primaacuterio
Esses micro-organismos apresentam colocircnias de 50 ndash 500 μm de diacircmetro
usualmente em forma de ldquoovo fritordquo quando cultivados em meio soacutelido visualizadas
com o auxiacutelio de microscoacutepio estereoscoacutepio (Figura 4) Em meio liacutequido o
crescimento geralmente natildeo causa turvaccedilatildeo provocando somente alteraccedilatildeo no pH
revelado por um indicador presente no meio de cultura (MILES 1992 RAZIN 1998)
A complexidade dos requerimentos nutricionais a variaccedilatildeo na forma celular e a
fragilidade osmoacutetica fazem com que os Mollicutes estejam sob constantes
investigaccedilotildees quanto a sua fisiologia para relatar seu crescimento e ecologia As
condiccedilotildees sob as quais eles crescem podem influenciar na estrutura e
funcionamento das ceacutelulas hospedeiras sendo importante natildeo somente para os
fisiologistas como tambeacutem para todos micoplasmologistas envolvidos em estudos
quantitativos (BALABANOV et al 2006 MILLES 1992 RAZIN et al 1978
RODWELL 1983 TULLY 1985)
Figura 4 ndash Crescimento de M hominis em meio SP4 com a produccedilatildeo de colocircnia em forma de ldquoovo fritordquo (aumento 40X)
Fonte Arquivo pessoal
56
232 Mollicutes Microbiota Intestinal e Obesidade
A ocorrecircncia e participaccedilatildeo da classe Mollicutes na microbiota intestinal e sua
relaccedilatildeo com a obesidade ainda eacute praticamente desconhecida No entanto
Turnbaugh et al (2008) investigaram a relaccedilatildeo dieta ecologia microbiana intestinal e
o balanccedilo energeacutetico a partir de um modelo murino de obesidade induzido por meio
do consumo de uma dieta ocidental Observou-se que a dieta ocidental estimulou o
crescimento de organismos da classe Mollicutes que posteriormente foram
reduzidos por subsequentes manipulaccedilotildees dieteacuteticas para limitar o ganho de peso
O transplante de microbiota de ratos com obesidade induzida por dieta para
destinataacuterios germ-free promoveu uma maior deposiccedilatildeo de gordura do que em
animais que receberam o transplante a partir de doadores eutroacuteficos Metagenocircmica
e anaacutelises bioquiacutemicas do microbioma intestinal em conjunto com sequenciamento e
reconstruccedilotildees metaboacutelicas associadas ao intestino humano revelaram que a
bacteacuteria Eubacterium dolichum) (um membro da classe Mollicutes) apresenta
caracteriacutesticas que podem fornecer uma vantagem competitiva aos membros desse
ramo em relaccedilatildeo aos nutrientes da dieta ocidental Essas vantagens relacionam-se
com a importaccedilatildeo e transformaccedilatildeo de accediluacutecares simples atraveacutes do Sistema
fosfotransferase (PTS)
Sistemas fosfotransferase (PTS) satildeo uma classe de sistemas de transporte
envolvidas na absorccedilatildeo e na fosforilaccedilatildeo de uma grande variedade de hidratos de
carbono (DEUTSCHER et al 2006) Cada transportador envolve trecircs enzimas de
ligaccedilatildeo que atuam como receptores e doadores de grupos fosforil duas enzimas
citoplasmaacuteticas que atuam em todos os hidratos de carbono PTS importados (HPR e
EI) e o outro eacute um complexo de hidratos de carbono especiacutefico (EII)
compreendendo um ou dois domiacutenios integrais de membrana hidrofoacutebicos (EIIC D)
e dois domiacutenios hidrofiacutelicos (EIIA B) (DEUTSCHER et al 2006) Fosfoenolpiruvato
embora produzidos atraveacutes da glicoacutelise pode ser usado para gerar ATP (atraveacutes da
piruvatoquinase) ou usado para conduzir a importaccedilatildeo de accediluacutecares adicionais
atraveacutes da transferecircncia de um grupo fosfato para EI do PTS
Genes PTS satildeo encontrados em vaacuterias divisotildees de bacteacuterias incluindo
Proteobacterias tais como E coli bem como vaacuterios Firmicutes e Mollicutes
sequenciados (Por exemplo Mycoplasma genitalium M pneumoniae M pulmonis
M penetrans M gallisepticum M mycoides M mobile M hyopneumoniae M
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synoviae e M capricolum) (KANEHISA et al 2004) O PTS tambeacutem desempenha
um papel na regulaccedilatildeo da expressatildeo do gene microbiano atraveacutes da repressatildeo
cataboacutelica permitindo que a ceacutelula passe a importar preferencialmente accediluacutecares
simples em relaccedilatildeo a outros hidratos de carbono (DEUTSCHER et al 2006)
Muacuteltiplos componentes do PTS estatildeo presentes no microbioma da dieta ocidental (EI
e HPr mais EII) o que poderia permitir a importaccedilatildeo de accediluacutecares simples (por
exemplo glicose e frutose que juntos formam sacarose um componente abundante
da dieta ocidental) bem como accediluacutecares associados com a mucosa do intestino do
hospedeiro (N-acetil-galactosamina) O microbioma da dieta ocidental tambeacutem
conteacutem genes que suportam o metabolismo destes accediluacutecares fosforilados para vaacuterios
produtos finais de fermentaccedilatildeo anaeroacutebia (por exemplo lactato e a cadeia curta de
aacutecidos graxos butirato e acetato (DEUTSCHER et al 2006)
58
3 OBJETIVOS
31 Objetivo geral
Analisar a participaccedilatildeo da Classe Mollicutes e dos Filos Firmicutes e Bacteroidetes
na microbiota intestinal de mulheres obesas e eutroacuteficas
32 Objetivos especiacuteficos
Determinar o estado nutricional das mulheres obesas do grupo caso e
eutroacuteficas do grupo controle
Determinar o consumo alimentar das mulheres obesas do grupo caso e
eutroacuteficas do grupo controle
Desenvolver um ensaio quantitativo por meio de TaqMan PCR para a
detecccedilatildeo de Mollicutes na microbiota intestinal de mulheres obesas e
eutroacuteficas
Quantificar os micro-organismos da Classe Mollicutes e dos Filos Firmicutes e
Bacteroidetes aleacutem de Bacteacuterias Totais por meio da PCR em tempo real em
amostras de fezes de mulheres obesas e eutroacuteficas
Analisar a liberaccedilatildeo de citocinas proacute-inflamatoacuterias IL-1 IL6 IL17-A e TNF-α
em amostras de sangue coletadas de mulheres obesas e eutroacuteficas
59
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
41 Protocolo do estudo
O presente estudo foi desenvolvido no laboratoacuterio de Micoplasmas do
Departamento de Microbiologia do Instituto de Ciecircncias Biomeacutedicas da Universidade
de Satildeo Paulo (ICB IIUSP) com o Ambulatoacuterio de Obesidade e Siacutendrome Metaboacutelica
do Serviccedilo de Endocrinologia do Hospital das Cliacutenicas da Universidade de Satildeo
Paulo (HC-FMUSP) O estudo foi aprovado pela Comissatildeo de Eacutetica em Pesquisa
Envolvendo Seres Humanos (CEPSH) do Instituto de Ciecircncias Biomeacutedicas da
Universidade de Satildeo Paulo (ICBUSP) (protocolo de pesquisa ndeg 110713) e pela
Comissatildeo de Eacutetica da Instituiccedilatildeo HC-FMUSP Todas as mulheres foram recrutadas a
partir da demanda espontacircnea do serviccedilo tendo sido inseridas no protocolo apoacutes
explicaccedilatildeo sucinta e individual do mesmo e assinatura do Termo de Consentimento
Livre e Esclarecido (TCLE) conforme preconiza a resoluccedilatildeo 19606 do Conselho
Nacional de Sauacutede
42 Casuiacutestica
As coletas foram realizadas entre os meses de Outubro de 2013 agrave Dezembro
de 2014 Para obtenccedilatildeo de resultados pela metodologia proposta para este estudo
a casuiacutestica foi de 40 mulheres sendo 20 diagnosticadas com obesidade
apresentando Iacutendice de massa corporal (IMCgt 30 kgm2) e 20 mulheres em eutrofia
(IMC entre 185 e 249 kgm2) As mulheres diagnosticadas com obesidade foram
recrutadas no grupo de Obesidade e Siacutendrome Metaboacutelica do serviccedilo de
Endocrinologia do Hospital das Cliacutenicas da Universidade de Satildeo Paulo (HC-
FMUSP)
Foram utilizados como criteacuterios de exclusatildeo para esse grupo a presenccedila de
quadros infecciosos com sinais cliacutenicos uso de antibioacuteticos (3 meses antes do
estudo) quimioterapia radioterapia gravidez uso de probioacuteticos cirurgias preacutevias
no Trato Gastrointestinal doenccedilas do Trato Gastrointestinal como Doenccedila de Crohn
e Siacutendrome do Coacutelon Irritaacutevel Devido ao fato de haver dificuldade para distinccedilatildeo de
alimentos classificados como prebioacuteticos a ingestatildeo destes natildeo foi incluiacuteda como
criteacuterio de exclusatildeo do estudo O grupo controle foi composto por mulheres adultas
60
eutroacuteficas recrutadas na comunidade sem nenhuma enfermidade aparente tendo
sido fixados os mesmos criteacuterios de exclusatildeo adotados para o grupo controle
43 Delineamento experimental
As mulheres foram submetidas agrave coleta de material fecal e de sangue aleacutem de
questionaacuterio semiestruturado como instrumento de coleta Tal instrumento foi
construiacutedo atraveacutes de consulta em perioacutedicos cientiacuteficos e livros acadecircmicos que
descrevem preditores importantes em relaccedilatildeo a fatores etioloacutegicos predisponentes e
mantedenores da obesidade e possiacutevel associaccedilatildeo com microbiota intestinal e
ambiente Foram consideradas questotildees que avaliavam histoacuteria familiar cliacutenica
obsteacutetrica ginecoloacutegica consumo de aacutelcool e tabaco aleacutem de questotildees que
avaliavam os haacutebitos alimentares como a praacutetica de dietas para emagrecer e
nuacutemero de refeiccedilotildees realizadas Foi utilizado para esse estudo o IPAQ (International
Physical Activity Questionnaire) versatildeo curta originalmente desenvolvido com
finalidade de estimar o niacutevel de praacutetica habitual de atividade fiacutesica de populaccedilotildees de
diferentes paiacuteses (BARROS NAHAS 2000) O questionaacuterio foi elaborado de modo a
facilitar a obtenccedilatildeo de informaccedilotildees durante a consulta com os pacientes e realizadas
por indiviacuteduos previamente instruiacutedos para o desenvolvimento do estudo tendo as
variaacuteveis sido agrupadas em 9 Seccedilotildees que representam a subcategorizaccedilatildeo das
variaacuteveis independentes para determinaccedilatildeo do perfil da populaccedilatildeo estudada (Anexo
B)
44 Determinaccedilatildeo do estado nutricional
441 Avaliaccedilatildeo qualitativa do consumo alimentar
Para investigar possiacuteveis relaccedilotildees entre alimentos e nutrientes da dieta e
microbiota intestinal utilizou-se o questionaacuterio de frequecircncia alimentar semi-quantitativo
(QFA) composto por 62 itens alimentares proposto por Fisberg et al (2008) que
desenvolveram um QFA para utilizaccedilatildeo em estudos epidemioloacutegicos com indiviacuteduos
adultos desenhados para testar hipoacuteteses epidemioloacutegicas e nutricionais em estudos
conduzidos primariamente em Satildeo Paulo para estimar o teor de nutrientes da dieta
61
habitual o que eacute de fundamental importacircncia para estimar a medida de exposiccedilatildeo aos
fatores dieteacuteticos e investigar as possiacuteveis associaccedilotildees com desfechos de interesse
Representou-se a frequecircncia de consumo alimentar em 8 categorias a saber
diaacuterio (mais de trecircs vezes por dia duas a trecircs vezes por dia uma vez por dia) semanal
(cinco a seis vezes por semana duas a quatro vezes por semana uma vez por
semana) mensal (uma a trecircs vezes por mecircs) e nunca ou quase nunca Os dados sobre
o consumo alimentar foram inseridos em planilha eletrocircnica com auxiacutelio do estudo de
Giacomello et al (2008) Inicialmente converteu-se a frequecircncia de consumo de cada
alimento em frequecircncia diaacuteria como proposto por Coelho et al (2011) Para tanto
atribuiu-se ao alimento valor 1 (um) quando consumido 1 vez ao dia Caso o alimento
fosse consumido mais de uma vez ao dia multiplicava-se o valor 1 pelo intervalo da
frequecircncia diaacuteria relatada Para as opccedilotildees que contemplaram intervalos de tempo
semanal e mensal utilizou-se a meacutedia do intervalo das frequecircncias dividido pelo
periacuteodo se semanal (7) e mensal (30) conforme descritos no Quadro 01
Quadro 01ndash Criteacuterios utilizados na estimativa da frequecircncia diaacuteria de consumo dos alimentos incluiacutedos no Questionaacuterio de Frequecircncia Alimentar
Frequecircncia Relatada Frequecircncia diaacuteria
3 ou mais vezesdia 31=3
2 a 3 vezesdia 251= 25
1 vezdia 11= 1
5 a 6 vezessemana 557= 079
2 a 4 vezessemana 37= 043
1vezsemana 17= 014
1 a 3 vezesmecircs 230= 007
1 vezmecircs 130= 003
NuncaQuase nunca 0
COELHO et al 2011
62
Posteriormente foram construiacutedos os grupos dos alimentos segundo o registro do
QFA Adotou-se como criteacuterio para a inclusatildeo do alimento no respectivo grupo o
consumo igual ou maior a 10 e as caracteriacutesticas nutricionais (HAIR et al 2005)
Considerando este criteacuterio foram construiacutedos 16 grupos de alimentos (1) massas (2)
preparaccedilotildees (3) carne vermelha e ovos (4) embutidos (5) carne branca (6) leite e
derivados (7) leguminosas (8) cereais raiacutezes e tubeacuterculos (9) hortaliccedilas (10) frutas
(11) industrializados (12) infusatildeo (13) bebida alcooacutelica (14) oacuteleos e gorduras (15)
lanches (16) accediluacutecares e doces
Os dados referentes ao QFA tambeacutem foram utilizados para calcular o consumo
energeacutetico e de nutrientes Primeiramente estes foram transformados em gramas
utilizando-se uma tabela para avaliaccedilatildeo de consumo alimentar em medidas caseiras
(PINHEIRO et al 2002) e em seguida lanccedilados no Software Excel para digitaccedilatildeo dos
dados do consumo alimentar e para o caacutelculo de consumo de macro e micronutrientes
Para preencher o banco de dados do Software com alimentos e preparaccedilotildees
consumidas pelas participantes foram utilizadas as Tabelas de composiccedilatildeo de
alimentos PHILIPPI (2002) e TACO (2006) com a Tabela de medidas caseiras
(PINHEIRO et al 2005) aleacutem de dados adicionais de Composiccedilatildeo quiacutemica de alimentos
compilados da Tabela de Composiccedilatildeo de Alimentos da Fundaccedilatildeo Instituto brasileiro de
Geografia e Estatiacutestica (IBGE) Os valores obtidos foram comparados com os valores de
recomendaccedilatildeo propostos pelo United States Departament of Agriculture (USDA) em
seus documentos Dietary References Intakes (DRI) referentes aos valores de Estimated
Average Requirements (EAR) e para os nutrientes que ainda natildeo possuem esse valor
definido utilizou-se como paracircmetro valores de Adequate Intake (AI)
442 Avaliaccedilatildeo antropomeacutetrica do estado nutricional
A mensuraccedilatildeo do peso corporal em quilogramas (kg) foi realizada em
duplicata considerando-se o peso meacutedio Para tal foi utilizada uma balanccedila digital
Filizolareg com capacidade maacutexima para 150 kg e precisatildeo de 100 g estando as
participantes da pesquisa descalccedilas e com roupas leves A estatura em centiacutemetros
(cm) foi realizada em duplicata considerando-se a estatura meacutedia As medidas
foram determinadas por meio de um estadiocircmetro graduado em centiacutemetros com
precisatildeo de 10 mm apresentando barra de madeira vertical e fixa com esquadro
moacutevel para posicionamento sobre a cabeccedila do indiviacuteduo quando os mesmos
63
estavam descalccedilos em posiccedilatildeo ereta com os peacutes paralelos calcanhares
panturrilhas gluacuteteos ombros e cabeccedila encostados no estadiocircmetro olhando-se
para frente
O Iacutendice de Massa Corpoacuterea (IMC) foi calculado pelo peso e estatura a partir
das quais foi determinada a relaccedilatildeo entre o peso e altura em metros ao quadrado e
avaliado segundo os pontos de corte preconizados pela OMS assim designados
baixo peso (IMC lt 185 Kgaltura2) eutrofia (IMC= 185 a 249 kgaltura2) sobrepeso
(IMC= 25 a 299 Kgaltura2) e obesidade (IMC gt30 Kg altura2) (WHO 1998)
4421 Anaacutelise da Composiccedilatildeo Corporal pelo Meacutetodo de Bioimpedacircncia
O aparelho de bioimpedacircncia eleacutetrica utilizado para a avaliaccedilatildeo da composiccedilatildeo
corporal foi o InBody 720 (Biospace Coreia) que consiste em bioimpedacircncia
octopolar atraveacutes de oito pontos de contato pelos quais passa a corrente eleacutetrica na
extremidade dos quatro membros determinando a porcentagem de gordura e massa
magra em cada membro assim como no tronco
A avaliaccedilatildeo foi realizada respeitando os procedimentos apresentados no
respectivo manual de uso do aparelho atendendo as seguintes condiccedilotildees de preacute-
teste (1) estar em jejum (2) natildeo consumir aacutelcool 48 horas antes do teste (3) natildeo
realizar exerciacutecio de intensidade moderada a elevada nas 12 horas antes da
avaliaccedilatildeo (4) natildeo efetuar o exame perante em estado febril ou de desidrataccedilatildeo (5)
natildeo utilizar bijuterias metaacutelicas ou implantes dentaacuterios com metal (6) natildeo ingerir cafeacute
e (7) realizar a avaliaccedilatildeo com roupa de banho ou roupas iacutentimas
O relatoacuterio da bioimpedacircncia Octopolar eacute dividido em quatro partes
informativas de dados obtidos
1 Anaacutelise da Composiccedilatildeo Corporal identifica como estaacute distribuiacuteda a aacutegua
corporal total percentual de massa magra e massa de gordura livre
2 Anaacutelise Muacutesculo-gordura mostra em kg o peso a massa de muacutesculo
esqueleacutetico e a massa de gordura
3 Diagnoacutestico da obesidade discrimina o IMC PGC (porcentagem de
gordura corporal) e RCQ (relaccedilatildeo cintura-quadril)
4 Aacuterea de Gordura Visceral informa a aacuterea de gordura visceral em cm2
64
45 Coleta das amostras cliacutenicas
Para a obtenccedilatildeo das amostras de fezes as mulheres foram previamente
instruiacutedas de acordo com o National Committee for Clinical Laboratory Standards
NCCCLS (2007) evacuando diretamente no coletor plaacutestico esteacuteril fornecido
juntamente com luvas espaacutetula coletora e etiqueta de identificaccedilatildeo O material foi
acondicionado em caixa isoteacutermica resfriada com gelo e transportado
imediatamente ao Laboratoacuterio de Micoplasmas ICBUSP As amostras de fezes
foram distribuiacutedas em aliquotas (180-200 ug) em microtubos e acondicionadas -80oC
ateacute a anaacutelise laboratorial
Para a realizaccedilatildeo da coleta do material sanguiacuteneo o operador munido de EPIs
realizou punccedilatildeo venosa perifeacuterica preferencialmente em membro superior natildeo
dominante Foram coletados cerca de 5 mL de sangue por tubopaciente tendo sido
utilizados tubos natildeo-heparinizados que foram conservados de forma similar aos
coletores em caixa isoteacutermica refrigerada O material obtido foi levado ateacute o
Laboratoacuterio de Micoplasmas ICBUSP onde as amostras foram centrifugadas a
3500 rpm para obtenccedilatildeo do soro seguido de sua distribuiccedilatildeo em aliacutequotas de cerca
de 1 mL e estocados a -80 degC ateacute o uso
65
46 Determinaccedilatildeo da microbiota intestinal
461 Padronizaccedilatildeo de reaccedilatildeo de PCR quantitativo (qPCR) por meio de TaqMan para a detecccedilatildeo de Mollicutes
4611 Cepas bacterianas e condiccedilotildees de cultura
Como controle positivo utilizou-se a cepa ATCC 23114 (PG-21) de M hominis
Tambeacutem foram utilizados como controle os seguintes micro-organismos obtidos da
coleccedilatildeo do Laboratoacuterio de Micoplasmas ICBUSP Mycoplasma bovis Donetta M
arginini G230 M dispar M2979 M pneumoniae M pulmonis PG34 M
gallisepticum PG31 M synoviae WUU1853 M penetrans ATCC 55252 (GTU 54)
M fermentans PG18 M pulmonis PG34 M hyorhinis M genitalium ATCC 33530
(G37) M buccale M edwardii PG24 M gateae M faucium M felis CO M bovis
Spiroplasma mirum (SMCA) Acholeplasma laidlawii PG38 Ureaplasma diversum
ATCC 449782 U urealyticum T960 Escherichia coli ATCC 25922 Klebsiella
pneumoniae ATCC 13883 Streptococcus pyogenes ATCC 12345 Salmonella
typhimurium C5 CIP Pseudomonas aeruginosa ATCC 10145 Staphylococcus
aureus ATCC 25293 e Bacillus cereus As cepas referentes aos micro-organismos
Bacteroides fragilis C45A AUS 00306 e Clostridium perfringens foram cedidas pelo
Professor Dr Jorge Luiz Melo Sampaio pesquisador associado do Instituto Fleury
As espeacutecies de Ureaplasmas foram cultivadas em meio UB especiacutefico para
ureaplasma com 5 de CMRL-1066 (com glutamina e sem bicarbonato) enquanto
as espeacutecies de Micoplasmas foram cultivadas em meio de cultura SP4 como
descrito por Tully et al (1995) As bacteacuterias com parede celular incluiacutedas como
controles foram cultivadas em meio de infusatildeo de ceacuterebro-coraccedilatildeo (BHI) Destas
cepas o DNA foi extraiacutedo a partir de culturas em fase logariacutetmica por meio do kit
Pure Linktrade Genomic DNA da Invitrogenreg
4612 Desenvolvimento de primers e sonda para a detecccedilatildeo de Mollicutes pela PCR quantitativa
Os oligonucleotiacutedeos iniciadores e as sondas foram selecionadas com base no
fragmento conservado do gene 16S rRNA especiacutefico para a classe Mollicutes As
sequecircncias do gene 16S rRNA de micoplasmas foram alinhadas utilizando o
algoritmo ClustalW do Software MEGA4 As regiotildees variaacuteveis foram selecionadas
66
manualmente para o sequencionamento dos iniciadores e sondas utilizadas neste
ensaio Propriedades dos oligonucleotiacutedeos foram tambeacutem analisadas pelo Software
Primer Express ver 30 (Applied Biosystems Life Technologies Corporation
Carlsbad CA EUA) A especificidade dos iniciadores e da sonda foi testada ldquoin
silicordquo utilizando algoritmos BLAST
O quadro 02 mostra as sequecircncias forward e reverse selecionadas para
amplificar um fragmento conservado do gene 16S rRNA especiacutefico de Mollicutes A
sonda TaqMan especiacutefica para o fragmento amplificado foi desenvolvida por uma
fonte comercial (Applied Biosystems Life Technologies Corporation)
Quadro 2 - Sequecircncias dos iniciadores utilizados para amplificaccedilatildeo do gene 16S rRNA para Mollicutes
Iniciadores Sequecircncia
Molli1 5 GCA TTA GAT GAT CCG CCT GAG T 3
Molli2 5 GTC CCC GTC AAT TCC TTT AAG TT 3
Sonda 5 GTC CCC GTC AAT TCC TTT AAG TT 3
4613 PCR quantitativa
Ensaios de quantificaccedilatildeo absoluta do DNA alvo foram realizados com sistema
de PCR em tempo real (qPCR) StepOne (Applied Biosystems Life Technologies
Corporation) Diferentes concentraccedilotildees de cada primer iniciador e sonda foram
testados para aprimorar a reaccedilatildeo de qPCR Considerou-se ideal as seguintes
caracteriacutesticas r2 ge 0950 eficiecircncia entre 95 a 105 e slope proacuteximo de -332
A melhor reaccedilatildeo obtida foi a partir de 625 microl de Universal PCR Master Mix
(Applied Biosystems) 1 microM de cada iniciador 05 microM de sonda TaqMan MGB
marcada com corante fluorescente 25 microl de DNA extraiacutedo e aacutegua sem RNase para
o volume final de 125 microl As condiccedilotildees de amplificaccedilatildeo foram 50 degC por 10 min 95
degC por 10 min e 45 ciclos de desnaturaccedilatildeo a 95 degC durante 15 s anelamento a 59
degC durante 1 min Todas as reaccedilotildees foram realizadas em duplicata no aparelho
PCR em tempo real StepOnePlus (Applied Biosystems)
67
Para a construccedilatildeo de padrotildees de DNA para a quantificaccedilatildeo absoluta utilizou-
se como controle positivo a cepa de referecircncia ndash M hominis ATCC 23114 (PG-21)
que foi inicialmente cultivada em 1 ml de caldo SP4 a 37 degC e expandidos ateacute 100
ml Na fase de crescimento logariacutetmico (com base em alteraccedilotildees colorimeacutetricas) a
cultura foi centrifugada a 20600 rpm durante 30 minutos a 25 degC O DNA foi extraiacutedo
usando o kit PureLinktrade Genomic DNA Mini O nuacutemero de coacutepias de DNA genocircmico
foi calculado por espectrofotometria (NanoDrop ND -1000 WITec Ag Littau Suiacuteccedila)
Diluiccedilotildees decimais (107- 1 coacutepiasl) do DNA de M hominis para curva padratildeo foram
preparadas e analisadas
Os dados foram obtidos durante a etapa de anelamento e analisados pelo
Software StepOne 21 (Applied Biosystems Life Technologies Corporation) O limiar
foi ajustado manualmente dentro da curva logariacutetmica acima do niacutevel de detecccedilatildeo
basal e abaixo da fase linear e do platocirc O ciclo limiar (Ct-threshold cycle) das
diluiccedilotildees do genoma foi plotado contra o nuacutemero de log de coacutepias do genoma e
utilizado como entrada para criar a curva padratildeo Anaacutelises de regressatildeo linear foram
aplicadas para calcular os valores de r2 e do slope Assumindo a eficiecircncia de 100
se o molde de DNA eacute duplicado em cada ciclo a eficiecircncia da PCR foi calculada
como E= 10 (-1slope) - 1 onde E eacute a eficiecircncia da PCR
4614 Especificidade da qPCR e repetibilidade intra e inter-ensaios
O DNA dos micro-organismos utilizados como controles foi testado para
verificar a especificidade dos ensaios de qPCR (descrito em cepas bacterianas) A
repetibilidade intra-ensaio foi determinada executando cinco repeticcedilotildees das diluiccedilotildees
do genoma de M hominis (107 a 1 coacutepia do genoma bacterianoreaccedilatildeo) na mesma
reaccedilatildeo A curva padratildeo foi gerada utilizando o software StepOne 21 (Applied
Biosystems Life Technologies Corporation) A repetibilidade inter-ensaio foi obtida
por reaccedilotildees em triplicatas com a mesma diluiccedilatildeo do genoma em trecircs ensaios
diferentes em dias separados e consecutivos Estas repeticcedilotildees foram aplicadas
para determinar a meacutedia o desvio padratildeo e o coeficiente de variaccedilatildeo em valores de
Ct para cada diluiccedilatildeo do genoma
68
462 Reaccedilatildeo em cadeia da polimerase (PCR) convencional
As amostras cliacutenicas tambeacutem foram submetidas a PCR convencional para a
detecccedilatildeo da Classe Mollicutes utilizando-se dos os iniciadores descritos por Van
Kuppeveld et al (1992) Aacutegua livre de nuclease foi utilizada como controle negativo
em ambos os ensaios Os produtos amplificados foram analisados em gel de
agarose a 15 com brometo de etiacutedio 05 mmmL e tampatildeo TAE (Trisacetate 40
mM EDTA 2 mM pH 80) Os produtos foram visualizados e foto documentados sob
luz ultravioleta utilizando um sistema foto documentador (Vilber Lourmat Marne-la-
Vallee Franccedila)
463 Detecccedilatildeo de micro-organismos dos filos Firmicutes e Bacteroidetes e bacteacuterias totais (Eubacterias) por PCR em tempo Real (qPCR)
Para a construccedilatildeo de padrotildees de DNA para a quantificaccedilatildeo absoluta de
Firmicutes e Bacteroidetes utilizou-se como controles positivos as cepas de
referecircncias ndash Clostridium perfringens e Bacteroides fragilis respectivamente Para a
quantificaccedilatildeo de Bacteacuterias Totais (Eubacteacuterias) foi utilizado como controle positivo
Clostridium perfringens Os controles foram submetidos agrave extraccedilatildeo de DNA por meio
do kit QIAamp DNA stool ndash QIAGEN baseado no protocolo de extraccedilatildeo sugerido
pelo fabricante Para os filos Firmicutes Bacteroidetes assim como Bacteacuterias totais
foram utilizadas sequencias de iniciadores descritos por Guo et al (2008)
apresentadas no quadro 3
69
Quadro 3 ndash Sequecircncias dos iniciadores utilizados para amplificaccedilatildeo do gene 16S rRNA para Firmicutes Bacteroidetes e Bacteacuterias Totais (Eubacteacuterias)
Iniciadores Sequecircncia Referecircncia
Firm934F 5 GGA GYA TGT GGT TTA ATT CGA AGC A 3 GUO et al 2008
Firm1060R 5 AGC TGA CGA CAA CCA TGC AC 3
Bact934F 5 GGA RCA TGT GGT TTA ATT CGA TGA T 3 GUO et al 2008
Bact1060R 5 AGC TGA CGA CAA CCA TGC AG 3
Eub338F 5 ACT CCT ACG GGA GGC AGC AG 3 FIERER et al 2005
Eub518R 5 ATT ACC GCG GCT GCT GG 3
Os micro-organismos foram quantificados de modo absoluto baseando-se em
curva padratildeo previamente estabelecida Para cada reaccedilatildeo finalizada uma nova
curva padratildeo foi adicionada e paracircmetros de qualidade foram adotados na anaacutelise
sendo estes r2 ge 0950 eficiecircncia da reaccedilatildeo variando de 95 a 105 e slope
proacuteximo de -332
As reaccedilotildees de qPCR foram realizadas em volume final de 125 μL com 625
μL da mistura universal SYBR Green (Applied Biosystems Satildeo Paulo SP Brasil)
0 25 μM de cada primer especiacutefico 45μL de aacutegua e 125 μl de DNA extraiacutedo com
volume final de 125 μL As quantificaccedilotildees foram realizadas utilizando-se a
plataforma Applied Biosystems (Life Technologies Corporation) com os seguintes
paracircmetros 50 degC por 10 minutos 95 degC por 10 minutos seguidos de 45 ciclos de
95 degC por 15 segundos e 60degC por 1 minuto seguidas da curva de melting (15
segundos a 95 degC 1 minuto a 60 degC 15 segundos a 95 degC e 15 segundos e 60 degC)
47 Dosagem de citocinas do soro sanguiacuteneo
A dosagem das citocinas IL-1β TNF-α IL-10 e IL17-A foram realizadas
utilizando-se kit de ELISA de captura (eBioscience San Diego C A Estados
Unidos) em placas de poliestireno com 96 orifiacutecios e alta absorccedilatildeo de acordo com
protocolo indicado pelo fabricante Apoacutes padronizaccedilatildeo da curva padratildeo a aliacutequota
de 100 microL do sobrenadante das ceacutelulas foi utilizada para dosar as citocinas IL-1β
TNF-α IL-10 e IL17-A A leitura foi realizada com instrumento leitor de ELISA Vivid
70
Vision com comprimento de onda de 450 nm Os dados obtidos em absorbacircncia
foram transformados em picomols por meio de foacutermula matemaacutetica
48 Anaacutelises Estatiacutesticas
As anaacutelises estatiacutesticas da presenccedila dos microrganismos da classe Mollicutes
detectados nas amostras cliacutenicas e dos dados obtidos dos questionaacuterios foram
avaliados por meio do software SPSS 200 (SPSSreg Inc Chicago Estados Unidos)
Para comparar variaacuteveis de consumo alimentar e as variaacuteveis relacionadas ao perfil
da populaccedilatildeo estudada entre os grupos caso e controle foi aplicado Teste de qui-
quadrado de Pearson ou Teste Exato de Fisher tendo sido considerado plt005 e IC
95 O teste t que compara meacutedia entre grupos foi utilizado para verificar a
existecircncia de associaccedilatildeo entre as variaacuteveis desfecho (mulheres obesas x mulheres
eutroacuteficas) e as variaacuteveis Mollicutes (presenccedila x ausecircncia) com o consumo
alimentar dos macronutrientes carboidratos proteiacutenas lipiacutedeos e fibras (p le 005)
Unidos) Aleacutem disso para verificaccedilatildeo de associaccedilatildeo entre as variaacuteveis desfecho e a
presenccedila de Mollicutes foi aplicado Teste de qui-quadrado de Pearson ou Teste
Exato de Fisher tendo sido calculada a razatildeo de chances (odds ratio) (IC 95)
com o objetivo de verificar o poder da associaccedilatildeo entre as variaacuteveis supracitadas
Para verificar as distribuiccedilotildees de cargas dos micro-organismos estudados em
ambos os grupos avaliados inicialmente foi utilizado o teste de normalidade de
Shapiro-Wilk que demonstrou natildeo satisfazer a preacute-suposiccedilatildeo para utilizaccedilatildeo de um
teste parameacutetrico A partir desse resultado foi utilizado o teste natildeo-parameacutetrico de
Mann-Whitney amplamente utilizado para amostras pareadas que natildeo seguem
distribuiccedilatildeo normal As anaacutelises foram realizadas utilizando o programa estatiacutestico
GraphPad Prism versatildeo 500 (GraphPad Software San Diego California USA)
sendo estabelecida a existecircncia de significacircncia estatiacutestica quando o valor de p le
005 em todas as anaacutelises
Para anaacutelise dos dados de quantificaccedilatildeo das citocinas tambeacutem foi utilizado o
programa GraphPad Prism versatildeo 500 (GraphPad Software San Diego California
USA) tendo sido realizado o teste natildeo-parameacutetrico de Mann-Whitney
71
5 RESULTADOS
51 Perfil da populaccedilatildeo estudada
A amostragem do estudo envolveu 40 mulheres sendo 20 classificadas com
obesidade (IMC gt30 Kgm2) e 20 em eutrofia (IMC 185 - 249 Kgm2) com meacutedia de
idade de 38 anos para todas as mulheres 44 anos (DP 93 Amplitude 28-57) para
as mulheres obesas do grupo caso e 33 anos (DP 1204 Amplitude22-66) para as
mulheres eutroacuteficas do grupo controle
No presente estudo as variaacuteveis foram agrupadas em 9 Seccedilotildees com
resultados descritivos representados nas tabelas de 1 a 9 que representam a
subcategorizaccedilatildeo das variaacuteveis independentes para determinaccedilatildeo do perfil da
populaccedilatildeo estudada
O grupo das mulheres obesas foi caracterizado pela maioria de cor preta
parda ou indiacutegena (70) onde as moleacutestias atuais associadas mais frequentes
foram hipertensatildeo (30) dispneia (35) constipaccedilatildeo (35) refluxo (35) e
alteraccedilatildeo menstrual (55) A maioria das mulheres nasceram de parto normal
(75) foram amamentadas (90) jaacute tiveram filhos (70) e foram classificadas
como fisicamente ativas (60) Aleacutem disso 13 (65) das mulheres do grupo caso
referiram fazer trecircs ou mais refeiccedilotildees por dia Em relaccedilatildeo ao grupo das mulheres
eutroacuteficas esse foi caracterizado pela maioria de cor branca ou amarela (55) onde
as moleacutestias atuais associadas mais frequentes foram hipercolesterolemia (5)
dispneia (5) gastrite (15) e constipaccedilatildeo (20) Metade das mulheres nasceram
de parto normal (50) e foram amamentadas (85) enquanto 2 (10) tiveram
filhos e 9 (55) foram classificadas como fisicamente ativas Assim como o grupo
caso 13 (65) das mulheres do grupo controle referiram fracionar sua refeiccedilatildeo em
trecircs ou mais por dia
Aleacutem disso observa-se com base nos resultados estatiacutesticos que houve
variaccedilatildeo significativa na comparaccedilatildeo das variaacuteveis relacionadas ao perfil da
populaccedilatildeo estudada Em relaccedilatildeo agrave Seccedilatildeo 1 Histoacuteria Cliacutenica foram encontradas
variaccedilotildees significativas para as variaacuteveis associadas ao trato gastrintestinal
flatulecircncia (p=0008) refluxo (p=0018) azia (p=0008) e para as variaacuteveis
associadas agrave Moleacutestia atual hipertensatildeo (p=0008) dispneacuteia (p=0008) e alteraccedilatildeo
menstrual (p=0000) Em relaccedilatildeo agrave Seccedilatildeo 4 Histoacuteria Obsteacutetrica foi encontrada
72
variaccedilatildeo significativa para a variaacutevel gestaccedilatildeo (p=0000) Para a Seccedilatildeo 5 Histoacuteria
ginecoloacutegica observou-se variaccedilatildeo estatiacutestica para a variaacutevel menopausa (p=0038)
Tabela 1 ndash Determinaccedilatildeo do perfil da populaccedilatildeo estudada referente agrave Seccedilatildeo 1 Dados socioeconocircmicos Satildeo Paulo SP 2013-2014
Nota n= 20 mulheresa ndash Considerou-se como valor de Salaacuterio Miacutenimo (R$ 67800) ndash Significacircncia estatiacutestica quando p-valor le 005
Tabela 2 ndash Determinaccedilatildeo do perfil da populaccedilatildeo estudada referente agrave Seccedilatildeo 2 Histoacuteria Familiar Satildeo Paulo SP 2013-2014
Nota n= 20 mulheres a ndash Referente agrave parentes de primeiro grau paternos e maternos aleacutem de irmatildeos ndash Significacircncia estatiacutestica quando p-valor le 005
Variaacuteveis
Grupo Caso n ()
Grupo Controle n ()
IC 95 P
Raccedilacor
009-128 0110 PretaPardaIndiacutegena BrancaAmarela
14 (70) 6 (30)
9 (45) 11 (55)
Escolaridade
096-128 0147 lt Ensino Meacutedio ge Ensino Meacutedio
1 (5) 19(95)
0 (0) 20 (100)
Relaccedilatildeo Estaacutevel
023-283 0752 Sim Natildeo
11 (55) 9 (45)
10 (50) 10 (50)
Renda familiar
010-155 0185 lt 2 salaacuterios miacutenimosa ge 2 salaacuterios miacutenimosa
9 (45) 11 (55)
5 (25) 15 (75 )
Variaacuteveis
Grupo Caso n ()
Grupo Controle n ()
IC 95 P
Famiacutelia hipertensatildeo
006-120 0077 Sim Natildeo
17 (85) 3 (15)
12 (60) 8 (40)
Famiacutelia diabetesa
013-157 0206 Sim Natildeo
12 (60) 8 (40)
8 (40) 12 (60)
Famiacutelia obesidadea
007-106 0058 Sim Natildeo
13 (65) 7(35)
7 (35) 13 (65)
Famiacutelia hipercolesterolemiaa
035-430 0749 Sim Natildeo
11 (55) 9 (45)
12 (60) 8 (40)
Famiacutelia Doenccedilas Caacuterdio-vasculares (DCV)a
029-345 1000 Sim Natildeo
10 (50) 10 (50)
10 (50) 10 (50)
73
Tabela 3 ndash Determinaccedilatildeo do perfil da populaccedilatildeo estudada referente agrave Seccedilatildeo 3 Histoacuteria Cliacutenica Satildeo Paulo SP 2013-2014
Nota n=20 mulheres a- Histoacuterico cliacutenico das pacientes em relaccedilatildeo agrave alteraccedilotildees gastrintestinais moleacutestia atual e uso de laxantes- Diferenccedila estatiacutestica natildeo computada pois a variaacutevel eacute uma constante
Variaacuteveis
Grupo Caso n ()
Grupo Controle n ()
IC 95 P
TGI constipaccedilatildeoa
003-115 0058 Sim Natildeo
7 (35) 13 (65)
2 (10) 18 (90)
TGI flatulecircnciaa
107-190 0008 Sim Natildeo
6 (30) 14 (70)
0 (0) 20 (100)
TGI refluxoa
001-089 0018 Sim Natildeo
7 (35) 13 (65)
1 (5) 19 (95)
TGI aziaa
107-190 0008 Sim Natildeo
6 (30) 14 (70)
0 (0) 20 (100)
TGI uacutelceraa
095-116 0311 Sim Natildeo
1 (5) 19 (95)
0 00) 20 (100)
TGI gastritea Sim Natildeo
2 (10)
18 (90)
3 (15)
17 (85) 023-107 0633
TGI naacuteuseasa Sim Natildeo
3 (15)
17(85)
1 (5)
19 (95) 002-314 0292
TGI vocircmitosa Sim Natildeo
1 (5)
19 (95)
0 (0)
20 (100) 095-116 0311
TGI diarreacuteiaa Sim Natildeo
0 (0)
20(100)
0 (0)
20 (100)
Moleacutestia atual hipertensatildeoa Sim Natildeo
6 (30)
14 (70)
0 (0)
20 (100) 107-190 0008
Moleacutestia atual diabetesa Sim Natildeo
0 (0)
20 (100)
0 (0)
20 (100)
Moleacutestia atual hipercolesterolemiaa Sim Natildeo
5 (25)
15 (75)
1 (5)
19 (95) 001-150 0077
Moleacutestia atual DCVa Sim Natildeo
2 (10)
18 (90)
0 (0)
20 (100) 096-128 0147
Moleacutestia atual Dispneacuteiaa Sim Natildeo
7 (35)
13 (65)
1 (5)
19 (95) 001-089 0018
Moleacutestia atual alteraccedilatildeo menstruala Sim Natildeo
11 (55)
9 (45)
0 (0)
20 (100) 136-360 0000
Uso de laxantesa Sim Natildeo
3 (15)
17 (85)
0 (0)
20 (100) 097-141 0072
74
Tabela 4 ndash Determinaccedilatildeo do perfil da populaccedilatildeo estudada referente agrave Seccedilatildeo 4 Histoacuteria Obsteacutetrica Satildeo Paulo SP 2013-2014
Nota n= 20 mulheres andash Foram considerados aspectos relacionados as pacientes em seu nascimento e na maternidade ndash Significacircncia estatiacutestica quando p-valor le 005
Variaacuteveis
Grupo Caso n ()
Grupo controle n ()
IC 95 P
Nascimento por parto cesaacutereaa
078-1144 0102 Sim Natildeo
5 (25) 15(75)
10 (50) 10 (50)
Nascimento por parto normala
008-127 0102 Sim Natildeo
15 (75) 5 (25)
10 (50) 10 (50)
Foi amamentadaa
009-424 0633 Sim Natildeo
18 (90) 2 (30)
17 (85) 3 (15)
Teve alguma gestaccedilatildeoa
0008-0273 0000 Sim Natildeo
14 (70) 6 (30)
2 (10) 18 (90)
Sofreu algum abortoa Sim Natildeo
2 (10)
18 (90)
2 (10)
18 (90) 096-128 0147
75
Tabela 5 ndash Determinaccedilatildeo do perfil da populaccedilatildeo estudada referente agrave Seccedilatildeo 5 Histoacuteria Ginecoloacutegica Satildeo Paulo SP 2013-2014
Nota n= 20 mulheres andash Idade meacutedia em que todas as mulheres estudadas comeccedilaram a ingerir
contraceptivo 22 anos ndash Significacircncia estatiacutestica quando p-valor le 0005
Tabela 6 ndash Determinaccedilatildeo do perfil da populaccedilatildeo estudada referente agrave Seccedilatildeo 6 Consumo atual de tabaco Satildeo Paulo SP 2013-2014
Nota n= 20 mulheres ndash Significacircncia estatiacutestica quando p-valor le 005
Variaacuteveis
Grupo Caso n ()
Grupo Controle n ()
IC 95 P
Menopausa
004-097 0038 Sim Natildeo
9 (45) 11(55)
3 (15) 17 (85)
Usou ou estaacute usando contraceptivo
021-470 1000 Sim Natildeo
16 (80) 4 (20)
16 (80) 14 (20)
Contraceptivo hormonal
041-633 0490 Sim Natildeo
13 (65) 7 (35)
15 (75) 5 (25)
Contraceptivo natildeo hormonal
002-314 0292 Sim Natildeo
3 (15) 17(85)
1 (5) 19 (95)
Idade que comeccedilou a ingerir ge 22 anosa
011-156 0197 Sim Natildeo
10 (50) 10 (50)
6 (30) 14 (70)
Idade que comeccedilou a ingerir lt 22 anosa Sim Natildeo
2 (10)
18 (90)
2 (10)
18 (90) 063-853 0197
Variaacuteveis
Grupo Caso n ()
Grupo Controle n ()
IC 95 P
Consumo atual de tabaco
002-207 0151 Sim Natildeo
4 (20) 16 (80)
1 (5) 19 (95)
Jaacute consumiu tabaco
023-418 1000 Sim Natildeo
5 (25) 15 (75)
5 (25) 15 (75)
76
Tabela 7 ndash Determinaccedilatildeo do perfil da populaccedilatildeo estudada referente agrave Seccedilatildeo 7 Consumo atual de aacutelcool Satildeo Paulo SP 2013-2014
Nota n= 20 mulheres ndash Significacircncia estatiacutestica quando p-valor le 005
Tabela 8 ndash Tabela de determinaccedilatildeo do perfil da populaccedilatildeo estudada referente agrave Seccedilatildeo 8 Atividade Fiacutesica (IPAQ versatildeo curta) Satildeo Paulo SP 2013-2014
Nota n= 20 mulheres andash Para a classificaccedilatildeo foi utilizado o IPAQ (International Physical Activity Questionnaire) versatildeo curta Irregularmente ativa Irregularmente ativa A e B ndash Significacircncia estatiacutestica quando p-valor le 005
Variaacuteveis
Grupo Caso n ()
Grupo Controle n ()
IC 95 P
Consumo atual de aacutelcool
052-643 0342 Sim Natildeo
8 (40) 12 (60)
11 (55) 9 (45)
Variaacuteveis
Grupo Caso n ()
Grupo Controle
IC 95 P
Niacutevel de atividade fiacutesica
015-191 0342 Ativaa Irregularmente ativaa
12 (60) 8 (40)
9 (45) 11 (55)
77
Tabela 9 ndash Tabela de determinaccedilatildeo do perfil da populaccedilatildeo estudada referente agrave Seccedilatildeo 9 Mudanccedilas recentes nos haacutebitos alimentares Satildeo Paulo SP 2013-2014
Nota n= 20 mulheres andash Meacutedia de refeiccedilotildees diaacuterias 3 refeiccedilotildees - Diferenccedila estatiacutestica natildeo
computada pois a variaacutevel eacute uma constante ndash Significacircncia estatiacutestica quando p-valor le 005
Variaacuteveis
Grupo Caso n ()
Grupo Controle
n ()
IC 95 P
Mudou haacutebitos alimentares recentemente
007-151 0144 Sim Natildeo
7 (35) 13 (65)
3 (15) 17 (85)
Mudou haacutebitos alimentares recentemente para perda de peso
007-151 0144 Sim Natildeo
7 (35) 13 (65)
3 (15) 17 (85)
Mudou haacutebitos alimentares recentemente para dieta vegetariana ou restriccedilatildeo de consumo carne
Sim Natildeo
0(0) 20(100)
0(0) 20(100)
Mudou haacutebitos alimentares recentemente restriccedilatildeo de consumo sal
Sim Natildeo
0(0) 20(100)
0(0) 20(100)
Mudou haacutebitos alimentares recentemente para reduccedilatildeo do colesterol
Sim Natildeo
0(0) 20(100)
0(0) 20(100)
ge refeiccedilotildeesdiaa
Sim Natildeo
13(65) 7(35)
14(70) 6(30)
033-473 0736
lt refeiccedilotildeesdiaa
Sim Natildeo
7(35)
13(65) 7(35)
13(65) 027-366 1000
Desjejum diariamente
051-900 0288 Sim Natildeo
13 (35) 7(65)
16 (80) 4 (20)
Costuma beliscar entre as refeiccedilotildees
035-430 0749 Sim Natildeo
11 (55) 9 (45)
12 (60) 8 (40)
Costuma ingerir liacutequidos durante as refeiccedilotildees
009-154 0168 Sim Natildeo
16 (80) 4 (20)
12 (60) 8 (40)
Costuma fazer refeiccedilotildees fora de casa
112-933 0018 Sim Natildeo
12 (60) 8 (40)
19 (95) 1 (5)
78
52 Determinaccedilatildeo do estado nutricional
521 Avaliaccedilatildeo qualitativa do consumo alimentar
Na Tabela 10 (apecircndice) encontra-se a participaccedilatildeo dos alimentos nos grupos
e meacutedias de consumo diaacuterio dos alimentos pela populaccedilatildeo estudada Os alimentos
mais consumidos e que apresentaram frequecircncia diaacuteria de uma vez ao dia ou mais
em relaccedilatildeo ao grupo caso foram feijatildeo arroz alface tomate e oacuteleo azeite ou
vinagre para tempero de salada Em relaccedilatildeo ao grupo controle os que apresentaram
consumo diaacuterio de uma vez ou mais foram arroz e patildeo francecircs patildeo de forma
integral patildeo doce ou torrada
O percentual de consumo dos 16 grupos alimentares identificados derivados
do QFA (Tabela 11) em relaccedilatildeo ao grupo caso que foram consumidos por 80 ou
mais da populaccedilatildeo foram massas carne vermelha e ovos embutidos carne branca
cereais raiacutezes e tubeacuterculos hortaliccedilas e frutas No mesmo grupo populacional os
grupos alimentares de menor consumo foram bebida alcooacutelica leite e derivados e
preparaccedilotildees com percentuais de consumo de 30 493 e 525
respectivamente Os grupos que apresentaram consumo intermediaacuterio foram
Infusatildeo Oacuteleos e gorduras accediluacutecar e doces lanches leguminosas e alimentos
industrializados com percentuais de consumo de 60 616 65 783 783 e
79 respectivamente No grupo controle os grupos alimentares que apresentaram
consumo de 80 ou mais da populaccedilatildeo foram massa carne vermelha e ovos carne
branca cereais raiacutezes e tubeacuterculos hortaliccedilas lanches e accediluacutecar e doces Ainda
nesse grupo populacional os grupos alimentares de menor consumo assim como no
grupo caso foram bebida alcooacutelica preparaccedilotildees e leite e derivados com
percentuais de consumo de 45 45 e 486 respectivamente Os grupos que
apresentaram consumo intermediaacuterio foram oacuteleos e gorduras Infusatildeo alimentos
embutidos leguminosas alimentos industrializados e frutas com percentuais de
consumo de 616 65 65 65 657 731 respectivamente
79
Tabela 11 ndash Definiccedilatildeo dos grupos alimentares derivados do Questionaacuterio de Frequecircncia Alimentar (QFA) e percentual de consumo da populaccedilatildeo estudada Satildeo Paulo SP 2013-2014
Grupo Alimentar
Grupo Consumo Alimentos
Massas
Caso 90 Macarratildeo com molho sem carne macarratildeo com molho com
carne lasanha nhoque pizza e panqueca Controle 916
Preparaccedilatildeo Caso
525 Sopas polenta cozida ou frita
Controle 45
Carne vermelha e ovos
Caso 888 Carne bovina Carne de porco carne de sol bacon e ovo
Controle 813
Embutidos Caso 825 Linguiccedila e embutidos (presunto mortadela salsicha)
Controle 65
Carne branca Caso 975 Frango peixe e frutos do mar
Controle 95
Leite e derivados
Caso 493 Leite integral leite desnatado leite semi-desnatado iogurte
natural iogurte com frutas queijo mussarela queijo prato
parmesatildeo provolone queijo minas e ricota
Controle 486
Leguminosas
Caso 783 Feijatildeo lentilha ervilha seca gratildeo de bico soja feijoada feijatildeo tropeiro
Controle 65
Cereais raiacutezes e tubeacuterculos
Caso
813
Arroz branco integral cozido com oacuteleo e temperos batata frita
mandioca frita batata cozida mandioca cozida inhame purecirc
de batatas ou mandioca farinha de mandioca farofa cuscuz
tapioca aveia patildeo francecircs patildeo de forma torrada biscoito
sem recheio doce e salgado biscoito recheado biscoito
amanteigado waffer bolo simples bolo recheado
Controle
887
Hortaliccedilas
Caso 964 Alface tomate cenoura outros legumes (abobrinha berinjela chuchu pepino) outras verduras cruas (acelga ruacutecula agriatildeo) outras verduras cozidas (acelga espinafre escarola couve) broacutecolis couve-flor e repolho
Controle 926
Frutas Caso 825 Laranja mexerica abacaxi banana maccedila pecircra melatildeo
melancia mamatildeo goiaba abacate suco natural Controle 731
Industrializados
Caso
79
Maionese condimentos molho para salada patecirc chantilly suco industrializado refrigerante comum diet e light hambuacuterguer nuggets almondegas Controle 657
Infusatildeo Caso 60 Chaacute e cafeacute sem accediluacutecar chaacute e cafeacute com accediluacutecar
Controle 65
Bebida alcooacutelica Caso 30 Cerveja
Controle 45
Oacuteleos e gorduras Caso 616 Oacuteleo azeite vinagre manteiga ou margarina comum
manteiga ou margarina light Controle 616
Lanches Caso 783 Salgados fritos salgados assados sanduiacuteche
Controle 833
Aacutecuacutecar e doces Caso 65 Chocolate bombom brigadeiro chocolate em poacute sobremesas doces tortas e pudins accediluacutecar mel geleacuteia Controle 888
80
Todos os indiviacuteduos da pesquisa foram avaliados quanto a ingestatildeo dieteacutetica
Os dados dieteacuteticos obtidos foram traduzidos em energia macro e micronutrientes
(Tabela 12) Observa-se com base nos resultados estatiacutesticos que natildeo houve
variaccedilatildeo significativa no consumo alimentar das mulheres estudadas tendo sido
semelhante entre os grupos caso e controle Aleacutem disso ao realizar-se o teste t
comparando as meacutedias de consumo dos macronutrientes carboidratos proteiacutenas
lipiacutedios e fibras com as variaacuteveis desfecho (mulheres obesas x mulheres eutroacuteficas)
tambeacutem natildeo foram observadas associaccedilotildees estatisticamente significantes
Analisando a razatildeo de ingestatildeo quilocaloriasquilograma de peso corporal
tem-se que o grupo caso teve meacutedia de ingestatildeo energeacutetica de 199 kcalkgdia e o
grupo controle 279 kcalkgdia (Tabela 13) O grupo controle evidenciou consumo
compatiacutevel para a manutenccedilatildeo do seu peso (faixa de recomendaccedilatildeo 25-30
kcalkgdia) enquanto o grupo caso apresentou um niacutevel meacutedio de ingestatildeo abaixo
do valor de manutenccedilatildeo a ingestatildeo energeacutetica foi 204 menor do que a
recomendaccedilatildeo considerando-se o limite inferior de 25 kcalkgdia
Outra razatildeo de ingestatildeo gramas de proteiacutenasquilograma de peso corporal eacute
utilizada para caacutelculo e recomendaccedilatildeo de consumo proteacuteico sem prejuiacutezo da funccedilatildeo
renal (recomendaccedilatildeo de ingestatildeo 06 a 08 g de proteiacutenaskg de pesodia) O grupo
controle apresentou ingestatildeo proteacuteica acima do recomendado 12 g de proteiacutenaskg
de pesodia enquanto o grupo caso apresentou um niacutevel meacutedio de consumo
compatiacutevel com a recomendaccedilatildeo 078 g de proteiacutenaskg de pesodia apresentando-
se no limite maacuteximo preconizado (Tabela 13)
81
Tabela 12 ndash Anaacutelise de consumo de energia e nutrientes da populaccedilatildeo estudada Satildeo Paulo SP 2013-2014
Variaacuteveis Grupo Meacutedia de consumo
Desvio Padratildeo
IC 95 P
Energiadia (kcal)
Caso 18571 93622 (137401 ndash 205869) 093
Controle 1692 98334 (120438 ndash 217822)
Carboidratodia (g)
Caso 24345 16826 (16706 ndash 25787)
090 Controle 20785
10997 (15402 ndash 26294)
Gordura totaldia (g)
Caso
658
276
(5205 ndash 7926) 086
Controle
627
4714 (3998 ndash 8673)
Gordura polinsaturadadia
(g)
Caso 795 416 (617 ndash 937) 048
Controle 85 675 (575 ndash 1237)
Gordura monoinsaturadadia
(g)
Caso 206 925 (1640 ndash 2553)
059 Controle 182 1598
(1077 ndash 2651)
Gordura saturadadia (g)
Caso 2185 1149 (1670 ndash 2808)
075 Controle 204 1698 (1239 ndash 2924)
Proteiacutenadia (g) Caso 7355 3508 (5531 ndash 8905)
091 Controle 7285 4985 (4914 ndash 9849)
Fibra totaldia (g) Caso 168 902 (1247 ndash 1953)
027 Controle 1265 765 (944 ndash1699)
Fibra soluacuteveldia (g) Caso 4 332 (273 ndash 563)
029 Controle 285 23 (215 ndash 437)
Fibra insoluacuteveldia (g)
Caso 56 391 (404 ndash 703) 025
Controle 395 232 (338 ndash 562)
Colesteroldia (g) Caso 23635 13965 (17127 ndash 30877)
077 Controle 26105 26790 (12780 ndash 39313)
Vitamina Adia (UI) Caso 95885 55538 (70451 ndash 124904)
055 Controle 872 47033 (64231 ndash 110801)
Vitamina Cdia (mg) Caso 2105 18857 (11025 ndash 29152)
011 Controle 12035 8752 (7936 ndash 16565)
Vitamina B1dia (mg)
Caso 13 117 (131 ndash 204) 072
Controle 13 166 (104 ndash 260)
Vitamina B2dia (mg)
Caso 08 083 (107 ndash 174) 079
Controle 105 089 (103 ndash 193)
82
Tabela 12 ndash Anaacutelise de consumo de energia e nutrientes da populaccedilatildeo estudada Satildeo Paulo SP 2013-2014
(Continuaccedilatildeo)
Variaacuteveis Grupo Meacutedia
de consumo Desvio Padratildeo
IC 95 P
Vitamina B6dia (ug)
Caso 110 102 (121 ndash 197)
085 Controle 105 088 (110 ndash 197)
Vitamina B12dia (ug)
Caso 38 253 (309 ndash 562) 096
Controle 385 285 (302 ndash 578)
Vitamina Ddia (mg)
Caso 915 1620 (211 ndash 1803) 012
Controle 23 3357 (733 ndash 4061)
Niacinadia (mg)
Caso 19 1005 (1402 ndash 2191)
059 Controle 193
1303 (1339 ndash 2641)
Folatodia (mg)
Caso
24010
11621
(17758 ndash 28351) 054
Controle 20495 12117 (14708 ndash 26684)
Aacutecido pantotecircnicodia
(mg)
Caso 35 216 (292 ndash 443) 074
Controle 29 251 (220 ndash 469)
VitaminaEdia (mg)
Caso 1155 651 (894 ndash 1309) 079
Controle 99 625 (738 ndash 1368)
Iododia (mg) Caso 547 4984 (3206 ndash 8098)
049 Controle 4515 3674 (2814 ndash 6439)
Soacutediodia (mg) Caso 230285 159724 (155816 ndash 246261)
099 Controle 201715 148254 (127647 ndash 274446)
Caacutelciodia (mg) Caso 69045 42353 (47627 ndash 89502)
068 Controle 62645 33992 (46373 ndash 79973)
Magneacutesiodia (mg)
Caso 2325 10339 (17818 ndash 25995) 044
Controle 1947 9452 (14888 ndash 24255)
Zincodia (mg) Caso 85 523 (617 ndash 1115)
086 Controle 78 476 (603 ndash 1068)
Manganecircsdia (mg)
Caso 6 85 (206 ndash 1045) 064
Controle 1095 2019 (148 ndash 1446)
Potaacutessiodia (mg)
Caso 271955 117073 (208408 ndash 3131423) 029
Controle 220685 115874 (164415 ndash 279085)
Foacutesforodia (mg)
Caso 9754 44188 (73698 ndash 1151535) 086
Controle 9085 56939 (63379 ndash 119689)
83
Tabela 12 ndash Anaacutelise de consumo de energia e nutrientes da populaccedilatildeo estudada Satildeo Paulo SP 2013-2014
(Continuaccedilatildeo)
Variaacuteveis Grupo Meacutedia
de consumo Desvio Padratildeo
IC 95 P
Ferrodia (mg) Caso 137 859
(996 ndash 1538)
069
Controle 1145 616 (885 ndash 1492)
Cobredia (mg) Caso 1 0 917 (1 ndash 167)
090 Controle 085 109 (094 ndash 167)
Selecircniodia (ug) Caso 33475 21854 (23251 ndash 44777)
068 Controle 400 5844 (11179 ndash 69057)
Nota significacircncia estatiacutestica quando p-valor le 005
Tabela 13 ndash Comparaccedilatildeo das variaacuteveis dieteacuteticas relacionadas agraves razotildees de ingestatildeo e Valor Energeacutetico Total (VET) da populaccedilatildeo estudada Satildeo Paulo SP 2013-2014
Variaacuteveis Grupo Caso
Grupo controle
Energia (Kcal) 18571
1692
Kcalkgdia 199
279
Carboidrato (g) 24345
20785
Carboidrato (VET) 5241
4913
Proteiacutena (g) 7355
7285
Grama de proteiacutenakgdia
078
12
Proteiacutena (VET) 1584
1722
Lipiacutedeo (g) 658
627
Lipiacutedeo ( VET) 3188
3335
84
A partir de dados de meacutedia de ingestatildeo de macronutrientes comparou-se a
porcentagem que cada um deles carboidratos proteiacutenas e lipiacutedeos (Tabela 13)
representa no Valor Energeacutetico total (VET) ingerido com o intervalo de
balanceamento dieteacutetico proposto pelas Dietary References Intake (DRI) Assim
tem-se que os grupos caso e controle balancearam suas dietas conforme o intervalo
de distribuiccedilatildeo energeacutetica recomendado visualizado na figura 5 Em relaccedilatildeo ao
consumo de fibras foi observado que ambos os grupos apresentaram um consumo
inferior ao Adequate Intake (AI) com consumo de 168 e 1265 para os grupos
caso e controle respectivamente Em relaccedilatildeo ao consumo de lipiacutedios o consumo de
gordura saturada mostrou-se maior que os 7 recomendado pela Sociedade
Brasileira de Cardiologia (2007) em consonacircncia com a National Heart Lung e Blood
Institute dos Estados Unidos tanto no grupo caso quanto no grupo controle de
1058 e 1085 respectivamente
Figura 5 ndash Comparaccedilatildeo entre as meacutedias de consumo de macronutrientes dos Grupos Caso e Controle com a Faixa de Distribuiccedilatildeo Aceitaacutevel de macronutrientes (AMDRDRI) e AI (Adequate Intake) para a faixa etaacuteria de 20 a 70 anos Satildeo Paulo SP 2013-2014
Legenda ndash A recomendaccedilatildeo de consumo de macronutrientes para tal faixa etaacuteria eacute
para Carboidratos 45 a 65 do VET (Valor Energeacutetico Total) Proteiacutenas 10 a 35 do VET Lipiacutedeos 20 a 35 do VET e Fibras 21 a 26 gramasdia
85
A comparaccedilatildeo da meacutedia da ingestatildeo das vitaminas A C E e folato dos
grupos caso e controle com as recomendaccedilotildees de ingestatildeo mostrou que a meacutedia de
consumo dos grupos foi semelhante e de acordo com a recomendaccedilatildeo exceto para
folato e vitamina E em que ambos os grupos mostraram meacutedias de ingestatildeo abaixo
do recomendado (Figura 6)
Figura 6 ndash Comparaccedilatildeo entre as meacutedias de consumo das Vitaminas A C E e folato dos Grupos Caso e Controle com a Faixa de Distribuiccedilatildeo Aceitaacutevel de macronutrientes (AMDRDRI) e AI (Adequate Intake) para a faixa etaacuteria de 20 a 70 anos Satildeo Paulo SP 2013-2014
A comparaccedilatildeo da meacutedia das ingestotildees das Vitaminas B1 B2 B6 B12 D
Niacina e Aacutecido pantotecircnico dos grupos caso e controle com as recomendaccedilotildees de
ingestatildeo demonstrou que a meacutedia de consumo em relaccedilatildeo agraves vitaminas B1 e B12
estavam acima do recomendado nos dois grupos As vitaminas B6 e aacutecido
pantotecircnico apresentaram ingestatildeo inferior ao preconizado nos grupos caso e
controle Ambos os grupos estudados apresentaram consumo em concordacircncia com
as recomendaccedilotildees em relaccedilatildeo agrave niacina No entanto as vitaminas B2 e D
apresentaram consumo pelo grupo caso inferior enquanto o grupo controle
apresentou-se de acordo com a recomendaccedilatildeo (Figura 7)
86
Figura 7 ndash Comparaccedilatildeo entre as meacutedias de consumo das Vitaminas B1 B2 B6 B12 D Niacina e Aacutecido pantotecircnico dos Grupos Caso e Controle com a Faixa de Distribuiccedilatildeo Aceitaacutevel de macronutrientes (AMDRDRI)e AI (Adequate Intake) para a faixa etaacuteria de 20 a 70 anos Satildeo Paulo SP 2013-2014
Para os minerais foacutesforo e selecircnio a ingestatildeo dos grupos Caso e Controle
tambeacutem foi adequada Exceto para iodo caacutelcio e magneacutesio que tiveram a ingestatildeo
menor que a recomendaccedilatildeo e o cobre que apresentou uma ingestatildeo inferior ao
preconizado no grupo controle enquanto o grupo caso demonstrou uma ingestatildeo
adequada dentro dos limites de recomendaccedilatildeo (Figura 8)
87
Figura 8 ndash Comparaccedilatildeo entre as meacutedias de consumo de Sais Minerais dos Grupos Caso e Controle com a Faixa de Distribuiccedilatildeo Aceitaacutevel de macronutrientes (AMDRDRI)e AI (Adequate Intake) para a faixa etaacuteria de 20 a 70 anos Satildeo Paulo SP 2013-2014
Para os minerais e nutrientes soacutedio manganecircs e potaacutessio a ingestatildeo dos
grupos Caso e Controle foi adequada Exceto para ferro que apresentou ingestatildeo
menor que a recomendaccedilatildeo e o zinco que apresentou ingestatildeo um pouco inferior ao
preconizado no grupo controle enquanto o grupo caso demonstrou ingestatildeo
adequada dentro dos limites de recomendaccedilatildeo (Figura 9)
Figura 9 ndash Comparaccedilatildeo entre as meacutedias de consumo de Sais Minerais e outros nutrientes dos Grupos Caso e Controle com a Faixa de Distribuiccedilatildeo Aceitaacutevel de macronutrientes (AMDRDRI)e AI (Adequate Intake) para a faixa etaacuteria de 20 a 70 anos Satildeo Paulo SP 2013-2014
88
522 Avaliaccedilatildeo antropomeacutetrica do estado nutricional
Os resultados da avaliaccedilatildeo antropomeacutetrica estatildeo apresentados na tabela 14
Foi observado que as mulheres estudadas do grupo caso apresentaram meacutedia de
IMC (Iacutendice de massa corporal) de 365 kgm2 (DP 441 Amplitude 306-449) Ao
classificar as pacientes em classes de obesidade de acordo com os criteacuterios
determinados pela OMS (Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede) (1995) verificou-se que
nove (45) das mulheres apresentam obesidade grau I (IMC 30-3499 kgm2) sete
(35) apresentam obesidade grau II (IMC 35-3999 kgm2) e quatro (20) das
mulheres apresentam obesidade grau III (IMC ge 40 kgm2) As mulheres do grupo
controle apresentaram IMC meacutedio de 224 kgm2 (DP 204 Amplitude 188-249)
Em relaccedilatildeo ao percentual de gordura observou-se a meacutedia de 4535 (DP
518 Amplitude 354-534) de gordura corporal no grupo caso e 3004 (DP 671
Amplitude 113-404) no grupo controle indicando um excesso de gordura corporal
em ambos os grupos de acordo com LOHMAN (1992) Em relaccedilatildeo agrave essa
classificaccedilatildeo no grupo caso todas as mulheres apresentam riscos de doenccedilas
associadas agrave obesidade apresentando um percentual de gordura corporal maior que
32 Das mulheres do grupo controle 2 (10) apresentaram-se abaixo da meacutedia 1
(5) na meacutedia 8 (40) acima da meacutedia e 9 (45) apresentaram risco de
desenvolvimento de doenccedilas relacionadas com a obesidade
A avaliaccedilatildeo da Razatildeo cintura-quadril (RCQ) importante indicador de
obesidade central Comparando-se os resultados obtidos com o ponto de corte
recomendado pela OMS (Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede 1995) de 085 para
mulheres observou-se que todas as pacientes avaliadas do grupo caso apresentam-
se acima do recomendado com a meacutedia de RCQ de 099 (DP 0074 Amplitude
087-119) enquanto as mulheres do grupo controle apresentaram uma razatildeo meacutedia
de 083 (DP 0047 Amplitude 077-096) onde sete (35) mulheres apresentaram
a RCQ acima do valor referecircncia preconizado pela OMS No entanto ao avaliar a
Razatildeo cintura quadril de acordo com os pontos de corte propostos por LOHMAN et
al (1988) em relaccedilatildeo ao risco de desenvolvimento de doenccedilas associadas agrave
Siacutendrome Metaboacutelica (Doenccedilas cardiovasculares hipertensatildeo dislipidemia e
alteraccedilatildeo no metabolismo de carboidratos) os resultados demonstraram que em
relaccedilatildeo ao grupo caso 18 (90) das mulheres apresentaram alto risco para o
desenvolvimento dessas doenccedilas enquanto 2 (10) apresentaram risco moderado
89
Em relaccedilatildeo ao grupo controle foi observado que 3 (15) natildeo apresentaram riscos
13 (65) apresentaram baixo risco 1(5) apresentou risco moderado e 3 (15)
apresentaram alto risco para o desenvolvimento dessas doenccedilas
Tabela 14 ndash Comparaccedilatildeo de variaacuteveis antropomeacutetricas da populaccedilatildeo estudada
Variaacuteveis Grupo Meacutedia
Desvio Padratildeo
Miacutenimo Maacuteximo
Peso (kg) Caso 9329 105 7574 1075
Controle 6054 787 4575 7422
Estatura (m2) Caso 160 007 149 172
Controle 164 007 151 18
IMC (Kgm2) Caso 3645 452 306 449
Controle 2241 204 188 249
Razatildeo cintura-quadril (RCQ)
Caso 099 007 088 119
Controle 083 005 077 096
Gordura corporal total
()
Caso
4535
519
354
531
Controle
30035
671
113 404
90
53 Determinaccedilatildeo da microbiota intestinal
531 Padronizaccedilatildeo de reaccedilatildeo de PCR quantitativo (qPCR) por meio de TaqMan para a detecccedilatildeo de Mollicutes
Pela qPCR quantificou-se carga de Mollicutes representadas por unidades
formadoras de colocircnias (UFCmicrol) nas amostras de fezes O ensaio de qPCR
demonstrou eficiecircncia de reaccedilatildeo de E= 1033 (r2= 095) A sensibilidade do teste
foi de detecccedilatildeo de no miacutenimo dez coacutepias de genomareaccedilatildeo quando utilizados os
padrotildees de nuacutemero de coacutepias de DNA genocircmico diluiacutedo (Figura 10)
Figura 10 ndash Curva-padratildeo gerada a partir dos pontos de Ct obtidos com o graacutefico de amplificaccedilatildeo de diluiccedilotildees seriadas do controle positivo Mycoplasma hominis calculado pelo software StepOne 21 (Applied Biosystems Life Technologies Corporation) Satildeo Paulo SP 2013-2014
A repetibilidade testada por meio dos testes intra-ensaio e inter-ensaio da
qPCR estaacute apresentada na tabela 15 O ensaio foi especiacutefico para Mollicutes natildeo
tendo sido visualizada amplificaccedilatildeo dos controles microbianos de outros micro-
organismos utilizados
91
Tabela 15 ndash Repetibilidade intra-ensaio e inter-ensaio da qPCR para Mollicutes Satildeo Paulo SP 2013-2014
Nordm de coacutepias do Genoma
Repetibilidade intra-ensaio Repetibilidade inter-ensaio
Genoma bacteriano diluiacutedo
em 1times TE Genoma bacteriano diluiacutedo
em 1times TE
Ponto meacutedio de corte
(Ct plusmn SD) CV ()
Ponto meacutedio de corte (Ct plusmn SD)
CV ()
10 3537 plusmn 015 045 3494 plusmn 045 129
102 3425 plusmn 017 050 3379plusmn 029 087
103 3099 plusmn 021 070 3074 plusmn 039 128
104 2739 plusmn 023 084 2739 plusmn 038 142
105 2356 plusmn 012 054 2291plusmn 025 110
106 1874 plusmn 066 352 1915 plusmn 077 403
CV coeficiente de variaccedilatildeo
A PCR geneacuterica para Mollicutes foi positiva em 17 (85) das amostras
cliacutenicas do grupo caso e 8 (40) das amostras do grupo controle obtidas No
entanto nem todas as amostras positivas em cPCR para Mollicutes foram positivas
em qPCR 13 (65) das amostras do grupo caso e trecircs (15) do grupo controle
foram positivas em qPCR (Tabela 16)
Tabela 16 ndash Comparaccedilatildeo entre os resultados obtidos no teste de sensibilidade pelas teacutecnicas de PCR convencional e qPCR para detecccedilatildeo de Mollicutes Satildeo Paulo SP 2013-2014
Amostra
Grupo PCR convencional qPCR
n () n ()
Positivaa Caso 17 (85) 13 (65) Negativab 3 (15) 7 (35)
Positivaa
Negativab Controle 8 (40)
12 (60) 3 (15) 17 (85)
Nota n= 20 mulheres aPositiva - Detecccedilatildeo de produto de DNA esperado bNegativa - Ausecircncia de produto de DNA esperado
92
Por meio da PCR em tempo real foi possiacutevel quantificar o DNA e
consequentemente a carga do microrganismo representada por unidades
formadoras de colocircnias - ufcmicrol nas amostras de fezes coletadas Os resultados da
qPCR demonstraram uma carga meacutedia de Mollicutes nas amostras de fezes
analisadas referentes ao grupo caso de 584 x 103 ufcmicrol e de 156 ufcmicrol referentes
ao grupo controle Observa-se na figura 11 graacutefico de dispersatildeo referente agraves
cargas meacutedias das amostras positivas com detecccedilotildees de aproximadamente 101 a
103 UFCml de Mollicutes Contudo as meacutedias das dosagens foram maiores nas
mulheres do grupo caso E apoacutes anaacutelise estatiacutestica por Mann-Whitney foi possiacutevel
observar diferenccedila estatisticamente significante para a espeacutecie Mollicutes (p =
00023) Em seguida foi testada atraveacutes do teste de Odds Ratio a associaccedilatildeo
epidemioloacutegica entre as variaacuteveis desfecho (mulheres obesas x mulheres eutroacuteficas)
e as variaacuteveis Mollicutes (presenccedila x ausecircncia) tendo sido detectada uma
associaccedilatildeo positiva estatisticamente significante entre a presenccedila de Mollicutes e
mulheres obesas (OR= 115 IC= 242-554) Aleacutem disso ao realizar-se o teste t
comparando as meacutedias de consumo dos macronutrientes carboidratos proteiacutenas
lipiacutedios e fibras com as variaacuteveis Mollicutes (presenccedila x ausecircncia) natildeo foram
observadas associaccedilotildees estatisticamente significantes
Figura 11 - Quantificaccedilatildeo por qPCR de Mollicutes (UFCmicrol) a partir das amostras de fezes nos grupos caso e controle Satildeo Paulo SP 2013-2014
Legenda ndash Concentraccedilatildeo meacutedia de Mollicutes entre as mulheres do grupo caso (~584 x 103 UFC
microL) e controle (~156 UFC microL) estudadas e positivas para Mollicutes pelo qPCR (p-valor=00023)
Mediana e desvio padratildeo indicadas por linhas soacutelidas no graacutefico Anaacutelise estatiacutestica realizada por
Mann Whitney assumindo p-valor le 005
93
532 Detecccedilatildeo de micro-organismos dos filos Firmicutes e Bacteroidetes aleacutem de bacteacuterias totais (Eubacterias) por PCR em tempo Real (qPCR)
Todas as amostras 40 (100) foram positivas para Firmicutes e Bacteroidetes
na qPCR tanto para o grupo caso como para o controle Natildeo foram observadas
diferenccedilas estatisticamente significantes para as cargas de Firmicutes Bacteroidetes
e Bacteacuterias totais entre as mulheres do grupo caso e controle No entanto as cargas
meacutedias de Firmicutes e Eubacteacuterias no grupo caso foram maiores que no grupo
controle enquanto Bacteroidetes apresentou uma maior carga no grupo controle A
figura 12 representa os graacuteficos de dispersatildeo referentes agraves cargas meacutedias das
amostras de fezes para esses micro-organismos
Figura 12 - Quantificaccedilatildeo por qPCR de Firmicutes Bacteroidetes e Eubacterias (UFCmicrol) a partir das amostras de fezes nos grupos caso e controle Satildeo Paulo SP 2013-2014
Legenda ndash (a) Concentraccedilatildeo de Firmicutes (UFCmicroL) entre as mulheres do grupo caso (~869 x 1018 UFCmicrol) e controle (~504 x 1014 UFCmicrol) (b) Concentraccedilatildeo de Bacteroidetes (UFCmicroL) entre as mulheres do grupo caso (~879 x 108 UFCmicrol) e controle (~146 x 109 UFCmicrol) (c) Concentraccedilatildeo de Eubacterias (UFCmicroL) entre as mulheres do grupo caso (~731 x 1024 UFCmicrol) e controle (~619 x 1021 UFCmicrol) Mediana e amplitude interquartiacutelica indicadas por linhas soacutelidas no graacutefico Anaacutelise estatiacutestica realizada por Mann Whitney assumindo p-valor le 005
94
Com o intuito de verificar o percentual de micro-organismos da classe
Mollicutes frente agrave carga meacutedia de Firmicutes foi realizada a anaacutelise do percentual
meacutedio dos referidos micro-organismos onde verificou-se que Mollicutes representam
424 do nuacutemero meacutedio de Firmicutes detectados na qPCR especiacutefica para o
mesmo nas amostras analisadas no grupo caso e 25 x 10-4 no grupo controle
(Tabela 17)
Tabela 17 ndash Nuacutemero meacutedio de coacutepias e percentual dos grupos Mollicutes estudados frente ao Filo Firmicutes na populaccedilatildeo estudada Satildeo Paulo SP 2013-2014
Nota Meacutedia de coacutepiasgrama de fezes Percentual de coacutepias de Mollicutes em relaccedilatildeo ao Filo Firmicutes
Os resultados da qPCR demonstraram carga meacutedia de Bacteacuterias totais
(Eubacteacuterias) nas amostras de fezes analisadas do grupo caso (~731 x 1024 UFCmicrol)
e controle (~619 x 1021 UFCmicrol) As anaacutelises de percentual entre a carga meacutedia de
Bacteroidetes Firmicutes e Mollicutes e a carga meacutedia de bacteacuterias totais estatildeo
representadas na Tabela 18
Grupo Firmicutes Mollicutes
Meacutedia coacutepias g de fezes
Meacutedia coacutepias g de fezes
Caso 869x1018
584x103
424
Controle 504x1014
16
25x10-4
95
Tabela 18 ndash Nuacutemero meacutedio de coacutepias e percentual dos grupos de bacterianos estudados frente agraves bacteacuterias totais na populaccedilatildeo estudada Satildeo Paulo SP 2013-2014
Nota Meacutedia de coacutepiasgrama de fezes Percentual de coacutepias de cada bacteacuteria em relaccedilatildeo agraves bacteacuterias totais
Foi calculada a proporccedilatildeo de Firmicutes em relaccedilatildeo aos Bacteroidetes na
microbiota intestinal das mulheres estudadas tendo sido observada maior proporccedilatildeo
na microbiota intestinal das mulheres obesas em relaccedilatildeo agraves eutroacuteficas do grupo
controle (Tabela 19) A relaccedilatildeo entre o percentual de Firmicutes e Bacteroidetes na
microbiota intestinal das mulheres do grupo caso foi cerca de 29 x 107 maior entre
as mulheres obesas do grupo caso em comparaccedilatildeo com o grupo controle
Tabela 19 ndash Proporccedilatildeo de Firmicutes em relaccedilatildeo agrave Bacteroidetes na populaccedilatildeo estudada Satildeo Paulo SP 2013-2014
Nota Meacutedia de coacutepiasgrama de fezes
Grupo Bacteacuterias totais
Firmicutes Bacteroidetes Mollicutes
Meacutedia coacutepias g de fezes
Meacutedia coacutepias g de
fezes
Meacutedia coacutepias g de
fezes
Meacutedia coacutepias g de fezes
Caso 731x 1024
869x1018
442x105
879x108
718x10-2
584x103
28x 10-2
Controle 619x 1021
504x1014
171x105
146x109
624x102 16
22x10-11
Grupo Firmicutes Bacteroidetes Proporccedilatildeo FirmicutesBacteroidetes
Meacutedia coacutepias g de fezes
Meacutedia coacutepias g de fezes
Meacutedia coacutepias g de fezes
Caso 869x1018 879x108
134x1013
Controle 504x1014
146x109
45x 105
96
54 Dosagem de citocinas do soro sanguiacuteneo
Ao serem quantificadas as citocinas IL-1β IL-10 IL17-A e TNF-α pela
teacutecnica de ELISA no plasma sanguiacuteneo das mulheres natildeo foi observada diferenccedila
estatisticamente significante entre os grupos caso e controle para nenhuma das
citocinas avaliadas IL-1β (p= 02249) IL-10 (p=1) IL17-A (p=03169) e TNF-α
(p=02235) (Figura 13)
Figura 13 ndash Quantificaccedilatildeo de IL-1β IL-10 IL17-A e TNF-α (pgmL) no plasma sanguiacuteneo por meio do ELISA nos grupos caso e controle da populaccedilatildeo estudada Satildeo Paulo SP 2013-2014
Legenda- (a) Concentraccedilatildeo de IL-1β (pgml) no plasma sanguiacuteneo das mulheres casos e controles (b) Concentraccedilatildeo de IL-10 (pgml) no plasma sanguiacuteneo das mulheres casos e controles (c) Concentraccedilatildeo de TNF-α (pgml) no plasma sanguiacuteneo das mulheres casos e controles (d) Concentraccedilatildeo de IL17-A (pgml) no plasma sanguiacuteneo das mulheres casos e controles Desvio padratildeo e meacutedia indicados por linhas soacutelidas no graacutefico Anaacutelise estatiacutestica por Mann Whitney p lt 005
97
6 DISCUSSAtildeO
A microbiota intestinal eacute um ecossistema complexo que desempenha um
importante papel na gecircnese da obesidade associada com o desenvolvimento das
respostas imunoloacutegicas aleacutem do estado nutricional do hospedeiro Projetos
mundiais de pesquisa estatildeo em desenvolvimento para compreender esta
complexidade microbiana na sauacutede humana (SHETTY et al 2013) O presente
estudo avaliou a participaccedilatildeo dos micro-organismos da Classe Mollicutes e dos Filos
Firmicutes e Bacteroidetes na microbiota intestinal de mulheres obesas e eutroacuteficas
Na diversidade das populaccedilotildees humanas e a ocorrecircncia da obesidade eacute
importante estudar a distribuiccedilatildeo da microbiota intestinal fazendo-se necessaacuterio e
imprescindiacutevel a caracterizaccedilatildeo da populaccedilatildeo estudada em relaccedilatildeo agrave preditores
importantes associados com a obesidade microbiota intestinal e ambiente
(KALLIOMAKI et al 2008 PENDERS et al 2006) No presente estudo observou-
se variaccedilatildeo estatiacutestica em relaccedilatildeo agrave variaacutevel gestaccedilatildeo onde 14 (70) das mulheres
do grupo caso e 2 (10) do controle relataram jaacute terem tido filhos Aagaard et al
(2012) verificaram que o microbioma era semelhante em mulheres gravidas ou natildeo
No entanto as mulheres graacutevidas apresentaram microbioma menos diversificado
Sugeriu-se que entre as mulheres em idade reprodutiva o microbioma permanece
como uma comunidade dinacircmica na vida reprodutiva do adulto e que a estrutura da
comunidade natildeo-graacutevida pode retornar em alguma medida nas uacuteltimas semanas de
gestaccedilatildeo Aleacutem disso alguns autores tecircm sugerido que o acuacutemulo de gordura
corporal na obesidade pode acarretar vaacuterias consequecircncias agrave sauacutede como diabetes
mellitus tipo 2 hipertensatildeo arterial dispneacuteia cacircncer dislipidemia doenccedilas
cardiacuteacas doenccedilas hepatobiliares osteoartrite alteraccedilotildees gastrintestinais e
distuacuterbios psicossociais o que corrobora com os achados em relaccedilatildeo agrave histoacuteria
cliacutenica das mulheres estudadas (FRANCISCHI et al 2000 PEREIRA et al 2003
SILVA 2005)
Para as mulheres em especial a menopausa tem sido associada como
colaboradora para o desenvolvimento de obesidade e acuacutemulo de gordura corporal
(SOWERS et al 2007) No presente estudo encontraram-se diferenccedilas estatiacutesticas
em relaccedilatildeo agrave variaacutevel menopausa onde 9 (45) das mulheres obesas do grupo
caso e 3 (15) das mulheres do grupo controle relataram ter entrado na
98
menopausa Entretanto Sternfeld et al (2004) em estudo de coorte feminina entre
42-52 anos de idade nos EUA natildeo encontraram associaccedilatildeo entre a menopausa e o
aumento de circunferecircncia da cintura bem como aumento do peso dessa forma
sugerindo que somente um fator pode natildeo ser o responsaacutevel pelo desenvolvimento
de obesidade No presente trabalho observou-se que 75 das mulheres do grupo
caso e 50 do grupo controle nasceram de parto normal Tem sido evidenciado na
literatura que o tipo de parto pode interferir na composiccedilatildeo da microbiota pela forma
de colonizaccedilatildeo do receacutem-nascido O parto via cesariana aumentaria o risco de
obesidade em relaccedilatildeo ao parto normal (HUH et al 2012 PEI et al 2014) Nesse
sentido Ajslev et al (2011) em estudo longitudinal prospectivo na infacircncia com
acompanhamento ateacute os sete anos observaram que uma combinaccedilatildeo de
exposiccedilotildees precoces que inclui o tipo de parto o IMC maternal preacute-gestacional e
uso de antibioacuteticos na primeira infacircncia (lt6 meses) influenciaram o risco de excesso
de peso
Existem diversos estudos em relaccedilatildeo aos fatores dieteacuteticos e a gecircnese da
obesidade (DAILEY 2014 ISOMAA et al 2001 MORENO-INDIAS et al 2014
PEREIRA et al 2002 ROMERO ZANESCO 2006 SANTOS et al 2006) No
entanto no presente estudo o valor energeacutetico encontrado em relaccedilatildeo ao grupo
caso ao analisar-se a razatildeo quilocaloriasquilograma de peso corporal foi inferior agrave
recomendaccedilatildeo caracterizando alimentaccedilatildeo insuficiente em energia (WHO 2003)
Da mesma maneira que no presente estudo Pereira et al (2012) natildeo encontraram
diferenccedilas significativas entre o consumo energeacutetico entre indiviacuteduos eutroacuteficos e
obesos Souza et al (2010) estudaram a ingestatildeo alimentar e balanccedilo energeacutetico da
populaccedilatildeo adulta de Niteroacutei- RJ e encontraram que a ingestatildeo energeacutetica mostrou-
se decrescente com o aumento do IMC para as mulheres A ingestatildeo energeacutetica em
menor quantidade parece indicar que embora o corpo esteja obeso os tecidos vitais
satildeo inadequadamente nutridos pois a alimentaccedilatildeo insuficiente fornece poucos
nutrientes (HUTSON et al 1965) Sawaya et al (2003) em estudo com mulheres
realizado em Maceioacute tambeacutem observaram que a ingestatildeo energeacutetica entre os
grupos eutroacutefico e obesos natildeo apresentou diferenccedila significativa Em outro estudo
com mulheres no Rio Grande do Sul tambeacutem foi verificado que o consumo alimentar
energeacutetico natildeo apresentou diferenccedila significativa (p=0157) entre os grupos (baixo
peso eutroacutefico e excesso de pesoobesidade) (FRANKE et al 2007) Com isto
99
provavelmente a ingestatildeo energeacutetica natildeo seja a causa da obesidade nas mulheres
estudadas sendo que a baixa ingestatildeo aliada a algumas deficiecircncias nutricionais e
predisposiccedilatildeo geneacutetica possa criar mecanismos de adaptaccedilatildeo levando a um ciclo
metaboacutelico cujo o desfecho seja o armazenamento de gordura na regiatildeo abdominal
(BALAMURUGAN et al 2010 CANI DELZENNE 2009 DAVID et al 2014
HANSON et al 2009 JIMENEZ MARTIN-MORENO 1995) Nesse contexto
devem ser considerados outros fatores de economia energeacutetica tais como o
desequiliacutebrio na microbiota intestinal aleacutem da adaptaccedilatildeo dos mecanismos de
consumo energeacutetico acarretando maior rendimento das calorias absorvidas
BALAMURUGAN et al 2010 CANI DELZENNE 2009 DAVID et al 2014
DEWULF et al 2013 DIBAISE FRANK MATHUR 2012 FRANKE 2007 GRAF et
al 2015 KOENIGA et al 2011 LE CHATELIER et al 2013 LEY et al 2006
PATIL et al 2012 RAOULT 2008 SAWAYA et al 2003 WICHMANN et al
2013)
Analisando a contribuiccedilatildeo do consumo dos macronutrientes e das fibras os
resultados do presente estudo demonstraram que este consumo estaacute dentro dos
criteacuterios exceto para o consumo de fibras que foi abaixo da recomendaccedilatildeo em
ambos os grupos Aleacutem disso comparando-se as meacutedias de consumo dos
macronutrientes e das fibras com as variaacuteveis desfecho (obesas x eutroacuteficas)
tambeacutem natildeo houve associaccedilotildees estatisticamente significantes Em Satildeo Paulo
observou-se que 295 dos indiviacuteduos entrevistados relataram ingestatildeo inferior agraves
necessidades fisioloacutegicas dos quais 58 eram indiviacuteduos obesos (SALVO
GIMENO 2002) Em outro estudo realizado com trabalhadores adultos de ambos os
sexos tambeacutem no Estado de Satildeo Paulo para avaliaccedilatildeo da ingestatildeo alimentar e
consumo de fibras dieteacuteticas foi encontrado que o consumo individual de fibras
dieteacuteticas diaacuteria variou 587 g a 2957 g sendo o consumo meacutedio da populaccedilatildeo
1461 g (PASSOS SHEID 2008) Fisberg et al (2009) em estudo realizado sobre
iacutendice de qualidade da dieta observaram padratildeo dieteacutetico com alto conteuacutedo de
gorduras totais colesterol e accediluacutecar refinado e com baixo teor de fibra alimentar
Estes resultados diferem em parte do padratildeo alimentar da populaccedilatildeo estudada no
entanto demonstra a necessidade de estiacutemulo ao maior consumo de alimentos ricos
em fibra
100
A partir dos resultados do estudo evidencia-se a adequaccedilatildeo comprometida
na alimentaccedilatildeo devido agrave elevada ingestatildeo de lipiacutedios (gordura saturada) e ingestatildeo
reduzida de fibras em ambos os grupos estudados contribuindo tanto para a
obesidade quanto em relaccedilatildeo ao acuacutemulo de tecido adiposo nas mulheres obesas e
eutroacuteficas Esses dados estatildeo em conformidade com o presente estudo em relaccedilatildeo
agraves variaacuteveis antropomeacutetricas analisadas Percentual de gordura corporal e Razatildeo
cintura-quadril onde ambos os grupos se apresentaram acima da meacutedia referecircncia
indicando excesso de gordura corporal Assim como no presente estudo outros
trabalhos tecircm demonstrado limitaccedilotildees e evidenciado que natildeo existe correlaccedilatildeo
precisa entre o IMC e o porcentual de gordura corpoacuterea Isso explica o fato de
indiviacuteduos que apresentam IMC dentro do padratildeo de normalidade mas possuem
uma quantidade de gordura corporal acima do ideal confirmando relatos de que o
IMC natildeo eacute um bom indicador quantitativo de adiposidade corporal e que pode
subestimar o percentual de gordura e classificando de forma errocircnea indiviacuteduos com
excesso de adiposidade (COSTA et al 2007 GLANER 2005) Dessa forma o
aumento de gordura corporal principalmente na regiatildeo abdominal pode tornar a
utilizaccedilatildeo do IMC cada vez mais limitada na avaliaccedilatildeo do estado nutricional jaacute que
indiviacuteduos com sobrepeso ou ateacute mesmo eutroacuteficos podem apresentar risco de
alteraccedilotildees metaboacutelicas devido a valores elevados de circunferecircncia da cintura
(REZENDE 2010) Aleacutem disso nossos resultados evidenciaram valores elevados
para RCQ o que pode explicar a porcentagem de algumas moleacutestias atuais
associadas agrave obesidade encontradas em ambos os grupos no presente trabalho
(OMS 2002 DAcircMASO BERNARDES 2003 OCHS-BALCOM et al 2006)
Diversos estudos tambeacutem contribuiacuteram na melhor compreensatildeo entre as
influecircncias da nutriccedilatildeo e da composiccedilatildeo corporal na composiccedilatildeo da microbiota
intestinal (BALAMURUGAN et al 2010 DAVID et al 2014 DEWULF et al 2013
GRAF et al 2015 WICHMANN et al 2013) No entanto pouco se conhece sobre a
participaccedilatildeo dos micro-organismos da classe Mollicutes na microbiota
principalmente quando associadas com fatores dieteacuteticos e antropomeacutetricos
Constatou-se no presente estudo diferenccedila estatisticamente significante para micro-
organismos da classe dos Mollicutes (p = 00023) Foi detectada associaccedilatildeo
estatisticamente significante entre a presenccedila de Mollicutes e mulheres obesas
(OR= 115 IC= 242-554) Nesse contexto Turnbaugh et al (2008) avaliaram a
101
microbiota de modelos experimentais de ratos geneticamente idecircnticos de
obesidade induzida pelo consumo de dieta ocidentalizada caracterizada por alto teor
de gordura e accediluacutecar Todos os animais herdaram uma microbiota semelhante e no
estado de obesidade observou-se maior crescimento da bacteacuteria Eubacterium
dolichum (membro da classe Mollicutes) que foram posteriormente reduzidos por
subsequentes manipulaccedilotildees dieteacuteticas para limitar o ganho de peso Ainda neste
estudo observou-se que a abundacircncia da classe dos Mollicutes foi acompanhada
pela supressatildeo de toda a divisatildeo de Bacteroidetes indicando que a classe
Mollicutes teve aptidatildeo aumentada em relaccedilatildeo a Firmicutes e todos os outros
Bacteroidetes identificados na populaccedilatildeo estudada Os autores observaram que os
molicutes evoluiacuteram a capacidade para importar o tipo de hidratos de carbono
encontradas na dieta ocidental administrada nos modelos experimentais estando
essas vantagens principalmente relacionadas com o Sistema fosfotransferase (PTS)
De acordo com Deutscher et al (2006) o PTS desempenha um papel na regulaccedilatildeo
da expressatildeo do gene microbiano atraveacutes da repressatildeo cataboacutelica permitindo que a
ceacutelula passe a utilizar preferencialmente accediluacutecares simples em relaccedilatildeo a outros
hidratos de carbono Anaacutelises de fragmentos do gene 16S rRNA dos dados de
metagenocircmica confirmaram a presenccedila dos molicutes no microbioma cecal quando
associados agrave uma dieta ocidental Em contrapartida Hildebrandt et al (2009) por
meio de metagenocircmica de fezes de camundongos magros inicialmente submetidos
a dieta de raccedilatildeo padratildeo com posterior mudanccedila para dieta rica em gordura natildeo
relataram encontrar molicutes em dieta de alto teor de gordura
No presente estudo ao se comparar as meacutedias de consumo dos
macronutrientes carboidratos proteiacutenas lipiacutedios e fibras com as variaacuteveis Mollicutes
(presenccedila x ausecircncia) natildeo foram observadas associaccedilotildees estatisticamente
significantes No entanto foi observado alto consumo de gorduras saturadas nas
mulheres estudadas com diferenccedila estatisticamente significante entre a quantidade
de molicutes na microbiota intestinal Esses resultados associados com as
evidecircncias encontradas na literatura acerca da participaccedilatildeo desses micro-
organismos na microbiota de pessoas obesas fornecem importantes evidecircncias de
que natildeo apenas o consumo alimentar e o percentual de gordura ingerida possam
influenciar o aumento de molicutes na microbiota intestinal Mas que esse aumento
tambeacutem pode estar associado ao possiacutevel enriquecimento de rotas metaboacutelicas
102
envolvidas na utilizaccedilatildeo de accediluacutecares simples relacionadas ao sistema PTS Aleacutem
disso tem sido evidenciado na literatura que em experimentos com animais germ-
free o consumo de uma dieta obesogecircnica parece natildeo estimular o desenvolvimento
da obesidade e que sucessivas manipulaccedilotildees dieteacuteticas para limitar o ganho de
peso possivelmente promovam subsequentes variaccedilotildees em relaccedilatildeo agrave populaccedilatildeo
microbiana na microbiota intestinal (GOODMAN et al 2011 TURNBAUGH et al
2009 WALKER et al 2011 YI LI 2012) Este achado foi sustentado por um estudo
recente em camundongos que mostrou que a composiccedilatildeo microbiana do intestino
natildeo eacute determinada apenas pela dieta atual mas tambeacutem em parte pela histoacuteria
dieteacutetica Aleacutem disso um estudo em seres humanos concluiu que a mudanccedila no
padratildeo de consumo de fibras pode produzir fortes mudanccedilas na microbiota
intestinal mas que estas dependem da composiccedilatildeo inicial da microbiota intestinal do
indiviacuteduo (AAFKE et al 2015 CARMODY et al 2015)
Estudos recentes tecircm demonstrado que a microbiota intestinal humana pode
estar alterada em indiviacuteduos obesos Nesse contexto tem sido amplamente
discutida a participaccedilatildeo dos filos Firmicutes e Bacteroidetes na microbiota desses
indiviacuteduos Aleacutem disso tem sido evidenciado que o filo Firmicutes representam mais
de 90 das categorias filogeneacuteticas conhecidas dominando a microbiota distal
Nesse sentido a obesidade estaacute associada com as diferenccedilas da microbiota
intestinal em niacutevel filo com menor diversidade geral e maior proporccedilatildeo relativa de
Firmicutes em relaccedilatildeo agrave Bacteroidetes em indiviacuteduos obesos em comparaccedilatildeo com
indiviacuteduos eutroacuteficos (ECKBURG et al 2005 LEY et al 2006 MORAN
SHANAHAN 2014 TURNBAUGH et al 2009) Nesse contexto os resultados do
presente estudo demonstraram que a relaccedilatildeo entre o percentual de Firmicutes e
Bacteroidetes na microbiota intestinal das mulheres do grupo caso foi cerca de 29x
107 maior entre as mulheres obesas em comparaccedilatildeo com o grupo controle
Estudos demonstraram que a relaccedilatildeo entre percentual de Firmicutes e Bacteroidetes
na microbiota intestinal eacute de cerca de 7020 para os natildeo obesos e ateacute 855 para os
obesos O que significa cerca de cinco vezes maior em obesos em comparaccedilatildeo com
natildeo obesos (BALAMURUGAN et al 2010 ECKBURG et al 2005 KOENIGA et al
2011 LE CHATELIER et al 2013 PATIL et al 2012) Os nossos achados estatildeo
em conformidade com alguns resultados da literatura Em estudo realizado por
Ridaura et al (2013) transplantaram-se micro-organismos intestinais de humanos
103
obesos e eutroacuteficos em intestinos de ratos com peso meacutedio Aqueles que receberam
a microbiota de humanos obesos tornaram-se ratos obesos e aqueles que
receberam microbiota de humanos magros permaneceram magros Outro estudo
realizado por Remely et al (2015) que tambeacutem investigaram atraveacutes de qPCR a
microbiota de humanos obesos durante a intervenccedilatildeo dieteacutetica para perda de peso
induzida observaram diminuiccedilatildeo na proporccedilatildeo de FirmicutesBacteroidetes nos
obesos apoacutes a intervenccedilatildeo dieteacutetica
A proporccedilatildeo FirmicutesBacteroidetes tem sido associada como um marcador
de sauacutede para um indiviacuteduo e um desequiliacutebrio nesta proporccedilatildeo estaacute associada com
diferentes doenccedilas (MARIAT et al 2009) A mudanccedila na abundacircncia relativa destes
filos resulta no aumento da capacidade de captaccedilatildeo de energia a partir dos
alimentos aleacutem de induzir a inflamaccedilatildeo de baixo grau A reduccedilatildeo de Bacteroidetes
tem sido relacionada com dieta rica em gordura que pode resultar em aumento dos
niacuteveis plasmaacuteticos de LPS (CANI et al 2007 EVERARD CANI 2013) enquanto o
aumento Firmicutes tem sido associado com o consumo de carnes (EVERARD
CANI 2013) Aleacutem disso vaacuterios estudos tecircm mostrado mudanccedila da relaccedilatildeo de
FirmicutesBacteroidetes em pessoas obesas durante intervenccedilotildees dieteacuteticas para
perda de peso corporal sugerindo que as mudanccedilas na concentraccedilatildeo de bacteacuterias
nos indiviacuteduos obesos podem ser revertidas depois da perda de peso induzida por
dieta fazendo com que a microbiota do indiviacuteduo obeso se assemelhe ao indiviacuteduo
eutroacutefico (CLEMENTE et al 2012 DEWULF et al 2013 DIBAISE et al 2012
REMELY et al 2013 2015) Em contrapartida estes resultados natildeo satildeo universais
outros estudos demonstraram padrotildees variaacuteveis em mudanccedilas de niacutevel de filo
medidos na composiccedilatildeo da microbiota de indiviacuteduos obesos (MORAN SHANAHAN
2014 SCHWIERTZ et al 2010 ZHANG et al 2009) Duncan et al (2008) avaliaram
a relaccedilatildeo entre IMC perda de peso e a predominacircncia de grupos de bacteacuterias em
amostras fecais de pessoas obesas e natildeo obesas Estes indiviacuteduos foram
submetidos a duas dietas para perda de peso por quatro semanas Natildeo foi
encontrada diferenccedila entre Bacteroidetes nas amostras entre indiviacuteduos obesos e
natildeo obesos No entanto houve reduccedilotildees no grupo de Firmicutes em obesos
submetidos a dietas hipocaloacutericas Em outro estudo realizado por Schwiertz et al
(2010) tambeacutem natildeo foram observadas diferenccedilas nas contagens de Bacteroidetes e
Firmicutes entre os grupos de estudo Xiao et al (2014) em estudo com intervenccedilatildeo
104
dieteacutetica baseada em gratildeos integrais onde analisaram a microbiota intestinal de 123
voluntaacuterios obesos antes e depois da intervenccedilatildeo de 9 semanas seguida por um
periacuteodo de manutenccedilatildeo de 14 semanas tambeacutem natildeo observaram alteraccedilotildees
significativas na abundacircncia de Bacteroidetes e Firmicutes ou na proporccedilatildeo destes
dois filos durante a intervenccedilatildeo dieteacutetica mesmo quando os voluntaacuterios perderam
uma quantidade significativa de peso Estudos recentes do Projeto Microbioma
Humano natildeo encontraram associaccedilatildeo entre a proporccedilatildeo FirmicutesBacteroidetes e
obesidade ou Iacutendice de Massa Corporal (IMC) Nesse sentido tem sido sugerido por
alguns autores que a utilizaccedilatildeo dessa relaccedilatildeo como um biomarcador para a
obesidade permanece incerto devido a variabilidade dos dados na literatura
(FINUCANE et al 2014 MURPHY et al 2010)
Recentemente tem sido proposta uma nova hipoacutetese que associa a
microbiota intestinal com a homeostase metaboacutelica demonstrando-a como uma das
fontes potenciais de inflamaccedilatildeo de baixo grau (ARAKI et al 2005 OKAYASU et al
1990 RAKOFF-NAHOUM 2004 XIAO et al 2014 ZHAO 2013) Nesse contexto
tem sido demonstrado que dietas com alto teor de gordura tambeacutem podem aumentar
as concentraccedilotildees de LPS no plasma de humanos Estudo realizado por Cani et al
(2007) mostrou em camundongos que o maior consumo de gordura levou ao maior
aumento nas concentraccedilotildees de LPS no plasma A absorccedilatildeo de LPS reforccedilada pela
alta ingestatildeo de gordura pode estimular a secreccedilatildeo das citocinas TNF-α e IL-6
resultando em inflamaccedilatildeo sistecircmica de baixo grau dessa forma a microbiota
intestinal pode ter papel ativo na promoccedilatildeo eou inibiccedilatildeo da inflamaccedilatildeo e portanto
um efeito no metabolismo lipiacutedico (FLOCK GREEN KRIS-ETHERTON 2011) Os
resultados do presente estudo natildeo demonstraram diferenccedilas estatisticamente
significantes entre os grupos caso e controle para nenhuma das citocinas avaliadas
No entanto estudos in vitro mostraram que o consumo de aacutecidos graxos saturados
tambeacutem observado no presente estudo em ambos os grupos promovem processo
inflamatoacuterio com aumento da expressatildeo de IL-6 e TNF-α de TLR- 4 e consequente
aumento da ativaccedilatildeo da via NF-kβ (AJUWON SPURLOCK 2005 CALDER et al
2011 WEATHERILL et al 2005) Em estudos experimentais a dieta hiperlipiacutedica
rica em gordura saturada demonstrou promover obesidade com consequente
aumento de peso corporal adiposidade e marcadores inflamatoacuterios (FERNANDEZ-
REAL et al 2003 PEREIRA et al 2012) Esses achados podem explicar o fato de
105
que no presente estudo natildeo foram observadas diferenccedilas estatisticamente
significantes em relaccedilatildeo a liberaccedilatildeo de TNF-α e IL1-β entre os grupos estudados
Em relaccedilatildeo agrave liberaccedilatildeo da citocina IL-17 tambeacutem natildeo foram observadas diferenccedilas
estatisticamente significantes no entanto os achados da literatura teumlm sugerido
que no contexto de disbiose a presenccedila de agentes patogecircnicos pode perturbar a
regulaccedilatildeo do ambiente anti-inflamatoacuterio e que quando patoacutegenos enteacutericos superam
as bacteacuterias comensais o desequiliacutebrio entre comensais e bacteacuterias patogecircnicas
provocam liberaccedilatildeo significativa de MAMPs Este aumento pode induzir IECs DCs e
macroacutefagos ativados a secretar citocinas inflamatoacuterias como a IL-1β IL-6 IL-12 e
IL-23 Estas citocinas estimulam o desenvolvimento de ceacutelulas CD4+ T auxiliares
(T helper-TH1) e ceacutelulas TH17 (produzem IL-17A IL-17F e IL-22) resultando na
inflamaccedilatildeo crocircnica (MAYNARD et al 2012)
O estudo da influecircncia de diferentes elementos da dieta e composiccedilatildeo
corporal sobre a variaccedilatildeo da composiccedilatildeo da microbiota tornou-se uma aacuterea de
crescente interesse cientiacutefico Com efeito a relaccedilatildeo entre a microbiota intestinal e a
obesidade estaacute bastante reconhecida No entanto a participaccedilatildeo dos micro-
organismos da classe dos Mollicutes e alguns mecanismos subjacentes a essas
interaccedilotildees permanecem pouco estudados Em relaccedilatildeo agraves limitaccedilotildees do estudo
deve-se considerar o desenho transversal natildeo sendo possiacutevel estabelecer relaccedilatildeo
de causa e efeito No entanto o estudo mostra-se relevante destacando como
ponto forte o cuidado metodoloacutegico e a relevacircncia dos resultados encontrados
contribuindo para o avanccedilo dos estudos da relaccedilatildeo entre os molicutes microbiota
intestinal e obesidade Nesse contexto a importacircncia e validade de estudos como
este eacute apontar os possiacuteveis fatores de risco que contribuam para obesidade sendo
que a cuidadosa interpretaccedilatildeo dos resultados eacute importante para a geraccedilatildeo de
hipoacuteteses
Nesse contexto uma pesquisa acerca da relaccedilatildeo causa-efeito entre a
microbiota intestinal e a obesidade eacute altamente justificaacutevel uma vez que diferentes
espeacutecies de bacteacuterias podem desempenhar um papel significativo na safra de
energia humana e regulaccedilatildeo do peso corporal Aleacutem disso a consideraccedilatildeo de
fatores de estilo de vida em estudos da microbiota intestinal eacute altamente
recomendada uma vez que mudanccedilas no padratildeo alimentar e atividade fiacutesica podem
influenciar a composiccedilatildeo da microbiota intestinal para o desenvolvimento da
106
obesidade A partir disso o presente estudo fornece evidecircncias de que alteraccedilotildees e
interaccedilotildees na microbiota intestinal possam definir subconjuntos de indiviacuteduos com
diferentes perfis de risco metaboacutelico e assim contribuir para a investigaccedilatildeo da
heterogeneidade associada a fenoacutetipos relacionados com a adiposidade
especialmente em sociedades que estatildeo passando por transformaccedilotildees
socioeconocircmicas tecnoloacutegicas e culturais para um estilo de vida moderno
107
7 CONCLUSOtildeES
Os grupos caso e controle balancearam suas dietas conforme o intervalo de
distribuiccedilatildeo energeacutetica recomendado no entanto foi observado um consumo
de fibras inferior e de gorduras saturadas superior ao recomendado em
ambos os grupos
As mulheres de ambos os grupos apresentaram excesso de gordura corporal
Foi desenvolvido um ensaio de PCR em tempo real especiacutefico sensiacutevel
reprodutiacutevel e quantitativo para a detecccedilatildeo de Mollicutes nas fezes humanas
Foram encontradas associaccedilotildees estatisticamente significantes entre a
presenccedila de Mollicutes e mulheres obesas
Natildeo foram observadas associaccedilotildees estatisticamente significantes em relaccedilatildeo
as meacutedias de consumo dos macronutrientes carboidratos proteiacutenas lipiacutedios e
fibras com a presenccedila de Mollicutes
Natildeo foram observadas diferenccedilas estatisticamente significantes para as
cargas de Firmicutes Bacteroidetes e Bacteacuterias totais entre as mulheres do
grupo caso e controle
A proporccedilatildeo de Firmicutes em relaccedilatildeo aos Bacteroidetes foi maior na
microbiota intestinal das mulheres obesas em relaccedilatildeo agraves eutroacuteficas
Natildeo foi observada diferenccedila estatisticamente significante entre os grupos
caso e controle para nenhuma das citocinas avaliadas
108
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APEcircNDICE A ndash TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
128
Universidade de Satildeo Paulo
Instituto de Ciecircncias Biomeacutedicas
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
ESTUDO Avaliaccedilatildeo da participaccedilatildeo dos microrganismos da Classe Mollicutes na microbiota intestinal de mulheres eutroacuteficas e obesas
Vocecirc estaacute sendo convidado (a) a participar do projeto de pesquisa acima citado O documento
abaixo conteacutem todas as informaccedilotildees necessaacuterias sobre a pesquisa que estamos fazendo Sua
colaboraccedilatildeo neste estudo seraacute de muita importacircncia para noacutes mas se desistir a qualquer momento
isso natildeo causaraacute nenhum prejuiacutezo a vocecirc
Eu _________________________________________________________________ profissatildeo ____________________________
residente e domiciliado na
_______________________________________________________________________________________________________________
______________________________________________________________ portador da Ceacutedula de identidade RG
___________________________ e inscrito no CPFMF______________________________ nascido(a) em _____
_____ _______ abaixo assinado(a) concordo de livre e espontacircnea vontade em participar como
voluntaacuterio(a) do estudo ldquoAvaliaccedilatildeo da participaccedilatildeo dos microrganismos da Classe Mollicutes
na microbiota intestinal de mulheres eutroacuteficas e obesasrdquo Declaro que obtive todas as
informaccedilotildees necessaacuterias bem como todos os eventuais esclarecimentos quanto agraves duacutevidas por
mim apresentadas
Estou ciente que
I) O estudo se faz necessaacuterio para que se possam descobrir as possiacuteveis causas da doenccedila
denominada vaginoses bacterianas a ser estudada no projeto ldquoAvaliaccedilatildeo da
participaccedilatildeo dos microrganismos da Classe Mollicutes na microbiota intestinal de
mulheres eutroacuteficas e obesasrdquo
II) Seratildeo feitas uma coleta de 5ml de sangue e fezes em periacuteodo uacutenico
III) A participaccedilatildeo neste projeto natildeo tem objetivo de me submeter a um tratamento bem
como natildeo me acarretaraacute qualquer despesa financeira com relaccedilatildeo aos procedimentos
meacutedico-cliacutenico-terapecircuticos efetuados no estudo
129
IV) Tenho a liberdade de desistir ou de interromper a colaboraccedilatildeo neste estudo no momento
em que desejar sem necessidade de qualquer explicaccedilatildeo
V) A desistecircncia natildeo causaraacute nenhum prejuiacutezo agrave minha sauacutede ou bem estar fiacutesico Natildeo viraacute
interferir no atendimento ou tratamento meacutedico
VI) Os resultados obtidos durante este ensaio seratildeo mantidos em sigilo mas concordo que
sejam divulgados em publicaccedilotildees cientiacuteficas desde que meus dados pessoais natildeo sejam
mencionados
VII) Caso eu desejar poderei pessoalmente tomar conhecimento dos resultados ao final
desta pesquisa
( ) Desejo conhecer os resultados desta pesquisa
( ) Natildeo desejo conhecer os resultados desta pesquisa
VIII) Concordo que o material possa ser utilizado em outros projetos desde que autorizado
pela Comissatildeo de Eacutetica deste Instituto e pelo responsaacutevel por esta pesquisa Caso minha
manifestaccedilatildeo seja positiva poderei retirar essa autorizaccedilatildeo a qualquer momento sem
qualquer prejuiacutezo para mim
( ) Sim ou ( ) Natildeo
IX ) Poderei contatar a Secretaria da Comissatildeo de Eacutetica em Pesquisa com Seres Humanos ndash
ICBUSP - no Fone 30917733 (e-mail cepicbuspbr) ou (11 3091-7297 jotiuspbr)
para recursos ou reclamaccedilotildees em relaccedilatildeo ao presente estudo
X) O sujeito de pesquisa ou seu representante quando for o caso deveraacute rubricar todas as
folhas do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido ndash TCLE - apondo sua assinatura na uacuteltima
paacutegina do referido Termo
XI) O pesquisador responsaacutevel deveraacute da mesma forma rubricar todas as folhas do Termo de
Consentimento Livre e Esclarecido ndash TCLEndash apondo sua assinatura na uacuteltima paacutegina do
referido Termo
XII) Resoluccedilatildeo 19696 - Estou recebendo uma coacutepia deste Termo de Consentimento Livre e
Esclarecido
Satildeo Paulo___________de________________de 20_____ ( ) Paciente ( ) Responsaacutevel
Testemunha 1 _______________________________________________
Nome RG Telefone
130
Testemunha 2 ___________________________________________________
Nome RG Telefone
Responsaacutevel pelo Projeto _____________________________________________________
PROF DR JORGE TIMENETSKY
131
APEcircNDICE B ndash QUESTIONAacuteRIO
132
UNIVERSIDADE DE SAtildeO PAULO
INSTITUTO DE CIEcircNCIAS BIOMEacuteDICAS
MESTRADO EM MICROBIOLOGIA
Seccedilatildeo 1 IDENTIFICACcedilAtildeO E DADOS PESSOAIS
Nome Idade ID
Telefone Data
Profissatildeo
Estado civil 1 Casada 2 Solteira 3 Mora com companheiro 4 Viuacuteva 5 Divorciada
Raccedilacor 1 Branca 2 Preta 3 Amarela 4 Parda 5 Indiacutegena
Escolaridade 1 Analfabeto 2 1ordm grau incompleto 3 1ordm grau Completo
4 2ordm grau incompleto 5 2ordm grau completo 6 Superior incompleto 7 superior completo
Condiccedilatildeo Socioeconocircmica Indicar aproximadamente a renda domiciliarfamiliar mensal (soma de todos os ganhos
das pessoas que dividem as despesas) (valor SM R$ 67800)
ateacute 1 salaacuterio miacutenimo (ateacute R$ 61800)
1 a 2 salaacuterios miacutenimos (mais de R$ 61800 a R$ 123600)
2 a 5 salaacuterios miacutenimos (mais de R$ 123600 a R$ 309000)
5 a 10 salaacuterios miacutenimos (mais de R$ 309000 a R$ 618000)
mais de 10 salaacuterios miacutenimos (mais de R$ 618000)
Seccedilatildeo 2 HISTOacuteRIA FAMILIAR (parentes de 1ordm grau paternos e maternos e irmatildeos)
1 HAS 2 Diabetes 3 Obesidade 4 Hipercolesterolemia 5 DCV
Seccedilatildeo 3 HISTOacuteRIA CLIacuteNICA
133
Alteraccedilotildees gastrointestinais 1 Constipaccedilatildeo Flatulecircncia 3 Refluxo 4 Azia
5 Ulcera 6 Gastrite 7 Naacuteuseas 8 Vocircmitos
Como o intestino se comporta habitualmente 1 Normal 2 Constipaccedilatildeo 3 Diarreacuteia
Moleacutestia atual 1 HAS 2 Diabetes 3 Obesidade 4 Hipercolesterolemia
5 DCV 6 Dispneacuteia 7 Alteraccedilatildeo Menstrual
Uso de laxantes 1 Sim 2 Natildeo
Seccedilatildeo 4 HISTOacuteRIA OBSTEacuteTRICA
Tipo de parto 1 Normal 2 Cesaacuterea
Foi amamentada 1 Natildeo 2 1 a 3 meses 3 4 a 6 meses 4 7 a 9 meses
5 10 a 12 meses 6 gt12 meses
Teve alguma gestaccedilatildeo 1 Sim 2 Natildeo
Quantos filhos 1 1 a 2 2 3 a 4 3 ge5
Quantos partos foram normais 1 1 a 2 2 3 a 4 3 ge5
Quantos partos foram cesaacuterea 1 1 a 2 2 3 a 4 3 ge5
Tempo de amamentaccedilatildeo dos filhos 1 Natildeo 2 1 a 3 meses 3 4 a 6 meses 4 7 a 9 meses
5 10 a 12 meses 6 gt12 meses
Seccedilatildeo 5 HISTOacuteRIA GINECOLOacuteGICA
Usou ou estaacute usando algum anticoncepcional (adesivo piacutelula anel vaginal DIU de hormocircnio injetaacutevel ou
bastatildeo subcutacircneo) 1 Sim 2 Natildeo
Com que idade comeccedilou a tomar
Parou de usar por algum tempo
Por quanto tempo parou
Seccedilatildeo 6 CONSUMO DE TABACO
134
Jaacute fumou mais de 20 maccedilos de cigarro (cachimbo ou charuto) em toda sua vida
1 Natildeo 2 Sim e fumo atualmente 3 Sim mas parei de fumar 4 Natildeo sabe natildeo informa
Se fumafumou o faz haacute quanto tempo
Quantos cigarros em meacutedia fumafumava por dia
____cigarros
____cachimbos
____charutos
Se parou de fumar haacute quanto tempo ocorreu
Seccedilatildeo 7 CONSUMO DE AacuteLCOOL
Etilista 1 Sim 2 Natildeo
Frequencia de ingestatildeo
Tipo de bebida ingerida
Haacute quanto tempo ingere
Seccedilatildeo 8 ATIVIDADE FIacuteSICA (IPAQ versatildeo curta)
As perguntas estatildeo relacionadas ao tempo que vocecirc gasta fazendo atividade fiacutesica na UacuteLTIMA
semana As perguntas incluem as atividades que vocecirc faz no trabalho para ir de um lugar a outro
por lazer por esporte por exerciacutecio ou como parte das suas atividades em casa ou no jardim
Para responder as questotildees lembre que
atividades fiacutesicas VIGOROSAS satildeo aquelas que precisam de um grande esforccedilo fiacutesico e que fazem respirar MUITO mais forte que o normal
atividades fiacutesicas MODERADAS satildeo aquelas que precisam de algum esforccedilo fiacutesico e que fazem respirar UM POUCO mais forte que o normal
Para responder as perguntas pense somente nas atividades que vocecirc realiza por pelo menos 10
minutos contiacutenuos de cada vez
135
1a Em quantos dias da uacuteltima semana vocecirc caminhou por pelo menos 10 minutos contiacutenuos em casa
ou no trabalho como forma de transporte para ir de um lugar para outro por lazer por prazer ou
como forma de exerciacutecio dias _____ por SEMANA ( ) Nenhum
1b Nos dias em que vocecirc caminhou por pelo menos 10 minutos contiacutenuos quanto tempo no total
vocecirc gastou caminhando por dia horas ______ Minutos _____
2a Em quantos dias da uacuteltima semana vocecirc realizou atividades MODERADAS por pelo menos 10
minutos contiacutenuos como por exemplo pedalar leve na bicicleta nadar danccedilar fazer ginaacutestica
aeroacutebica leve jogar volei recreativo carregar pesos leves fazer serviccedilos domeacutesticos na casa no
quintal ou no jardim como varrer aspirar cuidar do jardim ou qualquer atividade que fez aumentar
moderadamente sua respiraccedilatildeo ou batimentos do coraccedilatildeo (POR FAVOR NAtildeO INCLUA CAMINHADA)
dias _____ por SEMANA ( ) Nenhum
2b Nos dias em que vocecirc fez essas atividades moderadas por pelo menos 10 minutos contiacutenuos
quanto tempo no total vocecirc gastou fazendo essas atividades por dia
horas ______ Minutos _____
3a Em quantos dias da uacuteltima semana vocecirc realizou atividades VIGOROSAS por pelo menos 10
minutos contiacutenuos como por exemplo correr fazer ginaacutestica aeroacutebica jogar futebol pedalar raacutepido
na bicicleta jogar basquete fazer serviccedilos domeacutesticos pesados em casa no quintal ou cavoucar no
jardim carregar pesos elevados ou qualquer atividade que fez aumentar MUITO sua respiraccedilatildeo ou
batimentos do coraccedilatildeo dias _____ por SEMANA ( ) Nenhum
3b Nos dias em que vocecirc fez essas atividades vigorosas por pelo menos 10 minutos contiacutenuos quanto
tempo no total vocecirc gastou fazendo essas atividades por dia
horas ______ Minutos _____
Seccedilatildeo 9 HAacuteBITOS ALIMENTARES
Vocecirc mudou seus haacutebitos alimentares recentemente ou estaacute fazendo dieta para emagrecer ou por qualquer
outro motivo
1 Natildeo 5 Sim para reduccedilatildeo de sal
2 Sim para perda de peso 6 Sim para reduccedilatildeo de colesterol
3 Sim por orientaccedilatildeo meacutedica
136
4 Sim para dieta vegetariana ou reduccedilatildeo do consumo de carne
Vocecirc estaacute tomando algo para suplementar sua dieta (vitaminas minerais e outros produtos)
1 Natildeo 2 Sim regularmente 3 Sim mas natildeo regularmente
Se a resposta da pergunta anterior for sim favor preencher o quadro abaixo
Suplemento
Nome comercial Dose
Frequencia
Nuacutemero de refeiccedilotildees que costuma fazer por dia
Costuma fazer desjejum diariamente 1 Sim 2 Natildeo
Costuma beliscar entre as refeiccedilotildees 1 Sim 2 Natildeo
Costuma ingerir liacutequidos durante as refeiccedilotildees 1 Sim 2 Natildeo
Quantas refeiccedilotildees costuma fazer fora de casa por semana
Em que local costuma fazer as refeiccedilotildees fora de casa
1 Restaurantes 5 Natildeo faz
2 Lanches raacutepidos 6 Outro
3 Marmita
4 No trabalho
137
As questotildees seguintes relacionam-se ao seu haacutebito alimentar usual no PERIacuteODO DE UM ANO Para cada quadro responda por favor a frequecircncia que melhor descreva QUANTAS VEZES vocecirc costuma comer cada item e a respectiva UNIDADE DE TEMPO (se por dia por semana por mecircs ou no ano) Depois responda qual a sua PORCcedilAtildeO INDIVIDUAL USUAL em relaccedilatildeo agrave porccedilatildeo meacutedia indicada ESCOLHA SOMENTE UM CIacuteRCULO PARA CADA COLUNA Muitos grupos de alimentos incluem exemplos Eles satildeo sugestotildees e vocecirc pode pode consumir todos os itens indicados Se vocecirc natildeo come ou raramente come um determinado iacutetem preeencha o ciacuterculo da primeira coluna (N=nunca come) NAtildeO DEIXE ITENS EM BRANCO
138
139
140
141
Por favor liste qualquer outro alimento ou preparaccedilatildeo importante que vocecirc costuma comer ou beber pelo menos UMA VEZ POR SEMANA que natildeo foram citados aqui (por exemplo leite-de-coco outros tipos de carnes receitas caseiras creme de leite leite condensado gelatina e outros doces etc )
Alimento Frequecircncia por semana Quantidade Consumida
Quando vocecirc come carne bovina ou suiacutena vocecirc costuma comer a gordura visiacutevel 1 nunca ou raramente 2 algumas vezes 3 sempre 4 natildeo sabe Quando vocecirc come frango ou peru vocecirc costuma comer a pele 1 nunca ou raramente 2 algumas vezes 3 sempre 4 natildeo sabe
142
Seccedilatildeo 10 DADOS ANTROPOMEacuteTRICOS
Peso
_____________Kg
_____________Kg
Estatura
_____________m
_____________m
IMC
__________Calcular IMC= peso em Kg altura em m2
Circunferecircncia Abdominal
_____________cm
_____________cm
Reactacircncia
Resistecircncia ___________MG
_____________MLG
Peso MG_________kg
Peso MGL_________kg
TMB __________
aacutegua de massa magra
143
APEcircNDICE C- TABELA 10
144
Tabela 10 Participaccedilatildeo dos alimentos nos grupos meacutedias de consumo por dia dos alimentos consumidos pela populaccedilatildeo estudada Satildeo Paulo SP 2013-2014
Grupo Alimentar
Alimentos Grupo Frequecircncia diaacuteria (dp)
Frequecircncia diaacuteria (amplitude)
Massas
Macarratildeo com molho sem carne
Caso
02 (05)
(0-25)
Controle
02 (02) (0-043)
Macarratildeo com molho com carne lasanha nhoque
Caso 01 (012) (0-043)
Controle
02 (02) (0-079)
Pizza panqueca
Caso 015 (022) (0-1)
Controle 02 (01) (003-043)
Preparaccedilatildeo
Sopas
Caso 015 (018) (0-043)
Controle 014 (02) (0-043)
Polenta cozida ou frita
Caso 003 (005) (0-014)
Controle 0008 (003) (0-014)
Carne vermelha e
ovos
Carne bovina
Caso 06 (06) (008-25)
Controle 05 (018) (014-079)
Carne de porco Caso 008 (009) (0-043)
Controle 02 (05) (0-25)
Carne seca carne do sol bacon
Caso 006 (005) (0-014)
Controle 004 (006) (0-014)
Ovos Caso 02 (02) (0-1)
Controle 03 (05) (0-25)
Embutidos
Linguiccedila
Caso 011 (009) (0-043)
Controle 02 (05) (0-25)
Embutidos (presunto mortadela salsicha)
Caso 015 (023) (0-1)
Controle 02 (02) (0-043)
Carne branca
Frango Caso 06 (09) (003-3)
Controle 05 (05) (014-25)
Peixe e frutos do mar Caso 01 (01) (0-043)
Controle 01 (02) (0-043)
Leite e derivados
Leite integral Caso 07 (09) (0-3)
Controle 04 (06) (0-25)
Leite desnatado Caso 04 (09) (0-3)
Controle 002 (005) (0-014)
Leite semi-desnatado Caso 03 (08) (0-25)
Controle 0004 (002) (0-008)
Iogurte natural Caso 05 (09) (0-25)
Controle 03 (03) (0-079)
Iogurte com frutas Caso 03 (08) (0-25)
Controle 02 (02) (0-079)
145
Tabela 10 Participaccedilatildeo dos alimentos nos grupos meacutedias de consumo ao dia dos alimentos consumidos pela populaccedilatildeo estudada Satildeo Paulo SP 2013-2014
(Continuaccedilatildeo)
Grupo Alimentar
Alimentos Grupo Frequecircncia diaacuteria (dp)
Frequecircncia diaacuteria
(amplitude)
Leite e derivados
Queijo mussarela prato parmesatildeo e provolone
Caso 05 (07) (0-25)
Controle 05 (06) (003-25)
Queijo minas e ricota Caso 04 (08) (0-25)
Controle 04 (06) (0-25)
Leguminosas
Feijatildeo Caso 12 (09) (014-25)
Controle 06 (05) (008-25)
Lentilha ervilha seca gratildeo de bico soja
Caso 005 (009) (0-043)
Controle 006 (01) (0-043)
Feijatildeo tropeiro e feijoada
Caso 003 (003) (0-014)
Controle 002 (004) (0-014)
Cereais raiacutezes e
tubeacuterculos
Arroz branco ou integral cozido com
oacuteleo e temperos
Caso 15 (09) (043-25)
Controle 14 (07) (043-25)
Batata frita ou mandioca frita
Caso 007 (01) (0-043)
Controle 02 (01) (003-043)
Batata mandioca inhame (cozida ou assada) purecirc
Caso 01 (012) (0-043)
Controle 02 (02) (0-043)
Farinha de mandioca farofa cuscuz aveia tapioca
Caso 02 (03) (0-1)
Controle 01 (02) (0-1)
Patildeo francecircs patildeo de forma integral patildeo doce torrada
Caso 07 (06) (014-3)
Controle 17 (08) (0-25)
Biscoito sem recheio (doce salgado) Caso 04 (06) (0-25)
Controle 05 (06) (0-25)
Biscoito recheado waffer amanteigado
Caso 01 (03) (0-1)
Controle 009 (02) (0-043)
Bolo (simples recheado) Caso 01 (013) (0-043)
Controle 01 (013) (0-043)
Hortaliccedilas
Alface
Caso 12 (09) (008-3)
Controle 08 (06) (014-25)
Tomate Caso 14 (107) (008-3)
Controle 08 (06) (003-25)
Cenoura Caso 06 (07) (008-25)
Controle 04 (02) (0-1)
Outros legumes (abobrinha berinjela chuchu pepino)
Caso 04 (03) (008-1)
Controle 05 (07) (0-25)
Outras verduras cruas (acelga ruacutecula agriatildeo)
Caso 04 (03) (008-1)
Controle 04 (02) (0-1)
146
Tabela 10 Participaccedilatildeo dos alimentos nos grupos meacutedias de consumo ao dia dos alimentos consumidos pela populaccedilatildeo estudada Satildeo Paulo SP 2013-2014
(Continuaccedilatildeo)
Grupo Alimentar Alimentos Grupo Frequecircncia diaacuteria (dp)
Frequecircncia diaacuteria
(amplitude)
Hortaliccedilas
Outras verduras cozidas (acelga espinafre escarola couve)
Caso 03 (02) (0-1)
Controle 03 (02) (0-079)
Broacutecolis couve-flor repolho Caso 02 (015) (0-043)
Controle 03 (03) (0-1)
Frutas
Laranja mexerica abacaxi Caso 08 (09) (0-3)
Controle 04 (05) (003-25)
Banana Caso 08 (09) (0-3)
Controle 04 (02) (008-1)
Maccedilatilde pecircra Caso 05 (07) (0-3)
Controle 03 (03) (0-1)
Melatildeo melancia Caso 03 (07) (0-1)
Controle 01 (01) (0-043)
Mamatildeo Caso 03 (03) (0-1)
Controle 008 (006) (0-014)
Goiaba Caso 01 (02) (0-1)
Controle 0008 (002) (0-008)
Abacate Caso 08 (02) (0-1)
Controle 007 (001) (0-003)
Suco natural Caso 07 (09) (0-3)
Controle 03 (02) (0-1)
Industrializados
Maionese molho para salada patecirc chantily
Caso 01 (016) (0-043)
Controle 01 (02) (0-1)
Condimentos
Caso 04 (06) (0-25)
Controle 02 (03) (0-079)
Hamburguer nuggets almocircndega Caso 006 (009) (0-043)
Controle 005 (009) (0-043)
Suco industrializado Caso 08 (105) (0-3)
Controle 05 (03) (0-1)
Refrigerante comum Caso 02 (02) (0-079)
Controle 02 (02) (0-043)
Refrigerante light diet Caso 0 0
Controle 007 (02) (0-043)
147
Tabela 10 Participaccedilatildeo dos alimentos nos grupos meacutedias de consumo ao dia dos alimentos consumidos pela populaccedilatildeo estudada Satildeo Paulo SP 2013-2014
(Continuaccedilatildeo)
Grupo Alimentar Alimentos Grupo Frequecircncia diaacuteria (dp)
Frequecircncia diaacuteria
(amplitude)
Infusatildeo
Chaacute e cafeacute sem accediluacutecar Caso 09 (1) (0-25)
Controle 06 (07) (0-25)
Chaacute e cafeacute com accediluacutecar Caso 08 (08) (0-25)
Controle 07 (08) (0-3)
Bebida alcooacutelica
Cerveja
Caso 003 (005) (0-014)
Controle 0074 (01) (0-043)
Oacuteleos e gorduras
Oacuteleo azeite ou vinagre para tempero de salada
Caso 1 (09) (0-25)
Controle 03 (03) (0-1)
Manteiga ou margarina comum Caso 09 (09) (0-25)
Controle 07 (07) (0-25)
Manteiga ou margarina light Caso 02 (06) (0-25)
Controle 007 (003) (0-014)
Lanches
Salgado frito Caso 02 (03) (0-1)
Controle 01 (01) (0-043)
Salgado assado Caso 014 (02) (0-1)
Controle 02 (02) (0-043)
Sanduiche Caso 006 (009) (0-043)
Controle 005 (004) (0-014)
Accediluacutecar e doces
Chocolate bombom brigadeiro Caso 04 (04) (0-1)
Controle 06 (04) (003-2)
Achocolatado em poacute (adicionado ao leite)
Caso 013 (03) (0-1)
Controle 02 (03) (0-1)
Sobremesas doces tortas e pudins
Caso 02 (03) (0-1)
Controle 03 (03) (003-1)
Accediluacutecar mel e geleacuteia Caso 05 (07) (0-3)
Controle 08 (1) (0-3)
ldquoHoje lembrando-me dela me vendo nos olhos dela sei que o
tinha de ser se deu Por que era ela por que era eurdquo
Chico Buarque
Agrave minha matildee Maria Bernardete meu anjo de luz Dedico
AGRADECIMENTO ESPECIAL
Agrave Fundaccedilatildeo de Amparo agrave Pesquisa do Estado de Satildeo Paulo (FAPESP) agrave Fundaccedilatildeo de
Amparo agrave Pesquisa do Estado da Bahia (FAPESB) e agrave Coordenaccedilatildeo de
Aperfeiccediloamento de Pessoal de Niacutevel Superior (Capes) pelo apoio financeiro sem o
qual este estudo natildeo seria realizado
AGRADECIMENTOS
Agrave Deus e todos meus espiacuteritos de luz em vida e desencarnados por tudo que me
representam por me permitirem cruzar essa jornada com sabedoria resignaccedilatildeo feacute e
discernimento e por me mostrarem que os ldquoSinais seguem o que creemrdquo Ofereccedilo
Agrave melhor matildee que Deus poderia me permitir nascer que me mostrou a vida e me
ensinou os verdadeiros valores de amor perdatildeo caridade humildade e perseveranccedila
aleacutem de me mostrar que as barreiras da vida satildeo transponiacuteveis e que na verdade
devem ser encaradas como fronteiras Obrigada por continuar olhando por mim e me
incentivando mesmo de outro plano espiritual Sem o seu amor tudo isso seria
impossiacutevel A ti dedico
Agrave meu pai Oriston meu exemplo de vida e companheiro fiel por entender o meu
propoacutesito e me apoiar mesmo nas dificuldades Vocecirc me ensina mais a cada dia sobre
a leveza da vida e em como me tornar uma pessoa melhor uma filha melhor obrigada
Agrave meu irmatildeo Breno e minha cunhada Ariela pelo apoio e por me permitir ser a tia mais
feliz e amada desse mundo
Aos meus sobrinhos queridos Lulu Lis e Miguel por me mostrarem a pureza da vida e
do amor em sua essecircncia mais pura
Agrave Evinha minha ldquomatildee adotivardquo desde os meus 2 dias de vida por todo amor e
dedicaccedilatildeo Minha gratidatildeo seraacute eterna
Ao professor Jorge Timenetsky meu querido orientador por ter aceitado me orientar
natildeo soacute no planejamento e execuccedilatildeo do trabalho mas tambeacutem na vida Minha sincera
gratidatildeo pela orientaccedilatildeo dedicaccedilatildeo e competecircncia profissional
Ao professor Lucas meu mentor na vida e no trabalho pai matildee amigo e eterno
orientador Obrigada Marques por ter acreditado que essa semente um dia iria brotar
Sem o seu apoio e incentivo eu realmente natildeo conseguiria Ter vocecirc em meu caminho
eacute uma honra e um previleacutegio
Agrave Aricelma um dos maiores presentes que pude receber em minha trajetoacuteria pelo
amor conselhos carinhos e abraccedilos Vocecirc foi fundamental para eu me manter firme no
propoacutesito
Ao departamento de endocrinologia do HC-FMUSP e aos professores Alfredo Halpern e
Marcio Mancinni por abrirem as portas para a realizaccedilatildeo das coletas e por acreditarem
no trabalho
Aos funcionaacuterios do departamento de endocrinologia da HC-FMUSP sem os quais
seria inviaacutevel a realizaccedilatildeo das coletas
Aos pacientes por participarem deste estudo e me permitir aprender mais a cada
coleta
Ao professor Djanilson pelo auxiacutelio nas anaacutelises estatiacutesticas e por me apresentar
Jerusa um verdadeiro anjo sem a qual seria inviaacutevel as anaacutelises de consumo
alimentar
Agrave amiga e companheira de trajetoacuteria Aline Teixeira pela preciosa colaboraccedilatildeo nas
anaacutelises estatiacutesticas e por ser minha dupla imbatiacutevel
Ao amigo-irmatildeo Filipe Bezerra pela preciosa contribuiccedilatildeo nas adaptaccedilotildees das
ilustraccedilotildees e pela honra de sua amizade
Ao melhor grupo de pesquisa que jaacute sonhei fazer parte pelos ensinamentos e amizade
incondicional Juntos somos uma famiacutelia obrigada meus amigos
Agrave todos os amigos que passaram pelo aptdeg 63 ao longo desses anos vocecircs foram
fundamentais em todos os momentos dessa jornada
Aos funcionaacuterios do ICB II indispensaacuteveis no meu dia a dia pelo apoio amizade cafeacutes
e carinho
Agrave meus amigos-irmatildeos e suas respectivas famiacutelias por me ensinarem que amizade eacute o
sentimento que imanta as almas suave expressatildeo do ser que necessita intercambiar as
forccedilas da emoccedilatildeo sob os estiacutemulos do entendimento fraternal inspiradora de coragem
e de abnegaccedilatildeo que enfloresce as almas abenccediloando-as com resistecircncias para as
lutas Amo vocecircs gratidatildeo
Agrave todos que cruzaram meu caminho nesta jornada e que trouxeram consigo
ensinamentos que me transformaram em algueacutem melhor que outrora o meu muito
obrigada
Soacute o conhecimento vivido
O conhecimento de dentro para fora
Aquele que natildeo eacute aprendido nos livros nem na fria observaccedilatildeo
do fino repoacuterter de faro infaliacutevel
Soacute aquele conhecimento que se viveu dia a dia minuto a minuto
no erro e no acerto ()
Possibilita a criaccedilatildeo
Jorge Amado
18
RESUMO
SANTOS V M Avaliaccedilatildeo da participaccedilatildeo dos micro-organismos da Classe Mollicutes na microbiota intestinal de mulheres eutroacuteficas e obesas 2015 147 f Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Microbiologia) ndash Instituto de Ciecircncias Biomeacutedicas Universidade de Satildeo Paulo Satildeo Paulo 2015
A obesidade possui causas multifatoriais sendo caracterizada como um excesso de gordura
corporal acumulada no tecido adiposo causando impactos agrave sauacutede Estudos quanto agrave interaccedilatildeo
geneacutetica do indiviacuteduo com o ambiente mostram que alguns indiviacuteduos satildeo mais propensos ao ganho
de peso do que os outros em ambientes similares Satildeo muitas as evidecircncias de que o metabolismo
da microbiota intestinal facilita a extraccedilatildeo de calorias da dieta ajudam a estocaacute-las no tecido
adiposo aleacutem de prover energia e nutrientes para o crescimento microbiano Nesse contexto a
ocorrecircncia e participaccedilatildeo dos Mollicutes na microbiota intestinal eacute praticamente desconhecida
sendo necessaacuterios portanto o desenvolvimento de estudos que avaliem as implicaccedilotildees e
relevacircncia desses microrganismos nas respostas adaptativas da microbiota intestinal humana
Deste modo o objetivo do presente estudo foi analisar a participaccedilatildeo dos micro-organismos da
Classe Mollicutes e dos Filos Firmicutes e Bacteroidetes na microbiota intestinal de mulheres
obesas e eutroacuteficas Para a realizaccedilatildeo do estudo a casuiacutestica foi de 20 mulheres diagnosticadas
com obesidade (IMCgt 30kgm2) e 20 mulheres em eutrofia (IMC entre 185 e 249 kgm2 Foram
obtidas amostras de fezes sangue Foi aplicado um questionaacuterio semiestruturado sobre fatores
relacionados com obesidade e possiacutevel associaccedilatildeo com microbiota intestinal e ambiente aleacutem de
avaliaccedilatildeo antropomeacutetrica atraveacutes de Bioimpedacircncia e questionaacuterio de frequecircncia alimentar
Desenvolveu-se um ensaio quantitativo por meio de TaqMan PCR para a detecccedilatildeo de Mollicutes
nas amostras de fezes A metodologia foi especiacutefica sensiacutevel reprodutiacutevel e gerou dados
quantitativos para a detecccedilatildeo desses microrganismos nas fezes humanas Constatou-se no
presente estudo que o grupo caso apresentou consumo energeacutetico inferior ao recomendado e que
ambos os grupos apresentaram consumo superior de gorduras saturadas e inferior de fibras Em
relaccedilatildeo a determinaccedilatildeo do estado nutricional os dois grupos se apresentaram acima da meacutedia
referecircncia indicando excesso de gordura corporal Na determinaccedilatildeo da microbiota intestinal
constatou-se uma diferenccedila estatisticamente significante entre as meacutedias do nuacutemero dos micro-
organismos da classe Mollicutes entre os grupos caso e controle Detectou-se uma associaccedilatildeo
positiva estatisticamente significante entre a presenccedila de Mollicutes e mulheres obesas (OR= 115
IC= 242-554) Na quantificaccedilatildeo da presenccedila dos Filos Firmicutes e Bacteroidetes e Bacteacuterias
totais na microbiota natildeo foram observadas diferenccedilas estatisticamente significantes quanto a sua
quantidade entre as mulheres do grupo caso e controle No entanto foi observada maior proporccedilatildeo
de FirmicutesBacteroidetes na microbiota intestinal das mulheres obesas em relaccedilatildeo agraves eutroacuteficas
do grupo controle Os resultados obtidos permitiram obter evidecircncias importantes da participaccedilatildeo
dos micro-organismos da classe Mollicutes As alteraccedilotildees da microbiota intestinal tambeacutem
contribuiacuteram na definiccedilatildeo de subconjuntos de indiviacuteduos com diferentes perfis de risco metaboacutelico e
a da heterogeneidade associada a fenoacutetipos humanos relacionados com a adiposidade
Palavras-chave Obesidade Microbiota intestinal Mollicutes qPCR
ABSTRACT
SANTOS V M Evaluation of Mollicutes microorganismrsquos participation in the gut microbiota of obese and normal weight women 2015 147 p Masters thesis (Microbiology) ndash Instituto de Ciecircncias Biomeacutedicas Universidade de Satildeo Paulo Satildeo Paulo 2015
Obesity has multifactorial causes and it is characterized as an excess of corporal fat accumulated in adipose tissue causing health impacts Studies on the genetic interaction of the individual with the environment shows that some individuals are more prone to weight gain than others in similar environments There are many evidences that the gut microbiota metabolism facilitates the harvest of energy derived from ingested nutrients it help to store them in adipose tissue and provide energy and nutrients for microbial growth In this context the occurrence and participation of Mollicutes in the gut microbiota is pratically unknown requiring the development of studies to evaluate the implications and relevance of these microorganisms in the adaptive responses of the human gut microbiota Thus the aim of this study was to analyze the participation of the Class Mollicutes and Firmicutes and Bacteroidetes phylos in the gut microbiota of obese and normal weight women For the study it was collected samples of 20 women diagnosed with obesity (BMIgt 30 kg m2) and 20 women of normal weight (BMI between 185 and 249 kg m2) it was collected stool samples blood semi-structured questionnaire on etiological factors predisposing and associated with obesity and possible association with gut microbiota and the environment and anthropometric measurements using bioelectrical impedance A quantitative assay was developed through of TaqMan PCR for the detection of Mollicutes in stool samples from patients with the methodology specific sensitive reproducible and quantitative for the detection of these microorganisms in human stools It was found in this study that the case group had a lower energy consumption than recommended and that both groups had a higher intake of saturated fats and less fiber For determining the nutritional status of the two groups presented above average reference indicating excess body fat Regarding the determination of the intestinal microbiota of the study population there was a statistically significant difference between the mean of microorganisms of Mollicutes class between the case and control groups And it was detected a statistically significant positive association between the presence of Mollicutes and obese women (OR = 115 CI = 242 to 554) Regarding the analysis about the participation of phylos Firmicutes and Bacteroidetes and total bacteria in the microbiota of the study population no statistically significant differences observed for the microbial amount among women of the case and control group However there was a higher proportion of Firmicutes Bacteroidetes the gut microbiota of obese women compared to the control group normal weight women Analysis of the results provide important evidence about the participation of almost unknown Mollicutes class in the gut microbiota of the population studied as well as changes and interactions in intestinal microbiota can define subsets of individuals with different metabolic risk profiles and thus contribute to investigation of the heterogeneity associated phenotypes related to adiposity
Keywords Obesity Gut microbiota Mollicutes qPCR
LISTA DE ABREVIATURAS SIGLAS E SIacuteMBOLOS
A ndash Adenina
AEAndash N-araquidonoil etanolamina anandamida
AFndash Niacutevel de atividade fiacutesica
AGCCndash Aacutecidos graxos de cadeia curta
AgRPndash Peptiacutedeo Relacionado ao Agouti
AIDSndash Siacutendrome da imunodeficiecircncia adquirida
AIndash Adequate Intake
AMPndash Adenosina monofosfato
AMPKndash Adenosina proteiacutena quinase
AMPsndash Peptiacutedeos antimicrobianos bacterianos
APC ndash Ceacutelula apresentadora de antiacutegeno
APRILLndash Ligante indutor de proliferaccedilatildeo
atm ndash Atmosfera
ATP ndash Adenosina tri-fosfato
C ndash Citosina
C+G ndash Conteuacutedo citosina e guanina
Cb-1ndash Receptores canabinoacuteides
CCKndash Colecistocinina
CH4ndash Metano
CHOsndash Carboidratos
ChREBP ndash Carbohydrate response element-binding protein
CO2 ndash Gaacutes carbocircnico
CPT1ndash Carnitina palmitoil transferase 1
Ct ndash Cycle Treshold (Sinal de fluorescecircncia que pode ser
detectado)
CV ndash Coeficiente de variaccedilatildeo
DAG lipasendash sn-1-diacilglicerol lipase seletiva
DCs ndash Ceacutelulas Dendriacuteticas
DNA ndash Aacutecido Desoxirribonucleico
DRI ndash Dietary References Intakes
DP ndash Desvio padratildeo
dNTP ndash Deoxinucleotiacutedeo trifosfato
EAR ndash Estimated Average Requirements
EDTA ndash Aacutecido Etilenodiamino Tetra-aceacutetico
ELISA ndash Enzyme-Linked Immunoabsorbent Assay
EIndash Enzimas citoplasmaacuteticas do sistema PTS
EPIndash Equipamento de Proteccedilatildeo Individual
EROndash Espeacutecies reativas de oxigecircnio
FAAHndash Fatty acid amide hydrolase
FABFndash Fator de ativaccedilatildeo de ceacutelulas β
FFARndash Free fatty acids receptors
FIAFndash Fasting Induced Adipocyte Factor
g ndash Gramas
G ndash Guanina
GERndash Gasto energeacutetico de repouso
GETndash Gasto energeacutetico total
GLP-1ndash Peptiacutedeo semelhante ao glucagon
GPRndash Receptor acoplado agrave proteiacutena G
H2ndash Hidrogecircnio
HDLndash Lipoproteiacutena de alta densidade
HPRndash Enzimas citoplasmaacuteticas do sistema PTS
IBGEndash Instituto brasileiro de Geografia e Estatiacutestica
IC ndash Intervalo de Confianccedila
IECsndash Ceacutelulas epiteliais intestinais)
IFN-α ndash Interferon α
IFN-β ndash Interferon β
IFN-γ ndash Interferon gama
IgA ndash Imunoglobulina A
IL ndash Interleucina
IL-10 ndash Interleucina 10
IL-1β ndash Interleucina 1Beta
IL-25 ndash Interleucina 25
IL-33 ndash Interleucina 33
IL-6 ndash Interleucina 6
IMC ndash Iacutendice de massa corporal
IPAQ ndash International Physical Activity Questionnaire
kgndash Quilogramas
Kpb ndash Kilopares de bases
LPLndash Lipase lipoproteacuteica
LPSndash Lipopolissacariacutedeos
MAGndash Monoacilglicerol lipase
MAMPsndash Padrotildees moleculares associados agrave micro-organismos
MC4R ndash Receptor da Melanocortina 4
MDa ndash Megadaltons
mg ndash Miligramas
min ndash Minuto
mL ndash Mililitro
mm ndash Miliacutemetro
mM ndash Milimolar
mRNAndash RNA mensageiro
MSndash Ministeacuterio da Sauacutede
NAPE-PLDndash N-acil fostatidiletanolamida-fosfolipase D seletiva
NF-KBndash Fator nuclear Kappa B
NK ndash Natural Killers
nm ndash Nanocircmetro
NODndash Receptores de domiacutenio de digomerizaccedilatildeo de ligaccedilatildeo de
nucleotiacutedeos
NPYndash Neuropeptiacutedeo Y
ordm C ndash Graus Celsius
OMS (WHO) ndash Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede
OR ndash Odds Ratio
pb ndash Pares de base
PC1 ndash Proacute-hormocircnio Convertase 1
PCR ndash Reaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase
PGC-1ndash Peroxisome proliferator-activated receptor-gamma
coactivator 1 alpha
PGCndash Porcentagem de gordura corporal
pH ndash Potencial de hidrogecircnio iocircnico
pmol ndash Picomol
POFndash Pesquisa dos Orccedilamentos Familiares
POMCndash Proacute-oacutepio melanocortina
PPARndash Receptor Ativado por Proliferadores de Peroxissoma
PPI ndash Perda de peso intencional
PPLO ndash Pleuropneumonia-like Organisms
PTSndash Sistema fosfotransferase
PYYndash Peptiacutedeo tirosina-tirosina
QFAndash Questionaacuterio de frequecircncia alimentar
qPCR ndash PCR quantitativa ou PCR em tempo real
r2 ndash R da curva
RA ndash Aacutecido retinoacuteico
RCQndash Relaccedilatildeo cintura-quadril
REGIIIβndash Proteiacutenas antimicrobianas intestinais
REGIIIγndash Proteiacutenas antimicrobianas intestinais
RNA ndash Aacutecido ribonucleacuteico
rpm ndash Rotaccedilotildees por minuto
rRNA ndash RNA ribossocircmico
s ndash Segundo
SNCndash Sistema nervoso central
SREBP-1ndash Liver sterol response element binding protein type-1
SOCS-1 ndash Proteiacutenas supressora da sinalizaccedilatildeo de citocina-1
SOCS-3 ndash Proteiacutenas supressora da sinalizaccedilatildeo de citocina-3
T ndash Timina
TAndash Tecido adiposo
TCLE ndash Termo de Consentimento Livre e Esclarecido
TGF-β ndash Fator de crescimento tumoral-β
TGIndash Trato gastrintestinal
TLR ndash Toll-like receptor
TMndash Tecido muscular
TMBndash Taxa de metabolismo basal
TNF-α ndash Fator de Necrose Tumoral alfa
Tregndash Ceacutelulas T regulatoacuterias
tRNA ndash RNA transportador
TSLPndash Linfopoietina estromal tiacutemica
U ndash Unidade
UFC ndash Unidade Formadora de Colocircnia
UFCmicroL ndash Unidade Formadora de Colocircnia por microlitro
USDAndash United States Departament of Agriculture
VETndash Valor energeacutetico Total
X ndash Vezes
ZO-1ndash Zocircnula de oclusatildeo-1
α ndash Alfa
β ndash Beta
χ2 ndash Teste Qui-quadrado
ndash Por cento
microL ndash Microlitro
microm ndash Microcircmetros
microms ndash Microcircmetros por segundo
2-AGndash 2-araquidonoil glicerol
IacuteNDICE DE FIGURAS
Figura 1 ndash Fatores envolvidos no estabelecimento da microbiota humana ao longo da
vida 37
Figura 2 ndash Interaccedilatildeo funcional entre a microbiota intestinal humana e o sistema
imunoloacutegico 42
Figura 3 ndash Doenccedilas influenciadas pelo metabolismo microbiano
intestinal46
Figura 4 ndash Crescimento de M hominis em meio SP4 com a produccedilatildeo de colocircnia em
forma de ldquoovo fritordquo (aumento 40X) 55
Figura 5 ndash Comparaccedilatildeo entre as meacutedias de consumo de macronutrientes dos Grupos
Caso e Controle com a Faixa de Distribuiccedilatildeo Aceitaacutevel de macronutrientes (AMDRDRI)
e AI (Adequate Intake) para a faixa etaacuteria de 20 a 70 anos Satildeo Paulo SP 2013-
201484
Figura 6 ndash Comparaccedilatildeo entre as meacutedias de consumo das Vitaminas A C E e folato
dos Grupos Caso e Controle com a Faixa de Distribuiccedilatildeo Aceitaacutevel de macronutrientes
(AMDRDRI) e AI (Adequate Intake) para a faixa etaacuteria de 20 a 70 anos Satildeo Paulo
SP 2013-201485
Figura 7 ndash Comparaccedilatildeo entre as meacutedias de consumo das Vitaminas B1 B2 B6 B12
D Niacina e Aacutecido pantotecircnico dos Grupos Caso e Controle com a Faixa de
Distribuiccedilatildeo Aceitaacutevel de macronutrientes (AMDRDRI)e AI (Adequate Intake) para a
faixa etaacuteria de 20 a 70 anos Satildeo Paulo SP 2013-201486
Figura 8 ndash Comparaccedilatildeo entre as meacutedias de consumo de Sais Minerais dos Grupos
Caso e Controle com a Faixa de Distribuiccedilatildeo Aceitaacutevel de macronutrientes
(AMDRDRI)e AI (Adequate Intake) para a faixa etaacuteria de 20 a 70 anos Satildeo Paulo SP
2013-2014 87
Figura 9 ndash Comparaccedilatildeo entre as meacutedias de consumo de Sais Minerais e outros
nutrientes dos Grupos Caso e Controle com a Faixa de Distribuiccedilatildeo Aceitaacutevel de
macronutrientes (AMDRDRI)e AI (Adequate Intake) para a faixa etaacuteria de 20 a 70
anos Satildeo Paulo SP 2013-2014 87
Figura 10ndash Curva-padratildeo gerada a partir dos pontos de Ct obtidos com o graacutefico de
amplificaccedilatildeo de diluiccedilotildees seriadas do controle positivo Mycoplasma hominis calculado
pelo software StepOne 21 (Applied Biosystems Life Technologies Corporation) Satildeo
Paulo SP 2013-201490
Figura 11 ndash Quantificaccedilatildeo por qPCR de Mollicutes (UFCmicrol) a partir das amostras de
fezes nos grupos caso e controle Satildeo Paulo SP 2013-2014 92
Figura 12 ndash Quantificaccedilatildeo por qPCR de Firmicutes Bacteroidetes e Eubacterias
(UFCmicrol) a partir das amostras de fezes nos grupos caso e controle Satildeo Paulo SP
2013-201493
Figura 13 ndash Quantificaccedilatildeo de IL-1β IL-10 IL17-A e TNF-α (pgmL) no plasma
sanguiacuteneo por meio do ELISA nos grupos caso e controle da populaccedilatildeo estudada
Satildeo Paulo SP 2013-201496
IacuteNDICE DE QUADROS
Quadro 1 ndash Criteacuterios utilizados na estimativa da frequecircncia diaacuteria de consumo dos
alimentos incluiacutedos no Questionaacuterio de Frequecircncia Alimentar 61
Quadro 2 ndash Sequecircncias dos iniciadores utilizados para amplificaccedilatildeo do gene 16S rRNA
para Mollicutes 66
Quadro 3 ndash Sequecircncias dos iniciadores utilizados para amplificaccedilatildeo do gene 16S rRNA
para Firmicutes Bacteroidetes e Bacteacuterias Totais69
IacuteNDICE DE TABELAS
Tabela 1 ndash Determinaccedilatildeo do perfil da populaccedilatildeo estudada referente agrave Seccedilatildeo 1 Dados
socioeconocircmicos Satildeo Paulo SP 2013-201472
Tabela 2 ndash Determinaccedilatildeo do perfil da populaccedilatildeo estudada referente agrave Seccedilatildeo 2 Histoacuteria
Familiar Satildeo Paulo SP 2013-201472
Tabela 3 ndash Determinaccedilatildeo do perfil da populaccedilatildeo estudada referente agrave Seccedilatildeo 3 Histoacuteria
Cliacutenica Satildeo Paulo SP 2013-2014 73
Tabela 4 ndash Determinaccedilatildeo do perfil da populaccedilatildeo estudada referente agrave Seccedilatildeo 4 Histoacuteria
Obsteacutetrica Satildeo Paulo SP 2013-2014 74
Tabela 5 ndash Determinaccedilatildeo do perfil da populaccedilatildeo estudada referente agrave Seccedilatildeo 5 Histoacuteria
Ginecoloacutegica Satildeo Paulo SP 2013-2014 75
Tabela 6 ndash Determinaccedilatildeo do perfil da populaccedilatildeo estudada referente agrave Seccedilatildeo 6
Consumo atual de tabaco Satildeo Paulo SP 2013-2014 75
Tabela 7ndash Determinaccedilatildeo do perfil da populaccedilatildeo estudada referente agrave Seccedilatildeo 7
Consumo atual de aacutelcool Satildeo Paulo SP 2013-2014 76
Tabela 8 ndash Tabela de determinaccedilatildeo do perfil da populaccedilatildeo estudada referente agrave Seccedilatildeo
8 Atividade Fiacutesica (IPAQ versatildeo curta) Satildeo Paulo SP 2013-2014 76
Tabela 9 ndash Tabela de determinaccedilatildeo do perfil da populaccedilatildeo estudada referente agrave Seccedilatildeo
9 Mudanccedilas recentes nos haacutebitos alimentares Satildeo Paulo SP 2013-2014 77
Tabela 10 ndash Participaccedilatildeo dos alimentos nos grupos meacutedias de consumo por dia dos
alimentos consumidos pela populaccedilatildeo estudada Satildeo Paulo SP 2013-2014 144
Tabela 11 ndash Definiccedilatildeo dos grupos alimentares derivados do Questionaacuterio de Frequecircncia
Alimentar (QFA) e percentual de consumo da populaccedilatildeo estudada Satildeo Paulo SP
2013-201479
Tabela 12 ndash Anaacutelise de consumo de energia e nutrientes da populaccedilatildeo estudada Satildeo
Paulo SP 2013-2014 81
Tabela 13 ndash Comparaccedilatildeo das variaacuteveis dieteacuteticas relacionadas agraves razotildees de ingestatildeo e
Valor Energeacutetico Total (VET) da populaccedilatildeo estudada Satildeo Paulo SP 2013-2014 83
Tabela 14 ndash Comparaccedilatildeo de variaacuteveis antropomeacutetricas da populaccedilatildeo estudada 89
Tabela 15 ndash Repetibilidade intra-ensaio e inter-ensaio da qPCR para Mollicutes Satildeo
Paulo SP 2013-2014 91
Tabela 16 ndash Comparaccedilatildeo entre os resultados obtidos no teste de sensibilidade pelas
teacutecnicas de PCR convencional e qPCR para detecccedilatildeo de Mollicutes Satildeo Paulo SP
2013-201491
Tabela 17 ndash Nuacutemero meacutedio de coacutepias e percentual dos grupos Mollicutes estudados
frente ao Filo Firmicutes na populaccedilatildeo estudada Satildeo Paulo SP 2013-2014 94
Tabela 18 ndash Nuacutemero meacutedio de coacutepias e percentual dos grupos de bacterianos
estudados frente agraves bacteacuterias totais na populaccedilatildeo estudada Satildeo Paulo SP 2013-
201495
Tabela 19 ndash Proporccedilatildeo de Firmicutes em relaccedilatildeo agrave Bacteroidetes na populaccedilatildeo
estudada Satildeo Paulo SP 2013-201495
SUMAacuteRIO
1 INTRODUCcedilAtildeO 26
2 REFERENCIAL TEOacuteRICO 29
21 Obesidade 29
22 Microbiota Intestinal 31
221 Microbiota intestinal uma peccedila chave na sauacutede e na doenccedila31
222 Colonizaccedilatildeo e composiccedilatildeo da microbiota intestinal32
223 Fatores que influenciam a composiccedilatildeo da microbiota intestinal 34
2231 Fases da vida 34
2232 Tipo de parto 34
2233 Tipo de aleitamento 35
2234 Uso de antibioacutetico 35
2235 Dieta 36
224 Microbiota intestinal e a fisiologia do hospedeiro 38
2241 Nutriccedilatildeo e Metabolismo 38
2242 Proteccedilatildeo 39
22421 Competiccedilatildeo direta de nutrientes 39
22422 Imunomodulaccedilatildeo 40
2243 Funccedilatildeo Troacutefica 43
2244 Regulaccedilatildeo da adiposidade 43
225 Microbiota intestinal e disbiose44
226 Microbiota Intestinal e obesidade47
227 Mecanismos pelos quais a microbiota intestinal contribui para a obesidade49
2271 Extraccedilatildeo de energia adicional da dieta49
2272 Induccedilatildeo da inflamaccedilatildeo por meio da alteraccedilatildeo da permeabilidade intestinal51
23 MOLLICUTES 52
231 Caracteriacutesticas Gerais dos Mollicutes52
232 Mollicutes Microbiota Intestinal e Obesidade56
3 OBJETIVOS 58
31 Objetivo geral 58
32 Objetivos especiacuteficos 58
4 MATERIAL E MEacuteTODOS 59
41 Protocolo do estudo 59
42 Casuiacutestica 59
43 Delineamento experimental 60
44 Determinaccedilatildeo do estado nutricional 60
441 Avaliaccedilatildeo qualitativa do consumo alimentar 60
442 Avaliaccedilatildeo antropomeacutetrica do estado nutricional 62
4421 Anaacutelise da Composiccedilatildeo Corporal pelo Meacutetodo de Bioimpedacircncia 63
45 Coleta das amostras cliacutenicas 64
46 Determinaccedilatildeo da microbiota intestinal 65
461 Padronizaccedilatildeo de reaccedilatildeo de PCR quantitativo (qPCR) por meio de TaqMan para a detecccedilatildeo de
Mollicutes 65
4611 Cepas bacterianas e condiccedilotildees de cultura 65
4612 Desenvolvimento de primers e sonda para a detecccedilatildeo de Mollicutes pela PCR quantitativa 65
4613 PCR quantitativa 66
4614 Especificidade da qPCR e repetibilidade intra e inter-ensaios 67
462 Reaccedilatildeo em cadeia da polimerase (PCR) convencional 68
463 Detecccedilatildeo de micro-organismos dos filos Firmicutes e Bacteroidetes e bacteacuterias totais (Eubacterias)
por PCR em tempo Real (qPCR) 68
47 Dosagem de citocinas do soro sanguiacuteneo 69
48 Anaacutelises Estatiacutesticas 70
5 RESULTADOS 71
51 Perfil da populaccedilatildeo estudada 71
52 Determinaccedilatildeo do estado nutricional 78
521 Avaliaccedilatildeo qualitativa do consumo alimentar 78
522 Avaliaccedilatildeo antropomeacutetrica do estado nutricional 88
53 Determinaccedilatildeo da microbiota intestinal 90
531 Padronizaccedilatildeo de reaccedilatildeo de PCR quantitativo (qPCR) por meio de TaqMan para a detecccedilatildeo de
Mollicutes 90
532 Detecccedilatildeo de micro-organismos dos filos Firmicutes e Bacteroidetes aleacutem de bacteacuterias totais
(Eubacterias) por PCR em tempo Real (qPCR) 93
54 Dosagem de citocinas do soro sanguiacuteneo 96
6 DISCUSSAtildeO 97
7 CONCLUSOtildeES 107
REFEREcircNCIAS 108
APEcircNDICE A ndash TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO 127
APEcircNDICE B ndash QUESTIONAacuteRIO 131
APEcircNDICE C- TABELA 10 143
26
1 INTRODUCcedilAtildeO
A obesidade eacute definida pela Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede (WHO 2002)
como o excesso de gordura corporal acumulada no tecido adiposo com implicaccedilotildees
para a sauacutede Algumas estimativas globais recentes indicam que em 2013 mais de
600 milhotildees da populaccedilatildeo mundial adulta (com 18 anos ou mais) eram obesos com
11 dos homens e 15 das mulheres (MARIE 2014) No Brasil em 2014 estimou-
se que na populaccedilatildeo adulta (20 anos ou mais) 105 milhotildees satildeo obesos com 124
dos homens e 169 das mulheres (IBGE 2014) Nesse contexto atualmente a
obesidade estaacute entre os maiores problemas de sauacutede puacuteblica e distuacuterbio da nutriccedilatildeo
A obesidade eacute considerada atualmente uma epidemia (BACON APHRAMOR 2011
OLSHANSKY et al 2005) As alteraccedilotildees nos padrotildees dieteacuteticos e nutricionais da
populaccedilatildeo brasileira tecircm sido analisadas no processo da transiccedilatildeo nutricional (KAC
VELAacuteSQUEZ-MELEacuteNDEZ 2003)
Neste processo verificou-se que ocorreu inversatildeo nos padrotildees de distribuiccedilatildeo
das alteraccedilotildees nutricionais A alta incidecircncia de sobrepeso e obesidade na
populaccedilatildeo implica no aumento da ocorrecircncia de doenccedilas cardiovasculares cacircncer
diabetes mellitus e hipertensatildeo arterial (AMUNA ZOTOR 2008 ARAI et al 2009
DUNCAN et al 1993 GIGANTE et al 1997 JIRTLE SKINNER 2007 KAC
VELAacuteSQUEZ-MELEacuteNDEZ 2003 LESSA 1998 MONDINI MONTEIRO 1998
POPKIN et al 2006) Na obesidade ocorre basicamente o balanccedilo energeacutetico
positivo cuja patogecircnese natildeo estaacute completamente elucidada estando associada a
fatores comportamentais culturais e bioloacutegicos A regulaccedilatildeo do balanccedilo energeacutetico e
do estoque de energia corporal satildeo influenciados pela susceptibilidade individual e
seu contexto social e econocircmico demograacutefico cultural educacional ambiental e
familiar aleacutem de fatores hormonais e de heranccedila geneacutetica (GORAN 2000 VEIGA
SICHIERI 2006)
O mapa gecircnico da obesidade humana estaacute constantemente em mudanccedila pela
identificaccedilatildeo de novos genes e regiotildees cromossocircmicas associadas com a
obesidade As alteraccedilotildees do comportamento alimentar e os haacutebitos sedentaacuterios
indicam ser os principais fatores de interferecircncia nos genes de susceptibilidade a
obesidade e consequentemente no aumento da obesidade mundial Eacute provaacutevel
27
portanto que a obesidade ocorra como a resultante de fatores poligecircnicos
complexos e um ambiente obesogecircnico (dieta e sedentarismo) (BAJZER SEELEY
2006 BOUCHARD 2000 CANI et al 2007 DERAM VILLARES 2009 DUNCAN et
al 2008 TURNBAUGH et al 2009)
A captaccedilatildeo de energia pode justificar em parte o metabolismo de alguns
pacientes obesos que natildeo apresentam ingestatildeo alimentar excessiva sugerindo que
a microbiota intestinal pode predispor o indiviacuteduo agrave obesidade (BACKHED 2004)
Alguns estudos tecircm demonstrado que o desenvolvimento da obesidade em
humanos pode ser determinado pelas proporccedilotildees relativas de dois filos principais de
bacteacuterias da microbiota intestinal humana Bacteroidetes e Firmicutes que diferem
consideravelmente entre indiviacuteduos eutroacuteficos e obesos (DUNCAN et al 2008 LEY
et al 2005 2006 TENNYSON FRIEDMAN 2008) Estudos comparativos
mostraram que ratos obesos possuem significativamente niacuteveis mais baixos de
micro-organismos do Filo Bacteroidetes e niacuteveis mais elevados de Firmicutes Este
uacuteltimo estaacute associado com um aumento de absorccedilatildeo de energia da dieta
(BACKHED 2004 CANI DELZENNE 2009 DIBAISE et al 2012 LEY et al 2005
RAOULT 2008 TURNBAUGH et al 2006) Turnbaugh et al (2008) obtiveram
resultados semelhantes em ratos com obesidade induzida por dieta Curiosamente
embora as alteraccedilotildees nos niacuteveis de Firmicutes e Bacteroidetes foram observadas
nos camundongos obesos por dieta induzida a diferenccedila foi relacionada
principalmente as bacteacuterias da classe dos Mollicutes
As espeacutecies do Filo Bacteriodetes pertencem agrave microbiota intestinal humana e
animal Estas bacteacuterias satildeo bacilos ou cocobacilos gram-negativos anaeroacutebios
obrigatoacuterios heterotroacuteficos mesoacutefilos sacaroliacuteticos natildeo formadores de esporos
imoacuteveis Satildeo resistentes agrave bile natildeo produzem pigmentos Tecircm como principais
produtos finais do metabolismo da glicose os aacutecidos succiacutenico e aceacutetico
(JOHANSSON PETTERSON 2002 MANILOFF 2002) O Filo Firmicutes
encontrado em maior proporccedilatildeo no trato gastrintestinal humano satildeo micro-
organismos Gram positivos na maioria Na classificaccedilatildeo atual o filo divide-se
tipicamente em trecircs classes Bacilli - aeroacutebios facultativos ou obrigatoacuterios Clostridia -
organismos anaeroacutebios e Erysipelotrichia Mollicutes eacute a uacutenica classe do filo
Tenericutes anteriormente classificada dentro do filo Firmicutes (BERGEYrsquos 2009
2010 LUDWIG KLENK 2001 RAZIN et al 1998)
28
Os estudos das interaccedilotildees de Bacteroidetes e Firmicutes na microbiota
intestinal e sua associaccedilatildeo com a obesidade tecircm aumentado No entanto a
participaccedilatildeo dos Mollicutes eacute praticamente desconhecida O gecircnero Mycoplasma foi
introduzido em 1929 para designar micro-organismos atualmente classificados
como membros da famiacutelia Mycoplasmataceae ordem Mycoplasmatales da classe
dos Mollicutes (Mollis = mole cuacutetis = pele) (RAZIN 1992) Os Mollicutes possuem
um genoma pequeno sendo que algumas espeacutecies apresentam o menor genoma
entre os procariotos e em consequecircncia apresentam metabolismo reduzido
(MILES NICHOLAS 1998 NEIMARK 1986 RAZIN TULLY 1983) Distinguem-se
de outros procariotos pela simplicidade celular genoma e metabolismo reduzido A
ausecircncia natural da parede celular confere resistecircncia aos antibioacuteticos beta-
lactamicos Incluem-se as sulfas e rimfapicina respectivamente pela ausecircncia da
siacutentese de aacutecido foacutelico e possuir uma polimerase diferente Com aproximadamente
200 espeacutecies estes micro-organismos infectam humanos animais insetos e
plantas Considerados em geral como oportunistas por excelecircncia colonizam
ldquopreferencialmenterdquo a superfiacutecie de mucosas de mamiacuteferos mas tecircm potencial de
causar infecccedilotildees sistecircmicas dependendo do hospedeiro (DYBVIG 1990 RAZIN
YOGEV NAOT 1998)
29
2 REFERENCIAL TEOacuteRICO
21 Obesidade
A prevalecircncia da obesidade tem crescido rapidamente e representa um dos
principais desafios de sauacutede puacuteblica neste seacuteculo A Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede
(OMS) estima que pelo menos 28 milhotildees de pessoas morrem em decorrecircncia da
obesidade (IMC ge 30 kgm2) A prevalecircncia mundial quase duplicou entre 1980 e
2008 com uma transiccedilatildeo de 5 dos homens e 8 das mulheres em 1980 para
10 dos homens e 14 das mulheres (WHO 2014) A obesidade pode ser definida
como o grau de armazenamento de gordura no organismo associada ao ganho
excessivo de peso corporal total Eacute portanto considerada uma doenccedila crocircnica
podendo acarretar em consequecircncias para a sauacutede devido agraves suas relaccedilotildees com
diversas complicaccedilotildees metaboacutelicas (MS 2006)
A pesquisa dos Orccedilamentos Familiares (POF IBGE 2010) nos uacuteltimos seis
anos indicou que a frequecircncia de pessoas com excesso de peso aumentou em mais
de um ponto percentual ao ano Desta maneira em dez anos o excesso de peso
poderia alcanccedilar dois terccedilos da populaccedilatildeo adulta do Brasil magnitude idecircntica agrave
encontrada na populaccedilatildeo dos Estados Unidos Estimativas de inqueacuteritos nacionais e
internacionais das uacuteltimas deacutecadas indicam que a obesidade em 2025 alcance 40
da populaccedilatildeo nos EUA 30 na Inglaterra e 20 no Brasil (HU 2008)
O excesso de peso e a obesidade na populaccedilatildeo expressam essencialmente
o desequiliacutebrio entre ingestatildeo e utilizaccedilatildeo de calorias A justificativa estaacute na
mudanccedila dos padrotildees de alimentaccedilatildeo e de atividade fiacutesica Em 2002-2003 revelou-
se tendecircncia crescente de substituiccedilatildeo de alimentos baacutesicos e tradicionais na dieta
brasileira (como arroz feijatildeo e hortaliccedilas) por bebidas e alimentos industrializados
(como refrigerantes biscoitos carnes processadas e comida pronta) Caracteriza-se
portanto o aumento na densidade energeacutetica das refeiccedilotildees e padrotildees de
alimentaccedilatildeo capazes de comprometer a auto-regulaccedilatildeo do balanccedilo energeacutetico dos
indiviacuteduos e aumentar o risco de obesidade (LEVY-COSTA et al 2005)
Aleacutem disto em consequecircncia agrave obesidade tem sido observado aumento
consideraacutevel da prevalecircncia de doenccedilas crocircnicas natildeo transmissiacuteveis como doenccedilas
cardiovasculares cacircncer diabetes mellitus e hipertensatildeo arterial Pelo longo tempo
30
de evoluccedilatildeo destas doenccedilas ocorrem lesotildees irreversiacuteveis de intensidade variada
resultando no aumento de incapacidade ou oacutebito vecircm ocupando um maior espaccedilo
no perfil de morbimortalidade de populaccedilotildees latino americanas (DUNCAN et al 1993
LESSA 1998) Em importante estudo entre 1958 e 1951 envolvendo cinco mil
indiviacuteduos de 35 a 75 anos por periacuteodo de ateacute 44 anos a obesidade (IMC gt 30Kgm2)
foi independentemente associada ao maior risco para hipertensatildeo (mulheres
RR=26 IC95 22-31) diabetes tipo 2 (mulheres RR=14 IC95 1-18) e doenccedila
cardiovascular mulheres RR=14 IC95 11-17) (WILSON et al 2002) Os ganhos
na diminuiccedilatildeo das taxas de tabagismo ao longo do seacuteculo XX e as expectativas no
aumento de tempo de vida podem ser neutralizadas pelas prespectivas do aumento
da obesidade (STEWART et al 2009) Especialmente em paiacuteses em
desenvolvimento como o Brasil o custo anual para o Sistema Uacutenico de Sauacutede para
atender as doenccedilas relacionadas ao sobrepeso eacute estimado em US$ 20152102171
(BAHIA et al 2012)
O ganho de peso ocorre pela menor utilizaccedilatildeo de gordura como fonte de
energia do que oxidar carboidratos elevando o coeficiente respiratoacuterio obtido
atraveacutes da razatildeo entre a produccedilatildeo de gaacutes carbocircnico resultante da oxidaccedilatildeo de
carboidratos e o consumo de oxigecircnio determinado atraveacutes de calorimetria (MARRA
et al 2004) Seis lesotildees monogecircnicas principais produzem desordens endoacutecrinas
que resultam na obesidade Deficiecircncia congecircnita de Leptina defeitos no receptor
de Leptina deficiecircncia no proacute-hormocircnio convertase 1(PC1) deficiecircncia em proacute-oacutepio-
melanocortina (POMC) defeitos no receptor da Melanocortina 4 (MC4R) e defeitos
no Receptor Ativado por Proliferadores de Peroxissoma (PPAR) O controle da
ingestatildeo alimentar a curto prazo eacute controlado principalmente por vias de
sinalizaccedilatildeo que emanam do trato gastrintestinal incluindo o peptiacutedeo orexiacutegenico
grelina que ativa os sinais de fome e os peptiacutedeos anorexigecircnicos
colecistoquinina (CCK) peptiacutedeo similar ao glucagon 1- glucagon-like peptide 1
(GLP-1) e peptiacutedeo tirosina-tirosina (PYY) que geram sinais de saciedade Para o
controle da ingestatildeo agrave longo prazo parecem ser primordiais os sinais que emanam a
partir do tecido adiposo (leptina) e pacircncreas (insulina) liberados em resposta agrave
ingestatildeo de alimentos e depoacutesitos de gordura corporal (KONTUREK et al 2004)
Tem sido amplamente documentado na literatura o reganho de peso
sucessivo agraves dietas pois sabe-se que cerca de um a dois terccedilos do peso perdido
31
tendem a ser recuperados no ano seguinte sendo a recuperaccedilatildeo quase total ao final
de cinco anos (GOODRICK et al 1996) A partir disso tem sido questionado o
efeito das dietas restritivas sobre a biologia humana e sua contribuiccedilatildeo para tornar a
obesidade uma condiccedilatildeo que possivelmente se autoperpetua e se agrava de
maneira progressiva Diversos trabalhos mostram que a ciclagem de peso (ou efeito
sanfona) pode aumentar a suscetibilidade para o ganho de massa corporal no
futuro (KORKEILA et al1999 NEUMARK-SZTAINER et al 2006 2007)
22 Microbiota Intestinal
221 Microbiota intestinal uma peccedila chave na sauacutede e na doenccedila
Nas deacutecadas passadas acreditava-se que todos os micro-organismos da
microbiota possuiacuteam potencial de causar infecccedilotildees O estudo da interaccedilatildeo entre
micro-organismos e o desenvolvimento de enfermidades eacute um tema crescente na
justificativa de certas doenccedilas (DETHLEFSEN et al 2007) O termo microbiota
refere-se ao conjunto de micro-organismos no hospedeiro sadio e o termo
microbioma eacute o conjunto de genes microbianos (BACKHED 2004 LANGA 2006
VRIEZE 2010) O estudo da diversidade e distribuiccedilatildeo da microbiota e sua interaccedilatildeo
com hospedeiro tem contribuiacutedo na justificativa de algumas doenccedilas (LEY et al
2008 VENTURA et al 2008) A microbiota do trato gastrintestinal humano eacute o
ecossistema mais complexo constituiacutedo por diversas espeacutecies de micro-organismos
As bacteacuterias constituem o grupo com maior diversidade e abundacircncia Assim como o
genoma de cada indiviacuteduo eacute uma impressatildeo digital a composiccedilatildeo da microbiota
intestinal tambeacutem parece ser (LEY et al 2006 RAJILIĆ-STOJANOVIĆ SMIDT DE
VOS 2007 XU GORDON 2003)
O comensalismo e a simbiose bacteriana refletem uma ldquocorrida dinacircmicardquo
que se inicia no encontro da bacteacuteria com o hospedeiro vulneraacutevel e prossegue com
respostas adaptativas entre os dois organismos Em alguns casos a coevoluccedilatildeo
atenua a virulecircncia e conduz a uma coexistecircncia paciacutefica com ou sem franca
codependecircncia Em outras circunstacircncias a relaccedilatildeo patogecircnica eacute mantida por meio
da superaccedilatildeo dos mecanismos de defesas inatas ou adaptativas do hospedeiro
pelas bacteacuterias (GORDON HOOPER 2001) Estima-se que a microbiota intestinal eacute
composta por mais de 1000 espeacutecies bacterianas O nuacutemero de ceacutelulas microbianas
32
no luacutemen intestinal eacute de 10 vezes maior que as ceacutelulas eucarioacuteticas do organismo
representando em torno de 1 kg de peso corporal (SCARPELLINI 2010) Aleacutem
disso o microbioma eacute 100 vezes maior que o genoma humano podendo-se assim
considerar a microbiota intestinal como um oacutergatildeo virtual exteriorizado
metabolicamente adaptaacutevel e flexiacutevel aleacutem de rapidamente renovaacutevel o que
contribui para metabolismo e desempenha importante papel na obtenccedilatildeo de energia
da dieta (FRANCcedilOIS-PIERRE 2009)
A microbiota intestinal eacute crucial para a vida humana com impacto na fisiologia
e na nutriccedilatildeo do hospedeiro (HATTORI TAYLOR 2008) Considera-se que
humanos satildeo ldquosuperorganismosrdquo com metabolismo mediado pelos atributos
humanos e microbianos (GILL et al 2006) O conceito de ldquosuperorganismordquo
representa importante mudanccedila de paradigma no entendimento da biologia humana
e pode ter impacto expressivo na prevenccedilatildeo e na terapia de doenccedilas no futuro
(NICHOLSON 2006)
222 Colonizaccedilatildeo e composiccedilatildeo da microbiota intestinal
O trato gastrintestinal fetal eacute considerado praticamente esteacuteril No nascimento
eacute rapidamente colonizado por micro-organismos da matildee e do ambiente hospitalar
(PALMER et al 2007) Sugere-se que de trecircs a quatro semanas apoacutes o nascimento
a microbiota intestinal comeccedila a se estabilizar aumentando gradualmente a sua
complexidade Apoacutes um ano assemelha-se agrave microbiota de um adulto (MACKIE et
al 1999 PALMER et al 2007 SCHEacuteLE et al 2013) Contrapondo-se agrave percepccedilatildeo
da ausecircncia de micro-organismos no feto demonstrou-se a presenccedila de DNA
bacteriano na placenta e no cordatildeo umbilical (JIMEacuteNEZ et al 2005 SATOKARI et
al 2009) Aleacutem disso a identificaccedilatildeo de algumas bacteacuterias no mecocircnio explica a
origem dos primeiros micro-organismos colonizadores do intestino antes mesmo do
nascimento possivelmente como um mecanismo adaptativo para o desenvolvimento
do intestino fetal fora do organismo materno (JIMEacuteNEZ et al 2008)
Os micro-organismos presentes no trato gastrintestinal podem ser autoacutectones
ou aloacutectones Linhagens autoacutectones tecircm longa associaccedilatildeo com o hospedeiro e
formam uma populaccedilatildeo estaacutevel de tamanho caracteriacutestico em uma regiatildeo do
intestino Os organismos aloacutectones satildeo adquiridos principalmente atraveacutes dos
alimentos ingeridos e do ecossistema oral Eacute difiacutecil determinar se um organismo eacute
33
um autoacutectone verdadeiro Contudo as bacteacuterias aloacutectones natildeo persistem no
ecossistema e satildeo detectaacuteveis apenas por um periacuteodo limitado (GORDON
HOOPER 2001 LEY et al 2006 WALTER 2008)
Os micro-organismos satildeo encontrados em todo o trato gastrintestinal no
entanto as mudanccedilas nas condiccedilotildees fisioloacutegicas implicam diferenccedilas na
composiccedilatildeo de micro-organismos nos diversos locais No trato gastrintestinal
inferior o fluxo do conteuacutedo torna-se mais lento e o ambiente conteacutem menos
substacircncias antimicrobianas favorecendo a colonizaccedilatildeo microbiana e o
estabelecimento de maior densidade de micro-organismos (QIN et al 2010
ZOETENDAL et al 2006) A partir da cavidade oral ao acircnus tem sido observado o
aumento da densidade microbiana no jejuno iacuteleo e no intestino grosso em
comparaccedilatildeo com o estocircmago e duodeno O coacutelon refere-se a um ecossistema
complexo com ampla diversidade microbiana e presenccedila de diversos gecircneros
bacterianos O pH neutro e a abundacircncia relativa de nutrientes como os
carboidratos natildeo digeriacuteveis e outros componentes alimentares que escapam do
processo digestivo tornam o coacutelon um ambiente favoraacutevel agrave proliferaccedilatildeo microbiana
O coacutelon eacute a regiatildeo do TGI que apresenta maior densidade microbiana podendo
alcanccedilar 1014UFCg-1 Dados tem mostrado que cada indiviacuteduo carrega mais de
1000 filotipos que representam mais de 7000 linhagens (AZAD et al 2013
ECKBURG et al 2005 FRANK et al 2007 HOLZAPFEL 2006 KLEEREBEZEM
VAUGHAN 2009 LEY et al 2008 QUIGLEY 2013 ZOETENDAL et al 2006)
Aproximadamente 99 dos genes identificados por metagenoma do intestino
humano satildeo bacterianos Na maioria dos indiviacuteduos cerca de 90 dos filos satildeo
Firmicutes e Bacteroidetes seguidos por Actinobacterias (famiacutelia Bifidobacteriaceae)
e Proteobacterias (famiacutelia Enterobacteriaceae) O filo mais abundante refere-se ao
Firmicutes apresentando como principais integrantes as classes Bacilli Clostridia e
Molicutes e dos Bacteroidetes as classes Bacteroides Flavobacteria e
Sphingobacterias Os filos Actinobacterias e Proteobacterias se apresentam em
menor proporccedilatildeo (ARUMUGAM et al 2011 DE FILIPPO et al 2010
HUTTENHOWER et al 2012 QIN et al 2010 QUIGLEY 2013 VILLANUEVA-
MILLAacuteN et al 2015 VRIEZE 2010 ZOETENDAL et al 2006)
34
223 Fatores que influenciam a composiccedilatildeo da microbiota intestinal
A microbiota do TGI humano eacute uma comunidade complexa cuja composiccedilatildeo
eacute inconstante diferindo inter e intra-individualmente definida por uma seacuterie de
fatores como geneacutetica do hospedeiro alimentaccedilatildeo sucessatildeo bacteriana funccedilatildeo
imune e estado de sauacutede (LEY et al 2008 EVERARD et al 2011 2014)
2231 Fases da vida
A diversidade bacteriana no intestino infantil eacute inicialmente muito baixa ateacute os
dois anos ao contraacuterio da microbiota de adulto (GAREAU et al 2010 HAJELA et al
2015) A baixa diversidade de bacteacuterias na primeira infacircncia inibe a maturaccedilatildeo
regular da microbiota intestinal e maturaccedilatildeo tardia da mucosa do sistema
imunoloacutegico implicando em riscos do aumento da resposta imune assim como
doenccedilas aleacutergicas Neste contexto envolve o desenvolvimento da toleracircncia oral e a
susceptibilidade da crianccedila a alergias e inflamaccedilatildeo A microbiota sofre portanto
mudanccedilas substanciais nos extremos da vida essas ramificaccedilotildees ainda estatildeo sendo
exploradas (AURELI et al 2011 HAJELA et al 2015 SHERIDAN et al 2014
SMITH et al 2013)
2232 Tipo de parto
A microbiota maternal eacute uma fonte de micro-organismos para a colonizaccedilatildeo do
TGI do receacutem-nascido As bacteacuterias residentes no canal vaginal e na regiatildeo perineal
tambeacutem ganham acesso ao TGI de receacutem-nascidos (BRY et al 1996 MACKIE et
al 1999) Ocorrem diferenccedilas entre o microbioma de um bebecirc receacutem-nascido por
parto normal em comparaccedilatildeo ao bebecirc receacutem-nascido por parto cesaacuterea No parto
vaginal o bebecirc eacute colonizado por bacteacuterias vaginais e fecais maternas cujas
composiccedilatildeo microbiana reflete a microbiota intestinal materna composta
predominantemente pelos gecircneros Lactobacillus Prevotella Atopobium e Sneathia
As amostras fecais de bebecircs nascidos de parto cesariana apresentaram gecircneros
tiacutepicos de microbiota da pele e do ambiente hospitalar predominantemente
Staphylococcus e C difficile Estes bebecircs tambeacutem apresentaram niacuteveis
significativamente mais baixos de Bifidobacterium e diversidade bacteriana menor do
que os bebecircs nascidos por parto normal Estas diferenccedilas podem justificar o
aumento do risco de doenccedilas especiacuteficas em bebecircs receacutem-nascidos por parto
35
cesariana agrave longo prazo (AZAD et al 2013 BELLO et al 2010 COLLADO et al
2012 DOMINGUEZ- PENDERS et al 2006 PRINCE et al 2014)
As diferenccedilas no processo de colonizaccedilatildeo intestinal decorrentes do tipo de
parto poderiam refletir-se no desenvolvimento do sistema imunoloacutegico visto que os
micro-organismos gastrintestinais influenciam esse processo por meio do envio de
importantes sinais regulatoacuterios necessaacuterios para o desenvolvimento da adequada
toleracircncia ao ambiente (BIASUCCI et al 2008 CARDWELL et al 2008
DOMINGUEZ-BELLO et al 2010 KOENIG et al 2011 MORELLI et al 2008
RENZ-POLSTER et al 2005)
2233 Tipo de aleitamento
O leite materno humano eacute considerado um dos principais fatores da iniciaccedilatildeo e
no desenvolvimento da microbiota do neonato uma vez que conteacutem substratos
(prebioacuteticos) para estimular o crescimento bacteriano e tambeacutem eacute fonte de micro-
organismos Estima-se que o consumo de 800 ml de leite materno por dia
proporcione 1 x 105 a 1 x 107 micro-organismos comensais durante a amamentaccedilatildeo
(MARTIN et al 2004) Desta maneira a contagem de Bifidobacterium aumenta
drasticamente Lactobacillus e Bacteroides aumentam em menor proporccedilatildeo e
enterobacteacuterias e enterococos diminuem Espeacutecies de Bifidobacterium
correspondem de 80 a 90 do total dos componentes da microbiota fecal infantil
presentes em bebecircs amamentados por leite materno Jaacute em receacutem-nascidos
alimentados com foacutermulas infantis a microbiota tem demonstrado ser muito mais
complexa sendo composta por Bifidobacterium Bacteroides Clostridium e
Streptococcus (ADLERBERTH WOLD 2009 CUMMINS THOMPSON 1997 DE
SANTA BARBARA et al 2003 DONOVAN ODIE 1994 DONOVAN 2006 MACKIE
et al 1999 MARQUES et al 2010 MCCRACKEN LORENZ 2001 PALMER
2011 POROYKO et al 2010)
2234 Uso de antibioacutetico
A eventual antibioticoterapia interfere tambeacutem no equiliacutebrio da microbiota A
disbiose (alteraccedilatildeo da microbiota) depende de fatores como espectro de accedilatildeo da
droga idade e dieta do indiviacuteduo dosagem e duraccedilatildeo do tratamento via de
administraccedilatildeo propriedades farmacocineacuteticas e farmacodinacircmicas aleacutem de grau de
36
resistecircncia da comunidade (LEY 2000 SULLIVAN et al 2001) A seleccedilatildeo de
bacteacuterias resistentes a drogas pela antibioticoterapia eacute um problema mundial Os
genes de resistecircncia passam para diversos gecircneros bacterianos no intestino A
aquisiccedilatildeo de genes de resistecircncia confere benefiacutecios a determinada espeacutecie
bacteriana diante da pressatildeo seletiva exercida pelo antibioacutetico Quando essa
pressatildeo seletiva eacute suspensa a cepa resistente apresenta menor desempenho em
comparaccedilatildeo com a espeacutecie susceptiacutevel No entanto esse clone menos competitivo
pode compensar essa perda de desempenho pela aquisiccedilatildeo de mutaccedilotildees
compensatoacuterias (JERNBERG et al 2010) No intestino os antibioacuteticos aleacutem de
selecionarem bacteacuterias resistentes tambeacutem aumentam o nuacutemero de transferecircncias
do pool de genes de ceacutelulas resistentes (DETHJEFSEN et al 2008 KARAMI et al
2007 YANG et al 2009)
2235 Dieta
Muitos estudos tem sido realizados no intuito de compreender a relaccedilatildeo entre o
consumo alimentar e a composiccedilatildeo da microbiota intestinal principalmente no
sentido de uma dieta ocidentalizada baseada em alimentos ricos em carboidratos
simples lipiacutedios e proteiacutenas de origem animal sal e poucos alimentos in natura
como frutas e hortaliccedilas ao comparar se com a dietas dos nossos antepassados
caracterizada pelo consumo de grandes quantidades de amido fibras e
polissacaacuteridos vegetais aleacutem de pequenas quantidades de gordura e proteiacutena
animal Em modelos murinos de obesidade induzida por padratildeo de dieta ocidental
no qual animais geneticamente idecircnticos que herdaram microbiotas semelhantes a
relaccedilatildeo entre dieta e representantes microbianos eacute dinacircmica e ajustaacutevel impactando
a capacidade da microbiota de promover a adiposidade no hospedeiro (CARMODY
et al 2015 DAVID et al 2014 DE FILIPPO et al 2010 FLEISSNER et al 2010
HILDEBRANDT et al 2009 LEY et al 2008 MENDONCcedilA ANJOS 2004 WALKER
et al 2011 WONG et al 2012 WU et al 2011)
Uma vez que a microbiota foi estabelecida nestes primeiros anos observa-se
um aumento na composiccedilatildeo microbiana tanto na diversidade quanto na riqueza
atingindo a mais alta complexidade em adultos com vaacuterias centenas de filotipos e
niacuteveis de espeacutecie Cada indiviacuteduo humano atinge um cliacutemax de composiccedilatildeo
homeostaacutetico o que provavelmente permanece relativamente estaacutevel durante a
37
maior parte da vida de um adulto saudaacutevel Nas fases tardias da vida a composiccedilatildeo
da microbiota torna-se novamente menos diversificada e mais dinacircmica
caracterizada por uma maior proporccedilatildeo de Bacteroidetes para Firmicutes aumento
de Proteobacteria e diminuiccedilatildeo da Bifidobacterium (MACKIE 1999 OTTMAN et al
2012 RAUTAVA et al 2012 VILLANUEVA-MILLAacuteN et al 2015) (Figura 1)
Figura 1 ndash Fatores envolvidos no estabelecimento da microbiota humana ao longo
da vida
Adaptado de MJ Villanueva-Millaacuten et al 2015
38
224 Microbiota intestinal e a fisiologia do hospedeiro
O intestino representa a interface natural entre microbiota intestinal e o
hospedeiro sendo a mucosa intestinal a localizaccedilatildeo principal para a interaccedilatildeo de
micro-organismos e antiacutegenos com o hospedeiro por meio de intenso cross-talk
(KINROSS et al 2011) Os achados de estudos cliacutenicos e experimentais tecircm
evidenciado que a interaccedilatildeo microbiotahospedeiro pode influenciar favoravelmente
a sauacutede do hospedeiro de diversas maneiras Ateacute agora as principais funccedilotildees
conhecidas da microbiota podem ser classificadas em quatro grupos metaboacutelica
(nutriccedilatildeo e digestatildeo) proteccedilatildeo (proteccedilatildeo contra agentes patogecircnicos
imunomodulaccedilatildeo) troacutefica (controle da proliferaccedilatildeo de ceacutelulas epiteliais e
diferenciaccedilatildeo) e regulaccedilatildeo da adiposidade
2241 Nutriccedilatildeo e Metabolismo
A microbiota intestinal eacute um importante fator que afeta a extraccedilatildeo de energia a
partir da dieta e do armazenamento de energia no hospedeiro A fim de realizar
estas funccedilotildees as enzimas metaboacutelicas da microbiota intestinal como as glicosidases
e polissacaridases tecircm a capacidade de extrair energia a partir de nutrientes
inacessiacuteveis uma vez que estas enzimas satildeo capazes de clivar ligaccedilotildees glicosiacutedicas
presentes em alguns polissacariacutedeos de plantas e fibras dieteacuteticas (BACKHED et al
2004 2005 GUARNER MALAGELADA 2003) Os polissacariacutedeos natildeo digeriacuteveis
como a oligofrutose (inulina) satildeo metabolizados pela microbiota colocircnica em
oligossacariacutedeos e monossacariacutedeos e entatildeo fermentados a aacutecidos graxos de
cadeia curta (AGCC) particularmente acetato propionato e butirato Estes AGCC
satildeo rapidamente absorvidos O Butirato fornece energia para o metabolismo celular
enquanto acetato e propionato seguem para a corrente sanguiacutenea sendo
transportados para o fiacutegado e oacutergatildeos perifeacutericos onde podem atuar como substratos
para a gliconeogecircnese e lipogecircnese (SHEN et al 2013 ZAIBI et al 2010)
A microbiota intestinal tambeacutem induz a expressatildeo do peptiacutedeo YY (PYY)
anorexigecircnico que geram sinais de saciedade atraveacutes de um mecanismo
dependente do receptor GPR41 Assim a produccedilatildeo de AGCC pela microbiota
intestinal estaacute associada com um aumento na saciedade e uma reduccedilatildeo na ingestatildeo
de alimentos no hospedeiro o qual por sua vez controla o ganho de peso corporal
(CLUNY et al 2015 SHEN et al 2013 ZAIBI et al 2010) Outros mecanismos
39
pelos quais as bacteacuterias do intestino podem influenciar metabolismo do colesterol
satildeo induzidos atraveacutes de Fasting Induced Adipocyte Factor (FIAF) que eacute
seletivamente suprimida no epiteacutelio intestinal pela microbiota intestinal (MARTINEZ
et al 2009)
Tambeacutem tem sido relatado o envolvimento da microbiota intestinal na
metabolizaccedilatildeo de polifenoacuteis que contribuem para o seu potencial antioxidante e
accedilotildees beneacuteficas aleacutem de siacutentese de algumas vitaminas como B12 e K aleacutem da
induccedilatildeo da expressatildeo do receptor de vitamina D pelos AGCC aumentando a sua
absorccedilatildeo e regulando o metabolismo do caacutelcio (BRENCHLEY DOUEK 2012
GUARNER MALAGELADA 2003 KIM et al 1998 MANACH DONOVAN 2004
RESTA 2009 SCALBERT WILLIAMSON 2000) Finalmente a microbiota intestinal
tambeacutem eacute capaz de executar uma seacuterie de biotransformaccedilotildees em xenobioacuteticos
como drogas e seus metaboacutelitos em formas que podem afetar sua absorccedilatildeo e
biodisponibilidade (WILSON NICHOLSON 2009) Neste contexto tem sido
demonstrado que a microbiota intestinal metaboliza toacutexicos e compostos
potencialmente canceriacutegenos tais como pirolisatos (BRENCHLEY DOUEK 2012)
2242 Proteccedilatildeo
Tem sido observado que a ausecircncia da microbiota intestinal torna o organismo
suscetiacutevel agrave infecccedilatildeo Alguns dos mecanismos envolvidos nessas accedilotildees protetoras
incluem competiccedilatildeo direta de nutrientes limitados e a modulaccedilatildeo de respostas
imunoloacutegicas no hospedeiro (GUARNER MALAGELADA 2003 KAMADA et al
2013 SEKIROV et al 2010)
22421 Competiccedilatildeo direta de nutrientes
Vaacuterios mecanismos tecircm sido implicados na resistecircncia agrave colonizaccedilatildeo do trato
gastrintestinal por patoacutegenos A camada de muco intestinal eacute capaz de manter
mutualismos mantendo as bacteacuterias no compartimento e restringindo estimulaccedilatildeo
imunoloacutegica ostensiva O hospedeiro fornece ativamente os nutrientes que a
microbiota precisa e a microbiota indica a quantidade de nutrientes que satildeo
necessaacuterios para o hospedeiro Esta relaccedilatildeo impede superproduccedilatildeo indesejada do
nutriente o que favoreceria a intrusatildeo de micro-organismos competitivos com
potencial de patogenicidade Finalmente as bacteacuterias podem inibir o crescimento
40
dos seus concorrentes produzindo peptiacutedeos antimicrobianos ou proteiacutenas
conhecidas como bacteriocinas que satildeo sintetizadas em ribossomos (GUARNER
MALAGELADA 2003 MONTALTO et al 2009 PURCHIARONI et al 2013
SEKIROV et al 2010)
22422 Imunomodulaccedilatildeo
As interaccedilotildees entre micro-organismos e ceacutelulas epiteliais e imunes baseiam-se
no reconhecimento de padrotildees moleculares associados agrave micro-organismos
(MAMPs) sendo mediado por receptores de reconhecimento padratildeo representados
pelos receptores do tipo toll (TLR) encontrados na superfiacutecie de ceacutelulas epiteliais e
imunes e pelos receptores de domiacutenio de digomerizaccedilatildeo de ligaccedilatildeo de nucleotiacutedeos
(NOD) que se encontram no citoplasma Esses receptores desempenham um
importante papel na gecircnese e na modulaccedilatildeo da resposta inflamatoacuteria (FRANCHI et
al 2009 MARANDUBA et al 2014 MONTALTO et al 2009 PURCHIARONI et al
2013)
A interaccedilatildeo funcional entre microbiota intestinal e sistema imunoloacutegico inicia-
se com a promoccedilatildeo de um ambiente anti-inflamatoacuterio pelas bacteacuterias (Figura 2) Em
um contexto simbioacutetico MAMPs estimulam continuamente atraveacutes das IECs (ceacutelulas
epiteliais intestinais) a secreccedilatildeo das proteiacutenas antimicrobianas intestinais REGIIIγ
para o luacutemen aleacutem de linfopoietina estromal tiacutemica (TSLP) IL-33 IL-25 e o fator de
crescimento tumoral-β (TGF-β) sob o epiteacutelio Esses mediadores imunoloacutegicos
induzem o desenvolvimento de macroacutefagos tolerogecircnicos e ceacutelulas dendriacuteticas
(DCs) tolerogecircnicas (KAMADA et al 2013 MAYNARD et al 2012)
Ceacutelulas Dendriacuteticas (DCs) tolerogecircnicas produzem TGF-β e aacutecido retinoacuteico
(RA) que estimulam o desenvolvimento de Ceacutelulas T regulatoacuterias (Treg) Assim
atraveacutes das ceacutelulas Treg (que utilizam diversos mecanismos de regulaccedilatildeo)
macroacutefagos (que produzem IL-10) e DCs tolerogecircncicos o sistema imunoloacutegico
intestinal eacute capaz de estabelecer e manter um ambiente anti-inflamatoacuterio Aleacutem dos
papeacuteis reguladores essenciais de TGF-β esta citocina tem sido associada com
outras substacircncias derivadas do epiteacutelio tais como fator de ativaccedilatildeo de ceacutelulas β
(FABF) e ligante indutor de proliferaccedilatildeo (APRILL) com o intuito de induzir o
desenvolvimento de ceacutelulas produtoras de IgA (plasmoacutecitos) (FAGARASAN et al
2010) Esta imunoglobulina eacute capaz de prevenir a ligaccedilatildeo de bacteacuterias comensais no
41
epiteacutelio do hospedeiro estando portanto envolvida na formaccedilatildeo da microbiota
intestinal (MACPHERSON et al 2012)
Aleacutem disto tem sido relatada que a produccedilatildeo de alguns tipos de peptiacutedeos
antimicrobianos bacterianos (AMPs) como a secreccedilatildeo das proteiacutenas
antimicrobianas intestinais REGIIIγ REGIIIβ e angiogenina-4 eacute influenciada pela
micro-organismos comensais via TLR MyD88 (FRANCHI et al 2009 GOTO
IVANOV 2013 VAN VLIET et al 2010) Desse modo verifica-se que no intestino
humano saudaacutevel a microbiota promove constante exposiccedilatildeo de ligantes aos TLR
garantindo a ativaccedilatildeo basal contiacutenua de vias de sinalizaccedilatildeo resultando em
inflamaccedilatildeo fisioloacutegica de baixa intensidade Aleacutem disso micro-organismos
comensais tambeacutem satildeo capazes de suprimir respostas inflamatoacuterias intensas (VAN
VLIET et al 2010)
42
Figura 2 ndash Interaccedilatildeo funcional entre a microbiota intestinal humana e o sistema
imunoloacutegico
Legenda ndash O equiliacutebrio evolutivo eacute formado ao longo do tempo sendo modulado por pressatildeo ambiental A
microbiota intestinal e o ambiente intestinal satildeo desenvolvidas em conjunto sendo necessaacuterio para o benefiacutecio de ambos tolerar um ao outro O sistema imunoloacutegico monitora essa interaccedilatildeo garantindo a homeostase e contribuindo para a simbiose No entanto o desequiliacutebrio causado na presenccedila de disbiose pode causar a reaccedilatildeo do sistema imunoloacutegico Simbiose e disbiose dependem de equiliacutebrio entre bacteacuterias comensais e patogecircnicas Bacteacuterias comensais promovem um ambiente anti-inflamatoacuterio Em um contexto de simbiose MAMPs estimulam continuamente as IECs a secretarem moleacuteculas que atuam protegendo o epiteacutelio e produzindo um ambiente tolerogecircnico Em disbiose haacute uma liberaccedilatildeo significativa de MAMPs que podem induzir IECs DCs ativadas e macroacutefagos a secretar citocinas inflamatoacuterias Consequentemente haacute um desenvolvimento de efetores imunoloacutegicos IL-22 eacute produzida em ambas as situaccedilotildees mas a contribuiccedilatildeo para a remodelaccedilatildeo da barreira epitelial eacute controlada por regulaccedilatildeo imune M macroacutefago Com bacteacuterias comensais Pato bacteacuterias patogecircnicas
Adaptado de MARANDUBA et al 2014
43
2243 Funccedilatildeo Troacutefica
A microbiota intestinal desempenha funccedilotildees troacuteficas modulando a proliferaccedilatildeo
e diferenciaccedilatildeo de ceacutelulas epiteliais do coacutelon atraveacutes dos AGCC produzidos na
fermentaccedilatildeo de hidratos de carbono natildeo digeriacuteveis Neste contexto o butirato eacute
considerado o AGCC com maior efeito pois promove o crescimento e o turnover das
ceacutelulas epiteliais acelerando a maturaccedilatildeo intestinal da mucosa durante o seu
desenvolvimento ou para induzir seu reparo apoacutes uma lesatildeo O butirato eacute capaz de
aumentar proliferaccedilatildeo diferenciaccedilatildeo e maturaccedilatildeo aleacutem de reduzir apoptose de
enteroacutecitos normais no intestino delgado atraveacutes de sua influecircncia sobre a
expressatildeo de genes e a siacutentese de proteiacutenas (GUILLOTEAU et al 2010 HAMER et
al 2008)
O butirato parece exercer um efeito troacutefico em ceacutelulas epiteliais do iacuteleo e do
jejuno atraveacutes de um mecanismo de neuro-hormonal sugerindo um efeito indireto
No coacutelon a ausecircncia de butirato induziu apoptose massiva nos colonoacutecitos podendo
ser explicado pelo fato de que o butirato eacute a fonte principal de energia para estas
ceacutelulas aleacutem de estimular a liberaccedilatildeo de peacuteptidos gastrointestinais eou fatores de
crescimento que desempenham um papel fundamental na proliferaccedilatildeo celular
(GUILLOTEAU et al 2010 HAMER et al 2008)
2244 Regulaccedilatildeo da adiposidade
Tem sido evidenciado que a microbiota intestinal influecircncia a adiposidade do
hospedeiro A primeira evidecircncia do papel da microbiota intestinal na regulaccedilatildeo da
homeostase energeacutetica e adiposidade do hospedeiro foi demonstrada por Backhed
et al (2004) em estudo que foi demonstrado que ratos germ-free apresentavam
menor conteuacutedo de gordura corporal do que ratos convencionais mesmo ao
consumirem a mesma quantidade de alimentos Diferentes mecanismos tecircm sido
propostos para explicar a relaccedilatildeo entre microbiota intestinal e a adiposidade Assim
dependendo da sua composiccedilatildeo a microbiota pode aumentar a extraccedilatildeo energeacutetica
da dieta a partir de polissacariacutedeos natildeo digeriacuteveis com menor conteuacutedo de energia
disponiacutevel nas fezes aleacutem de maiores niacuteveis de AGCC no intestino Propotildee-se
ainda que a microbiota intestinal seja capaz de induzir a regulaccedilatildeo de genes do
hospedeiro que modulam o metabolismo energeacutetico (MUSSO et al 2011)
44
225 Microbiota intestinal e disbiose
Em condiccedilotildees saudaacuteveis existe um equiliacutebrio entre todos os micro-organismos
presentes no intestino estando as bacteacuterias beneacuteficas em maior quantidade
(eubiose) Entretanto pode ocorrer desequiliacutebrio na microbiota com consequente
predomiacutenio das bacteacuterias potencialmente patogecircnicas sobre as beneacuteficas Esse
desequiliacutebrio eacute definido como disbiose e pode comprometer a sauacutede do hospedeiro
uma vez que se associa agrave patogecircnese de vaacuterias doenccedilas (HAWRELAK MYERS
2004)
O uso de antibioacuteticos anti-inflamatoacuterios hormonais e natildeo hormonais abuso de
laxantes consumo excessivo de alimentos processados baixo consumo de
alimentos crus excessiva exposiccedilatildeo a toxinas ambientais incluindo alguns metais
pesados doenccedilas consumptivas como cacircncer e siacutendrome da imunodeficiecircncia
adquirida (AIDS) disfunccedilotildees hepatopancreaacuteticas estresse divertiacuteculos idade
tempo de tracircnsito e pH intestinal disponibilidade de material fermentaacutevel estado
imunoloacutegico do hospedeiro e infecccedilotildees satildeo fatores importantes para promover
alteraccedilatildeo da microbiota acarretando em disbiose intestinal e consequentemente
modificando vaacuterias funccedilotildees do TGI incluindo a digestatildeo a
biodisponibilidadeabsorccedilatildeo eliminaccedilatildeo desintoxicaccedilatildeo e funccedilatildeo imunoloacutegica
(ALMEIDA et al 2009 HAWRELA MYERS 2004 SEARS GENUIS 2012)
Em um contexto de disbiose (Figura 2) a presenccedila de agentes patogeacutenicos
pode perturbar a regulaccedilatildeo do ambiente anti-inflamatoacuterio Quando patoacutegenos
enteacutericos superam as bacteacuterias comensais o desequiliacutebrio entre comensais e
bacteacuterias patogecircnicas provoca uma liberaccedilatildeo significativa de MAMPs Este aumento
pode induzir IECs DCs e macroacutefagos ativados a secretar citocinas inflamatoacuterias
como a IL-1β IL-6 IL-12 e IL-23 Estas citocinas estimulam o desenvolvimento de
ceacutelulas CD4+ T auxiliares (T helper - TH1) e ceacutelulas TH17 (produzem IL-17A IL-
17F e IL-22) resultando na inflamaccedilatildeo crocircnica (MAYNARD et al 2012)
Na vigecircncia da disbiose intestinal pode ocorrer perda de funccedilotildees importantes
da microbiota do hospedeiro As alteraccedilotildees qualitativas e quantitativas na microbiota
intestinal aleacutem das alteraccedilotildees nas atividades metaboacutelicas e na distribuiccedilatildeo dos
micro-organismos ao longo do intestino associam-se a diversas condiccedilotildees tais
como diarreias deacuteficits nutricionais doenccedila celiacuteaca cacircncer colorretal doenccedilas
45
inflamatoacuterias intestinais siacutendrome do coacutelon irritaacutevel e supercrescimento bacteriano
(ALMEIDA et al 2009 HAWRELAK MYERS 2004)
A disbiose pode provocar aumento da permeabilidade intestinal alterando uma
importante funccedilatildeo da mucosa intestinal que eacute a atividade de barreira Assim
moleacuteculas antigecircnicas ou toacutexicas e micro-organismos nocivos podem se translocar
atraveacutes da barreira promovendo a passagem destas substacircncias atraveacutes da mucosa
epitelial para o sangue ou sistema linfaacutetico gerando uma resposta inflamatoacuteria
sistecircmica A ligaccedilatildeo entre disbiose e desenvolvimento de doenccedilas como obesidade
diabetes e doenccedilas cardiovasculares vem sendo explorada A obesidade representa
uma das doenccedilas mais estudadas associadas agrave perturbaccedilotildees na microbiota
intestinal no entanto requer mais estudos (Figura 3) (ALMEIDA et al 2009
HAWRELAK MYERS 2004 KINROSS et al 2011)
46
Figura 3 ndash Doenccedilas influenciadas pelo metabolismo microbiano intestinal
Legenda ndash A variedade de doenccedilas sistecircmicas que satildeo diretamente influenciadas pelo metabolismo da microbiota intestinal e a sua influecircncia sobre outras vias em mamiacuteferos tais como o sistema imunitaacuterio inato tem sido demonstradas Especificamente em destaque incluem as vias metaboacutelicas envolvidas com o metabolismo de drogas e a obesidade que satildeo diretamente influenciados pelo teor microbiano intestinal Ags antigeacutenios C bolteae Clostridium Bolteae DCs ceacutelulas dendriacuteticas AGCC aacutecidos graxos de cadeia curta TLR receptor Toll-like
Adaptado de Kinross et al 2011
47
226 Microbiota Intestinal e obesidade
A partir de 2004 mais um fator ambiental passou a ser apontado como
importante para o controle do peso e da homeostase energeacutetica a microbiota
intestinal As primeiras evidecircncias da relaccedilatildeo microbiota intestinal versus obesidade
foram constatadas em animais germ-free convencionalizados Esses animais
demonstraram que mesmo ao consumir uma menor quantidade de dieta e portanto
menos calorias em comparaccedilatildeo aos animais germ-free apresentaram aumento da
quantidade de gordura corporal (BACKHED et al 2004)
Especificamente tem-se observado que a microbiota de ratos obesos tem uma
maior capacidade de extraccedilatildeo de energia da dieta e esta caracteriacutestica pode ser
transmissiacutevel atraveacutes da colonizaccedilatildeo de ratos germ-free com a microbiota fecal de
doadores obesos resultando em um aumento significativamente maior no percentual
de gordura corporal total com o intuito de armazenar os lipiacutedeos produzidos Estes
estudos demonstraram que microbiota intestinal eacute um potencial fator de contribuiccedilatildeo
adicional agrave fisiopatologia da obesidade (BACKHED et al 2004 HARRIS et al 2012
LEY et al 2005 TURNBAUGH et al 2006)
A definiccedilatildeo da alteraccedilatildeo na composiccedilatildeo da microbiota intestinal de obesos
ainda permanece controversa na literatura tanto no que se refere agrave abordagem em
niacutevel de filo quanto de espeacutecies em humanos (LYRA et al 2010) Aleacutem destes
estudos realizados com animais germ-free outros observaram associaccedilotildees
importantes entre obesidade e mudanccedilas na composiccedilatildeo da microbiota intestinal tal
como uma diversidade bacteriana reduzida (no filo eou outros niacuteveis) eou
representaccedilatildeo alterada de genes e vias metaboacutelicas bacterianas (DE LA SERRE et
al 2010 LEY et al 2006 TURNBAUGH et al 2006)
Em geral vaacuterios autores tecircm demonstrado associaccedilotildees entre obesidade e
mudanccedilas na abundacircncia relativa dos dois filos bacterianos dominantes
Bacteroidetes e Firmicutes Mais especificamente um aumento do filo Firmicutes e
uma diminuiccedilatildeo do filo Bacteroidetes em modelos de ratos obesos e pacientes tecircm
sido observado Aleacutem disso indiviacuteduos magros e pessoas que perderam peso
apresentaram maior abundacircncia do filo Bacteroidetes (ABDALLAH et al 2011
BACKHED et al 2007 CANI et al 2008 LEY et al 2005 2006 TURNBAUGH et
al 2006 VERDAM et al 2013)
48
O aumento da razatildeo FirmicutesBacteroidetes em ratos obesos pode estar
associada com possiacuteveis mediaccedilotildees de respostas adaptativas pelo hospedeiro para
limitar a absorccedilatildeo de armazenamento de energia eou para promover a adiposidade
(LEY et al 2005) Embora os resultados dos estudos demonstrem diferenccedilas na
proporccedilatildeo de grupos bacterianos entre indiviacuteduos eutroacuteficos e obesos ainda natildeo se
sabe se algum grupo de micro-organismos em especial contribui de maneira direta
para o desenvolvimento da obesidade e de alteraccedilotildees metaboacutelicas Associaccedilotildees
entre tipos de bacteacuteria e as variaacuteveis metaboacutelicas tecircm sido observadas seja em
humanos ou em modelo animal indicando que a modulaccedilatildeo de determinados
grupos bacterianos possa exercer efeito no contexto da obesidade Os desafios
enfrentados agora se referem ao entendimento dos mecanismos pelos quais grupos
bacterianos influenciam paracircmetros metaboacutelicos e se intervenccedilotildees dieteacuteticas ou
medicamentosas utilizadas para modular a proporccedilatildeo desses grupos bacterianos
podem melhorar o perfil metaboacutelico ou ao contraacuterio agravaacute-lo (TURNBAUGH et al
2009)
Em relaccedilatildeo agrave composiccedilatildeo da microbiota intestinal seguida agrave perda de peso de
acordo com estudos de coorte a proporccedilatildeo de Bacteroidetes aumentou enquanto o
nuacutemero de Firmicutes diminuiu parecendo restaurar a relaccedilatildeo
FirmicutesBacteroides que estava inicialmente aumentada em indiviacuteduos obesos
Na verdade apoacutes 10 semanas de restriccedilatildeo energeacutetica e de exerciacutecio os
participantes que perderam mais de quatro quilogramas (kg) de peso corporal
mostraram um aumento significativo na populaccedilatildeo de Grupo B fragilis bem como
um aumento na proporccedilatildeo BacteroidesPrevotella positivamente correlacionada com
a perda de peso (HARRIS et al 2012 NADAL et al 2009 SANTACRUZ et al
2009)
No que se diz respeito aos efeitos do exerciacutecio fiacutesico na microbiota intestinal
Evans et al (2014) demonstraram que o exerciacutecio teve efeitos significativos tanto em
camundongos eutroacuteficos quanto em camundongos obesos que ingeriam dieta rica
em gordura sobre o equiliacutebrio relativo dos principais filos bacterianos juntamente
com a prevenccedilatildeo de obesidade e normalizaccedilatildeo da toleracircncia agrave glicose induzida por
dieta De fato a distacircncia percorrida eacute proporcional agrave diminuiccedilatildeo observada para a
razatildeo FirmicutesBacteroides (EVANS et al 2014) Tambeacutem eacute importante ressaltar
que o exerciacutecio aumentou significativamente a proporccedilatildeo relativa de bacteacuterias
49
produtoras de butirato tais como Bacteroidales S24-7 que estatildeo associados com a
sauacutede da ceacutelula epitelial intestinal Aleacutem disso o exerciacutecio fiacutesico aumentou a
diversidade da microbiota intestinal apenas em ratinhos alimentados com uma dieta
rica em gordura No entanto sugere-se que o exerciacutecio pode agir de forma
independente da microbiota intestinal aumentando a utilizaccedilatildeo de energia apesar
de um consumo de uma dieta rica em gordura
227 Mecanismos pelos quais a microbiota intestinal contribui para a obesidade
2271 Extraccedilatildeo de energia adicional da dieta
A noccedilatildeo de que a microbiota intestinal fornece energia para o hospedeiro eacute
suportada por achados em ratos germ-free natildeo naturalmente colonizados com
micro-organismos que apresentaram um menor ganho de peso quando alimentados
com uma dieta rica em gordura do que os ratos germ-free controles (BACKHED et
al 2007 CAESAR et al 2012 DING et al 2010 TREMAROLI BACKHED 2012)
Esses resultados evidenciam que na ausecircncia da microbiota o consumo de uma
dieta obesogecircnica parece natildeo estimular o desenvolvimento da obesidade A
Microbiota intestinal pode afetar ambos os lados da equaccedilatildeo do balanccedilo energeacutetico
natildeo apenas como um fator que influencia a colheita de energia a partir de
componentes da dieta mas tambeacutem como um fator que afeta genes do hospedeiro
que regulam o gasto de energia eou de armazenamento (BACKHED et al 2004
GILL et al 2006 WOLEVER et al 1991)
A fermentaccedilatildeo de polissacariacutedeos pela microbiota pode gerar um aumento no
fluxo de monossacariacutedeos para o fiacutegado e adipoacutecitos favorecendo a lipogecircnese de
novo atraveacutes da ativaccedilatildeo da expressatildeo de dois reguladores nucleares de enzimas
lipogecircnicas- carbohydrate response element-binding protein (ChREBP) e liver sterol
response element binding protein type-1 (SREBP-1) - os quais ativam as enzimas
lipogecircnicas acetil-CoA carboxilase e aacutecido graxo sintase (BACKHED et al 2004
MUSSO et al 2011 TSUKUMO et al 2009) Nesse contexto o menor acuacutemulo de
gordura corporal demonstrado em animais germ-free que consumiram dieta
hiperlipiacutedica e apresentaram absorccedilatildeo semelhante aos animais convencionalizados
indica que a microbiota pode exercer efeito sobre o fluxo de lipiacutedios entre os tecidos
reduzindo o acuacutemulo de gordura (BACKHED et al 2007)
50
A proteiacutena Fasting Induced Adipose Factor (FIAF) eacute suprimida pela presenccedila
de microbiota sendo um inibidor da lipase lipoproteacuteica (LPL) produzido pelo
intestino fiacutegado e tecido adiposo limitando a captaccedilatildeo de aacutecidos graxos e
favorecendo o acuacutemulo de triacilgriceroacuteis nesse tecido Tem sido demonstrado que
animais germ-free apresentaram uma maior expressatildeo de FIAF e fenoacutetipo resistente
agrave obesidade (BACKHED et al 2004 2005 2007) A participaccedilatildeo de FIAF no
metabolismo lipiacutedico foi reforccedilada atraveacutes de estudos com ratos germ-free que
diferiram apenas na expressatildeo dessa proteiacutena (FIAF ++ versus FIAF --) onde
verificou-se que a deficiecircncia dessa proteiacutena induzida geneticamente natildeo eacute um fator
protetor para animais germ-free contra o ganho de peso promovido pela dieta
hiperlipiacutedica (BACKHED et al 2007)
Aleacutem de promover a lipogecircnese (atraveacutes das enzimas lipogecircnicas e inibiccedilatildeo da
FIAF) a microbiota tambeacutem desempenha um papel importante no gasto de energia
obtida a partir da dieta Mais especificamente a microbiota de obesos parece
favorecer uma inibiccedilatildeo de oxidaccedilatildeo de aacutecidos graxos (que por sua vez favorecem a
deposiccedilatildeo e armazenamento de lipiacutedios no tecido adiposo fiacutegado eou tecido
muscular) por mecanismos complementares mas independentes (HARDIE
SAKAMOTO 2006 PUIGSERVER SPIEGELMAN 2003 RABOT et al 2010)
A microbiota tambeacutem pode influenciar a homeostase energeacutetica por meio da
sinalizaccedilatildeo exercida pelos aacutecidos graxos de cadeia curta (AGCC) Os AGCC agem
natildeo apenas como fonte de energia mas tambeacutem como moleacuteculas de sinalizaccedilatildeo
atraveacutes de receptores acoplados agrave proteiacutena G (GPRs) GPRs satildeo um grupo de
receptores transmembracircnicos intestinais que respondem aos aacutecidos graxos Entre
os receptores dessa famiacutelia os receptores Gpr41 e Gpr43 satildeo fundamentais sendo
expressos abundantemente no intestino delgado distal no coacutelon e nos adipoacutecitos
Essa ligaccedilatildeo resulta na ativaccedilatildeo desses receptores induzindo a secreccedilatildeo de
polipeptiacutedeo YY (PYY) e leptina hormocircnios que influenciam nas funccedilotildees intestinais
e na regulaccedilatildeo do apetite (BELLAHCENE et al 2013 BINDELS et al 2013
HARDIE SAKAMOTO 2006 INOUE et al 2014 MUSSO et al 2011 ZAIBI et al
2010)
51
2272 Induccedilatildeo da inflamaccedilatildeo por meio da alteraccedilatildeo da permeabilidade intestinal
As concentraccedilotildees sanguiacuteneas de lipopolissacariacutedeos (LPS) sofrem significativa
influecircncia da microbiota intestinal Principalmente as bacteacuterias Gram-negativas
apresentam em sua superfiacutecie celular os LPS que funcionam como antiacutegenos
estimulando a resposta imune do hospedeiro Assim a microbiota intestinal
representa um grande reservatoacuterio dessa endotoxina especialmente naqueles
indiviacuteduos que habitualmente consomem dieta com alto teor de gorduras
(HOTAMISLIGIL 2010)
A principal via de sinalizaccedilatildeo do LPS envolve o fator nuclear Kappa B (NF-KB)
O LPS pode aumentar os niacuteveis circulantes de resistina espeacutecies reativas de
oxigecircnio (ERO) e proteiacutenas supressoras da sinalizaccedilatildeo de citocinas-1 e 3 (SOCS-1 e
SOCS-3) A elevaccedilatildeo de citocinas proacute-inflamatoacuterias como interferon-gama (IFN-α)
TNF- α interleucina (IL)-6 e IL-1β geralmente observada em pacientes obesos
pode ser originada de macroacutefagos no tecido adiposo ou da interaccedilatildeo do LPS com
seu receptor O aumento dessas citocinas pode contribuir para a translocaccedilatildeo de
LPS favorecendo a ocorrecircncia de endotoxemia metaboacutelica e consequentemente
potencializar a inflamaccedilatildeo subcliacutenica por meio da reduccedilatildeo da expressatildeodistribuiccedilatildeo
de proteiacutenas formadoras de junccedilotildees oclusivas (tight junctions) como zocircnula de
oclusatildeo-1 (ZO-1) e ocludina aumentando a permeabilidade intestinal (CANI et al
2008 LAM et al 2012)
Aleacutem da reduccedilatildeo da expressatildeo das junccedilotildees oclusivas intestinais haacute tambeacutem
uma evidecircncia de que a microbiota intestinal pode regular a permeabilidade
intestinal atraveacutes do sistema endocanabinoacuteide Em um estudo realizado por Muccioli
et al (2010) a modulaccedilatildeo da composiccedilatildeo microbiana do intestino seja por
colonizaccedilatildeo em ratos germ-free ou por tratamento com antibioacuteticos reduziu a
expressatildeo dos receptores canabinoacuteides (Cb-1) tanto do coacutelon quanto do tecido
adiposo enquanto em animais alimentados com uma dieta rica em gordura foi
observado aumento da expressatildeo Cb1 (EVERARD et al 2013 GEURTS et al
2011 MUCCIOLI et al 2010)
52
23 MOLLICUTES
231 Caracteriacutesticas Gerais dos Mollicutes
Os micoplasmas foram primeiramente isolados por Norcard e Roux em 1898
que estudavam a Pleuropneumonia Bovina doenccedila descrita haacute mais de um seacuteculo
na Europa e na Aacutefrica Em seguida micro-organismos semelhantes isolados de
humanos e de animais foram descritos por outros pesquisadores e denominados de
PPLO ndash ldquoPleuropneumonia-Like Organismsrdquo (MOROWITZ 2002 RAZIN JACOBS
1992)
O termo ldquomicoplasmardquo foi usado para denominar os micro-organismos da
Classe Mollicutes (Mollis = mole cuacutetis = pele) mas sugeriu-se o uso do termo
geneacuterico molicutes como nome trivial para designar qualquer microrganismo desta
classe O termo micoplasma aplica-se apenas aos membros do gecircnero Mycoplasma
Recentemente algumas riqueacutetsias e outras bacteacuterias de taxonomia indefinida foram
incluiacutedas aos Mollicutes A classe eacute composta por quatro ordens (Mycoplasmatales
Entomoplasmatales Acholeplasmatales Anaeroplasmatales) sete famiacutelias
(Mycoplasmataceae Incertae sedis (ordem Mycoplasmatales)
Entomoplasmataceae Spiroplasmataceae Acholeplasmataceae Incertae sedis
(ordem Acholeplasmatales) e Anaeroplasmataceae) 11 gecircneros (Mycoplasma
Ureaplasma Eperythozoon Haemobartonella Entomoplasma Mesoplasma
Spiroplasma Acholeplasma Phytoplasma Anaeroplasma Asteroplasma) e mais de
200 espeacutecies A famiacutelia Mycoplasmataceae conteacutem os principais micro-organismos
de interesse meacutedico dentre os quais estatildeo os gecircneros Mycoplasma Os molicutes
compreendem aproximadamente 200 espeacutecies distribuiacutedas ente plantas insetos
animais e humanos (BERGEYrsquos 2010 RAZIN 1992 RAZIN YOGEV NAOT
1998)
Mollicutes eacute a uacutenica classe do filo Tenericutes sendo anteriormente
classificado dentro do filo Firmicutes tendo essa mudanccedila justificada em parte
pela anaacutelise de uma seacuterie de marcadores filogeneacuteticos conservados Esta
classificaccedilatildeo eacute ainda apoiada pela ausecircncia de parede celular caracteriacutestica desses
micro-organismos As sequecircncias do gene 16S rRNA contribuem para sua
classificaccedilatildeo em grupos filogeneacuteticos sendo essa sequecircncia obrigatoacuteria para a
caracterizaccedilatildeo de novas espeacutecies Aleacutem disso a atribuiccedilatildeo de espeacutecie aos grupos eacute
53
feita principalmente por hibridaccedilatildeo DNA-DNA sorologia e semelhanccedila na sequecircncia
do gene 16rRNA Algumas espeacutecies foram atribuiacutedas individualmente a grupos
filogeneacuteticos clusters e subclusters que tambeacutem compartilham outras
caracteriacutesticas (BERGEYrsquos 2009 2010 BROWN WHITCOMB BRADBURY 2007
WEISBURG et al 1989)
A natureza dos molicutes tem representado um desafio na compreensatildeo da
sua biologia classificaccedilatildeo e taxonomia Por muito tempo os micoplasmas foram
considerados viacuterus devido a capacidade de transpor filtros que bloqueavam a
passagem de bacteacuterias (RAZIN 1992) Os membros da classe Mollicutes satildeo
caracterizadas pelo genoma de tamanho reduzido (058 - 22 Mb) ausecircncia de
parede celular (RAZIN 1998) e por apresentarem requerimentos nutricionais
diferenciados quando comparados agrave maioria das bacteacuterias de interesse veterinaacuterio e
humano Aminoaacutecidos nucleotiacutedeos e esteroacuteis exoacutegenos satildeo utilizados para seu
crescimento in vitro O esterol presente no soro ou ceacutelulas do hospedeiro eacute
incorporado pela membrana da maioria das espeacutecies Este composto contribui na
fluidez necessaacuteria agrave membrana e confere resistecircncia parcial agrave lise osmoacutetica
(RUHNKE ROSENDAL 1994)
A membrana dos micoplasmas tem composiccedilatildeo semelhante agraves das eubacteacuterias
e estaacute exposta ao ambiente com exceccedilatildeo de poucas espeacutecies que possuem
glicocaacutelice (WIESLANDER et al 1992) Localizam-se principalmente nas ceacutelulas de
mucosas e com potencial de invasatildeo (VOELKER DYBVIG 1996) As mutaccedilotildees tecircm
sido mencionadas como estrateacutegia de sobrevivecircncia que podem ter ocorrido em
funccedilatildeo da evoluccedilatildeo associada a perdas genocircmicas (DAVID et al 2002)
Natildeo apresentam flagelos entretanto algumas espeacutecies exibem deslizamento
sobre superfiacutecies liacutequidas Alguns micoplasmas possuem um tipo de estrutura ou
prolongamento polar em sua superfiacutecie onde haacute alta concentraccedilatildeo de moleacuteculas de
adesatildeo que permitem a sua aderecircncia agrave ceacutelula hospedeira (RAZIN 1992) Acredita-
se que estas estruturas em algumas espeacutecies como Mycolasma penetrans de
origem humana estejam envolvidas na invasatildeo celular (LO et al 1992)
Os molicutes exibem estrita relaccedilatildeo aos hospedeiros e especificidade a tecidos
e oacutergatildeos que reflete as suas caracteriacutesticas nutricionais e adaptaccedilatildeo parasitaacuteria
Estas bacteacuterias podem ocorrer em hospedeiros e tecidos diferentes de seu ldquohabitatrdquo
normal entretanto como observado por Goulet et al (1995) existem variaccedilotildees e
54
eventualmente eacute possiacutevel isolar espeacutecies de siacutetios e hospedeiros diferentes
daqueles habituais (ERICKSON ROSS BOVE 1988 HORNOK et al 2012 ISO et
al 2013 RAZIN 1992 RAZIN YOGEV NAOT 1998 WAITES et al 1987)
A maioria dos molicutes vivem como comensais e em muitos artroacutepodes
podem mesmo ser considerados simbiontes Infecccedilotildees com micoplasmas
patogecircnicos satildeo raramente agudas e usualmente seguem um curso crocircnico (RAZIN
YOGEV NAOT 1998) Os Mollicutes principalmente as espeacutecies encontradas em
mamiacuteferos apesentam-se como parasitas ideais geralmente vivendo em harmonia
com seu hospedeiro mas por outro lado satildeo tambeacutem considerados como
ldquooportunistas ideaisrdquo Diversas doenccedilas nos seus respectivos hospedeiros satildeo
causadas ou associadas aos Mollicutes (RAZIN YOGEV NAOT 1998) Estas
bacteacuterias parecem preferir estabelecerem-se em nichos com ceacutelulas em constante
renovaccedilatildeo favorecendo a sua adesatildeo (GABRIDGE CHANDLER DANIELS 1985)
Micoplasmas em especial as espeacutecies com os menores genomas tecircm altas
taxas de mutaccedilatildeo o que sugere que eles estatildeo em um estado de evoluccedilatildeo raacutepida
Esses dados foram confirmados por estudos de sequecircncias de genes 5S rRNA que
incluiu uma seacuterie de acholeplasmas anaeroplasmas micoplasmas ureaplasmas e
Clostridium innocuum (BOVEacute 1999 RAZIN 1995 ROGERS et al 1985)
Quanto ao seu metabolismo os Mollicutes podem ser divididos em
fermentadores e natildeo-fermentadores Os fermentadores produzem aacutecidos por meio
da metabolizaccedilatildeo de glicose e de outros carboidratos diminuindo o pH do meio de
cultivo e os natildeo- fermentadores possuem a via da arginina-deidrolase para
obtenccedilatildeo de ATP aumentando o pH (RAZIN 1978 2004) Quando ambas as vias
ocorrem os aacutecidos produzidos da glicoacutelise podem mascarar a alcalinizaccedilatildeo do caldo
causada pela hidroacutelise da arginina (BASEMAN TULLY 1997 OLSON et al 1993
RAZIN 2004)
Um dos maiores empecilhos na pesquisa e no diagnoacutestico laboratorial das
infecccedilotildees causadas por molicutes tem sido a dificuldade em cultivaacute-los in vitro
Apresentam crescimento lento mesmo utilizando-se o meio de cultivo adequado
(RAZIN 1994) A temperatura de aproximadamente 37 ordmC eacute indicativa do ldquohabitatrdquo
natural dos molicutes que corresponde agrave dos mamiacuteferos reacutepteis peixes artroacutepodes
e plantas O crescimento e sobrevivecircncia dos molicutes em meio de cultura satildeo
dependentes do pH Para espeacutecies originaacuterias de plantas e vertebrados o pH oacutetimo
55
eacute de 74 e o crescimento ocorre entre pH 65 a 80 (RAZIN et al 1978) A inibiccedilatildeo
do crescimento pode ocorrer pela excessiva produccedilatildeo de aacutecidos ou aacutelcalis gerados
pelo metabolismo microbiano primaacuterio
Esses micro-organismos apresentam colocircnias de 50 ndash 500 μm de diacircmetro
usualmente em forma de ldquoovo fritordquo quando cultivados em meio soacutelido visualizadas
com o auxiacutelio de microscoacutepio estereoscoacutepio (Figura 4) Em meio liacutequido o
crescimento geralmente natildeo causa turvaccedilatildeo provocando somente alteraccedilatildeo no pH
revelado por um indicador presente no meio de cultura (MILES 1992 RAZIN 1998)
A complexidade dos requerimentos nutricionais a variaccedilatildeo na forma celular e a
fragilidade osmoacutetica fazem com que os Mollicutes estejam sob constantes
investigaccedilotildees quanto a sua fisiologia para relatar seu crescimento e ecologia As
condiccedilotildees sob as quais eles crescem podem influenciar na estrutura e
funcionamento das ceacutelulas hospedeiras sendo importante natildeo somente para os
fisiologistas como tambeacutem para todos micoplasmologistas envolvidos em estudos
quantitativos (BALABANOV et al 2006 MILLES 1992 RAZIN et al 1978
RODWELL 1983 TULLY 1985)
Figura 4 ndash Crescimento de M hominis em meio SP4 com a produccedilatildeo de colocircnia em forma de ldquoovo fritordquo (aumento 40X)
Fonte Arquivo pessoal
56
232 Mollicutes Microbiota Intestinal e Obesidade
A ocorrecircncia e participaccedilatildeo da classe Mollicutes na microbiota intestinal e sua
relaccedilatildeo com a obesidade ainda eacute praticamente desconhecida No entanto
Turnbaugh et al (2008) investigaram a relaccedilatildeo dieta ecologia microbiana intestinal e
o balanccedilo energeacutetico a partir de um modelo murino de obesidade induzido por meio
do consumo de uma dieta ocidental Observou-se que a dieta ocidental estimulou o
crescimento de organismos da classe Mollicutes que posteriormente foram
reduzidos por subsequentes manipulaccedilotildees dieteacuteticas para limitar o ganho de peso
O transplante de microbiota de ratos com obesidade induzida por dieta para
destinataacuterios germ-free promoveu uma maior deposiccedilatildeo de gordura do que em
animais que receberam o transplante a partir de doadores eutroacuteficos Metagenocircmica
e anaacutelises bioquiacutemicas do microbioma intestinal em conjunto com sequenciamento e
reconstruccedilotildees metaboacutelicas associadas ao intestino humano revelaram que a
bacteacuteria Eubacterium dolichum) (um membro da classe Mollicutes) apresenta
caracteriacutesticas que podem fornecer uma vantagem competitiva aos membros desse
ramo em relaccedilatildeo aos nutrientes da dieta ocidental Essas vantagens relacionam-se
com a importaccedilatildeo e transformaccedilatildeo de accediluacutecares simples atraveacutes do Sistema
fosfotransferase (PTS)
Sistemas fosfotransferase (PTS) satildeo uma classe de sistemas de transporte
envolvidas na absorccedilatildeo e na fosforilaccedilatildeo de uma grande variedade de hidratos de
carbono (DEUTSCHER et al 2006) Cada transportador envolve trecircs enzimas de
ligaccedilatildeo que atuam como receptores e doadores de grupos fosforil duas enzimas
citoplasmaacuteticas que atuam em todos os hidratos de carbono PTS importados (HPR e
EI) e o outro eacute um complexo de hidratos de carbono especiacutefico (EII)
compreendendo um ou dois domiacutenios integrais de membrana hidrofoacutebicos (EIIC D)
e dois domiacutenios hidrofiacutelicos (EIIA B) (DEUTSCHER et al 2006) Fosfoenolpiruvato
embora produzidos atraveacutes da glicoacutelise pode ser usado para gerar ATP (atraveacutes da
piruvatoquinase) ou usado para conduzir a importaccedilatildeo de accediluacutecares adicionais
atraveacutes da transferecircncia de um grupo fosfato para EI do PTS
Genes PTS satildeo encontrados em vaacuterias divisotildees de bacteacuterias incluindo
Proteobacterias tais como E coli bem como vaacuterios Firmicutes e Mollicutes
sequenciados (Por exemplo Mycoplasma genitalium M pneumoniae M pulmonis
M penetrans M gallisepticum M mycoides M mobile M hyopneumoniae M
57
synoviae e M capricolum) (KANEHISA et al 2004) O PTS tambeacutem desempenha
um papel na regulaccedilatildeo da expressatildeo do gene microbiano atraveacutes da repressatildeo
cataboacutelica permitindo que a ceacutelula passe a importar preferencialmente accediluacutecares
simples em relaccedilatildeo a outros hidratos de carbono (DEUTSCHER et al 2006)
Muacuteltiplos componentes do PTS estatildeo presentes no microbioma da dieta ocidental (EI
e HPr mais EII) o que poderia permitir a importaccedilatildeo de accediluacutecares simples (por
exemplo glicose e frutose que juntos formam sacarose um componente abundante
da dieta ocidental) bem como accediluacutecares associados com a mucosa do intestino do
hospedeiro (N-acetil-galactosamina) O microbioma da dieta ocidental tambeacutem
conteacutem genes que suportam o metabolismo destes accediluacutecares fosforilados para vaacuterios
produtos finais de fermentaccedilatildeo anaeroacutebia (por exemplo lactato e a cadeia curta de
aacutecidos graxos butirato e acetato (DEUTSCHER et al 2006)
58
3 OBJETIVOS
31 Objetivo geral
Analisar a participaccedilatildeo da Classe Mollicutes e dos Filos Firmicutes e Bacteroidetes
na microbiota intestinal de mulheres obesas e eutroacuteficas
32 Objetivos especiacuteficos
Determinar o estado nutricional das mulheres obesas do grupo caso e
eutroacuteficas do grupo controle
Determinar o consumo alimentar das mulheres obesas do grupo caso e
eutroacuteficas do grupo controle
Desenvolver um ensaio quantitativo por meio de TaqMan PCR para a
detecccedilatildeo de Mollicutes na microbiota intestinal de mulheres obesas e
eutroacuteficas
Quantificar os micro-organismos da Classe Mollicutes e dos Filos Firmicutes e
Bacteroidetes aleacutem de Bacteacuterias Totais por meio da PCR em tempo real em
amostras de fezes de mulheres obesas e eutroacuteficas
Analisar a liberaccedilatildeo de citocinas proacute-inflamatoacuterias IL-1 IL6 IL17-A e TNF-α
em amostras de sangue coletadas de mulheres obesas e eutroacuteficas
59
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
41 Protocolo do estudo
O presente estudo foi desenvolvido no laboratoacuterio de Micoplasmas do
Departamento de Microbiologia do Instituto de Ciecircncias Biomeacutedicas da Universidade
de Satildeo Paulo (ICB IIUSP) com o Ambulatoacuterio de Obesidade e Siacutendrome Metaboacutelica
do Serviccedilo de Endocrinologia do Hospital das Cliacutenicas da Universidade de Satildeo
Paulo (HC-FMUSP) O estudo foi aprovado pela Comissatildeo de Eacutetica em Pesquisa
Envolvendo Seres Humanos (CEPSH) do Instituto de Ciecircncias Biomeacutedicas da
Universidade de Satildeo Paulo (ICBUSP) (protocolo de pesquisa ndeg 110713) e pela
Comissatildeo de Eacutetica da Instituiccedilatildeo HC-FMUSP Todas as mulheres foram recrutadas a
partir da demanda espontacircnea do serviccedilo tendo sido inseridas no protocolo apoacutes
explicaccedilatildeo sucinta e individual do mesmo e assinatura do Termo de Consentimento
Livre e Esclarecido (TCLE) conforme preconiza a resoluccedilatildeo 19606 do Conselho
Nacional de Sauacutede
42 Casuiacutestica
As coletas foram realizadas entre os meses de Outubro de 2013 agrave Dezembro
de 2014 Para obtenccedilatildeo de resultados pela metodologia proposta para este estudo
a casuiacutestica foi de 40 mulheres sendo 20 diagnosticadas com obesidade
apresentando Iacutendice de massa corporal (IMCgt 30 kgm2) e 20 mulheres em eutrofia
(IMC entre 185 e 249 kgm2) As mulheres diagnosticadas com obesidade foram
recrutadas no grupo de Obesidade e Siacutendrome Metaboacutelica do serviccedilo de
Endocrinologia do Hospital das Cliacutenicas da Universidade de Satildeo Paulo (HC-
FMUSP)
Foram utilizados como criteacuterios de exclusatildeo para esse grupo a presenccedila de
quadros infecciosos com sinais cliacutenicos uso de antibioacuteticos (3 meses antes do
estudo) quimioterapia radioterapia gravidez uso de probioacuteticos cirurgias preacutevias
no Trato Gastrointestinal doenccedilas do Trato Gastrointestinal como Doenccedila de Crohn
e Siacutendrome do Coacutelon Irritaacutevel Devido ao fato de haver dificuldade para distinccedilatildeo de
alimentos classificados como prebioacuteticos a ingestatildeo destes natildeo foi incluiacuteda como
criteacuterio de exclusatildeo do estudo O grupo controle foi composto por mulheres adultas
60
eutroacuteficas recrutadas na comunidade sem nenhuma enfermidade aparente tendo
sido fixados os mesmos criteacuterios de exclusatildeo adotados para o grupo controle
43 Delineamento experimental
As mulheres foram submetidas agrave coleta de material fecal e de sangue aleacutem de
questionaacuterio semiestruturado como instrumento de coleta Tal instrumento foi
construiacutedo atraveacutes de consulta em perioacutedicos cientiacuteficos e livros acadecircmicos que
descrevem preditores importantes em relaccedilatildeo a fatores etioloacutegicos predisponentes e
mantedenores da obesidade e possiacutevel associaccedilatildeo com microbiota intestinal e
ambiente Foram consideradas questotildees que avaliavam histoacuteria familiar cliacutenica
obsteacutetrica ginecoloacutegica consumo de aacutelcool e tabaco aleacutem de questotildees que
avaliavam os haacutebitos alimentares como a praacutetica de dietas para emagrecer e
nuacutemero de refeiccedilotildees realizadas Foi utilizado para esse estudo o IPAQ (International
Physical Activity Questionnaire) versatildeo curta originalmente desenvolvido com
finalidade de estimar o niacutevel de praacutetica habitual de atividade fiacutesica de populaccedilotildees de
diferentes paiacuteses (BARROS NAHAS 2000) O questionaacuterio foi elaborado de modo a
facilitar a obtenccedilatildeo de informaccedilotildees durante a consulta com os pacientes e realizadas
por indiviacuteduos previamente instruiacutedos para o desenvolvimento do estudo tendo as
variaacuteveis sido agrupadas em 9 Seccedilotildees que representam a subcategorizaccedilatildeo das
variaacuteveis independentes para determinaccedilatildeo do perfil da populaccedilatildeo estudada (Anexo
B)
44 Determinaccedilatildeo do estado nutricional
441 Avaliaccedilatildeo qualitativa do consumo alimentar
Para investigar possiacuteveis relaccedilotildees entre alimentos e nutrientes da dieta e
microbiota intestinal utilizou-se o questionaacuterio de frequecircncia alimentar semi-quantitativo
(QFA) composto por 62 itens alimentares proposto por Fisberg et al (2008) que
desenvolveram um QFA para utilizaccedilatildeo em estudos epidemioloacutegicos com indiviacuteduos
adultos desenhados para testar hipoacuteteses epidemioloacutegicas e nutricionais em estudos
conduzidos primariamente em Satildeo Paulo para estimar o teor de nutrientes da dieta
61
habitual o que eacute de fundamental importacircncia para estimar a medida de exposiccedilatildeo aos
fatores dieteacuteticos e investigar as possiacuteveis associaccedilotildees com desfechos de interesse
Representou-se a frequecircncia de consumo alimentar em 8 categorias a saber
diaacuterio (mais de trecircs vezes por dia duas a trecircs vezes por dia uma vez por dia) semanal
(cinco a seis vezes por semana duas a quatro vezes por semana uma vez por
semana) mensal (uma a trecircs vezes por mecircs) e nunca ou quase nunca Os dados sobre
o consumo alimentar foram inseridos em planilha eletrocircnica com auxiacutelio do estudo de
Giacomello et al (2008) Inicialmente converteu-se a frequecircncia de consumo de cada
alimento em frequecircncia diaacuteria como proposto por Coelho et al (2011) Para tanto
atribuiu-se ao alimento valor 1 (um) quando consumido 1 vez ao dia Caso o alimento
fosse consumido mais de uma vez ao dia multiplicava-se o valor 1 pelo intervalo da
frequecircncia diaacuteria relatada Para as opccedilotildees que contemplaram intervalos de tempo
semanal e mensal utilizou-se a meacutedia do intervalo das frequecircncias dividido pelo
periacuteodo se semanal (7) e mensal (30) conforme descritos no Quadro 01
Quadro 01ndash Criteacuterios utilizados na estimativa da frequecircncia diaacuteria de consumo dos alimentos incluiacutedos no Questionaacuterio de Frequecircncia Alimentar
Frequecircncia Relatada Frequecircncia diaacuteria
3 ou mais vezesdia 31=3
2 a 3 vezesdia 251= 25
1 vezdia 11= 1
5 a 6 vezessemana 557= 079
2 a 4 vezessemana 37= 043
1vezsemana 17= 014
1 a 3 vezesmecircs 230= 007
1 vezmecircs 130= 003
NuncaQuase nunca 0
COELHO et al 2011
62
Posteriormente foram construiacutedos os grupos dos alimentos segundo o registro do
QFA Adotou-se como criteacuterio para a inclusatildeo do alimento no respectivo grupo o
consumo igual ou maior a 10 e as caracteriacutesticas nutricionais (HAIR et al 2005)
Considerando este criteacuterio foram construiacutedos 16 grupos de alimentos (1) massas (2)
preparaccedilotildees (3) carne vermelha e ovos (4) embutidos (5) carne branca (6) leite e
derivados (7) leguminosas (8) cereais raiacutezes e tubeacuterculos (9) hortaliccedilas (10) frutas
(11) industrializados (12) infusatildeo (13) bebida alcooacutelica (14) oacuteleos e gorduras (15)
lanches (16) accediluacutecares e doces
Os dados referentes ao QFA tambeacutem foram utilizados para calcular o consumo
energeacutetico e de nutrientes Primeiramente estes foram transformados em gramas
utilizando-se uma tabela para avaliaccedilatildeo de consumo alimentar em medidas caseiras
(PINHEIRO et al 2002) e em seguida lanccedilados no Software Excel para digitaccedilatildeo dos
dados do consumo alimentar e para o caacutelculo de consumo de macro e micronutrientes
Para preencher o banco de dados do Software com alimentos e preparaccedilotildees
consumidas pelas participantes foram utilizadas as Tabelas de composiccedilatildeo de
alimentos PHILIPPI (2002) e TACO (2006) com a Tabela de medidas caseiras
(PINHEIRO et al 2005) aleacutem de dados adicionais de Composiccedilatildeo quiacutemica de alimentos
compilados da Tabela de Composiccedilatildeo de Alimentos da Fundaccedilatildeo Instituto brasileiro de
Geografia e Estatiacutestica (IBGE) Os valores obtidos foram comparados com os valores de
recomendaccedilatildeo propostos pelo United States Departament of Agriculture (USDA) em
seus documentos Dietary References Intakes (DRI) referentes aos valores de Estimated
Average Requirements (EAR) e para os nutrientes que ainda natildeo possuem esse valor
definido utilizou-se como paracircmetro valores de Adequate Intake (AI)
442 Avaliaccedilatildeo antropomeacutetrica do estado nutricional
A mensuraccedilatildeo do peso corporal em quilogramas (kg) foi realizada em
duplicata considerando-se o peso meacutedio Para tal foi utilizada uma balanccedila digital
Filizolareg com capacidade maacutexima para 150 kg e precisatildeo de 100 g estando as
participantes da pesquisa descalccedilas e com roupas leves A estatura em centiacutemetros
(cm) foi realizada em duplicata considerando-se a estatura meacutedia As medidas
foram determinadas por meio de um estadiocircmetro graduado em centiacutemetros com
precisatildeo de 10 mm apresentando barra de madeira vertical e fixa com esquadro
moacutevel para posicionamento sobre a cabeccedila do indiviacuteduo quando os mesmos
63
estavam descalccedilos em posiccedilatildeo ereta com os peacutes paralelos calcanhares
panturrilhas gluacuteteos ombros e cabeccedila encostados no estadiocircmetro olhando-se
para frente
O Iacutendice de Massa Corpoacuterea (IMC) foi calculado pelo peso e estatura a partir
das quais foi determinada a relaccedilatildeo entre o peso e altura em metros ao quadrado e
avaliado segundo os pontos de corte preconizados pela OMS assim designados
baixo peso (IMC lt 185 Kgaltura2) eutrofia (IMC= 185 a 249 kgaltura2) sobrepeso
(IMC= 25 a 299 Kgaltura2) e obesidade (IMC gt30 Kg altura2) (WHO 1998)
4421 Anaacutelise da Composiccedilatildeo Corporal pelo Meacutetodo de Bioimpedacircncia
O aparelho de bioimpedacircncia eleacutetrica utilizado para a avaliaccedilatildeo da composiccedilatildeo
corporal foi o InBody 720 (Biospace Coreia) que consiste em bioimpedacircncia
octopolar atraveacutes de oito pontos de contato pelos quais passa a corrente eleacutetrica na
extremidade dos quatro membros determinando a porcentagem de gordura e massa
magra em cada membro assim como no tronco
A avaliaccedilatildeo foi realizada respeitando os procedimentos apresentados no
respectivo manual de uso do aparelho atendendo as seguintes condiccedilotildees de preacute-
teste (1) estar em jejum (2) natildeo consumir aacutelcool 48 horas antes do teste (3) natildeo
realizar exerciacutecio de intensidade moderada a elevada nas 12 horas antes da
avaliaccedilatildeo (4) natildeo efetuar o exame perante em estado febril ou de desidrataccedilatildeo (5)
natildeo utilizar bijuterias metaacutelicas ou implantes dentaacuterios com metal (6) natildeo ingerir cafeacute
e (7) realizar a avaliaccedilatildeo com roupa de banho ou roupas iacutentimas
O relatoacuterio da bioimpedacircncia Octopolar eacute dividido em quatro partes
informativas de dados obtidos
1 Anaacutelise da Composiccedilatildeo Corporal identifica como estaacute distribuiacuteda a aacutegua
corporal total percentual de massa magra e massa de gordura livre
2 Anaacutelise Muacutesculo-gordura mostra em kg o peso a massa de muacutesculo
esqueleacutetico e a massa de gordura
3 Diagnoacutestico da obesidade discrimina o IMC PGC (porcentagem de
gordura corporal) e RCQ (relaccedilatildeo cintura-quadril)
4 Aacuterea de Gordura Visceral informa a aacuterea de gordura visceral em cm2
64
45 Coleta das amostras cliacutenicas
Para a obtenccedilatildeo das amostras de fezes as mulheres foram previamente
instruiacutedas de acordo com o National Committee for Clinical Laboratory Standards
NCCCLS (2007) evacuando diretamente no coletor plaacutestico esteacuteril fornecido
juntamente com luvas espaacutetula coletora e etiqueta de identificaccedilatildeo O material foi
acondicionado em caixa isoteacutermica resfriada com gelo e transportado
imediatamente ao Laboratoacuterio de Micoplasmas ICBUSP As amostras de fezes
foram distribuiacutedas em aliquotas (180-200 ug) em microtubos e acondicionadas -80oC
ateacute a anaacutelise laboratorial
Para a realizaccedilatildeo da coleta do material sanguiacuteneo o operador munido de EPIs
realizou punccedilatildeo venosa perifeacuterica preferencialmente em membro superior natildeo
dominante Foram coletados cerca de 5 mL de sangue por tubopaciente tendo sido
utilizados tubos natildeo-heparinizados que foram conservados de forma similar aos
coletores em caixa isoteacutermica refrigerada O material obtido foi levado ateacute o
Laboratoacuterio de Micoplasmas ICBUSP onde as amostras foram centrifugadas a
3500 rpm para obtenccedilatildeo do soro seguido de sua distribuiccedilatildeo em aliacutequotas de cerca
de 1 mL e estocados a -80 degC ateacute o uso
65
46 Determinaccedilatildeo da microbiota intestinal
461 Padronizaccedilatildeo de reaccedilatildeo de PCR quantitativo (qPCR) por meio de TaqMan para a detecccedilatildeo de Mollicutes
4611 Cepas bacterianas e condiccedilotildees de cultura
Como controle positivo utilizou-se a cepa ATCC 23114 (PG-21) de M hominis
Tambeacutem foram utilizados como controle os seguintes micro-organismos obtidos da
coleccedilatildeo do Laboratoacuterio de Micoplasmas ICBUSP Mycoplasma bovis Donetta M
arginini G230 M dispar M2979 M pneumoniae M pulmonis PG34 M
gallisepticum PG31 M synoviae WUU1853 M penetrans ATCC 55252 (GTU 54)
M fermentans PG18 M pulmonis PG34 M hyorhinis M genitalium ATCC 33530
(G37) M buccale M edwardii PG24 M gateae M faucium M felis CO M bovis
Spiroplasma mirum (SMCA) Acholeplasma laidlawii PG38 Ureaplasma diversum
ATCC 449782 U urealyticum T960 Escherichia coli ATCC 25922 Klebsiella
pneumoniae ATCC 13883 Streptococcus pyogenes ATCC 12345 Salmonella
typhimurium C5 CIP Pseudomonas aeruginosa ATCC 10145 Staphylococcus
aureus ATCC 25293 e Bacillus cereus As cepas referentes aos micro-organismos
Bacteroides fragilis C45A AUS 00306 e Clostridium perfringens foram cedidas pelo
Professor Dr Jorge Luiz Melo Sampaio pesquisador associado do Instituto Fleury
As espeacutecies de Ureaplasmas foram cultivadas em meio UB especiacutefico para
ureaplasma com 5 de CMRL-1066 (com glutamina e sem bicarbonato) enquanto
as espeacutecies de Micoplasmas foram cultivadas em meio de cultura SP4 como
descrito por Tully et al (1995) As bacteacuterias com parede celular incluiacutedas como
controles foram cultivadas em meio de infusatildeo de ceacuterebro-coraccedilatildeo (BHI) Destas
cepas o DNA foi extraiacutedo a partir de culturas em fase logariacutetmica por meio do kit
Pure Linktrade Genomic DNA da Invitrogenreg
4612 Desenvolvimento de primers e sonda para a detecccedilatildeo de Mollicutes pela PCR quantitativa
Os oligonucleotiacutedeos iniciadores e as sondas foram selecionadas com base no
fragmento conservado do gene 16S rRNA especiacutefico para a classe Mollicutes As
sequecircncias do gene 16S rRNA de micoplasmas foram alinhadas utilizando o
algoritmo ClustalW do Software MEGA4 As regiotildees variaacuteveis foram selecionadas
66
manualmente para o sequencionamento dos iniciadores e sondas utilizadas neste
ensaio Propriedades dos oligonucleotiacutedeos foram tambeacutem analisadas pelo Software
Primer Express ver 30 (Applied Biosystems Life Technologies Corporation
Carlsbad CA EUA) A especificidade dos iniciadores e da sonda foi testada ldquoin
silicordquo utilizando algoritmos BLAST
O quadro 02 mostra as sequecircncias forward e reverse selecionadas para
amplificar um fragmento conservado do gene 16S rRNA especiacutefico de Mollicutes A
sonda TaqMan especiacutefica para o fragmento amplificado foi desenvolvida por uma
fonte comercial (Applied Biosystems Life Technologies Corporation)
Quadro 2 - Sequecircncias dos iniciadores utilizados para amplificaccedilatildeo do gene 16S rRNA para Mollicutes
Iniciadores Sequecircncia
Molli1 5 GCA TTA GAT GAT CCG CCT GAG T 3
Molli2 5 GTC CCC GTC AAT TCC TTT AAG TT 3
Sonda 5 GTC CCC GTC AAT TCC TTT AAG TT 3
4613 PCR quantitativa
Ensaios de quantificaccedilatildeo absoluta do DNA alvo foram realizados com sistema
de PCR em tempo real (qPCR) StepOne (Applied Biosystems Life Technologies
Corporation) Diferentes concentraccedilotildees de cada primer iniciador e sonda foram
testados para aprimorar a reaccedilatildeo de qPCR Considerou-se ideal as seguintes
caracteriacutesticas r2 ge 0950 eficiecircncia entre 95 a 105 e slope proacuteximo de -332
A melhor reaccedilatildeo obtida foi a partir de 625 microl de Universal PCR Master Mix
(Applied Biosystems) 1 microM de cada iniciador 05 microM de sonda TaqMan MGB
marcada com corante fluorescente 25 microl de DNA extraiacutedo e aacutegua sem RNase para
o volume final de 125 microl As condiccedilotildees de amplificaccedilatildeo foram 50 degC por 10 min 95
degC por 10 min e 45 ciclos de desnaturaccedilatildeo a 95 degC durante 15 s anelamento a 59
degC durante 1 min Todas as reaccedilotildees foram realizadas em duplicata no aparelho
PCR em tempo real StepOnePlus (Applied Biosystems)
67
Para a construccedilatildeo de padrotildees de DNA para a quantificaccedilatildeo absoluta utilizou-
se como controle positivo a cepa de referecircncia ndash M hominis ATCC 23114 (PG-21)
que foi inicialmente cultivada em 1 ml de caldo SP4 a 37 degC e expandidos ateacute 100
ml Na fase de crescimento logariacutetmico (com base em alteraccedilotildees colorimeacutetricas) a
cultura foi centrifugada a 20600 rpm durante 30 minutos a 25 degC O DNA foi extraiacutedo
usando o kit PureLinktrade Genomic DNA Mini O nuacutemero de coacutepias de DNA genocircmico
foi calculado por espectrofotometria (NanoDrop ND -1000 WITec Ag Littau Suiacuteccedila)
Diluiccedilotildees decimais (107- 1 coacutepiasl) do DNA de M hominis para curva padratildeo foram
preparadas e analisadas
Os dados foram obtidos durante a etapa de anelamento e analisados pelo
Software StepOne 21 (Applied Biosystems Life Technologies Corporation) O limiar
foi ajustado manualmente dentro da curva logariacutetmica acima do niacutevel de detecccedilatildeo
basal e abaixo da fase linear e do platocirc O ciclo limiar (Ct-threshold cycle) das
diluiccedilotildees do genoma foi plotado contra o nuacutemero de log de coacutepias do genoma e
utilizado como entrada para criar a curva padratildeo Anaacutelises de regressatildeo linear foram
aplicadas para calcular os valores de r2 e do slope Assumindo a eficiecircncia de 100
se o molde de DNA eacute duplicado em cada ciclo a eficiecircncia da PCR foi calculada
como E= 10 (-1slope) - 1 onde E eacute a eficiecircncia da PCR
4614 Especificidade da qPCR e repetibilidade intra e inter-ensaios
O DNA dos micro-organismos utilizados como controles foi testado para
verificar a especificidade dos ensaios de qPCR (descrito em cepas bacterianas) A
repetibilidade intra-ensaio foi determinada executando cinco repeticcedilotildees das diluiccedilotildees
do genoma de M hominis (107 a 1 coacutepia do genoma bacterianoreaccedilatildeo) na mesma
reaccedilatildeo A curva padratildeo foi gerada utilizando o software StepOne 21 (Applied
Biosystems Life Technologies Corporation) A repetibilidade inter-ensaio foi obtida
por reaccedilotildees em triplicatas com a mesma diluiccedilatildeo do genoma em trecircs ensaios
diferentes em dias separados e consecutivos Estas repeticcedilotildees foram aplicadas
para determinar a meacutedia o desvio padratildeo e o coeficiente de variaccedilatildeo em valores de
Ct para cada diluiccedilatildeo do genoma
68
462 Reaccedilatildeo em cadeia da polimerase (PCR) convencional
As amostras cliacutenicas tambeacutem foram submetidas a PCR convencional para a
detecccedilatildeo da Classe Mollicutes utilizando-se dos os iniciadores descritos por Van
Kuppeveld et al (1992) Aacutegua livre de nuclease foi utilizada como controle negativo
em ambos os ensaios Os produtos amplificados foram analisados em gel de
agarose a 15 com brometo de etiacutedio 05 mmmL e tampatildeo TAE (Trisacetate 40
mM EDTA 2 mM pH 80) Os produtos foram visualizados e foto documentados sob
luz ultravioleta utilizando um sistema foto documentador (Vilber Lourmat Marne-la-
Vallee Franccedila)
463 Detecccedilatildeo de micro-organismos dos filos Firmicutes e Bacteroidetes e bacteacuterias totais (Eubacterias) por PCR em tempo Real (qPCR)
Para a construccedilatildeo de padrotildees de DNA para a quantificaccedilatildeo absoluta de
Firmicutes e Bacteroidetes utilizou-se como controles positivos as cepas de
referecircncias ndash Clostridium perfringens e Bacteroides fragilis respectivamente Para a
quantificaccedilatildeo de Bacteacuterias Totais (Eubacteacuterias) foi utilizado como controle positivo
Clostridium perfringens Os controles foram submetidos agrave extraccedilatildeo de DNA por meio
do kit QIAamp DNA stool ndash QIAGEN baseado no protocolo de extraccedilatildeo sugerido
pelo fabricante Para os filos Firmicutes Bacteroidetes assim como Bacteacuterias totais
foram utilizadas sequencias de iniciadores descritos por Guo et al (2008)
apresentadas no quadro 3
69
Quadro 3 ndash Sequecircncias dos iniciadores utilizados para amplificaccedilatildeo do gene 16S rRNA para Firmicutes Bacteroidetes e Bacteacuterias Totais (Eubacteacuterias)
Iniciadores Sequecircncia Referecircncia
Firm934F 5 GGA GYA TGT GGT TTA ATT CGA AGC A 3 GUO et al 2008
Firm1060R 5 AGC TGA CGA CAA CCA TGC AC 3
Bact934F 5 GGA RCA TGT GGT TTA ATT CGA TGA T 3 GUO et al 2008
Bact1060R 5 AGC TGA CGA CAA CCA TGC AG 3
Eub338F 5 ACT CCT ACG GGA GGC AGC AG 3 FIERER et al 2005
Eub518R 5 ATT ACC GCG GCT GCT GG 3
Os micro-organismos foram quantificados de modo absoluto baseando-se em
curva padratildeo previamente estabelecida Para cada reaccedilatildeo finalizada uma nova
curva padratildeo foi adicionada e paracircmetros de qualidade foram adotados na anaacutelise
sendo estes r2 ge 0950 eficiecircncia da reaccedilatildeo variando de 95 a 105 e slope
proacuteximo de -332
As reaccedilotildees de qPCR foram realizadas em volume final de 125 μL com 625
μL da mistura universal SYBR Green (Applied Biosystems Satildeo Paulo SP Brasil)
0 25 μM de cada primer especiacutefico 45μL de aacutegua e 125 μl de DNA extraiacutedo com
volume final de 125 μL As quantificaccedilotildees foram realizadas utilizando-se a
plataforma Applied Biosystems (Life Technologies Corporation) com os seguintes
paracircmetros 50 degC por 10 minutos 95 degC por 10 minutos seguidos de 45 ciclos de
95 degC por 15 segundos e 60degC por 1 minuto seguidas da curva de melting (15
segundos a 95 degC 1 minuto a 60 degC 15 segundos a 95 degC e 15 segundos e 60 degC)
47 Dosagem de citocinas do soro sanguiacuteneo
A dosagem das citocinas IL-1β TNF-α IL-10 e IL17-A foram realizadas
utilizando-se kit de ELISA de captura (eBioscience San Diego C A Estados
Unidos) em placas de poliestireno com 96 orifiacutecios e alta absorccedilatildeo de acordo com
protocolo indicado pelo fabricante Apoacutes padronizaccedilatildeo da curva padratildeo a aliacutequota
de 100 microL do sobrenadante das ceacutelulas foi utilizada para dosar as citocinas IL-1β
TNF-α IL-10 e IL17-A A leitura foi realizada com instrumento leitor de ELISA Vivid
70
Vision com comprimento de onda de 450 nm Os dados obtidos em absorbacircncia
foram transformados em picomols por meio de foacutermula matemaacutetica
48 Anaacutelises Estatiacutesticas
As anaacutelises estatiacutesticas da presenccedila dos microrganismos da classe Mollicutes
detectados nas amostras cliacutenicas e dos dados obtidos dos questionaacuterios foram
avaliados por meio do software SPSS 200 (SPSSreg Inc Chicago Estados Unidos)
Para comparar variaacuteveis de consumo alimentar e as variaacuteveis relacionadas ao perfil
da populaccedilatildeo estudada entre os grupos caso e controle foi aplicado Teste de qui-
quadrado de Pearson ou Teste Exato de Fisher tendo sido considerado plt005 e IC
95 O teste t que compara meacutedia entre grupos foi utilizado para verificar a
existecircncia de associaccedilatildeo entre as variaacuteveis desfecho (mulheres obesas x mulheres
eutroacuteficas) e as variaacuteveis Mollicutes (presenccedila x ausecircncia) com o consumo
alimentar dos macronutrientes carboidratos proteiacutenas lipiacutedeos e fibras (p le 005)
Unidos) Aleacutem disso para verificaccedilatildeo de associaccedilatildeo entre as variaacuteveis desfecho e a
presenccedila de Mollicutes foi aplicado Teste de qui-quadrado de Pearson ou Teste
Exato de Fisher tendo sido calculada a razatildeo de chances (odds ratio) (IC 95)
com o objetivo de verificar o poder da associaccedilatildeo entre as variaacuteveis supracitadas
Para verificar as distribuiccedilotildees de cargas dos micro-organismos estudados em
ambos os grupos avaliados inicialmente foi utilizado o teste de normalidade de
Shapiro-Wilk que demonstrou natildeo satisfazer a preacute-suposiccedilatildeo para utilizaccedilatildeo de um
teste parameacutetrico A partir desse resultado foi utilizado o teste natildeo-parameacutetrico de
Mann-Whitney amplamente utilizado para amostras pareadas que natildeo seguem
distribuiccedilatildeo normal As anaacutelises foram realizadas utilizando o programa estatiacutestico
GraphPad Prism versatildeo 500 (GraphPad Software San Diego California USA)
sendo estabelecida a existecircncia de significacircncia estatiacutestica quando o valor de p le
005 em todas as anaacutelises
Para anaacutelise dos dados de quantificaccedilatildeo das citocinas tambeacutem foi utilizado o
programa GraphPad Prism versatildeo 500 (GraphPad Software San Diego California
USA) tendo sido realizado o teste natildeo-parameacutetrico de Mann-Whitney
71
5 RESULTADOS
51 Perfil da populaccedilatildeo estudada
A amostragem do estudo envolveu 40 mulheres sendo 20 classificadas com
obesidade (IMC gt30 Kgm2) e 20 em eutrofia (IMC 185 - 249 Kgm2) com meacutedia de
idade de 38 anos para todas as mulheres 44 anos (DP 93 Amplitude 28-57) para
as mulheres obesas do grupo caso e 33 anos (DP 1204 Amplitude22-66) para as
mulheres eutroacuteficas do grupo controle
No presente estudo as variaacuteveis foram agrupadas em 9 Seccedilotildees com
resultados descritivos representados nas tabelas de 1 a 9 que representam a
subcategorizaccedilatildeo das variaacuteveis independentes para determinaccedilatildeo do perfil da
populaccedilatildeo estudada
O grupo das mulheres obesas foi caracterizado pela maioria de cor preta
parda ou indiacutegena (70) onde as moleacutestias atuais associadas mais frequentes
foram hipertensatildeo (30) dispneia (35) constipaccedilatildeo (35) refluxo (35) e
alteraccedilatildeo menstrual (55) A maioria das mulheres nasceram de parto normal
(75) foram amamentadas (90) jaacute tiveram filhos (70) e foram classificadas
como fisicamente ativas (60) Aleacutem disso 13 (65) das mulheres do grupo caso
referiram fazer trecircs ou mais refeiccedilotildees por dia Em relaccedilatildeo ao grupo das mulheres
eutroacuteficas esse foi caracterizado pela maioria de cor branca ou amarela (55) onde
as moleacutestias atuais associadas mais frequentes foram hipercolesterolemia (5)
dispneia (5) gastrite (15) e constipaccedilatildeo (20) Metade das mulheres nasceram
de parto normal (50) e foram amamentadas (85) enquanto 2 (10) tiveram
filhos e 9 (55) foram classificadas como fisicamente ativas Assim como o grupo
caso 13 (65) das mulheres do grupo controle referiram fracionar sua refeiccedilatildeo em
trecircs ou mais por dia
Aleacutem disso observa-se com base nos resultados estatiacutesticos que houve
variaccedilatildeo significativa na comparaccedilatildeo das variaacuteveis relacionadas ao perfil da
populaccedilatildeo estudada Em relaccedilatildeo agrave Seccedilatildeo 1 Histoacuteria Cliacutenica foram encontradas
variaccedilotildees significativas para as variaacuteveis associadas ao trato gastrintestinal
flatulecircncia (p=0008) refluxo (p=0018) azia (p=0008) e para as variaacuteveis
associadas agrave Moleacutestia atual hipertensatildeo (p=0008) dispneacuteia (p=0008) e alteraccedilatildeo
menstrual (p=0000) Em relaccedilatildeo agrave Seccedilatildeo 4 Histoacuteria Obsteacutetrica foi encontrada
72
variaccedilatildeo significativa para a variaacutevel gestaccedilatildeo (p=0000) Para a Seccedilatildeo 5 Histoacuteria
ginecoloacutegica observou-se variaccedilatildeo estatiacutestica para a variaacutevel menopausa (p=0038)
Tabela 1 ndash Determinaccedilatildeo do perfil da populaccedilatildeo estudada referente agrave Seccedilatildeo 1 Dados socioeconocircmicos Satildeo Paulo SP 2013-2014
Nota n= 20 mulheresa ndash Considerou-se como valor de Salaacuterio Miacutenimo (R$ 67800) ndash Significacircncia estatiacutestica quando p-valor le 005
Tabela 2 ndash Determinaccedilatildeo do perfil da populaccedilatildeo estudada referente agrave Seccedilatildeo 2 Histoacuteria Familiar Satildeo Paulo SP 2013-2014
Nota n= 20 mulheres a ndash Referente agrave parentes de primeiro grau paternos e maternos aleacutem de irmatildeos ndash Significacircncia estatiacutestica quando p-valor le 005
Variaacuteveis
Grupo Caso n ()
Grupo Controle n ()
IC 95 P
Raccedilacor
009-128 0110 PretaPardaIndiacutegena BrancaAmarela
14 (70) 6 (30)
9 (45) 11 (55)
Escolaridade
096-128 0147 lt Ensino Meacutedio ge Ensino Meacutedio
1 (5) 19(95)
0 (0) 20 (100)
Relaccedilatildeo Estaacutevel
023-283 0752 Sim Natildeo
11 (55) 9 (45)
10 (50) 10 (50)
Renda familiar
010-155 0185 lt 2 salaacuterios miacutenimosa ge 2 salaacuterios miacutenimosa
9 (45) 11 (55)
5 (25) 15 (75 )
Variaacuteveis
Grupo Caso n ()
Grupo Controle n ()
IC 95 P
Famiacutelia hipertensatildeo
006-120 0077 Sim Natildeo
17 (85) 3 (15)
12 (60) 8 (40)
Famiacutelia diabetesa
013-157 0206 Sim Natildeo
12 (60) 8 (40)
8 (40) 12 (60)
Famiacutelia obesidadea
007-106 0058 Sim Natildeo
13 (65) 7(35)
7 (35) 13 (65)
Famiacutelia hipercolesterolemiaa
035-430 0749 Sim Natildeo
11 (55) 9 (45)
12 (60) 8 (40)
Famiacutelia Doenccedilas Caacuterdio-vasculares (DCV)a
029-345 1000 Sim Natildeo
10 (50) 10 (50)
10 (50) 10 (50)
73
Tabela 3 ndash Determinaccedilatildeo do perfil da populaccedilatildeo estudada referente agrave Seccedilatildeo 3 Histoacuteria Cliacutenica Satildeo Paulo SP 2013-2014
Nota n=20 mulheres a- Histoacuterico cliacutenico das pacientes em relaccedilatildeo agrave alteraccedilotildees gastrintestinais moleacutestia atual e uso de laxantes- Diferenccedila estatiacutestica natildeo computada pois a variaacutevel eacute uma constante
Variaacuteveis
Grupo Caso n ()
Grupo Controle n ()
IC 95 P
TGI constipaccedilatildeoa
003-115 0058 Sim Natildeo
7 (35) 13 (65)
2 (10) 18 (90)
TGI flatulecircnciaa
107-190 0008 Sim Natildeo
6 (30) 14 (70)
0 (0) 20 (100)
TGI refluxoa
001-089 0018 Sim Natildeo
7 (35) 13 (65)
1 (5) 19 (95)
TGI aziaa
107-190 0008 Sim Natildeo
6 (30) 14 (70)
0 (0) 20 (100)
TGI uacutelceraa
095-116 0311 Sim Natildeo
1 (5) 19 (95)
0 00) 20 (100)
TGI gastritea Sim Natildeo
2 (10)
18 (90)
3 (15)
17 (85) 023-107 0633
TGI naacuteuseasa Sim Natildeo
3 (15)
17(85)
1 (5)
19 (95) 002-314 0292
TGI vocircmitosa Sim Natildeo
1 (5)
19 (95)
0 (0)
20 (100) 095-116 0311
TGI diarreacuteiaa Sim Natildeo
0 (0)
20(100)
0 (0)
20 (100)
Moleacutestia atual hipertensatildeoa Sim Natildeo
6 (30)
14 (70)
0 (0)
20 (100) 107-190 0008
Moleacutestia atual diabetesa Sim Natildeo
0 (0)
20 (100)
0 (0)
20 (100)
Moleacutestia atual hipercolesterolemiaa Sim Natildeo
5 (25)
15 (75)
1 (5)
19 (95) 001-150 0077
Moleacutestia atual DCVa Sim Natildeo
2 (10)
18 (90)
0 (0)
20 (100) 096-128 0147
Moleacutestia atual Dispneacuteiaa Sim Natildeo
7 (35)
13 (65)
1 (5)
19 (95) 001-089 0018
Moleacutestia atual alteraccedilatildeo menstruala Sim Natildeo
11 (55)
9 (45)
0 (0)
20 (100) 136-360 0000
Uso de laxantesa Sim Natildeo
3 (15)
17 (85)
0 (0)
20 (100) 097-141 0072
74
Tabela 4 ndash Determinaccedilatildeo do perfil da populaccedilatildeo estudada referente agrave Seccedilatildeo 4 Histoacuteria Obsteacutetrica Satildeo Paulo SP 2013-2014
Nota n= 20 mulheres andash Foram considerados aspectos relacionados as pacientes em seu nascimento e na maternidade ndash Significacircncia estatiacutestica quando p-valor le 005
Variaacuteveis
Grupo Caso n ()
Grupo controle n ()
IC 95 P
Nascimento por parto cesaacutereaa
078-1144 0102 Sim Natildeo
5 (25) 15(75)
10 (50) 10 (50)
Nascimento por parto normala
008-127 0102 Sim Natildeo
15 (75) 5 (25)
10 (50) 10 (50)
Foi amamentadaa
009-424 0633 Sim Natildeo
18 (90) 2 (30)
17 (85) 3 (15)
Teve alguma gestaccedilatildeoa
0008-0273 0000 Sim Natildeo
14 (70) 6 (30)
2 (10) 18 (90)
Sofreu algum abortoa Sim Natildeo
2 (10)
18 (90)
2 (10)
18 (90) 096-128 0147
75
Tabela 5 ndash Determinaccedilatildeo do perfil da populaccedilatildeo estudada referente agrave Seccedilatildeo 5 Histoacuteria Ginecoloacutegica Satildeo Paulo SP 2013-2014
Nota n= 20 mulheres andash Idade meacutedia em que todas as mulheres estudadas comeccedilaram a ingerir
contraceptivo 22 anos ndash Significacircncia estatiacutestica quando p-valor le 0005
Tabela 6 ndash Determinaccedilatildeo do perfil da populaccedilatildeo estudada referente agrave Seccedilatildeo 6 Consumo atual de tabaco Satildeo Paulo SP 2013-2014
Nota n= 20 mulheres ndash Significacircncia estatiacutestica quando p-valor le 005
Variaacuteveis
Grupo Caso n ()
Grupo Controle n ()
IC 95 P
Menopausa
004-097 0038 Sim Natildeo
9 (45) 11(55)
3 (15) 17 (85)
Usou ou estaacute usando contraceptivo
021-470 1000 Sim Natildeo
16 (80) 4 (20)
16 (80) 14 (20)
Contraceptivo hormonal
041-633 0490 Sim Natildeo
13 (65) 7 (35)
15 (75) 5 (25)
Contraceptivo natildeo hormonal
002-314 0292 Sim Natildeo
3 (15) 17(85)
1 (5) 19 (95)
Idade que comeccedilou a ingerir ge 22 anosa
011-156 0197 Sim Natildeo
10 (50) 10 (50)
6 (30) 14 (70)
Idade que comeccedilou a ingerir lt 22 anosa Sim Natildeo
2 (10)
18 (90)
2 (10)
18 (90) 063-853 0197
Variaacuteveis
Grupo Caso n ()
Grupo Controle n ()
IC 95 P
Consumo atual de tabaco
002-207 0151 Sim Natildeo
4 (20) 16 (80)
1 (5) 19 (95)
Jaacute consumiu tabaco
023-418 1000 Sim Natildeo
5 (25) 15 (75)
5 (25) 15 (75)
76
Tabela 7 ndash Determinaccedilatildeo do perfil da populaccedilatildeo estudada referente agrave Seccedilatildeo 7 Consumo atual de aacutelcool Satildeo Paulo SP 2013-2014
Nota n= 20 mulheres ndash Significacircncia estatiacutestica quando p-valor le 005
Tabela 8 ndash Tabela de determinaccedilatildeo do perfil da populaccedilatildeo estudada referente agrave Seccedilatildeo 8 Atividade Fiacutesica (IPAQ versatildeo curta) Satildeo Paulo SP 2013-2014
Nota n= 20 mulheres andash Para a classificaccedilatildeo foi utilizado o IPAQ (International Physical Activity Questionnaire) versatildeo curta Irregularmente ativa Irregularmente ativa A e B ndash Significacircncia estatiacutestica quando p-valor le 005
Variaacuteveis
Grupo Caso n ()
Grupo Controle n ()
IC 95 P
Consumo atual de aacutelcool
052-643 0342 Sim Natildeo
8 (40) 12 (60)
11 (55) 9 (45)
Variaacuteveis
Grupo Caso n ()
Grupo Controle
IC 95 P
Niacutevel de atividade fiacutesica
015-191 0342 Ativaa Irregularmente ativaa
12 (60) 8 (40)
9 (45) 11 (55)
77
Tabela 9 ndash Tabela de determinaccedilatildeo do perfil da populaccedilatildeo estudada referente agrave Seccedilatildeo 9 Mudanccedilas recentes nos haacutebitos alimentares Satildeo Paulo SP 2013-2014
Nota n= 20 mulheres andash Meacutedia de refeiccedilotildees diaacuterias 3 refeiccedilotildees - Diferenccedila estatiacutestica natildeo
computada pois a variaacutevel eacute uma constante ndash Significacircncia estatiacutestica quando p-valor le 005
Variaacuteveis
Grupo Caso n ()
Grupo Controle
n ()
IC 95 P
Mudou haacutebitos alimentares recentemente
007-151 0144 Sim Natildeo
7 (35) 13 (65)
3 (15) 17 (85)
Mudou haacutebitos alimentares recentemente para perda de peso
007-151 0144 Sim Natildeo
7 (35) 13 (65)
3 (15) 17 (85)
Mudou haacutebitos alimentares recentemente para dieta vegetariana ou restriccedilatildeo de consumo carne
Sim Natildeo
0(0) 20(100)
0(0) 20(100)
Mudou haacutebitos alimentares recentemente restriccedilatildeo de consumo sal
Sim Natildeo
0(0) 20(100)
0(0) 20(100)
Mudou haacutebitos alimentares recentemente para reduccedilatildeo do colesterol
Sim Natildeo
0(0) 20(100)
0(0) 20(100)
ge refeiccedilotildeesdiaa
Sim Natildeo
13(65) 7(35)
14(70) 6(30)
033-473 0736
lt refeiccedilotildeesdiaa
Sim Natildeo
7(35)
13(65) 7(35)
13(65) 027-366 1000
Desjejum diariamente
051-900 0288 Sim Natildeo
13 (35) 7(65)
16 (80) 4 (20)
Costuma beliscar entre as refeiccedilotildees
035-430 0749 Sim Natildeo
11 (55) 9 (45)
12 (60) 8 (40)
Costuma ingerir liacutequidos durante as refeiccedilotildees
009-154 0168 Sim Natildeo
16 (80) 4 (20)
12 (60) 8 (40)
Costuma fazer refeiccedilotildees fora de casa
112-933 0018 Sim Natildeo
12 (60) 8 (40)
19 (95) 1 (5)
78
52 Determinaccedilatildeo do estado nutricional
521 Avaliaccedilatildeo qualitativa do consumo alimentar
Na Tabela 10 (apecircndice) encontra-se a participaccedilatildeo dos alimentos nos grupos
e meacutedias de consumo diaacuterio dos alimentos pela populaccedilatildeo estudada Os alimentos
mais consumidos e que apresentaram frequecircncia diaacuteria de uma vez ao dia ou mais
em relaccedilatildeo ao grupo caso foram feijatildeo arroz alface tomate e oacuteleo azeite ou
vinagre para tempero de salada Em relaccedilatildeo ao grupo controle os que apresentaram
consumo diaacuterio de uma vez ou mais foram arroz e patildeo francecircs patildeo de forma
integral patildeo doce ou torrada
O percentual de consumo dos 16 grupos alimentares identificados derivados
do QFA (Tabela 11) em relaccedilatildeo ao grupo caso que foram consumidos por 80 ou
mais da populaccedilatildeo foram massas carne vermelha e ovos embutidos carne branca
cereais raiacutezes e tubeacuterculos hortaliccedilas e frutas No mesmo grupo populacional os
grupos alimentares de menor consumo foram bebida alcooacutelica leite e derivados e
preparaccedilotildees com percentuais de consumo de 30 493 e 525
respectivamente Os grupos que apresentaram consumo intermediaacuterio foram
Infusatildeo Oacuteleos e gorduras accediluacutecar e doces lanches leguminosas e alimentos
industrializados com percentuais de consumo de 60 616 65 783 783 e
79 respectivamente No grupo controle os grupos alimentares que apresentaram
consumo de 80 ou mais da populaccedilatildeo foram massa carne vermelha e ovos carne
branca cereais raiacutezes e tubeacuterculos hortaliccedilas lanches e accediluacutecar e doces Ainda
nesse grupo populacional os grupos alimentares de menor consumo assim como no
grupo caso foram bebida alcooacutelica preparaccedilotildees e leite e derivados com
percentuais de consumo de 45 45 e 486 respectivamente Os grupos que
apresentaram consumo intermediaacuterio foram oacuteleos e gorduras Infusatildeo alimentos
embutidos leguminosas alimentos industrializados e frutas com percentuais de
consumo de 616 65 65 65 657 731 respectivamente
79
Tabela 11 ndash Definiccedilatildeo dos grupos alimentares derivados do Questionaacuterio de Frequecircncia Alimentar (QFA) e percentual de consumo da populaccedilatildeo estudada Satildeo Paulo SP 2013-2014
Grupo Alimentar
Grupo Consumo Alimentos
Massas
Caso 90 Macarratildeo com molho sem carne macarratildeo com molho com
carne lasanha nhoque pizza e panqueca Controle 916
Preparaccedilatildeo Caso
525 Sopas polenta cozida ou frita
Controle 45
Carne vermelha e ovos
Caso 888 Carne bovina Carne de porco carne de sol bacon e ovo
Controle 813
Embutidos Caso 825 Linguiccedila e embutidos (presunto mortadela salsicha)
Controle 65
Carne branca Caso 975 Frango peixe e frutos do mar
Controle 95
Leite e derivados
Caso 493 Leite integral leite desnatado leite semi-desnatado iogurte
natural iogurte com frutas queijo mussarela queijo prato
parmesatildeo provolone queijo minas e ricota
Controle 486
Leguminosas
Caso 783 Feijatildeo lentilha ervilha seca gratildeo de bico soja feijoada feijatildeo tropeiro
Controle 65
Cereais raiacutezes e tubeacuterculos
Caso
813
Arroz branco integral cozido com oacuteleo e temperos batata frita
mandioca frita batata cozida mandioca cozida inhame purecirc
de batatas ou mandioca farinha de mandioca farofa cuscuz
tapioca aveia patildeo francecircs patildeo de forma torrada biscoito
sem recheio doce e salgado biscoito recheado biscoito
amanteigado waffer bolo simples bolo recheado
Controle
887
Hortaliccedilas
Caso 964 Alface tomate cenoura outros legumes (abobrinha berinjela chuchu pepino) outras verduras cruas (acelga ruacutecula agriatildeo) outras verduras cozidas (acelga espinafre escarola couve) broacutecolis couve-flor e repolho
Controle 926
Frutas Caso 825 Laranja mexerica abacaxi banana maccedila pecircra melatildeo
melancia mamatildeo goiaba abacate suco natural Controle 731
Industrializados
Caso
79
Maionese condimentos molho para salada patecirc chantilly suco industrializado refrigerante comum diet e light hambuacuterguer nuggets almondegas Controle 657
Infusatildeo Caso 60 Chaacute e cafeacute sem accediluacutecar chaacute e cafeacute com accediluacutecar
Controle 65
Bebida alcooacutelica Caso 30 Cerveja
Controle 45
Oacuteleos e gorduras Caso 616 Oacuteleo azeite vinagre manteiga ou margarina comum
manteiga ou margarina light Controle 616
Lanches Caso 783 Salgados fritos salgados assados sanduiacuteche
Controle 833
Aacutecuacutecar e doces Caso 65 Chocolate bombom brigadeiro chocolate em poacute sobremesas doces tortas e pudins accediluacutecar mel geleacuteia Controle 888
80
Todos os indiviacuteduos da pesquisa foram avaliados quanto a ingestatildeo dieteacutetica
Os dados dieteacuteticos obtidos foram traduzidos em energia macro e micronutrientes
(Tabela 12) Observa-se com base nos resultados estatiacutesticos que natildeo houve
variaccedilatildeo significativa no consumo alimentar das mulheres estudadas tendo sido
semelhante entre os grupos caso e controle Aleacutem disso ao realizar-se o teste t
comparando as meacutedias de consumo dos macronutrientes carboidratos proteiacutenas
lipiacutedios e fibras com as variaacuteveis desfecho (mulheres obesas x mulheres eutroacuteficas)
tambeacutem natildeo foram observadas associaccedilotildees estatisticamente significantes
Analisando a razatildeo de ingestatildeo quilocaloriasquilograma de peso corporal
tem-se que o grupo caso teve meacutedia de ingestatildeo energeacutetica de 199 kcalkgdia e o
grupo controle 279 kcalkgdia (Tabela 13) O grupo controle evidenciou consumo
compatiacutevel para a manutenccedilatildeo do seu peso (faixa de recomendaccedilatildeo 25-30
kcalkgdia) enquanto o grupo caso apresentou um niacutevel meacutedio de ingestatildeo abaixo
do valor de manutenccedilatildeo a ingestatildeo energeacutetica foi 204 menor do que a
recomendaccedilatildeo considerando-se o limite inferior de 25 kcalkgdia
Outra razatildeo de ingestatildeo gramas de proteiacutenasquilograma de peso corporal eacute
utilizada para caacutelculo e recomendaccedilatildeo de consumo proteacuteico sem prejuiacutezo da funccedilatildeo
renal (recomendaccedilatildeo de ingestatildeo 06 a 08 g de proteiacutenaskg de pesodia) O grupo
controle apresentou ingestatildeo proteacuteica acima do recomendado 12 g de proteiacutenaskg
de pesodia enquanto o grupo caso apresentou um niacutevel meacutedio de consumo
compatiacutevel com a recomendaccedilatildeo 078 g de proteiacutenaskg de pesodia apresentando-
se no limite maacuteximo preconizado (Tabela 13)
81
Tabela 12 ndash Anaacutelise de consumo de energia e nutrientes da populaccedilatildeo estudada Satildeo Paulo SP 2013-2014
Variaacuteveis Grupo Meacutedia de consumo
Desvio Padratildeo
IC 95 P
Energiadia (kcal)
Caso 18571 93622 (137401 ndash 205869) 093
Controle 1692 98334 (120438 ndash 217822)
Carboidratodia (g)
Caso 24345 16826 (16706 ndash 25787)
090 Controle 20785
10997 (15402 ndash 26294)
Gordura totaldia (g)
Caso
658
276
(5205 ndash 7926) 086
Controle
627
4714 (3998 ndash 8673)
Gordura polinsaturadadia
(g)
Caso 795 416 (617 ndash 937) 048
Controle 85 675 (575 ndash 1237)
Gordura monoinsaturadadia
(g)
Caso 206 925 (1640 ndash 2553)
059 Controle 182 1598
(1077 ndash 2651)
Gordura saturadadia (g)
Caso 2185 1149 (1670 ndash 2808)
075 Controle 204 1698 (1239 ndash 2924)
Proteiacutenadia (g) Caso 7355 3508 (5531 ndash 8905)
091 Controle 7285 4985 (4914 ndash 9849)
Fibra totaldia (g) Caso 168 902 (1247 ndash 1953)
027 Controle 1265 765 (944 ndash1699)
Fibra soluacuteveldia (g) Caso 4 332 (273 ndash 563)
029 Controle 285 23 (215 ndash 437)
Fibra insoluacuteveldia (g)
Caso 56 391 (404 ndash 703) 025
Controle 395 232 (338 ndash 562)
Colesteroldia (g) Caso 23635 13965 (17127 ndash 30877)
077 Controle 26105 26790 (12780 ndash 39313)
Vitamina Adia (UI) Caso 95885 55538 (70451 ndash 124904)
055 Controle 872 47033 (64231 ndash 110801)
Vitamina Cdia (mg) Caso 2105 18857 (11025 ndash 29152)
011 Controle 12035 8752 (7936 ndash 16565)
Vitamina B1dia (mg)
Caso 13 117 (131 ndash 204) 072
Controle 13 166 (104 ndash 260)
Vitamina B2dia (mg)
Caso 08 083 (107 ndash 174) 079
Controle 105 089 (103 ndash 193)
82
Tabela 12 ndash Anaacutelise de consumo de energia e nutrientes da populaccedilatildeo estudada Satildeo Paulo SP 2013-2014
(Continuaccedilatildeo)
Variaacuteveis Grupo Meacutedia
de consumo Desvio Padratildeo
IC 95 P
Vitamina B6dia (ug)
Caso 110 102 (121 ndash 197)
085 Controle 105 088 (110 ndash 197)
Vitamina B12dia (ug)
Caso 38 253 (309 ndash 562) 096
Controle 385 285 (302 ndash 578)
Vitamina Ddia (mg)
Caso 915 1620 (211 ndash 1803) 012
Controle 23 3357 (733 ndash 4061)
Niacinadia (mg)
Caso 19 1005 (1402 ndash 2191)
059 Controle 193
1303 (1339 ndash 2641)
Folatodia (mg)
Caso
24010
11621
(17758 ndash 28351) 054
Controle 20495 12117 (14708 ndash 26684)
Aacutecido pantotecircnicodia
(mg)
Caso 35 216 (292 ndash 443) 074
Controle 29 251 (220 ndash 469)
VitaminaEdia (mg)
Caso 1155 651 (894 ndash 1309) 079
Controle 99 625 (738 ndash 1368)
Iododia (mg) Caso 547 4984 (3206 ndash 8098)
049 Controle 4515 3674 (2814 ndash 6439)
Soacutediodia (mg) Caso 230285 159724 (155816 ndash 246261)
099 Controle 201715 148254 (127647 ndash 274446)
Caacutelciodia (mg) Caso 69045 42353 (47627 ndash 89502)
068 Controle 62645 33992 (46373 ndash 79973)
Magneacutesiodia (mg)
Caso 2325 10339 (17818 ndash 25995) 044
Controle 1947 9452 (14888 ndash 24255)
Zincodia (mg) Caso 85 523 (617 ndash 1115)
086 Controle 78 476 (603 ndash 1068)
Manganecircsdia (mg)
Caso 6 85 (206 ndash 1045) 064
Controle 1095 2019 (148 ndash 1446)
Potaacutessiodia (mg)
Caso 271955 117073 (208408 ndash 3131423) 029
Controle 220685 115874 (164415 ndash 279085)
Foacutesforodia (mg)
Caso 9754 44188 (73698 ndash 1151535) 086
Controle 9085 56939 (63379 ndash 119689)
83
Tabela 12 ndash Anaacutelise de consumo de energia e nutrientes da populaccedilatildeo estudada Satildeo Paulo SP 2013-2014
(Continuaccedilatildeo)
Variaacuteveis Grupo Meacutedia
de consumo Desvio Padratildeo
IC 95 P
Ferrodia (mg) Caso 137 859
(996 ndash 1538)
069
Controle 1145 616 (885 ndash 1492)
Cobredia (mg) Caso 1 0 917 (1 ndash 167)
090 Controle 085 109 (094 ndash 167)
Selecircniodia (ug) Caso 33475 21854 (23251 ndash 44777)
068 Controle 400 5844 (11179 ndash 69057)
Nota significacircncia estatiacutestica quando p-valor le 005
Tabela 13 ndash Comparaccedilatildeo das variaacuteveis dieteacuteticas relacionadas agraves razotildees de ingestatildeo e Valor Energeacutetico Total (VET) da populaccedilatildeo estudada Satildeo Paulo SP 2013-2014
Variaacuteveis Grupo Caso
Grupo controle
Energia (Kcal) 18571
1692
Kcalkgdia 199
279
Carboidrato (g) 24345
20785
Carboidrato (VET) 5241
4913
Proteiacutena (g) 7355
7285
Grama de proteiacutenakgdia
078
12
Proteiacutena (VET) 1584
1722
Lipiacutedeo (g) 658
627
Lipiacutedeo ( VET) 3188
3335
84
A partir de dados de meacutedia de ingestatildeo de macronutrientes comparou-se a
porcentagem que cada um deles carboidratos proteiacutenas e lipiacutedeos (Tabela 13)
representa no Valor Energeacutetico total (VET) ingerido com o intervalo de
balanceamento dieteacutetico proposto pelas Dietary References Intake (DRI) Assim
tem-se que os grupos caso e controle balancearam suas dietas conforme o intervalo
de distribuiccedilatildeo energeacutetica recomendado visualizado na figura 5 Em relaccedilatildeo ao
consumo de fibras foi observado que ambos os grupos apresentaram um consumo
inferior ao Adequate Intake (AI) com consumo de 168 e 1265 para os grupos
caso e controle respectivamente Em relaccedilatildeo ao consumo de lipiacutedios o consumo de
gordura saturada mostrou-se maior que os 7 recomendado pela Sociedade
Brasileira de Cardiologia (2007) em consonacircncia com a National Heart Lung e Blood
Institute dos Estados Unidos tanto no grupo caso quanto no grupo controle de
1058 e 1085 respectivamente
Figura 5 ndash Comparaccedilatildeo entre as meacutedias de consumo de macronutrientes dos Grupos Caso e Controle com a Faixa de Distribuiccedilatildeo Aceitaacutevel de macronutrientes (AMDRDRI) e AI (Adequate Intake) para a faixa etaacuteria de 20 a 70 anos Satildeo Paulo SP 2013-2014
Legenda ndash A recomendaccedilatildeo de consumo de macronutrientes para tal faixa etaacuteria eacute
para Carboidratos 45 a 65 do VET (Valor Energeacutetico Total) Proteiacutenas 10 a 35 do VET Lipiacutedeos 20 a 35 do VET e Fibras 21 a 26 gramasdia
85
A comparaccedilatildeo da meacutedia da ingestatildeo das vitaminas A C E e folato dos
grupos caso e controle com as recomendaccedilotildees de ingestatildeo mostrou que a meacutedia de
consumo dos grupos foi semelhante e de acordo com a recomendaccedilatildeo exceto para
folato e vitamina E em que ambos os grupos mostraram meacutedias de ingestatildeo abaixo
do recomendado (Figura 6)
Figura 6 ndash Comparaccedilatildeo entre as meacutedias de consumo das Vitaminas A C E e folato dos Grupos Caso e Controle com a Faixa de Distribuiccedilatildeo Aceitaacutevel de macronutrientes (AMDRDRI) e AI (Adequate Intake) para a faixa etaacuteria de 20 a 70 anos Satildeo Paulo SP 2013-2014
A comparaccedilatildeo da meacutedia das ingestotildees das Vitaminas B1 B2 B6 B12 D
Niacina e Aacutecido pantotecircnico dos grupos caso e controle com as recomendaccedilotildees de
ingestatildeo demonstrou que a meacutedia de consumo em relaccedilatildeo agraves vitaminas B1 e B12
estavam acima do recomendado nos dois grupos As vitaminas B6 e aacutecido
pantotecircnico apresentaram ingestatildeo inferior ao preconizado nos grupos caso e
controle Ambos os grupos estudados apresentaram consumo em concordacircncia com
as recomendaccedilotildees em relaccedilatildeo agrave niacina No entanto as vitaminas B2 e D
apresentaram consumo pelo grupo caso inferior enquanto o grupo controle
apresentou-se de acordo com a recomendaccedilatildeo (Figura 7)
86
Figura 7 ndash Comparaccedilatildeo entre as meacutedias de consumo das Vitaminas B1 B2 B6 B12 D Niacina e Aacutecido pantotecircnico dos Grupos Caso e Controle com a Faixa de Distribuiccedilatildeo Aceitaacutevel de macronutrientes (AMDRDRI)e AI (Adequate Intake) para a faixa etaacuteria de 20 a 70 anos Satildeo Paulo SP 2013-2014
Para os minerais foacutesforo e selecircnio a ingestatildeo dos grupos Caso e Controle
tambeacutem foi adequada Exceto para iodo caacutelcio e magneacutesio que tiveram a ingestatildeo
menor que a recomendaccedilatildeo e o cobre que apresentou uma ingestatildeo inferior ao
preconizado no grupo controle enquanto o grupo caso demonstrou uma ingestatildeo
adequada dentro dos limites de recomendaccedilatildeo (Figura 8)
87
Figura 8 ndash Comparaccedilatildeo entre as meacutedias de consumo de Sais Minerais dos Grupos Caso e Controle com a Faixa de Distribuiccedilatildeo Aceitaacutevel de macronutrientes (AMDRDRI)e AI (Adequate Intake) para a faixa etaacuteria de 20 a 70 anos Satildeo Paulo SP 2013-2014
Para os minerais e nutrientes soacutedio manganecircs e potaacutessio a ingestatildeo dos
grupos Caso e Controle foi adequada Exceto para ferro que apresentou ingestatildeo
menor que a recomendaccedilatildeo e o zinco que apresentou ingestatildeo um pouco inferior ao
preconizado no grupo controle enquanto o grupo caso demonstrou ingestatildeo
adequada dentro dos limites de recomendaccedilatildeo (Figura 9)
Figura 9 ndash Comparaccedilatildeo entre as meacutedias de consumo de Sais Minerais e outros nutrientes dos Grupos Caso e Controle com a Faixa de Distribuiccedilatildeo Aceitaacutevel de macronutrientes (AMDRDRI)e AI (Adequate Intake) para a faixa etaacuteria de 20 a 70 anos Satildeo Paulo SP 2013-2014
88
522 Avaliaccedilatildeo antropomeacutetrica do estado nutricional
Os resultados da avaliaccedilatildeo antropomeacutetrica estatildeo apresentados na tabela 14
Foi observado que as mulheres estudadas do grupo caso apresentaram meacutedia de
IMC (Iacutendice de massa corporal) de 365 kgm2 (DP 441 Amplitude 306-449) Ao
classificar as pacientes em classes de obesidade de acordo com os criteacuterios
determinados pela OMS (Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede) (1995) verificou-se que
nove (45) das mulheres apresentam obesidade grau I (IMC 30-3499 kgm2) sete
(35) apresentam obesidade grau II (IMC 35-3999 kgm2) e quatro (20) das
mulheres apresentam obesidade grau III (IMC ge 40 kgm2) As mulheres do grupo
controle apresentaram IMC meacutedio de 224 kgm2 (DP 204 Amplitude 188-249)
Em relaccedilatildeo ao percentual de gordura observou-se a meacutedia de 4535 (DP
518 Amplitude 354-534) de gordura corporal no grupo caso e 3004 (DP 671
Amplitude 113-404) no grupo controle indicando um excesso de gordura corporal
em ambos os grupos de acordo com LOHMAN (1992) Em relaccedilatildeo agrave essa
classificaccedilatildeo no grupo caso todas as mulheres apresentam riscos de doenccedilas
associadas agrave obesidade apresentando um percentual de gordura corporal maior que
32 Das mulheres do grupo controle 2 (10) apresentaram-se abaixo da meacutedia 1
(5) na meacutedia 8 (40) acima da meacutedia e 9 (45) apresentaram risco de
desenvolvimento de doenccedilas relacionadas com a obesidade
A avaliaccedilatildeo da Razatildeo cintura-quadril (RCQ) importante indicador de
obesidade central Comparando-se os resultados obtidos com o ponto de corte
recomendado pela OMS (Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede 1995) de 085 para
mulheres observou-se que todas as pacientes avaliadas do grupo caso apresentam-
se acima do recomendado com a meacutedia de RCQ de 099 (DP 0074 Amplitude
087-119) enquanto as mulheres do grupo controle apresentaram uma razatildeo meacutedia
de 083 (DP 0047 Amplitude 077-096) onde sete (35) mulheres apresentaram
a RCQ acima do valor referecircncia preconizado pela OMS No entanto ao avaliar a
Razatildeo cintura quadril de acordo com os pontos de corte propostos por LOHMAN et
al (1988) em relaccedilatildeo ao risco de desenvolvimento de doenccedilas associadas agrave
Siacutendrome Metaboacutelica (Doenccedilas cardiovasculares hipertensatildeo dislipidemia e
alteraccedilatildeo no metabolismo de carboidratos) os resultados demonstraram que em
relaccedilatildeo ao grupo caso 18 (90) das mulheres apresentaram alto risco para o
desenvolvimento dessas doenccedilas enquanto 2 (10) apresentaram risco moderado
89
Em relaccedilatildeo ao grupo controle foi observado que 3 (15) natildeo apresentaram riscos
13 (65) apresentaram baixo risco 1(5) apresentou risco moderado e 3 (15)
apresentaram alto risco para o desenvolvimento dessas doenccedilas
Tabela 14 ndash Comparaccedilatildeo de variaacuteveis antropomeacutetricas da populaccedilatildeo estudada
Variaacuteveis Grupo Meacutedia
Desvio Padratildeo
Miacutenimo Maacuteximo
Peso (kg) Caso 9329 105 7574 1075
Controle 6054 787 4575 7422
Estatura (m2) Caso 160 007 149 172
Controle 164 007 151 18
IMC (Kgm2) Caso 3645 452 306 449
Controle 2241 204 188 249
Razatildeo cintura-quadril (RCQ)
Caso 099 007 088 119
Controle 083 005 077 096
Gordura corporal total
()
Caso
4535
519
354
531
Controle
30035
671
113 404
90
53 Determinaccedilatildeo da microbiota intestinal
531 Padronizaccedilatildeo de reaccedilatildeo de PCR quantitativo (qPCR) por meio de TaqMan para a detecccedilatildeo de Mollicutes
Pela qPCR quantificou-se carga de Mollicutes representadas por unidades
formadoras de colocircnias (UFCmicrol) nas amostras de fezes O ensaio de qPCR
demonstrou eficiecircncia de reaccedilatildeo de E= 1033 (r2= 095) A sensibilidade do teste
foi de detecccedilatildeo de no miacutenimo dez coacutepias de genomareaccedilatildeo quando utilizados os
padrotildees de nuacutemero de coacutepias de DNA genocircmico diluiacutedo (Figura 10)
Figura 10 ndash Curva-padratildeo gerada a partir dos pontos de Ct obtidos com o graacutefico de amplificaccedilatildeo de diluiccedilotildees seriadas do controle positivo Mycoplasma hominis calculado pelo software StepOne 21 (Applied Biosystems Life Technologies Corporation) Satildeo Paulo SP 2013-2014
A repetibilidade testada por meio dos testes intra-ensaio e inter-ensaio da
qPCR estaacute apresentada na tabela 15 O ensaio foi especiacutefico para Mollicutes natildeo
tendo sido visualizada amplificaccedilatildeo dos controles microbianos de outros micro-
organismos utilizados
91
Tabela 15 ndash Repetibilidade intra-ensaio e inter-ensaio da qPCR para Mollicutes Satildeo Paulo SP 2013-2014
Nordm de coacutepias do Genoma
Repetibilidade intra-ensaio Repetibilidade inter-ensaio
Genoma bacteriano diluiacutedo
em 1times TE Genoma bacteriano diluiacutedo
em 1times TE
Ponto meacutedio de corte
(Ct plusmn SD) CV ()
Ponto meacutedio de corte (Ct plusmn SD)
CV ()
10 3537 plusmn 015 045 3494 plusmn 045 129
102 3425 plusmn 017 050 3379plusmn 029 087
103 3099 plusmn 021 070 3074 plusmn 039 128
104 2739 plusmn 023 084 2739 plusmn 038 142
105 2356 plusmn 012 054 2291plusmn 025 110
106 1874 plusmn 066 352 1915 plusmn 077 403
CV coeficiente de variaccedilatildeo
A PCR geneacuterica para Mollicutes foi positiva em 17 (85) das amostras
cliacutenicas do grupo caso e 8 (40) das amostras do grupo controle obtidas No
entanto nem todas as amostras positivas em cPCR para Mollicutes foram positivas
em qPCR 13 (65) das amostras do grupo caso e trecircs (15) do grupo controle
foram positivas em qPCR (Tabela 16)
Tabela 16 ndash Comparaccedilatildeo entre os resultados obtidos no teste de sensibilidade pelas teacutecnicas de PCR convencional e qPCR para detecccedilatildeo de Mollicutes Satildeo Paulo SP 2013-2014
Amostra
Grupo PCR convencional qPCR
n () n ()
Positivaa Caso 17 (85) 13 (65) Negativab 3 (15) 7 (35)
Positivaa
Negativab Controle 8 (40)
12 (60) 3 (15) 17 (85)
Nota n= 20 mulheres aPositiva - Detecccedilatildeo de produto de DNA esperado bNegativa - Ausecircncia de produto de DNA esperado
92
Por meio da PCR em tempo real foi possiacutevel quantificar o DNA e
consequentemente a carga do microrganismo representada por unidades
formadoras de colocircnias - ufcmicrol nas amostras de fezes coletadas Os resultados da
qPCR demonstraram uma carga meacutedia de Mollicutes nas amostras de fezes
analisadas referentes ao grupo caso de 584 x 103 ufcmicrol e de 156 ufcmicrol referentes
ao grupo controle Observa-se na figura 11 graacutefico de dispersatildeo referente agraves
cargas meacutedias das amostras positivas com detecccedilotildees de aproximadamente 101 a
103 UFCml de Mollicutes Contudo as meacutedias das dosagens foram maiores nas
mulheres do grupo caso E apoacutes anaacutelise estatiacutestica por Mann-Whitney foi possiacutevel
observar diferenccedila estatisticamente significante para a espeacutecie Mollicutes (p =
00023) Em seguida foi testada atraveacutes do teste de Odds Ratio a associaccedilatildeo
epidemioloacutegica entre as variaacuteveis desfecho (mulheres obesas x mulheres eutroacuteficas)
e as variaacuteveis Mollicutes (presenccedila x ausecircncia) tendo sido detectada uma
associaccedilatildeo positiva estatisticamente significante entre a presenccedila de Mollicutes e
mulheres obesas (OR= 115 IC= 242-554) Aleacutem disso ao realizar-se o teste t
comparando as meacutedias de consumo dos macronutrientes carboidratos proteiacutenas
lipiacutedios e fibras com as variaacuteveis Mollicutes (presenccedila x ausecircncia) natildeo foram
observadas associaccedilotildees estatisticamente significantes
Figura 11 - Quantificaccedilatildeo por qPCR de Mollicutes (UFCmicrol) a partir das amostras de fezes nos grupos caso e controle Satildeo Paulo SP 2013-2014
Legenda ndash Concentraccedilatildeo meacutedia de Mollicutes entre as mulheres do grupo caso (~584 x 103 UFC
microL) e controle (~156 UFC microL) estudadas e positivas para Mollicutes pelo qPCR (p-valor=00023)
Mediana e desvio padratildeo indicadas por linhas soacutelidas no graacutefico Anaacutelise estatiacutestica realizada por
Mann Whitney assumindo p-valor le 005
93
532 Detecccedilatildeo de micro-organismos dos filos Firmicutes e Bacteroidetes aleacutem de bacteacuterias totais (Eubacterias) por PCR em tempo Real (qPCR)
Todas as amostras 40 (100) foram positivas para Firmicutes e Bacteroidetes
na qPCR tanto para o grupo caso como para o controle Natildeo foram observadas
diferenccedilas estatisticamente significantes para as cargas de Firmicutes Bacteroidetes
e Bacteacuterias totais entre as mulheres do grupo caso e controle No entanto as cargas
meacutedias de Firmicutes e Eubacteacuterias no grupo caso foram maiores que no grupo
controle enquanto Bacteroidetes apresentou uma maior carga no grupo controle A
figura 12 representa os graacuteficos de dispersatildeo referentes agraves cargas meacutedias das
amostras de fezes para esses micro-organismos
Figura 12 - Quantificaccedilatildeo por qPCR de Firmicutes Bacteroidetes e Eubacterias (UFCmicrol) a partir das amostras de fezes nos grupos caso e controle Satildeo Paulo SP 2013-2014
Legenda ndash (a) Concentraccedilatildeo de Firmicutes (UFCmicroL) entre as mulheres do grupo caso (~869 x 1018 UFCmicrol) e controle (~504 x 1014 UFCmicrol) (b) Concentraccedilatildeo de Bacteroidetes (UFCmicroL) entre as mulheres do grupo caso (~879 x 108 UFCmicrol) e controle (~146 x 109 UFCmicrol) (c) Concentraccedilatildeo de Eubacterias (UFCmicroL) entre as mulheres do grupo caso (~731 x 1024 UFCmicrol) e controle (~619 x 1021 UFCmicrol) Mediana e amplitude interquartiacutelica indicadas por linhas soacutelidas no graacutefico Anaacutelise estatiacutestica realizada por Mann Whitney assumindo p-valor le 005
94
Com o intuito de verificar o percentual de micro-organismos da classe
Mollicutes frente agrave carga meacutedia de Firmicutes foi realizada a anaacutelise do percentual
meacutedio dos referidos micro-organismos onde verificou-se que Mollicutes representam
424 do nuacutemero meacutedio de Firmicutes detectados na qPCR especiacutefica para o
mesmo nas amostras analisadas no grupo caso e 25 x 10-4 no grupo controle
(Tabela 17)
Tabela 17 ndash Nuacutemero meacutedio de coacutepias e percentual dos grupos Mollicutes estudados frente ao Filo Firmicutes na populaccedilatildeo estudada Satildeo Paulo SP 2013-2014
Nota Meacutedia de coacutepiasgrama de fezes Percentual de coacutepias de Mollicutes em relaccedilatildeo ao Filo Firmicutes
Os resultados da qPCR demonstraram carga meacutedia de Bacteacuterias totais
(Eubacteacuterias) nas amostras de fezes analisadas do grupo caso (~731 x 1024 UFCmicrol)
e controle (~619 x 1021 UFCmicrol) As anaacutelises de percentual entre a carga meacutedia de
Bacteroidetes Firmicutes e Mollicutes e a carga meacutedia de bacteacuterias totais estatildeo
representadas na Tabela 18
Grupo Firmicutes Mollicutes
Meacutedia coacutepias g de fezes
Meacutedia coacutepias g de fezes
Caso 869x1018
584x103
424
Controle 504x1014
16
25x10-4
95
Tabela 18 ndash Nuacutemero meacutedio de coacutepias e percentual dos grupos de bacterianos estudados frente agraves bacteacuterias totais na populaccedilatildeo estudada Satildeo Paulo SP 2013-2014
Nota Meacutedia de coacutepiasgrama de fezes Percentual de coacutepias de cada bacteacuteria em relaccedilatildeo agraves bacteacuterias totais
Foi calculada a proporccedilatildeo de Firmicutes em relaccedilatildeo aos Bacteroidetes na
microbiota intestinal das mulheres estudadas tendo sido observada maior proporccedilatildeo
na microbiota intestinal das mulheres obesas em relaccedilatildeo agraves eutroacuteficas do grupo
controle (Tabela 19) A relaccedilatildeo entre o percentual de Firmicutes e Bacteroidetes na
microbiota intestinal das mulheres do grupo caso foi cerca de 29 x 107 maior entre
as mulheres obesas do grupo caso em comparaccedilatildeo com o grupo controle
Tabela 19 ndash Proporccedilatildeo de Firmicutes em relaccedilatildeo agrave Bacteroidetes na populaccedilatildeo estudada Satildeo Paulo SP 2013-2014
Nota Meacutedia de coacutepiasgrama de fezes
Grupo Bacteacuterias totais
Firmicutes Bacteroidetes Mollicutes
Meacutedia coacutepias g de fezes
Meacutedia coacutepias g de
fezes
Meacutedia coacutepias g de
fezes
Meacutedia coacutepias g de fezes
Caso 731x 1024
869x1018
442x105
879x108
718x10-2
584x103
28x 10-2
Controle 619x 1021
504x1014
171x105
146x109
624x102 16
22x10-11
Grupo Firmicutes Bacteroidetes Proporccedilatildeo FirmicutesBacteroidetes
Meacutedia coacutepias g de fezes
Meacutedia coacutepias g de fezes
Meacutedia coacutepias g de fezes
Caso 869x1018 879x108
134x1013
Controle 504x1014
146x109
45x 105
96
54 Dosagem de citocinas do soro sanguiacuteneo
Ao serem quantificadas as citocinas IL-1β IL-10 IL17-A e TNF-α pela
teacutecnica de ELISA no plasma sanguiacuteneo das mulheres natildeo foi observada diferenccedila
estatisticamente significante entre os grupos caso e controle para nenhuma das
citocinas avaliadas IL-1β (p= 02249) IL-10 (p=1) IL17-A (p=03169) e TNF-α
(p=02235) (Figura 13)
Figura 13 ndash Quantificaccedilatildeo de IL-1β IL-10 IL17-A e TNF-α (pgmL) no plasma sanguiacuteneo por meio do ELISA nos grupos caso e controle da populaccedilatildeo estudada Satildeo Paulo SP 2013-2014
Legenda- (a) Concentraccedilatildeo de IL-1β (pgml) no plasma sanguiacuteneo das mulheres casos e controles (b) Concentraccedilatildeo de IL-10 (pgml) no plasma sanguiacuteneo das mulheres casos e controles (c) Concentraccedilatildeo de TNF-α (pgml) no plasma sanguiacuteneo das mulheres casos e controles (d) Concentraccedilatildeo de IL17-A (pgml) no plasma sanguiacuteneo das mulheres casos e controles Desvio padratildeo e meacutedia indicados por linhas soacutelidas no graacutefico Anaacutelise estatiacutestica por Mann Whitney p lt 005
97
6 DISCUSSAtildeO
A microbiota intestinal eacute um ecossistema complexo que desempenha um
importante papel na gecircnese da obesidade associada com o desenvolvimento das
respostas imunoloacutegicas aleacutem do estado nutricional do hospedeiro Projetos
mundiais de pesquisa estatildeo em desenvolvimento para compreender esta
complexidade microbiana na sauacutede humana (SHETTY et al 2013) O presente
estudo avaliou a participaccedilatildeo dos micro-organismos da Classe Mollicutes e dos Filos
Firmicutes e Bacteroidetes na microbiota intestinal de mulheres obesas e eutroacuteficas
Na diversidade das populaccedilotildees humanas e a ocorrecircncia da obesidade eacute
importante estudar a distribuiccedilatildeo da microbiota intestinal fazendo-se necessaacuterio e
imprescindiacutevel a caracterizaccedilatildeo da populaccedilatildeo estudada em relaccedilatildeo agrave preditores
importantes associados com a obesidade microbiota intestinal e ambiente
(KALLIOMAKI et al 2008 PENDERS et al 2006) No presente estudo observou-
se variaccedilatildeo estatiacutestica em relaccedilatildeo agrave variaacutevel gestaccedilatildeo onde 14 (70) das mulheres
do grupo caso e 2 (10) do controle relataram jaacute terem tido filhos Aagaard et al
(2012) verificaram que o microbioma era semelhante em mulheres gravidas ou natildeo
No entanto as mulheres graacutevidas apresentaram microbioma menos diversificado
Sugeriu-se que entre as mulheres em idade reprodutiva o microbioma permanece
como uma comunidade dinacircmica na vida reprodutiva do adulto e que a estrutura da
comunidade natildeo-graacutevida pode retornar em alguma medida nas uacuteltimas semanas de
gestaccedilatildeo Aleacutem disso alguns autores tecircm sugerido que o acuacutemulo de gordura
corporal na obesidade pode acarretar vaacuterias consequecircncias agrave sauacutede como diabetes
mellitus tipo 2 hipertensatildeo arterial dispneacuteia cacircncer dislipidemia doenccedilas
cardiacuteacas doenccedilas hepatobiliares osteoartrite alteraccedilotildees gastrintestinais e
distuacuterbios psicossociais o que corrobora com os achados em relaccedilatildeo agrave histoacuteria
cliacutenica das mulheres estudadas (FRANCISCHI et al 2000 PEREIRA et al 2003
SILVA 2005)
Para as mulheres em especial a menopausa tem sido associada como
colaboradora para o desenvolvimento de obesidade e acuacutemulo de gordura corporal
(SOWERS et al 2007) No presente estudo encontraram-se diferenccedilas estatiacutesticas
em relaccedilatildeo agrave variaacutevel menopausa onde 9 (45) das mulheres obesas do grupo
caso e 3 (15) das mulheres do grupo controle relataram ter entrado na
98
menopausa Entretanto Sternfeld et al (2004) em estudo de coorte feminina entre
42-52 anos de idade nos EUA natildeo encontraram associaccedilatildeo entre a menopausa e o
aumento de circunferecircncia da cintura bem como aumento do peso dessa forma
sugerindo que somente um fator pode natildeo ser o responsaacutevel pelo desenvolvimento
de obesidade No presente trabalho observou-se que 75 das mulheres do grupo
caso e 50 do grupo controle nasceram de parto normal Tem sido evidenciado na
literatura que o tipo de parto pode interferir na composiccedilatildeo da microbiota pela forma
de colonizaccedilatildeo do receacutem-nascido O parto via cesariana aumentaria o risco de
obesidade em relaccedilatildeo ao parto normal (HUH et al 2012 PEI et al 2014) Nesse
sentido Ajslev et al (2011) em estudo longitudinal prospectivo na infacircncia com
acompanhamento ateacute os sete anos observaram que uma combinaccedilatildeo de
exposiccedilotildees precoces que inclui o tipo de parto o IMC maternal preacute-gestacional e
uso de antibioacuteticos na primeira infacircncia (lt6 meses) influenciaram o risco de excesso
de peso
Existem diversos estudos em relaccedilatildeo aos fatores dieteacuteticos e a gecircnese da
obesidade (DAILEY 2014 ISOMAA et al 2001 MORENO-INDIAS et al 2014
PEREIRA et al 2002 ROMERO ZANESCO 2006 SANTOS et al 2006) No
entanto no presente estudo o valor energeacutetico encontrado em relaccedilatildeo ao grupo
caso ao analisar-se a razatildeo quilocaloriasquilograma de peso corporal foi inferior agrave
recomendaccedilatildeo caracterizando alimentaccedilatildeo insuficiente em energia (WHO 2003)
Da mesma maneira que no presente estudo Pereira et al (2012) natildeo encontraram
diferenccedilas significativas entre o consumo energeacutetico entre indiviacuteduos eutroacuteficos e
obesos Souza et al (2010) estudaram a ingestatildeo alimentar e balanccedilo energeacutetico da
populaccedilatildeo adulta de Niteroacutei- RJ e encontraram que a ingestatildeo energeacutetica mostrou-
se decrescente com o aumento do IMC para as mulheres A ingestatildeo energeacutetica em
menor quantidade parece indicar que embora o corpo esteja obeso os tecidos vitais
satildeo inadequadamente nutridos pois a alimentaccedilatildeo insuficiente fornece poucos
nutrientes (HUTSON et al 1965) Sawaya et al (2003) em estudo com mulheres
realizado em Maceioacute tambeacutem observaram que a ingestatildeo energeacutetica entre os
grupos eutroacutefico e obesos natildeo apresentou diferenccedila significativa Em outro estudo
com mulheres no Rio Grande do Sul tambeacutem foi verificado que o consumo alimentar
energeacutetico natildeo apresentou diferenccedila significativa (p=0157) entre os grupos (baixo
peso eutroacutefico e excesso de pesoobesidade) (FRANKE et al 2007) Com isto
99
provavelmente a ingestatildeo energeacutetica natildeo seja a causa da obesidade nas mulheres
estudadas sendo que a baixa ingestatildeo aliada a algumas deficiecircncias nutricionais e
predisposiccedilatildeo geneacutetica possa criar mecanismos de adaptaccedilatildeo levando a um ciclo
metaboacutelico cujo o desfecho seja o armazenamento de gordura na regiatildeo abdominal
(BALAMURUGAN et al 2010 CANI DELZENNE 2009 DAVID et al 2014
HANSON et al 2009 JIMENEZ MARTIN-MORENO 1995) Nesse contexto
devem ser considerados outros fatores de economia energeacutetica tais como o
desequiliacutebrio na microbiota intestinal aleacutem da adaptaccedilatildeo dos mecanismos de
consumo energeacutetico acarretando maior rendimento das calorias absorvidas
BALAMURUGAN et al 2010 CANI DELZENNE 2009 DAVID et al 2014
DEWULF et al 2013 DIBAISE FRANK MATHUR 2012 FRANKE 2007 GRAF et
al 2015 KOENIGA et al 2011 LE CHATELIER et al 2013 LEY et al 2006
PATIL et al 2012 RAOULT 2008 SAWAYA et al 2003 WICHMANN et al
2013)
Analisando a contribuiccedilatildeo do consumo dos macronutrientes e das fibras os
resultados do presente estudo demonstraram que este consumo estaacute dentro dos
criteacuterios exceto para o consumo de fibras que foi abaixo da recomendaccedilatildeo em
ambos os grupos Aleacutem disso comparando-se as meacutedias de consumo dos
macronutrientes e das fibras com as variaacuteveis desfecho (obesas x eutroacuteficas)
tambeacutem natildeo houve associaccedilotildees estatisticamente significantes Em Satildeo Paulo
observou-se que 295 dos indiviacuteduos entrevistados relataram ingestatildeo inferior agraves
necessidades fisioloacutegicas dos quais 58 eram indiviacuteduos obesos (SALVO
GIMENO 2002) Em outro estudo realizado com trabalhadores adultos de ambos os
sexos tambeacutem no Estado de Satildeo Paulo para avaliaccedilatildeo da ingestatildeo alimentar e
consumo de fibras dieteacuteticas foi encontrado que o consumo individual de fibras
dieteacuteticas diaacuteria variou 587 g a 2957 g sendo o consumo meacutedio da populaccedilatildeo
1461 g (PASSOS SHEID 2008) Fisberg et al (2009) em estudo realizado sobre
iacutendice de qualidade da dieta observaram padratildeo dieteacutetico com alto conteuacutedo de
gorduras totais colesterol e accediluacutecar refinado e com baixo teor de fibra alimentar
Estes resultados diferem em parte do padratildeo alimentar da populaccedilatildeo estudada no
entanto demonstra a necessidade de estiacutemulo ao maior consumo de alimentos ricos
em fibra
100
A partir dos resultados do estudo evidencia-se a adequaccedilatildeo comprometida
na alimentaccedilatildeo devido agrave elevada ingestatildeo de lipiacutedios (gordura saturada) e ingestatildeo
reduzida de fibras em ambos os grupos estudados contribuindo tanto para a
obesidade quanto em relaccedilatildeo ao acuacutemulo de tecido adiposo nas mulheres obesas e
eutroacuteficas Esses dados estatildeo em conformidade com o presente estudo em relaccedilatildeo
agraves variaacuteveis antropomeacutetricas analisadas Percentual de gordura corporal e Razatildeo
cintura-quadril onde ambos os grupos se apresentaram acima da meacutedia referecircncia
indicando excesso de gordura corporal Assim como no presente estudo outros
trabalhos tecircm demonstrado limitaccedilotildees e evidenciado que natildeo existe correlaccedilatildeo
precisa entre o IMC e o porcentual de gordura corpoacuterea Isso explica o fato de
indiviacuteduos que apresentam IMC dentro do padratildeo de normalidade mas possuem
uma quantidade de gordura corporal acima do ideal confirmando relatos de que o
IMC natildeo eacute um bom indicador quantitativo de adiposidade corporal e que pode
subestimar o percentual de gordura e classificando de forma errocircnea indiviacuteduos com
excesso de adiposidade (COSTA et al 2007 GLANER 2005) Dessa forma o
aumento de gordura corporal principalmente na regiatildeo abdominal pode tornar a
utilizaccedilatildeo do IMC cada vez mais limitada na avaliaccedilatildeo do estado nutricional jaacute que
indiviacuteduos com sobrepeso ou ateacute mesmo eutroacuteficos podem apresentar risco de
alteraccedilotildees metaboacutelicas devido a valores elevados de circunferecircncia da cintura
(REZENDE 2010) Aleacutem disso nossos resultados evidenciaram valores elevados
para RCQ o que pode explicar a porcentagem de algumas moleacutestias atuais
associadas agrave obesidade encontradas em ambos os grupos no presente trabalho
(OMS 2002 DAcircMASO BERNARDES 2003 OCHS-BALCOM et al 2006)
Diversos estudos tambeacutem contribuiacuteram na melhor compreensatildeo entre as
influecircncias da nutriccedilatildeo e da composiccedilatildeo corporal na composiccedilatildeo da microbiota
intestinal (BALAMURUGAN et al 2010 DAVID et al 2014 DEWULF et al 2013
GRAF et al 2015 WICHMANN et al 2013) No entanto pouco se conhece sobre a
participaccedilatildeo dos micro-organismos da classe Mollicutes na microbiota
principalmente quando associadas com fatores dieteacuteticos e antropomeacutetricos
Constatou-se no presente estudo diferenccedila estatisticamente significante para micro-
organismos da classe dos Mollicutes (p = 00023) Foi detectada associaccedilatildeo
estatisticamente significante entre a presenccedila de Mollicutes e mulheres obesas
(OR= 115 IC= 242-554) Nesse contexto Turnbaugh et al (2008) avaliaram a
101
microbiota de modelos experimentais de ratos geneticamente idecircnticos de
obesidade induzida pelo consumo de dieta ocidentalizada caracterizada por alto teor
de gordura e accediluacutecar Todos os animais herdaram uma microbiota semelhante e no
estado de obesidade observou-se maior crescimento da bacteacuteria Eubacterium
dolichum (membro da classe Mollicutes) que foram posteriormente reduzidos por
subsequentes manipulaccedilotildees dieteacuteticas para limitar o ganho de peso Ainda neste
estudo observou-se que a abundacircncia da classe dos Mollicutes foi acompanhada
pela supressatildeo de toda a divisatildeo de Bacteroidetes indicando que a classe
Mollicutes teve aptidatildeo aumentada em relaccedilatildeo a Firmicutes e todos os outros
Bacteroidetes identificados na populaccedilatildeo estudada Os autores observaram que os
molicutes evoluiacuteram a capacidade para importar o tipo de hidratos de carbono
encontradas na dieta ocidental administrada nos modelos experimentais estando
essas vantagens principalmente relacionadas com o Sistema fosfotransferase (PTS)
De acordo com Deutscher et al (2006) o PTS desempenha um papel na regulaccedilatildeo
da expressatildeo do gene microbiano atraveacutes da repressatildeo cataboacutelica permitindo que a
ceacutelula passe a utilizar preferencialmente accediluacutecares simples em relaccedilatildeo a outros
hidratos de carbono Anaacutelises de fragmentos do gene 16S rRNA dos dados de
metagenocircmica confirmaram a presenccedila dos molicutes no microbioma cecal quando
associados agrave uma dieta ocidental Em contrapartida Hildebrandt et al (2009) por
meio de metagenocircmica de fezes de camundongos magros inicialmente submetidos
a dieta de raccedilatildeo padratildeo com posterior mudanccedila para dieta rica em gordura natildeo
relataram encontrar molicutes em dieta de alto teor de gordura
No presente estudo ao se comparar as meacutedias de consumo dos
macronutrientes carboidratos proteiacutenas lipiacutedios e fibras com as variaacuteveis Mollicutes
(presenccedila x ausecircncia) natildeo foram observadas associaccedilotildees estatisticamente
significantes No entanto foi observado alto consumo de gorduras saturadas nas
mulheres estudadas com diferenccedila estatisticamente significante entre a quantidade
de molicutes na microbiota intestinal Esses resultados associados com as
evidecircncias encontradas na literatura acerca da participaccedilatildeo desses micro-
organismos na microbiota de pessoas obesas fornecem importantes evidecircncias de
que natildeo apenas o consumo alimentar e o percentual de gordura ingerida possam
influenciar o aumento de molicutes na microbiota intestinal Mas que esse aumento
tambeacutem pode estar associado ao possiacutevel enriquecimento de rotas metaboacutelicas
102
envolvidas na utilizaccedilatildeo de accediluacutecares simples relacionadas ao sistema PTS Aleacutem
disso tem sido evidenciado na literatura que em experimentos com animais germ-
free o consumo de uma dieta obesogecircnica parece natildeo estimular o desenvolvimento
da obesidade e que sucessivas manipulaccedilotildees dieteacuteticas para limitar o ganho de
peso possivelmente promovam subsequentes variaccedilotildees em relaccedilatildeo agrave populaccedilatildeo
microbiana na microbiota intestinal (GOODMAN et al 2011 TURNBAUGH et al
2009 WALKER et al 2011 YI LI 2012) Este achado foi sustentado por um estudo
recente em camundongos que mostrou que a composiccedilatildeo microbiana do intestino
natildeo eacute determinada apenas pela dieta atual mas tambeacutem em parte pela histoacuteria
dieteacutetica Aleacutem disso um estudo em seres humanos concluiu que a mudanccedila no
padratildeo de consumo de fibras pode produzir fortes mudanccedilas na microbiota
intestinal mas que estas dependem da composiccedilatildeo inicial da microbiota intestinal do
indiviacuteduo (AAFKE et al 2015 CARMODY et al 2015)
Estudos recentes tecircm demonstrado que a microbiota intestinal humana pode
estar alterada em indiviacuteduos obesos Nesse contexto tem sido amplamente
discutida a participaccedilatildeo dos filos Firmicutes e Bacteroidetes na microbiota desses
indiviacuteduos Aleacutem disso tem sido evidenciado que o filo Firmicutes representam mais
de 90 das categorias filogeneacuteticas conhecidas dominando a microbiota distal
Nesse sentido a obesidade estaacute associada com as diferenccedilas da microbiota
intestinal em niacutevel filo com menor diversidade geral e maior proporccedilatildeo relativa de
Firmicutes em relaccedilatildeo agrave Bacteroidetes em indiviacuteduos obesos em comparaccedilatildeo com
indiviacuteduos eutroacuteficos (ECKBURG et al 2005 LEY et al 2006 MORAN
SHANAHAN 2014 TURNBAUGH et al 2009) Nesse contexto os resultados do
presente estudo demonstraram que a relaccedilatildeo entre o percentual de Firmicutes e
Bacteroidetes na microbiota intestinal das mulheres do grupo caso foi cerca de 29x
107 maior entre as mulheres obesas em comparaccedilatildeo com o grupo controle
Estudos demonstraram que a relaccedilatildeo entre percentual de Firmicutes e Bacteroidetes
na microbiota intestinal eacute de cerca de 7020 para os natildeo obesos e ateacute 855 para os
obesos O que significa cerca de cinco vezes maior em obesos em comparaccedilatildeo com
natildeo obesos (BALAMURUGAN et al 2010 ECKBURG et al 2005 KOENIGA et al
2011 LE CHATELIER et al 2013 PATIL et al 2012) Os nossos achados estatildeo
em conformidade com alguns resultados da literatura Em estudo realizado por
Ridaura et al (2013) transplantaram-se micro-organismos intestinais de humanos
103
obesos e eutroacuteficos em intestinos de ratos com peso meacutedio Aqueles que receberam
a microbiota de humanos obesos tornaram-se ratos obesos e aqueles que
receberam microbiota de humanos magros permaneceram magros Outro estudo
realizado por Remely et al (2015) que tambeacutem investigaram atraveacutes de qPCR a
microbiota de humanos obesos durante a intervenccedilatildeo dieteacutetica para perda de peso
induzida observaram diminuiccedilatildeo na proporccedilatildeo de FirmicutesBacteroidetes nos
obesos apoacutes a intervenccedilatildeo dieteacutetica
A proporccedilatildeo FirmicutesBacteroidetes tem sido associada como um marcador
de sauacutede para um indiviacuteduo e um desequiliacutebrio nesta proporccedilatildeo estaacute associada com
diferentes doenccedilas (MARIAT et al 2009) A mudanccedila na abundacircncia relativa destes
filos resulta no aumento da capacidade de captaccedilatildeo de energia a partir dos
alimentos aleacutem de induzir a inflamaccedilatildeo de baixo grau A reduccedilatildeo de Bacteroidetes
tem sido relacionada com dieta rica em gordura que pode resultar em aumento dos
niacuteveis plasmaacuteticos de LPS (CANI et al 2007 EVERARD CANI 2013) enquanto o
aumento Firmicutes tem sido associado com o consumo de carnes (EVERARD
CANI 2013) Aleacutem disso vaacuterios estudos tecircm mostrado mudanccedila da relaccedilatildeo de
FirmicutesBacteroidetes em pessoas obesas durante intervenccedilotildees dieteacuteticas para
perda de peso corporal sugerindo que as mudanccedilas na concentraccedilatildeo de bacteacuterias
nos indiviacuteduos obesos podem ser revertidas depois da perda de peso induzida por
dieta fazendo com que a microbiota do indiviacuteduo obeso se assemelhe ao indiviacuteduo
eutroacutefico (CLEMENTE et al 2012 DEWULF et al 2013 DIBAISE et al 2012
REMELY et al 2013 2015) Em contrapartida estes resultados natildeo satildeo universais
outros estudos demonstraram padrotildees variaacuteveis em mudanccedilas de niacutevel de filo
medidos na composiccedilatildeo da microbiota de indiviacuteduos obesos (MORAN SHANAHAN
2014 SCHWIERTZ et al 2010 ZHANG et al 2009) Duncan et al (2008) avaliaram
a relaccedilatildeo entre IMC perda de peso e a predominacircncia de grupos de bacteacuterias em
amostras fecais de pessoas obesas e natildeo obesas Estes indiviacuteduos foram
submetidos a duas dietas para perda de peso por quatro semanas Natildeo foi
encontrada diferenccedila entre Bacteroidetes nas amostras entre indiviacuteduos obesos e
natildeo obesos No entanto houve reduccedilotildees no grupo de Firmicutes em obesos
submetidos a dietas hipocaloacutericas Em outro estudo realizado por Schwiertz et al
(2010) tambeacutem natildeo foram observadas diferenccedilas nas contagens de Bacteroidetes e
Firmicutes entre os grupos de estudo Xiao et al (2014) em estudo com intervenccedilatildeo
104
dieteacutetica baseada em gratildeos integrais onde analisaram a microbiota intestinal de 123
voluntaacuterios obesos antes e depois da intervenccedilatildeo de 9 semanas seguida por um
periacuteodo de manutenccedilatildeo de 14 semanas tambeacutem natildeo observaram alteraccedilotildees
significativas na abundacircncia de Bacteroidetes e Firmicutes ou na proporccedilatildeo destes
dois filos durante a intervenccedilatildeo dieteacutetica mesmo quando os voluntaacuterios perderam
uma quantidade significativa de peso Estudos recentes do Projeto Microbioma
Humano natildeo encontraram associaccedilatildeo entre a proporccedilatildeo FirmicutesBacteroidetes e
obesidade ou Iacutendice de Massa Corporal (IMC) Nesse sentido tem sido sugerido por
alguns autores que a utilizaccedilatildeo dessa relaccedilatildeo como um biomarcador para a
obesidade permanece incerto devido a variabilidade dos dados na literatura
(FINUCANE et al 2014 MURPHY et al 2010)
Recentemente tem sido proposta uma nova hipoacutetese que associa a
microbiota intestinal com a homeostase metaboacutelica demonstrando-a como uma das
fontes potenciais de inflamaccedilatildeo de baixo grau (ARAKI et al 2005 OKAYASU et al
1990 RAKOFF-NAHOUM 2004 XIAO et al 2014 ZHAO 2013) Nesse contexto
tem sido demonstrado que dietas com alto teor de gordura tambeacutem podem aumentar
as concentraccedilotildees de LPS no plasma de humanos Estudo realizado por Cani et al
(2007) mostrou em camundongos que o maior consumo de gordura levou ao maior
aumento nas concentraccedilotildees de LPS no plasma A absorccedilatildeo de LPS reforccedilada pela
alta ingestatildeo de gordura pode estimular a secreccedilatildeo das citocinas TNF-α e IL-6
resultando em inflamaccedilatildeo sistecircmica de baixo grau dessa forma a microbiota
intestinal pode ter papel ativo na promoccedilatildeo eou inibiccedilatildeo da inflamaccedilatildeo e portanto
um efeito no metabolismo lipiacutedico (FLOCK GREEN KRIS-ETHERTON 2011) Os
resultados do presente estudo natildeo demonstraram diferenccedilas estatisticamente
significantes entre os grupos caso e controle para nenhuma das citocinas avaliadas
No entanto estudos in vitro mostraram que o consumo de aacutecidos graxos saturados
tambeacutem observado no presente estudo em ambos os grupos promovem processo
inflamatoacuterio com aumento da expressatildeo de IL-6 e TNF-α de TLR- 4 e consequente
aumento da ativaccedilatildeo da via NF-kβ (AJUWON SPURLOCK 2005 CALDER et al
2011 WEATHERILL et al 2005) Em estudos experimentais a dieta hiperlipiacutedica
rica em gordura saturada demonstrou promover obesidade com consequente
aumento de peso corporal adiposidade e marcadores inflamatoacuterios (FERNANDEZ-
REAL et al 2003 PEREIRA et al 2012) Esses achados podem explicar o fato de
105
que no presente estudo natildeo foram observadas diferenccedilas estatisticamente
significantes em relaccedilatildeo a liberaccedilatildeo de TNF-α e IL1-β entre os grupos estudados
Em relaccedilatildeo agrave liberaccedilatildeo da citocina IL-17 tambeacutem natildeo foram observadas diferenccedilas
estatisticamente significantes no entanto os achados da literatura teumlm sugerido
que no contexto de disbiose a presenccedila de agentes patogecircnicos pode perturbar a
regulaccedilatildeo do ambiente anti-inflamatoacuterio e que quando patoacutegenos enteacutericos superam
as bacteacuterias comensais o desequiliacutebrio entre comensais e bacteacuterias patogecircnicas
provocam liberaccedilatildeo significativa de MAMPs Este aumento pode induzir IECs DCs e
macroacutefagos ativados a secretar citocinas inflamatoacuterias como a IL-1β IL-6 IL-12 e
IL-23 Estas citocinas estimulam o desenvolvimento de ceacutelulas CD4+ T auxiliares
(T helper-TH1) e ceacutelulas TH17 (produzem IL-17A IL-17F e IL-22) resultando na
inflamaccedilatildeo crocircnica (MAYNARD et al 2012)
O estudo da influecircncia de diferentes elementos da dieta e composiccedilatildeo
corporal sobre a variaccedilatildeo da composiccedilatildeo da microbiota tornou-se uma aacuterea de
crescente interesse cientiacutefico Com efeito a relaccedilatildeo entre a microbiota intestinal e a
obesidade estaacute bastante reconhecida No entanto a participaccedilatildeo dos micro-
organismos da classe dos Mollicutes e alguns mecanismos subjacentes a essas
interaccedilotildees permanecem pouco estudados Em relaccedilatildeo agraves limitaccedilotildees do estudo
deve-se considerar o desenho transversal natildeo sendo possiacutevel estabelecer relaccedilatildeo
de causa e efeito No entanto o estudo mostra-se relevante destacando como
ponto forte o cuidado metodoloacutegico e a relevacircncia dos resultados encontrados
contribuindo para o avanccedilo dos estudos da relaccedilatildeo entre os molicutes microbiota
intestinal e obesidade Nesse contexto a importacircncia e validade de estudos como
este eacute apontar os possiacuteveis fatores de risco que contribuam para obesidade sendo
que a cuidadosa interpretaccedilatildeo dos resultados eacute importante para a geraccedilatildeo de
hipoacuteteses
Nesse contexto uma pesquisa acerca da relaccedilatildeo causa-efeito entre a
microbiota intestinal e a obesidade eacute altamente justificaacutevel uma vez que diferentes
espeacutecies de bacteacuterias podem desempenhar um papel significativo na safra de
energia humana e regulaccedilatildeo do peso corporal Aleacutem disso a consideraccedilatildeo de
fatores de estilo de vida em estudos da microbiota intestinal eacute altamente
recomendada uma vez que mudanccedilas no padratildeo alimentar e atividade fiacutesica podem
influenciar a composiccedilatildeo da microbiota intestinal para o desenvolvimento da
106
obesidade A partir disso o presente estudo fornece evidecircncias de que alteraccedilotildees e
interaccedilotildees na microbiota intestinal possam definir subconjuntos de indiviacuteduos com
diferentes perfis de risco metaboacutelico e assim contribuir para a investigaccedilatildeo da
heterogeneidade associada a fenoacutetipos relacionados com a adiposidade
especialmente em sociedades que estatildeo passando por transformaccedilotildees
socioeconocircmicas tecnoloacutegicas e culturais para um estilo de vida moderno
107
7 CONCLUSOtildeES
Os grupos caso e controle balancearam suas dietas conforme o intervalo de
distribuiccedilatildeo energeacutetica recomendado no entanto foi observado um consumo
de fibras inferior e de gorduras saturadas superior ao recomendado em
ambos os grupos
As mulheres de ambos os grupos apresentaram excesso de gordura corporal
Foi desenvolvido um ensaio de PCR em tempo real especiacutefico sensiacutevel
reprodutiacutevel e quantitativo para a detecccedilatildeo de Mollicutes nas fezes humanas
Foram encontradas associaccedilotildees estatisticamente significantes entre a
presenccedila de Mollicutes e mulheres obesas
Natildeo foram observadas associaccedilotildees estatisticamente significantes em relaccedilatildeo
as meacutedias de consumo dos macronutrientes carboidratos proteiacutenas lipiacutedios e
fibras com a presenccedila de Mollicutes
Natildeo foram observadas diferenccedilas estatisticamente significantes para as
cargas de Firmicutes Bacteroidetes e Bacteacuterias totais entre as mulheres do
grupo caso e controle
A proporccedilatildeo de Firmicutes em relaccedilatildeo aos Bacteroidetes foi maior na
microbiota intestinal das mulheres obesas em relaccedilatildeo agraves eutroacuteficas
Natildeo foi observada diferenccedila estatisticamente significante entre os grupos
caso e controle para nenhuma das citocinas avaliadas
108
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APEcircNDICE A ndash TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
128
Universidade de Satildeo Paulo
Instituto de Ciecircncias Biomeacutedicas
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
ESTUDO Avaliaccedilatildeo da participaccedilatildeo dos microrganismos da Classe Mollicutes na microbiota intestinal de mulheres eutroacuteficas e obesas
Vocecirc estaacute sendo convidado (a) a participar do projeto de pesquisa acima citado O documento
abaixo conteacutem todas as informaccedilotildees necessaacuterias sobre a pesquisa que estamos fazendo Sua
colaboraccedilatildeo neste estudo seraacute de muita importacircncia para noacutes mas se desistir a qualquer momento
isso natildeo causaraacute nenhum prejuiacutezo a vocecirc
Eu _________________________________________________________________ profissatildeo ____________________________
residente e domiciliado na
_______________________________________________________________________________________________________________
______________________________________________________________ portador da Ceacutedula de identidade RG
___________________________ e inscrito no CPFMF______________________________ nascido(a) em _____
_____ _______ abaixo assinado(a) concordo de livre e espontacircnea vontade em participar como
voluntaacuterio(a) do estudo ldquoAvaliaccedilatildeo da participaccedilatildeo dos microrganismos da Classe Mollicutes
na microbiota intestinal de mulheres eutroacuteficas e obesasrdquo Declaro que obtive todas as
informaccedilotildees necessaacuterias bem como todos os eventuais esclarecimentos quanto agraves duacutevidas por
mim apresentadas
Estou ciente que
I) O estudo se faz necessaacuterio para que se possam descobrir as possiacuteveis causas da doenccedila
denominada vaginoses bacterianas a ser estudada no projeto ldquoAvaliaccedilatildeo da
participaccedilatildeo dos microrganismos da Classe Mollicutes na microbiota intestinal de
mulheres eutroacuteficas e obesasrdquo
II) Seratildeo feitas uma coleta de 5ml de sangue e fezes em periacuteodo uacutenico
III) A participaccedilatildeo neste projeto natildeo tem objetivo de me submeter a um tratamento bem
como natildeo me acarretaraacute qualquer despesa financeira com relaccedilatildeo aos procedimentos
meacutedico-cliacutenico-terapecircuticos efetuados no estudo
129
IV) Tenho a liberdade de desistir ou de interromper a colaboraccedilatildeo neste estudo no momento
em que desejar sem necessidade de qualquer explicaccedilatildeo
V) A desistecircncia natildeo causaraacute nenhum prejuiacutezo agrave minha sauacutede ou bem estar fiacutesico Natildeo viraacute
interferir no atendimento ou tratamento meacutedico
VI) Os resultados obtidos durante este ensaio seratildeo mantidos em sigilo mas concordo que
sejam divulgados em publicaccedilotildees cientiacuteficas desde que meus dados pessoais natildeo sejam
mencionados
VII) Caso eu desejar poderei pessoalmente tomar conhecimento dos resultados ao final
desta pesquisa
( ) Desejo conhecer os resultados desta pesquisa
( ) Natildeo desejo conhecer os resultados desta pesquisa
VIII) Concordo que o material possa ser utilizado em outros projetos desde que autorizado
pela Comissatildeo de Eacutetica deste Instituto e pelo responsaacutevel por esta pesquisa Caso minha
manifestaccedilatildeo seja positiva poderei retirar essa autorizaccedilatildeo a qualquer momento sem
qualquer prejuiacutezo para mim
( ) Sim ou ( ) Natildeo
IX ) Poderei contatar a Secretaria da Comissatildeo de Eacutetica em Pesquisa com Seres Humanos ndash
ICBUSP - no Fone 30917733 (e-mail cepicbuspbr) ou (11 3091-7297 jotiuspbr)
para recursos ou reclamaccedilotildees em relaccedilatildeo ao presente estudo
X) O sujeito de pesquisa ou seu representante quando for o caso deveraacute rubricar todas as
folhas do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido ndash TCLE - apondo sua assinatura na uacuteltima
paacutegina do referido Termo
XI) O pesquisador responsaacutevel deveraacute da mesma forma rubricar todas as folhas do Termo de
Consentimento Livre e Esclarecido ndash TCLEndash apondo sua assinatura na uacuteltima paacutegina do
referido Termo
XII) Resoluccedilatildeo 19696 - Estou recebendo uma coacutepia deste Termo de Consentimento Livre e
Esclarecido
Satildeo Paulo___________de________________de 20_____ ( ) Paciente ( ) Responsaacutevel
Testemunha 1 _______________________________________________
Nome RG Telefone
130
Testemunha 2 ___________________________________________________
Nome RG Telefone
Responsaacutevel pelo Projeto _____________________________________________________
PROF DR JORGE TIMENETSKY
131
APEcircNDICE B ndash QUESTIONAacuteRIO
132
UNIVERSIDADE DE SAtildeO PAULO
INSTITUTO DE CIEcircNCIAS BIOMEacuteDICAS
MESTRADO EM MICROBIOLOGIA
Seccedilatildeo 1 IDENTIFICACcedilAtildeO E DADOS PESSOAIS
Nome Idade ID
Telefone Data
Profissatildeo
Estado civil 1 Casada 2 Solteira 3 Mora com companheiro 4 Viuacuteva 5 Divorciada
Raccedilacor 1 Branca 2 Preta 3 Amarela 4 Parda 5 Indiacutegena
Escolaridade 1 Analfabeto 2 1ordm grau incompleto 3 1ordm grau Completo
4 2ordm grau incompleto 5 2ordm grau completo 6 Superior incompleto 7 superior completo
Condiccedilatildeo Socioeconocircmica Indicar aproximadamente a renda domiciliarfamiliar mensal (soma de todos os ganhos
das pessoas que dividem as despesas) (valor SM R$ 67800)
ateacute 1 salaacuterio miacutenimo (ateacute R$ 61800)
1 a 2 salaacuterios miacutenimos (mais de R$ 61800 a R$ 123600)
2 a 5 salaacuterios miacutenimos (mais de R$ 123600 a R$ 309000)
5 a 10 salaacuterios miacutenimos (mais de R$ 309000 a R$ 618000)
mais de 10 salaacuterios miacutenimos (mais de R$ 618000)
Seccedilatildeo 2 HISTOacuteRIA FAMILIAR (parentes de 1ordm grau paternos e maternos e irmatildeos)
1 HAS 2 Diabetes 3 Obesidade 4 Hipercolesterolemia 5 DCV
Seccedilatildeo 3 HISTOacuteRIA CLIacuteNICA
133
Alteraccedilotildees gastrointestinais 1 Constipaccedilatildeo Flatulecircncia 3 Refluxo 4 Azia
5 Ulcera 6 Gastrite 7 Naacuteuseas 8 Vocircmitos
Como o intestino se comporta habitualmente 1 Normal 2 Constipaccedilatildeo 3 Diarreacuteia
Moleacutestia atual 1 HAS 2 Diabetes 3 Obesidade 4 Hipercolesterolemia
5 DCV 6 Dispneacuteia 7 Alteraccedilatildeo Menstrual
Uso de laxantes 1 Sim 2 Natildeo
Seccedilatildeo 4 HISTOacuteRIA OBSTEacuteTRICA
Tipo de parto 1 Normal 2 Cesaacuterea
Foi amamentada 1 Natildeo 2 1 a 3 meses 3 4 a 6 meses 4 7 a 9 meses
5 10 a 12 meses 6 gt12 meses
Teve alguma gestaccedilatildeo 1 Sim 2 Natildeo
Quantos filhos 1 1 a 2 2 3 a 4 3 ge5
Quantos partos foram normais 1 1 a 2 2 3 a 4 3 ge5
Quantos partos foram cesaacuterea 1 1 a 2 2 3 a 4 3 ge5
Tempo de amamentaccedilatildeo dos filhos 1 Natildeo 2 1 a 3 meses 3 4 a 6 meses 4 7 a 9 meses
5 10 a 12 meses 6 gt12 meses
Seccedilatildeo 5 HISTOacuteRIA GINECOLOacuteGICA
Usou ou estaacute usando algum anticoncepcional (adesivo piacutelula anel vaginal DIU de hormocircnio injetaacutevel ou
bastatildeo subcutacircneo) 1 Sim 2 Natildeo
Com que idade comeccedilou a tomar
Parou de usar por algum tempo
Por quanto tempo parou
Seccedilatildeo 6 CONSUMO DE TABACO
134
Jaacute fumou mais de 20 maccedilos de cigarro (cachimbo ou charuto) em toda sua vida
1 Natildeo 2 Sim e fumo atualmente 3 Sim mas parei de fumar 4 Natildeo sabe natildeo informa
Se fumafumou o faz haacute quanto tempo
Quantos cigarros em meacutedia fumafumava por dia
____cigarros
____cachimbos
____charutos
Se parou de fumar haacute quanto tempo ocorreu
Seccedilatildeo 7 CONSUMO DE AacuteLCOOL
Etilista 1 Sim 2 Natildeo
Frequencia de ingestatildeo
Tipo de bebida ingerida
Haacute quanto tempo ingere
Seccedilatildeo 8 ATIVIDADE FIacuteSICA (IPAQ versatildeo curta)
As perguntas estatildeo relacionadas ao tempo que vocecirc gasta fazendo atividade fiacutesica na UacuteLTIMA
semana As perguntas incluem as atividades que vocecirc faz no trabalho para ir de um lugar a outro
por lazer por esporte por exerciacutecio ou como parte das suas atividades em casa ou no jardim
Para responder as questotildees lembre que
atividades fiacutesicas VIGOROSAS satildeo aquelas que precisam de um grande esforccedilo fiacutesico e que fazem respirar MUITO mais forte que o normal
atividades fiacutesicas MODERADAS satildeo aquelas que precisam de algum esforccedilo fiacutesico e que fazem respirar UM POUCO mais forte que o normal
Para responder as perguntas pense somente nas atividades que vocecirc realiza por pelo menos 10
minutos contiacutenuos de cada vez
135
1a Em quantos dias da uacuteltima semana vocecirc caminhou por pelo menos 10 minutos contiacutenuos em casa
ou no trabalho como forma de transporte para ir de um lugar para outro por lazer por prazer ou
como forma de exerciacutecio dias _____ por SEMANA ( ) Nenhum
1b Nos dias em que vocecirc caminhou por pelo menos 10 minutos contiacutenuos quanto tempo no total
vocecirc gastou caminhando por dia horas ______ Minutos _____
2a Em quantos dias da uacuteltima semana vocecirc realizou atividades MODERADAS por pelo menos 10
minutos contiacutenuos como por exemplo pedalar leve na bicicleta nadar danccedilar fazer ginaacutestica
aeroacutebica leve jogar volei recreativo carregar pesos leves fazer serviccedilos domeacutesticos na casa no
quintal ou no jardim como varrer aspirar cuidar do jardim ou qualquer atividade que fez aumentar
moderadamente sua respiraccedilatildeo ou batimentos do coraccedilatildeo (POR FAVOR NAtildeO INCLUA CAMINHADA)
dias _____ por SEMANA ( ) Nenhum
2b Nos dias em que vocecirc fez essas atividades moderadas por pelo menos 10 minutos contiacutenuos
quanto tempo no total vocecirc gastou fazendo essas atividades por dia
horas ______ Minutos _____
3a Em quantos dias da uacuteltima semana vocecirc realizou atividades VIGOROSAS por pelo menos 10
minutos contiacutenuos como por exemplo correr fazer ginaacutestica aeroacutebica jogar futebol pedalar raacutepido
na bicicleta jogar basquete fazer serviccedilos domeacutesticos pesados em casa no quintal ou cavoucar no
jardim carregar pesos elevados ou qualquer atividade que fez aumentar MUITO sua respiraccedilatildeo ou
batimentos do coraccedilatildeo dias _____ por SEMANA ( ) Nenhum
3b Nos dias em que vocecirc fez essas atividades vigorosas por pelo menos 10 minutos contiacutenuos quanto
tempo no total vocecirc gastou fazendo essas atividades por dia
horas ______ Minutos _____
Seccedilatildeo 9 HAacuteBITOS ALIMENTARES
Vocecirc mudou seus haacutebitos alimentares recentemente ou estaacute fazendo dieta para emagrecer ou por qualquer
outro motivo
1 Natildeo 5 Sim para reduccedilatildeo de sal
2 Sim para perda de peso 6 Sim para reduccedilatildeo de colesterol
3 Sim por orientaccedilatildeo meacutedica
136
4 Sim para dieta vegetariana ou reduccedilatildeo do consumo de carne
Vocecirc estaacute tomando algo para suplementar sua dieta (vitaminas minerais e outros produtos)
1 Natildeo 2 Sim regularmente 3 Sim mas natildeo regularmente
Se a resposta da pergunta anterior for sim favor preencher o quadro abaixo
Suplemento
Nome comercial Dose
Frequencia
Nuacutemero de refeiccedilotildees que costuma fazer por dia
Costuma fazer desjejum diariamente 1 Sim 2 Natildeo
Costuma beliscar entre as refeiccedilotildees 1 Sim 2 Natildeo
Costuma ingerir liacutequidos durante as refeiccedilotildees 1 Sim 2 Natildeo
Quantas refeiccedilotildees costuma fazer fora de casa por semana
Em que local costuma fazer as refeiccedilotildees fora de casa
1 Restaurantes 5 Natildeo faz
2 Lanches raacutepidos 6 Outro
3 Marmita
4 No trabalho
137
As questotildees seguintes relacionam-se ao seu haacutebito alimentar usual no PERIacuteODO DE UM ANO Para cada quadro responda por favor a frequecircncia que melhor descreva QUANTAS VEZES vocecirc costuma comer cada item e a respectiva UNIDADE DE TEMPO (se por dia por semana por mecircs ou no ano) Depois responda qual a sua PORCcedilAtildeO INDIVIDUAL USUAL em relaccedilatildeo agrave porccedilatildeo meacutedia indicada ESCOLHA SOMENTE UM CIacuteRCULO PARA CADA COLUNA Muitos grupos de alimentos incluem exemplos Eles satildeo sugestotildees e vocecirc pode pode consumir todos os itens indicados Se vocecirc natildeo come ou raramente come um determinado iacutetem preeencha o ciacuterculo da primeira coluna (N=nunca come) NAtildeO DEIXE ITENS EM BRANCO
138
139
140
141
Por favor liste qualquer outro alimento ou preparaccedilatildeo importante que vocecirc costuma comer ou beber pelo menos UMA VEZ POR SEMANA que natildeo foram citados aqui (por exemplo leite-de-coco outros tipos de carnes receitas caseiras creme de leite leite condensado gelatina e outros doces etc )
Alimento Frequecircncia por semana Quantidade Consumida
Quando vocecirc come carne bovina ou suiacutena vocecirc costuma comer a gordura visiacutevel 1 nunca ou raramente 2 algumas vezes 3 sempre 4 natildeo sabe Quando vocecirc come frango ou peru vocecirc costuma comer a pele 1 nunca ou raramente 2 algumas vezes 3 sempre 4 natildeo sabe
142
Seccedilatildeo 10 DADOS ANTROPOMEacuteTRICOS
Peso
_____________Kg
_____________Kg
Estatura
_____________m
_____________m
IMC
__________Calcular IMC= peso em Kg altura em m2
Circunferecircncia Abdominal
_____________cm
_____________cm
Reactacircncia
Resistecircncia ___________MG
_____________MLG
Peso MG_________kg
Peso MGL_________kg
TMB __________
aacutegua de massa magra
143
APEcircNDICE C- TABELA 10
144
Tabela 10 Participaccedilatildeo dos alimentos nos grupos meacutedias de consumo por dia dos alimentos consumidos pela populaccedilatildeo estudada Satildeo Paulo SP 2013-2014
Grupo Alimentar
Alimentos Grupo Frequecircncia diaacuteria (dp)
Frequecircncia diaacuteria (amplitude)
Massas
Macarratildeo com molho sem carne
Caso
02 (05)
(0-25)
Controle
02 (02) (0-043)
Macarratildeo com molho com carne lasanha nhoque
Caso 01 (012) (0-043)
Controle
02 (02) (0-079)
Pizza panqueca
Caso 015 (022) (0-1)
Controle 02 (01) (003-043)
Preparaccedilatildeo
Sopas
Caso 015 (018) (0-043)
Controle 014 (02) (0-043)
Polenta cozida ou frita
Caso 003 (005) (0-014)
Controle 0008 (003) (0-014)
Carne vermelha e
ovos
Carne bovina
Caso 06 (06) (008-25)
Controle 05 (018) (014-079)
Carne de porco Caso 008 (009) (0-043)
Controle 02 (05) (0-25)
Carne seca carne do sol bacon
Caso 006 (005) (0-014)
Controle 004 (006) (0-014)
Ovos Caso 02 (02) (0-1)
Controle 03 (05) (0-25)
Embutidos
Linguiccedila
Caso 011 (009) (0-043)
Controle 02 (05) (0-25)
Embutidos (presunto mortadela salsicha)
Caso 015 (023) (0-1)
Controle 02 (02) (0-043)
Carne branca
Frango Caso 06 (09) (003-3)
Controle 05 (05) (014-25)
Peixe e frutos do mar Caso 01 (01) (0-043)
Controle 01 (02) (0-043)
Leite e derivados
Leite integral Caso 07 (09) (0-3)
Controle 04 (06) (0-25)
Leite desnatado Caso 04 (09) (0-3)
Controle 002 (005) (0-014)
Leite semi-desnatado Caso 03 (08) (0-25)
Controle 0004 (002) (0-008)
Iogurte natural Caso 05 (09) (0-25)
Controle 03 (03) (0-079)
Iogurte com frutas Caso 03 (08) (0-25)
Controle 02 (02) (0-079)
145
Tabela 10 Participaccedilatildeo dos alimentos nos grupos meacutedias de consumo ao dia dos alimentos consumidos pela populaccedilatildeo estudada Satildeo Paulo SP 2013-2014
(Continuaccedilatildeo)
Grupo Alimentar
Alimentos Grupo Frequecircncia diaacuteria (dp)
Frequecircncia diaacuteria
(amplitude)
Leite e derivados
Queijo mussarela prato parmesatildeo e provolone
Caso 05 (07) (0-25)
Controle 05 (06) (003-25)
Queijo minas e ricota Caso 04 (08) (0-25)
Controle 04 (06) (0-25)
Leguminosas
Feijatildeo Caso 12 (09) (014-25)
Controle 06 (05) (008-25)
Lentilha ervilha seca gratildeo de bico soja
Caso 005 (009) (0-043)
Controle 006 (01) (0-043)
Feijatildeo tropeiro e feijoada
Caso 003 (003) (0-014)
Controle 002 (004) (0-014)
Cereais raiacutezes e
tubeacuterculos
Arroz branco ou integral cozido com
oacuteleo e temperos
Caso 15 (09) (043-25)
Controle 14 (07) (043-25)
Batata frita ou mandioca frita
Caso 007 (01) (0-043)
Controle 02 (01) (003-043)
Batata mandioca inhame (cozida ou assada) purecirc
Caso 01 (012) (0-043)
Controle 02 (02) (0-043)
Farinha de mandioca farofa cuscuz aveia tapioca
Caso 02 (03) (0-1)
Controle 01 (02) (0-1)
Patildeo francecircs patildeo de forma integral patildeo doce torrada
Caso 07 (06) (014-3)
Controle 17 (08) (0-25)
Biscoito sem recheio (doce salgado) Caso 04 (06) (0-25)
Controle 05 (06) (0-25)
Biscoito recheado waffer amanteigado
Caso 01 (03) (0-1)
Controle 009 (02) (0-043)
Bolo (simples recheado) Caso 01 (013) (0-043)
Controle 01 (013) (0-043)
Hortaliccedilas
Alface
Caso 12 (09) (008-3)
Controle 08 (06) (014-25)
Tomate Caso 14 (107) (008-3)
Controle 08 (06) (003-25)
Cenoura Caso 06 (07) (008-25)
Controle 04 (02) (0-1)
Outros legumes (abobrinha berinjela chuchu pepino)
Caso 04 (03) (008-1)
Controle 05 (07) (0-25)
Outras verduras cruas (acelga ruacutecula agriatildeo)
Caso 04 (03) (008-1)
Controle 04 (02) (0-1)
146
Tabela 10 Participaccedilatildeo dos alimentos nos grupos meacutedias de consumo ao dia dos alimentos consumidos pela populaccedilatildeo estudada Satildeo Paulo SP 2013-2014
(Continuaccedilatildeo)
Grupo Alimentar Alimentos Grupo Frequecircncia diaacuteria (dp)
Frequecircncia diaacuteria
(amplitude)
Hortaliccedilas
Outras verduras cozidas (acelga espinafre escarola couve)
Caso 03 (02) (0-1)
Controle 03 (02) (0-079)
Broacutecolis couve-flor repolho Caso 02 (015) (0-043)
Controle 03 (03) (0-1)
Frutas
Laranja mexerica abacaxi Caso 08 (09) (0-3)
Controle 04 (05) (003-25)
Banana Caso 08 (09) (0-3)
Controle 04 (02) (008-1)
Maccedilatilde pecircra Caso 05 (07) (0-3)
Controle 03 (03) (0-1)
Melatildeo melancia Caso 03 (07) (0-1)
Controle 01 (01) (0-043)
Mamatildeo Caso 03 (03) (0-1)
Controle 008 (006) (0-014)
Goiaba Caso 01 (02) (0-1)
Controle 0008 (002) (0-008)
Abacate Caso 08 (02) (0-1)
Controle 007 (001) (0-003)
Suco natural Caso 07 (09) (0-3)
Controle 03 (02) (0-1)
Industrializados
Maionese molho para salada patecirc chantily
Caso 01 (016) (0-043)
Controle 01 (02) (0-1)
Condimentos
Caso 04 (06) (0-25)
Controle 02 (03) (0-079)
Hamburguer nuggets almocircndega Caso 006 (009) (0-043)
Controle 005 (009) (0-043)
Suco industrializado Caso 08 (105) (0-3)
Controle 05 (03) (0-1)
Refrigerante comum Caso 02 (02) (0-079)
Controle 02 (02) (0-043)
Refrigerante light diet Caso 0 0
Controle 007 (02) (0-043)
147
Tabela 10 Participaccedilatildeo dos alimentos nos grupos meacutedias de consumo ao dia dos alimentos consumidos pela populaccedilatildeo estudada Satildeo Paulo SP 2013-2014
(Continuaccedilatildeo)
Grupo Alimentar Alimentos Grupo Frequecircncia diaacuteria (dp)
Frequecircncia diaacuteria
(amplitude)
Infusatildeo
Chaacute e cafeacute sem accediluacutecar Caso 09 (1) (0-25)
Controle 06 (07) (0-25)
Chaacute e cafeacute com accediluacutecar Caso 08 (08) (0-25)
Controle 07 (08) (0-3)
Bebida alcooacutelica
Cerveja
Caso 003 (005) (0-014)
Controle 0074 (01) (0-043)
Oacuteleos e gorduras
Oacuteleo azeite ou vinagre para tempero de salada
Caso 1 (09) (0-25)
Controle 03 (03) (0-1)
Manteiga ou margarina comum Caso 09 (09) (0-25)
Controle 07 (07) (0-25)
Manteiga ou margarina light Caso 02 (06) (0-25)
Controle 007 (003) (0-014)
Lanches
Salgado frito Caso 02 (03) (0-1)
Controle 01 (01) (0-043)
Salgado assado Caso 014 (02) (0-1)
Controle 02 (02) (0-043)
Sanduiche Caso 006 (009) (0-043)
Controle 005 (004) (0-014)
Accediluacutecar e doces
Chocolate bombom brigadeiro Caso 04 (04) (0-1)
Controle 06 (04) (003-2)
Achocolatado em poacute (adicionado ao leite)
Caso 013 (03) (0-1)
Controle 02 (03) (0-1)
Sobremesas doces tortas e pudins
Caso 02 (03) (0-1)
Controle 03 (03) (003-1)
Accediluacutecar mel e geleacuteia Caso 05 (07) (0-3)
Controle 08 (1) (0-3)
AGRADECIMENTO ESPECIAL
Agrave Fundaccedilatildeo de Amparo agrave Pesquisa do Estado de Satildeo Paulo (FAPESP) agrave Fundaccedilatildeo de
Amparo agrave Pesquisa do Estado da Bahia (FAPESB) e agrave Coordenaccedilatildeo de
Aperfeiccediloamento de Pessoal de Niacutevel Superior (Capes) pelo apoio financeiro sem o
qual este estudo natildeo seria realizado
AGRADECIMENTOS
Agrave Deus e todos meus espiacuteritos de luz em vida e desencarnados por tudo que me
representam por me permitirem cruzar essa jornada com sabedoria resignaccedilatildeo feacute e
discernimento e por me mostrarem que os ldquoSinais seguem o que creemrdquo Ofereccedilo
Agrave melhor matildee que Deus poderia me permitir nascer que me mostrou a vida e me
ensinou os verdadeiros valores de amor perdatildeo caridade humildade e perseveranccedila
aleacutem de me mostrar que as barreiras da vida satildeo transponiacuteveis e que na verdade
devem ser encaradas como fronteiras Obrigada por continuar olhando por mim e me
incentivando mesmo de outro plano espiritual Sem o seu amor tudo isso seria
impossiacutevel A ti dedico
Agrave meu pai Oriston meu exemplo de vida e companheiro fiel por entender o meu
propoacutesito e me apoiar mesmo nas dificuldades Vocecirc me ensina mais a cada dia sobre
a leveza da vida e em como me tornar uma pessoa melhor uma filha melhor obrigada
Agrave meu irmatildeo Breno e minha cunhada Ariela pelo apoio e por me permitir ser a tia mais
feliz e amada desse mundo
Aos meus sobrinhos queridos Lulu Lis e Miguel por me mostrarem a pureza da vida e
do amor em sua essecircncia mais pura
Agrave Evinha minha ldquomatildee adotivardquo desde os meus 2 dias de vida por todo amor e
dedicaccedilatildeo Minha gratidatildeo seraacute eterna
Ao professor Jorge Timenetsky meu querido orientador por ter aceitado me orientar
natildeo soacute no planejamento e execuccedilatildeo do trabalho mas tambeacutem na vida Minha sincera
gratidatildeo pela orientaccedilatildeo dedicaccedilatildeo e competecircncia profissional
Ao professor Lucas meu mentor na vida e no trabalho pai matildee amigo e eterno
orientador Obrigada Marques por ter acreditado que essa semente um dia iria brotar
Sem o seu apoio e incentivo eu realmente natildeo conseguiria Ter vocecirc em meu caminho
eacute uma honra e um previleacutegio
Agrave Aricelma um dos maiores presentes que pude receber em minha trajetoacuteria pelo
amor conselhos carinhos e abraccedilos Vocecirc foi fundamental para eu me manter firme no
propoacutesito
Ao departamento de endocrinologia do HC-FMUSP e aos professores Alfredo Halpern e
Marcio Mancinni por abrirem as portas para a realizaccedilatildeo das coletas e por acreditarem
no trabalho
Aos funcionaacuterios do departamento de endocrinologia da HC-FMUSP sem os quais
seria inviaacutevel a realizaccedilatildeo das coletas
Aos pacientes por participarem deste estudo e me permitir aprender mais a cada
coleta
Ao professor Djanilson pelo auxiacutelio nas anaacutelises estatiacutesticas e por me apresentar
Jerusa um verdadeiro anjo sem a qual seria inviaacutevel as anaacutelises de consumo
alimentar
Agrave amiga e companheira de trajetoacuteria Aline Teixeira pela preciosa colaboraccedilatildeo nas
anaacutelises estatiacutesticas e por ser minha dupla imbatiacutevel
Ao amigo-irmatildeo Filipe Bezerra pela preciosa contribuiccedilatildeo nas adaptaccedilotildees das
ilustraccedilotildees e pela honra de sua amizade
Ao melhor grupo de pesquisa que jaacute sonhei fazer parte pelos ensinamentos e amizade
incondicional Juntos somos uma famiacutelia obrigada meus amigos
Agrave todos os amigos que passaram pelo aptdeg 63 ao longo desses anos vocecircs foram
fundamentais em todos os momentos dessa jornada
Aos funcionaacuterios do ICB II indispensaacuteveis no meu dia a dia pelo apoio amizade cafeacutes
e carinho
Agrave meus amigos-irmatildeos e suas respectivas famiacutelias por me ensinarem que amizade eacute o
sentimento que imanta as almas suave expressatildeo do ser que necessita intercambiar as
forccedilas da emoccedilatildeo sob os estiacutemulos do entendimento fraternal inspiradora de coragem
e de abnegaccedilatildeo que enfloresce as almas abenccediloando-as com resistecircncias para as
lutas Amo vocecircs gratidatildeo
Agrave todos que cruzaram meu caminho nesta jornada e que trouxeram consigo
ensinamentos que me transformaram em algueacutem melhor que outrora o meu muito
obrigada
Soacute o conhecimento vivido
O conhecimento de dentro para fora
Aquele que natildeo eacute aprendido nos livros nem na fria observaccedilatildeo
do fino repoacuterter de faro infaliacutevel
Soacute aquele conhecimento que se viveu dia a dia minuto a minuto
no erro e no acerto ()
Possibilita a criaccedilatildeo
Jorge Amado
18
RESUMO
SANTOS V M Avaliaccedilatildeo da participaccedilatildeo dos micro-organismos da Classe Mollicutes na microbiota intestinal de mulheres eutroacuteficas e obesas 2015 147 f Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Microbiologia) ndash Instituto de Ciecircncias Biomeacutedicas Universidade de Satildeo Paulo Satildeo Paulo 2015
A obesidade possui causas multifatoriais sendo caracterizada como um excesso de gordura
corporal acumulada no tecido adiposo causando impactos agrave sauacutede Estudos quanto agrave interaccedilatildeo
geneacutetica do indiviacuteduo com o ambiente mostram que alguns indiviacuteduos satildeo mais propensos ao ganho
de peso do que os outros em ambientes similares Satildeo muitas as evidecircncias de que o metabolismo
da microbiota intestinal facilita a extraccedilatildeo de calorias da dieta ajudam a estocaacute-las no tecido
adiposo aleacutem de prover energia e nutrientes para o crescimento microbiano Nesse contexto a
ocorrecircncia e participaccedilatildeo dos Mollicutes na microbiota intestinal eacute praticamente desconhecida
sendo necessaacuterios portanto o desenvolvimento de estudos que avaliem as implicaccedilotildees e
relevacircncia desses microrganismos nas respostas adaptativas da microbiota intestinal humana
Deste modo o objetivo do presente estudo foi analisar a participaccedilatildeo dos micro-organismos da
Classe Mollicutes e dos Filos Firmicutes e Bacteroidetes na microbiota intestinal de mulheres
obesas e eutroacuteficas Para a realizaccedilatildeo do estudo a casuiacutestica foi de 20 mulheres diagnosticadas
com obesidade (IMCgt 30kgm2) e 20 mulheres em eutrofia (IMC entre 185 e 249 kgm2 Foram
obtidas amostras de fezes sangue Foi aplicado um questionaacuterio semiestruturado sobre fatores
relacionados com obesidade e possiacutevel associaccedilatildeo com microbiota intestinal e ambiente aleacutem de
avaliaccedilatildeo antropomeacutetrica atraveacutes de Bioimpedacircncia e questionaacuterio de frequecircncia alimentar
Desenvolveu-se um ensaio quantitativo por meio de TaqMan PCR para a detecccedilatildeo de Mollicutes
nas amostras de fezes A metodologia foi especiacutefica sensiacutevel reprodutiacutevel e gerou dados
quantitativos para a detecccedilatildeo desses microrganismos nas fezes humanas Constatou-se no
presente estudo que o grupo caso apresentou consumo energeacutetico inferior ao recomendado e que
ambos os grupos apresentaram consumo superior de gorduras saturadas e inferior de fibras Em
relaccedilatildeo a determinaccedilatildeo do estado nutricional os dois grupos se apresentaram acima da meacutedia
referecircncia indicando excesso de gordura corporal Na determinaccedilatildeo da microbiota intestinal
constatou-se uma diferenccedila estatisticamente significante entre as meacutedias do nuacutemero dos micro-
organismos da classe Mollicutes entre os grupos caso e controle Detectou-se uma associaccedilatildeo
positiva estatisticamente significante entre a presenccedila de Mollicutes e mulheres obesas (OR= 115
IC= 242-554) Na quantificaccedilatildeo da presenccedila dos Filos Firmicutes e Bacteroidetes e Bacteacuterias
totais na microbiota natildeo foram observadas diferenccedilas estatisticamente significantes quanto a sua
quantidade entre as mulheres do grupo caso e controle No entanto foi observada maior proporccedilatildeo
de FirmicutesBacteroidetes na microbiota intestinal das mulheres obesas em relaccedilatildeo agraves eutroacuteficas
do grupo controle Os resultados obtidos permitiram obter evidecircncias importantes da participaccedilatildeo
dos micro-organismos da classe Mollicutes As alteraccedilotildees da microbiota intestinal tambeacutem
contribuiacuteram na definiccedilatildeo de subconjuntos de indiviacuteduos com diferentes perfis de risco metaboacutelico e
a da heterogeneidade associada a fenoacutetipos humanos relacionados com a adiposidade
Palavras-chave Obesidade Microbiota intestinal Mollicutes qPCR
ABSTRACT
SANTOS V M Evaluation of Mollicutes microorganismrsquos participation in the gut microbiota of obese and normal weight women 2015 147 p Masters thesis (Microbiology) ndash Instituto de Ciecircncias Biomeacutedicas Universidade de Satildeo Paulo Satildeo Paulo 2015
Obesity has multifactorial causes and it is characterized as an excess of corporal fat accumulated in adipose tissue causing health impacts Studies on the genetic interaction of the individual with the environment shows that some individuals are more prone to weight gain than others in similar environments There are many evidences that the gut microbiota metabolism facilitates the harvest of energy derived from ingested nutrients it help to store them in adipose tissue and provide energy and nutrients for microbial growth In this context the occurrence and participation of Mollicutes in the gut microbiota is pratically unknown requiring the development of studies to evaluate the implications and relevance of these microorganisms in the adaptive responses of the human gut microbiota Thus the aim of this study was to analyze the participation of the Class Mollicutes and Firmicutes and Bacteroidetes phylos in the gut microbiota of obese and normal weight women For the study it was collected samples of 20 women diagnosed with obesity (BMIgt 30 kg m2) and 20 women of normal weight (BMI between 185 and 249 kg m2) it was collected stool samples blood semi-structured questionnaire on etiological factors predisposing and associated with obesity and possible association with gut microbiota and the environment and anthropometric measurements using bioelectrical impedance A quantitative assay was developed through of TaqMan PCR for the detection of Mollicutes in stool samples from patients with the methodology specific sensitive reproducible and quantitative for the detection of these microorganisms in human stools It was found in this study that the case group had a lower energy consumption than recommended and that both groups had a higher intake of saturated fats and less fiber For determining the nutritional status of the two groups presented above average reference indicating excess body fat Regarding the determination of the intestinal microbiota of the study population there was a statistically significant difference between the mean of microorganisms of Mollicutes class between the case and control groups And it was detected a statistically significant positive association between the presence of Mollicutes and obese women (OR = 115 CI = 242 to 554) Regarding the analysis about the participation of phylos Firmicutes and Bacteroidetes and total bacteria in the microbiota of the study population no statistically significant differences observed for the microbial amount among women of the case and control group However there was a higher proportion of Firmicutes Bacteroidetes the gut microbiota of obese women compared to the control group normal weight women Analysis of the results provide important evidence about the participation of almost unknown Mollicutes class in the gut microbiota of the population studied as well as changes and interactions in intestinal microbiota can define subsets of individuals with different metabolic risk profiles and thus contribute to investigation of the heterogeneity associated phenotypes related to adiposity
Keywords Obesity Gut microbiota Mollicutes qPCR
LISTA DE ABREVIATURAS SIGLAS E SIacuteMBOLOS
A ndash Adenina
AEAndash N-araquidonoil etanolamina anandamida
AFndash Niacutevel de atividade fiacutesica
AGCCndash Aacutecidos graxos de cadeia curta
AgRPndash Peptiacutedeo Relacionado ao Agouti
AIDSndash Siacutendrome da imunodeficiecircncia adquirida
AIndash Adequate Intake
AMPndash Adenosina monofosfato
AMPKndash Adenosina proteiacutena quinase
AMPsndash Peptiacutedeos antimicrobianos bacterianos
APC ndash Ceacutelula apresentadora de antiacutegeno
APRILLndash Ligante indutor de proliferaccedilatildeo
atm ndash Atmosfera
ATP ndash Adenosina tri-fosfato
C ndash Citosina
C+G ndash Conteuacutedo citosina e guanina
Cb-1ndash Receptores canabinoacuteides
CCKndash Colecistocinina
CH4ndash Metano
CHOsndash Carboidratos
ChREBP ndash Carbohydrate response element-binding protein
CO2 ndash Gaacutes carbocircnico
CPT1ndash Carnitina palmitoil transferase 1
Ct ndash Cycle Treshold (Sinal de fluorescecircncia que pode ser
detectado)
CV ndash Coeficiente de variaccedilatildeo
DAG lipasendash sn-1-diacilglicerol lipase seletiva
DCs ndash Ceacutelulas Dendriacuteticas
DNA ndash Aacutecido Desoxirribonucleico
DRI ndash Dietary References Intakes
DP ndash Desvio padratildeo
dNTP ndash Deoxinucleotiacutedeo trifosfato
EAR ndash Estimated Average Requirements
EDTA ndash Aacutecido Etilenodiamino Tetra-aceacutetico
ELISA ndash Enzyme-Linked Immunoabsorbent Assay
EIndash Enzimas citoplasmaacuteticas do sistema PTS
EPIndash Equipamento de Proteccedilatildeo Individual
EROndash Espeacutecies reativas de oxigecircnio
FAAHndash Fatty acid amide hydrolase
FABFndash Fator de ativaccedilatildeo de ceacutelulas β
FFARndash Free fatty acids receptors
FIAFndash Fasting Induced Adipocyte Factor
g ndash Gramas
G ndash Guanina
GERndash Gasto energeacutetico de repouso
GETndash Gasto energeacutetico total
GLP-1ndash Peptiacutedeo semelhante ao glucagon
GPRndash Receptor acoplado agrave proteiacutena G
H2ndash Hidrogecircnio
HDLndash Lipoproteiacutena de alta densidade
HPRndash Enzimas citoplasmaacuteticas do sistema PTS
IBGEndash Instituto brasileiro de Geografia e Estatiacutestica
IC ndash Intervalo de Confianccedila
IECsndash Ceacutelulas epiteliais intestinais)
IFN-α ndash Interferon α
IFN-β ndash Interferon β
IFN-γ ndash Interferon gama
IgA ndash Imunoglobulina A
IL ndash Interleucina
IL-10 ndash Interleucina 10
IL-1β ndash Interleucina 1Beta
IL-25 ndash Interleucina 25
IL-33 ndash Interleucina 33
IL-6 ndash Interleucina 6
IMC ndash Iacutendice de massa corporal
IPAQ ndash International Physical Activity Questionnaire
kgndash Quilogramas
Kpb ndash Kilopares de bases
LPLndash Lipase lipoproteacuteica
LPSndash Lipopolissacariacutedeos
MAGndash Monoacilglicerol lipase
MAMPsndash Padrotildees moleculares associados agrave micro-organismos
MC4R ndash Receptor da Melanocortina 4
MDa ndash Megadaltons
mg ndash Miligramas
min ndash Minuto
mL ndash Mililitro
mm ndash Miliacutemetro
mM ndash Milimolar
mRNAndash RNA mensageiro
MSndash Ministeacuterio da Sauacutede
NAPE-PLDndash N-acil fostatidiletanolamida-fosfolipase D seletiva
NF-KBndash Fator nuclear Kappa B
NK ndash Natural Killers
nm ndash Nanocircmetro
NODndash Receptores de domiacutenio de digomerizaccedilatildeo de ligaccedilatildeo de
nucleotiacutedeos
NPYndash Neuropeptiacutedeo Y
ordm C ndash Graus Celsius
OMS (WHO) ndash Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede
OR ndash Odds Ratio
pb ndash Pares de base
PC1 ndash Proacute-hormocircnio Convertase 1
PCR ndash Reaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase
PGC-1ndash Peroxisome proliferator-activated receptor-gamma
coactivator 1 alpha
PGCndash Porcentagem de gordura corporal
pH ndash Potencial de hidrogecircnio iocircnico
pmol ndash Picomol
POFndash Pesquisa dos Orccedilamentos Familiares
POMCndash Proacute-oacutepio melanocortina
PPARndash Receptor Ativado por Proliferadores de Peroxissoma
PPI ndash Perda de peso intencional
PPLO ndash Pleuropneumonia-like Organisms
PTSndash Sistema fosfotransferase
PYYndash Peptiacutedeo tirosina-tirosina
QFAndash Questionaacuterio de frequecircncia alimentar
qPCR ndash PCR quantitativa ou PCR em tempo real
r2 ndash R da curva
RA ndash Aacutecido retinoacuteico
RCQndash Relaccedilatildeo cintura-quadril
REGIIIβndash Proteiacutenas antimicrobianas intestinais
REGIIIγndash Proteiacutenas antimicrobianas intestinais
RNA ndash Aacutecido ribonucleacuteico
rpm ndash Rotaccedilotildees por minuto
rRNA ndash RNA ribossocircmico
s ndash Segundo
SNCndash Sistema nervoso central
SREBP-1ndash Liver sterol response element binding protein type-1
SOCS-1 ndash Proteiacutenas supressora da sinalizaccedilatildeo de citocina-1
SOCS-3 ndash Proteiacutenas supressora da sinalizaccedilatildeo de citocina-3
T ndash Timina
TAndash Tecido adiposo
TCLE ndash Termo de Consentimento Livre e Esclarecido
TGF-β ndash Fator de crescimento tumoral-β
TGIndash Trato gastrintestinal
TLR ndash Toll-like receptor
TMndash Tecido muscular
TMBndash Taxa de metabolismo basal
TNF-α ndash Fator de Necrose Tumoral alfa
Tregndash Ceacutelulas T regulatoacuterias
tRNA ndash RNA transportador
TSLPndash Linfopoietina estromal tiacutemica
U ndash Unidade
UFC ndash Unidade Formadora de Colocircnia
UFCmicroL ndash Unidade Formadora de Colocircnia por microlitro
USDAndash United States Departament of Agriculture
VETndash Valor energeacutetico Total
X ndash Vezes
ZO-1ndash Zocircnula de oclusatildeo-1
α ndash Alfa
β ndash Beta
χ2 ndash Teste Qui-quadrado
ndash Por cento
microL ndash Microlitro
microm ndash Microcircmetros
microms ndash Microcircmetros por segundo
2-AGndash 2-araquidonoil glicerol
IacuteNDICE DE FIGURAS
Figura 1 ndash Fatores envolvidos no estabelecimento da microbiota humana ao longo da
vida 37
Figura 2 ndash Interaccedilatildeo funcional entre a microbiota intestinal humana e o sistema
imunoloacutegico 42
Figura 3 ndash Doenccedilas influenciadas pelo metabolismo microbiano
intestinal46
Figura 4 ndash Crescimento de M hominis em meio SP4 com a produccedilatildeo de colocircnia em
forma de ldquoovo fritordquo (aumento 40X) 55
Figura 5 ndash Comparaccedilatildeo entre as meacutedias de consumo de macronutrientes dos Grupos
Caso e Controle com a Faixa de Distribuiccedilatildeo Aceitaacutevel de macronutrientes (AMDRDRI)
e AI (Adequate Intake) para a faixa etaacuteria de 20 a 70 anos Satildeo Paulo SP 2013-
201484
Figura 6 ndash Comparaccedilatildeo entre as meacutedias de consumo das Vitaminas A C E e folato
dos Grupos Caso e Controle com a Faixa de Distribuiccedilatildeo Aceitaacutevel de macronutrientes
(AMDRDRI) e AI (Adequate Intake) para a faixa etaacuteria de 20 a 70 anos Satildeo Paulo
SP 2013-201485
Figura 7 ndash Comparaccedilatildeo entre as meacutedias de consumo das Vitaminas B1 B2 B6 B12
D Niacina e Aacutecido pantotecircnico dos Grupos Caso e Controle com a Faixa de
Distribuiccedilatildeo Aceitaacutevel de macronutrientes (AMDRDRI)e AI (Adequate Intake) para a
faixa etaacuteria de 20 a 70 anos Satildeo Paulo SP 2013-201486
Figura 8 ndash Comparaccedilatildeo entre as meacutedias de consumo de Sais Minerais dos Grupos
Caso e Controle com a Faixa de Distribuiccedilatildeo Aceitaacutevel de macronutrientes
(AMDRDRI)e AI (Adequate Intake) para a faixa etaacuteria de 20 a 70 anos Satildeo Paulo SP
2013-2014 87
Figura 9 ndash Comparaccedilatildeo entre as meacutedias de consumo de Sais Minerais e outros
nutrientes dos Grupos Caso e Controle com a Faixa de Distribuiccedilatildeo Aceitaacutevel de
macronutrientes (AMDRDRI)e AI (Adequate Intake) para a faixa etaacuteria de 20 a 70
anos Satildeo Paulo SP 2013-2014 87
Figura 10ndash Curva-padratildeo gerada a partir dos pontos de Ct obtidos com o graacutefico de
amplificaccedilatildeo de diluiccedilotildees seriadas do controle positivo Mycoplasma hominis calculado
pelo software StepOne 21 (Applied Biosystems Life Technologies Corporation) Satildeo
Paulo SP 2013-201490
Figura 11 ndash Quantificaccedilatildeo por qPCR de Mollicutes (UFCmicrol) a partir das amostras de
fezes nos grupos caso e controle Satildeo Paulo SP 2013-2014 92
Figura 12 ndash Quantificaccedilatildeo por qPCR de Firmicutes Bacteroidetes e Eubacterias
(UFCmicrol) a partir das amostras de fezes nos grupos caso e controle Satildeo Paulo SP
2013-201493
Figura 13 ndash Quantificaccedilatildeo de IL-1β IL-10 IL17-A e TNF-α (pgmL) no plasma
sanguiacuteneo por meio do ELISA nos grupos caso e controle da populaccedilatildeo estudada
Satildeo Paulo SP 2013-201496
IacuteNDICE DE QUADROS
Quadro 1 ndash Criteacuterios utilizados na estimativa da frequecircncia diaacuteria de consumo dos
alimentos incluiacutedos no Questionaacuterio de Frequecircncia Alimentar 61
Quadro 2 ndash Sequecircncias dos iniciadores utilizados para amplificaccedilatildeo do gene 16S rRNA
para Mollicutes 66
Quadro 3 ndash Sequecircncias dos iniciadores utilizados para amplificaccedilatildeo do gene 16S rRNA
para Firmicutes Bacteroidetes e Bacteacuterias Totais69
IacuteNDICE DE TABELAS
Tabela 1 ndash Determinaccedilatildeo do perfil da populaccedilatildeo estudada referente agrave Seccedilatildeo 1 Dados
socioeconocircmicos Satildeo Paulo SP 2013-201472
Tabela 2 ndash Determinaccedilatildeo do perfil da populaccedilatildeo estudada referente agrave Seccedilatildeo 2 Histoacuteria
Familiar Satildeo Paulo SP 2013-201472
Tabela 3 ndash Determinaccedilatildeo do perfil da populaccedilatildeo estudada referente agrave Seccedilatildeo 3 Histoacuteria
Cliacutenica Satildeo Paulo SP 2013-2014 73
Tabela 4 ndash Determinaccedilatildeo do perfil da populaccedilatildeo estudada referente agrave Seccedilatildeo 4 Histoacuteria
Obsteacutetrica Satildeo Paulo SP 2013-2014 74
Tabela 5 ndash Determinaccedilatildeo do perfil da populaccedilatildeo estudada referente agrave Seccedilatildeo 5 Histoacuteria
Ginecoloacutegica Satildeo Paulo SP 2013-2014 75
Tabela 6 ndash Determinaccedilatildeo do perfil da populaccedilatildeo estudada referente agrave Seccedilatildeo 6
Consumo atual de tabaco Satildeo Paulo SP 2013-2014 75
Tabela 7ndash Determinaccedilatildeo do perfil da populaccedilatildeo estudada referente agrave Seccedilatildeo 7
Consumo atual de aacutelcool Satildeo Paulo SP 2013-2014 76
Tabela 8 ndash Tabela de determinaccedilatildeo do perfil da populaccedilatildeo estudada referente agrave Seccedilatildeo
8 Atividade Fiacutesica (IPAQ versatildeo curta) Satildeo Paulo SP 2013-2014 76
Tabela 9 ndash Tabela de determinaccedilatildeo do perfil da populaccedilatildeo estudada referente agrave Seccedilatildeo
9 Mudanccedilas recentes nos haacutebitos alimentares Satildeo Paulo SP 2013-2014 77
Tabela 10 ndash Participaccedilatildeo dos alimentos nos grupos meacutedias de consumo por dia dos
alimentos consumidos pela populaccedilatildeo estudada Satildeo Paulo SP 2013-2014 144
Tabela 11 ndash Definiccedilatildeo dos grupos alimentares derivados do Questionaacuterio de Frequecircncia
Alimentar (QFA) e percentual de consumo da populaccedilatildeo estudada Satildeo Paulo SP
2013-201479
Tabela 12 ndash Anaacutelise de consumo de energia e nutrientes da populaccedilatildeo estudada Satildeo
Paulo SP 2013-2014 81
Tabela 13 ndash Comparaccedilatildeo das variaacuteveis dieteacuteticas relacionadas agraves razotildees de ingestatildeo e
Valor Energeacutetico Total (VET) da populaccedilatildeo estudada Satildeo Paulo SP 2013-2014 83
Tabela 14 ndash Comparaccedilatildeo de variaacuteveis antropomeacutetricas da populaccedilatildeo estudada 89
Tabela 15 ndash Repetibilidade intra-ensaio e inter-ensaio da qPCR para Mollicutes Satildeo
Paulo SP 2013-2014 91
Tabela 16 ndash Comparaccedilatildeo entre os resultados obtidos no teste de sensibilidade pelas
teacutecnicas de PCR convencional e qPCR para detecccedilatildeo de Mollicutes Satildeo Paulo SP
2013-201491
Tabela 17 ndash Nuacutemero meacutedio de coacutepias e percentual dos grupos Mollicutes estudados
frente ao Filo Firmicutes na populaccedilatildeo estudada Satildeo Paulo SP 2013-2014 94
Tabela 18 ndash Nuacutemero meacutedio de coacutepias e percentual dos grupos de bacterianos
estudados frente agraves bacteacuterias totais na populaccedilatildeo estudada Satildeo Paulo SP 2013-
201495
Tabela 19 ndash Proporccedilatildeo de Firmicutes em relaccedilatildeo agrave Bacteroidetes na populaccedilatildeo
estudada Satildeo Paulo SP 2013-201495
SUMAacuteRIO
1 INTRODUCcedilAtildeO 26
2 REFERENCIAL TEOacuteRICO 29
21 Obesidade 29
22 Microbiota Intestinal 31
221 Microbiota intestinal uma peccedila chave na sauacutede e na doenccedila31
222 Colonizaccedilatildeo e composiccedilatildeo da microbiota intestinal32
223 Fatores que influenciam a composiccedilatildeo da microbiota intestinal 34
2231 Fases da vida 34
2232 Tipo de parto 34
2233 Tipo de aleitamento 35
2234 Uso de antibioacutetico 35
2235 Dieta 36
224 Microbiota intestinal e a fisiologia do hospedeiro 38
2241 Nutriccedilatildeo e Metabolismo 38
2242 Proteccedilatildeo 39
22421 Competiccedilatildeo direta de nutrientes 39
22422 Imunomodulaccedilatildeo 40
2243 Funccedilatildeo Troacutefica 43
2244 Regulaccedilatildeo da adiposidade 43
225 Microbiota intestinal e disbiose44
226 Microbiota Intestinal e obesidade47
227 Mecanismos pelos quais a microbiota intestinal contribui para a obesidade49
2271 Extraccedilatildeo de energia adicional da dieta49
2272 Induccedilatildeo da inflamaccedilatildeo por meio da alteraccedilatildeo da permeabilidade intestinal51
23 MOLLICUTES 52
231 Caracteriacutesticas Gerais dos Mollicutes52
232 Mollicutes Microbiota Intestinal e Obesidade56
3 OBJETIVOS 58
31 Objetivo geral 58
32 Objetivos especiacuteficos 58
4 MATERIAL E MEacuteTODOS 59
41 Protocolo do estudo 59
42 Casuiacutestica 59
43 Delineamento experimental 60
44 Determinaccedilatildeo do estado nutricional 60
441 Avaliaccedilatildeo qualitativa do consumo alimentar 60
442 Avaliaccedilatildeo antropomeacutetrica do estado nutricional 62
4421 Anaacutelise da Composiccedilatildeo Corporal pelo Meacutetodo de Bioimpedacircncia 63
45 Coleta das amostras cliacutenicas 64
46 Determinaccedilatildeo da microbiota intestinal 65
461 Padronizaccedilatildeo de reaccedilatildeo de PCR quantitativo (qPCR) por meio de TaqMan para a detecccedilatildeo de
Mollicutes 65
4611 Cepas bacterianas e condiccedilotildees de cultura 65
4612 Desenvolvimento de primers e sonda para a detecccedilatildeo de Mollicutes pela PCR quantitativa 65
4613 PCR quantitativa 66
4614 Especificidade da qPCR e repetibilidade intra e inter-ensaios 67
462 Reaccedilatildeo em cadeia da polimerase (PCR) convencional 68
463 Detecccedilatildeo de micro-organismos dos filos Firmicutes e Bacteroidetes e bacteacuterias totais (Eubacterias)
por PCR em tempo Real (qPCR) 68
47 Dosagem de citocinas do soro sanguiacuteneo 69
48 Anaacutelises Estatiacutesticas 70
5 RESULTADOS 71
51 Perfil da populaccedilatildeo estudada 71
52 Determinaccedilatildeo do estado nutricional 78
521 Avaliaccedilatildeo qualitativa do consumo alimentar 78
522 Avaliaccedilatildeo antropomeacutetrica do estado nutricional 88
53 Determinaccedilatildeo da microbiota intestinal 90
531 Padronizaccedilatildeo de reaccedilatildeo de PCR quantitativo (qPCR) por meio de TaqMan para a detecccedilatildeo de
Mollicutes 90
532 Detecccedilatildeo de micro-organismos dos filos Firmicutes e Bacteroidetes aleacutem de bacteacuterias totais
(Eubacterias) por PCR em tempo Real (qPCR) 93
54 Dosagem de citocinas do soro sanguiacuteneo 96
6 DISCUSSAtildeO 97
7 CONCLUSOtildeES 107
REFEREcircNCIAS 108
APEcircNDICE A ndash TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO 127
APEcircNDICE B ndash QUESTIONAacuteRIO 131
APEcircNDICE C- TABELA 10 143
26
1 INTRODUCcedilAtildeO
A obesidade eacute definida pela Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede (WHO 2002)
como o excesso de gordura corporal acumulada no tecido adiposo com implicaccedilotildees
para a sauacutede Algumas estimativas globais recentes indicam que em 2013 mais de
600 milhotildees da populaccedilatildeo mundial adulta (com 18 anos ou mais) eram obesos com
11 dos homens e 15 das mulheres (MARIE 2014) No Brasil em 2014 estimou-
se que na populaccedilatildeo adulta (20 anos ou mais) 105 milhotildees satildeo obesos com 124
dos homens e 169 das mulheres (IBGE 2014) Nesse contexto atualmente a
obesidade estaacute entre os maiores problemas de sauacutede puacuteblica e distuacuterbio da nutriccedilatildeo
A obesidade eacute considerada atualmente uma epidemia (BACON APHRAMOR 2011
OLSHANSKY et al 2005) As alteraccedilotildees nos padrotildees dieteacuteticos e nutricionais da
populaccedilatildeo brasileira tecircm sido analisadas no processo da transiccedilatildeo nutricional (KAC
VELAacuteSQUEZ-MELEacuteNDEZ 2003)
Neste processo verificou-se que ocorreu inversatildeo nos padrotildees de distribuiccedilatildeo
das alteraccedilotildees nutricionais A alta incidecircncia de sobrepeso e obesidade na
populaccedilatildeo implica no aumento da ocorrecircncia de doenccedilas cardiovasculares cacircncer
diabetes mellitus e hipertensatildeo arterial (AMUNA ZOTOR 2008 ARAI et al 2009
DUNCAN et al 1993 GIGANTE et al 1997 JIRTLE SKINNER 2007 KAC
VELAacuteSQUEZ-MELEacuteNDEZ 2003 LESSA 1998 MONDINI MONTEIRO 1998
POPKIN et al 2006) Na obesidade ocorre basicamente o balanccedilo energeacutetico
positivo cuja patogecircnese natildeo estaacute completamente elucidada estando associada a
fatores comportamentais culturais e bioloacutegicos A regulaccedilatildeo do balanccedilo energeacutetico e
do estoque de energia corporal satildeo influenciados pela susceptibilidade individual e
seu contexto social e econocircmico demograacutefico cultural educacional ambiental e
familiar aleacutem de fatores hormonais e de heranccedila geneacutetica (GORAN 2000 VEIGA
SICHIERI 2006)
O mapa gecircnico da obesidade humana estaacute constantemente em mudanccedila pela
identificaccedilatildeo de novos genes e regiotildees cromossocircmicas associadas com a
obesidade As alteraccedilotildees do comportamento alimentar e os haacutebitos sedentaacuterios
indicam ser os principais fatores de interferecircncia nos genes de susceptibilidade a
obesidade e consequentemente no aumento da obesidade mundial Eacute provaacutevel
27
portanto que a obesidade ocorra como a resultante de fatores poligecircnicos
complexos e um ambiente obesogecircnico (dieta e sedentarismo) (BAJZER SEELEY
2006 BOUCHARD 2000 CANI et al 2007 DERAM VILLARES 2009 DUNCAN et
al 2008 TURNBAUGH et al 2009)
A captaccedilatildeo de energia pode justificar em parte o metabolismo de alguns
pacientes obesos que natildeo apresentam ingestatildeo alimentar excessiva sugerindo que
a microbiota intestinal pode predispor o indiviacuteduo agrave obesidade (BACKHED 2004)
Alguns estudos tecircm demonstrado que o desenvolvimento da obesidade em
humanos pode ser determinado pelas proporccedilotildees relativas de dois filos principais de
bacteacuterias da microbiota intestinal humana Bacteroidetes e Firmicutes que diferem
consideravelmente entre indiviacuteduos eutroacuteficos e obesos (DUNCAN et al 2008 LEY
et al 2005 2006 TENNYSON FRIEDMAN 2008) Estudos comparativos
mostraram que ratos obesos possuem significativamente niacuteveis mais baixos de
micro-organismos do Filo Bacteroidetes e niacuteveis mais elevados de Firmicutes Este
uacuteltimo estaacute associado com um aumento de absorccedilatildeo de energia da dieta
(BACKHED 2004 CANI DELZENNE 2009 DIBAISE et al 2012 LEY et al 2005
RAOULT 2008 TURNBAUGH et al 2006) Turnbaugh et al (2008) obtiveram
resultados semelhantes em ratos com obesidade induzida por dieta Curiosamente
embora as alteraccedilotildees nos niacuteveis de Firmicutes e Bacteroidetes foram observadas
nos camundongos obesos por dieta induzida a diferenccedila foi relacionada
principalmente as bacteacuterias da classe dos Mollicutes
As espeacutecies do Filo Bacteriodetes pertencem agrave microbiota intestinal humana e
animal Estas bacteacuterias satildeo bacilos ou cocobacilos gram-negativos anaeroacutebios
obrigatoacuterios heterotroacuteficos mesoacutefilos sacaroliacuteticos natildeo formadores de esporos
imoacuteveis Satildeo resistentes agrave bile natildeo produzem pigmentos Tecircm como principais
produtos finais do metabolismo da glicose os aacutecidos succiacutenico e aceacutetico
(JOHANSSON PETTERSON 2002 MANILOFF 2002) O Filo Firmicutes
encontrado em maior proporccedilatildeo no trato gastrintestinal humano satildeo micro-
organismos Gram positivos na maioria Na classificaccedilatildeo atual o filo divide-se
tipicamente em trecircs classes Bacilli - aeroacutebios facultativos ou obrigatoacuterios Clostridia -
organismos anaeroacutebios e Erysipelotrichia Mollicutes eacute a uacutenica classe do filo
Tenericutes anteriormente classificada dentro do filo Firmicutes (BERGEYrsquos 2009
2010 LUDWIG KLENK 2001 RAZIN et al 1998)
28
Os estudos das interaccedilotildees de Bacteroidetes e Firmicutes na microbiota
intestinal e sua associaccedilatildeo com a obesidade tecircm aumentado No entanto a
participaccedilatildeo dos Mollicutes eacute praticamente desconhecida O gecircnero Mycoplasma foi
introduzido em 1929 para designar micro-organismos atualmente classificados
como membros da famiacutelia Mycoplasmataceae ordem Mycoplasmatales da classe
dos Mollicutes (Mollis = mole cuacutetis = pele) (RAZIN 1992) Os Mollicutes possuem
um genoma pequeno sendo que algumas espeacutecies apresentam o menor genoma
entre os procariotos e em consequecircncia apresentam metabolismo reduzido
(MILES NICHOLAS 1998 NEIMARK 1986 RAZIN TULLY 1983) Distinguem-se
de outros procariotos pela simplicidade celular genoma e metabolismo reduzido A
ausecircncia natural da parede celular confere resistecircncia aos antibioacuteticos beta-
lactamicos Incluem-se as sulfas e rimfapicina respectivamente pela ausecircncia da
siacutentese de aacutecido foacutelico e possuir uma polimerase diferente Com aproximadamente
200 espeacutecies estes micro-organismos infectam humanos animais insetos e
plantas Considerados em geral como oportunistas por excelecircncia colonizam
ldquopreferencialmenterdquo a superfiacutecie de mucosas de mamiacuteferos mas tecircm potencial de
causar infecccedilotildees sistecircmicas dependendo do hospedeiro (DYBVIG 1990 RAZIN
YOGEV NAOT 1998)
29
2 REFERENCIAL TEOacuteRICO
21 Obesidade
A prevalecircncia da obesidade tem crescido rapidamente e representa um dos
principais desafios de sauacutede puacuteblica neste seacuteculo A Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede
(OMS) estima que pelo menos 28 milhotildees de pessoas morrem em decorrecircncia da
obesidade (IMC ge 30 kgm2) A prevalecircncia mundial quase duplicou entre 1980 e
2008 com uma transiccedilatildeo de 5 dos homens e 8 das mulheres em 1980 para
10 dos homens e 14 das mulheres (WHO 2014) A obesidade pode ser definida
como o grau de armazenamento de gordura no organismo associada ao ganho
excessivo de peso corporal total Eacute portanto considerada uma doenccedila crocircnica
podendo acarretar em consequecircncias para a sauacutede devido agraves suas relaccedilotildees com
diversas complicaccedilotildees metaboacutelicas (MS 2006)
A pesquisa dos Orccedilamentos Familiares (POF IBGE 2010) nos uacuteltimos seis
anos indicou que a frequecircncia de pessoas com excesso de peso aumentou em mais
de um ponto percentual ao ano Desta maneira em dez anos o excesso de peso
poderia alcanccedilar dois terccedilos da populaccedilatildeo adulta do Brasil magnitude idecircntica agrave
encontrada na populaccedilatildeo dos Estados Unidos Estimativas de inqueacuteritos nacionais e
internacionais das uacuteltimas deacutecadas indicam que a obesidade em 2025 alcance 40
da populaccedilatildeo nos EUA 30 na Inglaterra e 20 no Brasil (HU 2008)
O excesso de peso e a obesidade na populaccedilatildeo expressam essencialmente
o desequiliacutebrio entre ingestatildeo e utilizaccedilatildeo de calorias A justificativa estaacute na
mudanccedila dos padrotildees de alimentaccedilatildeo e de atividade fiacutesica Em 2002-2003 revelou-
se tendecircncia crescente de substituiccedilatildeo de alimentos baacutesicos e tradicionais na dieta
brasileira (como arroz feijatildeo e hortaliccedilas) por bebidas e alimentos industrializados
(como refrigerantes biscoitos carnes processadas e comida pronta) Caracteriza-se
portanto o aumento na densidade energeacutetica das refeiccedilotildees e padrotildees de
alimentaccedilatildeo capazes de comprometer a auto-regulaccedilatildeo do balanccedilo energeacutetico dos
indiviacuteduos e aumentar o risco de obesidade (LEVY-COSTA et al 2005)
Aleacutem disto em consequecircncia agrave obesidade tem sido observado aumento
consideraacutevel da prevalecircncia de doenccedilas crocircnicas natildeo transmissiacuteveis como doenccedilas
cardiovasculares cacircncer diabetes mellitus e hipertensatildeo arterial Pelo longo tempo
30
de evoluccedilatildeo destas doenccedilas ocorrem lesotildees irreversiacuteveis de intensidade variada
resultando no aumento de incapacidade ou oacutebito vecircm ocupando um maior espaccedilo
no perfil de morbimortalidade de populaccedilotildees latino americanas (DUNCAN et al 1993
LESSA 1998) Em importante estudo entre 1958 e 1951 envolvendo cinco mil
indiviacuteduos de 35 a 75 anos por periacuteodo de ateacute 44 anos a obesidade (IMC gt 30Kgm2)
foi independentemente associada ao maior risco para hipertensatildeo (mulheres
RR=26 IC95 22-31) diabetes tipo 2 (mulheres RR=14 IC95 1-18) e doenccedila
cardiovascular mulheres RR=14 IC95 11-17) (WILSON et al 2002) Os ganhos
na diminuiccedilatildeo das taxas de tabagismo ao longo do seacuteculo XX e as expectativas no
aumento de tempo de vida podem ser neutralizadas pelas prespectivas do aumento
da obesidade (STEWART et al 2009) Especialmente em paiacuteses em
desenvolvimento como o Brasil o custo anual para o Sistema Uacutenico de Sauacutede para
atender as doenccedilas relacionadas ao sobrepeso eacute estimado em US$ 20152102171
(BAHIA et al 2012)
O ganho de peso ocorre pela menor utilizaccedilatildeo de gordura como fonte de
energia do que oxidar carboidratos elevando o coeficiente respiratoacuterio obtido
atraveacutes da razatildeo entre a produccedilatildeo de gaacutes carbocircnico resultante da oxidaccedilatildeo de
carboidratos e o consumo de oxigecircnio determinado atraveacutes de calorimetria (MARRA
et al 2004) Seis lesotildees monogecircnicas principais produzem desordens endoacutecrinas
que resultam na obesidade Deficiecircncia congecircnita de Leptina defeitos no receptor
de Leptina deficiecircncia no proacute-hormocircnio convertase 1(PC1) deficiecircncia em proacute-oacutepio-
melanocortina (POMC) defeitos no receptor da Melanocortina 4 (MC4R) e defeitos
no Receptor Ativado por Proliferadores de Peroxissoma (PPAR) O controle da
ingestatildeo alimentar a curto prazo eacute controlado principalmente por vias de
sinalizaccedilatildeo que emanam do trato gastrintestinal incluindo o peptiacutedeo orexiacutegenico
grelina que ativa os sinais de fome e os peptiacutedeos anorexigecircnicos
colecistoquinina (CCK) peptiacutedeo similar ao glucagon 1- glucagon-like peptide 1
(GLP-1) e peptiacutedeo tirosina-tirosina (PYY) que geram sinais de saciedade Para o
controle da ingestatildeo agrave longo prazo parecem ser primordiais os sinais que emanam a
partir do tecido adiposo (leptina) e pacircncreas (insulina) liberados em resposta agrave
ingestatildeo de alimentos e depoacutesitos de gordura corporal (KONTUREK et al 2004)
Tem sido amplamente documentado na literatura o reganho de peso
sucessivo agraves dietas pois sabe-se que cerca de um a dois terccedilos do peso perdido
31
tendem a ser recuperados no ano seguinte sendo a recuperaccedilatildeo quase total ao final
de cinco anos (GOODRICK et al 1996) A partir disso tem sido questionado o
efeito das dietas restritivas sobre a biologia humana e sua contribuiccedilatildeo para tornar a
obesidade uma condiccedilatildeo que possivelmente se autoperpetua e se agrava de
maneira progressiva Diversos trabalhos mostram que a ciclagem de peso (ou efeito
sanfona) pode aumentar a suscetibilidade para o ganho de massa corporal no
futuro (KORKEILA et al1999 NEUMARK-SZTAINER et al 2006 2007)
22 Microbiota Intestinal
221 Microbiota intestinal uma peccedila chave na sauacutede e na doenccedila
Nas deacutecadas passadas acreditava-se que todos os micro-organismos da
microbiota possuiacuteam potencial de causar infecccedilotildees O estudo da interaccedilatildeo entre
micro-organismos e o desenvolvimento de enfermidades eacute um tema crescente na
justificativa de certas doenccedilas (DETHLEFSEN et al 2007) O termo microbiota
refere-se ao conjunto de micro-organismos no hospedeiro sadio e o termo
microbioma eacute o conjunto de genes microbianos (BACKHED 2004 LANGA 2006
VRIEZE 2010) O estudo da diversidade e distribuiccedilatildeo da microbiota e sua interaccedilatildeo
com hospedeiro tem contribuiacutedo na justificativa de algumas doenccedilas (LEY et al
2008 VENTURA et al 2008) A microbiota do trato gastrintestinal humano eacute o
ecossistema mais complexo constituiacutedo por diversas espeacutecies de micro-organismos
As bacteacuterias constituem o grupo com maior diversidade e abundacircncia Assim como o
genoma de cada indiviacuteduo eacute uma impressatildeo digital a composiccedilatildeo da microbiota
intestinal tambeacutem parece ser (LEY et al 2006 RAJILIĆ-STOJANOVIĆ SMIDT DE
VOS 2007 XU GORDON 2003)
O comensalismo e a simbiose bacteriana refletem uma ldquocorrida dinacircmicardquo
que se inicia no encontro da bacteacuteria com o hospedeiro vulneraacutevel e prossegue com
respostas adaptativas entre os dois organismos Em alguns casos a coevoluccedilatildeo
atenua a virulecircncia e conduz a uma coexistecircncia paciacutefica com ou sem franca
codependecircncia Em outras circunstacircncias a relaccedilatildeo patogecircnica eacute mantida por meio
da superaccedilatildeo dos mecanismos de defesas inatas ou adaptativas do hospedeiro
pelas bacteacuterias (GORDON HOOPER 2001) Estima-se que a microbiota intestinal eacute
composta por mais de 1000 espeacutecies bacterianas O nuacutemero de ceacutelulas microbianas
32
no luacutemen intestinal eacute de 10 vezes maior que as ceacutelulas eucarioacuteticas do organismo
representando em torno de 1 kg de peso corporal (SCARPELLINI 2010) Aleacutem
disso o microbioma eacute 100 vezes maior que o genoma humano podendo-se assim
considerar a microbiota intestinal como um oacutergatildeo virtual exteriorizado
metabolicamente adaptaacutevel e flexiacutevel aleacutem de rapidamente renovaacutevel o que
contribui para metabolismo e desempenha importante papel na obtenccedilatildeo de energia
da dieta (FRANCcedilOIS-PIERRE 2009)
A microbiota intestinal eacute crucial para a vida humana com impacto na fisiologia
e na nutriccedilatildeo do hospedeiro (HATTORI TAYLOR 2008) Considera-se que
humanos satildeo ldquosuperorganismosrdquo com metabolismo mediado pelos atributos
humanos e microbianos (GILL et al 2006) O conceito de ldquosuperorganismordquo
representa importante mudanccedila de paradigma no entendimento da biologia humana
e pode ter impacto expressivo na prevenccedilatildeo e na terapia de doenccedilas no futuro
(NICHOLSON 2006)
222 Colonizaccedilatildeo e composiccedilatildeo da microbiota intestinal
O trato gastrintestinal fetal eacute considerado praticamente esteacuteril No nascimento
eacute rapidamente colonizado por micro-organismos da matildee e do ambiente hospitalar
(PALMER et al 2007) Sugere-se que de trecircs a quatro semanas apoacutes o nascimento
a microbiota intestinal comeccedila a se estabilizar aumentando gradualmente a sua
complexidade Apoacutes um ano assemelha-se agrave microbiota de um adulto (MACKIE et
al 1999 PALMER et al 2007 SCHEacuteLE et al 2013) Contrapondo-se agrave percepccedilatildeo
da ausecircncia de micro-organismos no feto demonstrou-se a presenccedila de DNA
bacteriano na placenta e no cordatildeo umbilical (JIMEacuteNEZ et al 2005 SATOKARI et
al 2009) Aleacutem disso a identificaccedilatildeo de algumas bacteacuterias no mecocircnio explica a
origem dos primeiros micro-organismos colonizadores do intestino antes mesmo do
nascimento possivelmente como um mecanismo adaptativo para o desenvolvimento
do intestino fetal fora do organismo materno (JIMEacuteNEZ et al 2008)
Os micro-organismos presentes no trato gastrintestinal podem ser autoacutectones
ou aloacutectones Linhagens autoacutectones tecircm longa associaccedilatildeo com o hospedeiro e
formam uma populaccedilatildeo estaacutevel de tamanho caracteriacutestico em uma regiatildeo do
intestino Os organismos aloacutectones satildeo adquiridos principalmente atraveacutes dos
alimentos ingeridos e do ecossistema oral Eacute difiacutecil determinar se um organismo eacute
33
um autoacutectone verdadeiro Contudo as bacteacuterias aloacutectones natildeo persistem no
ecossistema e satildeo detectaacuteveis apenas por um periacuteodo limitado (GORDON
HOOPER 2001 LEY et al 2006 WALTER 2008)
Os micro-organismos satildeo encontrados em todo o trato gastrintestinal no
entanto as mudanccedilas nas condiccedilotildees fisioloacutegicas implicam diferenccedilas na
composiccedilatildeo de micro-organismos nos diversos locais No trato gastrintestinal
inferior o fluxo do conteuacutedo torna-se mais lento e o ambiente conteacutem menos
substacircncias antimicrobianas favorecendo a colonizaccedilatildeo microbiana e o
estabelecimento de maior densidade de micro-organismos (QIN et al 2010
ZOETENDAL et al 2006) A partir da cavidade oral ao acircnus tem sido observado o
aumento da densidade microbiana no jejuno iacuteleo e no intestino grosso em
comparaccedilatildeo com o estocircmago e duodeno O coacutelon refere-se a um ecossistema
complexo com ampla diversidade microbiana e presenccedila de diversos gecircneros
bacterianos O pH neutro e a abundacircncia relativa de nutrientes como os
carboidratos natildeo digeriacuteveis e outros componentes alimentares que escapam do
processo digestivo tornam o coacutelon um ambiente favoraacutevel agrave proliferaccedilatildeo microbiana
O coacutelon eacute a regiatildeo do TGI que apresenta maior densidade microbiana podendo
alcanccedilar 1014UFCg-1 Dados tem mostrado que cada indiviacuteduo carrega mais de
1000 filotipos que representam mais de 7000 linhagens (AZAD et al 2013
ECKBURG et al 2005 FRANK et al 2007 HOLZAPFEL 2006 KLEEREBEZEM
VAUGHAN 2009 LEY et al 2008 QUIGLEY 2013 ZOETENDAL et al 2006)
Aproximadamente 99 dos genes identificados por metagenoma do intestino
humano satildeo bacterianos Na maioria dos indiviacuteduos cerca de 90 dos filos satildeo
Firmicutes e Bacteroidetes seguidos por Actinobacterias (famiacutelia Bifidobacteriaceae)
e Proteobacterias (famiacutelia Enterobacteriaceae) O filo mais abundante refere-se ao
Firmicutes apresentando como principais integrantes as classes Bacilli Clostridia e
Molicutes e dos Bacteroidetes as classes Bacteroides Flavobacteria e
Sphingobacterias Os filos Actinobacterias e Proteobacterias se apresentam em
menor proporccedilatildeo (ARUMUGAM et al 2011 DE FILIPPO et al 2010
HUTTENHOWER et al 2012 QIN et al 2010 QUIGLEY 2013 VILLANUEVA-
MILLAacuteN et al 2015 VRIEZE 2010 ZOETENDAL et al 2006)
34
223 Fatores que influenciam a composiccedilatildeo da microbiota intestinal
A microbiota do TGI humano eacute uma comunidade complexa cuja composiccedilatildeo
eacute inconstante diferindo inter e intra-individualmente definida por uma seacuterie de
fatores como geneacutetica do hospedeiro alimentaccedilatildeo sucessatildeo bacteriana funccedilatildeo
imune e estado de sauacutede (LEY et al 2008 EVERARD et al 2011 2014)
2231 Fases da vida
A diversidade bacteriana no intestino infantil eacute inicialmente muito baixa ateacute os
dois anos ao contraacuterio da microbiota de adulto (GAREAU et al 2010 HAJELA et al
2015) A baixa diversidade de bacteacuterias na primeira infacircncia inibe a maturaccedilatildeo
regular da microbiota intestinal e maturaccedilatildeo tardia da mucosa do sistema
imunoloacutegico implicando em riscos do aumento da resposta imune assim como
doenccedilas aleacutergicas Neste contexto envolve o desenvolvimento da toleracircncia oral e a
susceptibilidade da crianccedila a alergias e inflamaccedilatildeo A microbiota sofre portanto
mudanccedilas substanciais nos extremos da vida essas ramificaccedilotildees ainda estatildeo sendo
exploradas (AURELI et al 2011 HAJELA et al 2015 SHERIDAN et al 2014
SMITH et al 2013)
2232 Tipo de parto
A microbiota maternal eacute uma fonte de micro-organismos para a colonizaccedilatildeo do
TGI do receacutem-nascido As bacteacuterias residentes no canal vaginal e na regiatildeo perineal
tambeacutem ganham acesso ao TGI de receacutem-nascidos (BRY et al 1996 MACKIE et
al 1999) Ocorrem diferenccedilas entre o microbioma de um bebecirc receacutem-nascido por
parto normal em comparaccedilatildeo ao bebecirc receacutem-nascido por parto cesaacuterea No parto
vaginal o bebecirc eacute colonizado por bacteacuterias vaginais e fecais maternas cujas
composiccedilatildeo microbiana reflete a microbiota intestinal materna composta
predominantemente pelos gecircneros Lactobacillus Prevotella Atopobium e Sneathia
As amostras fecais de bebecircs nascidos de parto cesariana apresentaram gecircneros
tiacutepicos de microbiota da pele e do ambiente hospitalar predominantemente
Staphylococcus e C difficile Estes bebecircs tambeacutem apresentaram niacuteveis
significativamente mais baixos de Bifidobacterium e diversidade bacteriana menor do
que os bebecircs nascidos por parto normal Estas diferenccedilas podem justificar o
aumento do risco de doenccedilas especiacuteficas em bebecircs receacutem-nascidos por parto
35
cesariana agrave longo prazo (AZAD et al 2013 BELLO et al 2010 COLLADO et al
2012 DOMINGUEZ- PENDERS et al 2006 PRINCE et al 2014)
As diferenccedilas no processo de colonizaccedilatildeo intestinal decorrentes do tipo de
parto poderiam refletir-se no desenvolvimento do sistema imunoloacutegico visto que os
micro-organismos gastrintestinais influenciam esse processo por meio do envio de
importantes sinais regulatoacuterios necessaacuterios para o desenvolvimento da adequada
toleracircncia ao ambiente (BIASUCCI et al 2008 CARDWELL et al 2008
DOMINGUEZ-BELLO et al 2010 KOENIG et al 2011 MORELLI et al 2008
RENZ-POLSTER et al 2005)
2233 Tipo de aleitamento
O leite materno humano eacute considerado um dos principais fatores da iniciaccedilatildeo e
no desenvolvimento da microbiota do neonato uma vez que conteacutem substratos
(prebioacuteticos) para estimular o crescimento bacteriano e tambeacutem eacute fonte de micro-
organismos Estima-se que o consumo de 800 ml de leite materno por dia
proporcione 1 x 105 a 1 x 107 micro-organismos comensais durante a amamentaccedilatildeo
(MARTIN et al 2004) Desta maneira a contagem de Bifidobacterium aumenta
drasticamente Lactobacillus e Bacteroides aumentam em menor proporccedilatildeo e
enterobacteacuterias e enterococos diminuem Espeacutecies de Bifidobacterium
correspondem de 80 a 90 do total dos componentes da microbiota fecal infantil
presentes em bebecircs amamentados por leite materno Jaacute em receacutem-nascidos
alimentados com foacutermulas infantis a microbiota tem demonstrado ser muito mais
complexa sendo composta por Bifidobacterium Bacteroides Clostridium e
Streptococcus (ADLERBERTH WOLD 2009 CUMMINS THOMPSON 1997 DE
SANTA BARBARA et al 2003 DONOVAN ODIE 1994 DONOVAN 2006 MACKIE
et al 1999 MARQUES et al 2010 MCCRACKEN LORENZ 2001 PALMER
2011 POROYKO et al 2010)
2234 Uso de antibioacutetico
A eventual antibioticoterapia interfere tambeacutem no equiliacutebrio da microbiota A
disbiose (alteraccedilatildeo da microbiota) depende de fatores como espectro de accedilatildeo da
droga idade e dieta do indiviacuteduo dosagem e duraccedilatildeo do tratamento via de
administraccedilatildeo propriedades farmacocineacuteticas e farmacodinacircmicas aleacutem de grau de
36
resistecircncia da comunidade (LEY 2000 SULLIVAN et al 2001) A seleccedilatildeo de
bacteacuterias resistentes a drogas pela antibioticoterapia eacute um problema mundial Os
genes de resistecircncia passam para diversos gecircneros bacterianos no intestino A
aquisiccedilatildeo de genes de resistecircncia confere benefiacutecios a determinada espeacutecie
bacteriana diante da pressatildeo seletiva exercida pelo antibioacutetico Quando essa
pressatildeo seletiva eacute suspensa a cepa resistente apresenta menor desempenho em
comparaccedilatildeo com a espeacutecie susceptiacutevel No entanto esse clone menos competitivo
pode compensar essa perda de desempenho pela aquisiccedilatildeo de mutaccedilotildees
compensatoacuterias (JERNBERG et al 2010) No intestino os antibioacuteticos aleacutem de
selecionarem bacteacuterias resistentes tambeacutem aumentam o nuacutemero de transferecircncias
do pool de genes de ceacutelulas resistentes (DETHJEFSEN et al 2008 KARAMI et al
2007 YANG et al 2009)
2235 Dieta
Muitos estudos tem sido realizados no intuito de compreender a relaccedilatildeo entre o
consumo alimentar e a composiccedilatildeo da microbiota intestinal principalmente no
sentido de uma dieta ocidentalizada baseada em alimentos ricos em carboidratos
simples lipiacutedios e proteiacutenas de origem animal sal e poucos alimentos in natura
como frutas e hortaliccedilas ao comparar se com a dietas dos nossos antepassados
caracterizada pelo consumo de grandes quantidades de amido fibras e
polissacaacuteridos vegetais aleacutem de pequenas quantidades de gordura e proteiacutena
animal Em modelos murinos de obesidade induzida por padratildeo de dieta ocidental
no qual animais geneticamente idecircnticos que herdaram microbiotas semelhantes a
relaccedilatildeo entre dieta e representantes microbianos eacute dinacircmica e ajustaacutevel impactando
a capacidade da microbiota de promover a adiposidade no hospedeiro (CARMODY
et al 2015 DAVID et al 2014 DE FILIPPO et al 2010 FLEISSNER et al 2010
HILDEBRANDT et al 2009 LEY et al 2008 MENDONCcedilA ANJOS 2004 WALKER
et al 2011 WONG et al 2012 WU et al 2011)
Uma vez que a microbiota foi estabelecida nestes primeiros anos observa-se
um aumento na composiccedilatildeo microbiana tanto na diversidade quanto na riqueza
atingindo a mais alta complexidade em adultos com vaacuterias centenas de filotipos e
niacuteveis de espeacutecie Cada indiviacuteduo humano atinge um cliacutemax de composiccedilatildeo
homeostaacutetico o que provavelmente permanece relativamente estaacutevel durante a
37
maior parte da vida de um adulto saudaacutevel Nas fases tardias da vida a composiccedilatildeo
da microbiota torna-se novamente menos diversificada e mais dinacircmica
caracterizada por uma maior proporccedilatildeo de Bacteroidetes para Firmicutes aumento
de Proteobacteria e diminuiccedilatildeo da Bifidobacterium (MACKIE 1999 OTTMAN et al
2012 RAUTAVA et al 2012 VILLANUEVA-MILLAacuteN et al 2015) (Figura 1)
Figura 1 ndash Fatores envolvidos no estabelecimento da microbiota humana ao longo
da vida
Adaptado de MJ Villanueva-Millaacuten et al 2015
38
224 Microbiota intestinal e a fisiologia do hospedeiro
O intestino representa a interface natural entre microbiota intestinal e o
hospedeiro sendo a mucosa intestinal a localizaccedilatildeo principal para a interaccedilatildeo de
micro-organismos e antiacutegenos com o hospedeiro por meio de intenso cross-talk
(KINROSS et al 2011) Os achados de estudos cliacutenicos e experimentais tecircm
evidenciado que a interaccedilatildeo microbiotahospedeiro pode influenciar favoravelmente
a sauacutede do hospedeiro de diversas maneiras Ateacute agora as principais funccedilotildees
conhecidas da microbiota podem ser classificadas em quatro grupos metaboacutelica
(nutriccedilatildeo e digestatildeo) proteccedilatildeo (proteccedilatildeo contra agentes patogecircnicos
imunomodulaccedilatildeo) troacutefica (controle da proliferaccedilatildeo de ceacutelulas epiteliais e
diferenciaccedilatildeo) e regulaccedilatildeo da adiposidade
2241 Nutriccedilatildeo e Metabolismo
A microbiota intestinal eacute um importante fator que afeta a extraccedilatildeo de energia a
partir da dieta e do armazenamento de energia no hospedeiro A fim de realizar
estas funccedilotildees as enzimas metaboacutelicas da microbiota intestinal como as glicosidases
e polissacaridases tecircm a capacidade de extrair energia a partir de nutrientes
inacessiacuteveis uma vez que estas enzimas satildeo capazes de clivar ligaccedilotildees glicosiacutedicas
presentes em alguns polissacariacutedeos de plantas e fibras dieteacuteticas (BACKHED et al
2004 2005 GUARNER MALAGELADA 2003) Os polissacariacutedeos natildeo digeriacuteveis
como a oligofrutose (inulina) satildeo metabolizados pela microbiota colocircnica em
oligossacariacutedeos e monossacariacutedeos e entatildeo fermentados a aacutecidos graxos de
cadeia curta (AGCC) particularmente acetato propionato e butirato Estes AGCC
satildeo rapidamente absorvidos O Butirato fornece energia para o metabolismo celular
enquanto acetato e propionato seguem para a corrente sanguiacutenea sendo
transportados para o fiacutegado e oacutergatildeos perifeacutericos onde podem atuar como substratos
para a gliconeogecircnese e lipogecircnese (SHEN et al 2013 ZAIBI et al 2010)
A microbiota intestinal tambeacutem induz a expressatildeo do peptiacutedeo YY (PYY)
anorexigecircnico que geram sinais de saciedade atraveacutes de um mecanismo
dependente do receptor GPR41 Assim a produccedilatildeo de AGCC pela microbiota
intestinal estaacute associada com um aumento na saciedade e uma reduccedilatildeo na ingestatildeo
de alimentos no hospedeiro o qual por sua vez controla o ganho de peso corporal
(CLUNY et al 2015 SHEN et al 2013 ZAIBI et al 2010) Outros mecanismos
39
pelos quais as bacteacuterias do intestino podem influenciar metabolismo do colesterol
satildeo induzidos atraveacutes de Fasting Induced Adipocyte Factor (FIAF) que eacute
seletivamente suprimida no epiteacutelio intestinal pela microbiota intestinal (MARTINEZ
et al 2009)
Tambeacutem tem sido relatado o envolvimento da microbiota intestinal na
metabolizaccedilatildeo de polifenoacuteis que contribuem para o seu potencial antioxidante e
accedilotildees beneacuteficas aleacutem de siacutentese de algumas vitaminas como B12 e K aleacutem da
induccedilatildeo da expressatildeo do receptor de vitamina D pelos AGCC aumentando a sua
absorccedilatildeo e regulando o metabolismo do caacutelcio (BRENCHLEY DOUEK 2012
GUARNER MALAGELADA 2003 KIM et al 1998 MANACH DONOVAN 2004
RESTA 2009 SCALBERT WILLIAMSON 2000) Finalmente a microbiota intestinal
tambeacutem eacute capaz de executar uma seacuterie de biotransformaccedilotildees em xenobioacuteticos
como drogas e seus metaboacutelitos em formas que podem afetar sua absorccedilatildeo e
biodisponibilidade (WILSON NICHOLSON 2009) Neste contexto tem sido
demonstrado que a microbiota intestinal metaboliza toacutexicos e compostos
potencialmente canceriacutegenos tais como pirolisatos (BRENCHLEY DOUEK 2012)
2242 Proteccedilatildeo
Tem sido observado que a ausecircncia da microbiota intestinal torna o organismo
suscetiacutevel agrave infecccedilatildeo Alguns dos mecanismos envolvidos nessas accedilotildees protetoras
incluem competiccedilatildeo direta de nutrientes limitados e a modulaccedilatildeo de respostas
imunoloacutegicas no hospedeiro (GUARNER MALAGELADA 2003 KAMADA et al
2013 SEKIROV et al 2010)
22421 Competiccedilatildeo direta de nutrientes
Vaacuterios mecanismos tecircm sido implicados na resistecircncia agrave colonizaccedilatildeo do trato
gastrintestinal por patoacutegenos A camada de muco intestinal eacute capaz de manter
mutualismos mantendo as bacteacuterias no compartimento e restringindo estimulaccedilatildeo
imunoloacutegica ostensiva O hospedeiro fornece ativamente os nutrientes que a
microbiota precisa e a microbiota indica a quantidade de nutrientes que satildeo
necessaacuterios para o hospedeiro Esta relaccedilatildeo impede superproduccedilatildeo indesejada do
nutriente o que favoreceria a intrusatildeo de micro-organismos competitivos com
potencial de patogenicidade Finalmente as bacteacuterias podem inibir o crescimento
40
dos seus concorrentes produzindo peptiacutedeos antimicrobianos ou proteiacutenas
conhecidas como bacteriocinas que satildeo sintetizadas em ribossomos (GUARNER
MALAGELADA 2003 MONTALTO et al 2009 PURCHIARONI et al 2013
SEKIROV et al 2010)
22422 Imunomodulaccedilatildeo
As interaccedilotildees entre micro-organismos e ceacutelulas epiteliais e imunes baseiam-se
no reconhecimento de padrotildees moleculares associados agrave micro-organismos
(MAMPs) sendo mediado por receptores de reconhecimento padratildeo representados
pelos receptores do tipo toll (TLR) encontrados na superfiacutecie de ceacutelulas epiteliais e
imunes e pelos receptores de domiacutenio de digomerizaccedilatildeo de ligaccedilatildeo de nucleotiacutedeos
(NOD) que se encontram no citoplasma Esses receptores desempenham um
importante papel na gecircnese e na modulaccedilatildeo da resposta inflamatoacuteria (FRANCHI et
al 2009 MARANDUBA et al 2014 MONTALTO et al 2009 PURCHIARONI et al
2013)
A interaccedilatildeo funcional entre microbiota intestinal e sistema imunoloacutegico inicia-
se com a promoccedilatildeo de um ambiente anti-inflamatoacuterio pelas bacteacuterias (Figura 2) Em
um contexto simbioacutetico MAMPs estimulam continuamente atraveacutes das IECs (ceacutelulas
epiteliais intestinais) a secreccedilatildeo das proteiacutenas antimicrobianas intestinais REGIIIγ
para o luacutemen aleacutem de linfopoietina estromal tiacutemica (TSLP) IL-33 IL-25 e o fator de
crescimento tumoral-β (TGF-β) sob o epiteacutelio Esses mediadores imunoloacutegicos
induzem o desenvolvimento de macroacutefagos tolerogecircnicos e ceacutelulas dendriacuteticas
(DCs) tolerogecircnicas (KAMADA et al 2013 MAYNARD et al 2012)
Ceacutelulas Dendriacuteticas (DCs) tolerogecircnicas produzem TGF-β e aacutecido retinoacuteico
(RA) que estimulam o desenvolvimento de Ceacutelulas T regulatoacuterias (Treg) Assim
atraveacutes das ceacutelulas Treg (que utilizam diversos mecanismos de regulaccedilatildeo)
macroacutefagos (que produzem IL-10) e DCs tolerogecircncicos o sistema imunoloacutegico
intestinal eacute capaz de estabelecer e manter um ambiente anti-inflamatoacuterio Aleacutem dos
papeacuteis reguladores essenciais de TGF-β esta citocina tem sido associada com
outras substacircncias derivadas do epiteacutelio tais como fator de ativaccedilatildeo de ceacutelulas β
(FABF) e ligante indutor de proliferaccedilatildeo (APRILL) com o intuito de induzir o
desenvolvimento de ceacutelulas produtoras de IgA (plasmoacutecitos) (FAGARASAN et al
2010) Esta imunoglobulina eacute capaz de prevenir a ligaccedilatildeo de bacteacuterias comensais no
41
epiteacutelio do hospedeiro estando portanto envolvida na formaccedilatildeo da microbiota
intestinal (MACPHERSON et al 2012)
Aleacutem disto tem sido relatada que a produccedilatildeo de alguns tipos de peptiacutedeos
antimicrobianos bacterianos (AMPs) como a secreccedilatildeo das proteiacutenas
antimicrobianas intestinais REGIIIγ REGIIIβ e angiogenina-4 eacute influenciada pela
micro-organismos comensais via TLR MyD88 (FRANCHI et al 2009 GOTO
IVANOV 2013 VAN VLIET et al 2010) Desse modo verifica-se que no intestino
humano saudaacutevel a microbiota promove constante exposiccedilatildeo de ligantes aos TLR
garantindo a ativaccedilatildeo basal contiacutenua de vias de sinalizaccedilatildeo resultando em
inflamaccedilatildeo fisioloacutegica de baixa intensidade Aleacutem disso micro-organismos
comensais tambeacutem satildeo capazes de suprimir respostas inflamatoacuterias intensas (VAN
VLIET et al 2010)
42
Figura 2 ndash Interaccedilatildeo funcional entre a microbiota intestinal humana e o sistema
imunoloacutegico
Legenda ndash O equiliacutebrio evolutivo eacute formado ao longo do tempo sendo modulado por pressatildeo ambiental A
microbiota intestinal e o ambiente intestinal satildeo desenvolvidas em conjunto sendo necessaacuterio para o benefiacutecio de ambos tolerar um ao outro O sistema imunoloacutegico monitora essa interaccedilatildeo garantindo a homeostase e contribuindo para a simbiose No entanto o desequiliacutebrio causado na presenccedila de disbiose pode causar a reaccedilatildeo do sistema imunoloacutegico Simbiose e disbiose dependem de equiliacutebrio entre bacteacuterias comensais e patogecircnicas Bacteacuterias comensais promovem um ambiente anti-inflamatoacuterio Em um contexto de simbiose MAMPs estimulam continuamente as IECs a secretarem moleacuteculas que atuam protegendo o epiteacutelio e produzindo um ambiente tolerogecircnico Em disbiose haacute uma liberaccedilatildeo significativa de MAMPs que podem induzir IECs DCs ativadas e macroacutefagos a secretar citocinas inflamatoacuterias Consequentemente haacute um desenvolvimento de efetores imunoloacutegicos IL-22 eacute produzida em ambas as situaccedilotildees mas a contribuiccedilatildeo para a remodelaccedilatildeo da barreira epitelial eacute controlada por regulaccedilatildeo imune M macroacutefago Com bacteacuterias comensais Pato bacteacuterias patogecircnicas
Adaptado de MARANDUBA et al 2014
43
2243 Funccedilatildeo Troacutefica
A microbiota intestinal desempenha funccedilotildees troacuteficas modulando a proliferaccedilatildeo
e diferenciaccedilatildeo de ceacutelulas epiteliais do coacutelon atraveacutes dos AGCC produzidos na
fermentaccedilatildeo de hidratos de carbono natildeo digeriacuteveis Neste contexto o butirato eacute
considerado o AGCC com maior efeito pois promove o crescimento e o turnover das
ceacutelulas epiteliais acelerando a maturaccedilatildeo intestinal da mucosa durante o seu
desenvolvimento ou para induzir seu reparo apoacutes uma lesatildeo O butirato eacute capaz de
aumentar proliferaccedilatildeo diferenciaccedilatildeo e maturaccedilatildeo aleacutem de reduzir apoptose de
enteroacutecitos normais no intestino delgado atraveacutes de sua influecircncia sobre a
expressatildeo de genes e a siacutentese de proteiacutenas (GUILLOTEAU et al 2010 HAMER et
al 2008)
O butirato parece exercer um efeito troacutefico em ceacutelulas epiteliais do iacuteleo e do
jejuno atraveacutes de um mecanismo de neuro-hormonal sugerindo um efeito indireto
No coacutelon a ausecircncia de butirato induziu apoptose massiva nos colonoacutecitos podendo
ser explicado pelo fato de que o butirato eacute a fonte principal de energia para estas
ceacutelulas aleacutem de estimular a liberaccedilatildeo de peacuteptidos gastrointestinais eou fatores de
crescimento que desempenham um papel fundamental na proliferaccedilatildeo celular
(GUILLOTEAU et al 2010 HAMER et al 2008)
2244 Regulaccedilatildeo da adiposidade
Tem sido evidenciado que a microbiota intestinal influecircncia a adiposidade do
hospedeiro A primeira evidecircncia do papel da microbiota intestinal na regulaccedilatildeo da
homeostase energeacutetica e adiposidade do hospedeiro foi demonstrada por Backhed
et al (2004) em estudo que foi demonstrado que ratos germ-free apresentavam
menor conteuacutedo de gordura corporal do que ratos convencionais mesmo ao
consumirem a mesma quantidade de alimentos Diferentes mecanismos tecircm sido
propostos para explicar a relaccedilatildeo entre microbiota intestinal e a adiposidade Assim
dependendo da sua composiccedilatildeo a microbiota pode aumentar a extraccedilatildeo energeacutetica
da dieta a partir de polissacariacutedeos natildeo digeriacuteveis com menor conteuacutedo de energia
disponiacutevel nas fezes aleacutem de maiores niacuteveis de AGCC no intestino Propotildee-se
ainda que a microbiota intestinal seja capaz de induzir a regulaccedilatildeo de genes do
hospedeiro que modulam o metabolismo energeacutetico (MUSSO et al 2011)
44
225 Microbiota intestinal e disbiose
Em condiccedilotildees saudaacuteveis existe um equiliacutebrio entre todos os micro-organismos
presentes no intestino estando as bacteacuterias beneacuteficas em maior quantidade
(eubiose) Entretanto pode ocorrer desequiliacutebrio na microbiota com consequente
predomiacutenio das bacteacuterias potencialmente patogecircnicas sobre as beneacuteficas Esse
desequiliacutebrio eacute definido como disbiose e pode comprometer a sauacutede do hospedeiro
uma vez que se associa agrave patogecircnese de vaacuterias doenccedilas (HAWRELAK MYERS
2004)
O uso de antibioacuteticos anti-inflamatoacuterios hormonais e natildeo hormonais abuso de
laxantes consumo excessivo de alimentos processados baixo consumo de
alimentos crus excessiva exposiccedilatildeo a toxinas ambientais incluindo alguns metais
pesados doenccedilas consumptivas como cacircncer e siacutendrome da imunodeficiecircncia
adquirida (AIDS) disfunccedilotildees hepatopancreaacuteticas estresse divertiacuteculos idade
tempo de tracircnsito e pH intestinal disponibilidade de material fermentaacutevel estado
imunoloacutegico do hospedeiro e infecccedilotildees satildeo fatores importantes para promover
alteraccedilatildeo da microbiota acarretando em disbiose intestinal e consequentemente
modificando vaacuterias funccedilotildees do TGI incluindo a digestatildeo a
biodisponibilidadeabsorccedilatildeo eliminaccedilatildeo desintoxicaccedilatildeo e funccedilatildeo imunoloacutegica
(ALMEIDA et al 2009 HAWRELA MYERS 2004 SEARS GENUIS 2012)
Em um contexto de disbiose (Figura 2) a presenccedila de agentes patogeacutenicos
pode perturbar a regulaccedilatildeo do ambiente anti-inflamatoacuterio Quando patoacutegenos
enteacutericos superam as bacteacuterias comensais o desequiliacutebrio entre comensais e
bacteacuterias patogecircnicas provoca uma liberaccedilatildeo significativa de MAMPs Este aumento
pode induzir IECs DCs e macroacutefagos ativados a secretar citocinas inflamatoacuterias
como a IL-1β IL-6 IL-12 e IL-23 Estas citocinas estimulam o desenvolvimento de
ceacutelulas CD4+ T auxiliares (T helper - TH1) e ceacutelulas TH17 (produzem IL-17A IL-
17F e IL-22) resultando na inflamaccedilatildeo crocircnica (MAYNARD et al 2012)
Na vigecircncia da disbiose intestinal pode ocorrer perda de funccedilotildees importantes
da microbiota do hospedeiro As alteraccedilotildees qualitativas e quantitativas na microbiota
intestinal aleacutem das alteraccedilotildees nas atividades metaboacutelicas e na distribuiccedilatildeo dos
micro-organismos ao longo do intestino associam-se a diversas condiccedilotildees tais
como diarreias deacuteficits nutricionais doenccedila celiacuteaca cacircncer colorretal doenccedilas
45
inflamatoacuterias intestinais siacutendrome do coacutelon irritaacutevel e supercrescimento bacteriano
(ALMEIDA et al 2009 HAWRELAK MYERS 2004)
A disbiose pode provocar aumento da permeabilidade intestinal alterando uma
importante funccedilatildeo da mucosa intestinal que eacute a atividade de barreira Assim
moleacuteculas antigecircnicas ou toacutexicas e micro-organismos nocivos podem se translocar
atraveacutes da barreira promovendo a passagem destas substacircncias atraveacutes da mucosa
epitelial para o sangue ou sistema linfaacutetico gerando uma resposta inflamatoacuteria
sistecircmica A ligaccedilatildeo entre disbiose e desenvolvimento de doenccedilas como obesidade
diabetes e doenccedilas cardiovasculares vem sendo explorada A obesidade representa
uma das doenccedilas mais estudadas associadas agrave perturbaccedilotildees na microbiota
intestinal no entanto requer mais estudos (Figura 3) (ALMEIDA et al 2009
HAWRELAK MYERS 2004 KINROSS et al 2011)
46
Figura 3 ndash Doenccedilas influenciadas pelo metabolismo microbiano intestinal
Legenda ndash A variedade de doenccedilas sistecircmicas que satildeo diretamente influenciadas pelo metabolismo da microbiota intestinal e a sua influecircncia sobre outras vias em mamiacuteferos tais como o sistema imunitaacuterio inato tem sido demonstradas Especificamente em destaque incluem as vias metaboacutelicas envolvidas com o metabolismo de drogas e a obesidade que satildeo diretamente influenciados pelo teor microbiano intestinal Ags antigeacutenios C bolteae Clostridium Bolteae DCs ceacutelulas dendriacuteticas AGCC aacutecidos graxos de cadeia curta TLR receptor Toll-like
Adaptado de Kinross et al 2011
47
226 Microbiota Intestinal e obesidade
A partir de 2004 mais um fator ambiental passou a ser apontado como
importante para o controle do peso e da homeostase energeacutetica a microbiota
intestinal As primeiras evidecircncias da relaccedilatildeo microbiota intestinal versus obesidade
foram constatadas em animais germ-free convencionalizados Esses animais
demonstraram que mesmo ao consumir uma menor quantidade de dieta e portanto
menos calorias em comparaccedilatildeo aos animais germ-free apresentaram aumento da
quantidade de gordura corporal (BACKHED et al 2004)
Especificamente tem-se observado que a microbiota de ratos obesos tem uma
maior capacidade de extraccedilatildeo de energia da dieta e esta caracteriacutestica pode ser
transmissiacutevel atraveacutes da colonizaccedilatildeo de ratos germ-free com a microbiota fecal de
doadores obesos resultando em um aumento significativamente maior no percentual
de gordura corporal total com o intuito de armazenar os lipiacutedeos produzidos Estes
estudos demonstraram que microbiota intestinal eacute um potencial fator de contribuiccedilatildeo
adicional agrave fisiopatologia da obesidade (BACKHED et al 2004 HARRIS et al 2012
LEY et al 2005 TURNBAUGH et al 2006)
A definiccedilatildeo da alteraccedilatildeo na composiccedilatildeo da microbiota intestinal de obesos
ainda permanece controversa na literatura tanto no que se refere agrave abordagem em
niacutevel de filo quanto de espeacutecies em humanos (LYRA et al 2010) Aleacutem destes
estudos realizados com animais germ-free outros observaram associaccedilotildees
importantes entre obesidade e mudanccedilas na composiccedilatildeo da microbiota intestinal tal
como uma diversidade bacteriana reduzida (no filo eou outros niacuteveis) eou
representaccedilatildeo alterada de genes e vias metaboacutelicas bacterianas (DE LA SERRE et
al 2010 LEY et al 2006 TURNBAUGH et al 2006)
Em geral vaacuterios autores tecircm demonstrado associaccedilotildees entre obesidade e
mudanccedilas na abundacircncia relativa dos dois filos bacterianos dominantes
Bacteroidetes e Firmicutes Mais especificamente um aumento do filo Firmicutes e
uma diminuiccedilatildeo do filo Bacteroidetes em modelos de ratos obesos e pacientes tecircm
sido observado Aleacutem disso indiviacuteduos magros e pessoas que perderam peso
apresentaram maior abundacircncia do filo Bacteroidetes (ABDALLAH et al 2011
BACKHED et al 2007 CANI et al 2008 LEY et al 2005 2006 TURNBAUGH et
al 2006 VERDAM et al 2013)
48
O aumento da razatildeo FirmicutesBacteroidetes em ratos obesos pode estar
associada com possiacuteveis mediaccedilotildees de respostas adaptativas pelo hospedeiro para
limitar a absorccedilatildeo de armazenamento de energia eou para promover a adiposidade
(LEY et al 2005) Embora os resultados dos estudos demonstrem diferenccedilas na
proporccedilatildeo de grupos bacterianos entre indiviacuteduos eutroacuteficos e obesos ainda natildeo se
sabe se algum grupo de micro-organismos em especial contribui de maneira direta
para o desenvolvimento da obesidade e de alteraccedilotildees metaboacutelicas Associaccedilotildees
entre tipos de bacteacuteria e as variaacuteveis metaboacutelicas tecircm sido observadas seja em
humanos ou em modelo animal indicando que a modulaccedilatildeo de determinados
grupos bacterianos possa exercer efeito no contexto da obesidade Os desafios
enfrentados agora se referem ao entendimento dos mecanismos pelos quais grupos
bacterianos influenciam paracircmetros metaboacutelicos e se intervenccedilotildees dieteacuteticas ou
medicamentosas utilizadas para modular a proporccedilatildeo desses grupos bacterianos
podem melhorar o perfil metaboacutelico ou ao contraacuterio agravaacute-lo (TURNBAUGH et al
2009)
Em relaccedilatildeo agrave composiccedilatildeo da microbiota intestinal seguida agrave perda de peso de
acordo com estudos de coorte a proporccedilatildeo de Bacteroidetes aumentou enquanto o
nuacutemero de Firmicutes diminuiu parecendo restaurar a relaccedilatildeo
FirmicutesBacteroides que estava inicialmente aumentada em indiviacuteduos obesos
Na verdade apoacutes 10 semanas de restriccedilatildeo energeacutetica e de exerciacutecio os
participantes que perderam mais de quatro quilogramas (kg) de peso corporal
mostraram um aumento significativo na populaccedilatildeo de Grupo B fragilis bem como
um aumento na proporccedilatildeo BacteroidesPrevotella positivamente correlacionada com
a perda de peso (HARRIS et al 2012 NADAL et al 2009 SANTACRUZ et al
2009)
No que se diz respeito aos efeitos do exerciacutecio fiacutesico na microbiota intestinal
Evans et al (2014) demonstraram que o exerciacutecio teve efeitos significativos tanto em
camundongos eutroacuteficos quanto em camundongos obesos que ingeriam dieta rica
em gordura sobre o equiliacutebrio relativo dos principais filos bacterianos juntamente
com a prevenccedilatildeo de obesidade e normalizaccedilatildeo da toleracircncia agrave glicose induzida por
dieta De fato a distacircncia percorrida eacute proporcional agrave diminuiccedilatildeo observada para a
razatildeo FirmicutesBacteroides (EVANS et al 2014) Tambeacutem eacute importante ressaltar
que o exerciacutecio aumentou significativamente a proporccedilatildeo relativa de bacteacuterias
49
produtoras de butirato tais como Bacteroidales S24-7 que estatildeo associados com a
sauacutede da ceacutelula epitelial intestinal Aleacutem disso o exerciacutecio fiacutesico aumentou a
diversidade da microbiota intestinal apenas em ratinhos alimentados com uma dieta
rica em gordura No entanto sugere-se que o exerciacutecio pode agir de forma
independente da microbiota intestinal aumentando a utilizaccedilatildeo de energia apesar
de um consumo de uma dieta rica em gordura
227 Mecanismos pelos quais a microbiota intestinal contribui para a obesidade
2271 Extraccedilatildeo de energia adicional da dieta
A noccedilatildeo de que a microbiota intestinal fornece energia para o hospedeiro eacute
suportada por achados em ratos germ-free natildeo naturalmente colonizados com
micro-organismos que apresentaram um menor ganho de peso quando alimentados
com uma dieta rica em gordura do que os ratos germ-free controles (BACKHED et
al 2007 CAESAR et al 2012 DING et al 2010 TREMAROLI BACKHED 2012)
Esses resultados evidenciam que na ausecircncia da microbiota o consumo de uma
dieta obesogecircnica parece natildeo estimular o desenvolvimento da obesidade A
Microbiota intestinal pode afetar ambos os lados da equaccedilatildeo do balanccedilo energeacutetico
natildeo apenas como um fator que influencia a colheita de energia a partir de
componentes da dieta mas tambeacutem como um fator que afeta genes do hospedeiro
que regulam o gasto de energia eou de armazenamento (BACKHED et al 2004
GILL et al 2006 WOLEVER et al 1991)
A fermentaccedilatildeo de polissacariacutedeos pela microbiota pode gerar um aumento no
fluxo de monossacariacutedeos para o fiacutegado e adipoacutecitos favorecendo a lipogecircnese de
novo atraveacutes da ativaccedilatildeo da expressatildeo de dois reguladores nucleares de enzimas
lipogecircnicas- carbohydrate response element-binding protein (ChREBP) e liver sterol
response element binding protein type-1 (SREBP-1) - os quais ativam as enzimas
lipogecircnicas acetil-CoA carboxilase e aacutecido graxo sintase (BACKHED et al 2004
MUSSO et al 2011 TSUKUMO et al 2009) Nesse contexto o menor acuacutemulo de
gordura corporal demonstrado em animais germ-free que consumiram dieta
hiperlipiacutedica e apresentaram absorccedilatildeo semelhante aos animais convencionalizados
indica que a microbiota pode exercer efeito sobre o fluxo de lipiacutedios entre os tecidos
reduzindo o acuacutemulo de gordura (BACKHED et al 2007)
50
A proteiacutena Fasting Induced Adipose Factor (FIAF) eacute suprimida pela presenccedila
de microbiota sendo um inibidor da lipase lipoproteacuteica (LPL) produzido pelo
intestino fiacutegado e tecido adiposo limitando a captaccedilatildeo de aacutecidos graxos e
favorecendo o acuacutemulo de triacilgriceroacuteis nesse tecido Tem sido demonstrado que
animais germ-free apresentaram uma maior expressatildeo de FIAF e fenoacutetipo resistente
agrave obesidade (BACKHED et al 2004 2005 2007) A participaccedilatildeo de FIAF no
metabolismo lipiacutedico foi reforccedilada atraveacutes de estudos com ratos germ-free que
diferiram apenas na expressatildeo dessa proteiacutena (FIAF ++ versus FIAF --) onde
verificou-se que a deficiecircncia dessa proteiacutena induzida geneticamente natildeo eacute um fator
protetor para animais germ-free contra o ganho de peso promovido pela dieta
hiperlipiacutedica (BACKHED et al 2007)
Aleacutem de promover a lipogecircnese (atraveacutes das enzimas lipogecircnicas e inibiccedilatildeo da
FIAF) a microbiota tambeacutem desempenha um papel importante no gasto de energia
obtida a partir da dieta Mais especificamente a microbiota de obesos parece
favorecer uma inibiccedilatildeo de oxidaccedilatildeo de aacutecidos graxos (que por sua vez favorecem a
deposiccedilatildeo e armazenamento de lipiacutedios no tecido adiposo fiacutegado eou tecido
muscular) por mecanismos complementares mas independentes (HARDIE
SAKAMOTO 2006 PUIGSERVER SPIEGELMAN 2003 RABOT et al 2010)
A microbiota tambeacutem pode influenciar a homeostase energeacutetica por meio da
sinalizaccedilatildeo exercida pelos aacutecidos graxos de cadeia curta (AGCC) Os AGCC agem
natildeo apenas como fonte de energia mas tambeacutem como moleacuteculas de sinalizaccedilatildeo
atraveacutes de receptores acoplados agrave proteiacutena G (GPRs) GPRs satildeo um grupo de
receptores transmembracircnicos intestinais que respondem aos aacutecidos graxos Entre
os receptores dessa famiacutelia os receptores Gpr41 e Gpr43 satildeo fundamentais sendo
expressos abundantemente no intestino delgado distal no coacutelon e nos adipoacutecitos
Essa ligaccedilatildeo resulta na ativaccedilatildeo desses receptores induzindo a secreccedilatildeo de
polipeptiacutedeo YY (PYY) e leptina hormocircnios que influenciam nas funccedilotildees intestinais
e na regulaccedilatildeo do apetite (BELLAHCENE et al 2013 BINDELS et al 2013
HARDIE SAKAMOTO 2006 INOUE et al 2014 MUSSO et al 2011 ZAIBI et al
2010)
51
2272 Induccedilatildeo da inflamaccedilatildeo por meio da alteraccedilatildeo da permeabilidade intestinal
As concentraccedilotildees sanguiacuteneas de lipopolissacariacutedeos (LPS) sofrem significativa
influecircncia da microbiota intestinal Principalmente as bacteacuterias Gram-negativas
apresentam em sua superfiacutecie celular os LPS que funcionam como antiacutegenos
estimulando a resposta imune do hospedeiro Assim a microbiota intestinal
representa um grande reservatoacuterio dessa endotoxina especialmente naqueles
indiviacuteduos que habitualmente consomem dieta com alto teor de gorduras
(HOTAMISLIGIL 2010)
A principal via de sinalizaccedilatildeo do LPS envolve o fator nuclear Kappa B (NF-KB)
O LPS pode aumentar os niacuteveis circulantes de resistina espeacutecies reativas de
oxigecircnio (ERO) e proteiacutenas supressoras da sinalizaccedilatildeo de citocinas-1 e 3 (SOCS-1 e
SOCS-3) A elevaccedilatildeo de citocinas proacute-inflamatoacuterias como interferon-gama (IFN-α)
TNF- α interleucina (IL)-6 e IL-1β geralmente observada em pacientes obesos
pode ser originada de macroacutefagos no tecido adiposo ou da interaccedilatildeo do LPS com
seu receptor O aumento dessas citocinas pode contribuir para a translocaccedilatildeo de
LPS favorecendo a ocorrecircncia de endotoxemia metaboacutelica e consequentemente
potencializar a inflamaccedilatildeo subcliacutenica por meio da reduccedilatildeo da expressatildeodistribuiccedilatildeo
de proteiacutenas formadoras de junccedilotildees oclusivas (tight junctions) como zocircnula de
oclusatildeo-1 (ZO-1) e ocludina aumentando a permeabilidade intestinal (CANI et al
2008 LAM et al 2012)
Aleacutem da reduccedilatildeo da expressatildeo das junccedilotildees oclusivas intestinais haacute tambeacutem
uma evidecircncia de que a microbiota intestinal pode regular a permeabilidade
intestinal atraveacutes do sistema endocanabinoacuteide Em um estudo realizado por Muccioli
et al (2010) a modulaccedilatildeo da composiccedilatildeo microbiana do intestino seja por
colonizaccedilatildeo em ratos germ-free ou por tratamento com antibioacuteticos reduziu a
expressatildeo dos receptores canabinoacuteides (Cb-1) tanto do coacutelon quanto do tecido
adiposo enquanto em animais alimentados com uma dieta rica em gordura foi
observado aumento da expressatildeo Cb1 (EVERARD et al 2013 GEURTS et al
2011 MUCCIOLI et al 2010)
52
23 MOLLICUTES
231 Caracteriacutesticas Gerais dos Mollicutes
Os micoplasmas foram primeiramente isolados por Norcard e Roux em 1898
que estudavam a Pleuropneumonia Bovina doenccedila descrita haacute mais de um seacuteculo
na Europa e na Aacutefrica Em seguida micro-organismos semelhantes isolados de
humanos e de animais foram descritos por outros pesquisadores e denominados de
PPLO ndash ldquoPleuropneumonia-Like Organismsrdquo (MOROWITZ 2002 RAZIN JACOBS
1992)
O termo ldquomicoplasmardquo foi usado para denominar os micro-organismos da
Classe Mollicutes (Mollis = mole cuacutetis = pele) mas sugeriu-se o uso do termo
geneacuterico molicutes como nome trivial para designar qualquer microrganismo desta
classe O termo micoplasma aplica-se apenas aos membros do gecircnero Mycoplasma
Recentemente algumas riqueacutetsias e outras bacteacuterias de taxonomia indefinida foram
incluiacutedas aos Mollicutes A classe eacute composta por quatro ordens (Mycoplasmatales
Entomoplasmatales Acholeplasmatales Anaeroplasmatales) sete famiacutelias
(Mycoplasmataceae Incertae sedis (ordem Mycoplasmatales)
Entomoplasmataceae Spiroplasmataceae Acholeplasmataceae Incertae sedis
(ordem Acholeplasmatales) e Anaeroplasmataceae) 11 gecircneros (Mycoplasma
Ureaplasma Eperythozoon Haemobartonella Entomoplasma Mesoplasma
Spiroplasma Acholeplasma Phytoplasma Anaeroplasma Asteroplasma) e mais de
200 espeacutecies A famiacutelia Mycoplasmataceae conteacutem os principais micro-organismos
de interesse meacutedico dentre os quais estatildeo os gecircneros Mycoplasma Os molicutes
compreendem aproximadamente 200 espeacutecies distribuiacutedas ente plantas insetos
animais e humanos (BERGEYrsquos 2010 RAZIN 1992 RAZIN YOGEV NAOT
1998)
Mollicutes eacute a uacutenica classe do filo Tenericutes sendo anteriormente
classificado dentro do filo Firmicutes tendo essa mudanccedila justificada em parte
pela anaacutelise de uma seacuterie de marcadores filogeneacuteticos conservados Esta
classificaccedilatildeo eacute ainda apoiada pela ausecircncia de parede celular caracteriacutestica desses
micro-organismos As sequecircncias do gene 16S rRNA contribuem para sua
classificaccedilatildeo em grupos filogeneacuteticos sendo essa sequecircncia obrigatoacuteria para a
caracterizaccedilatildeo de novas espeacutecies Aleacutem disso a atribuiccedilatildeo de espeacutecie aos grupos eacute
53
feita principalmente por hibridaccedilatildeo DNA-DNA sorologia e semelhanccedila na sequecircncia
do gene 16rRNA Algumas espeacutecies foram atribuiacutedas individualmente a grupos
filogeneacuteticos clusters e subclusters que tambeacutem compartilham outras
caracteriacutesticas (BERGEYrsquos 2009 2010 BROWN WHITCOMB BRADBURY 2007
WEISBURG et al 1989)
A natureza dos molicutes tem representado um desafio na compreensatildeo da
sua biologia classificaccedilatildeo e taxonomia Por muito tempo os micoplasmas foram
considerados viacuterus devido a capacidade de transpor filtros que bloqueavam a
passagem de bacteacuterias (RAZIN 1992) Os membros da classe Mollicutes satildeo
caracterizadas pelo genoma de tamanho reduzido (058 - 22 Mb) ausecircncia de
parede celular (RAZIN 1998) e por apresentarem requerimentos nutricionais
diferenciados quando comparados agrave maioria das bacteacuterias de interesse veterinaacuterio e
humano Aminoaacutecidos nucleotiacutedeos e esteroacuteis exoacutegenos satildeo utilizados para seu
crescimento in vitro O esterol presente no soro ou ceacutelulas do hospedeiro eacute
incorporado pela membrana da maioria das espeacutecies Este composto contribui na
fluidez necessaacuteria agrave membrana e confere resistecircncia parcial agrave lise osmoacutetica
(RUHNKE ROSENDAL 1994)
A membrana dos micoplasmas tem composiccedilatildeo semelhante agraves das eubacteacuterias
e estaacute exposta ao ambiente com exceccedilatildeo de poucas espeacutecies que possuem
glicocaacutelice (WIESLANDER et al 1992) Localizam-se principalmente nas ceacutelulas de
mucosas e com potencial de invasatildeo (VOELKER DYBVIG 1996) As mutaccedilotildees tecircm
sido mencionadas como estrateacutegia de sobrevivecircncia que podem ter ocorrido em
funccedilatildeo da evoluccedilatildeo associada a perdas genocircmicas (DAVID et al 2002)
Natildeo apresentam flagelos entretanto algumas espeacutecies exibem deslizamento
sobre superfiacutecies liacutequidas Alguns micoplasmas possuem um tipo de estrutura ou
prolongamento polar em sua superfiacutecie onde haacute alta concentraccedilatildeo de moleacuteculas de
adesatildeo que permitem a sua aderecircncia agrave ceacutelula hospedeira (RAZIN 1992) Acredita-
se que estas estruturas em algumas espeacutecies como Mycolasma penetrans de
origem humana estejam envolvidas na invasatildeo celular (LO et al 1992)
Os molicutes exibem estrita relaccedilatildeo aos hospedeiros e especificidade a tecidos
e oacutergatildeos que reflete as suas caracteriacutesticas nutricionais e adaptaccedilatildeo parasitaacuteria
Estas bacteacuterias podem ocorrer em hospedeiros e tecidos diferentes de seu ldquohabitatrdquo
normal entretanto como observado por Goulet et al (1995) existem variaccedilotildees e
54
eventualmente eacute possiacutevel isolar espeacutecies de siacutetios e hospedeiros diferentes
daqueles habituais (ERICKSON ROSS BOVE 1988 HORNOK et al 2012 ISO et
al 2013 RAZIN 1992 RAZIN YOGEV NAOT 1998 WAITES et al 1987)
A maioria dos molicutes vivem como comensais e em muitos artroacutepodes
podem mesmo ser considerados simbiontes Infecccedilotildees com micoplasmas
patogecircnicos satildeo raramente agudas e usualmente seguem um curso crocircnico (RAZIN
YOGEV NAOT 1998) Os Mollicutes principalmente as espeacutecies encontradas em
mamiacuteferos apesentam-se como parasitas ideais geralmente vivendo em harmonia
com seu hospedeiro mas por outro lado satildeo tambeacutem considerados como
ldquooportunistas ideaisrdquo Diversas doenccedilas nos seus respectivos hospedeiros satildeo
causadas ou associadas aos Mollicutes (RAZIN YOGEV NAOT 1998) Estas
bacteacuterias parecem preferir estabelecerem-se em nichos com ceacutelulas em constante
renovaccedilatildeo favorecendo a sua adesatildeo (GABRIDGE CHANDLER DANIELS 1985)
Micoplasmas em especial as espeacutecies com os menores genomas tecircm altas
taxas de mutaccedilatildeo o que sugere que eles estatildeo em um estado de evoluccedilatildeo raacutepida
Esses dados foram confirmados por estudos de sequecircncias de genes 5S rRNA que
incluiu uma seacuterie de acholeplasmas anaeroplasmas micoplasmas ureaplasmas e
Clostridium innocuum (BOVEacute 1999 RAZIN 1995 ROGERS et al 1985)
Quanto ao seu metabolismo os Mollicutes podem ser divididos em
fermentadores e natildeo-fermentadores Os fermentadores produzem aacutecidos por meio
da metabolizaccedilatildeo de glicose e de outros carboidratos diminuindo o pH do meio de
cultivo e os natildeo- fermentadores possuem a via da arginina-deidrolase para
obtenccedilatildeo de ATP aumentando o pH (RAZIN 1978 2004) Quando ambas as vias
ocorrem os aacutecidos produzidos da glicoacutelise podem mascarar a alcalinizaccedilatildeo do caldo
causada pela hidroacutelise da arginina (BASEMAN TULLY 1997 OLSON et al 1993
RAZIN 2004)
Um dos maiores empecilhos na pesquisa e no diagnoacutestico laboratorial das
infecccedilotildees causadas por molicutes tem sido a dificuldade em cultivaacute-los in vitro
Apresentam crescimento lento mesmo utilizando-se o meio de cultivo adequado
(RAZIN 1994) A temperatura de aproximadamente 37 ordmC eacute indicativa do ldquohabitatrdquo
natural dos molicutes que corresponde agrave dos mamiacuteferos reacutepteis peixes artroacutepodes
e plantas O crescimento e sobrevivecircncia dos molicutes em meio de cultura satildeo
dependentes do pH Para espeacutecies originaacuterias de plantas e vertebrados o pH oacutetimo
55
eacute de 74 e o crescimento ocorre entre pH 65 a 80 (RAZIN et al 1978) A inibiccedilatildeo
do crescimento pode ocorrer pela excessiva produccedilatildeo de aacutecidos ou aacutelcalis gerados
pelo metabolismo microbiano primaacuterio
Esses micro-organismos apresentam colocircnias de 50 ndash 500 μm de diacircmetro
usualmente em forma de ldquoovo fritordquo quando cultivados em meio soacutelido visualizadas
com o auxiacutelio de microscoacutepio estereoscoacutepio (Figura 4) Em meio liacutequido o
crescimento geralmente natildeo causa turvaccedilatildeo provocando somente alteraccedilatildeo no pH
revelado por um indicador presente no meio de cultura (MILES 1992 RAZIN 1998)
A complexidade dos requerimentos nutricionais a variaccedilatildeo na forma celular e a
fragilidade osmoacutetica fazem com que os Mollicutes estejam sob constantes
investigaccedilotildees quanto a sua fisiologia para relatar seu crescimento e ecologia As
condiccedilotildees sob as quais eles crescem podem influenciar na estrutura e
funcionamento das ceacutelulas hospedeiras sendo importante natildeo somente para os
fisiologistas como tambeacutem para todos micoplasmologistas envolvidos em estudos
quantitativos (BALABANOV et al 2006 MILLES 1992 RAZIN et al 1978
RODWELL 1983 TULLY 1985)
Figura 4 ndash Crescimento de M hominis em meio SP4 com a produccedilatildeo de colocircnia em forma de ldquoovo fritordquo (aumento 40X)
Fonte Arquivo pessoal
56
232 Mollicutes Microbiota Intestinal e Obesidade
A ocorrecircncia e participaccedilatildeo da classe Mollicutes na microbiota intestinal e sua
relaccedilatildeo com a obesidade ainda eacute praticamente desconhecida No entanto
Turnbaugh et al (2008) investigaram a relaccedilatildeo dieta ecologia microbiana intestinal e
o balanccedilo energeacutetico a partir de um modelo murino de obesidade induzido por meio
do consumo de uma dieta ocidental Observou-se que a dieta ocidental estimulou o
crescimento de organismos da classe Mollicutes que posteriormente foram
reduzidos por subsequentes manipulaccedilotildees dieteacuteticas para limitar o ganho de peso
O transplante de microbiota de ratos com obesidade induzida por dieta para
destinataacuterios germ-free promoveu uma maior deposiccedilatildeo de gordura do que em
animais que receberam o transplante a partir de doadores eutroacuteficos Metagenocircmica
e anaacutelises bioquiacutemicas do microbioma intestinal em conjunto com sequenciamento e
reconstruccedilotildees metaboacutelicas associadas ao intestino humano revelaram que a
bacteacuteria Eubacterium dolichum) (um membro da classe Mollicutes) apresenta
caracteriacutesticas que podem fornecer uma vantagem competitiva aos membros desse
ramo em relaccedilatildeo aos nutrientes da dieta ocidental Essas vantagens relacionam-se
com a importaccedilatildeo e transformaccedilatildeo de accediluacutecares simples atraveacutes do Sistema
fosfotransferase (PTS)
Sistemas fosfotransferase (PTS) satildeo uma classe de sistemas de transporte
envolvidas na absorccedilatildeo e na fosforilaccedilatildeo de uma grande variedade de hidratos de
carbono (DEUTSCHER et al 2006) Cada transportador envolve trecircs enzimas de
ligaccedilatildeo que atuam como receptores e doadores de grupos fosforil duas enzimas
citoplasmaacuteticas que atuam em todos os hidratos de carbono PTS importados (HPR e
EI) e o outro eacute um complexo de hidratos de carbono especiacutefico (EII)
compreendendo um ou dois domiacutenios integrais de membrana hidrofoacutebicos (EIIC D)
e dois domiacutenios hidrofiacutelicos (EIIA B) (DEUTSCHER et al 2006) Fosfoenolpiruvato
embora produzidos atraveacutes da glicoacutelise pode ser usado para gerar ATP (atraveacutes da
piruvatoquinase) ou usado para conduzir a importaccedilatildeo de accediluacutecares adicionais
atraveacutes da transferecircncia de um grupo fosfato para EI do PTS
Genes PTS satildeo encontrados em vaacuterias divisotildees de bacteacuterias incluindo
Proteobacterias tais como E coli bem como vaacuterios Firmicutes e Mollicutes
sequenciados (Por exemplo Mycoplasma genitalium M pneumoniae M pulmonis
M penetrans M gallisepticum M mycoides M mobile M hyopneumoniae M
57
synoviae e M capricolum) (KANEHISA et al 2004) O PTS tambeacutem desempenha
um papel na regulaccedilatildeo da expressatildeo do gene microbiano atraveacutes da repressatildeo
cataboacutelica permitindo que a ceacutelula passe a importar preferencialmente accediluacutecares
simples em relaccedilatildeo a outros hidratos de carbono (DEUTSCHER et al 2006)
Muacuteltiplos componentes do PTS estatildeo presentes no microbioma da dieta ocidental (EI
e HPr mais EII) o que poderia permitir a importaccedilatildeo de accediluacutecares simples (por
exemplo glicose e frutose que juntos formam sacarose um componente abundante
da dieta ocidental) bem como accediluacutecares associados com a mucosa do intestino do
hospedeiro (N-acetil-galactosamina) O microbioma da dieta ocidental tambeacutem
conteacutem genes que suportam o metabolismo destes accediluacutecares fosforilados para vaacuterios
produtos finais de fermentaccedilatildeo anaeroacutebia (por exemplo lactato e a cadeia curta de
aacutecidos graxos butirato e acetato (DEUTSCHER et al 2006)
58
3 OBJETIVOS
31 Objetivo geral
Analisar a participaccedilatildeo da Classe Mollicutes e dos Filos Firmicutes e Bacteroidetes
na microbiota intestinal de mulheres obesas e eutroacuteficas
32 Objetivos especiacuteficos
Determinar o estado nutricional das mulheres obesas do grupo caso e
eutroacuteficas do grupo controle
Determinar o consumo alimentar das mulheres obesas do grupo caso e
eutroacuteficas do grupo controle
Desenvolver um ensaio quantitativo por meio de TaqMan PCR para a
detecccedilatildeo de Mollicutes na microbiota intestinal de mulheres obesas e
eutroacuteficas
Quantificar os micro-organismos da Classe Mollicutes e dos Filos Firmicutes e
Bacteroidetes aleacutem de Bacteacuterias Totais por meio da PCR em tempo real em
amostras de fezes de mulheres obesas e eutroacuteficas
Analisar a liberaccedilatildeo de citocinas proacute-inflamatoacuterias IL-1 IL6 IL17-A e TNF-α
em amostras de sangue coletadas de mulheres obesas e eutroacuteficas
59
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
41 Protocolo do estudo
O presente estudo foi desenvolvido no laboratoacuterio de Micoplasmas do
Departamento de Microbiologia do Instituto de Ciecircncias Biomeacutedicas da Universidade
de Satildeo Paulo (ICB IIUSP) com o Ambulatoacuterio de Obesidade e Siacutendrome Metaboacutelica
do Serviccedilo de Endocrinologia do Hospital das Cliacutenicas da Universidade de Satildeo
Paulo (HC-FMUSP) O estudo foi aprovado pela Comissatildeo de Eacutetica em Pesquisa
Envolvendo Seres Humanos (CEPSH) do Instituto de Ciecircncias Biomeacutedicas da
Universidade de Satildeo Paulo (ICBUSP) (protocolo de pesquisa ndeg 110713) e pela
Comissatildeo de Eacutetica da Instituiccedilatildeo HC-FMUSP Todas as mulheres foram recrutadas a
partir da demanda espontacircnea do serviccedilo tendo sido inseridas no protocolo apoacutes
explicaccedilatildeo sucinta e individual do mesmo e assinatura do Termo de Consentimento
Livre e Esclarecido (TCLE) conforme preconiza a resoluccedilatildeo 19606 do Conselho
Nacional de Sauacutede
42 Casuiacutestica
As coletas foram realizadas entre os meses de Outubro de 2013 agrave Dezembro
de 2014 Para obtenccedilatildeo de resultados pela metodologia proposta para este estudo
a casuiacutestica foi de 40 mulheres sendo 20 diagnosticadas com obesidade
apresentando Iacutendice de massa corporal (IMCgt 30 kgm2) e 20 mulheres em eutrofia
(IMC entre 185 e 249 kgm2) As mulheres diagnosticadas com obesidade foram
recrutadas no grupo de Obesidade e Siacutendrome Metaboacutelica do serviccedilo de
Endocrinologia do Hospital das Cliacutenicas da Universidade de Satildeo Paulo (HC-
FMUSP)
Foram utilizados como criteacuterios de exclusatildeo para esse grupo a presenccedila de
quadros infecciosos com sinais cliacutenicos uso de antibioacuteticos (3 meses antes do
estudo) quimioterapia radioterapia gravidez uso de probioacuteticos cirurgias preacutevias
no Trato Gastrointestinal doenccedilas do Trato Gastrointestinal como Doenccedila de Crohn
e Siacutendrome do Coacutelon Irritaacutevel Devido ao fato de haver dificuldade para distinccedilatildeo de
alimentos classificados como prebioacuteticos a ingestatildeo destes natildeo foi incluiacuteda como
criteacuterio de exclusatildeo do estudo O grupo controle foi composto por mulheres adultas
60
eutroacuteficas recrutadas na comunidade sem nenhuma enfermidade aparente tendo
sido fixados os mesmos criteacuterios de exclusatildeo adotados para o grupo controle
43 Delineamento experimental
As mulheres foram submetidas agrave coleta de material fecal e de sangue aleacutem de
questionaacuterio semiestruturado como instrumento de coleta Tal instrumento foi
construiacutedo atraveacutes de consulta em perioacutedicos cientiacuteficos e livros acadecircmicos que
descrevem preditores importantes em relaccedilatildeo a fatores etioloacutegicos predisponentes e
mantedenores da obesidade e possiacutevel associaccedilatildeo com microbiota intestinal e
ambiente Foram consideradas questotildees que avaliavam histoacuteria familiar cliacutenica
obsteacutetrica ginecoloacutegica consumo de aacutelcool e tabaco aleacutem de questotildees que
avaliavam os haacutebitos alimentares como a praacutetica de dietas para emagrecer e
nuacutemero de refeiccedilotildees realizadas Foi utilizado para esse estudo o IPAQ (International
Physical Activity Questionnaire) versatildeo curta originalmente desenvolvido com
finalidade de estimar o niacutevel de praacutetica habitual de atividade fiacutesica de populaccedilotildees de
diferentes paiacuteses (BARROS NAHAS 2000) O questionaacuterio foi elaborado de modo a
facilitar a obtenccedilatildeo de informaccedilotildees durante a consulta com os pacientes e realizadas
por indiviacuteduos previamente instruiacutedos para o desenvolvimento do estudo tendo as
variaacuteveis sido agrupadas em 9 Seccedilotildees que representam a subcategorizaccedilatildeo das
variaacuteveis independentes para determinaccedilatildeo do perfil da populaccedilatildeo estudada (Anexo
B)
44 Determinaccedilatildeo do estado nutricional
441 Avaliaccedilatildeo qualitativa do consumo alimentar
Para investigar possiacuteveis relaccedilotildees entre alimentos e nutrientes da dieta e
microbiota intestinal utilizou-se o questionaacuterio de frequecircncia alimentar semi-quantitativo
(QFA) composto por 62 itens alimentares proposto por Fisberg et al (2008) que
desenvolveram um QFA para utilizaccedilatildeo em estudos epidemioloacutegicos com indiviacuteduos
adultos desenhados para testar hipoacuteteses epidemioloacutegicas e nutricionais em estudos
conduzidos primariamente em Satildeo Paulo para estimar o teor de nutrientes da dieta
61
habitual o que eacute de fundamental importacircncia para estimar a medida de exposiccedilatildeo aos
fatores dieteacuteticos e investigar as possiacuteveis associaccedilotildees com desfechos de interesse
Representou-se a frequecircncia de consumo alimentar em 8 categorias a saber
diaacuterio (mais de trecircs vezes por dia duas a trecircs vezes por dia uma vez por dia) semanal
(cinco a seis vezes por semana duas a quatro vezes por semana uma vez por
semana) mensal (uma a trecircs vezes por mecircs) e nunca ou quase nunca Os dados sobre
o consumo alimentar foram inseridos em planilha eletrocircnica com auxiacutelio do estudo de
Giacomello et al (2008) Inicialmente converteu-se a frequecircncia de consumo de cada
alimento em frequecircncia diaacuteria como proposto por Coelho et al (2011) Para tanto
atribuiu-se ao alimento valor 1 (um) quando consumido 1 vez ao dia Caso o alimento
fosse consumido mais de uma vez ao dia multiplicava-se o valor 1 pelo intervalo da
frequecircncia diaacuteria relatada Para as opccedilotildees que contemplaram intervalos de tempo
semanal e mensal utilizou-se a meacutedia do intervalo das frequecircncias dividido pelo
periacuteodo se semanal (7) e mensal (30) conforme descritos no Quadro 01
Quadro 01ndash Criteacuterios utilizados na estimativa da frequecircncia diaacuteria de consumo dos alimentos incluiacutedos no Questionaacuterio de Frequecircncia Alimentar
Frequecircncia Relatada Frequecircncia diaacuteria
3 ou mais vezesdia 31=3
2 a 3 vezesdia 251= 25
1 vezdia 11= 1
5 a 6 vezessemana 557= 079
2 a 4 vezessemana 37= 043
1vezsemana 17= 014
1 a 3 vezesmecircs 230= 007
1 vezmecircs 130= 003
NuncaQuase nunca 0
COELHO et al 2011
62
Posteriormente foram construiacutedos os grupos dos alimentos segundo o registro do
QFA Adotou-se como criteacuterio para a inclusatildeo do alimento no respectivo grupo o
consumo igual ou maior a 10 e as caracteriacutesticas nutricionais (HAIR et al 2005)
Considerando este criteacuterio foram construiacutedos 16 grupos de alimentos (1) massas (2)
preparaccedilotildees (3) carne vermelha e ovos (4) embutidos (5) carne branca (6) leite e
derivados (7) leguminosas (8) cereais raiacutezes e tubeacuterculos (9) hortaliccedilas (10) frutas
(11) industrializados (12) infusatildeo (13) bebida alcooacutelica (14) oacuteleos e gorduras (15)
lanches (16) accediluacutecares e doces
Os dados referentes ao QFA tambeacutem foram utilizados para calcular o consumo
energeacutetico e de nutrientes Primeiramente estes foram transformados em gramas
utilizando-se uma tabela para avaliaccedilatildeo de consumo alimentar em medidas caseiras
(PINHEIRO et al 2002) e em seguida lanccedilados no Software Excel para digitaccedilatildeo dos
dados do consumo alimentar e para o caacutelculo de consumo de macro e micronutrientes
Para preencher o banco de dados do Software com alimentos e preparaccedilotildees
consumidas pelas participantes foram utilizadas as Tabelas de composiccedilatildeo de
alimentos PHILIPPI (2002) e TACO (2006) com a Tabela de medidas caseiras
(PINHEIRO et al 2005) aleacutem de dados adicionais de Composiccedilatildeo quiacutemica de alimentos
compilados da Tabela de Composiccedilatildeo de Alimentos da Fundaccedilatildeo Instituto brasileiro de
Geografia e Estatiacutestica (IBGE) Os valores obtidos foram comparados com os valores de
recomendaccedilatildeo propostos pelo United States Departament of Agriculture (USDA) em
seus documentos Dietary References Intakes (DRI) referentes aos valores de Estimated
Average Requirements (EAR) e para os nutrientes que ainda natildeo possuem esse valor
definido utilizou-se como paracircmetro valores de Adequate Intake (AI)
442 Avaliaccedilatildeo antropomeacutetrica do estado nutricional
A mensuraccedilatildeo do peso corporal em quilogramas (kg) foi realizada em
duplicata considerando-se o peso meacutedio Para tal foi utilizada uma balanccedila digital
Filizolareg com capacidade maacutexima para 150 kg e precisatildeo de 100 g estando as
participantes da pesquisa descalccedilas e com roupas leves A estatura em centiacutemetros
(cm) foi realizada em duplicata considerando-se a estatura meacutedia As medidas
foram determinadas por meio de um estadiocircmetro graduado em centiacutemetros com
precisatildeo de 10 mm apresentando barra de madeira vertical e fixa com esquadro
moacutevel para posicionamento sobre a cabeccedila do indiviacuteduo quando os mesmos
63
estavam descalccedilos em posiccedilatildeo ereta com os peacutes paralelos calcanhares
panturrilhas gluacuteteos ombros e cabeccedila encostados no estadiocircmetro olhando-se
para frente
O Iacutendice de Massa Corpoacuterea (IMC) foi calculado pelo peso e estatura a partir
das quais foi determinada a relaccedilatildeo entre o peso e altura em metros ao quadrado e
avaliado segundo os pontos de corte preconizados pela OMS assim designados
baixo peso (IMC lt 185 Kgaltura2) eutrofia (IMC= 185 a 249 kgaltura2) sobrepeso
(IMC= 25 a 299 Kgaltura2) e obesidade (IMC gt30 Kg altura2) (WHO 1998)
4421 Anaacutelise da Composiccedilatildeo Corporal pelo Meacutetodo de Bioimpedacircncia
O aparelho de bioimpedacircncia eleacutetrica utilizado para a avaliaccedilatildeo da composiccedilatildeo
corporal foi o InBody 720 (Biospace Coreia) que consiste em bioimpedacircncia
octopolar atraveacutes de oito pontos de contato pelos quais passa a corrente eleacutetrica na
extremidade dos quatro membros determinando a porcentagem de gordura e massa
magra em cada membro assim como no tronco
A avaliaccedilatildeo foi realizada respeitando os procedimentos apresentados no
respectivo manual de uso do aparelho atendendo as seguintes condiccedilotildees de preacute-
teste (1) estar em jejum (2) natildeo consumir aacutelcool 48 horas antes do teste (3) natildeo
realizar exerciacutecio de intensidade moderada a elevada nas 12 horas antes da
avaliaccedilatildeo (4) natildeo efetuar o exame perante em estado febril ou de desidrataccedilatildeo (5)
natildeo utilizar bijuterias metaacutelicas ou implantes dentaacuterios com metal (6) natildeo ingerir cafeacute
e (7) realizar a avaliaccedilatildeo com roupa de banho ou roupas iacutentimas
O relatoacuterio da bioimpedacircncia Octopolar eacute dividido em quatro partes
informativas de dados obtidos
1 Anaacutelise da Composiccedilatildeo Corporal identifica como estaacute distribuiacuteda a aacutegua
corporal total percentual de massa magra e massa de gordura livre
2 Anaacutelise Muacutesculo-gordura mostra em kg o peso a massa de muacutesculo
esqueleacutetico e a massa de gordura
3 Diagnoacutestico da obesidade discrimina o IMC PGC (porcentagem de
gordura corporal) e RCQ (relaccedilatildeo cintura-quadril)
4 Aacuterea de Gordura Visceral informa a aacuterea de gordura visceral em cm2
64
45 Coleta das amostras cliacutenicas
Para a obtenccedilatildeo das amostras de fezes as mulheres foram previamente
instruiacutedas de acordo com o National Committee for Clinical Laboratory Standards
NCCCLS (2007) evacuando diretamente no coletor plaacutestico esteacuteril fornecido
juntamente com luvas espaacutetula coletora e etiqueta de identificaccedilatildeo O material foi
acondicionado em caixa isoteacutermica resfriada com gelo e transportado
imediatamente ao Laboratoacuterio de Micoplasmas ICBUSP As amostras de fezes
foram distribuiacutedas em aliquotas (180-200 ug) em microtubos e acondicionadas -80oC
ateacute a anaacutelise laboratorial
Para a realizaccedilatildeo da coleta do material sanguiacuteneo o operador munido de EPIs
realizou punccedilatildeo venosa perifeacuterica preferencialmente em membro superior natildeo
dominante Foram coletados cerca de 5 mL de sangue por tubopaciente tendo sido
utilizados tubos natildeo-heparinizados que foram conservados de forma similar aos
coletores em caixa isoteacutermica refrigerada O material obtido foi levado ateacute o
Laboratoacuterio de Micoplasmas ICBUSP onde as amostras foram centrifugadas a
3500 rpm para obtenccedilatildeo do soro seguido de sua distribuiccedilatildeo em aliacutequotas de cerca
de 1 mL e estocados a -80 degC ateacute o uso
65
46 Determinaccedilatildeo da microbiota intestinal
461 Padronizaccedilatildeo de reaccedilatildeo de PCR quantitativo (qPCR) por meio de TaqMan para a detecccedilatildeo de Mollicutes
4611 Cepas bacterianas e condiccedilotildees de cultura
Como controle positivo utilizou-se a cepa ATCC 23114 (PG-21) de M hominis
Tambeacutem foram utilizados como controle os seguintes micro-organismos obtidos da
coleccedilatildeo do Laboratoacuterio de Micoplasmas ICBUSP Mycoplasma bovis Donetta M
arginini G230 M dispar M2979 M pneumoniae M pulmonis PG34 M
gallisepticum PG31 M synoviae WUU1853 M penetrans ATCC 55252 (GTU 54)
M fermentans PG18 M pulmonis PG34 M hyorhinis M genitalium ATCC 33530
(G37) M buccale M edwardii PG24 M gateae M faucium M felis CO M bovis
Spiroplasma mirum (SMCA) Acholeplasma laidlawii PG38 Ureaplasma diversum
ATCC 449782 U urealyticum T960 Escherichia coli ATCC 25922 Klebsiella
pneumoniae ATCC 13883 Streptococcus pyogenes ATCC 12345 Salmonella
typhimurium C5 CIP Pseudomonas aeruginosa ATCC 10145 Staphylococcus
aureus ATCC 25293 e Bacillus cereus As cepas referentes aos micro-organismos
Bacteroides fragilis C45A AUS 00306 e Clostridium perfringens foram cedidas pelo
Professor Dr Jorge Luiz Melo Sampaio pesquisador associado do Instituto Fleury
As espeacutecies de Ureaplasmas foram cultivadas em meio UB especiacutefico para
ureaplasma com 5 de CMRL-1066 (com glutamina e sem bicarbonato) enquanto
as espeacutecies de Micoplasmas foram cultivadas em meio de cultura SP4 como
descrito por Tully et al (1995) As bacteacuterias com parede celular incluiacutedas como
controles foram cultivadas em meio de infusatildeo de ceacuterebro-coraccedilatildeo (BHI) Destas
cepas o DNA foi extraiacutedo a partir de culturas em fase logariacutetmica por meio do kit
Pure Linktrade Genomic DNA da Invitrogenreg
4612 Desenvolvimento de primers e sonda para a detecccedilatildeo de Mollicutes pela PCR quantitativa
Os oligonucleotiacutedeos iniciadores e as sondas foram selecionadas com base no
fragmento conservado do gene 16S rRNA especiacutefico para a classe Mollicutes As
sequecircncias do gene 16S rRNA de micoplasmas foram alinhadas utilizando o
algoritmo ClustalW do Software MEGA4 As regiotildees variaacuteveis foram selecionadas
66
manualmente para o sequencionamento dos iniciadores e sondas utilizadas neste
ensaio Propriedades dos oligonucleotiacutedeos foram tambeacutem analisadas pelo Software
Primer Express ver 30 (Applied Biosystems Life Technologies Corporation
Carlsbad CA EUA) A especificidade dos iniciadores e da sonda foi testada ldquoin
silicordquo utilizando algoritmos BLAST
O quadro 02 mostra as sequecircncias forward e reverse selecionadas para
amplificar um fragmento conservado do gene 16S rRNA especiacutefico de Mollicutes A
sonda TaqMan especiacutefica para o fragmento amplificado foi desenvolvida por uma
fonte comercial (Applied Biosystems Life Technologies Corporation)
Quadro 2 - Sequecircncias dos iniciadores utilizados para amplificaccedilatildeo do gene 16S rRNA para Mollicutes
Iniciadores Sequecircncia
Molli1 5 GCA TTA GAT GAT CCG CCT GAG T 3
Molli2 5 GTC CCC GTC AAT TCC TTT AAG TT 3
Sonda 5 GTC CCC GTC AAT TCC TTT AAG TT 3
4613 PCR quantitativa
Ensaios de quantificaccedilatildeo absoluta do DNA alvo foram realizados com sistema
de PCR em tempo real (qPCR) StepOne (Applied Biosystems Life Technologies
Corporation) Diferentes concentraccedilotildees de cada primer iniciador e sonda foram
testados para aprimorar a reaccedilatildeo de qPCR Considerou-se ideal as seguintes
caracteriacutesticas r2 ge 0950 eficiecircncia entre 95 a 105 e slope proacuteximo de -332
A melhor reaccedilatildeo obtida foi a partir de 625 microl de Universal PCR Master Mix
(Applied Biosystems) 1 microM de cada iniciador 05 microM de sonda TaqMan MGB
marcada com corante fluorescente 25 microl de DNA extraiacutedo e aacutegua sem RNase para
o volume final de 125 microl As condiccedilotildees de amplificaccedilatildeo foram 50 degC por 10 min 95
degC por 10 min e 45 ciclos de desnaturaccedilatildeo a 95 degC durante 15 s anelamento a 59
degC durante 1 min Todas as reaccedilotildees foram realizadas em duplicata no aparelho
PCR em tempo real StepOnePlus (Applied Biosystems)
67
Para a construccedilatildeo de padrotildees de DNA para a quantificaccedilatildeo absoluta utilizou-
se como controle positivo a cepa de referecircncia ndash M hominis ATCC 23114 (PG-21)
que foi inicialmente cultivada em 1 ml de caldo SP4 a 37 degC e expandidos ateacute 100
ml Na fase de crescimento logariacutetmico (com base em alteraccedilotildees colorimeacutetricas) a
cultura foi centrifugada a 20600 rpm durante 30 minutos a 25 degC O DNA foi extraiacutedo
usando o kit PureLinktrade Genomic DNA Mini O nuacutemero de coacutepias de DNA genocircmico
foi calculado por espectrofotometria (NanoDrop ND -1000 WITec Ag Littau Suiacuteccedila)
Diluiccedilotildees decimais (107- 1 coacutepiasl) do DNA de M hominis para curva padratildeo foram
preparadas e analisadas
Os dados foram obtidos durante a etapa de anelamento e analisados pelo
Software StepOne 21 (Applied Biosystems Life Technologies Corporation) O limiar
foi ajustado manualmente dentro da curva logariacutetmica acima do niacutevel de detecccedilatildeo
basal e abaixo da fase linear e do platocirc O ciclo limiar (Ct-threshold cycle) das
diluiccedilotildees do genoma foi plotado contra o nuacutemero de log de coacutepias do genoma e
utilizado como entrada para criar a curva padratildeo Anaacutelises de regressatildeo linear foram
aplicadas para calcular os valores de r2 e do slope Assumindo a eficiecircncia de 100
se o molde de DNA eacute duplicado em cada ciclo a eficiecircncia da PCR foi calculada
como E= 10 (-1slope) - 1 onde E eacute a eficiecircncia da PCR
4614 Especificidade da qPCR e repetibilidade intra e inter-ensaios
O DNA dos micro-organismos utilizados como controles foi testado para
verificar a especificidade dos ensaios de qPCR (descrito em cepas bacterianas) A
repetibilidade intra-ensaio foi determinada executando cinco repeticcedilotildees das diluiccedilotildees
do genoma de M hominis (107 a 1 coacutepia do genoma bacterianoreaccedilatildeo) na mesma
reaccedilatildeo A curva padratildeo foi gerada utilizando o software StepOne 21 (Applied
Biosystems Life Technologies Corporation) A repetibilidade inter-ensaio foi obtida
por reaccedilotildees em triplicatas com a mesma diluiccedilatildeo do genoma em trecircs ensaios
diferentes em dias separados e consecutivos Estas repeticcedilotildees foram aplicadas
para determinar a meacutedia o desvio padratildeo e o coeficiente de variaccedilatildeo em valores de
Ct para cada diluiccedilatildeo do genoma
68
462 Reaccedilatildeo em cadeia da polimerase (PCR) convencional
As amostras cliacutenicas tambeacutem foram submetidas a PCR convencional para a
detecccedilatildeo da Classe Mollicutes utilizando-se dos os iniciadores descritos por Van
Kuppeveld et al (1992) Aacutegua livre de nuclease foi utilizada como controle negativo
em ambos os ensaios Os produtos amplificados foram analisados em gel de
agarose a 15 com brometo de etiacutedio 05 mmmL e tampatildeo TAE (Trisacetate 40
mM EDTA 2 mM pH 80) Os produtos foram visualizados e foto documentados sob
luz ultravioleta utilizando um sistema foto documentador (Vilber Lourmat Marne-la-
Vallee Franccedila)
463 Detecccedilatildeo de micro-organismos dos filos Firmicutes e Bacteroidetes e bacteacuterias totais (Eubacterias) por PCR em tempo Real (qPCR)
Para a construccedilatildeo de padrotildees de DNA para a quantificaccedilatildeo absoluta de
Firmicutes e Bacteroidetes utilizou-se como controles positivos as cepas de
referecircncias ndash Clostridium perfringens e Bacteroides fragilis respectivamente Para a
quantificaccedilatildeo de Bacteacuterias Totais (Eubacteacuterias) foi utilizado como controle positivo
Clostridium perfringens Os controles foram submetidos agrave extraccedilatildeo de DNA por meio
do kit QIAamp DNA stool ndash QIAGEN baseado no protocolo de extraccedilatildeo sugerido
pelo fabricante Para os filos Firmicutes Bacteroidetes assim como Bacteacuterias totais
foram utilizadas sequencias de iniciadores descritos por Guo et al (2008)
apresentadas no quadro 3
69
Quadro 3 ndash Sequecircncias dos iniciadores utilizados para amplificaccedilatildeo do gene 16S rRNA para Firmicutes Bacteroidetes e Bacteacuterias Totais (Eubacteacuterias)
Iniciadores Sequecircncia Referecircncia
Firm934F 5 GGA GYA TGT GGT TTA ATT CGA AGC A 3 GUO et al 2008
Firm1060R 5 AGC TGA CGA CAA CCA TGC AC 3
Bact934F 5 GGA RCA TGT GGT TTA ATT CGA TGA T 3 GUO et al 2008
Bact1060R 5 AGC TGA CGA CAA CCA TGC AG 3
Eub338F 5 ACT CCT ACG GGA GGC AGC AG 3 FIERER et al 2005
Eub518R 5 ATT ACC GCG GCT GCT GG 3
Os micro-organismos foram quantificados de modo absoluto baseando-se em
curva padratildeo previamente estabelecida Para cada reaccedilatildeo finalizada uma nova
curva padratildeo foi adicionada e paracircmetros de qualidade foram adotados na anaacutelise
sendo estes r2 ge 0950 eficiecircncia da reaccedilatildeo variando de 95 a 105 e slope
proacuteximo de -332
As reaccedilotildees de qPCR foram realizadas em volume final de 125 μL com 625
μL da mistura universal SYBR Green (Applied Biosystems Satildeo Paulo SP Brasil)
0 25 μM de cada primer especiacutefico 45μL de aacutegua e 125 μl de DNA extraiacutedo com
volume final de 125 μL As quantificaccedilotildees foram realizadas utilizando-se a
plataforma Applied Biosystems (Life Technologies Corporation) com os seguintes
paracircmetros 50 degC por 10 minutos 95 degC por 10 minutos seguidos de 45 ciclos de
95 degC por 15 segundos e 60degC por 1 minuto seguidas da curva de melting (15
segundos a 95 degC 1 minuto a 60 degC 15 segundos a 95 degC e 15 segundos e 60 degC)
47 Dosagem de citocinas do soro sanguiacuteneo
A dosagem das citocinas IL-1β TNF-α IL-10 e IL17-A foram realizadas
utilizando-se kit de ELISA de captura (eBioscience San Diego C A Estados
Unidos) em placas de poliestireno com 96 orifiacutecios e alta absorccedilatildeo de acordo com
protocolo indicado pelo fabricante Apoacutes padronizaccedilatildeo da curva padratildeo a aliacutequota
de 100 microL do sobrenadante das ceacutelulas foi utilizada para dosar as citocinas IL-1β
TNF-α IL-10 e IL17-A A leitura foi realizada com instrumento leitor de ELISA Vivid
70
Vision com comprimento de onda de 450 nm Os dados obtidos em absorbacircncia
foram transformados em picomols por meio de foacutermula matemaacutetica
48 Anaacutelises Estatiacutesticas
As anaacutelises estatiacutesticas da presenccedila dos microrganismos da classe Mollicutes
detectados nas amostras cliacutenicas e dos dados obtidos dos questionaacuterios foram
avaliados por meio do software SPSS 200 (SPSSreg Inc Chicago Estados Unidos)
Para comparar variaacuteveis de consumo alimentar e as variaacuteveis relacionadas ao perfil
da populaccedilatildeo estudada entre os grupos caso e controle foi aplicado Teste de qui-
quadrado de Pearson ou Teste Exato de Fisher tendo sido considerado plt005 e IC
95 O teste t que compara meacutedia entre grupos foi utilizado para verificar a
existecircncia de associaccedilatildeo entre as variaacuteveis desfecho (mulheres obesas x mulheres
eutroacuteficas) e as variaacuteveis Mollicutes (presenccedila x ausecircncia) com o consumo
alimentar dos macronutrientes carboidratos proteiacutenas lipiacutedeos e fibras (p le 005)
Unidos) Aleacutem disso para verificaccedilatildeo de associaccedilatildeo entre as variaacuteveis desfecho e a
presenccedila de Mollicutes foi aplicado Teste de qui-quadrado de Pearson ou Teste
Exato de Fisher tendo sido calculada a razatildeo de chances (odds ratio) (IC 95)
com o objetivo de verificar o poder da associaccedilatildeo entre as variaacuteveis supracitadas
Para verificar as distribuiccedilotildees de cargas dos micro-organismos estudados em
ambos os grupos avaliados inicialmente foi utilizado o teste de normalidade de
Shapiro-Wilk que demonstrou natildeo satisfazer a preacute-suposiccedilatildeo para utilizaccedilatildeo de um
teste parameacutetrico A partir desse resultado foi utilizado o teste natildeo-parameacutetrico de
Mann-Whitney amplamente utilizado para amostras pareadas que natildeo seguem
distribuiccedilatildeo normal As anaacutelises foram realizadas utilizando o programa estatiacutestico
GraphPad Prism versatildeo 500 (GraphPad Software San Diego California USA)
sendo estabelecida a existecircncia de significacircncia estatiacutestica quando o valor de p le
005 em todas as anaacutelises
Para anaacutelise dos dados de quantificaccedilatildeo das citocinas tambeacutem foi utilizado o
programa GraphPad Prism versatildeo 500 (GraphPad Software San Diego California
USA) tendo sido realizado o teste natildeo-parameacutetrico de Mann-Whitney
71
5 RESULTADOS
51 Perfil da populaccedilatildeo estudada
A amostragem do estudo envolveu 40 mulheres sendo 20 classificadas com
obesidade (IMC gt30 Kgm2) e 20 em eutrofia (IMC 185 - 249 Kgm2) com meacutedia de
idade de 38 anos para todas as mulheres 44 anos (DP 93 Amplitude 28-57) para
as mulheres obesas do grupo caso e 33 anos (DP 1204 Amplitude22-66) para as
mulheres eutroacuteficas do grupo controle
No presente estudo as variaacuteveis foram agrupadas em 9 Seccedilotildees com
resultados descritivos representados nas tabelas de 1 a 9 que representam a
subcategorizaccedilatildeo das variaacuteveis independentes para determinaccedilatildeo do perfil da
populaccedilatildeo estudada
O grupo das mulheres obesas foi caracterizado pela maioria de cor preta
parda ou indiacutegena (70) onde as moleacutestias atuais associadas mais frequentes
foram hipertensatildeo (30) dispneia (35) constipaccedilatildeo (35) refluxo (35) e
alteraccedilatildeo menstrual (55) A maioria das mulheres nasceram de parto normal
(75) foram amamentadas (90) jaacute tiveram filhos (70) e foram classificadas
como fisicamente ativas (60) Aleacutem disso 13 (65) das mulheres do grupo caso
referiram fazer trecircs ou mais refeiccedilotildees por dia Em relaccedilatildeo ao grupo das mulheres
eutroacuteficas esse foi caracterizado pela maioria de cor branca ou amarela (55) onde
as moleacutestias atuais associadas mais frequentes foram hipercolesterolemia (5)
dispneia (5) gastrite (15) e constipaccedilatildeo (20) Metade das mulheres nasceram
de parto normal (50) e foram amamentadas (85) enquanto 2 (10) tiveram
filhos e 9 (55) foram classificadas como fisicamente ativas Assim como o grupo
caso 13 (65) das mulheres do grupo controle referiram fracionar sua refeiccedilatildeo em
trecircs ou mais por dia
Aleacutem disso observa-se com base nos resultados estatiacutesticos que houve
variaccedilatildeo significativa na comparaccedilatildeo das variaacuteveis relacionadas ao perfil da
populaccedilatildeo estudada Em relaccedilatildeo agrave Seccedilatildeo 1 Histoacuteria Cliacutenica foram encontradas
variaccedilotildees significativas para as variaacuteveis associadas ao trato gastrintestinal
flatulecircncia (p=0008) refluxo (p=0018) azia (p=0008) e para as variaacuteveis
associadas agrave Moleacutestia atual hipertensatildeo (p=0008) dispneacuteia (p=0008) e alteraccedilatildeo
menstrual (p=0000) Em relaccedilatildeo agrave Seccedilatildeo 4 Histoacuteria Obsteacutetrica foi encontrada
72
variaccedilatildeo significativa para a variaacutevel gestaccedilatildeo (p=0000) Para a Seccedilatildeo 5 Histoacuteria
ginecoloacutegica observou-se variaccedilatildeo estatiacutestica para a variaacutevel menopausa (p=0038)
Tabela 1 ndash Determinaccedilatildeo do perfil da populaccedilatildeo estudada referente agrave Seccedilatildeo 1 Dados socioeconocircmicos Satildeo Paulo SP 2013-2014
Nota n= 20 mulheresa ndash Considerou-se como valor de Salaacuterio Miacutenimo (R$ 67800) ndash Significacircncia estatiacutestica quando p-valor le 005
Tabela 2 ndash Determinaccedilatildeo do perfil da populaccedilatildeo estudada referente agrave Seccedilatildeo 2 Histoacuteria Familiar Satildeo Paulo SP 2013-2014
Nota n= 20 mulheres a ndash Referente agrave parentes de primeiro grau paternos e maternos aleacutem de irmatildeos ndash Significacircncia estatiacutestica quando p-valor le 005
Variaacuteveis
Grupo Caso n ()
Grupo Controle n ()
IC 95 P
Raccedilacor
009-128 0110 PretaPardaIndiacutegena BrancaAmarela
14 (70) 6 (30)
9 (45) 11 (55)
Escolaridade
096-128 0147 lt Ensino Meacutedio ge Ensino Meacutedio
1 (5) 19(95)
0 (0) 20 (100)
Relaccedilatildeo Estaacutevel
023-283 0752 Sim Natildeo
11 (55) 9 (45)
10 (50) 10 (50)
Renda familiar
010-155 0185 lt 2 salaacuterios miacutenimosa ge 2 salaacuterios miacutenimosa
9 (45) 11 (55)
5 (25) 15 (75 )
Variaacuteveis
Grupo Caso n ()
Grupo Controle n ()
IC 95 P
Famiacutelia hipertensatildeo
006-120 0077 Sim Natildeo
17 (85) 3 (15)
12 (60) 8 (40)
Famiacutelia diabetesa
013-157 0206 Sim Natildeo
12 (60) 8 (40)
8 (40) 12 (60)
Famiacutelia obesidadea
007-106 0058 Sim Natildeo
13 (65) 7(35)
7 (35) 13 (65)
Famiacutelia hipercolesterolemiaa
035-430 0749 Sim Natildeo
11 (55) 9 (45)
12 (60) 8 (40)
Famiacutelia Doenccedilas Caacuterdio-vasculares (DCV)a
029-345 1000 Sim Natildeo
10 (50) 10 (50)
10 (50) 10 (50)
73
Tabela 3 ndash Determinaccedilatildeo do perfil da populaccedilatildeo estudada referente agrave Seccedilatildeo 3 Histoacuteria Cliacutenica Satildeo Paulo SP 2013-2014
Nota n=20 mulheres a- Histoacuterico cliacutenico das pacientes em relaccedilatildeo agrave alteraccedilotildees gastrintestinais moleacutestia atual e uso de laxantes- Diferenccedila estatiacutestica natildeo computada pois a variaacutevel eacute uma constante
Variaacuteveis
Grupo Caso n ()
Grupo Controle n ()
IC 95 P
TGI constipaccedilatildeoa
003-115 0058 Sim Natildeo
7 (35) 13 (65)
2 (10) 18 (90)
TGI flatulecircnciaa
107-190 0008 Sim Natildeo
6 (30) 14 (70)
0 (0) 20 (100)
TGI refluxoa
001-089 0018 Sim Natildeo
7 (35) 13 (65)
1 (5) 19 (95)
TGI aziaa
107-190 0008 Sim Natildeo
6 (30) 14 (70)
0 (0) 20 (100)
TGI uacutelceraa
095-116 0311 Sim Natildeo
1 (5) 19 (95)
0 00) 20 (100)
TGI gastritea Sim Natildeo
2 (10)
18 (90)
3 (15)
17 (85) 023-107 0633
TGI naacuteuseasa Sim Natildeo
3 (15)
17(85)
1 (5)
19 (95) 002-314 0292
TGI vocircmitosa Sim Natildeo
1 (5)
19 (95)
0 (0)
20 (100) 095-116 0311
TGI diarreacuteiaa Sim Natildeo
0 (0)
20(100)
0 (0)
20 (100)
Moleacutestia atual hipertensatildeoa Sim Natildeo
6 (30)
14 (70)
0 (0)
20 (100) 107-190 0008
Moleacutestia atual diabetesa Sim Natildeo
0 (0)
20 (100)
0 (0)
20 (100)
Moleacutestia atual hipercolesterolemiaa Sim Natildeo
5 (25)
15 (75)
1 (5)
19 (95) 001-150 0077
Moleacutestia atual DCVa Sim Natildeo
2 (10)
18 (90)
0 (0)
20 (100) 096-128 0147
Moleacutestia atual Dispneacuteiaa Sim Natildeo
7 (35)
13 (65)
1 (5)
19 (95) 001-089 0018
Moleacutestia atual alteraccedilatildeo menstruala Sim Natildeo
11 (55)
9 (45)
0 (0)
20 (100) 136-360 0000
Uso de laxantesa Sim Natildeo
3 (15)
17 (85)
0 (0)
20 (100) 097-141 0072
74
Tabela 4 ndash Determinaccedilatildeo do perfil da populaccedilatildeo estudada referente agrave Seccedilatildeo 4 Histoacuteria Obsteacutetrica Satildeo Paulo SP 2013-2014
Nota n= 20 mulheres andash Foram considerados aspectos relacionados as pacientes em seu nascimento e na maternidade ndash Significacircncia estatiacutestica quando p-valor le 005
Variaacuteveis
Grupo Caso n ()
Grupo controle n ()
IC 95 P
Nascimento por parto cesaacutereaa
078-1144 0102 Sim Natildeo
5 (25) 15(75)
10 (50) 10 (50)
Nascimento por parto normala
008-127 0102 Sim Natildeo
15 (75) 5 (25)
10 (50) 10 (50)
Foi amamentadaa
009-424 0633 Sim Natildeo
18 (90) 2 (30)
17 (85) 3 (15)
Teve alguma gestaccedilatildeoa
0008-0273 0000 Sim Natildeo
14 (70) 6 (30)
2 (10) 18 (90)
Sofreu algum abortoa Sim Natildeo
2 (10)
18 (90)
2 (10)
18 (90) 096-128 0147
75
Tabela 5 ndash Determinaccedilatildeo do perfil da populaccedilatildeo estudada referente agrave Seccedilatildeo 5 Histoacuteria Ginecoloacutegica Satildeo Paulo SP 2013-2014
Nota n= 20 mulheres andash Idade meacutedia em que todas as mulheres estudadas comeccedilaram a ingerir
contraceptivo 22 anos ndash Significacircncia estatiacutestica quando p-valor le 0005
Tabela 6 ndash Determinaccedilatildeo do perfil da populaccedilatildeo estudada referente agrave Seccedilatildeo 6 Consumo atual de tabaco Satildeo Paulo SP 2013-2014
Nota n= 20 mulheres ndash Significacircncia estatiacutestica quando p-valor le 005
Variaacuteveis
Grupo Caso n ()
Grupo Controle n ()
IC 95 P
Menopausa
004-097 0038 Sim Natildeo
9 (45) 11(55)
3 (15) 17 (85)
Usou ou estaacute usando contraceptivo
021-470 1000 Sim Natildeo
16 (80) 4 (20)
16 (80) 14 (20)
Contraceptivo hormonal
041-633 0490 Sim Natildeo
13 (65) 7 (35)
15 (75) 5 (25)
Contraceptivo natildeo hormonal
002-314 0292 Sim Natildeo
3 (15) 17(85)
1 (5) 19 (95)
Idade que comeccedilou a ingerir ge 22 anosa
011-156 0197 Sim Natildeo
10 (50) 10 (50)
6 (30) 14 (70)
Idade que comeccedilou a ingerir lt 22 anosa Sim Natildeo
2 (10)
18 (90)
2 (10)
18 (90) 063-853 0197
Variaacuteveis
Grupo Caso n ()
Grupo Controle n ()
IC 95 P
Consumo atual de tabaco
002-207 0151 Sim Natildeo
4 (20) 16 (80)
1 (5) 19 (95)
Jaacute consumiu tabaco
023-418 1000 Sim Natildeo
5 (25) 15 (75)
5 (25) 15 (75)
76
Tabela 7 ndash Determinaccedilatildeo do perfil da populaccedilatildeo estudada referente agrave Seccedilatildeo 7 Consumo atual de aacutelcool Satildeo Paulo SP 2013-2014
Nota n= 20 mulheres ndash Significacircncia estatiacutestica quando p-valor le 005
Tabela 8 ndash Tabela de determinaccedilatildeo do perfil da populaccedilatildeo estudada referente agrave Seccedilatildeo 8 Atividade Fiacutesica (IPAQ versatildeo curta) Satildeo Paulo SP 2013-2014
Nota n= 20 mulheres andash Para a classificaccedilatildeo foi utilizado o IPAQ (International Physical Activity Questionnaire) versatildeo curta Irregularmente ativa Irregularmente ativa A e B ndash Significacircncia estatiacutestica quando p-valor le 005
Variaacuteveis
Grupo Caso n ()
Grupo Controle n ()
IC 95 P
Consumo atual de aacutelcool
052-643 0342 Sim Natildeo
8 (40) 12 (60)
11 (55) 9 (45)
Variaacuteveis
Grupo Caso n ()
Grupo Controle
IC 95 P
Niacutevel de atividade fiacutesica
015-191 0342 Ativaa Irregularmente ativaa
12 (60) 8 (40)
9 (45) 11 (55)
77
Tabela 9 ndash Tabela de determinaccedilatildeo do perfil da populaccedilatildeo estudada referente agrave Seccedilatildeo 9 Mudanccedilas recentes nos haacutebitos alimentares Satildeo Paulo SP 2013-2014
Nota n= 20 mulheres andash Meacutedia de refeiccedilotildees diaacuterias 3 refeiccedilotildees - Diferenccedila estatiacutestica natildeo
computada pois a variaacutevel eacute uma constante ndash Significacircncia estatiacutestica quando p-valor le 005
Variaacuteveis
Grupo Caso n ()
Grupo Controle
n ()
IC 95 P
Mudou haacutebitos alimentares recentemente
007-151 0144 Sim Natildeo
7 (35) 13 (65)
3 (15) 17 (85)
Mudou haacutebitos alimentares recentemente para perda de peso
007-151 0144 Sim Natildeo
7 (35) 13 (65)
3 (15) 17 (85)
Mudou haacutebitos alimentares recentemente para dieta vegetariana ou restriccedilatildeo de consumo carne
Sim Natildeo
0(0) 20(100)
0(0) 20(100)
Mudou haacutebitos alimentares recentemente restriccedilatildeo de consumo sal
Sim Natildeo
0(0) 20(100)
0(0) 20(100)
Mudou haacutebitos alimentares recentemente para reduccedilatildeo do colesterol
Sim Natildeo
0(0) 20(100)
0(0) 20(100)
ge refeiccedilotildeesdiaa
Sim Natildeo
13(65) 7(35)
14(70) 6(30)
033-473 0736
lt refeiccedilotildeesdiaa
Sim Natildeo
7(35)
13(65) 7(35)
13(65) 027-366 1000
Desjejum diariamente
051-900 0288 Sim Natildeo
13 (35) 7(65)
16 (80) 4 (20)
Costuma beliscar entre as refeiccedilotildees
035-430 0749 Sim Natildeo
11 (55) 9 (45)
12 (60) 8 (40)
Costuma ingerir liacutequidos durante as refeiccedilotildees
009-154 0168 Sim Natildeo
16 (80) 4 (20)
12 (60) 8 (40)
Costuma fazer refeiccedilotildees fora de casa
112-933 0018 Sim Natildeo
12 (60) 8 (40)
19 (95) 1 (5)
78
52 Determinaccedilatildeo do estado nutricional
521 Avaliaccedilatildeo qualitativa do consumo alimentar
Na Tabela 10 (apecircndice) encontra-se a participaccedilatildeo dos alimentos nos grupos
e meacutedias de consumo diaacuterio dos alimentos pela populaccedilatildeo estudada Os alimentos
mais consumidos e que apresentaram frequecircncia diaacuteria de uma vez ao dia ou mais
em relaccedilatildeo ao grupo caso foram feijatildeo arroz alface tomate e oacuteleo azeite ou
vinagre para tempero de salada Em relaccedilatildeo ao grupo controle os que apresentaram
consumo diaacuterio de uma vez ou mais foram arroz e patildeo francecircs patildeo de forma
integral patildeo doce ou torrada
O percentual de consumo dos 16 grupos alimentares identificados derivados
do QFA (Tabela 11) em relaccedilatildeo ao grupo caso que foram consumidos por 80 ou
mais da populaccedilatildeo foram massas carne vermelha e ovos embutidos carne branca
cereais raiacutezes e tubeacuterculos hortaliccedilas e frutas No mesmo grupo populacional os
grupos alimentares de menor consumo foram bebida alcooacutelica leite e derivados e
preparaccedilotildees com percentuais de consumo de 30 493 e 525
respectivamente Os grupos que apresentaram consumo intermediaacuterio foram
Infusatildeo Oacuteleos e gorduras accediluacutecar e doces lanches leguminosas e alimentos
industrializados com percentuais de consumo de 60 616 65 783 783 e
79 respectivamente No grupo controle os grupos alimentares que apresentaram
consumo de 80 ou mais da populaccedilatildeo foram massa carne vermelha e ovos carne
branca cereais raiacutezes e tubeacuterculos hortaliccedilas lanches e accediluacutecar e doces Ainda
nesse grupo populacional os grupos alimentares de menor consumo assim como no
grupo caso foram bebida alcooacutelica preparaccedilotildees e leite e derivados com
percentuais de consumo de 45 45 e 486 respectivamente Os grupos que
apresentaram consumo intermediaacuterio foram oacuteleos e gorduras Infusatildeo alimentos
embutidos leguminosas alimentos industrializados e frutas com percentuais de
consumo de 616 65 65 65 657 731 respectivamente
79
Tabela 11 ndash Definiccedilatildeo dos grupos alimentares derivados do Questionaacuterio de Frequecircncia Alimentar (QFA) e percentual de consumo da populaccedilatildeo estudada Satildeo Paulo SP 2013-2014
Grupo Alimentar
Grupo Consumo Alimentos
Massas
Caso 90 Macarratildeo com molho sem carne macarratildeo com molho com
carne lasanha nhoque pizza e panqueca Controle 916
Preparaccedilatildeo Caso
525 Sopas polenta cozida ou frita
Controle 45
Carne vermelha e ovos
Caso 888 Carne bovina Carne de porco carne de sol bacon e ovo
Controle 813
Embutidos Caso 825 Linguiccedila e embutidos (presunto mortadela salsicha)
Controle 65
Carne branca Caso 975 Frango peixe e frutos do mar
Controle 95
Leite e derivados
Caso 493 Leite integral leite desnatado leite semi-desnatado iogurte
natural iogurte com frutas queijo mussarela queijo prato
parmesatildeo provolone queijo minas e ricota
Controle 486
Leguminosas
Caso 783 Feijatildeo lentilha ervilha seca gratildeo de bico soja feijoada feijatildeo tropeiro
Controle 65
Cereais raiacutezes e tubeacuterculos
Caso
813
Arroz branco integral cozido com oacuteleo e temperos batata frita
mandioca frita batata cozida mandioca cozida inhame purecirc
de batatas ou mandioca farinha de mandioca farofa cuscuz
tapioca aveia patildeo francecircs patildeo de forma torrada biscoito
sem recheio doce e salgado biscoito recheado biscoito
amanteigado waffer bolo simples bolo recheado
Controle
887
Hortaliccedilas
Caso 964 Alface tomate cenoura outros legumes (abobrinha berinjela chuchu pepino) outras verduras cruas (acelga ruacutecula agriatildeo) outras verduras cozidas (acelga espinafre escarola couve) broacutecolis couve-flor e repolho
Controle 926
Frutas Caso 825 Laranja mexerica abacaxi banana maccedila pecircra melatildeo
melancia mamatildeo goiaba abacate suco natural Controle 731
Industrializados
Caso
79
Maionese condimentos molho para salada patecirc chantilly suco industrializado refrigerante comum diet e light hambuacuterguer nuggets almondegas Controle 657
Infusatildeo Caso 60 Chaacute e cafeacute sem accediluacutecar chaacute e cafeacute com accediluacutecar
Controle 65
Bebida alcooacutelica Caso 30 Cerveja
Controle 45
Oacuteleos e gorduras Caso 616 Oacuteleo azeite vinagre manteiga ou margarina comum
manteiga ou margarina light Controle 616
Lanches Caso 783 Salgados fritos salgados assados sanduiacuteche
Controle 833
Aacutecuacutecar e doces Caso 65 Chocolate bombom brigadeiro chocolate em poacute sobremesas doces tortas e pudins accediluacutecar mel geleacuteia Controle 888
80
Todos os indiviacuteduos da pesquisa foram avaliados quanto a ingestatildeo dieteacutetica
Os dados dieteacuteticos obtidos foram traduzidos em energia macro e micronutrientes
(Tabela 12) Observa-se com base nos resultados estatiacutesticos que natildeo houve
variaccedilatildeo significativa no consumo alimentar das mulheres estudadas tendo sido
semelhante entre os grupos caso e controle Aleacutem disso ao realizar-se o teste t
comparando as meacutedias de consumo dos macronutrientes carboidratos proteiacutenas
lipiacutedios e fibras com as variaacuteveis desfecho (mulheres obesas x mulheres eutroacuteficas)
tambeacutem natildeo foram observadas associaccedilotildees estatisticamente significantes
Analisando a razatildeo de ingestatildeo quilocaloriasquilograma de peso corporal
tem-se que o grupo caso teve meacutedia de ingestatildeo energeacutetica de 199 kcalkgdia e o
grupo controle 279 kcalkgdia (Tabela 13) O grupo controle evidenciou consumo
compatiacutevel para a manutenccedilatildeo do seu peso (faixa de recomendaccedilatildeo 25-30
kcalkgdia) enquanto o grupo caso apresentou um niacutevel meacutedio de ingestatildeo abaixo
do valor de manutenccedilatildeo a ingestatildeo energeacutetica foi 204 menor do que a
recomendaccedilatildeo considerando-se o limite inferior de 25 kcalkgdia
Outra razatildeo de ingestatildeo gramas de proteiacutenasquilograma de peso corporal eacute
utilizada para caacutelculo e recomendaccedilatildeo de consumo proteacuteico sem prejuiacutezo da funccedilatildeo
renal (recomendaccedilatildeo de ingestatildeo 06 a 08 g de proteiacutenaskg de pesodia) O grupo
controle apresentou ingestatildeo proteacuteica acima do recomendado 12 g de proteiacutenaskg
de pesodia enquanto o grupo caso apresentou um niacutevel meacutedio de consumo
compatiacutevel com a recomendaccedilatildeo 078 g de proteiacutenaskg de pesodia apresentando-
se no limite maacuteximo preconizado (Tabela 13)
81
Tabela 12 ndash Anaacutelise de consumo de energia e nutrientes da populaccedilatildeo estudada Satildeo Paulo SP 2013-2014
Variaacuteveis Grupo Meacutedia de consumo
Desvio Padratildeo
IC 95 P
Energiadia (kcal)
Caso 18571 93622 (137401 ndash 205869) 093
Controle 1692 98334 (120438 ndash 217822)
Carboidratodia (g)
Caso 24345 16826 (16706 ndash 25787)
090 Controle 20785
10997 (15402 ndash 26294)
Gordura totaldia (g)
Caso
658
276
(5205 ndash 7926) 086
Controle
627
4714 (3998 ndash 8673)
Gordura polinsaturadadia
(g)
Caso 795 416 (617 ndash 937) 048
Controle 85 675 (575 ndash 1237)
Gordura monoinsaturadadia
(g)
Caso 206 925 (1640 ndash 2553)
059 Controle 182 1598
(1077 ndash 2651)
Gordura saturadadia (g)
Caso 2185 1149 (1670 ndash 2808)
075 Controle 204 1698 (1239 ndash 2924)
Proteiacutenadia (g) Caso 7355 3508 (5531 ndash 8905)
091 Controle 7285 4985 (4914 ndash 9849)
Fibra totaldia (g) Caso 168 902 (1247 ndash 1953)
027 Controle 1265 765 (944 ndash1699)
Fibra soluacuteveldia (g) Caso 4 332 (273 ndash 563)
029 Controle 285 23 (215 ndash 437)
Fibra insoluacuteveldia (g)
Caso 56 391 (404 ndash 703) 025
Controle 395 232 (338 ndash 562)
Colesteroldia (g) Caso 23635 13965 (17127 ndash 30877)
077 Controle 26105 26790 (12780 ndash 39313)
Vitamina Adia (UI) Caso 95885 55538 (70451 ndash 124904)
055 Controle 872 47033 (64231 ndash 110801)
Vitamina Cdia (mg) Caso 2105 18857 (11025 ndash 29152)
011 Controle 12035 8752 (7936 ndash 16565)
Vitamina B1dia (mg)
Caso 13 117 (131 ndash 204) 072
Controle 13 166 (104 ndash 260)
Vitamina B2dia (mg)
Caso 08 083 (107 ndash 174) 079
Controle 105 089 (103 ndash 193)
82
Tabela 12 ndash Anaacutelise de consumo de energia e nutrientes da populaccedilatildeo estudada Satildeo Paulo SP 2013-2014
(Continuaccedilatildeo)
Variaacuteveis Grupo Meacutedia
de consumo Desvio Padratildeo
IC 95 P
Vitamina B6dia (ug)
Caso 110 102 (121 ndash 197)
085 Controle 105 088 (110 ndash 197)
Vitamina B12dia (ug)
Caso 38 253 (309 ndash 562) 096
Controle 385 285 (302 ndash 578)
Vitamina Ddia (mg)
Caso 915 1620 (211 ndash 1803) 012
Controle 23 3357 (733 ndash 4061)
Niacinadia (mg)
Caso 19 1005 (1402 ndash 2191)
059 Controle 193
1303 (1339 ndash 2641)
Folatodia (mg)
Caso
24010
11621
(17758 ndash 28351) 054
Controle 20495 12117 (14708 ndash 26684)
Aacutecido pantotecircnicodia
(mg)
Caso 35 216 (292 ndash 443) 074
Controle 29 251 (220 ndash 469)
VitaminaEdia (mg)
Caso 1155 651 (894 ndash 1309) 079
Controle 99 625 (738 ndash 1368)
Iododia (mg) Caso 547 4984 (3206 ndash 8098)
049 Controle 4515 3674 (2814 ndash 6439)
Soacutediodia (mg) Caso 230285 159724 (155816 ndash 246261)
099 Controle 201715 148254 (127647 ndash 274446)
Caacutelciodia (mg) Caso 69045 42353 (47627 ndash 89502)
068 Controle 62645 33992 (46373 ndash 79973)
Magneacutesiodia (mg)
Caso 2325 10339 (17818 ndash 25995) 044
Controle 1947 9452 (14888 ndash 24255)
Zincodia (mg) Caso 85 523 (617 ndash 1115)
086 Controle 78 476 (603 ndash 1068)
Manganecircsdia (mg)
Caso 6 85 (206 ndash 1045) 064
Controle 1095 2019 (148 ndash 1446)
Potaacutessiodia (mg)
Caso 271955 117073 (208408 ndash 3131423) 029
Controle 220685 115874 (164415 ndash 279085)
Foacutesforodia (mg)
Caso 9754 44188 (73698 ndash 1151535) 086
Controle 9085 56939 (63379 ndash 119689)
83
Tabela 12 ndash Anaacutelise de consumo de energia e nutrientes da populaccedilatildeo estudada Satildeo Paulo SP 2013-2014
(Continuaccedilatildeo)
Variaacuteveis Grupo Meacutedia
de consumo Desvio Padratildeo
IC 95 P
Ferrodia (mg) Caso 137 859
(996 ndash 1538)
069
Controle 1145 616 (885 ndash 1492)
Cobredia (mg) Caso 1 0 917 (1 ndash 167)
090 Controle 085 109 (094 ndash 167)
Selecircniodia (ug) Caso 33475 21854 (23251 ndash 44777)
068 Controle 400 5844 (11179 ndash 69057)
Nota significacircncia estatiacutestica quando p-valor le 005
Tabela 13 ndash Comparaccedilatildeo das variaacuteveis dieteacuteticas relacionadas agraves razotildees de ingestatildeo e Valor Energeacutetico Total (VET) da populaccedilatildeo estudada Satildeo Paulo SP 2013-2014
Variaacuteveis Grupo Caso
Grupo controle
Energia (Kcal) 18571
1692
Kcalkgdia 199
279
Carboidrato (g) 24345
20785
Carboidrato (VET) 5241
4913
Proteiacutena (g) 7355
7285
Grama de proteiacutenakgdia
078
12
Proteiacutena (VET) 1584
1722
Lipiacutedeo (g) 658
627
Lipiacutedeo ( VET) 3188
3335
84
A partir de dados de meacutedia de ingestatildeo de macronutrientes comparou-se a
porcentagem que cada um deles carboidratos proteiacutenas e lipiacutedeos (Tabela 13)
representa no Valor Energeacutetico total (VET) ingerido com o intervalo de
balanceamento dieteacutetico proposto pelas Dietary References Intake (DRI) Assim
tem-se que os grupos caso e controle balancearam suas dietas conforme o intervalo
de distribuiccedilatildeo energeacutetica recomendado visualizado na figura 5 Em relaccedilatildeo ao
consumo de fibras foi observado que ambos os grupos apresentaram um consumo
inferior ao Adequate Intake (AI) com consumo de 168 e 1265 para os grupos
caso e controle respectivamente Em relaccedilatildeo ao consumo de lipiacutedios o consumo de
gordura saturada mostrou-se maior que os 7 recomendado pela Sociedade
Brasileira de Cardiologia (2007) em consonacircncia com a National Heart Lung e Blood
Institute dos Estados Unidos tanto no grupo caso quanto no grupo controle de
1058 e 1085 respectivamente
Figura 5 ndash Comparaccedilatildeo entre as meacutedias de consumo de macronutrientes dos Grupos Caso e Controle com a Faixa de Distribuiccedilatildeo Aceitaacutevel de macronutrientes (AMDRDRI) e AI (Adequate Intake) para a faixa etaacuteria de 20 a 70 anos Satildeo Paulo SP 2013-2014
Legenda ndash A recomendaccedilatildeo de consumo de macronutrientes para tal faixa etaacuteria eacute
para Carboidratos 45 a 65 do VET (Valor Energeacutetico Total) Proteiacutenas 10 a 35 do VET Lipiacutedeos 20 a 35 do VET e Fibras 21 a 26 gramasdia
85
A comparaccedilatildeo da meacutedia da ingestatildeo das vitaminas A C E e folato dos
grupos caso e controle com as recomendaccedilotildees de ingestatildeo mostrou que a meacutedia de
consumo dos grupos foi semelhante e de acordo com a recomendaccedilatildeo exceto para
folato e vitamina E em que ambos os grupos mostraram meacutedias de ingestatildeo abaixo
do recomendado (Figura 6)
Figura 6 ndash Comparaccedilatildeo entre as meacutedias de consumo das Vitaminas A C E e folato dos Grupos Caso e Controle com a Faixa de Distribuiccedilatildeo Aceitaacutevel de macronutrientes (AMDRDRI) e AI (Adequate Intake) para a faixa etaacuteria de 20 a 70 anos Satildeo Paulo SP 2013-2014
A comparaccedilatildeo da meacutedia das ingestotildees das Vitaminas B1 B2 B6 B12 D
Niacina e Aacutecido pantotecircnico dos grupos caso e controle com as recomendaccedilotildees de
ingestatildeo demonstrou que a meacutedia de consumo em relaccedilatildeo agraves vitaminas B1 e B12
estavam acima do recomendado nos dois grupos As vitaminas B6 e aacutecido
pantotecircnico apresentaram ingestatildeo inferior ao preconizado nos grupos caso e
controle Ambos os grupos estudados apresentaram consumo em concordacircncia com
as recomendaccedilotildees em relaccedilatildeo agrave niacina No entanto as vitaminas B2 e D
apresentaram consumo pelo grupo caso inferior enquanto o grupo controle
apresentou-se de acordo com a recomendaccedilatildeo (Figura 7)
86
Figura 7 ndash Comparaccedilatildeo entre as meacutedias de consumo das Vitaminas B1 B2 B6 B12 D Niacina e Aacutecido pantotecircnico dos Grupos Caso e Controle com a Faixa de Distribuiccedilatildeo Aceitaacutevel de macronutrientes (AMDRDRI)e AI (Adequate Intake) para a faixa etaacuteria de 20 a 70 anos Satildeo Paulo SP 2013-2014
Para os minerais foacutesforo e selecircnio a ingestatildeo dos grupos Caso e Controle
tambeacutem foi adequada Exceto para iodo caacutelcio e magneacutesio que tiveram a ingestatildeo
menor que a recomendaccedilatildeo e o cobre que apresentou uma ingestatildeo inferior ao
preconizado no grupo controle enquanto o grupo caso demonstrou uma ingestatildeo
adequada dentro dos limites de recomendaccedilatildeo (Figura 8)
87
Figura 8 ndash Comparaccedilatildeo entre as meacutedias de consumo de Sais Minerais dos Grupos Caso e Controle com a Faixa de Distribuiccedilatildeo Aceitaacutevel de macronutrientes (AMDRDRI)e AI (Adequate Intake) para a faixa etaacuteria de 20 a 70 anos Satildeo Paulo SP 2013-2014
Para os minerais e nutrientes soacutedio manganecircs e potaacutessio a ingestatildeo dos
grupos Caso e Controle foi adequada Exceto para ferro que apresentou ingestatildeo
menor que a recomendaccedilatildeo e o zinco que apresentou ingestatildeo um pouco inferior ao
preconizado no grupo controle enquanto o grupo caso demonstrou ingestatildeo
adequada dentro dos limites de recomendaccedilatildeo (Figura 9)
Figura 9 ndash Comparaccedilatildeo entre as meacutedias de consumo de Sais Minerais e outros nutrientes dos Grupos Caso e Controle com a Faixa de Distribuiccedilatildeo Aceitaacutevel de macronutrientes (AMDRDRI)e AI (Adequate Intake) para a faixa etaacuteria de 20 a 70 anos Satildeo Paulo SP 2013-2014
88
522 Avaliaccedilatildeo antropomeacutetrica do estado nutricional
Os resultados da avaliaccedilatildeo antropomeacutetrica estatildeo apresentados na tabela 14
Foi observado que as mulheres estudadas do grupo caso apresentaram meacutedia de
IMC (Iacutendice de massa corporal) de 365 kgm2 (DP 441 Amplitude 306-449) Ao
classificar as pacientes em classes de obesidade de acordo com os criteacuterios
determinados pela OMS (Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede) (1995) verificou-se que
nove (45) das mulheres apresentam obesidade grau I (IMC 30-3499 kgm2) sete
(35) apresentam obesidade grau II (IMC 35-3999 kgm2) e quatro (20) das
mulheres apresentam obesidade grau III (IMC ge 40 kgm2) As mulheres do grupo
controle apresentaram IMC meacutedio de 224 kgm2 (DP 204 Amplitude 188-249)
Em relaccedilatildeo ao percentual de gordura observou-se a meacutedia de 4535 (DP
518 Amplitude 354-534) de gordura corporal no grupo caso e 3004 (DP 671
Amplitude 113-404) no grupo controle indicando um excesso de gordura corporal
em ambos os grupos de acordo com LOHMAN (1992) Em relaccedilatildeo agrave essa
classificaccedilatildeo no grupo caso todas as mulheres apresentam riscos de doenccedilas
associadas agrave obesidade apresentando um percentual de gordura corporal maior que
32 Das mulheres do grupo controle 2 (10) apresentaram-se abaixo da meacutedia 1
(5) na meacutedia 8 (40) acima da meacutedia e 9 (45) apresentaram risco de
desenvolvimento de doenccedilas relacionadas com a obesidade
A avaliaccedilatildeo da Razatildeo cintura-quadril (RCQ) importante indicador de
obesidade central Comparando-se os resultados obtidos com o ponto de corte
recomendado pela OMS (Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede 1995) de 085 para
mulheres observou-se que todas as pacientes avaliadas do grupo caso apresentam-
se acima do recomendado com a meacutedia de RCQ de 099 (DP 0074 Amplitude
087-119) enquanto as mulheres do grupo controle apresentaram uma razatildeo meacutedia
de 083 (DP 0047 Amplitude 077-096) onde sete (35) mulheres apresentaram
a RCQ acima do valor referecircncia preconizado pela OMS No entanto ao avaliar a
Razatildeo cintura quadril de acordo com os pontos de corte propostos por LOHMAN et
al (1988) em relaccedilatildeo ao risco de desenvolvimento de doenccedilas associadas agrave
Siacutendrome Metaboacutelica (Doenccedilas cardiovasculares hipertensatildeo dislipidemia e
alteraccedilatildeo no metabolismo de carboidratos) os resultados demonstraram que em
relaccedilatildeo ao grupo caso 18 (90) das mulheres apresentaram alto risco para o
desenvolvimento dessas doenccedilas enquanto 2 (10) apresentaram risco moderado
89
Em relaccedilatildeo ao grupo controle foi observado que 3 (15) natildeo apresentaram riscos
13 (65) apresentaram baixo risco 1(5) apresentou risco moderado e 3 (15)
apresentaram alto risco para o desenvolvimento dessas doenccedilas
Tabela 14 ndash Comparaccedilatildeo de variaacuteveis antropomeacutetricas da populaccedilatildeo estudada
Variaacuteveis Grupo Meacutedia
Desvio Padratildeo
Miacutenimo Maacuteximo
Peso (kg) Caso 9329 105 7574 1075
Controle 6054 787 4575 7422
Estatura (m2) Caso 160 007 149 172
Controle 164 007 151 18
IMC (Kgm2) Caso 3645 452 306 449
Controle 2241 204 188 249
Razatildeo cintura-quadril (RCQ)
Caso 099 007 088 119
Controle 083 005 077 096
Gordura corporal total
()
Caso
4535
519
354
531
Controle
30035
671
113 404
90
53 Determinaccedilatildeo da microbiota intestinal
531 Padronizaccedilatildeo de reaccedilatildeo de PCR quantitativo (qPCR) por meio de TaqMan para a detecccedilatildeo de Mollicutes
Pela qPCR quantificou-se carga de Mollicutes representadas por unidades
formadoras de colocircnias (UFCmicrol) nas amostras de fezes O ensaio de qPCR
demonstrou eficiecircncia de reaccedilatildeo de E= 1033 (r2= 095) A sensibilidade do teste
foi de detecccedilatildeo de no miacutenimo dez coacutepias de genomareaccedilatildeo quando utilizados os
padrotildees de nuacutemero de coacutepias de DNA genocircmico diluiacutedo (Figura 10)
Figura 10 ndash Curva-padratildeo gerada a partir dos pontos de Ct obtidos com o graacutefico de amplificaccedilatildeo de diluiccedilotildees seriadas do controle positivo Mycoplasma hominis calculado pelo software StepOne 21 (Applied Biosystems Life Technologies Corporation) Satildeo Paulo SP 2013-2014
A repetibilidade testada por meio dos testes intra-ensaio e inter-ensaio da
qPCR estaacute apresentada na tabela 15 O ensaio foi especiacutefico para Mollicutes natildeo
tendo sido visualizada amplificaccedilatildeo dos controles microbianos de outros micro-
organismos utilizados
91
Tabela 15 ndash Repetibilidade intra-ensaio e inter-ensaio da qPCR para Mollicutes Satildeo Paulo SP 2013-2014
Nordm de coacutepias do Genoma
Repetibilidade intra-ensaio Repetibilidade inter-ensaio
Genoma bacteriano diluiacutedo
em 1times TE Genoma bacteriano diluiacutedo
em 1times TE
Ponto meacutedio de corte
(Ct plusmn SD) CV ()
Ponto meacutedio de corte (Ct plusmn SD)
CV ()
10 3537 plusmn 015 045 3494 plusmn 045 129
102 3425 plusmn 017 050 3379plusmn 029 087
103 3099 plusmn 021 070 3074 plusmn 039 128
104 2739 plusmn 023 084 2739 plusmn 038 142
105 2356 plusmn 012 054 2291plusmn 025 110
106 1874 plusmn 066 352 1915 plusmn 077 403
CV coeficiente de variaccedilatildeo
A PCR geneacuterica para Mollicutes foi positiva em 17 (85) das amostras
cliacutenicas do grupo caso e 8 (40) das amostras do grupo controle obtidas No
entanto nem todas as amostras positivas em cPCR para Mollicutes foram positivas
em qPCR 13 (65) das amostras do grupo caso e trecircs (15) do grupo controle
foram positivas em qPCR (Tabela 16)
Tabela 16 ndash Comparaccedilatildeo entre os resultados obtidos no teste de sensibilidade pelas teacutecnicas de PCR convencional e qPCR para detecccedilatildeo de Mollicutes Satildeo Paulo SP 2013-2014
Amostra
Grupo PCR convencional qPCR
n () n ()
Positivaa Caso 17 (85) 13 (65) Negativab 3 (15) 7 (35)
Positivaa
Negativab Controle 8 (40)
12 (60) 3 (15) 17 (85)
Nota n= 20 mulheres aPositiva - Detecccedilatildeo de produto de DNA esperado bNegativa - Ausecircncia de produto de DNA esperado
92
Por meio da PCR em tempo real foi possiacutevel quantificar o DNA e
consequentemente a carga do microrganismo representada por unidades
formadoras de colocircnias - ufcmicrol nas amostras de fezes coletadas Os resultados da
qPCR demonstraram uma carga meacutedia de Mollicutes nas amostras de fezes
analisadas referentes ao grupo caso de 584 x 103 ufcmicrol e de 156 ufcmicrol referentes
ao grupo controle Observa-se na figura 11 graacutefico de dispersatildeo referente agraves
cargas meacutedias das amostras positivas com detecccedilotildees de aproximadamente 101 a
103 UFCml de Mollicutes Contudo as meacutedias das dosagens foram maiores nas
mulheres do grupo caso E apoacutes anaacutelise estatiacutestica por Mann-Whitney foi possiacutevel
observar diferenccedila estatisticamente significante para a espeacutecie Mollicutes (p =
00023) Em seguida foi testada atraveacutes do teste de Odds Ratio a associaccedilatildeo
epidemioloacutegica entre as variaacuteveis desfecho (mulheres obesas x mulheres eutroacuteficas)
e as variaacuteveis Mollicutes (presenccedila x ausecircncia) tendo sido detectada uma
associaccedilatildeo positiva estatisticamente significante entre a presenccedila de Mollicutes e
mulheres obesas (OR= 115 IC= 242-554) Aleacutem disso ao realizar-se o teste t
comparando as meacutedias de consumo dos macronutrientes carboidratos proteiacutenas
lipiacutedios e fibras com as variaacuteveis Mollicutes (presenccedila x ausecircncia) natildeo foram
observadas associaccedilotildees estatisticamente significantes
Figura 11 - Quantificaccedilatildeo por qPCR de Mollicutes (UFCmicrol) a partir das amostras de fezes nos grupos caso e controle Satildeo Paulo SP 2013-2014
Legenda ndash Concentraccedilatildeo meacutedia de Mollicutes entre as mulheres do grupo caso (~584 x 103 UFC
microL) e controle (~156 UFC microL) estudadas e positivas para Mollicutes pelo qPCR (p-valor=00023)
Mediana e desvio padratildeo indicadas por linhas soacutelidas no graacutefico Anaacutelise estatiacutestica realizada por
Mann Whitney assumindo p-valor le 005
93
532 Detecccedilatildeo de micro-organismos dos filos Firmicutes e Bacteroidetes aleacutem de bacteacuterias totais (Eubacterias) por PCR em tempo Real (qPCR)
Todas as amostras 40 (100) foram positivas para Firmicutes e Bacteroidetes
na qPCR tanto para o grupo caso como para o controle Natildeo foram observadas
diferenccedilas estatisticamente significantes para as cargas de Firmicutes Bacteroidetes
e Bacteacuterias totais entre as mulheres do grupo caso e controle No entanto as cargas
meacutedias de Firmicutes e Eubacteacuterias no grupo caso foram maiores que no grupo
controle enquanto Bacteroidetes apresentou uma maior carga no grupo controle A
figura 12 representa os graacuteficos de dispersatildeo referentes agraves cargas meacutedias das
amostras de fezes para esses micro-organismos
Figura 12 - Quantificaccedilatildeo por qPCR de Firmicutes Bacteroidetes e Eubacterias (UFCmicrol) a partir das amostras de fezes nos grupos caso e controle Satildeo Paulo SP 2013-2014
Legenda ndash (a) Concentraccedilatildeo de Firmicutes (UFCmicroL) entre as mulheres do grupo caso (~869 x 1018 UFCmicrol) e controle (~504 x 1014 UFCmicrol) (b) Concentraccedilatildeo de Bacteroidetes (UFCmicroL) entre as mulheres do grupo caso (~879 x 108 UFCmicrol) e controle (~146 x 109 UFCmicrol) (c) Concentraccedilatildeo de Eubacterias (UFCmicroL) entre as mulheres do grupo caso (~731 x 1024 UFCmicrol) e controle (~619 x 1021 UFCmicrol) Mediana e amplitude interquartiacutelica indicadas por linhas soacutelidas no graacutefico Anaacutelise estatiacutestica realizada por Mann Whitney assumindo p-valor le 005
94
Com o intuito de verificar o percentual de micro-organismos da classe
Mollicutes frente agrave carga meacutedia de Firmicutes foi realizada a anaacutelise do percentual
meacutedio dos referidos micro-organismos onde verificou-se que Mollicutes representam
424 do nuacutemero meacutedio de Firmicutes detectados na qPCR especiacutefica para o
mesmo nas amostras analisadas no grupo caso e 25 x 10-4 no grupo controle
(Tabela 17)
Tabela 17 ndash Nuacutemero meacutedio de coacutepias e percentual dos grupos Mollicutes estudados frente ao Filo Firmicutes na populaccedilatildeo estudada Satildeo Paulo SP 2013-2014
Nota Meacutedia de coacutepiasgrama de fezes Percentual de coacutepias de Mollicutes em relaccedilatildeo ao Filo Firmicutes
Os resultados da qPCR demonstraram carga meacutedia de Bacteacuterias totais
(Eubacteacuterias) nas amostras de fezes analisadas do grupo caso (~731 x 1024 UFCmicrol)
e controle (~619 x 1021 UFCmicrol) As anaacutelises de percentual entre a carga meacutedia de
Bacteroidetes Firmicutes e Mollicutes e a carga meacutedia de bacteacuterias totais estatildeo
representadas na Tabela 18
Grupo Firmicutes Mollicutes
Meacutedia coacutepias g de fezes
Meacutedia coacutepias g de fezes
Caso 869x1018
584x103
424
Controle 504x1014
16
25x10-4
95
Tabela 18 ndash Nuacutemero meacutedio de coacutepias e percentual dos grupos de bacterianos estudados frente agraves bacteacuterias totais na populaccedilatildeo estudada Satildeo Paulo SP 2013-2014
Nota Meacutedia de coacutepiasgrama de fezes Percentual de coacutepias de cada bacteacuteria em relaccedilatildeo agraves bacteacuterias totais
Foi calculada a proporccedilatildeo de Firmicutes em relaccedilatildeo aos Bacteroidetes na
microbiota intestinal das mulheres estudadas tendo sido observada maior proporccedilatildeo
na microbiota intestinal das mulheres obesas em relaccedilatildeo agraves eutroacuteficas do grupo
controle (Tabela 19) A relaccedilatildeo entre o percentual de Firmicutes e Bacteroidetes na
microbiota intestinal das mulheres do grupo caso foi cerca de 29 x 107 maior entre
as mulheres obesas do grupo caso em comparaccedilatildeo com o grupo controle
Tabela 19 ndash Proporccedilatildeo de Firmicutes em relaccedilatildeo agrave Bacteroidetes na populaccedilatildeo estudada Satildeo Paulo SP 2013-2014
Nota Meacutedia de coacutepiasgrama de fezes
Grupo Bacteacuterias totais
Firmicutes Bacteroidetes Mollicutes
Meacutedia coacutepias g de fezes
Meacutedia coacutepias g de
fezes
Meacutedia coacutepias g de
fezes
Meacutedia coacutepias g de fezes
Caso 731x 1024
869x1018
442x105
879x108
718x10-2
584x103
28x 10-2
Controle 619x 1021
504x1014
171x105
146x109
624x102 16
22x10-11
Grupo Firmicutes Bacteroidetes Proporccedilatildeo FirmicutesBacteroidetes
Meacutedia coacutepias g de fezes
Meacutedia coacutepias g de fezes
Meacutedia coacutepias g de fezes
Caso 869x1018 879x108
134x1013
Controle 504x1014
146x109
45x 105
96
54 Dosagem de citocinas do soro sanguiacuteneo
Ao serem quantificadas as citocinas IL-1β IL-10 IL17-A e TNF-α pela
teacutecnica de ELISA no plasma sanguiacuteneo das mulheres natildeo foi observada diferenccedila
estatisticamente significante entre os grupos caso e controle para nenhuma das
citocinas avaliadas IL-1β (p= 02249) IL-10 (p=1) IL17-A (p=03169) e TNF-α
(p=02235) (Figura 13)
Figura 13 ndash Quantificaccedilatildeo de IL-1β IL-10 IL17-A e TNF-α (pgmL) no plasma sanguiacuteneo por meio do ELISA nos grupos caso e controle da populaccedilatildeo estudada Satildeo Paulo SP 2013-2014
Legenda- (a) Concentraccedilatildeo de IL-1β (pgml) no plasma sanguiacuteneo das mulheres casos e controles (b) Concentraccedilatildeo de IL-10 (pgml) no plasma sanguiacuteneo das mulheres casos e controles (c) Concentraccedilatildeo de TNF-α (pgml) no plasma sanguiacuteneo das mulheres casos e controles (d) Concentraccedilatildeo de IL17-A (pgml) no plasma sanguiacuteneo das mulheres casos e controles Desvio padratildeo e meacutedia indicados por linhas soacutelidas no graacutefico Anaacutelise estatiacutestica por Mann Whitney p lt 005
97
6 DISCUSSAtildeO
A microbiota intestinal eacute um ecossistema complexo que desempenha um
importante papel na gecircnese da obesidade associada com o desenvolvimento das
respostas imunoloacutegicas aleacutem do estado nutricional do hospedeiro Projetos
mundiais de pesquisa estatildeo em desenvolvimento para compreender esta
complexidade microbiana na sauacutede humana (SHETTY et al 2013) O presente
estudo avaliou a participaccedilatildeo dos micro-organismos da Classe Mollicutes e dos Filos
Firmicutes e Bacteroidetes na microbiota intestinal de mulheres obesas e eutroacuteficas
Na diversidade das populaccedilotildees humanas e a ocorrecircncia da obesidade eacute
importante estudar a distribuiccedilatildeo da microbiota intestinal fazendo-se necessaacuterio e
imprescindiacutevel a caracterizaccedilatildeo da populaccedilatildeo estudada em relaccedilatildeo agrave preditores
importantes associados com a obesidade microbiota intestinal e ambiente
(KALLIOMAKI et al 2008 PENDERS et al 2006) No presente estudo observou-
se variaccedilatildeo estatiacutestica em relaccedilatildeo agrave variaacutevel gestaccedilatildeo onde 14 (70) das mulheres
do grupo caso e 2 (10) do controle relataram jaacute terem tido filhos Aagaard et al
(2012) verificaram que o microbioma era semelhante em mulheres gravidas ou natildeo
No entanto as mulheres graacutevidas apresentaram microbioma menos diversificado
Sugeriu-se que entre as mulheres em idade reprodutiva o microbioma permanece
como uma comunidade dinacircmica na vida reprodutiva do adulto e que a estrutura da
comunidade natildeo-graacutevida pode retornar em alguma medida nas uacuteltimas semanas de
gestaccedilatildeo Aleacutem disso alguns autores tecircm sugerido que o acuacutemulo de gordura
corporal na obesidade pode acarretar vaacuterias consequecircncias agrave sauacutede como diabetes
mellitus tipo 2 hipertensatildeo arterial dispneacuteia cacircncer dislipidemia doenccedilas
cardiacuteacas doenccedilas hepatobiliares osteoartrite alteraccedilotildees gastrintestinais e
distuacuterbios psicossociais o que corrobora com os achados em relaccedilatildeo agrave histoacuteria
cliacutenica das mulheres estudadas (FRANCISCHI et al 2000 PEREIRA et al 2003
SILVA 2005)
Para as mulheres em especial a menopausa tem sido associada como
colaboradora para o desenvolvimento de obesidade e acuacutemulo de gordura corporal
(SOWERS et al 2007) No presente estudo encontraram-se diferenccedilas estatiacutesticas
em relaccedilatildeo agrave variaacutevel menopausa onde 9 (45) das mulheres obesas do grupo
caso e 3 (15) das mulheres do grupo controle relataram ter entrado na
98
menopausa Entretanto Sternfeld et al (2004) em estudo de coorte feminina entre
42-52 anos de idade nos EUA natildeo encontraram associaccedilatildeo entre a menopausa e o
aumento de circunferecircncia da cintura bem como aumento do peso dessa forma
sugerindo que somente um fator pode natildeo ser o responsaacutevel pelo desenvolvimento
de obesidade No presente trabalho observou-se que 75 das mulheres do grupo
caso e 50 do grupo controle nasceram de parto normal Tem sido evidenciado na
literatura que o tipo de parto pode interferir na composiccedilatildeo da microbiota pela forma
de colonizaccedilatildeo do receacutem-nascido O parto via cesariana aumentaria o risco de
obesidade em relaccedilatildeo ao parto normal (HUH et al 2012 PEI et al 2014) Nesse
sentido Ajslev et al (2011) em estudo longitudinal prospectivo na infacircncia com
acompanhamento ateacute os sete anos observaram que uma combinaccedilatildeo de
exposiccedilotildees precoces que inclui o tipo de parto o IMC maternal preacute-gestacional e
uso de antibioacuteticos na primeira infacircncia (lt6 meses) influenciaram o risco de excesso
de peso
Existem diversos estudos em relaccedilatildeo aos fatores dieteacuteticos e a gecircnese da
obesidade (DAILEY 2014 ISOMAA et al 2001 MORENO-INDIAS et al 2014
PEREIRA et al 2002 ROMERO ZANESCO 2006 SANTOS et al 2006) No
entanto no presente estudo o valor energeacutetico encontrado em relaccedilatildeo ao grupo
caso ao analisar-se a razatildeo quilocaloriasquilograma de peso corporal foi inferior agrave
recomendaccedilatildeo caracterizando alimentaccedilatildeo insuficiente em energia (WHO 2003)
Da mesma maneira que no presente estudo Pereira et al (2012) natildeo encontraram
diferenccedilas significativas entre o consumo energeacutetico entre indiviacuteduos eutroacuteficos e
obesos Souza et al (2010) estudaram a ingestatildeo alimentar e balanccedilo energeacutetico da
populaccedilatildeo adulta de Niteroacutei- RJ e encontraram que a ingestatildeo energeacutetica mostrou-
se decrescente com o aumento do IMC para as mulheres A ingestatildeo energeacutetica em
menor quantidade parece indicar que embora o corpo esteja obeso os tecidos vitais
satildeo inadequadamente nutridos pois a alimentaccedilatildeo insuficiente fornece poucos
nutrientes (HUTSON et al 1965) Sawaya et al (2003) em estudo com mulheres
realizado em Maceioacute tambeacutem observaram que a ingestatildeo energeacutetica entre os
grupos eutroacutefico e obesos natildeo apresentou diferenccedila significativa Em outro estudo
com mulheres no Rio Grande do Sul tambeacutem foi verificado que o consumo alimentar
energeacutetico natildeo apresentou diferenccedila significativa (p=0157) entre os grupos (baixo
peso eutroacutefico e excesso de pesoobesidade) (FRANKE et al 2007) Com isto
99
provavelmente a ingestatildeo energeacutetica natildeo seja a causa da obesidade nas mulheres
estudadas sendo que a baixa ingestatildeo aliada a algumas deficiecircncias nutricionais e
predisposiccedilatildeo geneacutetica possa criar mecanismos de adaptaccedilatildeo levando a um ciclo
metaboacutelico cujo o desfecho seja o armazenamento de gordura na regiatildeo abdominal
(BALAMURUGAN et al 2010 CANI DELZENNE 2009 DAVID et al 2014
HANSON et al 2009 JIMENEZ MARTIN-MORENO 1995) Nesse contexto
devem ser considerados outros fatores de economia energeacutetica tais como o
desequiliacutebrio na microbiota intestinal aleacutem da adaptaccedilatildeo dos mecanismos de
consumo energeacutetico acarretando maior rendimento das calorias absorvidas
BALAMURUGAN et al 2010 CANI DELZENNE 2009 DAVID et al 2014
DEWULF et al 2013 DIBAISE FRANK MATHUR 2012 FRANKE 2007 GRAF et
al 2015 KOENIGA et al 2011 LE CHATELIER et al 2013 LEY et al 2006
PATIL et al 2012 RAOULT 2008 SAWAYA et al 2003 WICHMANN et al
2013)
Analisando a contribuiccedilatildeo do consumo dos macronutrientes e das fibras os
resultados do presente estudo demonstraram que este consumo estaacute dentro dos
criteacuterios exceto para o consumo de fibras que foi abaixo da recomendaccedilatildeo em
ambos os grupos Aleacutem disso comparando-se as meacutedias de consumo dos
macronutrientes e das fibras com as variaacuteveis desfecho (obesas x eutroacuteficas)
tambeacutem natildeo houve associaccedilotildees estatisticamente significantes Em Satildeo Paulo
observou-se que 295 dos indiviacuteduos entrevistados relataram ingestatildeo inferior agraves
necessidades fisioloacutegicas dos quais 58 eram indiviacuteduos obesos (SALVO
GIMENO 2002) Em outro estudo realizado com trabalhadores adultos de ambos os
sexos tambeacutem no Estado de Satildeo Paulo para avaliaccedilatildeo da ingestatildeo alimentar e
consumo de fibras dieteacuteticas foi encontrado que o consumo individual de fibras
dieteacuteticas diaacuteria variou 587 g a 2957 g sendo o consumo meacutedio da populaccedilatildeo
1461 g (PASSOS SHEID 2008) Fisberg et al (2009) em estudo realizado sobre
iacutendice de qualidade da dieta observaram padratildeo dieteacutetico com alto conteuacutedo de
gorduras totais colesterol e accediluacutecar refinado e com baixo teor de fibra alimentar
Estes resultados diferem em parte do padratildeo alimentar da populaccedilatildeo estudada no
entanto demonstra a necessidade de estiacutemulo ao maior consumo de alimentos ricos
em fibra
100
A partir dos resultados do estudo evidencia-se a adequaccedilatildeo comprometida
na alimentaccedilatildeo devido agrave elevada ingestatildeo de lipiacutedios (gordura saturada) e ingestatildeo
reduzida de fibras em ambos os grupos estudados contribuindo tanto para a
obesidade quanto em relaccedilatildeo ao acuacutemulo de tecido adiposo nas mulheres obesas e
eutroacuteficas Esses dados estatildeo em conformidade com o presente estudo em relaccedilatildeo
agraves variaacuteveis antropomeacutetricas analisadas Percentual de gordura corporal e Razatildeo
cintura-quadril onde ambos os grupos se apresentaram acima da meacutedia referecircncia
indicando excesso de gordura corporal Assim como no presente estudo outros
trabalhos tecircm demonstrado limitaccedilotildees e evidenciado que natildeo existe correlaccedilatildeo
precisa entre o IMC e o porcentual de gordura corpoacuterea Isso explica o fato de
indiviacuteduos que apresentam IMC dentro do padratildeo de normalidade mas possuem
uma quantidade de gordura corporal acima do ideal confirmando relatos de que o
IMC natildeo eacute um bom indicador quantitativo de adiposidade corporal e que pode
subestimar o percentual de gordura e classificando de forma errocircnea indiviacuteduos com
excesso de adiposidade (COSTA et al 2007 GLANER 2005) Dessa forma o
aumento de gordura corporal principalmente na regiatildeo abdominal pode tornar a
utilizaccedilatildeo do IMC cada vez mais limitada na avaliaccedilatildeo do estado nutricional jaacute que
indiviacuteduos com sobrepeso ou ateacute mesmo eutroacuteficos podem apresentar risco de
alteraccedilotildees metaboacutelicas devido a valores elevados de circunferecircncia da cintura
(REZENDE 2010) Aleacutem disso nossos resultados evidenciaram valores elevados
para RCQ o que pode explicar a porcentagem de algumas moleacutestias atuais
associadas agrave obesidade encontradas em ambos os grupos no presente trabalho
(OMS 2002 DAcircMASO BERNARDES 2003 OCHS-BALCOM et al 2006)
Diversos estudos tambeacutem contribuiacuteram na melhor compreensatildeo entre as
influecircncias da nutriccedilatildeo e da composiccedilatildeo corporal na composiccedilatildeo da microbiota
intestinal (BALAMURUGAN et al 2010 DAVID et al 2014 DEWULF et al 2013
GRAF et al 2015 WICHMANN et al 2013) No entanto pouco se conhece sobre a
participaccedilatildeo dos micro-organismos da classe Mollicutes na microbiota
principalmente quando associadas com fatores dieteacuteticos e antropomeacutetricos
Constatou-se no presente estudo diferenccedila estatisticamente significante para micro-
organismos da classe dos Mollicutes (p = 00023) Foi detectada associaccedilatildeo
estatisticamente significante entre a presenccedila de Mollicutes e mulheres obesas
(OR= 115 IC= 242-554) Nesse contexto Turnbaugh et al (2008) avaliaram a
101
microbiota de modelos experimentais de ratos geneticamente idecircnticos de
obesidade induzida pelo consumo de dieta ocidentalizada caracterizada por alto teor
de gordura e accediluacutecar Todos os animais herdaram uma microbiota semelhante e no
estado de obesidade observou-se maior crescimento da bacteacuteria Eubacterium
dolichum (membro da classe Mollicutes) que foram posteriormente reduzidos por
subsequentes manipulaccedilotildees dieteacuteticas para limitar o ganho de peso Ainda neste
estudo observou-se que a abundacircncia da classe dos Mollicutes foi acompanhada
pela supressatildeo de toda a divisatildeo de Bacteroidetes indicando que a classe
Mollicutes teve aptidatildeo aumentada em relaccedilatildeo a Firmicutes e todos os outros
Bacteroidetes identificados na populaccedilatildeo estudada Os autores observaram que os
molicutes evoluiacuteram a capacidade para importar o tipo de hidratos de carbono
encontradas na dieta ocidental administrada nos modelos experimentais estando
essas vantagens principalmente relacionadas com o Sistema fosfotransferase (PTS)
De acordo com Deutscher et al (2006) o PTS desempenha um papel na regulaccedilatildeo
da expressatildeo do gene microbiano atraveacutes da repressatildeo cataboacutelica permitindo que a
ceacutelula passe a utilizar preferencialmente accediluacutecares simples em relaccedilatildeo a outros
hidratos de carbono Anaacutelises de fragmentos do gene 16S rRNA dos dados de
metagenocircmica confirmaram a presenccedila dos molicutes no microbioma cecal quando
associados agrave uma dieta ocidental Em contrapartida Hildebrandt et al (2009) por
meio de metagenocircmica de fezes de camundongos magros inicialmente submetidos
a dieta de raccedilatildeo padratildeo com posterior mudanccedila para dieta rica em gordura natildeo
relataram encontrar molicutes em dieta de alto teor de gordura
No presente estudo ao se comparar as meacutedias de consumo dos
macronutrientes carboidratos proteiacutenas lipiacutedios e fibras com as variaacuteveis Mollicutes
(presenccedila x ausecircncia) natildeo foram observadas associaccedilotildees estatisticamente
significantes No entanto foi observado alto consumo de gorduras saturadas nas
mulheres estudadas com diferenccedila estatisticamente significante entre a quantidade
de molicutes na microbiota intestinal Esses resultados associados com as
evidecircncias encontradas na literatura acerca da participaccedilatildeo desses micro-
organismos na microbiota de pessoas obesas fornecem importantes evidecircncias de
que natildeo apenas o consumo alimentar e o percentual de gordura ingerida possam
influenciar o aumento de molicutes na microbiota intestinal Mas que esse aumento
tambeacutem pode estar associado ao possiacutevel enriquecimento de rotas metaboacutelicas
102
envolvidas na utilizaccedilatildeo de accediluacutecares simples relacionadas ao sistema PTS Aleacutem
disso tem sido evidenciado na literatura que em experimentos com animais germ-
free o consumo de uma dieta obesogecircnica parece natildeo estimular o desenvolvimento
da obesidade e que sucessivas manipulaccedilotildees dieteacuteticas para limitar o ganho de
peso possivelmente promovam subsequentes variaccedilotildees em relaccedilatildeo agrave populaccedilatildeo
microbiana na microbiota intestinal (GOODMAN et al 2011 TURNBAUGH et al
2009 WALKER et al 2011 YI LI 2012) Este achado foi sustentado por um estudo
recente em camundongos que mostrou que a composiccedilatildeo microbiana do intestino
natildeo eacute determinada apenas pela dieta atual mas tambeacutem em parte pela histoacuteria
dieteacutetica Aleacutem disso um estudo em seres humanos concluiu que a mudanccedila no
padratildeo de consumo de fibras pode produzir fortes mudanccedilas na microbiota
intestinal mas que estas dependem da composiccedilatildeo inicial da microbiota intestinal do
indiviacuteduo (AAFKE et al 2015 CARMODY et al 2015)
Estudos recentes tecircm demonstrado que a microbiota intestinal humana pode
estar alterada em indiviacuteduos obesos Nesse contexto tem sido amplamente
discutida a participaccedilatildeo dos filos Firmicutes e Bacteroidetes na microbiota desses
indiviacuteduos Aleacutem disso tem sido evidenciado que o filo Firmicutes representam mais
de 90 das categorias filogeneacuteticas conhecidas dominando a microbiota distal
Nesse sentido a obesidade estaacute associada com as diferenccedilas da microbiota
intestinal em niacutevel filo com menor diversidade geral e maior proporccedilatildeo relativa de
Firmicutes em relaccedilatildeo agrave Bacteroidetes em indiviacuteduos obesos em comparaccedilatildeo com
indiviacuteduos eutroacuteficos (ECKBURG et al 2005 LEY et al 2006 MORAN
SHANAHAN 2014 TURNBAUGH et al 2009) Nesse contexto os resultados do
presente estudo demonstraram que a relaccedilatildeo entre o percentual de Firmicutes e
Bacteroidetes na microbiota intestinal das mulheres do grupo caso foi cerca de 29x
107 maior entre as mulheres obesas em comparaccedilatildeo com o grupo controle
Estudos demonstraram que a relaccedilatildeo entre percentual de Firmicutes e Bacteroidetes
na microbiota intestinal eacute de cerca de 7020 para os natildeo obesos e ateacute 855 para os
obesos O que significa cerca de cinco vezes maior em obesos em comparaccedilatildeo com
natildeo obesos (BALAMURUGAN et al 2010 ECKBURG et al 2005 KOENIGA et al
2011 LE CHATELIER et al 2013 PATIL et al 2012) Os nossos achados estatildeo
em conformidade com alguns resultados da literatura Em estudo realizado por
Ridaura et al (2013) transplantaram-se micro-organismos intestinais de humanos
103
obesos e eutroacuteficos em intestinos de ratos com peso meacutedio Aqueles que receberam
a microbiota de humanos obesos tornaram-se ratos obesos e aqueles que
receberam microbiota de humanos magros permaneceram magros Outro estudo
realizado por Remely et al (2015) que tambeacutem investigaram atraveacutes de qPCR a
microbiota de humanos obesos durante a intervenccedilatildeo dieteacutetica para perda de peso
induzida observaram diminuiccedilatildeo na proporccedilatildeo de FirmicutesBacteroidetes nos
obesos apoacutes a intervenccedilatildeo dieteacutetica
A proporccedilatildeo FirmicutesBacteroidetes tem sido associada como um marcador
de sauacutede para um indiviacuteduo e um desequiliacutebrio nesta proporccedilatildeo estaacute associada com
diferentes doenccedilas (MARIAT et al 2009) A mudanccedila na abundacircncia relativa destes
filos resulta no aumento da capacidade de captaccedilatildeo de energia a partir dos
alimentos aleacutem de induzir a inflamaccedilatildeo de baixo grau A reduccedilatildeo de Bacteroidetes
tem sido relacionada com dieta rica em gordura que pode resultar em aumento dos
niacuteveis plasmaacuteticos de LPS (CANI et al 2007 EVERARD CANI 2013) enquanto o
aumento Firmicutes tem sido associado com o consumo de carnes (EVERARD
CANI 2013) Aleacutem disso vaacuterios estudos tecircm mostrado mudanccedila da relaccedilatildeo de
FirmicutesBacteroidetes em pessoas obesas durante intervenccedilotildees dieteacuteticas para
perda de peso corporal sugerindo que as mudanccedilas na concentraccedilatildeo de bacteacuterias
nos indiviacuteduos obesos podem ser revertidas depois da perda de peso induzida por
dieta fazendo com que a microbiota do indiviacuteduo obeso se assemelhe ao indiviacuteduo
eutroacutefico (CLEMENTE et al 2012 DEWULF et al 2013 DIBAISE et al 2012
REMELY et al 2013 2015) Em contrapartida estes resultados natildeo satildeo universais
outros estudos demonstraram padrotildees variaacuteveis em mudanccedilas de niacutevel de filo
medidos na composiccedilatildeo da microbiota de indiviacuteduos obesos (MORAN SHANAHAN
2014 SCHWIERTZ et al 2010 ZHANG et al 2009) Duncan et al (2008) avaliaram
a relaccedilatildeo entre IMC perda de peso e a predominacircncia de grupos de bacteacuterias em
amostras fecais de pessoas obesas e natildeo obesas Estes indiviacuteduos foram
submetidos a duas dietas para perda de peso por quatro semanas Natildeo foi
encontrada diferenccedila entre Bacteroidetes nas amostras entre indiviacuteduos obesos e
natildeo obesos No entanto houve reduccedilotildees no grupo de Firmicutes em obesos
submetidos a dietas hipocaloacutericas Em outro estudo realizado por Schwiertz et al
(2010) tambeacutem natildeo foram observadas diferenccedilas nas contagens de Bacteroidetes e
Firmicutes entre os grupos de estudo Xiao et al (2014) em estudo com intervenccedilatildeo
104
dieteacutetica baseada em gratildeos integrais onde analisaram a microbiota intestinal de 123
voluntaacuterios obesos antes e depois da intervenccedilatildeo de 9 semanas seguida por um
periacuteodo de manutenccedilatildeo de 14 semanas tambeacutem natildeo observaram alteraccedilotildees
significativas na abundacircncia de Bacteroidetes e Firmicutes ou na proporccedilatildeo destes
dois filos durante a intervenccedilatildeo dieteacutetica mesmo quando os voluntaacuterios perderam
uma quantidade significativa de peso Estudos recentes do Projeto Microbioma
Humano natildeo encontraram associaccedilatildeo entre a proporccedilatildeo FirmicutesBacteroidetes e
obesidade ou Iacutendice de Massa Corporal (IMC) Nesse sentido tem sido sugerido por
alguns autores que a utilizaccedilatildeo dessa relaccedilatildeo como um biomarcador para a
obesidade permanece incerto devido a variabilidade dos dados na literatura
(FINUCANE et al 2014 MURPHY et al 2010)
Recentemente tem sido proposta uma nova hipoacutetese que associa a
microbiota intestinal com a homeostase metaboacutelica demonstrando-a como uma das
fontes potenciais de inflamaccedilatildeo de baixo grau (ARAKI et al 2005 OKAYASU et al
1990 RAKOFF-NAHOUM 2004 XIAO et al 2014 ZHAO 2013) Nesse contexto
tem sido demonstrado que dietas com alto teor de gordura tambeacutem podem aumentar
as concentraccedilotildees de LPS no plasma de humanos Estudo realizado por Cani et al
(2007) mostrou em camundongos que o maior consumo de gordura levou ao maior
aumento nas concentraccedilotildees de LPS no plasma A absorccedilatildeo de LPS reforccedilada pela
alta ingestatildeo de gordura pode estimular a secreccedilatildeo das citocinas TNF-α e IL-6
resultando em inflamaccedilatildeo sistecircmica de baixo grau dessa forma a microbiota
intestinal pode ter papel ativo na promoccedilatildeo eou inibiccedilatildeo da inflamaccedilatildeo e portanto
um efeito no metabolismo lipiacutedico (FLOCK GREEN KRIS-ETHERTON 2011) Os
resultados do presente estudo natildeo demonstraram diferenccedilas estatisticamente
significantes entre os grupos caso e controle para nenhuma das citocinas avaliadas
No entanto estudos in vitro mostraram que o consumo de aacutecidos graxos saturados
tambeacutem observado no presente estudo em ambos os grupos promovem processo
inflamatoacuterio com aumento da expressatildeo de IL-6 e TNF-α de TLR- 4 e consequente
aumento da ativaccedilatildeo da via NF-kβ (AJUWON SPURLOCK 2005 CALDER et al
2011 WEATHERILL et al 2005) Em estudos experimentais a dieta hiperlipiacutedica
rica em gordura saturada demonstrou promover obesidade com consequente
aumento de peso corporal adiposidade e marcadores inflamatoacuterios (FERNANDEZ-
REAL et al 2003 PEREIRA et al 2012) Esses achados podem explicar o fato de
105
que no presente estudo natildeo foram observadas diferenccedilas estatisticamente
significantes em relaccedilatildeo a liberaccedilatildeo de TNF-α e IL1-β entre os grupos estudados
Em relaccedilatildeo agrave liberaccedilatildeo da citocina IL-17 tambeacutem natildeo foram observadas diferenccedilas
estatisticamente significantes no entanto os achados da literatura teumlm sugerido
que no contexto de disbiose a presenccedila de agentes patogecircnicos pode perturbar a
regulaccedilatildeo do ambiente anti-inflamatoacuterio e que quando patoacutegenos enteacutericos superam
as bacteacuterias comensais o desequiliacutebrio entre comensais e bacteacuterias patogecircnicas
provocam liberaccedilatildeo significativa de MAMPs Este aumento pode induzir IECs DCs e
macroacutefagos ativados a secretar citocinas inflamatoacuterias como a IL-1β IL-6 IL-12 e
IL-23 Estas citocinas estimulam o desenvolvimento de ceacutelulas CD4+ T auxiliares
(T helper-TH1) e ceacutelulas TH17 (produzem IL-17A IL-17F e IL-22) resultando na
inflamaccedilatildeo crocircnica (MAYNARD et al 2012)
O estudo da influecircncia de diferentes elementos da dieta e composiccedilatildeo
corporal sobre a variaccedilatildeo da composiccedilatildeo da microbiota tornou-se uma aacuterea de
crescente interesse cientiacutefico Com efeito a relaccedilatildeo entre a microbiota intestinal e a
obesidade estaacute bastante reconhecida No entanto a participaccedilatildeo dos micro-
organismos da classe dos Mollicutes e alguns mecanismos subjacentes a essas
interaccedilotildees permanecem pouco estudados Em relaccedilatildeo agraves limitaccedilotildees do estudo
deve-se considerar o desenho transversal natildeo sendo possiacutevel estabelecer relaccedilatildeo
de causa e efeito No entanto o estudo mostra-se relevante destacando como
ponto forte o cuidado metodoloacutegico e a relevacircncia dos resultados encontrados
contribuindo para o avanccedilo dos estudos da relaccedilatildeo entre os molicutes microbiota
intestinal e obesidade Nesse contexto a importacircncia e validade de estudos como
este eacute apontar os possiacuteveis fatores de risco que contribuam para obesidade sendo
que a cuidadosa interpretaccedilatildeo dos resultados eacute importante para a geraccedilatildeo de
hipoacuteteses
Nesse contexto uma pesquisa acerca da relaccedilatildeo causa-efeito entre a
microbiota intestinal e a obesidade eacute altamente justificaacutevel uma vez que diferentes
espeacutecies de bacteacuterias podem desempenhar um papel significativo na safra de
energia humana e regulaccedilatildeo do peso corporal Aleacutem disso a consideraccedilatildeo de
fatores de estilo de vida em estudos da microbiota intestinal eacute altamente
recomendada uma vez que mudanccedilas no padratildeo alimentar e atividade fiacutesica podem
influenciar a composiccedilatildeo da microbiota intestinal para o desenvolvimento da
106
obesidade A partir disso o presente estudo fornece evidecircncias de que alteraccedilotildees e
interaccedilotildees na microbiota intestinal possam definir subconjuntos de indiviacuteduos com
diferentes perfis de risco metaboacutelico e assim contribuir para a investigaccedilatildeo da
heterogeneidade associada a fenoacutetipos relacionados com a adiposidade
especialmente em sociedades que estatildeo passando por transformaccedilotildees
socioeconocircmicas tecnoloacutegicas e culturais para um estilo de vida moderno
107
7 CONCLUSOtildeES
Os grupos caso e controle balancearam suas dietas conforme o intervalo de
distribuiccedilatildeo energeacutetica recomendado no entanto foi observado um consumo
de fibras inferior e de gorduras saturadas superior ao recomendado em
ambos os grupos
As mulheres de ambos os grupos apresentaram excesso de gordura corporal
Foi desenvolvido um ensaio de PCR em tempo real especiacutefico sensiacutevel
reprodutiacutevel e quantitativo para a detecccedilatildeo de Mollicutes nas fezes humanas
Foram encontradas associaccedilotildees estatisticamente significantes entre a
presenccedila de Mollicutes e mulheres obesas
Natildeo foram observadas associaccedilotildees estatisticamente significantes em relaccedilatildeo
as meacutedias de consumo dos macronutrientes carboidratos proteiacutenas lipiacutedios e
fibras com a presenccedila de Mollicutes
Natildeo foram observadas diferenccedilas estatisticamente significantes para as
cargas de Firmicutes Bacteroidetes e Bacteacuterias totais entre as mulheres do
grupo caso e controle
A proporccedilatildeo de Firmicutes em relaccedilatildeo aos Bacteroidetes foi maior na
microbiota intestinal das mulheres obesas em relaccedilatildeo agraves eutroacuteficas
Natildeo foi observada diferenccedila estatisticamente significante entre os grupos
caso e controle para nenhuma das citocinas avaliadas
108
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APEcircNDICE A ndash TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
128
Universidade de Satildeo Paulo
Instituto de Ciecircncias Biomeacutedicas
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
ESTUDO Avaliaccedilatildeo da participaccedilatildeo dos microrganismos da Classe Mollicutes na microbiota intestinal de mulheres eutroacuteficas e obesas
Vocecirc estaacute sendo convidado (a) a participar do projeto de pesquisa acima citado O documento
abaixo conteacutem todas as informaccedilotildees necessaacuterias sobre a pesquisa que estamos fazendo Sua
colaboraccedilatildeo neste estudo seraacute de muita importacircncia para noacutes mas se desistir a qualquer momento
isso natildeo causaraacute nenhum prejuiacutezo a vocecirc
Eu _________________________________________________________________ profissatildeo ____________________________
residente e domiciliado na
_______________________________________________________________________________________________________________
______________________________________________________________ portador da Ceacutedula de identidade RG
___________________________ e inscrito no CPFMF______________________________ nascido(a) em _____
_____ _______ abaixo assinado(a) concordo de livre e espontacircnea vontade em participar como
voluntaacuterio(a) do estudo ldquoAvaliaccedilatildeo da participaccedilatildeo dos microrganismos da Classe Mollicutes
na microbiota intestinal de mulheres eutroacuteficas e obesasrdquo Declaro que obtive todas as
informaccedilotildees necessaacuterias bem como todos os eventuais esclarecimentos quanto agraves duacutevidas por
mim apresentadas
Estou ciente que
I) O estudo se faz necessaacuterio para que se possam descobrir as possiacuteveis causas da doenccedila
denominada vaginoses bacterianas a ser estudada no projeto ldquoAvaliaccedilatildeo da
participaccedilatildeo dos microrganismos da Classe Mollicutes na microbiota intestinal de
mulheres eutroacuteficas e obesasrdquo
II) Seratildeo feitas uma coleta de 5ml de sangue e fezes em periacuteodo uacutenico
III) A participaccedilatildeo neste projeto natildeo tem objetivo de me submeter a um tratamento bem
como natildeo me acarretaraacute qualquer despesa financeira com relaccedilatildeo aos procedimentos
meacutedico-cliacutenico-terapecircuticos efetuados no estudo
129
IV) Tenho a liberdade de desistir ou de interromper a colaboraccedilatildeo neste estudo no momento
em que desejar sem necessidade de qualquer explicaccedilatildeo
V) A desistecircncia natildeo causaraacute nenhum prejuiacutezo agrave minha sauacutede ou bem estar fiacutesico Natildeo viraacute
interferir no atendimento ou tratamento meacutedico
VI) Os resultados obtidos durante este ensaio seratildeo mantidos em sigilo mas concordo que
sejam divulgados em publicaccedilotildees cientiacuteficas desde que meus dados pessoais natildeo sejam
mencionados
VII) Caso eu desejar poderei pessoalmente tomar conhecimento dos resultados ao final
desta pesquisa
( ) Desejo conhecer os resultados desta pesquisa
( ) Natildeo desejo conhecer os resultados desta pesquisa
VIII) Concordo que o material possa ser utilizado em outros projetos desde que autorizado
pela Comissatildeo de Eacutetica deste Instituto e pelo responsaacutevel por esta pesquisa Caso minha
manifestaccedilatildeo seja positiva poderei retirar essa autorizaccedilatildeo a qualquer momento sem
qualquer prejuiacutezo para mim
( ) Sim ou ( ) Natildeo
IX ) Poderei contatar a Secretaria da Comissatildeo de Eacutetica em Pesquisa com Seres Humanos ndash
ICBUSP - no Fone 30917733 (e-mail cepicbuspbr) ou (11 3091-7297 jotiuspbr)
para recursos ou reclamaccedilotildees em relaccedilatildeo ao presente estudo
X) O sujeito de pesquisa ou seu representante quando for o caso deveraacute rubricar todas as
folhas do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido ndash TCLE - apondo sua assinatura na uacuteltima
paacutegina do referido Termo
XI) O pesquisador responsaacutevel deveraacute da mesma forma rubricar todas as folhas do Termo de
Consentimento Livre e Esclarecido ndash TCLEndash apondo sua assinatura na uacuteltima paacutegina do
referido Termo
XII) Resoluccedilatildeo 19696 - Estou recebendo uma coacutepia deste Termo de Consentimento Livre e
Esclarecido
Satildeo Paulo___________de________________de 20_____ ( ) Paciente ( ) Responsaacutevel
Testemunha 1 _______________________________________________
Nome RG Telefone
130
Testemunha 2 ___________________________________________________
Nome RG Telefone
Responsaacutevel pelo Projeto _____________________________________________________
PROF DR JORGE TIMENETSKY
131
APEcircNDICE B ndash QUESTIONAacuteRIO
132
UNIVERSIDADE DE SAtildeO PAULO
INSTITUTO DE CIEcircNCIAS BIOMEacuteDICAS
MESTRADO EM MICROBIOLOGIA
Seccedilatildeo 1 IDENTIFICACcedilAtildeO E DADOS PESSOAIS
Nome Idade ID
Telefone Data
Profissatildeo
Estado civil 1 Casada 2 Solteira 3 Mora com companheiro 4 Viuacuteva 5 Divorciada
Raccedilacor 1 Branca 2 Preta 3 Amarela 4 Parda 5 Indiacutegena
Escolaridade 1 Analfabeto 2 1ordm grau incompleto 3 1ordm grau Completo
4 2ordm grau incompleto 5 2ordm grau completo 6 Superior incompleto 7 superior completo
Condiccedilatildeo Socioeconocircmica Indicar aproximadamente a renda domiciliarfamiliar mensal (soma de todos os ganhos
das pessoas que dividem as despesas) (valor SM R$ 67800)
ateacute 1 salaacuterio miacutenimo (ateacute R$ 61800)
1 a 2 salaacuterios miacutenimos (mais de R$ 61800 a R$ 123600)
2 a 5 salaacuterios miacutenimos (mais de R$ 123600 a R$ 309000)
5 a 10 salaacuterios miacutenimos (mais de R$ 309000 a R$ 618000)
mais de 10 salaacuterios miacutenimos (mais de R$ 618000)
Seccedilatildeo 2 HISTOacuteRIA FAMILIAR (parentes de 1ordm grau paternos e maternos e irmatildeos)
1 HAS 2 Diabetes 3 Obesidade 4 Hipercolesterolemia 5 DCV
Seccedilatildeo 3 HISTOacuteRIA CLIacuteNICA
133
Alteraccedilotildees gastrointestinais 1 Constipaccedilatildeo Flatulecircncia 3 Refluxo 4 Azia
5 Ulcera 6 Gastrite 7 Naacuteuseas 8 Vocircmitos
Como o intestino se comporta habitualmente 1 Normal 2 Constipaccedilatildeo 3 Diarreacuteia
Moleacutestia atual 1 HAS 2 Diabetes 3 Obesidade 4 Hipercolesterolemia
5 DCV 6 Dispneacuteia 7 Alteraccedilatildeo Menstrual
Uso de laxantes 1 Sim 2 Natildeo
Seccedilatildeo 4 HISTOacuteRIA OBSTEacuteTRICA
Tipo de parto 1 Normal 2 Cesaacuterea
Foi amamentada 1 Natildeo 2 1 a 3 meses 3 4 a 6 meses 4 7 a 9 meses
5 10 a 12 meses 6 gt12 meses
Teve alguma gestaccedilatildeo 1 Sim 2 Natildeo
Quantos filhos 1 1 a 2 2 3 a 4 3 ge5
Quantos partos foram normais 1 1 a 2 2 3 a 4 3 ge5
Quantos partos foram cesaacuterea 1 1 a 2 2 3 a 4 3 ge5
Tempo de amamentaccedilatildeo dos filhos 1 Natildeo 2 1 a 3 meses 3 4 a 6 meses 4 7 a 9 meses
5 10 a 12 meses 6 gt12 meses
Seccedilatildeo 5 HISTOacuteRIA GINECOLOacuteGICA
Usou ou estaacute usando algum anticoncepcional (adesivo piacutelula anel vaginal DIU de hormocircnio injetaacutevel ou
bastatildeo subcutacircneo) 1 Sim 2 Natildeo
Com que idade comeccedilou a tomar
Parou de usar por algum tempo
Por quanto tempo parou
Seccedilatildeo 6 CONSUMO DE TABACO
134
Jaacute fumou mais de 20 maccedilos de cigarro (cachimbo ou charuto) em toda sua vida
1 Natildeo 2 Sim e fumo atualmente 3 Sim mas parei de fumar 4 Natildeo sabe natildeo informa
Se fumafumou o faz haacute quanto tempo
Quantos cigarros em meacutedia fumafumava por dia
____cigarros
____cachimbos
____charutos
Se parou de fumar haacute quanto tempo ocorreu
Seccedilatildeo 7 CONSUMO DE AacuteLCOOL
Etilista 1 Sim 2 Natildeo
Frequencia de ingestatildeo
Tipo de bebida ingerida
Haacute quanto tempo ingere
Seccedilatildeo 8 ATIVIDADE FIacuteSICA (IPAQ versatildeo curta)
As perguntas estatildeo relacionadas ao tempo que vocecirc gasta fazendo atividade fiacutesica na UacuteLTIMA
semana As perguntas incluem as atividades que vocecirc faz no trabalho para ir de um lugar a outro
por lazer por esporte por exerciacutecio ou como parte das suas atividades em casa ou no jardim
Para responder as questotildees lembre que
atividades fiacutesicas VIGOROSAS satildeo aquelas que precisam de um grande esforccedilo fiacutesico e que fazem respirar MUITO mais forte que o normal
atividades fiacutesicas MODERADAS satildeo aquelas que precisam de algum esforccedilo fiacutesico e que fazem respirar UM POUCO mais forte que o normal
Para responder as perguntas pense somente nas atividades que vocecirc realiza por pelo menos 10
minutos contiacutenuos de cada vez
135
1a Em quantos dias da uacuteltima semana vocecirc caminhou por pelo menos 10 minutos contiacutenuos em casa
ou no trabalho como forma de transporte para ir de um lugar para outro por lazer por prazer ou
como forma de exerciacutecio dias _____ por SEMANA ( ) Nenhum
1b Nos dias em que vocecirc caminhou por pelo menos 10 minutos contiacutenuos quanto tempo no total
vocecirc gastou caminhando por dia horas ______ Minutos _____
2a Em quantos dias da uacuteltima semana vocecirc realizou atividades MODERADAS por pelo menos 10
minutos contiacutenuos como por exemplo pedalar leve na bicicleta nadar danccedilar fazer ginaacutestica
aeroacutebica leve jogar volei recreativo carregar pesos leves fazer serviccedilos domeacutesticos na casa no
quintal ou no jardim como varrer aspirar cuidar do jardim ou qualquer atividade que fez aumentar
moderadamente sua respiraccedilatildeo ou batimentos do coraccedilatildeo (POR FAVOR NAtildeO INCLUA CAMINHADA)
dias _____ por SEMANA ( ) Nenhum
2b Nos dias em que vocecirc fez essas atividades moderadas por pelo menos 10 minutos contiacutenuos
quanto tempo no total vocecirc gastou fazendo essas atividades por dia
horas ______ Minutos _____
3a Em quantos dias da uacuteltima semana vocecirc realizou atividades VIGOROSAS por pelo menos 10
minutos contiacutenuos como por exemplo correr fazer ginaacutestica aeroacutebica jogar futebol pedalar raacutepido
na bicicleta jogar basquete fazer serviccedilos domeacutesticos pesados em casa no quintal ou cavoucar no
jardim carregar pesos elevados ou qualquer atividade que fez aumentar MUITO sua respiraccedilatildeo ou
batimentos do coraccedilatildeo dias _____ por SEMANA ( ) Nenhum
3b Nos dias em que vocecirc fez essas atividades vigorosas por pelo menos 10 minutos contiacutenuos quanto
tempo no total vocecirc gastou fazendo essas atividades por dia
horas ______ Minutos _____
Seccedilatildeo 9 HAacuteBITOS ALIMENTARES
Vocecirc mudou seus haacutebitos alimentares recentemente ou estaacute fazendo dieta para emagrecer ou por qualquer
outro motivo
1 Natildeo 5 Sim para reduccedilatildeo de sal
2 Sim para perda de peso 6 Sim para reduccedilatildeo de colesterol
3 Sim por orientaccedilatildeo meacutedica
136
4 Sim para dieta vegetariana ou reduccedilatildeo do consumo de carne
Vocecirc estaacute tomando algo para suplementar sua dieta (vitaminas minerais e outros produtos)
1 Natildeo 2 Sim regularmente 3 Sim mas natildeo regularmente
Se a resposta da pergunta anterior for sim favor preencher o quadro abaixo
Suplemento
Nome comercial Dose
Frequencia
Nuacutemero de refeiccedilotildees que costuma fazer por dia
Costuma fazer desjejum diariamente 1 Sim 2 Natildeo
Costuma beliscar entre as refeiccedilotildees 1 Sim 2 Natildeo
Costuma ingerir liacutequidos durante as refeiccedilotildees 1 Sim 2 Natildeo
Quantas refeiccedilotildees costuma fazer fora de casa por semana
Em que local costuma fazer as refeiccedilotildees fora de casa
1 Restaurantes 5 Natildeo faz
2 Lanches raacutepidos 6 Outro
3 Marmita
4 No trabalho
137
As questotildees seguintes relacionam-se ao seu haacutebito alimentar usual no PERIacuteODO DE UM ANO Para cada quadro responda por favor a frequecircncia que melhor descreva QUANTAS VEZES vocecirc costuma comer cada item e a respectiva UNIDADE DE TEMPO (se por dia por semana por mecircs ou no ano) Depois responda qual a sua PORCcedilAtildeO INDIVIDUAL USUAL em relaccedilatildeo agrave porccedilatildeo meacutedia indicada ESCOLHA SOMENTE UM CIacuteRCULO PARA CADA COLUNA Muitos grupos de alimentos incluem exemplos Eles satildeo sugestotildees e vocecirc pode pode consumir todos os itens indicados Se vocecirc natildeo come ou raramente come um determinado iacutetem preeencha o ciacuterculo da primeira coluna (N=nunca come) NAtildeO DEIXE ITENS EM BRANCO
138
139
140
141
Por favor liste qualquer outro alimento ou preparaccedilatildeo importante que vocecirc costuma comer ou beber pelo menos UMA VEZ POR SEMANA que natildeo foram citados aqui (por exemplo leite-de-coco outros tipos de carnes receitas caseiras creme de leite leite condensado gelatina e outros doces etc )
Alimento Frequecircncia por semana Quantidade Consumida
Quando vocecirc come carne bovina ou suiacutena vocecirc costuma comer a gordura visiacutevel 1 nunca ou raramente 2 algumas vezes 3 sempre 4 natildeo sabe Quando vocecirc come frango ou peru vocecirc costuma comer a pele 1 nunca ou raramente 2 algumas vezes 3 sempre 4 natildeo sabe
142
Seccedilatildeo 10 DADOS ANTROPOMEacuteTRICOS
Peso
_____________Kg
_____________Kg
Estatura
_____________m
_____________m
IMC
__________Calcular IMC= peso em Kg altura em m2
Circunferecircncia Abdominal
_____________cm
_____________cm
Reactacircncia
Resistecircncia ___________MG
_____________MLG
Peso MG_________kg
Peso MGL_________kg
TMB __________
aacutegua de massa magra
143
APEcircNDICE C- TABELA 10
144
Tabela 10 Participaccedilatildeo dos alimentos nos grupos meacutedias de consumo por dia dos alimentos consumidos pela populaccedilatildeo estudada Satildeo Paulo SP 2013-2014
Grupo Alimentar
Alimentos Grupo Frequecircncia diaacuteria (dp)
Frequecircncia diaacuteria (amplitude)
Massas
Macarratildeo com molho sem carne
Caso
02 (05)
(0-25)
Controle
02 (02) (0-043)
Macarratildeo com molho com carne lasanha nhoque
Caso 01 (012) (0-043)
Controle
02 (02) (0-079)
Pizza panqueca
Caso 015 (022) (0-1)
Controle 02 (01) (003-043)
Preparaccedilatildeo
Sopas
Caso 015 (018) (0-043)
Controle 014 (02) (0-043)
Polenta cozida ou frita
Caso 003 (005) (0-014)
Controle 0008 (003) (0-014)
Carne vermelha e
ovos
Carne bovina
Caso 06 (06) (008-25)
Controle 05 (018) (014-079)
Carne de porco Caso 008 (009) (0-043)
Controle 02 (05) (0-25)
Carne seca carne do sol bacon
Caso 006 (005) (0-014)
Controle 004 (006) (0-014)
Ovos Caso 02 (02) (0-1)
Controle 03 (05) (0-25)
Embutidos
Linguiccedila
Caso 011 (009) (0-043)
Controle 02 (05) (0-25)
Embutidos (presunto mortadela salsicha)
Caso 015 (023) (0-1)
Controle 02 (02) (0-043)
Carne branca
Frango Caso 06 (09) (003-3)
Controle 05 (05) (014-25)
Peixe e frutos do mar Caso 01 (01) (0-043)
Controle 01 (02) (0-043)
Leite e derivados
Leite integral Caso 07 (09) (0-3)
Controle 04 (06) (0-25)
Leite desnatado Caso 04 (09) (0-3)
Controle 002 (005) (0-014)
Leite semi-desnatado Caso 03 (08) (0-25)
Controle 0004 (002) (0-008)
Iogurte natural Caso 05 (09) (0-25)
Controle 03 (03) (0-079)
Iogurte com frutas Caso 03 (08) (0-25)
Controle 02 (02) (0-079)
145
Tabela 10 Participaccedilatildeo dos alimentos nos grupos meacutedias de consumo ao dia dos alimentos consumidos pela populaccedilatildeo estudada Satildeo Paulo SP 2013-2014
(Continuaccedilatildeo)
Grupo Alimentar
Alimentos Grupo Frequecircncia diaacuteria (dp)
Frequecircncia diaacuteria
(amplitude)
Leite e derivados
Queijo mussarela prato parmesatildeo e provolone
Caso 05 (07) (0-25)
Controle 05 (06) (003-25)
Queijo minas e ricota Caso 04 (08) (0-25)
Controle 04 (06) (0-25)
Leguminosas
Feijatildeo Caso 12 (09) (014-25)
Controle 06 (05) (008-25)
Lentilha ervilha seca gratildeo de bico soja
Caso 005 (009) (0-043)
Controle 006 (01) (0-043)
Feijatildeo tropeiro e feijoada
Caso 003 (003) (0-014)
Controle 002 (004) (0-014)
Cereais raiacutezes e
tubeacuterculos
Arroz branco ou integral cozido com
oacuteleo e temperos
Caso 15 (09) (043-25)
Controle 14 (07) (043-25)
Batata frita ou mandioca frita
Caso 007 (01) (0-043)
Controle 02 (01) (003-043)
Batata mandioca inhame (cozida ou assada) purecirc
Caso 01 (012) (0-043)
Controle 02 (02) (0-043)
Farinha de mandioca farofa cuscuz aveia tapioca
Caso 02 (03) (0-1)
Controle 01 (02) (0-1)
Patildeo francecircs patildeo de forma integral patildeo doce torrada
Caso 07 (06) (014-3)
Controle 17 (08) (0-25)
Biscoito sem recheio (doce salgado) Caso 04 (06) (0-25)
Controle 05 (06) (0-25)
Biscoito recheado waffer amanteigado
Caso 01 (03) (0-1)
Controle 009 (02) (0-043)
Bolo (simples recheado) Caso 01 (013) (0-043)
Controle 01 (013) (0-043)
Hortaliccedilas
Alface
Caso 12 (09) (008-3)
Controle 08 (06) (014-25)
Tomate Caso 14 (107) (008-3)
Controle 08 (06) (003-25)
Cenoura Caso 06 (07) (008-25)
Controle 04 (02) (0-1)
Outros legumes (abobrinha berinjela chuchu pepino)
Caso 04 (03) (008-1)
Controle 05 (07) (0-25)
Outras verduras cruas (acelga ruacutecula agriatildeo)
Caso 04 (03) (008-1)
Controle 04 (02) (0-1)
146
Tabela 10 Participaccedilatildeo dos alimentos nos grupos meacutedias de consumo ao dia dos alimentos consumidos pela populaccedilatildeo estudada Satildeo Paulo SP 2013-2014
(Continuaccedilatildeo)
Grupo Alimentar Alimentos Grupo Frequecircncia diaacuteria (dp)
Frequecircncia diaacuteria
(amplitude)
Hortaliccedilas
Outras verduras cozidas (acelga espinafre escarola couve)
Caso 03 (02) (0-1)
Controle 03 (02) (0-079)
Broacutecolis couve-flor repolho Caso 02 (015) (0-043)
Controle 03 (03) (0-1)
Frutas
Laranja mexerica abacaxi Caso 08 (09) (0-3)
Controle 04 (05) (003-25)
Banana Caso 08 (09) (0-3)
Controle 04 (02) (008-1)
Maccedilatilde pecircra Caso 05 (07) (0-3)
Controle 03 (03) (0-1)
Melatildeo melancia Caso 03 (07) (0-1)
Controle 01 (01) (0-043)
Mamatildeo Caso 03 (03) (0-1)
Controle 008 (006) (0-014)
Goiaba Caso 01 (02) (0-1)
Controle 0008 (002) (0-008)
Abacate Caso 08 (02) (0-1)
Controle 007 (001) (0-003)
Suco natural Caso 07 (09) (0-3)
Controle 03 (02) (0-1)
Industrializados
Maionese molho para salada patecirc chantily
Caso 01 (016) (0-043)
Controle 01 (02) (0-1)
Condimentos
Caso 04 (06) (0-25)
Controle 02 (03) (0-079)
Hamburguer nuggets almocircndega Caso 006 (009) (0-043)
Controle 005 (009) (0-043)
Suco industrializado Caso 08 (105) (0-3)
Controle 05 (03) (0-1)
Refrigerante comum Caso 02 (02) (0-079)
Controle 02 (02) (0-043)
Refrigerante light diet Caso 0 0
Controle 007 (02) (0-043)
147
Tabela 10 Participaccedilatildeo dos alimentos nos grupos meacutedias de consumo ao dia dos alimentos consumidos pela populaccedilatildeo estudada Satildeo Paulo SP 2013-2014
(Continuaccedilatildeo)
Grupo Alimentar Alimentos Grupo Frequecircncia diaacuteria (dp)
Frequecircncia diaacuteria
(amplitude)
Infusatildeo
Chaacute e cafeacute sem accediluacutecar Caso 09 (1) (0-25)
Controle 06 (07) (0-25)
Chaacute e cafeacute com accediluacutecar Caso 08 (08) (0-25)
Controle 07 (08) (0-3)
Bebida alcooacutelica
Cerveja
Caso 003 (005) (0-014)
Controle 0074 (01) (0-043)
Oacuteleos e gorduras
Oacuteleo azeite ou vinagre para tempero de salada
Caso 1 (09) (0-25)
Controle 03 (03) (0-1)
Manteiga ou margarina comum Caso 09 (09) (0-25)
Controle 07 (07) (0-25)
Manteiga ou margarina light Caso 02 (06) (0-25)
Controle 007 (003) (0-014)
Lanches
Salgado frito Caso 02 (03) (0-1)
Controle 01 (01) (0-043)
Salgado assado Caso 014 (02) (0-1)
Controle 02 (02) (0-043)
Sanduiche Caso 006 (009) (0-043)
Controle 005 (004) (0-014)
Accediluacutecar e doces
Chocolate bombom brigadeiro Caso 04 (04) (0-1)
Controle 06 (04) (003-2)
Achocolatado em poacute (adicionado ao leite)
Caso 013 (03) (0-1)
Controle 02 (03) (0-1)
Sobremesas doces tortas e pudins
Caso 02 (03) (0-1)
Controle 03 (03) (003-1)
Accediluacutecar mel e geleacuteia Caso 05 (07) (0-3)
Controle 08 (1) (0-3)
AGRADECIMENTOS
Agrave Deus e todos meus espiacuteritos de luz em vida e desencarnados por tudo que me
representam por me permitirem cruzar essa jornada com sabedoria resignaccedilatildeo feacute e
discernimento e por me mostrarem que os ldquoSinais seguem o que creemrdquo Ofereccedilo
Agrave melhor matildee que Deus poderia me permitir nascer que me mostrou a vida e me
ensinou os verdadeiros valores de amor perdatildeo caridade humildade e perseveranccedila
aleacutem de me mostrar que as barreiras da vida satildeo transponiacuteveis e que na verdade
devem ser encaradas como fronteiras Obrigada por continuar olhando por mim e me
incentivando mesmo de outro plano espiritual Sem o seu amor tudo isso seria
impossiacutevel A ti dedico
Agrave meu pai Oriston meu exemplo de vida e companheiro fiel por entender o meu
propoacutesito e me apoiar mesmo nas dificuldades Vocecirc me ensina mais a cada dia sobre
a leveza da vida e em como me tornar uma pessoa melhor uma filha melhor obrigada
Agrave meu irmatildeo Breno e minha cunhada Ariela pelo apoio e por me permitir ser a tia mais
feliz e amada desse mundo
Aos meus sobrinhos queridos Lulu Lis e Miguel por me mostrarem a pureza da vida e
do amor em sua essecircncia mais pura
Agrave Evinha minha ldquomatildee adotivardquo desde os meus 2 dias de vida por todo amor e
dedicaccedilatildeo Minha gratidatildeo seraacute eterna
Ao professor Jorge Timenetsky meu querido orientador por ter aceitado me orientar
natildeo soacute no planejamento e execuccedilatildeo do trabalho mas tambeacutem na vida Minha sincera
gratidatildeo pela orientaccedilatildeo dedicaccedilatildeo e competecircncia profissional
Ao professor Lucas meu mentor na vida e no trabalho pai matildee amigo e eterno
orientador Obrigada Marques por ter acreditado que essa semente um dia iria brotar
Sem o seu apoio e incentivo eu realmente natildeo conseguiria Ter vocecirc em meu caminho
eacute uma honra e um previleacutegio
Agrave Aricelma um dos maiores presentes que pude receber em minha trajetoacuteria pelo
amor conselhos carinhos e abraccedilos Vocecirc foi fundamental para eu me manter firme no
propoacutesito
Ao departamento de endocrinologia do HC-FMUSP e aos professores Alfredo Halpern e
Marcio Mancinni por abrirem as portas para a realizaccedilatildeo das coletas e por acreditarem
no trabalho
Aos funcionaacuterios do departamento de endocrinologia da HC-FMUSP sem os quais
seria inviaacutevel a realizaccedilatildeo das coletas
Aos pacientes por participarem deste estudo e me permitir aprender mais a cada
coleta
Ao professor Djanilson pelo auxiacutelio nas anaacutelises estatiacutesticas e por me apresentar
Jerusa um verdadeiro anjo sem a qual seria inviaacutevel as anaacutelises de consumo
alimentar
Agrave amiga e companheira de trajetoacuteria Aline Teixeira pela preciosa colaboraccedilatildeo nas
anaacutelises estatiacutesticas e por ser minha dupla imbatiacutevel
Ao amigo-irmatildeo Filipe Bezerra pela preciosa contribuiccedilatildeo nas adaptaccedilotildees das
ilustraccedilotildees e pela honra de sua amizade
Ao melhor grupo de pesquisa que jaacute sonhei fazer parte pelos ensinamentos e amizade
incondicional Juntos somos uma famiacutelia obrigada meus amigos
Agrave todos os amigos que passaram pelo aptdeg 63 ao longo desses anos vocecircs foram
fundamentais em todos os momentos dessa jornada
Aos funcionaacuterios do ICB II indispensaacuteveis no meu dia a dia pelo apoio amizade cafeacutes
e carinho
Agrave meus amigos-irmatildeos e suas respectivas famiacutelias por me ensinarem que amizade eacute o
sentimento que imanta as almas suave expressatildeo do ser que necessita intercambiar as
forccedilas da emoccedilatildeo sob os estiacutemulos do entendimento fraternal inspiradora de coragem
e de abnegaccedilatildeo que enfloresce as almas abenccediloando-as com resistecircncias para as
lutas Amo vocecircs gratidatildeo
Agrave todos que cruzaram meu caminho nesta jornada e que trouxeram consigo
ensinamentos que me transformaram em algueacutem melhor que outrora o meu muito
obrigada
Soacute o conhecimento vivido
O conhecimento de dentro para fora
Aquele que natildeo eacute aprendido nos livros nem na fria observaccedilatildeo
do fino repoacuterter de faro infaliacutevel
Soacute aquele conhecimento que se viveu dia a dia minuto a minuto
no erro e no acerto ()
Possibilita a criaccedilatildeo
Jorge Amado
18
RESUMO
SANTOS V M Avaliaccedilatildeo da participaccedilatildeo dos micro-organismos da Classe Mollicutes na microbiota intestinal de mulheres eutroacuteficas e obesas 2015 147 f Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Microbiologia) ndash Instituto de Ciecircncias Biomeacutedicas Universidade de Satildeo Paulo Satildeo Paulo 2015
A obesidade possui causas multifatoriais sendo caracterizada como um excesso de gordura
corporal acumulada no tecido adiposo causando impactos agrave sauacutede Estudos quanto agrave interaccedilatildeo
geneacutetica do indiviacuteduo com o ambiente mostram que alguns indiviacuteduos satildeo mais propensos ao ganho
de peso do que os outros em ambientes similares Satildeo muitas as evidecircncias de que o metabolismo
da microbiota intestinal facilita a extraccedilatildeo de calorias da dieta ajudam a estocaacute-las no tecido
adiposo aleacutem de prover energia e nutrientes para o crescimento microbiano Nesse contexto a
ocorrecircncia e participaccedilatildeo dos Mollicutes na microbiota intestinal eacute praticamente desconhecida
sendo necessaacuterios portanto o desenvolvimento de estudos que avaliem as implicaccedilotildees e
relevacircncia desses microrganismos nas respostas adaptativas da microbiota intestinal humana
Deste modo o objetivo do presente estudo foi analisar a participaccedilatildeo dos micro-organismos da
Classe Mollicutes e dos Filos Firmicutes e Bacteroidetes na microbiota intestinal de mulheres
obesas e eutroacuteficas Para a realizaccedilatildeo do estudo a casuiacutestica foi de 20 mulheres diagnosticadas
com obesidade (IMCgt 30kgm2) e 20 mulheres em eutrofia (IMC entre 185 e 249 kgm2 Foram
obtidas amostras de fezes sangue Foi aplicado um questionaacuterio semiestruturado sobre fatores
relacionados com obesidade e possiacutevel associaccedilatildeo com microbiota intestinal e ambiente aleacutem de
avaliaccedilatildeo antropomeacutetrica atraveacutes de Bioimpedacircncia e questionaacuterio de frequecircncia alimentar
Desenvolveu-se um ensaio quantitativo por meio de TaqMan PCR para a detecccedilatildeo de Mollicutes
nas amostras de fezes A metodologia foi especiacutefica sensiacutevel reprodutiacutevel e gerou dados
quantitativos para a detecccedilatildeo desses microrganismos nas fezes humanas Constatou-se no
presente estudo que o grupo caso apresentou consumo energeacutetico inferior ao recomendado e que
ambos os grupos apresentaram consumo superior de gorduras saturadas e inferior de fibras Em
relaccedilatildeo a determinaccedilatildeo do estado nutricional os dois grupos se apresentaram acima da meacutedia
referecircncia indicando excesso de gordura corporal Na determinaccedilatildeo da microbiota intestinal
constatou-se uma diferenccedila estatisticamente significante entre as meacutedias do nuacutemero dos micro-
organismos da classe Mollicutes entre os grupos caso e controle Detectou-se uma associaccedilatildeo
positiva estatisticamente significante entre a presenccedila de Mollicutes e mulheres obesas (OR= 115
IC= 242-554) Na quantificaccedilatildeo da presenccedila dos Filos Firmicutes e Bacteroidetes e Bacteacuterias
totais na microbiota natildeo foram observadas diferenccedilas estatisticamente significantes quanto a sua
quantidade entre as mulheres do grupo caso e controle No entanto foi observada maior proporccedilatildeo
de FirmicutesBacteroidetes na microbiota intestinal das mulheres obesas em relaccedilatildeo agraves eutroacuteficas
do grupo controle Os resultados obtidos permitiram obter evidecircncias importantes da participaccedilatildeo
dos micro-organismos da classe Mollicutes As alteraccedilotildees da microbiota intestinal tambeacutem
contribuiacuteram na definiccedilatildeo de subconjuntos de indiviacuteduos com diferentes perfis de risco metaboacutelico e
a da heterogeneidade associada a fenoacutetipos humanos relacionados com a adiposidade
Palavras-chave Obesidade Microbiota intestinal Mollicutes qPCR
ABSTRACT
SANTOS V M Evaluation of Mollicutes microorganismrsquos participation in the gut microbiota of obese and normal weight women 2015 147 p Masters thesis (Microbiology) ndash Instituto de Ciecircncias Biomeacutedicas Universidade de Satildeo Paulo Satildeo Paulo 2015
Obesity has multifactorial causes and it is characterized as an excess of corporal fat accumulated in adipose tissue causing health impacts Studies on the genetic interaction of the individual with the environment shows that some individuals are more prone to weight gain than others in similar environments There are many evidences that the gut microbiota metabolism facilitates the harvest of energy derived from ingested nutrients it help to store them in adipose tissue and provide energy and nutrients for microbial growth In this context the occurrence and participation of Mollicutes in the gut microbiota is pratically unknown requiring the development of studies to evaluate the implications and relevance of these microorganisms in the adaptive responses of the human gut microbiota Thus the aim of this study was to analyze the participation of the Class Mollicutes and Firmicutes and Bacteroidetes phylos in the gut microbiota of obese and normal weight women For the study it was collected samples of 20 women diagnosed with obesity (BMIgt 30 kg m2) and 20 women of normal weight (BMI between 185 and 249 kg m2) it was collected stool samples blood semi-structured questionnaire on etiological factors predisposing and associated with obesity and possible association with gut microbiota and the environment and anthropometric measurements using bioelectrical impedance A quantitative assay was developed through of TaqMan PCR for the detection of Mollicutes in stool samples from patients with the methodology specific sensitive reproducible and quantitative for the detection of these microorganisms in human stools It was found in this study that the case group had a lower energy consumption than recommended and that both groups had a higher intake of saturated fats and less fiber For determining the nutritional status of the two groups presented above average reference indicating excess body fat Regarding the determination of the intestinal microbiota of the study population there was a statistically significant difference between the mean of microorganisms of Mollicutes class between the case and control groups And it was detected a statistically significant positive association between the presence of Mollicutes and obese women (OR = 115 CI = 242 to 554) Regarding the analysis about the participation of phylos Firmicutes and Bacteroidetes and total bacteria in the microbiota of the study population no statistically significant differences observed for the microbial amount among women of the case and control group However there was a higher proportion of Firmicutes Bacteroidetes the gut microbiota of obese women compared to the control group normal weight women Analysis of the results provide important evidence about the participation of almost unknown Mollicutes class in the gut microbiota of the population studied as well as changes and interactions in intestinal microbiota can define subsets of individuals with different metabolic risk profiles and thus contribute to investigation of the heterogeneity associated phenotypes related to adiposity
Keywords Obesity Gut microbiota Mollicutes qPCR
LISTA DE ABREVIATURAS SIGLAS E SIacuteMBOLOS
A ndash Adenina
AEAndash N-araquidonoil etanolamina anandamida
AFndash Niacutevel de atividade fiacutesica
AGCCndash Aacutecidos graxos de cadeia curta
AgRPndash Peptiacutedeo Relacionado ao Agouti
AIDSndash Siacutendrome da imunodeficiecircncia adquirida
AIndash Adequate Intake
AMPndash Adenosina monofosfato
AMPKndash Adenosina proteiacutena quinase
AMPsndash Peptiacutedeos antimicrobianos bacterianos
APC ndash Ceacutelula apresentadora de antiacutegeno
APRILLndash Ligante indutor de proliferaccedilatildeo
atm ndash Atmosfera
ATP ndash Adenosina tri-fosfato
C ndash Citosina
C+G ndash Conteuacutedo citosina e guanina
Cb-1ndash Receptores canabinoacuteides
CCKndash Colecistocinina
CH4ndash Metano
CHOsndash Carboidratos
ChREBP ndash Carbohydrate response element-binding protein
CO2 ndash Gaacutes carbocircnico
CPT1ndash Carnitina palmitoil transferase 1
Ct ndash Cycle Treshold (Sinal de fluorescecircncia que pode ser
detectado)
CV ndash Coeficiente de variaccedilatildeo
DAG lipasendash sn-1-diacilglicerol lipase seletiva
DCs ndash Ceacutelulas Dendriacuteticas
DNA ndash Aacutecido Desoxirribonucleico
DRI ndash Dietary References Intakes
DP ndash Desvio padratildeo
dNTP ndash Deoxinucleotiacutedeo trifosfato
EAR ndash Estimated Average Requirements
EDTA ndash Aacutecido Etilenodiamino Tetra-aceacutetico
ELISA ndash Enzyme-Linked Immunoabsorbent Assay
EIndash Enzimas citoplasmaacuteticas do sistema PTS
EPIndash Equipamento de Proteccedilatildeo Individual
EROndash Espeacutecies reativas de oxigecircnio
FAAHndash Fatty acid amide hydrolase
FABFndash Fator de ativaccedilatildeo de ceacutelulas β
FFARndash Free fatty acids receptors
FIAFndash Fasting Induced Adipocyte Factor
g ndash Gramas
G ndash Guanina
GERndash Gasto energeacutetico de repouso
GETndash Gasto energeacutetico total
GLP-1ndash Peptiacutedeo semelhante ao glucagon
GPRndash Receptor acoplado agrave proteiacutena G
H2ndash Hidrogecircnio
HDLndash Lipoproteiacutena de alta densidade
HPRndash Enzimas citoplasmaacuteticas do sistema PTS
IBGEndash Instituto brasileiro de Geografia e Estatiacutestica
IC ndash Intervalo de Confianccedila
IECsndash Ceacutelulas epiteliais intestinais)
IFN-α ndash Interferon α
IFN-β ndash Interferon β
IFN-γ ndash Interferon gama
IgA ndash Imunoglobulina A
IL ndash Interleucina
IL-10 ndash Interleucina 10
IL-1β ndash Interleucina 1Beta
IL-25 ndash Interleucina 25
IL-33 ndash Interleucina 33
IL-6 ndash Interleucina 6
IMC ndash Iacutendice de massa corporal
IPAQ ndash International Physical Activity Questionnaire
kgndash Quilogramas
Kpb ndash Kilopares de bases
LPLndash Lipase lipoproteacuteica
LPSndash Lipopolissacariacutedeos
MAGndash Monoacilglicerol lipase
MAMPsndash Padrotildees moleculares associados agrave micro-organismos
MC4R ndash Receptor da Melanocortina 4
MDa ndash Megadaltons
mg ndash Miligramas
min ndash Minuto
mL ndash Mililitro
mm ndash Miliacutemetro
mM ndash Milimolar
mRNAndash RNA mensageiro
MSndash Ministeacuterio da Sauacutede
NAPE-PLDndash N-acil fostatidiletanolamida-fosfolipase D seletiva
NF-KBndash Fator nuclear Kappa B
NK ndash Natural Killers
nm ndash Nanocircmetro
NODndash Receptores de domiacutenio de digomerizaccedilatildeo de ligaccedilatildeo de
nucleotiacutedeos
NPYndash Neuropeptiacutedeo Y
ordm C ndash Graus Celsius
OMS (WHO) ndash Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede
OR ndash Odds Ratio
pb ndash Pares de base
PC1 ndash Proacute-hormocircnio Convertase 1
PCR ndash Reaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase
PGC-1ndash Peroxisome proliferator-activated receptor-gamma
coactivator 1 alpha
PGCndash Porcentagem de gordura corporal
pH ndash Potencial de hidrogecircnio iocircnico
pmol ndash Picomol
POFndash Pesquisa dos Orccedilamentos Familiares
POMCndash Proacute-oacutepio melanocortina
PPARndash Receptor Ativado por Proliferadores de Peroxissoma
PPI ndash Perda de peso intencional
PPLO ndash Pleuropneumonia-like Organisms
PTSndash Sistema fosfotransferase
PYYndash Peptiacutedeo tirosina-tirosina
QFAndash Questionaacuterio de frequecircncia alimentar
qPCR ndash PCR quantitativa ou PCR em tempo real
r2 ndash R da curva
RA ndash Aacutecido retinoacuteico
RCQndash Relaccedilatildeo cintura-quadril
REGIIIβndash Proteiacutenas antimicrobianas intestinais
REGIIIγndash Proteiacutenas antimicrobianas intestinais
RNA ndash Aacutecido ribonucleacuteico
rpm ndash Rotaccedilotildees por minuto
rRNA ndash RNA ribossocircmico
s ndash Segundo
SNCndash Sistema nervoso central
SREBP-1ndash Liver sterol response element binding protein type-1
SOCS-1 ndash Proteiacutenas supressora da sinalizaccedilatildeo de citocina-1
SOCS-3 ndash Proteiacutenas supressora da sinalizaccedilatildeo de citocina-3
T ndash Timina
TAndash Tecido adiposo
TCLE ndash Termo de Consentimento Livre e Esclarecido
TGF-β ndash Fator de crescimento tumoral-β
TGIndash Trato gastrintestinal
TLR ndash Toll-like receptor
TMndash Tecido muscular
TMBndash Taxa de metabolismo basal
TNF-α ndash Fator de Necrose Tumoral alfa
Tregndash Ceacutelulas T regulatoacuterias
tRNA ndash RNA transportador
TSLPndash Linfopoietina estromal tiacutemica
U ndash Unidade
UFC ndash Unidade Formadora de Colocircnia
UFCmicroL ndash Unidade Formadora de Colocircnia por microlitro
USDAndash United States Departament of Agriculture
VETndash Valor energeacutetico Total
X ndash Vezes
ZO-1ndash Zocircnula de oclusatildeo-1
α ndash Alfa
β ndash Beta
χ2 ndash Teste Qui-quadrado
ndash Por cento
microL ndash Microlitro
microm ndash Microcircmetros
microms ndash Microcircmetros por segundo
2-AGndash 2-araquidonoil glicerol
IacuteNDICE DE FIGURAS
Figura 1 ndash Fatores envolvidos no estabelecimento da microbiota humana ao longo da
vida 37
Figura 2 ndash Interaccedilatildeo funcional entre a microbiota intestinal humana e o sistema
imunoloacutegico 42
Figura 3 ndash Doenccedilas influenciadas pelo metabolismo microbiano
intestinal46
Figura 4 ndash Crescimento de M hominis em meio SP4 com a produccedilatildeo de colocircnia em
forma de ldquoovo fritordquo (aumento 40X) 55
Figura 5 ndash Comparaccedilatildeo entre as meacutedias de consumo de macronutrientes dos Grupos
Caso e Controle com a Faixa de Distribuiccedilatildeo Aceitaacutevel de macronutrientes (AMDRDRI)
e AI (Adequate Intake) para a faixa etaacuteria de 20 a 70 anos Satildeo Paulo SP 2013-
201484
Figura 6 ndash Comparaccedilatildeo entre as meacutedias de consumo das Vitaminas A C E e folato
dos Grupos Caso e Controle com a Faixa de Distribuiccedilatildeo Aceitaacutevel de macronutrientes
(AMDRDRI) e AI (Adequate Intake) para a faixa etaacuteria de 20 a 70 anos Satildeo Paulo
SP 2013-201485
Figura 7 ndash Comparaccedilatildeo entre as meacutedias de consumo das Vitaminas B1 B2 B6 B12
D Niacina e Aacutecido pantotecircnico dos Grupos Caso e Controle com a Faixa de
Distribuiccedilatildeo Aceitaacutevel de macronutrientes (AMDRDRI)e AI (Adequate Intake) para a
faixa etaacuteria de 20 a 70 anos Satildeo Paulo SP 2013-201486
Figura 8 ndash Comparaccedilatildeo entre as meacutedias de consumo de Sais Minerais dos Grupos
Caso e Controle com a Faixa de Distribuiccedilatildeo Aceitaacutevel de macronutrientes
(AMDRDRI)e AI (Adequate Intake) para a faixa etaacuteria de 20 a 70 anos Satildeo Paulo SP
2013-2014 87
Figura 9 ndash Comparaccedilatildeo entre as meacutedias de consumo de Sais Minerais e outros
nutrientes dos Grupos Caso e Controle com a Faixa de Distribuiccedilatildeo Aceitaacutevel de
macronutrientes (AMDRDRI)e AI (Adequate Intake) para a faixa etaacuteria de 20 a 70
anos Satildeo Paulo SP 2013-2014 87
Figura 10ndash Curva-padratildeo gerada a partir dos pontos de Ct obtidos com o graacutefico de
amplificaccedilatildeo de diluiccedilotildees seriadas do controle positivo Mycoplasma hominis calculado
pelo software StepOne 21 (Applied Biosystems Life Technologies Corporation) Satildeo
Paulo SP 2013-201490
Figura 11 ndash Quantificaccedilatildeo por qPCR de Mollicutes (UFCmicrol) a partir das amostras de
fezes nos grupos caso e controle Satildeo Paulo SP 2013-2014 92
Figura 12 ndash Quantificaccedilatildeo por qPCR de Firmicutes Bacteroidetes e Eubacterias
(UFCmicrol) a partir das amostras de fezes nos grupos caso e controle Satildeo Paulo SP
2013-201493
Figura 13 ndash Quantificaccedilatildeo de IL-1β IL-10 IL17-A e TNF-α (pgmL) no plasma
sanguiacuteneo por meio do ELISA nos grupos caso e controle da populaccedilatildeo estudada
Satildeo Paulo SP 2013-201496
IacuteNDICE DE QUADROS
Quadro 1 ndash Criteacuterios utilizados na estimativa da frequecircncia diaacuteria de consumo dos
alimentos incluiacutedos no Questionaacuterio de Frequecircncia Alimentar 61
Quadro 2 ndash Sequecircncias dos iniciadores utilizados para amplificaccedilatildeo do gene 16S rRNA
para Mollicutes 66
Quadro 3 ndash Sequecircncias dos iniciadores utilizados para amplificaccedilatildeo do gene 16S rRNA
para Firmicutes Bacteroidetes e Bacteacuterias Totais69
IacuteNDICE DE TABELAS
Tabela 1 ndash Determinaccedilatildeo do perfil da populaccedilatildeo estudada referente agrave Seccedilatildeo 1 Dados
socioeconocircmicos Satildeo Paulo SP 2013-201472
Tabela 2 ndash Determinaccedilatildeo do perfil da populaccedilatildeo estudada referente agrave Seccedilatildeo 2 Histoacuteria
Familiar Satildeo Paulo SP 2013-201472
Tabela 3 ndash Determinaccedilatildeo do perfil da populaccedilatildeo estudada referente agrave Seccedilatildeo 3 Histoacuteria
Cliacutenica Satildeo Paulo SP 2013-2014 73
Tabela 4 ndash Determinaccedilatildeo do perfil da populaccedilatildeo estudada referente agrave Seccedilatildeo 4 Histoacuteria
Obsteacutetrica Satildeo Paulo SP 2013-2014 74
Tabela 5 ndash Determinaccedilatildeo do perfil da populaccedilatildeo estudada referente agrave Seccedilatildeo 5 Histoacuteria
Ginecoloacutegica Satildeo Paulo SP 2013-2014 75
Tabela 6 ndash Determinaccedilatildeo do perfil da populaccedilatildeo estudada referente agrave Seccedilatildeo 6
Consumo atual de tabaco Satildeo Paulo SP 2013-2014 75
Tabela 7ndash Determinaccedilatildeo do perfil da populaccedilatildeo estudada referente agrave Seccedilatildeo 7
Consumo atual de aacutelcool Satildeo Paulo SP 2013-2014 76
Tabela 8 ndash Tabela de determinaccedilatildeo do perfil da populaccedilatildeo estudada referente agrave Seccedilatildeo
8 Atividade Fiacutesica (IPAQ versatildeo curta) Satildeo Paulo SP 2013-2014 76
Tabela 9 ndash Tabela de determinaccedilatildeo do perfil da populaccedilatildeo estudada referente agrave Seccedilatildeo
9 Mudanccedilas recentes nos haacutebitos alimentares Satildeo Paulo SP 2013-2014 77
Tabela 10 ndash Participaccedilatildeo dos alimentos nos grupos meacutedias de consumo por dia dos
alimentos consumidos pela populaccedilatildeo estudada Satildeo Paulo SP 2013-2014 144
Tabela 11 ndash Definiccedilatildeo dos grupos alimentares derivados do Questionaacuterio de Frequecircncia
Alimentar (QFA) e percentual de consumo da populaccedilatildeo estudada Satildeo Paulo SP
2013-201479
Tabela 12 ndash Anaacutelise de consumo de energia e nutrientes da populaccedilatildeo estudada Satildeo
Paulo SP 2013-2014 81
Tabela 13 ndash Comparaccedilatildeo das variaacuteveis dieteacuteticas relacionadas agraves razotildees de ingestatildeo e
Valor Energeacutetico Total (VET) da populaccedilatildeo estudada Satildeo Paulo SP 2013-2014 83
Tabela 14 ndash Comparaccedilatildeo de variaacuteveis antropomeacutetricas da populaccedilatildeo estudada 89
Tabela 15 ndash Repetibilidade intra-ensaio e inter-ensaio da qPCR para Mollicutes Satildeo
Paulo SP 2013-2014 91
Tabela 16 ndash Comparaccedilatildeo entre os resultados obtidos no teste de sensibilidade pelas
teacutecnicas de PCR convencional e qPCR para detecccedilatildeo de Mollicutes Satildeo Paulo SP
2013-201491
Tabela 17 ndash Nuacutemero meacutedio de coacutepias e percentual dos grupos Mollicutes estudados
frente ao Filo Firmicutes na populaccedilatildeo estudada Satildeo Paulo SP 2013-2014 94
Tabela 18 ndash Nuacutemero meacutedio de coacutepias e percentual dos grupos de bacterianos
estudados frente agraves bacteacuterias totais na populaccedilatildeo estudada Satildeo Paulo SP 2013-
201495
Tabela 19 ndash Proporccedilatildeo de Firmicutes em relaccedilatildeo agrave Bacteroidetes na populaccedilatildeo
estudada Satildeo Paulo SP 2013-201495
SUMAacuteRIO
1 INTRODUCcedilAtildeO 26
2 REFERENCIAL TEOacuteRICO 29
21 Obesidade 29
22 Microbiota Intestinal 31
221 Microbiota intestinal uma peccedila chave na sauacutede e na doenccedila31
222 Colonizaccedilatildeo e composiccedilatildeo da microbiota intestinal32
223 Fatores que influenciam a composiccedilatildeo da microbiota intestinal 34
2231 Fases da vida 34
2232 Tipo de parto 34
2233 Tipo de aleitamento 35
2234 Uso de antibioacutetico 35
2235 Dieta 36
224 Microbiota intestinal e a fisiologia do hospedeiro 38
2241 Nutriccedilatildeo e Metabolismo 38
2242 Proteccedilatildeo 39
22421 Competiccedilatildeo direta de nutrientes 39
22422 Imunomodulaccedilatildeo 40
2243 Funccedilatildeo Troacutefica 43
2244 Regulaccedilatildeo da adiposidade 43
225 Microbiota intestinal e disbiose44
226 Microbiota Intestinal e obesidade47
227 Mecanismos pelos quais a microbiota intestinal contribui para a obesidade49
2271 Extraccedilatildeo de energia adicional da dieta49
2272 Induccedilatildeo da inflamaccedilatildeo por meio da alteraccedilatildeo da permeabilidade intestinal51
23 MOLLICUTES 52
231 Caracteriacutesticas Gerais dos Mollicutes52
232 Mollicutes Microbiota Intestinal e Obesidade56
3 OBJETIVOS 58
31 Objetivo geral 58
32 Objetivos especiacuteficos 58
4 MATERIAL E MEacuteTODOS 59
41 Protocolo do estudo 59
42 Casuiacutestica 59
43 Delineamento experimental 60
44 Determinaccedilatildeo do estado nutricional 60
441 Avaliaccedilatildeo qualitativa do consumo alimentar 60
442 Avaliaccedilatildeo antropomeacutetrica do estado nutricional 62
4421 Anaacutelise da Composiccedilatildeo Corporal pelo Meacutetodo de Bioimpedacircncia 63
45 Coleta das amostras cliacutenicas 64
46 Determinaccedilatildeo da microbiota intestinal 65
461 Padronizaccedilatildeo de reaccedilatildeo de PCR quantitativo (qPCR) por meio de TaqMan para a detecccedilatildeo de
Mollicutes 65
4611 Cepas bacterianas e condiccedilotildees de cultura 65
4612 Desenvolvimento de primers e sonda para a detecccedilatildeo de Mollicutes pela PCR quantitativa 65
4613 PCR quantitativa 66
4614 Especificidade da qPCR e repetibilidade intra e inter-ensaios 67
462 Reaccedilatildeo em cadeia da polimerase (PCR) convencional 68
463 Detecccedilatildeo de micro-organismos dos filos Firmicutes e Bacteroidetes e bacteacuterias totais (Eubacterias)
por PCR em tempo Real (qPCR) 68
47 Dosagem de citocinas do soro sanguiacuteneo 69
48 Anaacutelises Estatiacutesticas 70
5 RESULTADOS 71
51 Perfil da populaccedilatildeo estudada 71
52 Determinaccedilatildeo do estado nutricional 78
521 Avaliaccedilatildeo qualitativa do consumo alimentar 78
522 Avaliaccedilatildeo antropomeacutetrica do estado nutricional 88
53 Determinaccedilatildeo da microbiota intestinal 90
531 Padronizaccedilatildeo de reaccedilatildeo de PCR quantitativo (qPCR) por meio de TaqMan para a detecccedilatildeo de
Mollicutes 90
532 Detecccedilatildeo de micro-organismos dos filos Firmicutes e Bacteroidetes aleacutem de bacteacuterias totais
(Eubacterias) por PCR em tempo Real (qPCR) 93
54 Dosagem de citocinas do soro sanguiacuteneo 96
6 DISCUSSAtildeO 97
7 CONCLUSOtildeES 107
REFEREcircNCIAS 108
APEcircNDICE A ndash TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO 127
APEcircNDICE B ndash QUESTIONAacuteRIO 131
APEcircNDICE C- TABELA 10 143
26
1 INTRODUCcedilAtildeO
A obesidade eacute definida pela Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede (WHO 2002)
como o excesso de gordura corporal acumulada no tecido adiposo com implicaccedilotildees
para a sauacutede Algumas estimativas globais recentes indicam que em 2013 mais de
600 milhotildees da populaccedilatildeo mundial adulta (com 18 anos ou mais) eram obesos com
11 dos homens e 15 das mulheres (MARIE 2014) No Brasil em 2014 estimou-
se que na populaccedilatildeo adulta (20 anos ou mais) 105 milhotildees satildeo obesos com 124
dos homens e 169 das mulheres (IBGE 2014) Nesse contexto atualmente a
obesidade estaacute entre os maiores problemas de sauacutede puacuteblica e distuacuterbio da nutriccedilatildeo
A obesidade eacute considerada atualmente uma epidemia (BACON APHRAMOR 2011
OLSHANSKY et al 2005) As alteraccedilotildees nos padrotildees dieteacuteticos e nutricionais da
populaccedilatildeo brasileira tecircm sido analisadas no processo da transiccedilatildeo nutricional (KAC
VELAacuteSQUEZ-MELEacuteNDEZ 2003)
Neste processo verificou-se que ocorreu inversatildeo nos padrotildees de distribuiccedilatildeo
das alteraccedilotildees nutricionais A alta incidecircncia de sobrepeso e obesidade na
populaccedilatildeo implica no aumento da ocorrecircncia de doenccedilas cardiovasculares cacircncer
diabetes mellitus e hipertensatildeo arterial (AMUNA ZOTOR 2008 ARAI et al 2009
DUNCAN et al 1993 GIGANTE et al 1997 JIRTLE SKINNER 2007 KAC
VELAacuteSQUEZ-MELEacuteNDEZ 2003 LESSA 1998 MONDINI MONTEIRO 1998
POPKIN et al 2006) Na obesidade ocorre basicamente o balanccedilo energeacutetico
positivo cuja patogecircnese natildeo estaacute completamente elucidada estando associada a
fatores comportamentais culturais e bioloacutegicos A regulaccedilatildeo do balanccedilo energeacutetico e
do estoque de energia corporal satildeo influenciados pela susceptibilidade individual e
seu contexto social e econocircmico demograacutefico cultural educacional ambiental e
familiar aleacutem de fatores hormonais e de heranccedila geneacutetica (GORAN 2000 VEIGA
SICHIERI 2006)
O mapa gecircnico da obesidade humana estaacute constantemente em mudanccedila pela
identificaccedilatildeo de novos genes e regiotildees cromossocircmicas associadas com a
obesidade As alteraccedilotildees do comportamento alimentar e os haacutebitos sedentaacuterios
indicam ser os principais fatores de interferecircncia nos genes de susceptibilidade a
obesidade e consequentemente no aumento da obesidade mundial Eacute provaacutevel
27
portanto que a obesidade ocorra como a resultante de fatores poligecircnicos
complexos e um ambiente obesogecircnico (dieta e sedentarismo) (BAJZER SEELEY
2006 BOUCHARD 2000 CANI et al 2007 DERAM VILLARES 2009 DUNCAN et
al 2008 TURNBAUGH et al 2009)
A captaccedilatildeo de energia pode justificar em parte o metabolismo de alguns
pacientes obesos que natildeo apresentam ingestatildeo alimentar excessiva sugerindo que
a microbiota intestinal pode predispor o indiviacuteduo agrave obesidade (BACKHED 2004)
Alguns estudos tecircm demonstrado que o desenvolvimento da obesidade em
humanos pode ser determinado pelas proporccedilotildees relativas de dois filos principais de
bacteacuterias da microbiota intestinal humana Bacteroidetes e Firmicutes que diferem
consideravelmente entre indiviacuteduos eutroacuteficos e obesos (DUNCAN et al 2008 LEY
et al 2005 2006 TENNYSON FRIEDMAN 2008) Estudos comparativos
mostraram que ratos obesos possuem significativamente niacuteveis mais baixos de
micro-organismos do Filo Bacteroidetes e niacuteveis mais elevados de Firmicutes Este
uacuteltimo estaacute associado com um aumento de absorccedilatildeo de energia da dieta
(BACKHED 2004 CANI DELZENNE 2009 DIBAISE et al 2012 LEY et al 2005
RAOULT 2008 TURNBAUGH et al 2006) Turnbaugh et al (2008) obtiveram
resultados semelhantes em ratos com obesidade induzida por dieta Curiosamente
embora as alteraccedilotildees nos niacuteveis de Firmicutes e Bacteroidetes foram observadas
nos camundongos obesos por dieta induzida a diferenccedila foi relacionada
principalmente as bacteacuterias da classe dos Mollicutes
As espeacutecies do Filo Bacteriodetes pertencem agrave microbiota intestinal humana e
animal Estas bacteacuterias satildeo bacilos ou cocobacilos gram-negativos anaeroacutebios
obrigatoacuterios heterotroacuteficos mesoacutefilos sacaroliacuteticos natildeo formadores de esporos
imoacuteveis Satildeo resistentes agrave bile natildeo produzem pigmentos Tecircm como principais
produtos finais do metabolismo da glicose os aacutecidos succiacutenico e aceacutetico
(JOHANSSON PETTERSON 2002 MANILOFF 2002) O Filo Firmicutes
encontrado em maior proporccedilatildeo no trato gastrintestinal humano satildeo micro-
organismos Gram positivos na maioria Na classificaccedilatildeo atual o filo divide-se
tipicamente em trecircs classes Bacilli - aeroacutebios facultativos ou obrigatoacuterios Clostridia -
organismos anaeroacutebios e Erysipelotrichia Mollicutes eacute a uacutenica classe do filo
Tenericutes anteriormente classificada dentro do filo Firmicutes (BERGEYrsquos 2009
2010 LUDWIG KLENK 2001 RAZIN et al 1998)
28
Os estudos das interaccedilotildees de Bacteroidetes e Firmicutes na microbiota
intestinal e sua associaccedilatildeo com a obesidade tecircm aumentado No entanto a
participaccedilatildeo dos Mollicutes eacute praticamente desconhecida O gecircnero Mycoplasma foi
introduzido em 1929 para designar micro-organismos atualmente classificados
como membros da famiacutelia Mycoplasmataceae ordem Mycoplasmatales da classe
dos Mollicutes (Mollis = mole cuacutetis = pele) (RAZIN 1992) Os Mollicutes possuem
um genoma pequeno sendo que algumas espeacutecies apresentam o menor genoma
entre os procariotos e em consequecircncia apresentam metabolismo reduzido
(MILES NICHOLAS 1998 NEIMARK 1986 RAZIN TULLY 1983) Distinguem-se
de outros procariotos pela simplicidade celular genoma e metabolismo reduzido A
ausecircncia natural da parede celular confere resistecircncia aos antibioacuteticos beta-
lactamicos Incluem-se as sulfas e rimfapicina respectivamente pela ausecircncia da
siacutentese de aacutecido foacutelico e possuir uma polimerase diferente Com aproximadamente
200 espeacutecies estes micro-organismos infectam humanos animais insetos e
plantas Considerados em geral como oportunistas por excelecircncia colonizam
ldquopreferencialmenterdquo a superfiacutecie de mucosas de mamiacuteferos mas tecircm potencial de
causar infecccedilotildees sistecircmicas dependendo do hospedeiro (DYBVIG 1990 RAZIN
YOGEV NAOT 1998)
29
2 REFERENCIAL TEOacuteRICO
21 Obesidade
A prevalecircncia da obesidade tem crescido rapidamente e representa um dos
principais desafios de sauacutede puacuteblica neste seacuteculo A Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede
(OMS) estima que pelo menos 28 milhotildees de pessoas morrem em decorrecircncia da
obesidade (IMC ge 30 kgm2) A prevalecircncia mundial quase duplicou entre 1980 e
2008 com uma transiccedilatildeo de 5 dos homens e 8 das mulheres em 1980 para
10 dos homens e 14 das mulheres (WHO 2014) A obesidade pode ser definida
como o grau de armazenamento de gordura no organismo associada ao ganho
excessivo de peso corporal total Eacute portanto considerada uma doenccedila crocircnica
podendo acarretar em consequecircncias para a sauacutede devido agraves suas relaccedilotildees com
diversas complicaccedilotildees metaboacutelicas (MS 2006)
A pesquisa dos Orccedilamentos Familiares (POF IBGE 2010) nos uacuteltimos seis
anos indicou que a frequecircncia de pessoas com excesso de peso aumentou em mais
de um ponto percentual ao ano Desta maneira em dez anos o excesso de peso
poderia alcanccedilar dois terccedilos da populaccedilatildeo adulta do Brasil magnitude idecircntica agrave
encontrada na populaccedilatildeo dos Estados Unidos Estimativas de inqueacuteritos nacionais e
internacionais das uacuteltimas deacutecadas indicam que a obesidade em 2025 alcance 40
da populaccedilatildeo nos EUA 30 na Inglaterra e 20 no Brasil (HU 2008)
O excesso de peso e a obesidade na populaccedilatildeo expressam essencialmente
o desequiliacutebrio entre ingestatildeo e utilizaccedilatildeo de calorias A justificativa estaacute na
mudanccedila dos padrotildees de alimentaccedilatildeo e de atividade fiacutesica Em 2002-2003 revelou-
se tendecircncia crescente de substituiccedilatildeo de alimentos baacutesicos e tradicionais na dieta
brasileira (como arroz feijatildeo e hortaliccedilas) por bebidas e alimentos industrializados
(como refrigerantes biscoitos carnes processadas e comida pronta) Caracteriza-se
portanto o aumento na densidade energeacutetica das refeiccedilotildees e padrotildees de
alimentaccedilatildeo capazes de comprometer a auto-regulaccedilatildeo do balanccedilo energeacutetico dos
indiviacuteduos e aumentar o risco de obesidade (LEVY-COSTA et al 2005)
Aleacutem disto em consequecircncia agrave obesidade tem sido observado aumento
consideraacutevel da prevalecircncia de doenccedilas crocircnicas natildeo transmissiacuteveis como doenccedilas
cardiovasculares cacircncer diabetes mellitus e hipertensatildeo arterial Pelo longo tempo
30
de evoluccedilatildeo destas doenccedilas ocorrem lesotildees irreversiacuteveis de intensidade variada
resultando no aumento de incapacidade ou oacutebito vecircm ocupando um maior espaccedilo
no perfil de morbimortalidade de populaccedilotildees latino americanas (DUNCAN et al 1993
LESSA 1998) Em importante estudo entre 1958 e 1951 envolvendo cinco mil
indiviacuteduos de 35 a 75 anos por periacuteodo de ateacute 44 anos a obesidade (IMC gt 30Kgm2)
foi independentemente associada ao maior risco para hipertensatildeo (mulheres
RR=26 IC95 22-31) diabetes tipo 2 (mulheres RR=14 IC95 1-18) e doenccedila
cardiovascular mulheres RR=14 IC95 11-17) (WILSON et al 2002) Os ganhos
na diminuiccedilatildeo das taxas de tabagismo ao longo do seacuteculo XX e as expectativas no
aumento de tempo de vida podem ser neutralizadas pelas prespectivas do aumento
da obesidade (STEWART et al 2009) Especialmente em paiacuteses em
desenvolvimento como o Brasil o custo anual para o Sistema Uacutenico de Sauacutede para
atender as doenccedilas relacionadas ao sobrepeso eacute estimado em US$ 20152102171
(BAHIA et al 2012)
O ganho de peso ocorre pela menor utilizaccedilatildeo de gordura como fonte de
energia do que oxidar carboidratos elevando o coeficiente respiratoacuterio obtido
atraveacutes da razatildeo entre a produccedilatildeo de gaacutes carbocircnico resultante da oxidaccedilatildeo de
carboidratos e o consumo de oxigecircnio determinado atraveacutes de calorimetria (MARRA
et al 2004) Seis lesotildees monogecircnicas principais produzem desordens endoacutecrinas
que resultam na obesidade Deficiecircncia congecircnita de Leptina defeitos no receptor
de Leptina deficiecircncia no proacute-hormocircnio convertase 1(PC1) deficiecircncia em proacute-oacutepio-
melanocortina (POMC) defeitos no receptor da Melanocortina 4 (MC4R) e defeitos
no Receptor Ativado por Proliferadores de Peroxissoma (PPAR) O controle da
ingestatildeo alimentar a curto prazo eacute controlado principalmente por vias de
sinalizaccedilatildeo que emanam do trato gastrintestinal incluindo o peptiacutedeo orexiacutegenico
grelina que ativa os sinais de fome e os peptiacutedeos anorexigecircnicos
colecistoquinina (CCK) peptiacutedeo similar ao glucagon 1- glucagon-like peptide 1
(GLP-1) e peptiacutedeo tirosina-tirosina (PYY) que geram sinais de saciedade Para o
controle da ingestatildeo agrave longo prazo parecem ser primordiais os sinais que emanam a
partir do tecido adiposo (leptina) e pacircncreas (insulina) liberados em resposta agrave
ingestatildeo de alimentos e depoacutesitos de gordura corporal (KONTUREK et al 2004)
Tem sido amplamente documentado na literatura o reganho de peso
sucessivo agraves dietas pois sabe-se que cerca de um a dois terccedilos do peso perdido
31
tendem a ser recuperados no ano seguinte sendo a recuperaccedilatildeo quase total ao final
de cinco anos (GOODRICK et al 1996) A partir disso tem sido questionado o
efeito das dietas restritivas sobre a biologia humana e sua contribuiccedilatildeo para tornar a
obesidade uma condiccedilatildeo que possivelmente se autoperpetua e se agrava de
maneira progressiva Diversos trabalhos mostram que a ciclagem de peso (ou efeito
sanfona) pode aumentar a suscetibilidade para o ganho de massa corporal no
futuro (KORKEILA et al1999 NEUMARK-SZTAINER et al 2006 2007)
22 Microbiota Intestinal
221 Microbiota intestinal uma peccedila chave na sauacutede e na doenccedila
Nas deacutecadas passadas acreditava-se que todos os micro-organismos da
microbiota possuiacuteam potencial de causar infecccedilotildees O estudo da interaccedilatildeo entre
micro-organismos e o desenvolvimento de enfermidades eacute um tema crescente na
justificativa de certas doenccedilas (DETHLEFSEN et al 2007) O termo microbiota
refere-se ao conjunto de micro-organismos no hospedeiro sadio e o termo
microbioma eacute o conjunto de genes microbianos (BACKHED 2004 LANGA 2006
VRIEZE 2010) O estudo da diversidade e distribuiccedilatildeo da microbiota e sua interaccedilatildeo
com hospedeiro tem contribuiacutedo na justificativa de algumas doenccedilas (LEY et al
2008 VENTURA et al 2008) A microbiota do trato gastrintestinal humano eacute o
ecossistema mais complexo constituiacutedo por diversas espeacutecies de micro-organismos
As bacteacuterias constituem o grupo com maior diversidade e abundacircncia Assim como o
genoma de cada indiviacuteduo eacute uma impressatildeo digital a composiccedilatildeo da microbiota
intestinal tambeacutem parece ser (LEY et al 2006 RAJILIĆ-STOJANOVIĆ SMIDT DE
VOS 2007 XU GORDON 2003)
O comensalismo e a simbiose bacteriana refletem uma ldquocorrida dinacircmicardquo
que se inicia no encontro da bacteacuteria com o hospedeiro vulneraacutevel e prossegue com
respostas adaptativas entre os dois organismos Em alguns casos a coevoluccedilatildeo
atenua a virulecircncia e conduz a uma coexistecircncia paciacutefica com ou sem franca
codependecircncia Em outras circunstacircncias a relaccedilatildeo patogecircnica eacute mantida por meio
da superaccedilatildeo dos mecanismos de defesas inatas ou adaptativas do hospedeiro
pelas bacteacuterias (GORDON HOOPER 2001) Estima-se que a microbiota intestinal eacute
composta por mais de 1000 espeacutecies bacterianas O nuacutemero de ceacutelulas microbianas
32
no luacutemen intestinal eacute de 10 vezes maior que as ceacutelulas eucarioacuteticas do organismo
representando em torno de 1 kg de peso corporal (SCARPELLINI 2010) Aleacutem
disso o microbioma eacute 100 vezes maior que o genoma humano podendo-se assim
considerar a microbiota intestinal como um oacutergatildeo virtual exteriorizado
metabolicamente adaptaacutevel e flexiacutevel aleacutem de rapidamente renovaacutevel o que
contribui para metabolismo e desempenha importante papel na obtenccedilatildeo de energia
da dieta (FRANCcedilOIS-PIERRE 2009)
A microbiota intestinal eacute crucial para a vida humana com impacto na fisiologia
e na nutriccedilatildeo do hospedeiro (HATTORI TAYLOR 2008) Considera-se que
humanos satildeo ldquosuperorganismosrdquo com metabolismo mediado pelos atributos
humanos e microbianos (GILL et al 2006) O conceito de ldquosuperorganismordquo
representa importante mudanccedila de paradigma no entendimento da biologia humana
e pode ter impacto expressivo na prevenccedilatildeo e na terapia de doenccedilas no futuro
(NICHOLSON 2006)
222 Colonizaccedilatildeo e composiccedilatildeo da microbiota intestinal
O trato gastrintestinal fetal eacute considerado praticamente esteacuteril No nascimento
eacute rapidamente colonizado por micro-organismos da matildee e do ambiente hospitalar
(PALMER et al 2007) Sugere-se que de trecircs a quatro semanas apoacutes o nascimento
a microbiota intestinal comeccedila a se estabilizar aumentando gradualmente a sua
complexidade Apoacutes um ano assemelha-se agrave microbiota de um adulto (MACKIE et
al 1999 PALMER et al 2007 SCHEacuteLE et al 2013) Contrapondo-se agrave percepccedilatildeo
da ausecircncia de micro-organismos no feto demonstrou-se a presenccedila de DNA
bacteriano na placenta e no cordatildeo umbilical (JIMEacuteNEZ et al 2005 SATOKARI et
al 2009) Aleacutem disso a identificaccedilatildeo de algumas bacteacuterias no mecocircnio explica a
origem dos primeiros micro-organismos colonizadores do intestino antes mesmo do
nascimento possivelmente como um mecanismo adaptativo para o desenvolvimento
do intestino fetal fora do organismo materno (JIMEacuteNEZ et al 2008)
Os micro-organismos presentes no trato gastrintestinal podem ser autoacutectones
ou aloacutectones Linhagens autoacutectones tecircm longa associaccedilatildeo com o hospedeiro e
formam uma populaccedilatildeo estaacutevel de tamanho caracteriacutestico em uma regiatildeo do
intestino Os organismos aloacutectones satildeo adquiridos principalmente atraveacutes dos
alimentos ingeridos e do ecossistema oral Eacute difiacutecil determinar se um organismo eacute
33
um autoacutectone verdadeiro Contudo as bacteacuterias aloacutectones natildeo persistem no
ecossistema e satildeo detectaacuteveis apenas por um periacuteodo limitado (GORDON
HOOPER 2001 LEY et al 2006 WALTER 2008)
Os micro-organismos satildeo encontrados em todo o trato gastrintestinal no
entanto as mudanccedilas nas condiccedilotildees fisioloacutegicas implicam diferenccedilas na
composiccedilatildeo de micro-organismos nos diversos locais No trato gastrintestinal
inferior o fluxo do conteuacutedo torna-se mais lento e o ambiente conteacutem menos
substacircncias antimicrobianas favorecendo a colonizaccedilatildeo microbiana e o
estabelecimento de maior densidade de micro-organismos (QIN et al 2010
ZOETENDAL et al 2006) A partir da cavidade oral ao acircnus tem sido observado o
aumento da densidade microbiana no jejuno iacuteleo e no intestino grosso em
comparaccedilatildeo com o estocircmago e duodeno O coacutelon refere-se a um ecossistema
complexo com ampla diversidade microbiana e presenccedila de diversos gecircneros
bacterianos O pH neutro e a abundacircncia relativa de nutrientes como os
carboidratos natildeo digeriacuteveis e outros componentes alimentares que escapam do
processo digestivo tornam o coacutelon um ambiente favoraacutevel agrave proliferaccedilatildeo microbiana
O coacutelon eacute a regiatildeo do TGI que apresenta maior densidade microbiana podendo
alcanccedilar 1014UFCg-1 Dados tem mostrado que cada indiviacuteduo carrega mais de
1000 filotipos que representam mais de 7000 linhagens (AZAD et al 2013
ECKBURG et al 2005 FRANK et al 2007 HOLZAPFEL 2006 KLEEREBEZEM
VAUGHAN 2009 LEY et al 2008 QUIGLEY 2013 ZOETENDAL et al 2006)
Aproximadamente 99 dos genes identificados por metagenoma do intestino
humano satildeo bacterianos Na maioria dos indiviacuteduos cerca de 90 dos filos satildeo
Firmicutes e Bacteroidetes seguidos por Actinobacterias (famiacutelia Bifidobacteriaceae)
e Proteobacterias (famiacutelia Enterobacteriaceae) O filo mais abundante refere-se ao
Firmicutes apresentando como principais integrantes as classes Bacilli Clostridia e
Molicutes e dos Bacteroidetes as classes Bacteroides Flavobacteria e
Sphingobacterias Os filos Actinobacterias e Proteobacterias se apresentam em
menor proporccedilatildeo (ARUMUGAM et al 2011 DE FILIPPO et al 2010
HUTTENHOWER et al 2012 QIN et al 2010 QUIGLEY 2013 VILLANUEVA-
MILLAacuteN et al 2015 VRIEZE 2010 ZOETENDAL et al 2006)
34
223 Fatores que influenciam a composiccedilatildeo da microbiota intestinal
A microbiota do TGI humano eacute uma comunidade complexa cuja composiccedilatildeo
eacute inconstante diferindo inter e intra-individualmente definida por uma seacuterie de
fatores como geneacutetica do hospedeiro alimentaccedilatildeo sucessatildeo bacteriana funccedilatildeo
imune e estado de sauacutede (LEY et al 2008 EVERARD et al 2011 2014)
2231 Fases da vida
A diversidade bacteriana no intestino infantil eacute inicialmente muito baixa ateacute os
dois anos ao contraacuterio da microbiota de adulto (GAREAU et al 2010 HAJELA et al
2015) A baixa diversidade de bacteacuterias na primeira infacircncia inibe a maturaccedilatildeo
regular da microbiota intestinal e maturaccedilatildeo tardia da mucosa do sistema
imunoloacutegico implicando em riscos do aumento da resposta imune assim como
doenccedilas aleacutergicas Neste contexto envolve o desenvolvimento da toleracircncia oral e a
susceptibilidade da crianccedila a alergias e inflamaccedilatildeo A microbiota sofre portanto
mudanccedilas substanciais nos extremos da vida essas ramificaccedilotildees ainda estatildeo sendo
exploradas (AURELI et al 2011 HAJELA et al 2015 SHERIDAN et al 2014
SMITH et al 2013)
2232 Tipo de parto
A microbiota maternal eacute uma fonte de micro-organismos para a colonizaccedilatildeo do
TGI do receacutem-nascido As bacteacuterias residentes no canal vaginal e na regiatildeo perineal
tambeacutem ganham acesso ao TGI de receacutem-nascidos (BRY et al 1996 MACKIE et
al 1999) Ocorrem diferenccedilas entre o microbioma de um bebecirc receacutem-nascido por
parto normal em comparaccedilatildeo ao bebecirc receacutem-nascido por parto cesaacuterea No parto
vaginal o bebecirc eacute colonizado por bacteacuterias vaginais e fecais maternas cujas
composiccedilatildeo microbiana reflete a microbiota intestinal materna composta
predominantemente pelos gecircneros Lactobacillus Prevotella Atopobium e Sneathia
As amostras fecais de bebecircs nascidos de parto cesariana apresentaram gecircneros
tiacutepicos de microbiota da pele e do ambiente hospitalar predominantemente
Staphylococcus e C difficile Estes bebecircs tambeacutem apresentaram niacuteveis
significativamente mais baixos de Bifidobacterium e diversidade bacteriana menor do
que os bebecircs nascidos por parto normal Estas diferenccedilas podem justificar o
aumento do risco de doenccedilas especiacuteficas em bebecircs receacutem-nascidos por parto
35
cesariana agrave longo prazo (AZAD et al 2013 BELLO et al 2010 COLLADO et al
2012 DOMINGUEZ- PENDERS et al 2006 PRINCE et al 2014)
As diferenccedilas no processo de colonizaccedilatildeo intestinal decorrentes do tipo de
parto poderiam refletir-se no desenvolvimento do sistema imunoloacutegico visto que os
micro-organismos gastrintestinais influenciam esse processo por meio do envio de
importantes sinais regulatoacuterios necessaacuterios para o desenvolvimento da adequada
toleracircncia ao ambiente (BIASUCCI et al 2008 CARDWELL et al 2008
DOMINGUEZ-BELLO et al 2010 KOENIG et al 2011 MORELLI et al 2008
RENZ-POLSTER et al 2005)
2233 Tipo de aleitamento
O leite materno humano eacute considerado um dos principais fatores da iniciaccedilatildeo e
no desenvolvimento da microbiota do neonato uma vez que conteacutem substratos
(prebioacuteticos) para estimular o crescimento bacteriano e tambeacutem eacute fonte de micro-
organismos Estima-se que o consumo de 800 ml de leite materno por dia
proporcione 1 x 105 a 1 x 107 micro-organismos comensais durante a amamentaccedilatildeo
(MARTIN et al 2004) Desta maneira a contagem de Bifidobacterium aumenta
drasticamente Lactobacillus e Bacteroides aumentam em menor proporccedilatildeo e
enterobacteacuterias e enterococos diminuem Espeacutecies de Bifidobacterium
correspondem de 80 a 90 do total dos componentes da microbiota fecal infantil
presentes em bebecircs amamentados por leite materno Jaacute em receacutem-nascidos
alimentados com foacutermulas infantis a microbiota tem demonstrado ser muito mais
complexa sendo composta por Bifidobacterium Bacteroides Clostridium e
Streptococcus (ADLERBERTH WOLD 2009 CUMMINS THOMPSON 1997 DE
SANTA BARBARA et al 2003 DONOVAN ODIE 1994 DONOVAN 2006 MACKIE
et al 1999 MARQUES et al 2010 MCCRACKEN LORENZ 2001 PALMER
2011 POROYKO et al 2010)
2234 Uso de antibioacutetico
A eventual antibioticoterapia interfere tambeacutem no equiliacutebrio da microbiota A
disbiose (alteraccedilatildeo da microbiota) depende de fatores como espectro de accedilatildeo da
droga idade e dieta do indiviacuteduo dosagem e duraccedilatildeo do tratamento via de
administraccedilatildeo propriedades farmacocineacuteticas e farmacodinacircmicas aleacutem de grau de
36
resistecircncia da comunidade (LEY 2000 SULLIVAN et al 2001) A seleccedilatildeo de
bacteacuterias resistentes a drogas pela antibioticoterapia eacute um problema mundial Os
genes de resistecircncia passam para diversos gecircneros bacterianos no intestino A
aquisiccedilatildeo de genes de resistecircncia confere benefiacutecios a determinada espeacutecie
bacteriana diante da pressatildeo seletiva exercida pelo antibioacutetico Quando essa
pressatildeo seletiva eacute suspensa a cepa resistente apresenta menor desempenho em
comparaccedilatildeo com a espeacutecie susceptiacutevel No entanto esse clone menos competitivo
pode compensar essa perda de desempenho pela aquisiccedilatildeo de mutaccedilotildees
compensatoacuterias (JERNBERG et al 2010) No intestino os antibioacuteticos aleacutem de
selecionarem bacteacuterias resistentes tambeacutem aumentam o nuacutemero de transferecircncias
do pool de genes de ceacutelulas resistentes (DETHJEFSEN et al 2008 KARAMI et al
2007 YANG et al 2009)
2235 Dieta
Muitos estudos tem sido realizados no intuito de compreender a relaccedilatildeo entre o
consumo alimentar e a composiccedilatildeo da microbiota intestinal principalmente no
sentido de uma dieta ocidentalizada baseada em alimentos ricos em carboidratos
simples lipiacutedios e proteiacutenas de origem animal sal e poucos alimentos in natura
como frutas e hortaliccedilas ao comparar se com a dietas dos nossos antepassados
caracterizada pelo consumo de grandes quantidades de amido fibras e
polissacaacuteridos vegetais aleacutem de pequenas quantidades de gordura e proteiacutena
animal Em modelos murinos de obesidade induzida por padratildeo de dieta ocidental
no qual animais geneticamente idecircnticos que herdaram microbiotas semelhantes a
relaccedilatildeo entre dieta e representantes microbianos eacute dinacircmica e ajustaacutevel impactando
a capacidade da microbiota de promover a adiposidade no hospedeiro (CARMODY
et al 2015 DAVID et al 2014 DE FILIPPO et al 2010 FLEISSNER et al 2010
HILDEBRANDT et al 2009 LEY et al 2008 MENDONCcedilA ANJOS 2004 WALKER
et al 2011 WONG et al 2012 WU et al 2011)
Uma vez que a microbiota foi estabelecida nestes primeiros anos observa-se
um aumento na composiccedilatildeo microbiana tanto na diversidade quanto na riqueza
atingindo a mais alta complexidade em adultos com vaacuterias centenas de filotipos e
niacuteveis de espeacutecie Cada indiviacuteduo humano atinge um cliacutemax de composiccedilatildeo
homeostaacutetico o que provavelmente permanece relativamente estaacutevel durante a
37
maior parte da vida de um adulto saudaacutevel Nas fases tardias da vida a composiccedilatildeo
da microbiota torna-se novamente menos diversificada e mais dinacircmica
caracterizada por uma maior proporccedilatildeo de Bacteroidetes para Firmicutes aumento
de Proteobacteria e diminuiccedilatildeo da Bifidobacterium (MACKIE 1999 OTTMAN et al
2012 RAUTAVA et al 2012 VILLANUEVA-MILLAacuteN et al 2015) (Figura 1)
Figura 1 ndash Fatores envolvidos no estabelecimento da microbiota humana ao longo
da vida
Adaptado de MJ Villanueva-Millaacuten et al 2015
38
224 Microbiota intestinal e a fisiologia do hospedeiro
O intestino representa a interface natural entre microbiota intestinal e o
hospedeiro sendo a mucosa intestinal a localizaccedilatildeo principal para a interaccedilatildeo de
micro-organismos e antiacutegenos com o hospedeiro por meio de intenso cross-talk
(KINROSS et al 2011) Os achados de estudos cliacutenicos e experimentais tecircm
evidenciado que a interaccedilatildeo microbiotahospedeiro pode influenciar favoravelmente
a sauacutede do hospedeiro de diversas maneiras Ateacute agora as principais funccedilotildees
conhecidas da microbiota podem ser classificadas em quatro grupos metaboacutelica
(nutriccedilatildeo e digestatildeo) proteccedilatildeo (proteccedilatildeo contra agentes patogecircnicos
imunomodulaccedilatildeo) troacutefica (controle da proliferaccedilatildeo de ceacutelulas epiteliais e
diferenciaccedilatildeo) e regulaccedilatildeo da adiposidade
2241 Nutriccedilatildeo e Metabolismo
A microbiota intestinal eacute um importante fator que afeta a extraccedilatildeo de energia a
partir da dieta e do armazenamento de energia no hospedeiro A fim de realizar
estas funccedilotildees as enzimas metaboacutelicas da microbiota intestinal como as glicosidases
e polissacaridases tecircm a capacidade de extrair energia a partir de nutrientes
inacessiacuteveis uma vez que estas enzimas satildeo capazes de clivar ligaccedilotildees glicosiacutedicas
presentes em alguns polissacariacutedeos de plantas e fibras dieteacuteticas (BACKHED et al
2004 2005 GUARNER MALAGELADA 2003) Os polissacariacutedeos natildeo digeriacuteveis
como a oligofrutose (inulina) satildeo metabolizados pela microbiota colocircnica em
oligossacariacutedeos e monossacariacutedeos e entatildeo fermentados a aacutecidos graxos de
cadeia curta (AGCC) particularmente acetato propionato e butirato Estes AGCC
satildeo rapidamente absorvidos O Butirato fornece energia para o metabolismo celular
enquanto acetato e propionato seguem para a corrente sanguiacutenea sendo
transportados para o fiacutegado e oacutergatildeos perifeacutericos onde podem atuar como substratos
para a gliconeogecircnese e lipogecircnese (SHEN et al 2013 ZAIBI et al 2010)
A microbiota intestinal tambeacutem induz a expressatildeo do peptiacutedeo YY (PYY)
anorexigecircnico que geram sinais de saciedade atraveacutes de um mecanismo
dependente do receptor GPR41 Assim a produccedilatildeo de AGCC pela microbiota
intestinal estaacute associada com um aumento na saciedade e uma reduccedilatildeo na ingestatildeo
de alimentos no hospedeiro o qual por sua vez controla o ganho de peso corporal
(CLUNY et al 2015 SHEN et al 2013 ZAIBI et al 2010) Outros mecanismos
39
pelos quais as bacteacuterias do intestino podem influenciar metabolismo do colesterol
satildeo induzidos atraveacutes de Fasting Induced Adipocyte Factor (FIAF) que eacute
seletivamente suprimida no epiteacutelio intestinal pela microbiota intestinal (MARTINEZ
et al 2009)
Tambeacutem tem sido relatado o envolvimento da microbiota intestinal na
metabolizaccedilatildeo de polifenoacuteis que contribuem para o seu potencial antioxidante e
accedilotildees beneacuteficas aleacutem de siacutentese de algumas vitaminas como B12 e K aleacutem da
induccedilatildeo da expressatildeo do receptor de vitamina D pelos AGCC aumentando a sua
absorccedilatildeo e regulando o metabolismo do caacutelcio (BRENCHLEY DOUEK 2012
GUARNER MALAGELADA 2003 KIM et al 1998 MANACH DONOVAN 2004
RESTA 2009 SCALBERT WILLIAMSON 2000) Finalmente a microbiota intestinal
tambeacutem eacute capaz de executar uma seacuterie de biotransformaccedilotildees em xenobioacuteticos
como drogas e seus metaboacutelitos em formas que podem afetar sua absorccedilatildeo e
biodisponibilidade (WILSON NICHOLSON 2009) Neste contexto tem sido
demonstrado que a microbiota intestinal metaboliza toacutexicos e compostos
potencialmente canceriacutegenos tais como pirolisatos (BRENCHLEY DOUEK 2012)
2242 Proteccedilatildeo
Tem sido observado que a ausecircncia da microbiota intestinal torna o organismo
suscetiacutevel agrave infecccedilatildeo Alguns dos mecanismos envolvidos nessas accedilotildees protetoras
incluem competiccedilatildeo direta de nutrientes limitados e a modulaccedilatildeo de respostas
imunoloacutegicas no hospedeiro (GUARNER MALAGELADA 2003 KAMADA et al
2013 SEKIROV et al 2010)
22421 Competiccedilatildeo direta de nutrientes
Vaacuterios mecanismos tecircm sido implicados na resistecircncia agrave colonizaccedilatildeo do trato
gastrintestinal por patoacutegenos A camada de muco intestinal eacute capaz de manter
mutualismos mantendo as bacteacuterias no compartimento e restringindo estimulaccedilatildeo
imunoloacutegica ostensiva O hospedeiro fornece ativamente os nutrientes que a
microbiota precisa e a microbiota indica a quantidade de nutrientes que satildeo
necessaacuterios para o hospedeiro Esta relaccedilatildeo impede superproduccedilatildeo indesejada do
nutriente o que favoreceria a intrusatildeo de micro-organismos competitivos com
potencial de patogenicidade Finalmente as bacteacuterias podem inibir o crescimento
40
dos seus concorrentes produzindo peptiacutedeos antimicrobianos ou proteiacutenas
conhecidas como bacteriocinas que satildeo sintetizadas em ribossomos (GUARNER
MALAGELADA 2003 MONTALTO et al 2009 PURCHIARONI et al 2013
SEKIROV et al 2010)
22422 Imunomodulaccedilatildeo
As interaccedilotildees entre micro-organismos e ceacutelulas epiteliais e imunes baseiam-se
no reconhecimento de padrotildees moleculares associados agrave micro-organismos
(MAMPs) sendo mediado por receptores de reconhecimento padratildeo representados
pelos receptores do tipo toll (TLR) encontrados na superfiacutecie de ceacutelulas epiteliais e
imunes e pelos receptores de domiacutenio de digomerizaccedilatildeo de ligaccedilatildeo de nucleotiacutedeos
(NOD) que se encontram no citoplasma Esses receptores desempenham um
importante papel na gecircnese e na modulaccedilatildeo da resposta inflamatoacuteria (FRANCHI et
al 2009 MARANDUBA et al 2014 MONTALTO et al 2009 PURCHIARONI et al
2013)
A interaccedilatildeo funcional entre microbiota intestinal e sistema imunoloacutegico inicia-
se com a promoccedilatildeo de um ambiente anti-inflamatoacuterio pelas bacteacuterias (Figura 2) Em
um contexto simbioacutetico MAMPs estimulam continuamente atraveacutes das IECs (ceacutelulas
epiteliais intestinais) a secreccedilatildeo das proteiacutenas antimicrobianas intestinais REGIIIγ
para o luacutemen aleacutem de linfopoietina estromal tiacutemica (TSLP) IL-33 IL-25 e o fator de
crescimento tumoral-β (TGF-β) sob o epiteacutelio Esses mediadores imunoloacutegicos
induzem o desenvolvimento de macroacutefagos tolerogecircnicos e ceacutelulas dendriacuteticas
(DCs) tolerogecircnicas (KAMADA et al 2013 MAYNARD et al 2012)
Ceacutelulas Dendriacuteticas (DCs) tolerogecircnicas produzem TGF-β e aacutecido retinoacuteico
(RA) que estimulam o desenvolvimento de Ceacutelulas T regulatoacuterias (Treg) Assim
atraveacutes das ceacutelulas Treg (que utilizam diversos mecanismos de regulaccedilatildeo)
macroacutefagos (que produzem IL-10) e DCs tolerogecircncicos o sistema imunoloacutegico
intestinal eacute capaz de estabelecer e manter um ambiente anti-inflamatoacuterio Aleacutem dos
papeacuteis reguladores essenciais de TGF-β esta citocina tem sido associada com
outras substacircncias derivadas do epiteacutelio tais como fator de ativaccedilatildeo de ceacutelulas β
(FABF) e ligante indutor de proliferaccedilatildeo (APRILL) com o intuito de induzir o
desenvolvimento de ceacutelulas produtoras de IgA (plasmoacutecitos) (FAGARASAN et al
2010) Esta imunoglobulina eacute capaz de prevenir a ligaccedilatildeo de bacteacuterias comensais no
41
epiteacutelio do hospedeiro estando portanto envolvida na formaccedilatildeo da microbiota
intestinal (MACPHERSON et al 2012)
Aleacutem disto tem sido relatada que a produccedilatildeo de alguns tipos de peptiacutedeos
antimicrobianos bacterianos (AMPs) como a secreccedilatildeo das proteiacutenas
antimicrobianas intestinais REGIIIγ REGIIIβ e angiogenina-4 eacute influenciada pela
micro-organismos comensais via TLR MyD88 (FRANCHI et al 2009 GOTO
IVANOV 2013 VAN VLIET et al 2010) Desse modo verifica-se que no intestino
humano saudaacutevel a microbiota promove constante exposiccedilatildeo de ligantes aos TLR
garantindo a ativaccedilatildeo basal contiacutenua de vias de sinalizaccedilatildeo resultando em
inflamaccedilatildeo fisioloacutegica de baixa intensidade Aleacutem disso micro-organismos
comensais tambeacutem satildeo capazes de suprimir respostas inflamatoacuterias intensas (VAN
VLIET et al 2010)
42
Figura 2 ndash Interaccedilatildeo funcional entre a microbiota intestinal humana e o sistema
imunoloacutegico
Legenda ndash O equiliacutebrio evolutivo eacute formado ao longo do tempo sendo modulado por pressatildeo ambiental A
microbiota intestinal e o ambiente intestinal satildeo desenvolvidas em conjunto sendo necessaacuterio para o benefiacutecio de ambos tolerar um ao outro O sistema imunoloacutegico monitora essa interaccedilatildeo garantindo a homeostase e contribuindo para a simbiose No entanto o desequiliacutebrio causado na presenccedila de disbiose pode causar a reaccedilatildeo do sistema imunoloacutegico Simbiose e disbiose dependem de equiliacutebrio entre bacteacuterias comensais e patogecircnicas Bacteacuterias comensais promovem um ambiente anti-inflamatoacuterio Em um contexto de simbiose MAMPs estimulam continuamente as IECs a secretarem moleacuteculas que atuam protegendo o epiteacutelio e produzindo um ambiente tolerogecircnico Em disbiose haacute uma liberaccedilatildeo significativa de MAMPs que podem induzir IECs DCs ativadas e macroacutefagos a secretar citocinas inflamatoacuterias Consequentemente haacute um desenvolvimento de efetores imunoloacutegicos IL-22 eacute produzida em ambas as situaccedilotildees mas a contribuiccedilatildeo para a remodelaccedilatildeo da barreira epitelial eacute controlada por regulaccedilatildeo imune M macroacutefago Com bacteacuterias comensais Pato bacteacuterias patogecircnicas
Adaptado de MARANDUBA et al 2014
43
2243 Funccedilatildeo Troacutefica
A microbiota intestinal desempenha funccedilotildees troacuteficas modulando a proliferaccedilatildeo
e diferenciaccedilatildeo de ceacutelulas epiteliais do coacutelon atraveacutes dos AGCC produzidos na
fermentaccedilatildeo de hidratos de carbono natildeo digeriacuteveis Neste contexto o butirato eacute
considerado o AGCC com maior efeito pois promove o crescimento e o turnover das
ceacutelulas epiteliais acelerando a maturaccedilatildeo intestinal da mucosa durante o seu
desenvolvimento ou para induzir seu reparo apoacutes uma lesatildeo O butirato eacute capaz de
aumentar proliferaccedilatildeo diferenciaccedilatildeo e maturaccedilatildeo aleacutem de reduzir apoptose de
enteroacutecitos normais no intestino delgado atraveacutes de sua influecircncia sobre a
expressatildeo de genes e a siacutentese de proteiacutenas (GUILLOTEAU et al 2010 HAMER et
al 2008)
O butirato parece exercer um efeito troacutefico em ceacutelulas epiteliais do iacuteleo e do
jejuno atraveacutes de um mecanismo de neuro-hormonal sugerindo um efeito indireto
No coacutelon a ausecircncia de butirato induziu apoptose massiva nos colonoacutecitos podendo
ser explicado pelo fato de que o butirato eacute a fonte principal de energia para estas
ceacutelulas aleacutem de estimular a liberaccedilatildeo de peacuteptidos gastrointestinais eou fatores de
crescimento que desempenham um papel fundamental na proliferaccedilatildeo celular
(GUILLOTEAU et al 2010 HAMER et al 2008)
2244 Regulaccedilatildeo da adiposidade
Tem sido evidenciado que a microbiota intestinal influecircncia a adiposidade do
hospedeiro A primeira evidecircncia do papel da microbiota intestinal na regulaccedilatildeo da
homeostase energeacutetica e adiposidade do hospedeiro foi demonstrada por Backhed
et al (2004) em estudo que foi demonstrado que ratos germ-free apresentavam
menor conteuacutedo de gordura corporal do que ratos convencionais mesmo ao
consumirem a mesma quantidade de alimentos Diferentes mecanismos tecircm sido
propostos para explicar a relaccedilatildeo entre microbiota intestinal e a adiposidade Assim
dependendo da sua composiccedilatildeo a microbiota pode aumentar a extraccedilatildeo energeacutetica
da dieta a partir de polissacariacutedeos natildeo digeriacuteveis com menor conteuacutedo de energia
disponiacutevel nas fezes aleacutem de maiores niacuteveis de AGCC no intestino Propotildee-se
ainda que a microbiota intestinal seja capaz de induzir a regulaccedilatildeo de genes do
hospedeiro que modulam o metabolismo energeacutetico (MUSSO et al 2011)
44
225 Microbiota intestinal e disbiose
Em condiccedilotildees saudaacuteveis existe um equiliacutebrio entre todos os micro-organismos
presentes no intestino estando as bacteacuterias beneacuteficas em maior quantidade
(eubiose) Entretanto pode ocorrer desequiliacutebrio na microbiota com consequente
predomiacutenio das bacteacuterias potencialmente patogecircnicas sobre as beneacuteficas Esse
desequiliacutebrio eacute definido como disbiose e pode comprometer a sauacutede do hospedeiro
uma vez que se associa agrave patogecircnese de vaacuterias doenccedilas (HAWRELAK MYERS
2004)
O uso de antibioacuteticos anti-inflamatoacuterios hormonais e natildeo hormonais abuso de
laxantes consumo excessivo de alimentos processados baixo consumo de
alimentos crus excessiva exposiccedilatildeo a toxinas ambientais incluindo alguns metais
pesados doenccedilas consumptivas como cacircncer e siacutendrome da imunodeficiecircncia
adquirida (AIDS) disfunccedilotildees hepatopancreaacuteticas estresse divertiacuteculos idade
tempo de tracircnsito e pH intestinal disponibilidade de material fermentaacutevel estado
imunoloacutegico do hospedeiro e infecccedilotildees satildeo fatores importantes para promover
alteraccedilatildeo da microbiota acarretando em disbiose intestinal e consequentemente
modificando vaacuterias funccedilotildees do TGI incluindo a digestatildeo a
biodisponibilidadeabsorccedilatildeo eliminaccedilatildeo desintoxicaccedilatildeo e funccedilatildeo imunoloacutegica
(ALMEIDA et al 2009 HAWRELA MYERS 2004 SEARS GENUIS 2012)
Em um contexto de disbiose (Figura 2) a presenccedila de agentes patogeacutenicos
pode perturbar a regulaccedilatildeo do ambiente anti-inflamatoacuterio Quando patoacutegenos
enteacutericos superam as bacteacuterias comensais o desequiliacutebrio entre comensais e
bacteacuterias patogecircnicas provoca uma liberaccedilatildeo significativa de MAMPs Este aumento
pode induzir IECs DCs e macroacutefagos ativados a secretar citocinas inflamatoacuterias
como a IL-1β IL-6 IL-12 e IL-23 Estas citocinas estimulam o desenvolvimento de
ceacutelulas CD4+ T auxiliares (T helper - TH1) e ceacutelulas TH17 (produzem IL-17A IL-
17F e IL-22) resultando na inflamaccedilatildeo crocircnica (MAYNARD et al 2012)
Na vigecircncia da disbiose intestinal pode ocorrer perda de funccedilotildees importantes
da microbiota do hospedeiro As alteraccedilotildees qualitativas e quantitativas na microbiota
intestinal aleacutem das alteraccedilotildees nas atividades metaboacutelicas e na distribuiccedilatildeo dos
micro-organismos ao longo do intestino associam-se a diversas condiccedilotildees tais
como diarreias deacuteficits nutricionais doenccedila celiacuteaca cacircncer colorretal doenccedilas
45
inflamatoacuterias intestinais siacutendrome do coacutelon irritaacutevel e supercrescimento bacteriano
(ALMEIDA et al 2009 HAWRELAK MYERS 2004)
A disbiose pode provocar aumento da permeabilidade intestinal alterando uma
importante funccedilatildeo da mucosa intestinal que eacute a atividade de barreira Assim
moleacuteculas antigecircnicas ou toacutexicas e micro-organismos nocivos podem se translocar
atraveacutes da barreira promovendo a passagem destas substacircncias atraveacutes da mucosa
epitelial para o sangue ou sistema linfaacutetico gerando uma resposta inflamatoacuteria
sistecircmica A ligaccedilatildeo entre disbiose e desenvolvimento de doenccedilas como obesidade
diabetes e doenccedilas cardiovasculares vem sendo explorada A obesidade representa
uma das doenccedilas mais estudadas associadas agrave perturbaccedilotildees na microbiota
intestinal no entanto requer mais estudos (Figura 3) (ALMEIDA et al 2009
HAWRELAK MYERS 2004 KINROSS et al 2011)
46
Figura 3 ndash Doenccedilas influenciadas pelo metabolismo microbiano intestinal
Legenda ndash A variedade de doenccedilas sistecircmicas que satildeo diretamente influenciadas pelo metabolismo da microbiota intestinal e a sua influecircncia sobre outras vias em mamiacuteferos tais como o sistema imunitaacuterio inato tem sido demonstradas Especificamente em destaque incluem as vias metaboacutelicas envolvidas com o metabolismo de drogas e a obesidade que satildeo diretamente influenciados pelo teor microbiano intestinal Ags antigeacutenios C bolteae Clostridium Bolteae DCs ceacutelulas dendriacuteticas AGCC aacutecidos graxos de cadeia curta TLR receptor Toll-like
Adaptado de Kinross et al 2011
47
226 Microbiota Intestinal e obesidade
A partir de 2004 mais um fator ambiental passou a ser apontado como
importante para o controle do peso e da homeostase energeacutetica a microbiota
intestinal As primeiras evidecircncias da relaccedilatildeo microbiota intestinal versus obesidade
foram constatadas em animais germ-free convencionalizados Esses animais
demonstraram que mesmo ao consumir uma menor quantidade de dieta e portanto
menos calorias em comparaccedilatildeo aos animais germ-free apresentaram aumento da
quantidade de gordura corporal (BACKHED et al 2004)
Especificamente tem-se observado que a microbiota de ratos obesos tem uma
maior capacidade de extraccedilatildeo de energia da dieta e esta caracteriacutestica pode ser
transmissiacutevel atraveacutes da colonizaccedilatildeo de ratos germ-free com a microbiota fecal de
doadores obesos resultando em um aumento significativamente maior no percentual
de gordura corporal total com o intuito de armazenar os lipiacutedeos produzidos Estes
estudos demonstraram que microbiota intestinal eacute um potencial fator de contribuiccedilatildeo
adicional agrave fisiopatologia da obesidade (BACKHED et al 2004 HARRIS et al 2012
LEY et al 2005 TURNBAUGH et al 2006)
A definiccedilatildeo da alteraccedilatildeo na composiccedilatildeo da microbiota intestinal de obesos
ainda permanece controversa na literatura tanto no que se refere agrave abordagem em
niacutevel de filo quanto de espeacutecies em humanos (LYRA et al 2010) Aleacutem destes
estudos realizados com animais germ-free outros observaram associaccedilotildees
importantes entre obesidade e mudanccedilas na composiccedilatildeo da microbiota intestinal tal
como uma diversidade bacteriana reduzida (no filo eou outros niacuteveis) eou
representaccedilatildeo alterada de genes e vias metaboacutelicas bacterianas (DE LA SERRE et
al 2010 LEY et al 2006 TURNBAUGH et al 2006)
Em geral vaacuterios autores tecircm demonstrado associaccedilotildees entre obesidade e
mudanccedilas na abundacircncia relativa dos dois filos bacterianos dominantes
Bacteroidetes e Firmicutes Mais especificamente um aumento do filo Firmicutes e
uma diminuiccedilatildeo do filo Bacteroidetes em modelos de ratos obesos e pacientes tecircm
sido observado Aleacutem disso indiviacuteduos magros e pessoas que perderam peso
apresentaram maior abundacircncia do filo Bacteroidetes (ABDALLAH et al 2011
BACKHED et al 2007 CANI et al 2008 LEY et al 2005 2006 TURNBAUGH et
al 2006 VERDAM et al 2013)
48
O aumento da razatildeo FirmicutesBacteroidetes em ratos obesos pode estar
associada com possiacuteveis mediaccedilotildees de respostas adaptativas pelo hospedeiro para
limitar a absorccedilatildeo de armazenamento de energia eou para promover a adiposidade
(LEY et al 2005) Embora os resultados dos estudos demonstrem diferenccedilas na
proporccedilatildeo de grupos bacterianos entre indiviacuteduos eutroacuteficos e obesos ainda natildeo se
sabe se algum grupo de micro-organismos em especial contribui de maneira direta
para o desenvolvimento da obesidade e de alteraccedilotildees metaboacutelicas Associaccedilotildees
entre tipos de bacteacuteria e as variaacuteveis metaboacutelicas tecircm sido observadas seja em
humanos ou em modelo animal indicando que a modulaccedilatildeo de determinados
grupos bacterianos possa exercer efeito no contexto da obesidade Os desafios
enfrentados agora se referem ao entendimento dos mecanismos pelos quais grupos
bacterianos influenciam paracircmetros metaboacutelicos e se intervenccedilotildees dieteacuteticas ou
medicamentosas utilizadas para modular a proporccedilatildeo desses grupos bacterianos
podem melhorar o perfil metaboacutelico ou ao contraacuterio agravaacute-lo (TURNBAUGH et al
2009)
Em relaccedilatildeo agrave composiccedilatildeo da microbiota intestinal seguida agrave perda de peso de
acordo com estudos de coorte a proporccedilatildeo de Bacteroidetes aumentou enquanto o
nuacutemero de Firmicutes diminuiu parecendo restaurar a relaccedilatildeo
FirmicutesBacteroides que estava inicialmente aumentada em indiviacuteduos obesos
Na verdade apoacutes 10 semanas de restriccedilatildeo energeacutetica e de exerciacutecio os
participantes que perderam mais de quatro quilogramas (kg) de peso corporal
mostraram um aumento significativo na populaccedilatildeo de Grupo B fragilis bem como
um aumento na proporccedilatildeo BacteroidesPrevotella positivamente correlacionada com
a perda de peso (HARRIS et al 2012 NADAL et al 2009 SANTACRUZ et al
2009)
No que se diz respeito aos efeitos do exerciacutecio fiacutesico na microbiota intestinal
Evans et al (2014) demonstraram que o exerciacutecio teve efeitos significativos tanto em
camundongos eutroacuteficos quanto em camundongos obesos que ingeriam dieta rica
em gordura sobre o equiliacutebrio relativo dos principais filos bacterianos juntamente
com a prevenccedilatildeo de obesidade e normalizaccedilatildeo da toleracircncia agrave glicose induzida por
dieta De fato a distacircncia percorrida eacute proporcional agrave diminuiccedilatildeo observada para a
razatildeo FirmicutesBacteroides (EVANS et al 2014) Tambeacutem eacute importante ressaltar
que o exerciacutecio aumentou significativamente a proporccedilatildeo relativa de bacteacuterias
49
produtoras de butirato tais como Bacteroidales S24-7 que estatildeo associados com a
sauacutede da ceacutelula epitelial intestinal Aleacutem disso o exerciacutecio fiacutesico aumentou a
diversidade da microbiota intestinal apenas em ratinhos alimentados com uma dieta
rica em gordura No entanto sugere-se que o exerciacutecio pode agir de forma
independente da microbiota intestinal aumentando a utilizaccedilatildeo de energia apesar
de um consumo de uma dieta rica em gordura
227 Mecanismos pelos quais a microbiota intestinal contribui para a obesidade
2271 Extraccedilatildeo de energia adicional da dieta
A noccedilatildeo de que a microbiota intestinal fornece energia para o hospedeiro eacute
suportada por achados em ratos germ-free natildeo naturalmente colonizados com
micro-organismos que apresentaram um menor ganho de peso quando alimentados
com uma dieta rica em gordura do que os ratos germ-free controles (BACKHED et
al 2007 CAESAR et al 2012 DING et al 2010 TREMAROLI BACKHED 2012)
Esses resultados evidenciam que na ausecircncia da microbiota o consumo de uma
dieta obesogecircnica parece natildeo estimular o desenvolvimento da obesidade A
Microbiota intestinal pode afetar ambos os lados da equaccedilatildeo do balanccedilo energeacutetico
natildeo apenas como um fator que influencia a colheita de energia a partir de
componentes da dieta mas tambeacutem como um fator que afeta genes do hospedeiro
que regulam o gasto de energia eou de armazenamento (BACKHED et al 2004
GILL et al 2006 WOLEVER et al 1991)
A fermentaccedilatildeo de polissacariacutedeos pela microbiota pode gerar um aumento no
fluxo de monossacariacutedeos para o fiacutegado e adipoacutecitos favorecendo a lipogecircnese de
novo atraveacutes da ativaccedilatildeo da expressatildeo de dois reguladores nucleares de enzimas
lipogecircnicas- carbohydrate response element-binding protein (ChREBP) e liver sterol
response element binding protein type-1 (SREBP-1) - os quais ativam as enzimas
lipogecircnicas acetil-CoA carboxilase e aacutecido graxo sintase (BACKHED et al 2004
MUSSO et al 2011 TSUKUMO et al 2009) Nesse contexto o menor acuacutemulo de
gordura corporal demonstrado em animais germ-free que consumiram dieta
hiperlipiacutedica e apresentaram absorccedilatildeo semelhante aos animais convencionalizados
indica que a microbiota pode exercer efeito sobre o fluxo de lipiacutedios entre os tecidos
reduzindo o acuacutemulo de gordura (BACKHED et al 2007)
50
A proteiacutena Fasting Induced Adipose Factor (FIAF) eacute suprimida pela presenccedila
de microbiota sendo um inibidor da lipase lipoproteacuteica (LPL) produzido pelo
intestino fiacutegado e tecido adiposo limitando a captaccedilatildeo de aacutecidos graxos e
favorecendo o acuacutemulo de triacilgriceroacuteis nesse tecido Tem sido demonstrado que
animais germ-free apresentaram uma maior expressatildeo de FIAF e fenoacutetipo resistente
agrave obesidade (BACKHED et al 2004 2005 2007) A participaccedilatildeo de FIAF no
metabolismo lipiacutedico foi reforccedilada atraveacutes de estudos com ratos germ-free que
diferiram apenas na expressatildeo dessa proteiacutena (FIAF ++ versus FIAF --) onde
verificou-se que a deficiecircncia dessa proteiacutena induzida geneticamente natildeo eacute um fator
protetor para animais germ-free contra o ganho de peso promovido pela dieta
hiperlipiacutedica (BACKHED et al 2007)
Aleacutem de promover a lipogecircnese (atraveacutes das enzimas lipogecircnicas e inibiccedilatildeo da
FIAF) a microbiota tambeacutem desempenha um papel importante no gasto de energia
obtida a partir da dieta Mais especificamente a microbiota de obesos parece
favorecer uma inibiccedilatildeo de oxidaccedilatildeo de aacutecidos graxos (que por sua vez favorecem a
deposiccedilatildeo e armazenamento de lipiacutedios no tecido adiposo fiacutegado eou tecido
muscular) por mecanismos complementares mas independentes (HARDIE
SAKAMOTO 2006 PUIGSERVER SPIEGELMAN 2003 RABOT et al 2010)
A microbiota tambeacutem pode influenciar a homeostase energeacutetica por meio da
sinalizaccedilatildeo exercida pelos aacutecidos graxos de cadeia curta (AGCC) Os AGCC agem
natildeo apenas como fonte de energia mas tambeacutem como moleacuteculas de sinalizaccedilatildeo
atraveacutes de receptores acoplados agrave proteiacutena G (GPRs) GPRs satildeo um grupo de
receptores transmembracircnicos intestinais que respondem aos aacutecidos graxos Entre
os receptores dessa famiacutelia os receptores Gpr41 e Gpr43 satildeo fundamentais sendo
expressos abundantemente no intestino delgado distal no coacutelon e nos adipoacutecitos
Essa ligaccedilatildeo resulta na ativaccedilatildeo desses receptores induzindo a secreccedilatildeo de
polipeptiacutedeo YY (PYY) e leptina hormocircnios que influenciam nas funccedilotildees intestinais
e na regulaccedilatildeo do apetite (BELLAHCENE et al 2013 BINDELS et al 2013
HARDIE SAKAMOTO 2006 INOUE et al 2014 MUSSO et al 2011 ZAIBI et al
2010)
51
2272 Induccedilatildeo da inflamaccedilatildeo por meio da alteraccedilatildeo da permeabilidade intestinal
As concentraccedilotildees sanguiacuteneas de lipopolissacariacutedeos (LPS) sofrem significativa
influecircncia da microbiota intestinal Principalmente as bacteacuterias Gram-negativas
apresentam em sua superfiacutecie celular os LPS que funcionam como antiacutegenos
estimulando a resposta imune do hospedeiro Assim a microbiota intestinal
representa um grande reservatoacuterio dessa endotoxina especialmente naqueles
indiviacuteduos que habitualmente consomem dieta com alto teor de gorduras
(HOTAMISLIGIL 2010)
A principal via de sinalizaccedilatildeo do LPS envolve o fator nuclear Kappa B (NF-KB)
O LPS pode aumentar os niacuteveis circulantes de resistina espeacutecies reativas de
oxigecircnio (ERO) e proteiacutenas supressoras da sinalizaccedilatildeo de citocinas-1 e 3 (SOCS-1 e
SOCS-3) A elevaccedilatildeo de citocinas proacute-inflamatoacuterias como interferon-gama (IFN-α)
TNF- α interleucina (IL)-6 e IL-1β geralmente observada em pacientes obesos
pode ser originada de macroacutefagos no tecido adiposo ou da interaccedilatildeo do LPS com
seu receptor O aumento dessas citocinas pode contribuir para a translocaccedilatildeo de
LPS favorecendo a ocorrecircncia de endotoxemia metaboacutelica e consequentemente
potencializar a inflamaccedilatildeo subcliacutenica por meio da reduccedilatildeo da expressatildeodistribuiccedilatildeo
de proteiacutenas formadoras de junccedilotildees oclusivas (tight junctions) como zocircnula de
oclusatildeo-1 (ZO-1) e ocludina aumentando a permeabilidade intestinal (CANI et al
2008 LAM et al 2012)
Aleacutem da reduccedilatildeo da expressatildeo das junccedilotildees oclusivas intestinais haacute tambeacutem
uma evidecircncia de que a microbiota intestinal pode regular a permeabilidade
intestinal atraveacutes do sistema endocanabinoacuteide Em um estudo realizado por Muccioli
et al (2010) a modulaccedilatildeo da composiccedilatildeo microbiana do intestino seja por
colonizaccedilatildeo em ratos germ-free ou por tratamento com antibioacuteticos reduziu a
expressatildeo dos receptores canabinoacuteides (Cb-1) tanto do coacutelon quanto do tecido
adiposo enquanto em animais alimentados com uma dieta rica em gordura foi
observado aumento da expressatildeo Cb1 (EVERARD et al 2013 GEURTS et al
2011 MUCCIOLI et al 2010)
52
23 MOLLICUTES
231 Caracteriacutesticas Gerais dos Mollicutes
Os micoplasmas foram primeiramente isolados por Norcard e Roux em 1898
que estudavam a Pleuropneumonia Bovina doenccedila descrita haacute mais de um seacuteculo
na Europa e na Aacutefrica Em seguida micro-organismos semelhantes isolados de
humanos e de animais foram descritos por outros pesquisadores e denominados de
PPLO ndash ldquoPleuropneumonia-Like Organismsrdquo (MOROWITZ 2002 RAZIN JACOBS
1992)
O termo ldquomicoplasmardquo foi usado para denominar os micro-organismos da
Classe Mollicutes (Mollis = mole cuacutetis = pele) mas sugeriu-se o uso do termo
geneacuterico molicutes como nome trivial para designar qualquer microrganismo desta
classe O termo micoplasma aplica-se apenas aos membros do gecircnero Mycoplasma
Recentemente algumas riqueacutetsias e outras bacteacuterias de taxonomia indefinida foram
incluiacutedas aos Mollicutes A classe eacute composta por quatro ordens (Mycoplasmatales
Entomoplasmatales Acholeplasmatales Anaeroplasmatales) sete famiacutelias
(Mycoplasmataceae Incertae sedis (ordem Mycoplasmatales)
Entomoplasmataceae Spiroplasmataceae Acholeplasmataceae Incertae sedis
(ordem Acholeplasmatales) e Anaeroplasmataceae) 11 gecircneros (Mycoplasma
Ureaplasma Eperythozoon Haemobartonella Entomoplasma Mesoplasma
Spiroplasma Acholeplasma Phytoplasma Anaeroplasma Asteroplasma) e mais de
200 espeacutecies A famiacutelia Mycoplasmataceae conteacutem os principais micro-organismos
de interesse meacutedico dentre os quais estatildeo os gecircneros Mycoplasma Os molicutes
compreendem aproximadamente 200 espeacutecies distribuiacutedas ente plantas insetos
animais e humanos (BERGEYrsquos 2010 RAZIN 1992 RAZIN YOGEV NAOT
1998)
Mollicutes eacute a uacutenica classe do filo Tenericutes sendo anteriormente
classificado dentro do filo Firmicutes tendo essa mudanccedila justificada em parte
pela anaacutelise de uma seacuterie de marcadores filogeneacuteticos conservados Esta
classificaccedilatildeo eacute ainda apoiada pela ausecircncia de parede celular caracteriacutestica desses
micro-organismos As sequecircncias do gene 16S rRNA contribuem para sua
classificaccedilatildeo em grupos filogeneacuteticos sendo essa sequecircncia obrigatoacuteria para a
caracterizaccedilatildeo de novas espeacutecies Aleacutem disso a atribuiccedilatildeo de espeacutecie aos grupos eacute
53
feita principalmente por hibridaccedilatildeo DNA-DNA sorologia e semelhanccedila na sequecircncia
do gene 16rRNA Algumas espeacutecies foram atribuiacutedas individualmente a grupos
filogeneacuteticos clusters e subclusters que tambeacutem compartilham outras
caracteriacutesticas (BERGEYrsquos 2009 2010 BROWN WHITCOMB BRADBURY 2007
WEISBURG et al 1989)
A natureza dos molicutes tem representado um desafio na compreensatildeo da
sua biologia classificaccedilatildeo e taxonomia Por muito tempo os micoplasmas foram
considerados viacuterus devido a capacidade de transpor filtros que bloqueavam a
passagem de bacteacuterias (RAZIN 1992) Os membros da classe Mollicutes satildeo
caracterizadas pelo genoma de tamanho reduzido (058 - 22 Mb) ausecircncia de
parede celular (RAZIN 1998) e por apresentarem requerimentos nutricionais
diferenciados quando comparados agrave maioria das bacteacuterias de interesse veterinaacuterio e
humano Aminoaacutecidos nucleotiacutedeos e esteroacuteis exoacutegenos satildeo utilizados para seu
crescimento in vitro O esterol presente no soro ou ceacutelulas do hospedeiro eacute
incorporado pela membrana da maioria das espeacutecies Este composto contribui na
fluidez necessaacuteria agrave membrana e confere resistecircncia parcial agrave lise osmoacutetica
(RUHNKE ROSENDAL 1994)
A membrana dos micoplasmas tem composiccedilatildeo semelhante agraves das eubacteacuterias
e estaacute exposta ao ambiente com exceccedilatildeo de poucas espeacutecies que possuem
glicocaacutelice (WIESLANDER et al 1992) Localizam-se principalmente nas ceacutelulas de
mucosas e com potencial de invasatildeo (VOELKER DYBVIG 1996) As mutaccedilotildees tecircm
sido mencionadas como estrateacutegia de sobrevivecircncia que podem ter ocorrido em
funccedilatildeo da evoluccedilatildeo associada a perdas genocircmicas (DAVID et al 2002)
Natildeo apresentam flagelos entretanto algumas espeacutecies exibem deslizamento
sobre superfiacutecies liacutequidas Alguns micoplasmas possuem um tipo de estrutura ou
prolongamento polar em sua superfiacutecie onde haacute alta concentraccedilatildeo de moleacuteculas de
adesatildeo que permitem a sua aderecircncia agrave ceacutelula hospedeira (RAZIN 1992) Acredita-
se que estas estruturas em algumas espeacutecies como Mycolasma penetrans de
origem humana estejam envolvidas na invasatildeo celular (LO et al 1992)
Os molicutes exibem estrita relaccedilatildeo aos hospedeiros e especificidade a tecidos
e oacutergatildeos que reflete as suas caracteriacutesticas nutricionais e adaptaccedilatildeo parasitaacuteria
Estas bacteacuterias podem ocorrer em hospedeiros e tecidos diferentes de seu ldquohabitatrdquo
normal entretanto como observado por Goulet et al (1995) existem variaccedilotildees e
54
eventualmente eacute possiacutevel isolar espeacutecies de siacutetios e hospedeiros diferentes
daqueles habituais (ERICKSON ROSS BOVE 1988 HORNOK et al 2012 ISO et
al 2013 RAZIN 1992 RAZIN YOGEV NAOT 1998 WAITES et al 1987)
A maioria dos molicutes vivem como comensais e em muitos artroacutepodes
podem mesmo ser considerados simbiontes Infecccedilotildees com micoplasmas
patogecircnicos satildeo raramente agudas e usualmente seguem um curso crocircnico (RAZIN
YOGEV NAOT 1998) Os Mollicutes principalmente as espeacutecies encontradas em
mamiacuteferos apesentam-se como parasitas ideais geralmente vivendo em harmonia
com seu hospedeiro mas por outro lado satildeo tambeacutem considerados como
ldquooportunistas ideaisrdquo Diversas doenccedilas nos seus respectivos hospedeiros satildeo
causadas ou associadas aos Mollicutes (RAZIN YOGEV NAOT 1998) Estas
bacteacuterias parecem preferir estabelecerem-se em nichos com ceacutelulas em constante
renovaccedilatildeo favorecendo a sua adesatildeo (GABRIDGE CHANDLER DANIELS 1985)
Micoplasmas em especial as espeacutecies com os menores genomas tecircm altas
taxas de mutaccedilatildeo o que sugere que eles estatildeo em um estado de evoluccedilatildeo raacutepida
Esses dados foram confirmados por estudos de sequecircncias de genes 5S rRNA que
incluiu uma seacuterie de acholeplasmas anaeroplasmas micoplasmas ureaplasmas e
Clostridium innocuum (BOVEacute 1999 RAZIN 1995 ROGERS et al 1985)
Quanto ao seu metabolismo os Mollicutes podem ser divididos em
fermentadores e natildeo-fermentadores Os fermentadores produzem aacutecidos por meio
da metabolizaccedilatildeo de glicose e de outros carboidratos diminuindo o pH do meio de
cultivo e os natildeo- fermentadores possuem a via da arginina-deidrolase para
obtenccedilatildeo de ATP aumentando o pH (RAZIN 1978 2004) Quando ambas as vias
ocorrem os aacutecidos produzidos da glicoacutelise podem mascarar a alcalinizaccedilatildeo do caldo
causada pela hidroacutelise da arginina (BASEMAN TULLY 1997 OLSON et al 1993
RAZIN 2004)
Um dos maiores empecilhos na pesquisa e no diagnoacutestico laboratorial das
infecccedilotildees causadas por molicutes tem sido a dificuldade em cultivaacute-los in vitro
Apresentam crescimento lento mesmo utilizando-se o meio de cultivo adequado
(RAZIN 1994) A temperatura de aproximadamente 37 ordmC eacute indicativa do ldquohabitatrdquo
natural dos molicutes que corresponde agrave dos mamiacuteferos reacutepteis peixes artroacutepodes
e plantas O crescimento e sobrevivecircncia dos molicutes em meio de cultura satildeo
dependentes do pH Para espeacutecies originaacuterias de plantas e vertebrados o pH oacutetimo
55
eacute de 74 e o crescimento ocorre entre pH 65 a 80 (RAZIN et al 1978) A inibiccedilatildeo
do crescimento pode ocorrer pela excessiva produccedilatildeo de aacutecidos ou aacutelcalis gerados
pelo metabolismo microbiano primaacuterio
Esses micro-organismos apresentam colocircnias de 50 ndash 500 μm de diacircmetro
usualmente em forma de ldquoovo fritordquo quando cultivados em meio soacutelido visualizadas
com o auxiacutelio de microscoacutepio estereoscoacutepio (Figura 4) Em meio liacutequido o
crescimento geralmente natildeo causa turvaccedilatildeo provocando somente alteraccedilatildeo no pH
revelado por um indicador presente no meio de cultura (MILES 1992 RAZIN 1998)
A complexidade dos requerimentos nutricionais a variaccedilatildeo na forma celular e a
fragilidade osmoacutetica fazem com que os Mollicutes estejam sob constantes
investigaccedilotildees quanto a sua fisiologia para relatar seu crescimento e ecologia As
condiccedilotildees sob as quais eles crescem podem influenciar na estrutura e
funcionamento das ceacutelulas hospedeiras sendo importante natildeo somente para os
fisiologistas como tambeacutem para todos micoplasmologistas envolvidos em estudos
quantitativos (BALABANOV et al 2006 MILLES 1992 RAZIN et al 1978
RODWELL 1983 TULLY 1985)
Figura 4 ndash Crescimento de M hominis em meio SP4 com a produccedilatildeo de colocircnia em forma de ldquoovo fritordquo (aumento 40X)
Fonte Arquivo pessoal
56
232 Mollicutes Microbiota Intestinal e Obesidade
A ocorrecircncia e participaccedilatildeo da classe Mollicutes na microbiota intestinal e sua
relaccedilatildeo com a obesidade ainda eacute praticamente desconhecida No entanto
Turnbaugh et al (2008) investigaram a relaccedilatildeo dieta ecologia microbiana intestinal e
o balanccedilo energeacutetico a partir de um modelo murino de obesidade induzido por meio
do consumo de uma dieta ocidental Observou-se que a dieta ocidental estimulou o
crescimento de organismos da classe Mollicutes que posteriormente foram
reduzidos por subsequentes manipulaccedilotildees dieteacuteticas para limitar o ganho de peso
O transplante de microbiota de ratos com obesidade induzida por dieta para
destinataacuterios germ-free promoveu uma maior deposiccedilatildeo de gordura do que em
animais que receberam o transplante a partir de doadores eutroacuteficos Metagenocircmica
e anaacutelises bioquiacutemicas do microbioma intestinal em conjunto com sequenciamento e
reconstruccedilotildees metaboacutelicas associadas ao intestino humano revelaram que a
bacteacuteria Eubacterium dolichum) (um membro da classe Mollicutes) apresenta
caracteriacutesticas que podem fornecer uma vantagem competitiva aos membros desse
ramo em relaccedilatildeo aos nutrientes da dieta ocidental Essas vantagens relacionam-se
com a importaccedilatildeo e transformaccedilatildeo de accediluacutecares simples atraveacutes do Sistema
fosfotransferase (PTS)
Sistemas fosfotransferase (PTS) satildeo uma classe de sistemas de transporte
envolvidas na absorccedilatildeo e na fosforilaccedilatildeo de uma grande variedade de hidratos de
carbono (DEUTSCHER et al 2006) Cada transportador envolve trecircs enzimas de
ligaccedilatildeo que atuam como receptores e doadores de grupos fosforil duas enzimas
citoplasmaacuteticas que atuam em todos os hidratos de carbono PTS importados (HPR e
EI) e o outro eacute um complexo de hidratos de carbono especiacutefico (EII)
compreendendo um ou dois domiacutenios integrais de membrana hidrofoacutebicos (EIIC D)
e dois domiacutenios hidrofiacutelicos (EIIA B) (DEUTSCHER et al 2006) Fosfoenolpiruvato
embora produzidos atraveacutes da glicoacutelise pode ser usado para gerar ATP (atraveacutes da
piruvatoquinase) ou usado para conduzir a importaccedilatildeo de accediluacutecares adicionais
atraveacutes da transferecircncia de um grupo fosfato para EI do PTS
Genes PTS satildeo encontrados em vaacuterias divisotildees de bacteacuterias incluindo
Proteobacterias tais como E coli bem como vaacuterios Firmicutes e Mollicutes
sequenciados (Por exemplo Mycoplasma genitalium M pneumoniae M pulmonis
M penetrans M gallisepticum M mycoides M mobile M hyopneumoniae M
57
synoviae e M capricolum) (KANEHISA et al 2004) O PTS tambeacutem desempenha
um papel na regulaccedilatildeo da expressatildeo do gene microbiano atraveacutes da repressatildeo
cataboacutelica permitindo que a ceacutelula passe a importar preferencialmente accediluacutecares
simples em relaccedilatildeo a outros hidratos de carbono (DEUTSCHER et al 2006)
Muacuteltiplos componentes do PTS estatildeo presentes no microbioma da dieta ocidental (EI
e HPr mais EII) o que poderia permitir a importaccedilatildeo de accediluacutecares simples (por
exemplo glicose e frutose que juntos formam sacarose um componente abundante
da dieta ocidental) bem como accediluacutecares associados com a mucosa do intestino do
hospedeiro (N-acetil-galactosamina) O microbioma da dieta ocidental tambeacutem
conteacutem genes que suportam o metabolismo destes accediluacutecares fosforilados para vaacuterios
produtos finais de fermentaccedilatildeo anaeroacutebia (por exemplo lactato e a cadeia curta de
aacutecidos graxos butirato e acetato (DEUTSCHER et al 2006)
58
3 OBJETIVOS
31 Objetivo geral
Analisar a participaccedilatildeo da Classe Mollicutes e dos Filos Firmicutes e Bacteroidetes
na microbiota intestinal de mulheres obesas e eutroacuteficas
32 Objetivos especiacuteficos
Determinar o estado nutricional das mulheres obesas do grupo caso e
eutroacuteficas do grupo controle
Determinar o consumo alimentar das mulheres obesas do grupo caso e
eutroacuteficas do grupo controle
Desenvolver um ensaio quantitativo por meio de TaqMan PCR para a
detecccedilatildeo de Mollicutes na microbiota intestinal de mulheres obesas e
eutroacuteficas
Quantificar os micro-organismos da Classe Mollicutes e dos Filos Firmicutes e
Bacteroidetes aleacutem de Bacteacuterias Totais por meio da PCR em tempo real em
amostras de fezes de mulheres obesas e eutroacuteficas
Analisar a liberaccedilatildeo de citocinas proacute-inflamatoacuterias IL-1 IL6 IL17-A e TNF-α
em amostras de sangue coletadas de mulheres obesas e eutroacuteficas
59
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
41 Protocolo do estudo
O presente estudo foi desenvolvido no laboratoacuterio de Micoplasmas do
Departamento de Microbiologia do Instituto de Ciecircncias Biomeacutedicas da Universidade
de Satildeo Paulo (ICB IIUSP) com o Ambulatoacuterio de Obesidade e Siacutendrome Metaboacutelica
do Serviccedilo de Endocrinologia do Hospital das Cliacutenicas da Universidade de Satildeo
Paulo (HC-FMUSP) O estudo foi aprovado pela Comissatildeo de Eacutetica em Pesquisa
Envolvendo Seres Humanos (CEPSH) do Instituto de Ciecircncias Biomeacutedicas da
Universidade de Satildeo Paulo (ICBUSP) (protocolo de pesquisa ndeg 110713) e pela
Comissatildeo de Eacutetica da Instituiccedilatildeo HC-FMUSP Todas as mulheres foram recrutadas a
partir da demanda espontacircnea do serviccedilo tendo sido inseridas no protocolo apoacutes
explicaccedilatildeo sucinta e individual do mesmo e assinatura do Termo de Consentimento
Livre e Esclarecido (TCLE) conforme preconiza a resoluccedilatildeo 19606 do Conselho
Nacional de Sauacutede
42 Casuiacutestica
As coletas foram realizadas entre os meses de Outubro de 2013 agrave Dezembro
de 2014 Para obtenccedilatildeo de resultados pela metodologia proposta para este estudo
a casuiacutestica foi de 40 mulheres sendo 20 diagnosticadas com obesidade
apresentando Iacutendice de massa corporal (IMCgt 30 kgm2) e 20 mulheres em eutrofia
(IMC entre 185 e 249 kgm2) As mulheres diagnosticadas com obesidade foram
recrutadas no grupo de Obesidade e Siacutendrome Metaboacutelica do serviccedilo de
Endocrinologia do Hospital das Cliacutenicas da Universidade de Satildeo Paulo (HC-
FMUSP)
Foram utilizados como criteacuterios de exclusatildeo para esse grupo a presenccedila de
quadros infecciosos com sinais cliacutenicos uso de antibioacuteticos (3 meses antes do
estudo) quimioterapia radioterapia gravidez uso de probioacuteticos cirurgias preacutevias
no Trato Gastrointestinal doenccedilas do Trato Gastrointestinal como Doenccedila de Crohn
e Siacutendrome do Coacutelon Irritaacutevel Devido ao fato de haver dificuldade para distinccedilatildeo de
alimentos classificados como prebioacuteticos a ingestatildeo destes natildeo foi incluiacuteda como
criteacuterio de exclusatildeo do estudo O grupo controle foi composto por mulheres adultas
60
eutroacuteficas recrutadas na comunidade sem nenhuma enfermidade aparente tendo
sido fixados os mesmos criteacuterios de exclusatildeo adotados para o grupo controle
43 Delineamento experimental
As mulheres foram submetidas agrave coleta de material fecal e de sangue aleacutem de
questionaacuterio semiestruturado como instrumento de coleta Tal instrumento foi
construiacutedo atraveacutes de consulta em perioacutedicos cientiacuteficos e livros acadecircmicos que
descrevem preditores importantes em relaccedilatildeo a fatores etioloacutegicos predisponentes e
mantedenores da obesidade e possiacutevel associaccedilatildeo com microbiota intestinal e
ambiente Foram consideradas questotildees que avaliavam histoacuteria familiar cliacutenica
obsteacutetrica ginecoloacutegica consumo de aacutelcool e tabaco aleacutem de questotildees que
avaliavam os haacutebitos alimentares como a praacutetica de dietas para emagrecer e
nuacutemero de refeiccedilotildees realizadas Foi utilizado para esse estudo o IPAQ (International
Physical Activity Questionnaire) versatildeo curta originalmente desenvolvido com
finalidade de estimar o niacutevel de praacutetica habitual de atividade fiacutesica de populaccedilotildees de
diferentes paiacuteses (BARROS NAHAS 2000) O questionaacuterio foi elaborado de modo a
facilitar a obtenccedilatildeo de informaccedilotildees durante a consulta com os pacientes e realizadas
por indiviacuteduos previamente instruiacutedos para o desenvolvimento do estudo tendo as
variaacuteveis sido agrupadas em 9 Seccedilotildees que representam a subcategorizaccedilatildeo das
variaacuteveis independentes para determinaccedilatildeo do perfil da populaccedilatildeo estudada (Anexo
B)
44 Determinaccedilatildeo do estado nutricional
441 Avaliaccedilatildeo qualitativa do consumo alimentar
Para investigar possiacuteveis relaccedilotildees entre alimentos e nutrientes da dieta e
microbiota intestinal utilizou-se o questionaacuterio de frequecircncia alimentar semi-quantitativo
(QFA) composto por 62 itens alimentares proposto por Fisberg et al (2008) que
desenvolveram um QFA para utilizaccedilatildeo em estudos epidemioloacutegicos com indiviacuteduos
adultos desenhados para testar hipoacuteteses epidemioloacutegicas e nutricionais em estudos
conduzidos primariamente em Satildeo Paulo para estimar o teor de nutrientes da dieta
61
habitual o que eacute de fundamental importacircncia para estimar a medida de exposiccedilatildeo aos
fatores dieteacuteticos e investigar as possiacuteveis associaccedilotildees com desfechos de interesse
Representou-se a frequecircncia de consumo alimentar em 8 categorias a saber
diaacuterio (mais de trecircs vezes por dia duas a trecircs vezes por dia uma vez por dia) semanal
(cinco a seis vezes por semana duas a quatro vezes por semana uma vez por
semana) mensal (uma a trecircs vezes por mecircs) e nunca ou quase nunca Os dados sobre
o consumo alimentar foram inseridos em planilha eletrocircnica com auxiacutelio do estudo de
Giacomello et al (2008) Inicialmente converteu-se a frequecircncia de consumo de cada
alimento em frequecircncia diaacuteria como proposto por Coelho et al (2011) Para tanto
atribuiu-se ao alimento valor 1 (um) quando consumido 1 vez ao dia Caso o alimento
fosse consumido mais de uma vez ao dia multiplicava-se o valor 1 pelo intervalo da
frequecircncia diaacuteria relatada Para as opccedilotildees que contemplaram intervalos de tempo
semanal e mensal utilizou-se a meacutedia do intervalo das frequecircncias dividido pelo
periacuteodo se semanal (7) e mensal (30) conforme descritos no Quadro 01
Quadro 01ndash Criteacuterios utilizados na estimativa da frequecircncia diaacuteria de consumo dos alimentos incluiacutedos no Questionaacuterio de Frequecircncia Alimentar
Frequecircncia Relatada Frequecircncia diaacuteria
3 ou mais vezesdia 31=3
2 a 3 vezesdia 251= 25
1 vezdia 11= 1
5 a 6 vezessemana 557= 079
2 a 4 vezessemana 37= 043
1vezsemana 17= 014
1 a 3 vezesmecircs 230= 007
1 vezmecircs 130= 003
NuncaQuase nunca 0
COELHO et al 2011
62
Posteriormente foram construiacutedos os grupos dos alimentos segundo o registro do
QFA Adotou-se como criteacuterio para a inclusatildeo do alimento no respectivo grupo o
consumo igual ou maior a 10 e as caracteriacutesticas nutricionais (HAIR et al 2005)
Considerando este criteacuterio foram construiacutedos 16 grupos de alimentos (1) massas (2)
preparaccedilotildees (3) carne vermelha e ovos (4) embutidos (5) carne branca (6) leite e
derivados (7) leguminosas (8) cereais raiacutezes e tubeacuterculos (9) hortaliccedilas (10) frutas
(11) industrializados (12) infusatildeo (13) bebida alcooacutelica (14) oacuteleos e gorduras (15)
lanches (16) accediluacutecares e doces
Os dados referentes ao QFA tambeacutem foram utilizados para calcular o consumo
energeacutetico e de nutrientes Primeiramente estes foram transformados em gramas
utilizando-se uma tabela para avaliaccedilatildeo de consumo alimentar em medidas caseiras
(PINHEIRO et al 2002) e em seguida lanccedilados no Software Excel para digitaccedilatildeo dos
dados do consumo alimentar e para o caacutelculo de consumo de macro e micronutrientes
Para preencher o banco de dados do Software com alimentos e preparaccedilotildees
consumidas pelas participantes foram utilizadas as Tabelas de composiccedilatildeo de
alimentos PHILIPPI (2002) e TACO (2006) com a Tabela de medidas caseiras
(PINHEIRO et al 2005) aleacutem de dados adicionais de Composiccedilatildeo quiacutemica de alimentos
compilados da Tabela de Composiccedilatildeo de Alimentos da Fundaccedilatildeo Instituto brasileiro de
Geografia e Estatiacutestica (IBGE) Os valores obtidos foram comparados com os valores de
recomendaccedilatildeo propostos pelo United States Departament of Agriculture (USDA) em
seus documentos Dietary References Intakes (DRI) referentes aos valores de Estimated
Average Requirements (EAR) e para os nutrientes que ainda natildeo possuem esse valor
definido utilizou-se como paracircmetro valores de Adequate Intake (AI)
442 Avaliaccedilatildeo antropomeacutetrica do estado nutricional
A mensuraccedilatildeo do peso corporal em quilogramas (kg) foi realizada em
duplicata considerando-se o peso meacutedio Para tal foi utilizada uma balanccedila digital
Filizolareg com capacidade maacutexima para 150 kg e precisatildeo de 100 g estando as
participantes da pesquisa descalccedilas e com roupas leves A estatura em centiacutemetros
(cm) foi realizada em duplicata considerando-se a estatura meacutedia As medidas
foram determinadas por meio de um estadiocircmetro graduado em centiacutemetros com
precisatildeo de 10 mm apresentando barra de madeira vertical e fixa com esquadro
moacutevel para posicionamento sobre a cabeccedila do indiviacuteduo quando os mesmos
63
estavam descalccedilos em posiccedilatildeo ereta com os peacutes paralelos calcanhares
panturrilhas gluacuteteos ombros e cabeccedila encostados no estadiocircmetro olhando-se
para frente
O Iacutendice de Massa Corpoacuterea (IMC) foi calculado pelo peso e estatura a partir
das quais foi determinada a relaccedilatildeo entre o peso e altura em metros ao quadrado e
avaliado segundo os pontos de corte preconizados pela OMS assim designados
baixo peso (IMC lt 185 Kgaltura2) eutrofia (IMC= 185 a 249 kgaltura2) sobrepeso
(IMC= 25 a 299 Kgaltura2) e obesidade (IMC gt30 Kg altura2) (WHO 1998)
4421 Anaacutelise da Composiccedilatildeo Corporal pelo Meacutetodo de Bioimpedacircncia
O aparelho de bioimpedacircncia eleacutetrica utilizado para a avaliaccedilatildeo da composiccedilatildeo
corporal foi o InBody 720 (Biospace Coreia) que consiste em bioimpedacircncia
octopolar atraveacutes de oito pontos de contato pelos quais passa a corrente eleacutetrica na
extremidade dos quatro membros determinando a porcentagem de gordura e massa
magra em cada membro assim como no tronco
A avaliaccedilatildeo foi realizada respeitando os procedimentos apresentados no
respectivo manual de uso do aparelho atendendo as seguintes condiccedilotildees de preacute-
teste (1) estar em jejum (2) natildeo consumir aacutelcool 48 horas antes do teste (3) natildeo
realizar exerciacutecio de intensidade moderada a elevada nas 12 horas antes da
avaliaccedilatildeo (4) natildeo efetuar o exame perante em estado febril ou de desidrataccedilatildeo (5)
natildeo utilizar bijuterias metaacutelicas ou implantes dentaacuterios com metal (6) natildeo ingerir cafeacute
e (7) realizar a avaliaccedilatildeo com roupa de banho ou roupas iacutentimas
O relatoacuterio da bioimpedacircncia Octopolar eacute dividido em quatro partes
informativas de dados obtidos
1 Anaacutelise da Composiccedilatildeo Corporal identifica como estaacute distribuiacuteda a aacutegua
corporal total percentual de massa magra e massa de gordura livre
2 Anaacutelise Muacutesculo-gordura mostra em kg o peso a massa de muacutesculo
esqueleacutetico e a massa de gordura
3 Diagnoacutestico da obesidade discrimina o IMC PGC (porcentagem de
gordura corporal) e RCQ (relaccedilatildeo cintura-quadril)
4 Aacuterea de Gordura Visceral informa a aacuterea de gordura visceral em cm2
64
45 Coleta das amostras cliacutenicas
Para a obtenccedilatildeo das amostras de fezes as mulheres foram previamente
instruiacutedas de acordo com o National Committee for Clinical Laboratory Standards
NCCCLS (2007) evacuando diretamente no coletor plaacutestico esteacuteril fornecido
juntamente com luvas espaacutetula coletora e etiqueta de identificaccedilatildeo O material foi
acondicionado em caixa isoteacutermica resfriada com gelo e transportado
imediatamente ao Laboratoacuterio de Micoplasmas ICBUSP As amostras de fezes
foram distribuiacutedas em aliquotas (180-200 ug) em microtubos e acondicionadas -80oC
ateacute a anaacutelise laboratorial
Para a realizaccedilatildeo da coleta do material sanguiacuteneo o operador munido de EPIs
realizou punccedilatildeo venosa perifeacuterica preferencialmente em membro superior natildeo
dominante Foram coletados cerca de 5 mL de sangue por tubopaciente tendo sido
utilizados tubos natildeo-heparinizados que foram conservados de forma similar aos
coletores em caixa isoteacutermica refrigerada O material obtido foi levado ateacute o
Laboratoacuterio de Micoplasmas ICBUSP onde as amostras foram centrifugadas a
3500 rpm para obtenccedilatildeo do soro seguido de sua distribuiccedilatildeo em aliacutequotas de cerca
de 1 mL e estocados a -80 degC ateacute o uso
65
46 Determinaccedilatildeo da microbiota intestinal
461 Padronizaccedilatildeo de reaccedilatildeo de PCR quantitativo (qPCR) por meio de TaqMan para a detecccedilatildeo de Mollicutes
4611 Cepas bacterianas e condiccedilotildees de cultura
Como controle positivo utilizou-se a cepa ATCC 23114 (PG-21) de M hominis
Tambeacutem foram utilizados como controle os seguintes micro-organismos obtidos da
coleccedilatildeo do Laboratoacuterio de Micoplasmas ICBUSP Mycoplasma bovis Donetta M
arginini G230 M dispar M2979 M pneumoniae M pulmonis PG34 M
gallisepticum PG31 M synoviae WUU1853 M penetrans ATCC 55252 (GTU 54)
M fermentans PG18 M pulmonis PG34 M hyorhinis M genitalium ATCC 33530
(G37) M buccale M edwardii PG24 M gateae M faucium M felis CO M bovis
Spiroplasma mirum (SMCA) Acholeplasma laidlawii PG38 Ureaplasma diversum
ATCC 449782 U urealyticum T960 Escherichia coli ATCC 25922 Klebsiella
pneumoniae ATCC 13883 Streptococcus pyogenes ATCC 12345 Salmonella
typhimurium C5 CIP Pseudomonas aeruginosa ATCC 10145 Staphylococcus
aureus ATCC 25293 e Bacillus cereus As cepas referentes aos micro-organismos
Bacteroides fragilis C45A AUS 00306 e Clostridium perfringens foram cedidas pelo
Professor Dr Jorge Luiz Melo Sampaio pesquisador associado do Instituto Fleury
As espeacutecies de Ureaplasmas foram cultivadas em meio UB especiacutefico para
ureaplasma com 5 de CMRL-1066 (com glutamina e sem bicarbonato) enquanto
as espeacutecies de Micoplasmas foram cultivadas em meio de cultura SP4 como
descrito por Tully et al (1995) As bacteacuterias com parede celular incluiacutedas como
controles foram cultivadas em meio de infusatildeo de ceacuterebro-coraccedilatildeo (BHI) Destas
cepas o DNA foi extraiacutedo a partir de culturas em fase logariacutetmica por meio do kit
Pure Linktrade Genomic DNA da Invitrogenreg
4612 Desenvolvimento de primers e sonda para a detecccedilatildeo de Mollicutes pela PCR quantitativa
Os oligonucleotiacutedeos iniciadores e as sondas foram selecionadas com base no
fragmento conservado do gene 16S rRNA especiacutefico para a classe Mollicutes As
sequecircncias do gene 16S rRNA de micoplasmas foram alinhadas utilizando o
algoritmo ClustalW do Software MEGA4 As regiotildees variaacuteveis foram selecionadas
66
manualmente para o sequencionamento dos iniciadores e sondas utilizadas neste
ensaio Propriedades dos oligonucleotiacutedeos foram tambeacutem analisadas pelo Software
Primer Express ver 30 (Applied Biosystems Life Technologies Corporation
Carlsbad CA EUA) A especificidade dos iniciadores e da sonda foi testada ldquoin
silicordquo utilizando algoritmos BLAST
O quadro 02 mostra as sequecircncias forward e reverse selecionadas para
amplificar um fragmento conservado do gene 16S rRNA especiacutefico de Mollicutes A
sonda TaqMan especiacutefica para o fragmento amplificado foi desenvolvida por uma
fonte comercial (Applied Biosystems Life Technologies Corporation)
Quadro 2 - Sequecircncias dos iniciadores utilizados para amplificaccedilatildeo do gene 16S rRNA para Mollicutes
Iniciadores Sequecircncia
Molli1 5 GCA TTA GAT GAT CCG CCT GAG T 3
Molli2 5 GTC CCC GTC AAT TCC TTT AAG TT 3
Sonda 5 GTC CCC GTC AAT TCC TTT AAG TT 3
4613 PCR quantitativa
Ensaios de quantificaccedilatildeo absoluta do DNA alvo foram realizados com sistema
de PCR em tempo real (qPCR) StepOne (Applied Biosystems Life Technologies
Corporation) Diferentes concentraccedilotildees de cada primer iniciador e sonda foram
testados para aprimorar a reaccedilatildeo de qPCR Considerou-se ideal as seguintes
caracteriacutesticas r2 ge 0950 eficiecircncia entre 95 a 105 e slope proacuteximo de -332
A melhor reaccedilatildeo obtida foi a partir de 625 microl de Universal PCR Master Mix
(Applied Biosystems) 1 microM de cada iniciador 05 microM de sonda TaqMan MGB
marcada com corante fluorescente 25 microl de DNA extraiacutedo e aacutegua sem RNase para
o volume final de 125 microl As condiccedilotildees de amplificaccedilatildeo foram 50 degC por 10 min 95
degC por 10 min e 45 ciclos de desnaturaccedilatildeo a 95 degC durante 15 s anelamento a 59
degC durante 1 min Todas as reaccedilotildees foram realizadas em duplicata no aparelho
PCR em tempo real StepOnePlus (Applied Biosystems)
67
Para a construccedilatildeo de padrotildees de DNA para a quantificaccedilatildeo absoluta utilizou-
se como controle positivo a cepa de referecircncia ndash M hominis ATCC 23114 (PG-21)
que foi inicialmente cultivada em 1 ml de caldo SP4 a 37 degC e expandidos ateacute 100
ml Na fase de crescimento logariacutetmico (com base em alteraccedilotildees colorimeacutetricas) a
cultura foi centrifugada a 20600 rpm durante 30 minutos a 25 degC O DNA foi extraiacutedo
usando o kit PureLinktrade Genomic DNA Mini O nuacutemero de coacutepias de DNA genocircmico
foi calculado por espectrofotometria (NanoDrop ND -1000 WITec Ag Littau Suiacuteccedila)
Diluiccedilotildees decimais (107- 1 coacutepiasl) do DNA de M hominis para curva padratildeo foram
preparadas e analisadas
Os dados foram obtidos durante a etapa de anelamento e analisados pelo
Software StepOne 21 (Applied Biosystems Life Technologies Corporation) O limiar
foi ajustado manualmente dentro da curva logariacutetmica acima do niacutevel de detecccedilatildeo
basal e abaixo da fase linear e do platocirc O ciclo limiar (Ct-threshold cycle) das
diluiccedilotildees do genoma foi plotado contra o nuacutemero de log de coacutepias do genoma e
utilizado como entrada para criar a curva padratildeo Anaacutelises de regressatildeo linear foram
aplicadas para calcular os valores de r2 e do slope Assumindo a eficiecircncia de 100
se o molde de DNA eacute duplicado em cada ciclo a eficiecircncia da PCR foi calculada
como E= 10 (-1slope) - 1 onde E eacute a eficiecircncia da PCR
4614 Especificidade da qPCR e repetibilidade intra e inter-ensaios
O DNA dos micro-organismos utilizados como controles foi testado para
verificar a especificidade dos ensaios de qPCR (descrito em cepas bacterianas) A
repetibilidade intra-ensaio foi determinada executando cinco repeticcedilotildees das diluiccedilotildees
do genoma de M hominis (107 a 1 coacutepia do genoma bacterianoreaccedilatildeo) na mesma
reaccedilatildeo A curva padratildeo foi gerada utilizando o software StepOne 21 (Applied
Biosystems Life Technologies Corporation) A repetibilidade inter-ensaio foi obtida
por reaccedilotildees em triplicatas com a mesma diluiccedilatildeo do genoma em trecircs ensaios
diferentes em dias separados e consecutivos Estas repeticcedilotildees foram aplicadas
para determinar a meacutedia o desvio padratildeo e o coeficiente de variaccedilatildeo em valores de
Ct para cada diluiccedilatildeo do genoma
68
462 Reaccedilatildeo em cadeia da polimerase (PCR) convencional
As amostras cliacutenicas tambeacutem foram submetidas a PCR convencional para a
detecccedilatildeo da Classe Mollicutes utilizando-se dos os iniciadores descritos por Van
Kuppeveld et al (1992) Aacutegua livre de nuclease foi utilizada como controle negativo
em ambos os ensaios Os produtos amplificados foram analisados em gel de
agarose a 15 com brometo de etiacutedio 05 mmmL e tampatildeo TAE (Trisacetate 40
mM EDTA 2 mM pH 80) Os produtos foram visualizados e foto documentados sob
luz ultravioleta utilizando um sistema foto documentador (Vilber Lourmat Marne-la-
Vallee Franccedila)
463 Detecccedilatildeo de micro-organismos dos filos Firmicutes e Bacteroidetes e bacteacuterias totais (Eubacterias) por PCR em tempo Real (qPCR)
Para a construccedilatildeo de padrotildees de DNA para a quantificaccedilatildeo absoluta de
Firmicutes e Bacteroidetes utilizou-se como controles positivos as cepas de
referecircncias ndash Clostridium perfringens e Bacteroides fragilis respectivamente Para a
quantificaccedilatildeo de Bacteacuterias Totais (Eubacteacuterias) foi utilizado como controle positivo
Clostridium perfringens Os controles foram submetidos agrave extraccedilatildeo de DNA por meio
do kit QIAamp DNA stool ndash QIAGEN baseado no protocolo de extraccedilatildeo sugerido
pelo fabricante Para os filos Firmicutes Bacteroidetes assim como Bacteacuterias totais
foram utilizadas sequencias de iniciadores descritos por Guo et al (2008)
apresentadas no quadro 3
69
Quadro 3 ndash Sequecircncias dos iniciadores utilizados para amplificaccedilatildeo do gene 16S rRNA para Firmicutes Bacteroidetes e Bacteacuterias Totais (Eubacteacuterias)
Iniciadores Sequecircncia Referecircncia
Firm934F 5 GGA GYA TGT GGT TTA ATT CGA AGC A 3 GUO et al 2008
Firm1060R 5 AGC TGA CGA CAA CCA TGC AC 3
Bact934F 5 GGA RCA TGT GGT TTA ATT CGA TGA T 3 GUO et al 2008
Bact1060R 5 AGC TGA CGA CAA CCA TGC AG 3
Eub338F 5 ACT CCT ACG GGA GGC AGC AG 3 FIERER et al 2005
Eub518R 5 ATT ACC GCG GCT GCT GG 3
Os micro-organismos foram quantificados de modo absoluto baseando-se em
curva padratildeo previamente estabelecida Para cada reaccedilatildeo finalizada uma nova
curva padratildeo foi adicionada e paracircmetros de qualidade foram adotados na anaacutelise
sendo estes r2 ge 0950 eficiecircncia da reaccedilatildeo variando de 95 a 105 e slope
proacuteximo de -332
As reaccedilotildees de qPCR foram realizadas em volume final de 125 μL com 625
μL da mistura universal SYBR Green (Applied Biosystems Satildeo Paulo SP Brasil)
0 25 μM de cada primer especiacutefico 45μL de aacutegua e 125 μl de DNA extraiacutedo com
volume final de 125 μL As quantificaccedilotildees foram realizadas utilizando-se a
plataforma Applied Biosystems (Life Technologies Corporation) com os seguintes
paracircmetros 50 degC por 10 minutos 95 degC por 10 minutos seguidos de 45 ciclos de
95 degC por 15 segundos e 60degC por 1 minuto seguidas da curva de melting (15
segundos a 95 degC 1 minuto a 60 degC 15 segundos a 95 degC e 15 segundos e 60 degC)
47 Dosagem de citocinas do soro sanguiacuteneo
A dosagem das citocinas IL-1β TNF-α IL-10 e IL17-A foram realizadas
utilizando-se kit de ELISA de captura (eBioscience San Diego C A Estados
Unidos) em placas de poliestireno com 96 orifiacutecios e alta absorccedilatildeo de acordo com
protocolo indicado pelo fabricante Apoacutes padronizaccedilatildeo da curva padratildeo a aliacutequota
de 100 microL do sobrenadante das ceacutelulas foi utilizada para dosar as citocinas IL-1β
TNF-α IL-10 e IL17-A A leitura foi realizada com instrumento leitor de ELISA Vivid
70
Vision com comprimento de onda de 450 nm Os dados obtidos em absorbacircncia
foram transformados em picomols por meio de foacutermula matemaacutetica
48 Anaacutelises Estatiacutesticas
As anaacutelises estatiacutesticas da presenccedila dos microrganismos da classe Mollicutes
detectados nas amostras cliacutenicas e dos dados obtidos dos questionaacuterios foram
avaliados por meio do software SPSS 200 (SPSSreg Inc Chicago Estados Unidos)
Para comparar variaacuteveis de consumo alimentar e as variaacuteveis relacionadas ao perfil
da populaccedilatildeo estudada entre os grupos caso e controle foi aplicado Teste de qui-
quadrado de Pearson ou Teste Exato de Fisher tendo sido considerado plt005 e IC
95 O teste t que compara meacutedia entre grupos foi utilizado para verificar a
existecircncia de associaccedilatildeo entre as variaacuteveis desfecho (mulheres obesas x mulheres
eutroacuteficas) e as variaacuteveis Mollicutes (presenccedila x ausecircncia) com o consumo
alimentar dos macronutrientes carboidratos proteiacutenas lipiacutedeos e fibras (p le 005)
Unidos) Aleacutem disso para verificaccedilatildeo de associaccedilatildeo entre as variaacuteveis desfecho e a
presenccedila de Mollicutes foi aplicado Teste de qui-quadrado de Pearson ou Teste
Exato de Fisher tendo sido calculada a razatildeo de chances (odds ratio) (IC 95)
com o objetivo de verificar o poder da associaccedilatildeo entre as variaacuteveis supracitadas
Para verificar as distribuiccedilotildees de cargas dos micro-organismos estudados em
ambos os grupos avaliados inicialmente foi utilizado o teste de normalidade de
Shapiro-Wilk que demonstrou natildeo satisfazer a preacute-suposiccedilatildeo para utilizaccedilatildeo de um
teste parameacutetrico A partir desse resultado foi utilizado o teste natildeo-parameacutetrico de
Mann-Whitney amplamente utilizado para amostras pareadas que natildeo seguem
distribuiccedilatildeo normal As anaacutelises foram realizadas utilizando o programa estatiacutestico
GraphPad Prism versatildeo 500 (GraphPad Software San Diego California USA)
sendo estabelecida a existecircncia de significacircncia estatiacutestica quando o valor de p le
005 em todas as anaacutelises
Para anaacutelise dos dados de quantificaccedilatildeo das citocinas tambeacutem foi utilizado o
programa GraphPad Prism versatildeo 500 (GraphPad Software San Diego California
USA) tendo sido realizado o teste natildeo-parameacutetrico de Mann-Whitney
71
5 RESULTADOS
51 Perfil da populaccedilatildeo estudada
A amostragem do estudo envolveu 40 mulheres sendo 20 classificadas com
obesidade (IMC gt30 Kgm2) e 20 em eutrofia (IMC 185 - 249 Kgm2) com meacutedia de
idade de 38 anos para todas as mulheres 44 anos (DP 93 Amplitude 28-57) para
as mulheres obesas do grupo caso e 33 anos (DP 1204 Amplitude22-66) para as
mulheres eutroacuteficas do grupo controle
No presente estudo as variaacuteveis foram agrupadas em 9 Seccedilotildees com
resultados descritivos representados nas tabelas de 1 a 9 que representam a
subcategorizaccedilatildeo das variaacuteveis independentes para determinaccedilatildeo do perfil da
populaccedilatildeo estudada
O grupo das mulheres obesas foi caracterizado pela maioria de cor preta
parda ou indiacutegena (70) onde as moleacutestias atuais associadas mais frequentes
foram hipertensatildeo (30) dispneia (35) constipaccedilatildeo (35) refluxo (35) e
alteraccedilatildeo menstrual (55) A maioria das mulheres nasceram de parto normal
(75) foram amamentadas (90) jaacute tiveram filhos (70) e foram classificadas
como fisicamente ativas (60) Aleacutem disso 13 (65) das mulheres do grupo caso
referiram fazer trecircs ou mais refeiccedilotildees por dia Em relaccedilatildeo ao grupo das mulheres
eutroacuteficas esse foi caracterizado pela maioria de cor branca ou amarela (55) onde
as moleacutestias atuais associadas mais frequentes foram hipercolesterolemia (5)
dispneia (5) gastrite (15) e constipaccedilatildeo (20) Metade das mulheres nasceram
de parto normal (50) e foram amamentadas (85) enquanto 2 (10) tiveram
filhos e 9 (55) foram classificadas como fisicamente ativas Assim como o grupo
caso 13 (65) das mulheres do grupo controle referiram fracionar sua refeiccedilatildeo em
trecircs ou mais por dia
Aleacutem disso observa-se com base nos resultados estatiacutesticos que houve
variaccedilatildeo significativa na comparaccedilatildeo das variaacuteveis relacionadas ao perfil da
populaccedilatildeo estudada Em relaccedilatildeo agrave Seccedilatildeo 1 Histoacuteria Cliacutenica foram encontradas
variaccedilotildees significativas para as variaacuteveis associadas ao trato gastrintestinal
flatulecircncia (p=0008) refluxo (p=0018) azia (p=0008) e para as variaacuteveis
associadas agrave Moleacutestia atual hipertensatildeo (p=0008) dispneacuteia (p=0008) e alteraccedilatildeo
menstrual (p=0000) Em relaccedilatildeo agrave Seccedilatildeo 4 Histoacuteria Obsteacutetrica foi encontrada
72
variaccedilatildeo significativa para a variaacutevel gestaccedilatildeo (p=0000) Para a Seccedilatildeo 5 Histoacuteria
ginecoloacutegica observou-se variaccedilatildeo estatiacutestica para a variaacutevel menopausa (p=0038)
Tabela 1 ndash Determinaccedilatildeo do perfil da populaccedilatildeo estudada referente agrave Seccedilatildeo 1 Dados socioeconocircmicos Satildeo Paulo SP 2013-2014
Nota n= 20 mulheresa ndash Considerou-se como valor de Salaacuterio Miacutenimo (R$ 67800) ndash Significacircncia estatiacutestica quando p-valor le 005
Tabela 2 ndash Determinaccedilatildeo do perfil da populaccedilatildeo estudada referente agrave Seccedilatildeo 2 Histoacuteria Familiar Satildeo Paulo SP 2013-2014
Nota n= 20 mulheres a ndash Referente agrave parentes de primeiro grau paternos e maternos aleacutem de irmatildeos ndash Significacircncia estatiacutestica quando p-valor le 005
Variaacuteveis
Grupo Caso n ()
Grupo Controle n ()
IC 95 P
Raccedilacor
009-128 0110 PretaPardaIndiacutegena BrancaAmarela
14 (70) 6 (30)
9 (45) 11 (55)
Escolaridade
096-128 0147 lt Ensino Meacutedio ge Ensino Meacutedio
1 (5) 19(95)
0 (0) 20 (100)
Relaccedilatildeo Estaacutevel
023-283 0752 Sim Natildeo
11 (55) 9 (45)
10 (50) 10 (50)
Renda familiar
010-155 0185 lt 2 salaacuterios miacutenimosa ge 2 salaacuterios miacutenimosa
9 (45) 11 (55)
5 (25) 15 (75 )
Variaacuteveis
Grupo Caso n ()
Grupo Controle n ()
IC 95 P
Famiacutelia hipertensatildeo
006-120 0077 Sim Natildeo
17 (85) 3 (15)
12 (60) 8 (40)
Famiacutelia diabetesa
013-157 0206 Sim Natildeo
12 (60) 8 (40)
8 (40) 12 (60)
Famiacutelia obesidadea
007-106 0058 Sim Natildeo
13 (65) 7(35)
7 (35) 13 (65)
Famiacutelia hipercolesterolemiaa
035-430 0749 Sim Natildeo
11 (55) 9 (45)
12 (60) 8 (40)
Famiacutelia Doenccedilas Caacuterdio-vasculares (DCV)a
029-345 1000 Sim Natildeo
10 (50) 10 (50)
10 (50) 10 (50)
73
Tabela 3 ndash Determinaccedilatildeo do perfil da populaccedilatildeo estudada referente agrave Seccedilatildeo 3 Histoacuteria Cliacutenica Satildeo Paulo SP 2013-2014
Nota n=20 mulheres a- Histoacuterico cliacutenico das pacientes em relaccedilatildeo agrave alteraccedilotildees gastrintestinais moleacutestia atual e uso de laxantes- Diferenccedila estatiacutestica natildeo computada pois a variaacutevel eacute uma constante
Variaacuteveis
Grupo Caso n ()
Grupo Controle n ()
IC 95 P
TGI constipaccedilatildeoa
003-115 0058 Sim Natildeo
7 (35) 13 (65)
2 (10) 18 (90)
TGI flatulecircnciaa
107-190 0008 Sim Natildeo
6 (30) 14 (70)
0 (0) 20 (100)
TGI refluxoa
001-089 0018 Sim Natildeo
7 (35) 13 (65)
1 (5) 19 (95)
TGI aziaa
107-190 0008 Sim Natildeo
6 (30) 14 (70)
0 (0) 20 (100)
TGI uacutelceraa
095-116 0311 Sim Natildeo
1 (5) 19 (95)
0 00) 20 (100)
TGI gastritea Sim Natildeo
2 (10)
18 (90)
3 (15)
17 (85) 023-107 0633
TGI naacuteuseasa Sim Natildeo
3 (15)
17(85)
1 (5)
19 (95) 002-314 0292
TGI vocircmitosa Sim Natildeo
1 (5)
19 (95)
0 (0)
20 (100) 095-116 0311
TGI diarreacuteiaa Sim Natildeo
0 (0)
20(100)
0 (0)
20 (100)
Moleacutestia atual hipertensatildeoa Sim Natildeo
6 (30)
14 (70)
0 (0)
20 (100) 107-190 0008
Moleacutestia atual diabetesa Sim Natildeo
0 (0)
20 (100)
0 (0)
20 (100)
Moleacutestia atual hipercolesterolemiaa Sim Natildeo
5 (25)
15 (75)
1 (5)
19 (95) 001-150 0077
Moleacutestia atual DCVa Sim Natildeo
2 (10)
18 (90)
0 (0)
20 (100) 096-128 0147
Moleacutestia atual Dispneacuteiaa Sim Natildeo
7 (35)
13 (65)
1 (5)
19 (95) 001-089 0018
Moleacutestia atual alteraccedilatildeo menstruala Sim Natildeo
11 (55)
9 (45)
0 (0)
20 (100) 136-360 0000
Uso de laxantesa Sim Natildeo
3 (15)
17 (85)
0 (0)
20 (100) 097-141 0072
74
Tabela 4 ndash Determinaccedilatildeo do perfil da populaccedilatildeo estudada referente agrave Seccedilatildeo 4 Histoacuteria Obsteacutetrica Satildeo Paulo SP 2013-2014
Nota n= 20 mulheres andash Foram considerados aspectos relacionados as pacientes em seu nascimento e na maternidade ndash Significacircncia estatiacutestica quando p-valor le 005
Variaacuteveis
Grupo Caso n ()
Grupo controle n ()
IC 95 P
Nascimento por parto cesaacutereaa
078-1144 0102 Sim Natildeo
5 (25) 15(75)
10 (50) 10 (50)
Nascimento por parto normala
008-127 0102 Sim Natildeo
15 (75) 5 (25)
10 (50) 10 (50)
Foi amamentadaa
009-424 0633 Sim Natildeo
18 (90) 2 (30)
17 (85) 3 (15)
Teve alguma gestaccedilatildeoa
0008-0273 0000 Sim Natildeo
14 (70) 6 (30)
2 (10) 18 (90)
Sofreu algum abortoa Sim Natildeo
2 (10)
18 (90)
2 (10)
18 (90) 096-128 0147
75
Tabela 5 ndash Determinaccedilatildeo do perfil da populaccedilatildeo estudada referente agrave Seccedilatildeo 5 Histoacuteria Ginecoloacutegica Satildeo Paulo SP 2013-2014
Nota n= 20 mulheres andash Idade meacutedia em que todas as mulheres estudadas comeccedilaram a ingerir
contraceptivo 22 anos ndash Significacircncia estatiacutestica quando p-valor le 0005
Tabela 6 ndash Determinaccedilatildeo do perfil da populaccedilatildeo estudada referente agrave Seccedilatildeo 6 Consumo atual de tabaco Satildeo Paulo SP 2013-2014
Nota n= 20 mulheres ndash Significacircncia estatiacutestica quando p-valor le 005
Variaacuteveis
Grupo Caso n ()
Grupo Controle n ()
IC 95 P
Menopausa
004-097 0038 Sim Natildeo
9 (45) 11(55)
3 (15) 17 (85)
Usou ou estaacute usando contraceptivo
021-470 1000 Sim Natildeo
16 (80) 4 (20)
16 (80) 14 (20)
Contraceptivo hormonal
041-633 0490 Sim Natildeo
13 (65) 7 (35)
15 (75) 5 (25)
Contraceptivo natildeo hormonal
002-314 0292 Sim Natildeo
3 (15) 17(85)
1 (5) 19 (95)
Idade que comeccedilou a ingerir ge 22 anosa
011-156 0197 Sim Natildeo
10 (50) 10 (50)
6 (30) 14 (70)
Idade que comeccedilou a ingerir lt 22 anosa Sim Natildeo
2 (10)
18 (90)
2 (10)
18 (90) 063-853 0197
Variaacuteveis
Grupo Caso n ()
Grupo Controle n ()
IC 95 P
Consumo atual de tabaco
002-207 0151 Sim Natildeo
4 (20) 16 (80)
1 (5) 19 (95)
Jaacute consumiu tabaco
023-418 1000 Sim Natildeo
5 (25) 15 (75)
5 (25) 15 (75)
76
Tabela 7 ndash Determinaccedilatildeo do perfil da populaccedilatildeo estudada referente agrave Seccedilatildeo 7 Consumo atual de aacutelcool Satildeo Paulo SP 2013-2014
Nota n= 20 mulheres ndash Significacircncia estatiacutestica quando p-valor le 005
Tabela 8 ndash Tabela de determinaccedilatildeo do perfil da populaccedilatildeo estudada referente agrave Seccedilatildeo 8 Atividade Fiacutesica (IPAQ versatildeo curta) Satildeo Paulo SP 2013-2014
Nota n= 20 mulheres andash Para a classificaccedilatildeo foi utilizado o IPAQ (International Physical Activity Questionnaire) versatildeo curta Irregularmente ativa Irregularmente ativa A e B ndash Significacircncia estatiacutestica quando p-valor le 005
Variaacuteveis
Grupo Caso n ()
Grupo Controle n ()
IC 95 P
Consumo atual de aacutelcool
052-643 0342 Sim Natildeo
8 (40) 12 (60)
11 (55) 9 (45)
Variaacuteveis
Grupo Caso n ()
Grupo Controle
IC 95 P
Niacutevel de atividade fiacutesica
015-191 0342 Ativaa Irregularmente ativaa
12 (60) 8 (40)
9 (45) 11 (55)
77
Tabela 9 ndash Tabela de determinaccedilatildeo do perfil da populaccedilatildeo estudada referente agrave Seccedilatildeo 9 Mudanccedilas recentes nos haacutebitos alimentares Satildeo Paulo SP 2013-2014
Nota n= 20 mulheres andash Meacutedia de refeiccedilotildees diaacuterias 3 refeiccedilotildees - Diferenccedila estatiacutestica natildeo
computada pois a variaacutevel eacute uma constante ndash Significacircncia estatiacutestica quando p-valor le 005
Variaacuteveis
Grupo Caso n ()
Grupo Controle
n ()
IC 95 P
Mudou haacutebitos alimentares recentemente
007-151 0144 Sim Natildeo
7 (35) 13 (65)
3 (15) 17 (85)
Mudou haacutebitos alimentares recentemente para perda de peso
007-151 0144 Sim Natildeo
7 (35) 13 (65)
3 (15) 17 (85)
Mudou haacutebitos alimentares recentemente para dieta vegetariana ou restriccedilatildeo de consumo carne
Sim Natildeo
0(0) 20(100)
0(0) 20(100)
Mudou haacutebitos alimentares recentemente restriccedilatildeo de consumo sal
Sim Natildeo
0(0) 20(100)
0(0) 20(100)
Mudou haacutebitos alimentares recentemente para reduccedilatildeo do colesterol
Sim Natildeo
0(0) 20(100)
0(0) 20(100)
ge refeiccedilotildeesdiaa
Sim Natildeo
13(65) 7(35)
14(70) 6(30)
033-473 0736
lt refeiccedilotildeesdiaa
Sim Natildeo
7(35)
13(65) 7(35)
13(65) 027-366 1000
Desjejum diariamente
051-900 0288 Sim Natildeo
13 (35) 7(65)
16 (80) 4 (20)
Costuma beliscar entre as refeiccedilotildees
035-430 0749 Sim Natildeo
11 (55) 9 (45)
12 (60) 8 (40)
Costuma ingerir liacutequidos durante as refeiccedilotildees
009-154 0168 Sim Natildeo
16 (80) 4 (20)
12 (60) 8 (40)
Costuma fazer refeiccedilotildees fora de casa
112-933 0018 Sim Natildeo
12 (60) 8 (40)
19 (95) 1 (5)
78
52 Determinaccedilatildeo do estado nutricional
521 Avaliaccedilatildeo qualitativa do consumo alimentar
Na Tabela 10 (apecircndice) encontra-se a participaccedilatildeo dos alimentos nos grupos
e meacutedias de consumo diaacuterio dos alimentos pela populaccedilatildeo estudada Os alimentos
mais consumidos e que apresentaram frequecircncia diaacuteria de uma vez ao dia ou mais
em relaccedilatildeo ao grupo caso foram feijatildeo arroz alface tomate e oacuteleo azeite ou
vinagre para tempero de salada Em relaccedilatildeo ao grupo controle os que apresentaram
consumo diaacuterio de uma vez ou mais foram arroz e patildeo francecircs patildeo de forma
integral patildeo doce ou torrada
O percentual de consumo dos 16 grupos alimentares identificados derivados
do QFA (Tabela 11) em relaccedilatildeo ao grupo caso que foram consumidos por 80 ou
mais da populaccedilatildeo foram massas carne vermelha e ovos embutidos carne branca
cereais raiacutezes e tubeacuterculos hortaliccedilas e frutas No mesmo grupo populacional os
grupos alimentares de menor consumo foram bebida alcooacutelica leite e derivados e
preparaccedilotildees com percentuais de consumo de 30 493 e 525
respectivamente Os grupos que apresentaram consumo intermediaacuterio foram
Infusatildeo Oacuteleos e gorduras accediluacutecar e doces lanches leguminosas e alimentos
industrializados com percentuais de consumo de 60 616 65 783 783 e
79 respectivamente No grupo controle os grupos alimentares que apresentaram
consumo de 80 ou mais da populaccedilatildeo foram massa carne vermelha e ovos carne
branca cereais raiacutezes e tubeacuterculos hortaliccedilas lanches e accediluacutecar e doces Ainda
nesse grupo populacional os grupos alimentares de menor consumo assim como no
grupo caso foram bebida alcooacutelica preparaccedilotildees e leite e derivados com
percentuais de consumo de 45 45 e 486 respectivamente Os grupos que
apresentaram consumo intermediaacuterio foram oacuteleos e gorduras Infusatildeo alimentos
embutidos leguminosas alimentos industrializados e frutas com percentuais de
consumo de 616 65 65 65 657 731 respectivamente
79
Tabela 11 ndash Definiccedilatildeo dos grupos alimentares derivados do Questionaacuterio de Frequecircncia Alimentar (QFA) e percentual de consumo da populaccedilatildeo estudada Satildeo Paulo SP 2013-2014
Grupo Alimentar
Grupo Consumo Alimentos
Massas
Caso 90 Macarratildeo com molho sem carne macarratildeo com molho com
carne lasanha nhoque pizza e panqueca Controle 916
Preparaccedilatildeo Caso
525 Sopas polenta cozida ou frita
Controle 45
Carne vermelha e ovos
Caso 888 Carne bovina Carne de porco carne de sol bacon e ovo
Controle 813
Embutidos Caso 825 Linguiccedila e embutidos (presunto mortadela salsicha)
Controle 65
Carne branca Caso 975 Frango peixe e frutos do mar
Controle 95
Leite e derivados
Caso 493 Leite integral leite desnatado leite semi-desnatado iogurte
natural iogurte com frutas queijo mussarela queijo prato
parmesatildeo provolone queijo minas e ricota
Controle 486
Leguminosas
Caso 783 Feijatildeo lentilha ervilha seca gratildeo de bico soja feijoada feijatildeo tropeiro
Controle 65
Cereais raiacutezes e tubeacuterculos
Caso
813
Arroz branco integral cozido com oacuteleo e temperos batata frita
mandioca frita batata cozida mandioca cozida inhame purecirc
de batatas ou mandioca farinha de mandioca farofa cuscuz
tapioca aveia patildeo francecircs patildeo de forma torrada biscoito
sem recheio doce e salgado biscoito recheado biscoito
amanteigado waffer bolo simples bolo recheado
Controle
887
Hortaliccedilas
Caso 964 Alface tomate cenoura outros legumes (abobrinha berinjela chuchu pepino) outras verduras cruas (acelga ruacutecula agriatildeo) outras verduras cozidas (acelga espinafre escarola couve) broacutecolis couve-flor e repolho
Controle 926
Frutas Caso 825 Laranja mexerica abacaxi banana maccedila pecircra melatildeo
melancia mamatildeo goiaba abacate suco natural Controle 731
Industrializados
Caso
79
Maionese condimentos molho para salada patecirc chantilly suco industrializado refrigerante comum diet e light hambuacuterguer nuggets almondegas Controle 657
Infusatildeo Caso 60 Chaacute e cafeacute sem accediluacutecar chaacute e cafeacute com accediluacutecar
Controle 65
Bebida alcooacutelica Caso 30 Cerveja
Controle 45
Oacuteleos e gorduras Caso 616 Oacuteleo azeite vinagre manteiga ou margarina comum
manteiga ou margarina light Controle 616
Lanches Caso 783 Salgados fritos salgados assados sanduiacuteche
Controle 833
Aacutecuacutecar e doces Caso 65 Chocolate bombom brigadeiro chocolate em poacute sobremesas doces tortas e pudins accediluacutecar mel geleacuteia Controle 888
80
Todos os indiviacuteduos da pesquisa foram avaliados quanto a ingestatildeo dieteacutetica
Os dados dieteacuteticos obtidos foram traduzidos em energia macro e micronutrientes
(Tabela 12) Observa-se com base nos resultados estatiacutesticos que natildeo houve
variaccedilatildeo significativa no consumo alimentar das mulheres estudadas tendo sido
semelhante entre os grupos caso e controle Aleacutem disso ao realizar-se o teste t
comparando as meacutedias de consumo dos macronutrientes carboidratos proteiacutenas
lipiacutedios e fibras com as variaacuteveis desfecho (mulheres obesas x mulheres eutroacuteficas)
tambeacutem natildeo foram observadas associaccedilotildees estatisticamente significantes
Analisando a razatildeo de ingestatildeo quilocaloriasquilograma de peso corporal
tem-se que o grupo caso teve meacutedia de ingestatildeo energeacutetica de 199 kcalkgdia e o
grupo controle 279 kcalkgdia (Tabela 13) O grupo controle evidenciou consumo
compatiacutevel para a manutenccedilatildeo do seu peso (faixa de recomendaccedilatildeo 25-30
kcalkgdia) enquanto o grupo caso apresentou um niacutevel meacutedio de ingestatildeo abaixo
do valor de manutenccedilatildeo a ingestatildeo energeacutetica foi 204 menor do que a
recomendaccedilatildeo considerando-se o limite inferior de 25 kcalkgdia
Outra razatildeo de ingestatildeo gramas de proteiacutenasquilograma de peso corporal eacute
utilizada para caacutelculo e recomendaccedilatildeo de consumo proteacuteico sem prejuiacutezo da funccedilatildeo
renal (recomendaccedilatildeo de ingestatildeo 06 a 08 g de proteiacutenaskg de pesodia) O grupo
controle apresentou ingestatildeo proteacuteica acima do recomendado 12 g de proteiacutenaskg
de pesodia enquanto o grupo caso apresentou um niacutevel meacutedio de consumo
compatiacutevel com a recomendaccedilatildeo 078 g de proteiacutenaskg de pesodia apresentando-
se no limite maacuteximo preconizado (Tabela 13)
81
Tabela 12 ndash Anaacutelise de consumo de energia e nutrientes da populaccedilatildeo estudada Satildeo Paulo SP 2013-2014
Variaacuteveis Grupo Meacutedia de consumo
Desvio Padratildeo
IC 95 P
Energiadia (kcal)
Caso 18571 93622 (137401 ndash 205869) 093
Controle 1692 98334 (120438 ndash 217822)
Carboidratodia (g)
Caso 24345 16826 (16706 ndash 25787)
090 Controle 20785
10997 (15402 ndash 26294)
Gordura totaldia (g)
Caso
658
276
(5205 ndash 7926) 086
Controle
627
4714 (3998 ndash 8673)
Gordura polinsaturadadia
(g)
Caso 795 416 (617 ndash 937) 048
Controle 85 675 (575 ndash 1237)
Gordura monoinsaturadadia
(g)
Caso 206 925 (1640 ndash 2553)
059 Controle 182 1598
(1077 ndash 2651)
Gordura saturadadia (g)
Caso 2185 1149 (1670 ndash 2808)
075 Controle 204 1698 (1239 ndash 2924)
Proteiacutenadia (g) Caso 7355 3508 (5531 ndash 8905)
091 Controle 7285 4985 (4914 ndash 9849)
Fibra totaldia (g) Caso 168 902 (1247 ndash 1953)
027 Controle 1265 765 (944 ndash1699)
Fibra soluacuteveldia (g) Caso 4 332 (273 ndash 563)
029 Controle 285 23 (215 ndash 437)
Fibra insoluacuteveldia (g)
Caso 56 391 (404 ndash 703) 025
Controle 395 232 (338 ndash 562)
Colesteroldia (g) Caso 23635 13965 (17127 ndash 30877)
077 Controle 26105 26790 (12780 ndash 39313)
Vitamina Adia (UI) Caso 95885 55538 (70451 ndash 124904)
055 Controle 872 47033 (64231 ndash 110801)
Vitamina Cdia (mg) Caso 2105 18857 (11025 ndash 29152)
011 Controle 12035 8752 (7936 ndash 16565)
Vitamina B1dia (mg)
Caso 13 117 (131 ndash 204) 072
Controle 13 166 (104 ndash 260)
Vitamina B2dia (mg)
Caso 08 083 (107 ndash 174) 079
Controle 105 089 (103 ndash 193)
82
Tabela 12 ndash Anaacutelise de consumo de energia e nutrientes da populaccedilatildeo estudada Satildeo Paulo SP 2013-2014
(Continuaccedilatildeo)
Variaacuteveis Grupo Meacutedia
de consumo Desvio Padratildeo
IC 95 P
Vitamina B6dia (ug)
Caso 110 102 (121 ndash 197)
085 Controle 105 088 (110 ndash 197)
Vitamina B12dia (ug)
Caso 38 253 (309 ndash 562) 096
Controle 385 285 (302 ndash 578)
Vitamina Ddia (mg)
Caso 915 1620 (211 ndash 1803) 012
Controle 23 3357 (733 ndash 4061)
Niacinadia (mg)
Caso 19 1005 (1402 ndash 2191)
059 Controle 193
1303 (1339 ndash 2641)
Folatodia (mg)
Caso
24010
11621
(17758 ndash 28351) 054
Controle 20495 12117 (14708 ndash 26684)
Aacutecido pantotecircnicodia
(mg)
Caso 35 216 (292 ndash 443) 074
Controle 29 251 (220 ndash 469)
VitaminaEdia (mg)
Caso 1155 651 (894 ndash 1309) 079
Controle 99 625 (738 ndash 1368)
Iododia (mg) Caso 547 4984 (3206 ndash 8098)
049 Controle 4515 3674 (2814 ndash 6439)
Soacutediodia (mg) Caso 230285 159724 (155816 ndash 246261)
099 Controle 201715 148254 (127647 ndash 274446)
Caacutelciodia (mg) Caso 69045 42353 (47627 ndash 89502)
068 Controle 62645 33992 (46373 ndash 79973)
Magneacutesiodia (mg)
Caso 2325 10339 (17818 ndash 25995) 044
Controle 1947 9452 (14888 ndash 24255)
Zincodia (mg) Caso 85 523 (617 ndash 1115)
086 Controle 78 476 (603 ndash 1068)
Manganecircsdia (mg)
Caso 6 85 (206 ndash 1045) 064
Controle 1095 2019 (148 ndash 1446)
Potaacutessiodia (mg)
Caso 271955 117073 (208408 ndash 3131423) 029
Controle 220685 115874 (164415 ndash 279085)
Foacutesforodia (mg)
Caso 9754 44188 (73698 ndash 1151535) 086
Controle 9085 56939 (63379 ndash 119689)
83
Tabela 12 ndash Anaacutelise de consumo de energia e nutrientes da populaccedilatildeo estudada Satildeo Paulo SP 2013-2014
(Continuaccedilatildeo)
Variaacuteveis Grupo Meacutedia
de consumo Desvio Padratildeo
IC 95 P
Ferrodia (mg) Caso 137 859
(996 ndash 1538)
069
Controle 1145 616 (885 ndash 1492)
Cobredia (mg) Caso 1 0 917 (1 ndash 167)
090 Controle 085 109 (094 ndash 167)
Selecircniodia (ug) Caso 33475 21854 (23251 ndash 44777)
068 Controle 400 5844 (11179 ndash 69057)
Nota significacircncia estatiacutestica quando p-valor le 005
Tabela 13 ndash Comparaccedilatildeo das variaacuteveis dieteacuteticas relacionadas agraves razotildees de ingestatildeo e Valor Energeacutetico Total (VET) da populaccedilatildeo estudada Satildeo Paulo SP 2013-2014
Variaacuteveis Grupo Caso
Grupo controle
Energia (Kcal) 18571
1692
Kcalkgdia 199
279
Carboidrato (g) 24345
20785
Carboidrato (VET) 5241
4913
Proteiacutena (g) 7355
7285
Grama de proteiacutenakgdia
078
12
Proteiacutena (VET) 1584
1722
Lipiacutedeo (g) 658
627
Lipiacutedeo ( VET) 3188
3335
84
A partir de dados de meacutedia de ingestatildeo de macronutrientes comparou-se a
porcentagem que cada um deles carboidratos proteiacutenas e lipiacutedeos (Tabela 13)
representa no Valor Energeacutetico total (VET) ingerido com o intervalo de
balanceamento dieteacutetico proposto pelas Dietary References Intake (DRI) Assim
tem-se que os grupos caso e controle balancearam suas dietas conforme o intervalo
de distribuiccedilatildeo energeacutetica recomendado visualizado na figura 5 Em relaccedilatildeo ao
consumo de fibras foi observado que ambos os grupos apresentaram um consumo
inferior ao Adequate Intake (AI) com consumo de 168 e 1265 para os grupos
caso e controle respectivamente Em relaccedilatildeo ao consumo de lipiacutedios o consumo de
gordura saturada mostrou-se maior que os 7 recomendado pela Sociedade
Brasileira de Cardiologia (2007) em consonacircncia com a National Heart Lung e Blood
Institute dos Estados Unidos tanto no grupo caso quanto no grupo controle de
1058 e 1085 respectivamente
Figura 5 ndash Comparaccedilatildeo entre as meacutedias de consumo de macronutrientes dos Grupos Caso e Controle com a Faixa de Distribuiccedilatildeo Aceitaacutevel de macronutrientes (AMDRDRI) e AI (Adequate Intake) para a faixa etaacuteria de 20 a 70 anos Satildeo Paulo SP 2013-2014
Legenda ndash A recomendaccedilatildeo de consumo de macronutrientes para tal faixa etaacuteria eacute
para Carboidratos 45 a 65 do VET (Valor Energeacutetico Total) Proteiacutenas 10 a 35 do VET Lipiacutedeos 20 a 35 do VET e Fibras 21 a 26 gramasdia
85
A comparaccedilatildeo da meacutedia da ingestatildeo das vitaminas A C E e folato dos
grupos caso e controle com as recomendaccedilotildees de ingestatildeo mostrou que a meacutedia de
consumo dos grupos foi semelhante e de acordo com a recomendaccedilatildeo exceto para
folato e vitamina E em que ambos os grupos mostraram meacutedias de ingestatildeo abaixo
do recomendado (Figura 6)
Figura 6 ndash Comparaccedilatildeo entre as meacutedias de consumo das Vitaminas A C E e folato dos Grupos Caso e Controle com a Faixa de Distribuiccedilatildeo Aceitaacutevel de macronutrientes (AMDRDRI) e AI (Adequate Intake) para a faixa etaacuteria de 20 a 70 anos Satildeo Paulo SP 2013-2014
A comparaccedilatildeo da meacutedia das ingestotildees das Vitaminas B1 B2 B6 B12 D
Niacina e Aacutecido pantotecircnico dos grupos caso e controle com as recomendaccedilotildees de
ingestatildeo demonstrou que a meacutedia de consumo em relaccedilatildeo agraves vitaminas B1 e B12
estavam acima do recomendado nos dois grupos As vitaminas B6 e aacutecido
pantotecircnico apresentaram ingestatildeo inferior ao preconizado nos grupos caso e
controle Ambos os grupos estudados apresentaram consumo em concordacircncia com
as recomendaccedilotildees em relaccedilatildeo agrave niacina No entanto as vitaminas B2 e D
apresentaram consumo pelo grupo caso inferior enquanto o grupo controle
apresentou-se de acordo com a recomendaccedilatildeo (Figura 7)
86
Figura 7 ndash Comparaccedilatildeo entre as meacutedias de consumo das Vitaminas B1 B2 B6 B12 D Niacina e Aacutecido pantotecircnico dos Grupos Caso e Controle com a Faixa de Distribuiccedilatildeo Aceitaacutevel de macronutrientes (AMDRDRI)e AI (Adequate Intake) para a faixa etaacuteria de 20 a 70 anos Satildeo Paulo SP 2013-2014
Para os minerais foacutesforo e selecircnio a ingestatildeo dos grupos Caso e Controle
tambeacutem foi adequada Exceto para iodo caacutelcio e magneacutesio que tiveram a ingestatildeo
menor que a recomendaccedilatildeo e o cobre que apresentou uma ingestatildeo inferior ao
preconizado no grupo controle enquanto o grupo caso demonstrou uma ingestatildeo
adequada dentro dos limites de recomendaccedilatildeo (Figura 8)
87
Figura 8 ndash Comparaccedilatildeo entre as meacutedias de consumo de Sais Minerais dos Grupos Caso e Controle com a Faixa de Distribuiccedilatildeo Aceitaacutevel de macronutrientes (AMDRDRI)e AI (Adequate Intake) para a faixa etaacuteria de 20 a 70 anos Satildeo Paulo SP 2013-2014
Para os minerais e nutrientes soacutedio manganecircs e potaacutessio a ingestatildeo dos
grupos Caso e Controle foi adequada Exceto para ferro que apresentou ingestatildeo
menor que a recomendaccedilatildeo e o zinco que apresentou ingestatildeo um pouco inferior ao
preconizado no grupo controle enquanto o grupo caso demonstrou ingestatildeo
adequada dentro dos limites de recomendaccedilatildeo (Figura 9)
Figura 9 ndash Comparaccedilatildeo entre as meacutedias de consumo de Sais Minerais e outros nutrientes dos Grupos Caso e Controle com a Faixa de Distribuiccedilatildeo Aceitaacutevel de macronutrientes (AMDRDRI)e AI (Adequate Intake) para a faixa etaacuteria de 20 a 70 anos Satildeo Paulo SP 2013-2014
88
522 Avaliaccedilatildeo antropomeacutetrica do estado nutricional
Os resultados da avaliaccedilatildeo antropomeacutetrica estatildeo apresentados na tabela 14
Foi observado que as mulheres estudadas do grupo caso apresentaram meacutedia de
IMC (Iacutendice de massa corporal) de 365 kgm2 (DP 441 Amplitude 306-449) Ao
classificar as pacientes em classes de obesidade de acordo com os criteacuterios
determinados pela OMS (Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede) (1995) verificou-se que
nove (45) das mulheres apresentam obesidade grau I (IMC 30-3499 kgm2) sete
(35) apresentam obesidade grau II (IMC 35-3999 kgm2) e quatro (20) das
mulheres apresentam obesidade grau III (IMC ge 40 kgm2) As mulheres do grupo
controle apresentaram IMC meacutedio de 224 kgm2 (DP 204 Amplitude 188-249)
Em relaccedilatildeo ao percentual de gordura observou-se a meacutedia de 4535 (DP
518 Amplitude 354-534) de gordura corporal no grupo caso e 3004 (DP 671
Amplitude 113-404) no grupo controle indicando um excesso de gordura corporal
em ambos os grupos de acordo com LOHMAN (1992) Em relaccedilatildeo agrave essa
classificaccedilatildeo no grupo caso todas as mulheres apresentam riscos de doenccedilas
associadas agrave obesidade apresentando um percentual de gordura corporal maior que
32 Das mulheres do grupo controle 2 (10) apresentaram-se abaixo da meacutedia 1
(5) na meacutedia 8 (40) acima da meacutedia e 9 (45) apresentaram risco de
desenvolvimento de doenccedilas relacionadas com a obesidade
A avaliaccedilatildeo da Razatildeo cintura-quadril (RCQ) importante indicador de
obesidade central Comparando-se os resultados obtidos com o ponto de corte
recomendado pela OMS (Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede 1995) de 085 para
mulheres observou-se que todas as pacientes avaliadas do grupo caso apresentam-
se acima do recomendado com a meacutedia de RCQ de 099 (DP 0074 Amplitude
087-119) enquanto as mulheres do grupo controle apresentaram uma razatildeo meacutedia
de 083 (DP 0047 Amplitude 077-096) onde sete (35) mulheres apresentaram
a RCQ acima do valor referecircncia preconizado pela OMS No entanto ao avaliar a
Razatildeo cintura quadril de acordo com os pontos de corte propostos por LOHMAN et
al (1988) em relaccedilatildeo ao risco de desenvolvimento de doenccedilas associadas agrave
Siacutendrome Metaboacutelica (Doenccedilas cardiovasculares hipertensatildeo dislipidemia e
alteraccedilatildeo no metabolismo de carboidratos) os resultados demonstraram que em
relaccedilatildeo ao grupo caso 18 (90) das mulheres apresentaram alto risco para o
desenvolvimento dessas doenccedilas enquanto 2 (10) apresentaram risco moderado
89
Em relaccedilatildeo ao grupo controle foi observado que 3 (15) natildeo apresentaram riscos
13 (65) apresentaram baixo risco 1(5) apresentou risco moderado e 3 (15)
apresentaram alto risco para o desenvolvimento dessas doenccedilas
Tabela 14 ndash Comparaccedilatildeo de variaacuteveis antropomeacutetricas da populaccedilatildeo estudada
Variaacuteveis Grupo Meacutedia
Desvio Padratildeo
Miacutenimo Maacuteximo
Peso (kg) Caso 9329 105 7574 1075
Controle 6054 787 4575 7422
Estatura (m2) Caso 160 007 149 172
Controle 164 007 151 18
IMC (Kgm2) Caso 3645 452 306 449
Controle 2241 204 188 249
Razatildeo cintura-quadril (RCQ)
Caso 099 007 088 119
Controle 083 005 077 096
Gordura corporal total
()
Caso
4535
519
354
531
Controle
30035
671
113 404
90
53 Determinaccedilatildeo da microbiota intestinal
531 Padronizaccedilatildeo de reaccedilatildeo de PCR quantitativo (qPCR) por meio de TaqMan para a detecccedilatildeo de Mollicutes
Pela qPCR quantificou-se carga de Mollicutes representadas por unidades
formadoras de colocircnias (UFCmicrol) nas amostras de fezes O ensaio de qPCR
demonstrou eficiecircncia de reaccedilatildeo de E= 1033 (r2= 095) A sensibilidade do teste
foi de detecccedilatildeo de no miacutenimo dez coacutepias de genomareaccedilatildeo quando utilizados os
padrotildees de nuacutemero de coacutepias de DNA genocircmico diluiacutedo (Figura 10)
Figura 10 ndash Curva-padratildeo gerada a partir dos pontos de Ct obtidos com o graacutefico de amplificaccedilatildeo de diluiccedilotildees seriadas do controle positivo Mycoplasma hominis calculado pelo software StepOne 21 (Applied Biosystems Life Technologies Corporation) Satildeo Paulo SP 2013-2014
A repetibilidade testada por meio dos testes intra-ensaio e inter-ensaio da
qPCR estaacute apresentada na tabela 15 O ensaio foi especiacutefico para Mollicutes natildeo
tendo sido visualizada amplificaccedilatildeo dos controles microbianos de outros micro-
organismos utilizados
91
Tabela 15 ndash Repetibilidade intra-ensaio e inter-ensaio da qPCR para Mollicutes Satildeo Paulo SP 2013-2014
Nordm de coacutepias do Genoma
Repetibilidade intra-ensaio Repetibilidade inter-ensaio
Genoma bacteriano diluiacutedo
em 1times TE Genoma bacteriano diluiacutedo
em 1times TE
Ponto meacutedio de corte
(Ct plusmn SD) CV ()
Ponto meacutedio de corte (Ct plusmn SD)
CV ()
10 3537 plusmn 015 045 3494 plusmn 045 129
102 3425 plusmn 017 050 3379plusmn 029 087
103 3099 plusmn 021 070 3074 plusmn 039 128
104 2739 plusmn 023 084 2739 plusmn 038 142
105 2356 plusmn 012 054 2291plusmn 025 110
106 1874 plusmn 066 352 1915 plusmn 077 403
CV coeficiente de variaccedilatildeo
A PCR geneacuterica para Mollicutes foi positiva em 17 (85) das amostras
cliacutenicas do grupo caso e 8 (40) das amostras do grupo controle obtidas No
entanto nem todas as amostras positivas em cPCR para Mollicutes foram positivas
em qPCR 13 (65) das amostras do grupo caso e trecircs (15) do grupo controle
foram positivas em qPCR (Tabela 16)
Tabela 16 ndash Comparaccedilatildeo entre os resultados obtidos no teste de sensibilidade pelas teacutecnicas de PCR convencional e qPCR para detecccedilatildeo de Mollicutes Satildeo Paulo SP 2013-2014
Amostra
Grupo PCR convencional qPCR
n () n ()
Positivaa Caso 17 (85) 13 (65) Negativab 3 (15) 7 (35)
Positivaa
Negativab Controle 8 (40)
12 (60) 3 (15) 17 (85)
Nota n= 20 mulheres aPositiva - Detecccedilatildeo de produto de DNA esperado bNegativa - Ausecircncia de produto de DNA esperado
92
Por meio da PCR em tempo real foi possiacutevel quantificar o DNA e
consequentemente a carga do microrganismo representada por unidades
formadoras de colocircnias - ufcmicrol nas amostras de fezes coletadas Os resultados da
qPCR demonstraram uma carga meacutedia de Mollicutes nas amostras de fezes
analisadas referentes ao grupo caso de 584 x 103 ufcmicrol e de 156 ufcmicrol referentes
ao grupo controle Observa-se na figura 11 graacutefico de dispersatildeo referente agraves
cargas meacutedias das amostras positivas com detecccedilotildees de aproximadamente 101 a
103 UFCml de Mollicutes Contudo as meacutedias das dosagens foram maiores nas
mulheres do grupo caso E apoacutes anaacutelise estatiacutestica por Mann-Whitney foi possiacutevel
observar diferenccedila estatisticamente significante para a espeacutecie Mollicutes (p =
00023) Em seguida foi testada atraveacutes do teste de Odds Ratio a associaccedilatildeo
epidemioloacutegica entre as variaacuteveis desfecho (mulheres obesas x mulheres eutroacuteficas)
e as variaacuteveis Mollicutes (presenccedila x ausecircncia) tendo sido detectada uma
associaccedilatildeo positiva estatisticamente significante entre a presenccedila de Mollicutes e
mulheres obesas (OR= 115 IC= 242-554) Aleacutem disso ao realizar-se o teste t
comparando as meacutedias de consumo dos macronutrientes carboidratos proteiacutenas
lipiacutedios e fibras com as variaacuteveis Mollicutes (presenccedila x ausecircncia) natildeo foram
observadas associaccedilotildees estatisticamente significantes
Figura 11 - Quantificaccedilatildeo por qPCR de Mollicutes (UFCmicrol) a partir das amostras de fezes nos grupos caso e controle Satildeo Paulo SP 2013-2014
Legenda ndash Concentraccedilatildeo meacutedia de Mollicutes entre as mulheres do grupo caso (~584 x 103 UFC
microL) e controle (~156 UFC microL) estudadas e positivas para Mollicutes pelo qPCR (p-valor=00023)
Mediana e desvio padratildeo indicadas por linhas soacutelidas no graacutefico Anaacutelise estatiacutestica realizada por
Mann Whitney assumindo p-valor le 005
93
532 Detecccedilatildeo de micro-organismos dos filos Firmicutes e Bacteroidetes aleacutem de bacteacuterias totais (Eubacterias) por PCR em tempo Real (qPCR)
Todas as amostras 40 (100) foram positivas para Firmicutes e Bacteroidetes
na qPCR tanto para o grupo caso como para o controle Natildeo foram observadas
diferenccedilas estatisticamente significantes para as cargas de Firmicutes Bacteroidetes
e Bacteacuterias totais entre as mulheres do grupo caso e controle No entanto as cargas
meacutedias de Firmicutes e Eubacteacuterias no grupo caso foram maiores que no grupo
controle enquanto Bacteroidetes apresentou uma maior carga no grupo controle A
figura 12 representa os graacuteficos de dispersatildeo referentes agraves cargas meacutedias das
amostras de fezes para esses micro-organismos
Figura 12 - Quantificaccedilatildeo por qPCR de Firmicutes Bacteroidetes e Eubacterias (UFCmicrol) a partir das amostras de fezes nos grupos caso e controle Satildeo Paulo SP 2013-2014
Legenda ndash (a) Concentraccedilatildeo de Firmicutes (UFCmicroL) entre as mulheres do grupo caso (~869 x 1018 UFCmicrol) e controle (~504 x 1014 UFCmicrol) (b) Concentraccedilatildeo de Bacteroidetes (UFCmicroL) entre as mulheres do grupo caso (~879 x 108 UFCmicrol) e controle (~146 x 109 UFCmicrol) (c) Concentraccedilatildeo de Eubacterias (UFCmicroL) entre as mulheres do grupo caso (~731 x 1024 UFCmicrol) e controle (~619 x 1021 UFCmicrol) Mediana e amplitude interquartiacutelica indicadas por linhas soacutelidas no graacutefico Anaacutelise estatiacutestica realizada por Mann Whitney assumindo p-valor le 005
94
Com o intuito de verificar o percentual de micro-organismos da classe
Mollicutes frente agrave carga meacutedia de Firmicutes foi realizada a anaacutelise do percentual
meacutedio dos referidos micro-organismos onde verificou-se que Mollicutes representam
424 do nuacutemero meacutedio de Firmicutes detectados na qPCR especiacutefica para o
mesmo nas amostras analisadas no grupo caso e 25 x 10-4 no grupo controle
(Tabela 17)
Tabela 17 ndash Nuacutemero meacutedio de coacutepias e percentual dos grupos Mollicutes estudados frente ao Filo Firmicutes na populaccedilatildeo estudada Satildeo Paulo SP 2013-2014
Nota Meacutedia de coacutepiasgrama de fezes Percentual de coacutepias de Mollicutes em relaccedilatildeo ao Filo Firmicutes
Os resultados da qPCR demonstraram carga meacutedia de Bacteacuterias totais
(Eubacteacuterias) nas amostras de fezes analisadas do grupo caso (~731 x 1024 UFCmicrol)
e controle (~619 x 1021 UFCmicrol) As anaacutelises de percentual entre a carga meacutedia de
Bacteroidetes Firmicutes e Mollicutes e a carga meacutedia de bacteacuterias totais estatildeo
representadas na Tabela 18
Grupo Firmicutes Mollicutes
Meacutedia coacutepias g de fezes
Meacutedia coacutepias g de fezes
Caso 869x1018
584x103
424
Controle 504x1014
16
25x10-4
95
Tabela 18 ndash Nuacutemero meacutedio de coacutepias e percentual dos grupos de bacterianos estudados frente agraves bacteacuterias totais na populaccedilatildeo estudada Satildeo Paulo SP 2013-2014
Nota Meacutedia de coacutepiasgrama de fezes Percentual de coacutepias de cada bacteacuteria em relaccedilatildeo agraves bacteacuterias totais
Foi calculada a proporccedilatildeo de Firmicutes em relaccedilatildeo aos Bacteroidetes na
microbiota intestinal das mulheres estudadas tendo sido observada maior proporccedilatildeo
na microbiota intestinal das mulheres obesas em relaccedilatildeo agraves eutroacuteficas do grupo
controle (Tabela 19) A relaccedilatildeo entre o percentual de Firmicutes e Bacteroidetes na
microbiota intestinal das mulheres do grupo caso foi cerca de 29 x 107 maior entre
as mulheres obesas do grupo caso em comparaccedilatildeo com o grupo controle
Tabela 19 ndash Proporccedilatildeo de Firmicutes em relaccedilatildeo agrave Bacteroidetes na populaccedilatildeo estudada Satildeo Paulo SP 2013-2014
Nota Meacutedia de coacutepiasgrama de fezes
Grupo Bacteacuterias totais
Firmicutes Bacteroidetes Mollicutes
Meacutedia coacutepias g de fezes
Meacutedia coacutepias g de
fezes
Meacutedia coacutepias g de
fezes
Meacutedia coacutepias g de fezes
Caso 731x 1024
869x1018
442x105
879x108
718x10-2
584x103
28x 10-2
Controle 619x 1021
504x1014
171x105
146x109
624x102 16
22x10-11
Grupo Firmicutes Bacteroidetes Proporccedilatildeo FirmicutesBacteroidetes
Meacutedia coacutepias g de fezes
Meacutedia coacutepias g de fezes
Meacutedia coacutepias g de fezes
Caso 869x1018 879x108
134x1013
Controle 504x1014
146x109
45x 105
96
54 Dosagem de citocinas do soro sanguiacuteneo
Ao serem quantificadas as citocinas IL-1β IL-10 IL17-A e TNF-α pela
teacutecnica de ELISA no plasma sanguiacuteneo das mulheres natildeo foi observada diferenccedila
estatisticamente significante entre os grupos caso e controle para nenhuma das
citocinas avaliadas IL-1β (p= 02249) IL-10 (p=1) IL17-A (p=03169) e TNF-α
(p=02235) (Figura 13)
Figura 13 ndash Quantificaccedilatildeo de IL-1β IL-10 IL17-A e TNF-α (pgmL) no plasma sanguiacuteneo por meio do ELISA nos grupos caso e controle da populaccedilatildeo estudada Satildeo Paulo SP 2013-2014
Legenda- (a) Concentraccedilatildeo de IL-1β (pgml) no plasma sanguiacuteneo das mulheres casos e controles (b) Concentraccedilatildeo de IL-10 (pgml) no plasma sanguiacuteneo das mulheres casos e controles (c) Concentraccedilatildeo de TNF-α (pgml) no plasma sanguiacuteneo das mulheres casos e controles (d) Concentraccedilatildeo de IL17-A (pgml) no plasma sanguiacuteneo das mulheres casos e controles Desvio padratildeo e meacutedia indicados por linhas soacutelidas no graacutefico Anaacutelise estatiacutestica por Mann Whitney p lt 005
97
6 DISCUSSAtildeO
A microbiota intestinal eacute um ecossistema complexo que desempenha um
importante papel na gecircnese da obesidade associada com o desenvolvimento das
respostas imunoloacutegicas aleacutem do estado nutricional do hospedeiro Projetos
mundiais de pesquisa estatildeo em desenvolvimento para compreender esta
complexidade microbiana na sauacutede humana (SHETTY et al 2013) O presente
estudo avaliou a participaccedilatildeo dos micro-organismos da Classe Mollicutes e dos Filos
Firmicutes e Bacteroidetes na microbiota intestinal de mulheres obesas e eutroacuteficas
Na diversidade das populaccedilotildees humanas e a ocorrecircncia da obesidade eacute
importante estudar a distribuiccedilatildeo da microbiota intestinal fazendo-se necessaacuterio e
imprescindiacutevel a caracterizaccedilatildeo da populaccedilatildeo estudada em relaccedilatildeo agrave preditores
importantes associados com a obesidade microbiota intestinal e ambiente
(KALLIOMAKI et al 2008 PENDERS et al 2006) No presente estudo observou-
se variaccedilatildeo estatiacutestica em relaccedilatildeo agrave variaacutevel gestaccedilatildeo onde 14 (70) das mulheres
do grupo caso e 2 (10) do controle relataram jaacute terem tido filhos Aagaard et al
(2012) verificaram que o microbioma era semelhante em mulheres gravidas ou natildeo
No entanto as mulheres graacutevidas apresentaram microbioma menos diversificado
Sugeriu-se que entre as mulheres em idade reprodutiva o microbioma permanece
como uma comunidade dinacircmica na vida reprodutiva do adulto e que a estrutura da
comunidade natildeo-graacutevida pode retornar em alguma medida nas uacuteltimas semanas de
gestaccedilatildeo Aleacutem disso alguns autores tecircm sugerido que o acuacutemulo de gordura
corporal na obesidade pode acarretar vaacuterias consequecircncias agrave sauacutede como diabetes
mellitus tipo 2 hipertensatildeo arterial dispneacuteia cacircncer dislipidemia doenccedilas
cardiacuteacas doenccedilas hepatobiliares osteoartrite alteraccedilotildees gastrintestinais e
distuacuterbios psicossociais o que corrobora com os achados em relaccedilatildeo agrave histoacuteria
cliacutenica das mulheres estudadas (FRANCISCHI et al 2000 PEREIRA et al 2003
SILVA 2005)
Para as mulheres em especial a menopausa tem sido associada como
colaboradora para o desenvolvimento de obesidade e acuacutemulo de gordura corporal
(SOWERS et al 2007) No presente estudo encontraram-se diferenccedilas estatiacutesticas
em relaccedilatildeo agrave variaacutevel menopausa onde 9 (45) das mulheres obesas do grupo
caso e 3 (15) das mulheres do grupo controle relataram ter entrado na
98
menopausa Entretanto Sternfeld et al (2004) em estudo de coorte feminina entre
42-52 anos de idade nos EUA natildeo encontraram associaccedilatildeo entre a menopausa e o
aumento de circunferecircncia da cintura bem como aumento do peso dessa forma
sugerindo que somente um fator pode natildeo ser o responsaacutevel pelo desenvolvimento
de obesidade No presente trabalho observou-se que 75 das mulheres do grupo
caso e 50 do grupo controle nasceram de parto normal Tem sido evidenciado na
literatura que o tipo de parto pode interferir na composiccedilatildeo da microbiota pela forma
de colonizaccedilatildeo do receacutem-nascido O parto via cesariana aumentaria o risco de
obesidade em relaccedilatildeo ao parto normal (HUH et al 2012 PEI et al 2014) Nesse
sentido Ajslev et al (2011) em estudo longitudinal prospectivo na infacircncia com
acompanhamento ateacute os sete anos observaram que uma combinaccedilatildeo de
exposiccedilotildees precoces que inclui o tipo de parto o IMC maternal preacute-gestacional e
uso de antibioacuteticos na primeira infacircncia (lt6 meses) influenciaram o risco de excesso
de peso
Existem diversos estudos em relaccedilatildeo aos fatores dieteacuteticos e a gecircnese da
obesidade (DAILEY 2014 ISOMAA et al 2001 MORENO-INDIAS et al 2014
PEREIRA et al 2002 ROMERO ZANESCO 2006 SANTOS et al 2006) No
entanto no presente estudo o valor energeacutetico encontrado em relaccedilatildeo ao grupo
caso ao analisar-se a razatildeo quilocaloriasquilograma de peso corporal foi inferior agrave
recomendaccedilatildeo caracterizando alimentaccedilatildeo insuficiente em energia (WHO 2003)
Da mesma maneira que no presente estudo Pereira et al (2012) natildeo encontraram
diferenccedilas significativas entre o consumo energeacutetico entre indiviacuteduos eutroacuteficos e
obesos Souza et al (2010) estudaram a ingestatildeo alimentar e balanccedilo energeacutetico da
populaccedilatildeo adulta de Niteroacutei- RJ e encontraram que a ingestatildeo energeacutetica mostrou-
se decrescente com o aumento do IMC para as mulheres A ingestatildeo energeacutetica em
menor quantidade parece indicar que embora o corpo esteja obeso os tecidos vitais
satildeo inadequadamente nutridos pois a alimentaccedilatildeo insuficiente fornece poucos
nutrientes (HUTSON et al 1965) Sawaya et al (2003) em estudo com mulheres
realizado em Maceioacute tambeacutem observaram que a ingestatildeo energeacutetica entre os
grupos eutroacutefico e obesos natildeo apresentou diferenccedila significativa Em outro estudo
com mulheres no Rio Grande do Sul tambeacutem foi verificado que o consumo alimentar
energeacutetico natildeo apresentou diferenccedila significativa (p=0157) entre os grupos (baixo
peso eutroacutefico e excesso de pesoobesidade) (FRANKE et al 2007) Com isto
99
provavelmente a ingestatildeo energeacutetica natildeo seja a causa da obesidade nas mulheres
estudadas sendo que a baixa ingestatildeo aliada a algumas deficiecircncias nutricionais e
predisposiccedilatildeo geneacutetica possa criar mecanismos de adaptaccedilatildeo levando a um ciclo
metaboacutelico cujo o desfecho seja o armazenamento de gordura na regiatildeo abdominal
(BALAMURUGAN et al 2010 CANI DELZENNE 2009 DAVID et al 2014
HANSON et al 2009 JIMENEZ MARTIN-MORENO 1995) Nesse contexto
devem ser considerados outros fatores de economia energeacutetica tais como o
desequiliacutebrio na microbiota intestinal aleacutem da adaptaccedilatildeo dos mecanismos de
consumo energeacutetico acarretando maior rendimento das calorias absorvidas
BALAMURUGAN et al 2010 CANI DELZENNE 2009 DAVID et al 2014
DEWULF et al 2013 DIBAISE FRANK MATHUR 2012 FRANKE 2007 GRAF et
al 2015 KOENIGA et al 2011 LE CHATELIER et al 2013 LEY et al 2006
PATIL et al 2012 RAOULT 2008 SAWAYA et al 2003 WICHMANN et al
2013)
Analisando a contribuiccedilatildeo do consumo dos macronutrientes e das fibras os
resultados do presente estudo demonstraram que este consumo estaacute dentro dos
criteacuterios exceto para o consumo de fibras que foi abaixo da recomendaccedilatildeo em
ambos os grupos Aleacutem disso comparando-se as meacutedias de consumo dos
macronutrientes e das fibras com as variaacuteveis desfecho (obesas x eutroacuteficas)
tambeacutem natildeo houve associaccedilotildees estatisticamente significantes Em Satildeo Paulo
observou-se que 295 dos indiviacuteduos entrevistados relataram ingestatildeo inferior agraves
necessidades fisioloacutegicas dos quais 58 eram indiviacuteduos obesos (SALVO
GIMENO 2002) Em outro estudo realizado com trabalhadores adultos de ambos os
sexos tambeacutem no Estado de Satildeo Paulo para avaliaccedilatildeo da ingestatildeo alimentar e
consumo de fibras dieteacuteticas foi encontrado que o consumo individual de fibras
dieteacuteticas diaacuteria variou 587 g a 2957 g sendo o consumo meacutedio da populaccedilatildeo
1461 g (PASSOS SHEID 2008) Fisberg et al (2009) em estudo realizado sobre
iacutendice de qualidade da dieta observaram padratildeo dieteacutetico com alto conteuacutedo de
gorduras totais colesterol e accediluacutecar refinado e com baixo teor de fibra alimentar
Estes resultados diferem em parte do padratildeo alimentar da populaccedilatildeo estudada no
entanto demonstra a necessidade de estiacutemulo ao maior consumo de alimentos ricos
em fibra
100
A partir dos resultados do estudo evidencia-se a adequaccedilatildeo comprometida
na alimentaccedilatildeo devido agrave elevada ingestatildeo de lipiacutedios (gordura saturada) e ingestatildeo
reduzida de fibras em ambos os grupos estudados contribuindo tanto para a
obesidade quanto em relaccedilatildeo ao acuacutemulo de tecido adiposo nas mulheres obesas e
eutroacuteficas Esses dados estatildeo em conformidade com o presente estudo em relaccedilatildeo
agraves variaacuteveis antropomeacutetricas analisadas Percentual de gordura corporal e Razatildeo
cintura-quadril onde ambos os grupos se apresentaram acima da meacutedia referecircncia
indicando excesso de gordura corporal Assim como no presente estudo outros
trabalhos tecircm demonstrado limitaccedilotildees e evidenciado que natildeo existe correlaccedilatildeo
precisa entre o IMC e o porcentual de gordura corpoacuterea Isso explica o fato de
indiviacuteduos que apresentam IMC dentro do padratildeo de normalidade mas possuem
uma quantidade de gordura corporal acima do ideal confirmando relatos de que o
IMC natildeo eacute um bom indicador quantitativo de adiposidade corporal e que pode
subestimar o percentual de gordura e classificando de forma errocircnea indiviacuteduos com
excesso de adiposidade (COSTA et al 2007 GLANER 2005) Dessa forma o
aumento de gordura corporal principalmente na regiatildeo abdominal pode tornar a
utilizaccedilatildeo do IMC cada vez mais limitada na avaliaccedilatildeo do estado nutricional jaacute que
indiviacuteduos com sobrepeso ou ateacute mesmo eutroacuteficos podem apresentar risco de
alteraccedilotildees metaboacutelicas devido a valores elevados de circunferecircncia da cintura
(REZENDE 2010) Aleacutem disso nossos resultados evidenciaram valores elevados
para RCQ o que pode explicar a porcentagem de algumas moleacutestias atuais
associadas agrave obesidade encontradas em ambos os grupos no presente trabalho
(OMS 2002 DAcircMASO BERNARDES 2003 OCHS-BALCOM et al 2006)
Diversos estudos tambeacutem contribuiacuteram na melhor compreensatildeo entre as
influecircncias da nutriccedilatildeo e da composiccedilatildeo corporal na composiccedilatildeo da microbiota
intestinal (BALAMURUGAN et al 2010 DAVID et al 2014 DEWULF et al 2013
GRAF et al 2015 WICHMANN et al 2013) No entanto pouco se conhece sobre a
participaccedilatildeo dos micro-organismos da classe Mollicutes na microbiota
principalmente quando associadas com fatores dieteacuteticos e antropomeacutetricos
Constatou-se no presente estudo diferenccedila estatisticamente significante para micro-
organismos da classe dos Mollicutes (p = 00023) Foi detectada associaccedilatildeo
estatisticamente significante entre a presenccedila de Mollicutes e mulheres obesas
(OR= 115 IC= 242-554) Nesse contexto Turnbaugh et al (2008) avaliaram a
101
microbiota de modelos experimentais de ratos geneticamente idecircnticos de
obesidade induzida pelo consumo de dieta ocidentalizada caracterizada por alto teor
de gordura e accediluacutecar Todos os animais herdaram uma microbiota semelhante e no
estado de obesidade observou-se maior crescimento da bacteacuteria Eubacterium
dolichum (membro da classe Mollicutes) que foram posteriormente reduzidos por
subsequentes manipulaccedilotildees dieteacuteticas para limitar o ganho de peso Ainda neste
estudo observou-se que a abundacircncia da classe dos Mollicutes foi acompanhada
pela supressatildeo de toda a divisatildeo de Bacteroidetes indicando que a classe
Mollicutes teve aptidatildeo aumentada em relaccedilatildeo a Firmicutes e todos os outros
Bacteroidetes identificados na populaccedilatildeo estudada Os autores observaram que os
molicutes evoluiacuteram a capacidade para importar o tipo de hidratos de carbono
encontradas na dieta ocidental administrada nos modelos experimentais estando
essas vantagens principalmente relacionadas com o Sistema fosfotransferase (PTS)
De acordo com Deutscher et al (2006) o PTS desempenha um papel na regulaccedilatildeo
da expressatildeo do gene microbiano atraveacutes da repressatildeo cataboacutelica permitindo que a
ceacutelula passe a utilizar preferencialmente accediluacutecares simples em relaccedilatildeo a outros
hidratos de carbono Anaacutelises de fragmentos do gene 16S rRNA dos dados de
metagenocircmica confirmaram a presenccedila dos molicutes no microbioma cecal quando
associados agrave uma dieta ocidental Em contrapartida Hildebrandt et al (2009) por
meio de metagenocircmica de fezes de camundongos magros inicialmente submetidos
a dieta de raccedilatildeo padratildeo com posterior mudanccedila para dieta rica em gordura natildeo
relataram encontrar molicutes em dieta de alto teor de gordura
No presente estudo ao se comparar as meacutedias de consumo dos
macronutrientes carboidratos proteiacutenas lipiacutedios e fibras com as variaacuteveis Mollicutes
(presenccedila x ausecircncia) natildeo foram observadas associaccedilotildees estatisticamente
significantes No entanto foi observado alto consumo de gorduras saturadas nas
mulheres estudadas com diferenccedila estatisticamente significante entre a quantidade
de molicutes na microbiota intestinal Esses resultados associados com as
evidecircncias encontradas na literatura acerca da participaccedilatildeo desses micro-
organismos na microbiota de pessoas obesas fornecem importantes evidecircncias de
que natildeo apenas o consumo alimentar e o percentual de gordura ingerida possam
influenciar o aumento de molicutes na microbiota intestinal Mas que esse aumento
tambeacutem pode estar associado ao possiacutevel enriquecimento de rotas metaboacutelicas
102
envolvidas na utilizaccedilatildeo de accediluacutecares simples relacionadas ao sistema PTS Aleacutem
disso tem sido evidenciado na literatura que em experimentos com animais germ-
free o consumo de uma dieta obesogecircnica parece natildeo estimular o desenvolvimento
da obesidade e que sucessivas manipulaccedilotildees dieteacuteticas para limitar o ganho de
peso possivelmente promovam subsequentes variaccedilotildees em relaccedilatildeo agrave populaccedilatildeo
microbiana na microbiota intestinal (GOODMAN et al 2011 TURNBAUGH et al
2009 WALKER et al 2011 YI LI 2012) Este achado foi sustentado por um estudo
recente em camundongos que mostrou que a composiccedilatildeo microbiana do intestino
natildeo eacute determinada apenas pela dieta atual mas tambeacutem em parte pela histoacuteria
dieteacutetica Aleacutem disso um estudo em seres humanos concluiu que a mudanccedila no
padratildeo de consumo de fibras pode produzir fortes mudanccedilas na microbiota
intestinal mas que estas dependem da composiccedilatildeo inicial da microbiota intestinal do
indiviacuteduo (AAFKE et al 2015 CARMODY et al 2015)
Estudos recentes tecircm demonstrado que a microbiota intestinal humana pode
estar alterada em indiviacuteduos obesos Nesse contexto tem sido amplamente
discutida a participaccedilatildeo dos filos Firmicutes e Bacteroidetes na microbiota desses
indiviacuteduos Aleacutem disso tem sido evidenciado que o filo Firmicutes representam mais
de 90 das categorias filogeneacuteticas conhecidas dominando a microbiota distal
Nesse sentido a obesidade estaacute associada com as diferenccedilas da microbiota
intestinal em niacutevel filo com menor diversidade geral e maior proporccedilatildeo relativa de
Firmicutes em relaccedilatildeo agrave Bacteroidetes em indiviacuteduos obesos em comparaccedilatildeo com
indiviacuteduos eutroacuteficos (ECKBURG et al 2005 LEY et al 2006 MORAN
SHANAHAN 2014 TURNBAUGH et al 2009) Nesse contexto os resultados do
presente estudo demonstraram que a relaccedilatildeo entre o percentual de Firmicutes e
Bacteroidetes na microbiota intestinal das mulheres do grupo caso foi cerca de 29x
107 maior entre as mulheres obesas em comparaccedilatildeo com o grupo controle
Estudos demonstraram que a relaccedilatildeo entre percentual de Firmicutes e Bacteroidetes
na microbiota intestinal eacute de cerca de 7020 para os natildeo obesos e ateacute 855 para os
obesos O que significa cerca de cinco vezes maior em obesos em comparaccedilatildeo com
natildeo obesos (BALAMURUGAN et al 2010 ECKBURG et al 2005 KOENIGA et al
2011 LE CHATELIER et al 2013 PATIL et al 2012) Os nossos achados estatildeo
em conformidade com alguns resultados da literatura Em estudo realizado por
Ridaura et al (2013) transplantaram-se micro-organismos intestinais de humanos
103
obesos e eutroacuteficos em intestinos de ratos com peso meacutedio Aqueles que receberam
a microbiota de humanos obesos tornaram-se ratos obesos e aqueles que
receberam microbiota de humanos magros permaneceram magros Outro estudo
realizado por Remely et al (2015) que tambeacutem investigaram atraveacutes de qPCR a
microbiota de humanos obesos durante a intervenccedilatildeo dieteacutetica para perda de peso
induzida observaram diminuiccedilatildeo na proporccedilatildeo de FirmicutesBacteroidetes nos
obesos apoacutes a intervenccedilatildeo dieteacutetica
A proporccedilatildeo FirmicutesBacteroidetes tem sido associada como um marcador
de sauacutede para um indiviacuteduo e um desequiliacutebrio nesta proporccedilatildeo estaacute associada com
diferentes doenccedilas (MARIAT et al 2009) A mudanccedila na abundacircncia relativa destes
filos resulta no aumento da capacidade de captaccedilatildeo de energia a partir dos
alimentos aleacutem de induzir a inflamaccedilatildeo de baixo grau A reduccedilatildeo de Bacteroidetes
tem sido relacionada com dieta rica em gordura que pode resultar em aumento dos
niacuteveis plasmaacuteticos de LPS (CANI et al 2007 EVERARD CANI 2013) enquanto o
aumento Firmicutes tem sido associado com o consumo de carnes (EVERARD
CANI 2013) Aleacutem disso vaacuterios estudos tecircm mostrado mudanccedila da relaccedilatildeo de
FirmicutesBacteroidetes em pessoas obesas durante intervenccedilotildees dieteacuteticas para
perda de peso corporal sugerindo que as mudanccedilas na concentraccedilatildeo de bacteacuterias
nos indiviacuteduos obesos podem ser revertidas depois da perda de peso induzida por
dieta fazendo com que a microbiota do indiviacuteduo obeso se assemelhe ao indiviacuteduo
eutroacutefico (CLEMENTE et al 2012 DEWULF et al 2013 DIBAISE et al 2012
REMELY et al 2013 2015) Em contrapartida estes resultados natildeo satildeo universais
outros estudos demonstraram padrotildees variaacuteveis em mudanccedilas de niacutevel de filo
medidos na composiccedilatildeo da microbiota de indiviacuteduos obesos (MORAN SHANAHAN
2014 SCHWIERTZ et al 2010 ZHANG et al 2009) Duncan et al (2008) avaliaram
a relaccedilatildeo entre IMC perda de peso e a predominacircncia de grupos de bacteacuterias em
amostras fecais de pessoas obesas e natildeo obesas Estes indiviacuteduos foram
submetidos a duas dietas para perda de peso por quatro semanas Natildeo foi
encontrada diferenccedila entre Bacteroidetes nas amostras entre indiviacuteduos obesos e
natildeo obesos No entanto houve reduccedilotildees no grupo de Firmicutes em obesos
submetidos a dietas hipocaloacutericas Em outro estudo realizado por Schwiertz et al
(2010) tambeacutem natildeo foram observadas diferenccedilas nas contagens de Bacteroidetes e
Firmicutes entre os grupos de estudo Xiao et al (2014) em estudo com intervenccedilatildeo
104
dieteacutetica baseada em gratildeos integrais onde analisaram a microbiota intestinal de 123
voluntaacuterios obesos antes e depois da intervenccedilatildeo de 9 semanas seguida por um
periacuteodo de manutenccedilatildeo de 14 semanas tambeacutem natildeo observaram alteraccedilotildees
significativas na abundacircncia de Bacteroidetes e Firmicutes ou na proporccedilatildeo destes
dois filos durante a intervenccedilatildeo dieteacutetica mesmo quando os voluntaacuterios perderam
uma quantidade significativa de peso Estudos recentes do Projeto Microbioma
Humano natildeo encontraram associaccedilatildeo entre a proporccedilatildeo FirmicutesBacteroidetes e
obesidade ou Iacutendice de Massa Corporal (IMC) Nesse sentido tem sido sugerido por
alguns autores que a utilizaccedilatildeo dessa relaccedilatildeo como um biomarcador para a
obesidade permanece incerto devido a variabilidade dos dados na literatura
(FINUCANE et al 2014 MURPHY et al 2010)
Recentemente tem sido proposta uma nova hipoacutetese que associa a
microbiota intestinal com a homeostase metaboacutelica demonstrando-a como uma das
fontes potenciais de inflamaccedilatildeo de baixo grau (ARAKI et al 2005 OKAYASU et al
1990 RAKOFF-NAHOUM 2004 XIAO et al 2014 ZHAO 2013) Nesse contexto
tem sido demonstrado que dietas com alto teor de gordura tambeacutem podem aumentar
as concentraccedilotildees de LPS no plasma de humanos Estudo realizado por Cani et al
(2007) mostrou em camundongos que o maior consumo de gordura levou ao maior
aumento nas concentraccedilotildees de LPS no plasma A absorccedilatildeo de LPS reforccedilada pela
alta ingestatildeo de gordura pode estimular a secreccedilatildeo das citocinas TNF-α e IL-6
resultando em inflamaccedilatildeo sistecircmica de baixo grau dessa forma a microbiota
intestinal pode ter papel ativo na promoccedilatildeo eou inibiccedilatildeo da inflamaccedilatildeo e portanto
um efeito no metabolismo lipiacutedico (FLOCK GREEN KRIS-ETHERTON 2011) Os
resultados do presente estudo natildeo demonstraram diferenccedilas estatisticamente
significantes entre os grupos caso e controle para nenhuma das citocinas avaliadas
No entanto estudos in vitro mostraram que o consumo de aacutecidos graxos saturados
tambeacutem observado no presente estudo em ambos os grupos promovem processo
inflamatoacuterio com aumento da expressatildeo de IL-6 e TNF-α de TLR- 4 e consequente
aumento da ativaccedilatildeo da via NF-kβ (AJUWON SPURLOCK 2005 CALDER et al
2011 WEATHERILL et al 2005) Em estudos experimentais a dieta hiperlipiacutedica
rica em gordura saturada demonstrou promover obesidade com consequente
aumento de peso corporal adiposidade e marcadores inflamatoacuterios (FERNANDEZ-
REAL et al 2003 PEREIRA et al 2012) Esses achados podem explicar o fato de
105
que no presente estudo natildeo foram observadas diferenccedilas estatisticamente
significantes em relaccedilatildeo a liberaccedilatildeo de TNF-α e IL1-β entre os grupos estudados
Em relaccedilatildeo agrave liberaccedilatildeo da citocina IL-17 tambeacutem natildeo foram observadas diferenccedilas
estatisticamente significantes no entanto os achados da literatura teumlm sugerido
que no contexto de disbiose a presenccedila de agentes patogecircnicos pode perturbar a
regulaccedilatildeo do ambiente anti-inflamatoacuterio e que quando patoacutegenos enteacutericos superam
as bacteacuterias comensais o desequiliacutebrio entre comensais e bacteacuterias patogecircnicas
provocam liberaccedilatildeo significativa de MAMPs Este aumento pode induzir IECs DCs e
macroacutefagos ativados a secretar citocinas inflamatoacuterias como a IL-1β IL-6 IL-12 e
IL-23 Estas citocinas estimulam o desenvolvimento de ceacutelulas CD4+ T auxiliares
(T helper-TH1) e ceacutelulas TH17 (produzem IL-17A IL-17F e IL-22) resultando na
inflamaccedilatildeo crocircnica (MAYNARD et al 2012)
O estudo da influecircncia de diferentes elementos da dieta e composiccedilatildeo
corporal sobre a variaccedilatildeo da composiccedilatildeo da microbiota tornou-se uma aacuterea de
crescente interesse cientiacutefico Com efeito a relaccedilatildeo entre a microbiota intestinal e a
obesidade estaacute bastante reconhecida No entanto a participaccedilatildeo dos micro-
organismos da classe dos Mollicutes e alguns mecanismos subjacentes a essas
interaccedilotildees permanecem pouco estudados Em relaccedilatildeo agraves limitaccedilotildees do estudo
deve-se considerar o desenho transversal natildeo sendo possiacutevel estabelecer relaccedilatildeo
de causa e efeito No entanto o estudo mostra-se relevante destacando como
ponto forte o cuidado metodoloacutegico e a relevacircncia dos resultados encontrados
contribuindo para o avanccedilo dos estudos da relaccedilatildeo entre os molicutes microbiota
intestinal e obesidade Nesse contexto a importacircncia e validade de estudos como
este eacute apontar os possiacuteveis fatores de risco que contribuam para obesidade sendo
que a cuidadosa interpretaccedilatildeo dos resultados eacute importante para a geraccedilatildeo de
hipoacuteteses
Nesse contexto uma pesquisa acerca da relaccedilatildeo causa-efeito entre a
microbiota intestinal e a obesidade eacute altamente justificaacutevel uma vez que diferentes
espeacutecies de bacteacuterias podem desempenhar um papel significativo na safra de
energia humana e regulaccedilatildeo do peso corporal Aleacutem disso a consideraccedilatildeo de
fatores de estilo de vida em estudos da microbiota intestinal eacute altamente
recomendada uma vez que mudanccedilas no padratildeo alimentar e atividade fiacutesica podem
influenciar a composiccedilatildeo da microbiota intestinal para o desenvolvimento da
106
obesidade A partir disso o presente estudo fornece evidecircncias de que alteraccedilotildees e
interaccedilotildees na microbiota intestinal possam definir subconjuntos de indiviacuteduos com
diferentes perfis de risco metaboacutelico e assim contribuir para a investigaccedilatildeo da
heterogeneidade associada a fenoacutetipos relacionados com a adiposidade
especialmente em sociedades que estatildeo passando por transformaccedilotildees
socioeconocircmicas tecnoloacutegicas e culturais para um estilo de vida moderno
107
7 CONCLUSOtildeES
Os grupos caso e controle balancearam suas dietas conforme o intervalo de
distribuiccedilatildeo energeacutetica recomendado no entanto foi observado um consumo
de fibras inferior e de gorduras saturadas superior ao recomendado em
ambos os grupos
As mulheres de ambos os grupos apresentaram excesso de gordura corporal
Foi desenvolvido um ensaio de PCR em tempo real especiacutefico sensiacutevel
reprodutiacutevel e quantitativo para a detecccedilatildeo de Mollicutes nas fezes humanas
Foram encontradas associaccedilotildees estatisticamente significantes entre a
presenccedila de Mollicutes e mulheres obesas
Natildeo foram observadas associaccedilotildees estatisticamente significantes em relaccedilatildeo
as meacutedias de consumo dos macronutrientes carboidratos proteiacutenas lipiacutedios e
fibras com a presenccedila de Mollicutes
Natildeo foram observadas diferenccedilas estatisticamente significantes para as
cargas de Firmicutes Bacteroidetes e Bacteacuterias totais entre as mulheres do
grupo caso e controle
A proporccedilatildeo de Firmicutes em relaccedilatildeo aos Bacteroidetes foi maior na
microbiota intestinal das mulheres obesas em relaccedilatildeo agraves eutroacuteficas
Natildeo foi observada diferenccedila estatisticamente significante entre os grupos
caso e controle para nenhuma das citocinas avaliadas
108
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APEcircNDICE A ndash TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
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Universidade de Satildeo Paulo
Instituto de Ciecircncias Biomeacutedicas
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
ESTUDO Avaliaccedilatildeo da participaccedilatildeo dos microrganismos da Classe Mollicutes na microbiota intestinal de mulheres eutroacuteficas e obesas
Vocecirc estaacute sendo convidado (a) a participar do projeto de pesquisa acima citado O documento
abaixo conteacutem todas as informaccedilotildees necessaacuterias sobre a pesquisa que estamos fazendo Sua
colaboraccedilatildeo neste estudo seraacute de muita importacircncia para noacutes mas se desistir a qualquer momento
isso natildeo causaraacute nenhum prejuiacutezo a vocecirc
Eu _________________________________________________________________ profissatildeo ____________________________
residente e domiciliado na
_______________________________________________________________________________________________________________
______________________________________________________________ portador da Ceacutedula de identidade RG
___________________________ e inscrito no CPFMF______________________________ nascido(a) em _____
_____ _______ abaixo assinado(a) concordo de livre e espontacircnea vontade em participar como
voluntaacuterio(a) do estudo ldquoAvaliaccedilatildeo da participaccedilatildeo dos microrganismos da Classe Mollicutes
na microbiota intestinal de mulheres eutroacuteficas e obesasrdquo Declaro que obtive todas as
informaccedilotildees necessaacuterias bem como todos os eventuais esclarecimentos quanto agraves duacutevidas por
mim apresentadas
Estou ciente que
I) O estudo se faz necessaacuterio para que se possam descobrir as possiacuteveis causas da doenccedila
denominada vaginoses bacterianas a ser estudada no projeto ldquoAvaliaccedilatildeo da
participaccedilatildeo dos microrganismos da Classe Mollicutes na microbiota intestinal de
mulheres eutroacuteficas e obesasrdquo
II) Seratildeo feitas uma coleta de 5ml de sangue e fezes em periacuteodo uacutenico
III) A participaccedilatildeo neste projeto natildeo tem objetivo de me submeter a um tratamento bem
como natildeo me acarretaraacute qualquer despesa financeira com relaccedilatildeo aos procedimentos
meacutedico-cliacutenico-terapecircuticos efetuados no estudo
129
IV) Tenho a liberdade de desistir ou de interromper a colaboraccedilatildeo neste estudo no momento
em que desejar sem necessidade de qualquer explicaccedilatildeo
V) A desistecircncia natildeo causaraacute nenhum prejuiacutezo agrave minha sauacutede ou bem estar fiacutesico Natildeo viraacute
interferir no atendimento ou tratamento meacutedico
VI) Os resultados obtidos durante este ensaio seratildeo mantidos em sigilo mas concordo que
sejam divulgados em publicaccedilotildees cientiacuteficas desde que meus dados pessoais natildeo sejam
mencionados
VII) Caso eu desejar poderei pessoalmente tomar conhecimento dos resultados ao final
desta pesquisa
( ) Desejo conhecer os resultados desta pesquisa
( ) Natildeo desejo conhecer os resultados desta pesquisa
VIII) Concordo que o material possa ser utilizado em outros projetos desde que autorizado
pela Comissatildeo de Eacutetica deste Instituto e pelo responsaacutevel por esta pesquisa Caso minha
manifestaccedilatildeo seja positiva poderei retirar essa autorizaccedilatildeo a qualquer momento sem
qualquer prejuiacutezo para mim
( ) Sim ou ( ) Natildeo
IX ) Poderei contatar a Secretaria da Comissatildeo de Eacutetica em Pesquisa com Seres Humanos ndash
ICBUSP - no Fone 30917733 (e-mail cepicbuspbr) ou (11 3091-7297 jotiuspbr)
para recursos ou reclamaccedilotildees em relaccedilatildeo ao presente estudo
X) O sujeito de pesquisa ou seu representante quando for o caso deveraacute rubricar todas as
folhas do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido ndash TCLE - apondo sua assinatura na uacuteltima
paacutegina do referido Termo
XI) O pesquisador responsaacutevel deveraacute da mesma forma rubricar todas as folhas do Termo de
Consentimento Livre e Esclarecido ndash TCLEndash apondo sua assinatura na uacuteltima paacutegina do
referido Termo
XII) Resoluccedilatildeo 19696 - Estou recebendo uma coacutepia deste Termo de Consentimento Livre e
Esclarecido
Satildeo Paulo___________de________________de 20_____ ( ) Paciente ( ) Responsaacutevel
Testemunha 1 _______________________________________________
Nome RG Telefone
130
Testemunha 2 ___________________________________________________
Nome RG Telefone
Responsaacutevel pelo Projeto _____________________________________________________
PROF DR JORGE TIMENETSKY
131
APEcircNDICE B ndash QUESTIONAacuteRIO
132
UNIVERSIDADE DE SAtildeO PAULO
INSTITUTO DE CIEcircNCIAS BIOMEacuteDICAS
MESTRADO EM MICROBIOLOGIA
Seccedilatildeo 1 IDENTIFICACcedilAtildeO E DADOS PESSOAIS
Nome Idade ID
Telefone Data
Profissatildeo
Estado civil 1 Casada 2 Solteira 3 Mora com companheiro 4 Viuacuteva 5 Divorciada
Raccedilacor 1 Branca 2 Preta 3 Amarela 4 Parda 5 Indiacutegena
Escolaridade 1 Analfabeto 2 1ordm grau incompleto 3 1ordm grau Completo
4 2ordm grau incompleto 5 2ordm grau completo 6 Superior incompleto 7 superior completo
Condiccedilatildeo Socioeconocircmica Indicar aproximadamente a renda domiciliarfamiliar mensal (soma de todos os ganhos
das pessoas que dividem as despesas) (valor SM R$ 67800)
ateacute 1 salaacuterio miacutenimo (ateacute R$ 61800)
1 a 2 salaacuterios miacutenimos (mais de R$ 61800 a R$ 123600)
2 a 5 salaacuterios miacutenimos (mais de R$ 123600 a R$ 309000)
5 a 10 salaacuterios miacutenimos (mais de R$ 309000 a R$ 618000)
mais de 10 salaacuterios miacutenimos (mais de R$ 618000)
Seccedilatildeo 2 HISTOacuteRIA FAMILIAR (parentes de 1ordm grau paternos e maternos e irmatildeos)
1 HAS 2 Diabetes 3 Obesidade 4 Hipercolesterolemia 5 DCV
Seccedilatildeo 3 HISTOacuteRIA CLIacuteNICA
133
Alteraccedilotildees gastrointestinais 1 Constipaccedilatildeo Flatulecircncia 3 Refluxo 4 Azia
5 Ulcera 6 Gastrite 7 Naacuteuseas 8 Vocircmitos
Como o intestino se comporta habitualmente 1 Normal 2 Constipaccedilatildeo 3 Diarreacuteia
Moleacutestia atual 1 HAS 2 Diabetes 3 Obesidade 4 Hipercolesterolemia
5 DCV 6 Dispneacuteia 7 Alteraccedilatildeo Menstrual
Uso de laxantes 1 Sim 2 Natildeo
Seccedilatildeo 4 HISTOacuteRIA OBSTEacuteTRICA
Tipo de parto 1 Normal 2 Cesaacuterea
Foi amamentada 1 Natildeo 2 1 a 3 meses 3 4 a 6 meses 4 7 a 9 meses
5 10 a 12 meses 6 gt12 meses
Teve alguma gestaccedilatildeo 1 Sim 2 Natildeo
Quantos filhos 1 1 a 2 2 3 a 4 3 ge5
Quantos partos foram normais 1 1 a 2 2 3 a 4 3 ge5
Quantos partos foram cesaacuterea 1 1 a 2 2 3 a 4 3 ge5
Tempo de amamentaccedilatildeo dos filhos 1 Natildeo 2 1 a 3 meses 3 4 a 6 meses 4 7 a 9 meses
5 10 a 12 meses 6 gt12 meses
Seccedilatildeo 5 HISTOacuteRIA GINECOLOacuteGICA
Usou ou estaacute usando algum anticoncepcional (adesivo piacutelula anel vaginal DIU de hormocircnio injetaacutevel ou
bastatildeo subcutacircneo) 1 Sim 2 Natildeo
Com que idade comeccedilou a tomar
Parou de usar por algum tempo
Por quanto tempo parou
Seccedilatildeo 6 CONSUMO DE TABACO
134
Jaacute fumou mais de 20 maccedilos de cigarro (cachimbo ou charuto) em toda sua vida
1 Natildeo 2 Sim e fumo atualmente 3 Sim mas parei de fumar 4 Natildeo sabe natildeo informa
Se fumafumou o faz haacute quanto tempo
Quantos cigarros em meacutedia fumafumava por dia
____cigarros
____cachimbos
____charutos
Se parou de fumar haacute quanto tempo ocorreu
Seccedilatildeo 7 CONSUMO DE AacuteLCOOL
Etilista 1 Sim 2 Natildeo
Frequencia de ingestatildeo
Tipo de bebida ingerida
Haacute quanto tempo ingere
Seccedilatildeo 8 ATIVIDADE FIacuteSICA (IPAQ versatildeo curta)
As perguntas estatildeo relacionadas ao tempo que vocecirc gasta fazendo atividade fiacutesica na UacuteLTIMA
semana As perguntas incluem as atividades que vocecirc faz no trabalho para ir de um lugar a outro
por lazer por esporte por exerciacutecio ou como parte das suas atividades em casa ou no jardim
Para responder as questotildees lembre que
atividades fiacutesicas VIGOROSAS satildeo aquelas que precisam de um grande esforccedilo fiacutesico e que fazem respirar MUITO mais forte que o normal
atividades fiacutesicas MODERADAS satildeo aquelas que precisam de algum esforccedilo fiacutesico e que fazem respirar UM POUCO mais forte que o normal
Para responder as perguntas pense somente nas atividades que vocecirc realiza por pelo menos 10
minutos contiacutenuos de cada vez
135
1a Em quantos dias da uacuteltima semana vocecirc caminhou por pelo menos 10 minutos contiacutenuos em casa
ou no trabalho como forma de transporte para ir de um lugar para outro por lazer por prazer ou
como forma de exerciacutecio dias _____ por SEMANA ( ) Nenhum
1b Nos dias em que vocecirc caminhou por pelo menos 10 minutos contiacutenuos quanto tempo no total
vocecirc gastou caminhando por dia horas ______ Minutos _____
2a Em quantos dias da uacuteltima semana vocecirc realizou atividades MODERADAS por pelo menos 10
minutos contiacutenuos como por exemplo pedalar leve na bicicleta nadar danccedilar fazer ginaacutestica
aeroacutebica leve jogar volei recreativo carregar pesos leves fazer serviccedilos domeacutesticos na casa no
quintal ou no jardim como varrer aspirar cuidar do jardim ou qualquer atividade que fez aumentar
moderadamente sua respiraccedilatildeo ou batimentos do coraccedilatildeo (POR FAVOR NAtildeO INCLUA CAMINHADA)
dias _____ por SEMANA ( ) Nenhum
2b Nos dias em que vocecirc fez essas atividades moderadas por pelo menos 10 minutos contiacutenuos
quanto tempo no total vocecirc gastou fazendo essas atividades por dia
horas ______ Minutos _____
3a Em quantos dias da uacuteltima semana vocecirc realizou atividades VIGOROSAS por pelo menos 10
minutos contiacutenuos como por exemplo correr fazer ginaacutestica aeroacutebica jogar futebol pedalar raacutepido
na bicicleta jogar basquete fazer serviccedilos domeacutesticos pesados em casa no quintal ou cavoucar no
jardim carregar pesos elevados ou qualquer atividade que fez aumentar MUITO sua respiraccedilatildeo ou
batimentos do coraccedilatildeo dias _____ por SEMANA ( ) Nenhum
3b Nos dias em que vocecirc fez essas atividades vigorosas por pelo menos 10 minutos contiacutenuos quanto
tempo no total vocecirc gastou fazendo essas atividades por dia
horas ______ Minutos _____
Seccedilatildeo 9 HAacuteBITOS ALIMENTARES
Vocecirc mudou seus haacutebitos alimentares recentemente ou estaacute fazendo dieta para emagrecer ou por qualquer
outro motivo
1 Natildeo 5 Sim para reduccedilatildeo de sal
2 Sim para perda de peso 6 Sim para reduccedilatildeo de colesterol
3 Sim por orientaccedilatildeo meacutedica
136
4 Sim para dieta vegetariana ou reduccedilatildeo do consumo de carne
Vocecirc estaacute tomando algo para suplementar sua dieta (vitaminas minerais e outros produtos)
1 Natildeo 2 Sim regularmente 3 Sim mas natildeo regularmente
Se a resposta da pergunta anterior for sim favor preencher o quadro abaixo
Suplemento
Nome comercial Dose
Frequencia
Nuacutemero de refeiccedilotildees que costuma fazer por dia
Costuma fazer desjejum diariamente 1 Sim 2 Natildeo
Costuma beliscar entre as refeiccedilotildees 1 Sim 2 Natildeo
Costuma ingerir liacutequidos durante as refeiccedilotildees 1 Sim 2 Natildeo
Quantas refeiccedilotildees costuma fazer fora de casa por semana
Em que local costuma fazer as refeiccedilotildees fora de casa
1 Restaurantes 5 Natildeo faz
2 Lanches raacutepidos 6 Outro
3 Marmita
4 No trabalho
137
As questotildees seguintes relacionam-se ao seu haacutebito alimentar usual no PERIacuteODO DE UM ANO Para cada quadro responda por favor a frequecircncia que melhor descreva QUANTAS VEZES vocecirc costuma comer cada item e a respectiva UNIDADE DE TEMPO (se por dia por semana por mecircs ou no ano) Depois responda qual a sua PORCcedilAtildeO INDIVIDUAL USUAL em relaccedilatildeo agrave porccedilatildeo meacutedia indicada ESCOLHA SOMENTE UM CIacuteRCULO PARA CADA COLUNA Muitos grupos de alimentos incluem exemplos Eles satildeo sugestotildees e vocecirc pode pode consumir todos os itens indicados Se vocecirc natildeo come ou raramente come um determinado iacutetem preeencha o ciacuterculo da primeira coluna (N=nunca come) NAtildeO DEIXE ITENS EM BRANCO
138
139
140
141
Por favor liste qualquer outro alimento ou preparaccedilatildeo importante que vocecirc costuma comer ou beber pelo menos UMA VEZ POR SEMANA que natildeo foram citados aqui (por exemplo leite-de-coco outros tipos de carnes receitas caseiras creme de leite leite condensado gelatina e outros doces etc )
Alimento Frequecircncia por semana Quantidade Consumida
Quando vocecirc come carne bovina ou suiacutena vocecirc costuma comer a gordura visiacutevel 1 nunca ou raramente 2 algumas vezes 3 sempre 4 natildeo sabe Quando vocecirc come frango ou peru vocecirc costuma comer a pele 1 nunca ou raramente 2 algumas vezes 3 sempre 4 natildeo sabe
142
Seccedilatildeo 10 DADOS ANTROPOMEacuteTRICOS
Peso
_____________Kg
_____________Kg
Estatura
_____________m
_____________m
IMC
__________Calcular IMC= peso em Kg altura em m2
Circunferecircncia Abdominal
_____________cm
_____________cm
Reactacircncia
Resistecircncia ___________MG
_____________MLG
Peso MG_________kg
Peso MGL_________kg
TMB __________
aacutegua de massa magra
143
APEcircNDICE C- TABELA 10
144
Tabela 10 Participaccedilatildeo dos alimentos nos grupos meacutedias de consumo por dia dos alimentos consumidos pela populaccedilatildeo estudada Satildeo Paulo SP 2013-2014
Grupo Alimentar
Alimentos Grupo Frequecircncia diaacuteria (dp)
Frequecircncia diaacuteria (amplitude)
Massas
Macarratildeo com molho sem carne
Caso
02 (05)
(0-25)
Controle
02 (02) (0-043)
Macarratildeo com molho com carne lasanha nhoque
Caso 01 (012) (0-043)
Controle
02 (02) (0-079)
Pizza panqueca
Caso 015 (022) (0-1)
Controle 02 (01) (003-043)
Preparaccedilatildeo
Sopas
Caso 015 (018) (0-043)
Controle 014 (02) (0-043)
Polenta cozida ou frita
Caso 003 (005) (0-014)
Controle 0008 (003) (0-014)
Carne vermelha e
ovos
Carne bovina
Caso 06 (06) (008-25)
Controle 05 (018) (014-079)
Carne de porco Caso 008 (009) (0-043)
Controle 02 (05) (0-25)
Carne seca carne do sol bacon
Caso 006 (005) (0-014)
Controle 004 (006) (0-014)
Ovos Caso 02 (02) (0-1)
Controle 03 (05) (0-25)
Embutidos
Linguiccedila
Caso 011 (009) (0-043)
Controle 02 (05) (0-25)
Embutidos (presunto mortadela salsicha)
Caso 015 (023) (0-1)
Controle 02 (02) (0-043)
Carne branca
Frango Caso 06 (09) (003-3)
Controle 05 (05) (014-25)
Peixe e frutos do mar Caso 01 (01) (0-043)
Controle 01 (02) (0-043)
Leite e derivados
Leite integral Caso 07 (09) (0-3)
Controle 04 (06) (0-25)
Leite desnatado Caso 04 (09) (0-3)
Controle 002 (005) (0-014)
Leite semi-desnatado Caso 03 (08) (0-25)
Controle 0004 (002) (0-008)
Iogurte natural Caso 05 (09) (0-25)
Controle 03 (03) (0-079)
Iogurte com frutas Caso 03 (08) (0-25)
Controle 02 (02) (0-079)
145
Tabela 10 Participaccedilatildeo dos alimentos nos grupos meacutedias de consumo ao dia dos alimentos consumidos pela populaccedilatildeo estudada Satildeo Paulo SP 2013-2014
(Continuaccedilatildeo)
Grupo Alimentar
Alimentos Grupo Frequecircncia diaacuteria (dp)
Frequecircncia diaacuteria
(amplitude)
Leite e derivados
Queijo mussarela prato parmesatildeo e provolone
Caso 05 (07) (0-25)
Controle 05 (06) (003-25)
Queijo minas e ricota Caso 04 (08) (0-25)
Controle 04 (06) (0-25)
Leguminosas
Feijatildeo Caso 12 (09) (014-25)
Controle 06 (05) (008-25)
Lentilha ervilha seca gratildeo de bico soja
Caso 005 (009) (0-043)
Controle 006 (01) (0-043)
Feijatildeo tropeiro e feijoada
Caso 003 (003) (0-014)
Controle 002 (004) (0-014)
Cereais raiacutezes e
tubeacuterculos
Arroz branco ou integral cozido com
oacuteleo e temperos
Caso 15 (09) (043-25)
Controle 14 (07) (043-25)
Batata frita ou mandioca frita
Caso 007 (01) (0-043)
Controle 02 (01) (003-043)
Batata mandioca inhame (cozida ou assada) purecirc
Caso 01 (012) (0-043)
Controle 02 (02) (0-043)
Farinha de mandioca farofa cuscuz aveia tapioca
Caso 02 (03) (0-1)
Controle 01 (02) (0-1)
Patildeo francecircs patildeo de forma integral patildeo doce torrada
Caso 07 (06) (014-3)
Controle 17 (08) (0-25)
Biscoito sem recheio (doce salgado) Caso 04 (06) (0-25)
Controle 05 (06) (0-25)
Biscoito recheado waffer amanteigado
Caso 01 (03) (0-1)
Controle 009 (02) (0-043)
Bolo (simples recheado) Caso 01 (013) (0-043)
Controle 01 (013) (0-043)
Hortaliccedilas
Alface
Caso 12 (09) (008-3)
Controle 08 (06) (014-25)
Tomate Caso 14 (107) (008-3)
Controle 08 (06) (003-25)
Cenoura Caso 06 (07) (008-25)
Controle 04 (02) (0-1)
Outros legumes (abobrinha berinjela chuchu pepino)
Caso 04 (03) (008-1)
Controle 05 (07) (0-25)
Outras verduras cruas (acelga ruacutecula agriatildeo)
Caso 04 (03) (008-1)
Controle 04 (02) (0-1)
146
Tabela 10 Participaccedilatildeo dos alimentos nos grupos meacutedias de consumo ao dia dos alimentos consumidos pela populaccedilatildeo estudada Satildeo Paulo SP 2013-2014
(Continuaccedilatildeo)
Grupo Alimentar Alimentos Grupo Frequecircncia diaacuteria (dp)
Frequecircncia diaacuteria
(amplitude)
Hortaliccedilas
Outras verduras cozidas (acelga espinafre escarola couve)
Caso 03 (02) (0-1)
Controle 03 (02) (0-079)
Broacutecolis couve-flor repolho Caso 02 (015) (0-043)
Controle 03 (03) (0-1)
Frutas
Laranja mexerica abacaxi Caso 08 (09) (0-3)
Controle 04 (05) (003-25)
Banana Caso 08 (09) (0-3)
Controle 04 (02) (008-1)
Maccedilatilde pecircra Caso 05 (07) (0-3)
Controle 03 (03) (0-1)
Melatildeo melancia Caso 03 (07) (0-1)
Controle 01 (01) (0-043)
Mamatildeo Caso 03 (03) (0-1)
Controle 008 (006) (0-014)
Goiaba Caso 01 (02) (0-1)
Controle 0008 (002) (0-008)
Abacate Caso 08 (02) (0-1)
Controle 007 (001) (0-003)
Suco natural Caso 07 (09) (0-3)
Controle 03 (02) (0-1)
Industrializados
Maionese molho para salada patecirc chantily
Caso 01 (016) (0-043)
Controle 01 (02) (0-1)
Condimentos
Caso 04 (06) (0-25)
Controle 02 (03) (0-079)
Hamburguer nuggets almocircndega Caso 006 (009) (0-043)
Controle 005 (009) (0-043)
Suco industrializado Caso 08 (105) (0-3)
Controle 05 (03) (0-1)
Refrigerante comum Caso 02 (02) (0-079)
Controle 02 (02) (0-043)
Refrigerante light diet Caso 0 0
Controle 007 (02) (0-043)
147
Tabela 10 Participaccedilatildeo dos alimentos nos grupos meacutedias de consumo ao dia dos alimentos consumidos pela populaccedilatildeo estudada Satildeo Paulo SP 2013-2014
(Continuaccedilatildeo)
Grupo Alimentar Alimentos Grupo Frequecircncia diaacuteria (dp)
Frequecircncia diaacuteria
(amplitude)
Infusatildeo
Chaacute e cafeacute sem accediluacutecar Caso 09 (1) (0-25)
Controle 06 (07) (0-25)
Chaacute e cafeacute com accediluacutecar Caso 08 (08) (0-25)
Controle 07 (08) (0-3)
Bebida alcooacutelica
Cerveja
Caso 003 (005) (0-014)
Controle 0074 (01) (0-043)
Oacuteleos e gorduras
Oacuteleo azeite ou vinagre para tempero de salada
Caso 1 (09) (0-25)
Controle 03 (03) (0-1)
Manteiga ou margarina comum Caso 09 (09) (0-25)
Controle 07 (07) (0-25)
Manteiga ou margarina light Caso 02 (06) (0-25)
Controle 007 (003) (0-014)
Lanches
Salgado frito Caso 02 (03) (0-1)
Controle 01 (01) (0-043)
Salgado assado Caso 014 (02) (0-1)
Controle 02 (02) (0-043)
Sanduiche Caso 006 (009) (0-043)
Controle 005 (004) (0-014)
Accediluacutecar e doces
Chocolate bombom brigadeiro Caso 04 (04) (0-1)
Controle 06 (04) (003-2)
Achocolatado em poacute (adicionado ao leite)
Caso 013 (03) (0-1)
Controle 02 (03) (0-1)
Sobremesas doces tortas e pudins
Caso 02 (03) (0-1)
Controle 03 (03) (003-1)
Accediluacutecar mel e geleacuteia Caso 05 (07) (0-3)
Controle 08 (1) (0-3)
Agrave Aricelma um dos maiores presentes que pude receber em minha trajetoacuteria pelo
amor conselhos carinhos e abraccedilos Vocecirc foi fundamental para eu me manter firme no
propoacutesito
Ao departamento de endocrinologia do HC-FMUSP e aos professores Alfredo Halpern e
Marcio Mancinni por abrirem as portas para a realizaccedilatildeo das coletas e por acreditarem
no trabalho
Aos funcionaacuterios do departamento de endocrinologia da HC-FMUSP sem os quais
seria inviaacutevel a realizaccedilatildeo das coletas
Aos pacientes por participarem deste estudo e me permitir aprender mais a cada
coleta
Ao professor Djanilson pelo auxiacutelio nas anaacutelises estatiacutesticas e por me apresentar
Jerusa um verdadeiro anjo sem a qual seria inviaacutevel as anaacutelises de consumo
alimentar
Agrave amiga e companheira de trajetoacuteria Aline Teixeira pela preciosa colaboraccedilatildeo nas
anaacutelises estatiacutesticas e por ser minha dupla imbatiacutevel
Ao amigo-irmatildeo Filipe Bezerra pela preciosa contribuiccedilatildeo nas adaptaccedilotildees das
ilustraccedilotildees e pela honra de sua amizade
Ao melhor grupo de pesquisa que jaacute sonhei fazer parte pelos ensinamentos e amizade
incondicional Juntos somos uma famiacutelia obrigada meus amigos
Agrave todos os amigos que passaram pelo aptdeg 63 ao longo desses anos vocecircs foram
fundamentais em todos os momentos dessa jornada
Aos funcionaacuterios do ICB II indispensaacuteveis no meu dia a dia pelo apoio amizade cafeacutes
e carinho
Agrave meus amigos-irmatildeos e suas respectivas famiacutelias por me ensinarem que amizade eacute o
sentimento que imanta as almas suave expressatildeo do ser que necessita intercambiar as
forccedilas da emoccedilatildeo sob os estiacutemulos do entendimento fraternal inspiradora de coragem
e de abnegaccedilatildeo que enfloresce as almas abenccediloando-as com resistecircncias para as
lutas Amo vocecircs gratidatildeo
Agrave todos que cruzaram meu caminho nesta jornada e que trouxeram consigo
ensinamentos que me transformaram em algueacutem melhor que outrora o meu muito
obrigada
Soacute o conhecimento vivido
O conhecimento de dentro para fora
Aquele que natildeo eacute aprendido nos livros nem na fria observaccedilatildeo
do fino repoacuterter de faro infaliacutevel
Soacute aquele conhecimento que se viveu dia a dia minuto a minuto
no erro e no acerto ()
Possibilita a criaccedilatildeo
Jorge Amado
18
RESUMO
SANTOS V M Avaliaccedilatildeo da participaccedilatildeo dos micro-organismos da Classe Mollicutes na microbiota intestinal de mulheres eutroacuteficas e obesas 2015 147 f Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Microbiologia) ndash Instituto de Ciecircncias Biomeacutedicas Universidade de Satildeo Paulo Satildeo Paulo 2015
A obesidade possui causas multifatoriais sendo caracterizada como um excesso de gordura
corporal acumulada no tecido adiposo causando impactos agrave sauacutede Estudos quanto agrave interaccedilatildeo
geneacutetica do indiviacuteduo com o ambiente mostram que alguns indiviacuteduos satildeo mais propensos ao ganho
de peso do que os outros em ambientes similares Satildeo muitas as evidecircncias de que o metabolismo
da microbiota intestinal facilita a extraccedilatildeo de calorias da dieta ajudam a estocaacute-las no tecido
adiposo aleacutem de prover energia e nutrientes para o crescimento microbiano Nesse contexto a
ocorrecircncia e participaccedilatildeo dos Mollicutes na microbiota intestinal eacute praticamente desconhecida
sendo necessaacuterios portanto o desenvolvimento de estudos que avaliem as implicaccedilotildees e
relevacircncia desses microrganismos nas respostas adaptativas da microbiota intestinal humana
Deste modo o objetivo do presente estudo foi analisar a participaccedilatildeo dos micro-organismos da
Classe Mollicutes e dos Filos Firmicutes e Bacteroidetes na microbiota intestinal de mulheres
obesas e eutroacuteficas Para a realizaccedilatildeo do estudo a casuiacutestica foi de 20 mulheres diagnosticadas
com obesidade (IMCgt 30kgm2) e 20 mulheres em eutrofia (IMC entre 185 e 249 kgm2 Foram
obtidas amostras de fezes sangue Foi aplicado um questionaacuterio semiestruturado sobre fatores
relacionados com obesidade e possiacutevel associaccedilatildeo com microbiota intestinal e ambiente aleacutem de
avaliaccedilatildeo antropomeacutetrica atraveacutes de Bioimpedacircncia e questionaacuterio de frequecircncia alimentar
Desenvolveu-se um ensaio quantitativo por meio de TaqMan PCR para a detecccedilatildeo de Mollicutes
nas amostras de fezes A metodologia foi especiacutefica sensiacutevel reprodutiacutevel e gerou dados
quantitativos para a detecccedilatildeo desses microrganismos nas fezes humanas Constatou-se no
presente estudo que o grupo caso apresentou consumo energeacutetico inferior ao recomendado e que
ambos os grupos apresentaram consumo superior de gorduras saturadas e inferior de fibras Em
relaccedilatildeo a determinaccedilatildeo do estado nutricional os dois grupos se apresentaram acima da meacutedia
referecircncia indicando excesso de gordura corporal Na determinaccedilatildeo da microbiota intestinal
constatou-se uma diferenccedila estatisticamente significante entre as meacutedias do nuacutemero dos micro-
organismos da classe Mollicutes entre os grupos caso e controle Detectou-se uma associaccedilatildeo
positiva estatisticamente significante entre a presenccedila de Mollicutes e mulheres obesas (OR= 115
IC= 242-554) Na quantificaccedilatildeo da presenccedila dos Filos Firmicutes e Bacteroidetes e Bacteacuterias
totais na microbiota natildeo foram observadas diferenccedilas estatisticamente significantes quanto a sua
quantidade entre as mulheres do grupo caso e controle No entanto foi observada maior proporccedilatildeo
de FirmicutesBacteroidetes na microbiota intestinal das mulheres obesas em relaccedilatildeo agraves eutroacuteficas
do grupo controle Os resultados obtidos permitiram obter evidecircncias importantes da participaccedilatildeo
dos micro-organismos da classe Mollicutes As alteraccedilotildees da microbiota intestinal tambeacutem
contribuiacuteram na definiccedilatildeo de subconjuntos de indiviacuteduos com diferentes perfis de risco metaboacutelico e
a da heterogeneidade associada a fenoacutetipos humanos relacionados com a adiposidade
Palavras-chave Obesidade Microbiota intestinal Mollicutes qPCR
ABSTRACT
SANTOS V M Evaluation of Mollicutes microorganismrsquos participation in the gut microbiota of obese and normal weight women 2015 147 p Masters thesis (Microbiology) ndash Instituto de Ciecircncias Biomeacutedicas Universidade de Satildeo Paulo Satildeo Paulo 2015
Obesity has multifactorial causes and it is characterized as an excess of corporal fat accumulated in adipose tissue causing health impacts Studies on the genetic interaction of the individual with the environment shows that some individuals are more prone to weight gain than others in similar environments There are many evidences that the gut microbiota metabolism facilitates the harvest of energy derived from ingested nutrients it help to store them in adipose tissue and provide energy and nutrients for microbial growth In this context the occurrence and participation of Mollicutes in the gut microbiota is pratically unknown requiring the development of studies to evaluate the implications and relevance of these microorganisms in the adaptive responses of the human gut microbiota Thus the aim of this study was to analyze the participation of the Class Mollicutes and Firmicutes and Bacteroidetes phylos in the gut microbiota of obese and normal weight women For the study it was collected samples of 20 women diagnosed with obesity (BMIgt 30 kg m2) and 20 women of normal weight (BMI between 185 and 249 kg m2) it was collected stool samples blood semi-structured questionnaire on etiological factors predisposing and associated with obesity and possible association with gut microbiota and the environment and anthropometric measurements using bioelectrical impedance A quantitative assay was developed through of TaqMan PCR for the detection of Mollicutes in stool samples from patients with the methodology specific sensitive reproducible and quantitative for the detection of these microorganisms in human stools It was found in this study that the case group had a lower energy consumption than recommended and that both groups had a higher intake of saturated fats and less fiber For determining the nutritional status of the two groups presented above average reference indicating excess body fat Regarding the determination of the intestinal microbiota of the study population there was a statistically significant difference between the mean of microorganisms of Mollicutes class between the case and control groups And it was detected a statistically significant positive association between the presence of Mollicutes and obese women (OR = 115 CI = 242 to 554) Regarding the analysis about the participation of phylos Firmicutes and Bacteroidetes and total bacteria in the microbiota of the study population no statistically significant differences observed for the microbial amount among women of the case and control group However there was a higher proportion of Firmicutes Bacteroidetes the gut microbiota of obese women compared to the control group normal weight women Analysis of the results provide important evidence about the participation of almost unknown Mollicutes class in the gut microbiota of the population studied as well as changes and interactions in intestinal microbiota can define subsets of individuals with different metabolic risk profiles and thus contribute to investigation of the heterogeneity associated phenotypes related to adiposity
Keywords Obesity Gut microbiota Mollicutes qPCR
LISTA DE ABREVIATURAS SIGLAS E SIacuteMBOLOS
A ndash Adenina
AEAndash N-araquidonoil etanolamina anandamida
AFndash Niacutevel de atividade fiacutesica
AGCCndash Aacutecidos graxos de cadeia curta
AgRPndash Peptiacutedeo Relacionado ao Agouti
AIDSndash Siacutendrome da imunodeficiecircncia adquirida
AIndash Adequate Intake
AMPndash Adenosina monofosfato
AMPKndash Adenosina proteiacutena quinase
AMPsndash Peptiacutedeos antimicrobianos bacterianos
APC ndash Ceacutelula apresentadora de antiacutegeno
APRILLndash Ligante indutor de proliferaccedilatildeo
atm ndash Atmosfera
ATP ndash Adenosina tri-fosfato
C ndash Citosina
C+G ndash Conteuacutedo citosina e guanina
Cb-1ndash Receptores canabinoacuteides
CCKndash Colecistocinina
CH4ndash Metano
CHOsndash Carboidratos
ChREBP ndash Carbohydrate response element-binding protein
CO2 ndash Gaacutes carbocircnico
CPT1ndash Carnitina palmitoil transferase 1
Ct ndash Cycle Treshold (Sinal de fluorescecircncia que pode ser
detectado)
CV ndash Coeficiente de variaccedilatildeo
DAG lipasendash sn-1-diacilglicerol lipase seletiva
DCs ndash Ceacutelulas Dendriacuteticas
DNA ndash Aacutecido Desoxirribonucleico
DRI ndash Dietary References Intakes
DP ndash Desvio padratildeo
dNTP ndash Deoxinucleotiacutedeo trifosfato
EAR ndash Estimated Average Requirements
EDTA ndash Aacutecido Etilenodiamino Tetra-aceacutetico
ELISA ndash Enzyme-Linked Immunoabsorbent Assay
EIndash Enzimas citoplasmaacuteticas do sistema PTS
EPIndash Equipamento de Proteccedilatildeo Individual
EROndash Espeacutecies reativas de oxigecircnio
FAAHndash Fatty acid amide hydrolase
FABFndash Fator de ativaccedilatildeo de ceacutelulas β
FFARndash Free fatty acids receptors
FIAFndash Fasting Induced Adipocyte Factor
g ndash Gramas
G ndash Guanina
GERndash Gasto energeacutetico de repouso
GETndash Gasto energeacutetico total
GLP-1ndash Peptiacutedeo semelhante ao glucagon
GPRndash Receptor acoplado agrave proteiacutena G
H2ndash Hidrogecircnio
HDLndash Lipoproteiacutena de alta densidade
HPRndash Enzimas citoplasmaacuteticas do sistema PTS
IBGEndash Instituto brasileiro de Geografia e Estatiacutestica
IC ndash Intervalo de Confianccedila
IECsndash Ceacutelulas epiteliais intestinais)
IFN-α ndash Interferon α
IFN-β ndash Interferon β
IFN-γ ndash Interferon gama
IgA ndash Imunoglobulina A
IL ndash Interleucina
IL-10 ndash Interleucina 10
IL-1β ndash Interleucina 1Beta
IL-25 ndash Interleucina 25
IL-33 ndash Interleucina 33
IL-6 ndash Interleucina 6
IMC ndash Iacutendice de massa corporal
IPAQ ndash International Physical Activity Questionnaire
kgndash Quilogramas
Kpb ndash Kilopares de bases
LPLndash Lipase lipoproteacuteica
LPSndash Lipopolissacariacutedeos
MAGndash Monoacilglicerol lipase
MAMPsndash Padrotildees moleculares associados agrave micro-organismos
MC4R ndash Receptor da Melanocortina 4
MDa ndash Megadaltons
mg ndash Miligramas
min ndash Minuto
mL ndash Mililitro
mm ndash Miliacutemetro
mM ndash Milimolar
mRNAndash RNA mensageiro
MSndash Ministeacuterio da Sauacutede
NAPE-PLDndash N-acil fostatidiletanolamida-fosfolipase D seletiva
NF-KBndash Fator nuclear Kappa B
NK ndash Natural Killers
nm ndash Nanocircmetro
NODndash Receptores de domiacutenio de digomerizaccedilatildeo de ligaccedilatildeo de
nucleotiacutedeos
NPYndash Neuropeptiacutedeo Y
ordm C ndash Graus Celsius
OMS (WHO) ndash Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede
OR ndash Odds Ratio
pb ndash Pares de base
PC1 ndash Proacute-hormocircnio Convertase 1
PCR ndash Reaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase
PGC-1ndash Peroxisome proliferator-activated receptor-gamma
coactivator 1 alpha
PGCndash Porcentagem de gordura corporal
pH ndash Potencial de hidrogecircnio iocircnico
pmol ndash Picomol
POFndash Pesquisa dos Orccedilamentos Familiares
POMCndash Proacute-oacutepio melanocortina
PPARndash Receptor Ativado por Proliferadores de Peroxissoma
PPI ndash Perda de peso intencional
PPLO ndash Pleuropneumonia-like Organisms
PTSndash Sistema fosfotransferase
PYYndash Peptiacutedeo tirosina-tirosina
QFAndash Questionaacuterio de frequecircncia alimentar
qPCR ndash PCR quantitativa ou PCR em tempo real
r2 ndash R da curva
RA ndash Aacutecido retinoacuteico
RCQndash Relaccedilatildeo cintura-quadril
REGIIIβndash Proteiacutenas antimicrobianas intestinais
REGIIIγndash Proteiacutenas antimicrobianas intestinais
RNA ndash Aacutecido ribonucleacuteico
rpm ndash Rotaccedilotildees por minuto
rRNA ndash RNA ribossocircmico
s ndash Segundo
SNCndash Sistema nervoso central
SREBP-1ndash Liver sterol response element binding protein type-1
SOCS-1 ndash Proteiacutenas supressora da sinalizaccedilatildeo de citocina-1
SOCS-3 ndash Proteiacutenas supressora da sinalizaccedilatildeo de citocina-3
T ndash Timina
TAndash Tecido adiposo
TCLE ndash Termo de Consentimento Livre e Esclarecido
TGF-β ndash Fator de crescimento tumoral-β
TGIndash Trato gastrintestinal
TLR ndash Toll-like receptor
TMndash Tecido muscular
TMBndash Taxa de metabolismo basal
TNF-α ndash Fator de Necrose Tumoral alfa
Tregndash Ceacutelulas T regulatoacuterias
tRNA ndash RNA transportador
TSLPndash Linfopoietina estromal tiacutemica
U ndash Unidade
UFC ndash Unidade Formadora de Colocircnia
UFCmicroL ndash Unidade Formadora de Colocircnia por microlitro
USDAndash United States Departament of Agriculture
VETndash Valor energeacutetico Total
X ndash Vezes
ZO-1ndash Zocircnula de oclusatildeo-1
α ndash Alfa
β ndash Beta
χ2 ndash Teste Qui-quadrado
ndash Por cento
microL ndash Microlitro
microm ndash Microcircmetros
microms ndash Microcircmetros por segundo
2-AGndash 2-araquidonoil glicerol
IacuteNDICE DE FIGURAS
Figura 1 ndash Fatores envolvidos no estabelecimento da microbiota humana ao longo da
vida 37
Figura 2 ndash Interaccedilatildeo funcional entre a microbiota intestinal humana e o sistema
imunoloacutegico 42
Figura 3 ndash Doenccedilas influenciadas pelo metabolismo microbiano
intestinal46
Figura 4 ndash Crescimento de M hominis em meio SP4 com a produccedilatildeo de colocircnia em
forma de ldquoovo fritordquo (aumento 40X) 55
Figura 5 ndash Comparaccedilatildeo entre as meacutedias de consumo de macronutrientes dos Grupos
Caso e Controle com a Faixa de Distribuiccedilatildeo Aceitaacutevel de macronutrientes (AMDRDRI)
e AI (Adequate Intake) para a faixa etaacuteria de 20 a 70 anos Satildeo Paulo SP 2013-
201484
Figura 6 ndash Comparaccedilatildeo entre as meacutedias de consumo das Vitaminas A C E e folato
dos Grupos Caso e Controle com a Faixa de Distribuiccedilatildeo Aceitaacutevel de macronutrientes
(AMDRDRI) e AI (Adequate Intake) para a faixa etaacuteria de 20 a 70 anos Satildeo Paulo
SP 2013-201485
Figura 7 ndash Comparaccedilatildeo entre as meacutedias de consumo das Vitaminas B1 B2 B6 B12
D Niacina e Aacutecido pantotecircnico dos Grupos Caso e Controle com a Faixa de
Distribuiccedilatildeo Aceitaacutevel de macronutrientes (AMDRDRI)e AI (Adequate Intake) para a
faixa etaacuteria de 20 a 70 anos Satildeo Paulo SP 2013-201486
Figura 8 ndash Comparaccedilatildeo entre as meacutedias de consumo de Sais Minerais dos Grupos
Caso e Controle com a Faixa de Distribuiccedilatildeo Aceitaacutevel de macronutrientes
(AMDRDRI)e AI (Adequate Intake) para a faixa etaacuteria de 20 a 70 anos Satildeo Paulo SP
2013-2014 87
Figura 9 ndash Comparaccedilatildeo entre as meacutedias de consumo de Sais Minerais e outros
nutrientes dos Grupos Caso e Controle com a Faixa de Distribuiccedilatildeo Aceitaacutevel de
macronutrientes (AMDRDRI)e AI (Adequate Intake) para a faixa etaacuteria de 20 a 70
anos Satildeo Paulo SP 2013-2014 87
Figura 10ndash Curva-padratildeo gerada a partir dos pontos de Ct obtidos com o graacutefico de
amplificaccedilatildeo de diluiccedilotildees seriadas do controle positivo Mycoplasma hominis calculado
pelo software StepOne 21 (Applied Biosystems Life Technologies Corporation) Satildeo
Paulo SP 2013-201490
Figura 11 ndash Quantificaccedilatildeo por qPCR de Mollicutes (UFCmicrol) a partir das amostras de
fezes nos grupos caso e controle Satildeo Paulo SP 2013-2014 92
Figura 12 ndash Quantificaccedilatildeo por qPCR de Firmicutes Bacteroidetes e Eubacterias
(UFCmicrol) a partir das amostras de fezes nos grupos caso e controle Satildeo Paulo SP
2013-201493
Figura 13 ndash Quantificaccedilatildeo de IL-1β IL-10 IL17-A e TNF-α (pgmL) no plasma
sanguiacuteneo por meio do ELISA nos grupos caso e controle da populaccedilatildeo estudada
Satildeo Paulo SP 2013-201496
IacuteNDICE DE QUADROS
Quadro 1 ndash Criteacuterios utilizados na estimativa da frequecircncia diaacuteria de consumo dos
alimentos incluiacutedos no Questionaacuterio de Frequecircncia Alimentar 61
Quadro 2 ndash Sequecircncias dos iniciadores utilizados para amplificaccedilatildeo do gene 16S rRNA
para Mollicutes 66
Quadro 3 ndash Sequecircncias dos iniciadores utilizados para amplificaccedilatildeo do gene 16S rRNA
para Firmicutes Bacteroidetes e Bacteacuterias Totais69
IacuteNDICE DE TABELAS
Tabela 1 ndash Determinaccedilatildeo do perfil da populaccedilatildeo estudada referente agrave Seccedilatildeo 1 Dados
socioeconocircmicos Satildeo Paulo SP 2013-201472
Tabela 2 ndash Determinaccedilatildeo do perfil da populaccedilatildeo estudada referente agrave Seccedilatildeo 2 Histoacuteria
Familiar Satildeo Paulo SP 2013-201472
Tabela 3 ndash Determinaccedilatildeo do perfil da populaccedilatildeo estudada referente agrave Seccedilatildeo 3 Histoacuteria
Cliacutenica Satildeo Paulo SP 2013-2014 73
Tabela 4 ndash Determinaccedilatildeo do perfil da populaccedilatildeo estudada referente agrave Seccedilatildeo 4 Histoacuteria
Obsteacutetrica Satildeo Paulo SP 2013-2014 74
Tabela 5 ndash Determinaccedilatildeo do perfil da populaccedilatildeo estudada referente agrave Seccedilatildeo 5 Histoacuteria
Ginecoloacutegica Satildeo Paulo SP 2013-2014 75
Tabela 6 ndash Determinaccedilatildeo do perfil da populaccedilatildeo estudada referente agrave Seccedilatildeo 6
Consumo atual de tabaco Satildeo Paulo SP 2013-2014 75
Tabela 7ndash Determinaccedilatildeo do perfil da populaccedilatildeo estudada referente agrave Seccedilatildeo 7
Consumo atual de aacutelcool Satildeo Paulo SP 2013-2014 76
Tabela 8 ndash Tabela de determinaccedilatildeo do perfil da populaccedilatildeo estudada referente agrave Seccedilatildeo
8 Atividade Fiacutesica (IPAQ versatildeo curta) Satildeo Paulo SP 2013-2014 76
Tabela 9 ndash Tabela de determinaccedilatildeo do perfil da populaccedilatildeo estudada referente agrave Seccedilatildeo
9 Mudanccedilas recentes nos haacutebitos alimentares Satildeo Paulo SP 2013-2014 77
Tabela 10 ndash Participaccedilatildeo dos alimentos nos grupos meacutedias de consumo por dia dos
alimentos consumidos pela populaccedilatildeo estudada Satildeo Paulo SP 2013-2014 144
Tabela 11 ndash Definiccedilatildeo dos grupos alimentares derivados do Questionaacuterio de Frequecircncia
Alimentar (QFA) e percentual de consumo da populaccedilatildeo estudada Satildeo Paulo SP
2013-201479
Tabela 12 ndash Anaacutelise de consumo de energia e nutrientes da populaccedilatildeo estudada Satildeo
Paulo SP 2013-2014 81
Tabela 13 ndash Comparaccedilatildeo das variaacuteveis dieteacuteticas relacionadas agraves razotildees de ingestatildeo e
Valor Energeacutetico Total (VET) da populaccedilatildeo estudada Satildeo Paulo SP 2013-2014 83
Tabela 14 ndash Comparaccedilatildeo de variaacuteveis antropomeacutetricas da populaccedilatildeo estudada 89
Tabela 15 ndash Repetibilidade intra-ensaio e inter-ensaio da qPCR para Mollicutes Satildeo
Paulo SP 2013-2014 91
Tabela 16 ndash Comparaccedilatildeo entre os resultados obtidos no teste de sensibilidade pelas
teacutecnicas de PCR convencional e qPCR para detecccedilatildeo de Mollicutes Satildeo Paulo SP
2013-201491
Tabela 17 ndash Nuacutemero meacutedio de coacutepias e percentual dos grupos Mollicutes estudados
frente ao Filo Firmicutes na populaccedilatildeo estudada Satildeo Paulo SP 2013-2014 94
Tabela 18 ndash Nuacutemero meacutedio de coacutepias e percentual dos grupos de bacterianos
estudados frente agraves bacteacuterias totais na populaccedilatildeo estudada Satildeo Paulo SP 2013-
201495
Tabela 19 ndash Proporccedilatildeo de Firmicutes em relaccedilatildeo agrave Bacteroidetes na populaccedilatildeo
estudada Satildeo Paulo SP 2013-201495
SUMAacuteRIO
1 INTRODUCcedilAtildeO 26
2 REFERENCIAL TEOacuteRICO 29
21 Obesidade 29
22 Microbiota Intestinal 31
221 Microbiota intestinal uma peccedila chave na sauacutede e na doenccedila31
222 Colonizaccedilatildeo e composiccedilatildeo da microbiota intestinal32
223 Fatores que influenciam a composiccedilatildeo da microbiota intestinal 34
2231 Fases da vida 34
2232 Tipo de parto 34
2233 Tipo de aleitamento 35
2234 Uso de antibioacutetico 35
2235 Dieta 36
224 Microbiota intestinal e a fisiologia do hospedeiro 38
2241 Nutriccedilatildeo e Metabolismo 38
2242 Proteccedilatildeo 39
22421 Competiccedilatildeo direta de nutrientes 39
22422 Imunomodulaccedilatildeo 40
2243 Funccedilatildeo Troacutefica 43
2244 Regulaccedilatildeo da adiposidade 43
225 Microbiota intestinal e disbiose44
226 Microbiota Intestinal e obesidade47
227 Mecanismos pelos quais a microbiota intestinal contribui para a obesidade49
2271 Extraccedilatildeo de energia adicional da dieta49
2272 Induccedilatildeo da inflamaccedilatildeo por meio da alteraccedilatildeo da permeabilidade intestinal51
23 MOLLICUTES 52
231 Caracteriacutesticas Gerais dos Mollicutes52
232 Mollicutes Microbiota Intestinal e Obesidade56
3 OBJETIVOS 58
31 Objetivo geral 58
32 Objetivos especiacuteficos 58
4 MATERIAL E MEacuteTODOS 59
41 Protocolo do estudo 59
42 Casuiacutestica 59
43 Delineamento experimental 60
44 Determinaccedilatildeo do estado nutricional 60
441 Avaliaccedilatildeo qualitativa do consumo alimentar 60
442 Avaliaccedilatildeo antropomeacutetrica do estado nutricional 62
4421 Anaacutelise da Composiccedilatildeo Corporal pelo Meacutetodo de Bioimpedacircncia 63
45 Coleta das amostras cliacutenicas 64
46 Determinaccedilatildeo da microbiota intestinal 65
461 Padronizaccedilatildeo de reaccedilatildeo de PCR quantitativo (qPCR) por meio de TaqMan para a detecccedilatildeo de
Mollicutes 65
4611 Cepas bacterianas e condiccedilotildees de cultura 65
4612 Desenvolvimento de primers e sonda para a detecccedilatildeo de Mollicutes pela PCR quantitativa 65
4613 PCR quantitativa 66
4614 Especificidade da qPCR e repetibilidade intra e inter-ensaios 67
462 Reaccedilatildeo em cadeia da polimerase (PCR) convencional 68
463 Detecccedilatildeo de micro-organismos dos filos Firmicutes e Bacteroidetes e bacteacuterias totais (Eubacterias)
por PCR em tempo Real (qPCR) 68
47 Dosagem de citocinas do soro sanguiacuteneo 69
48 Anaacutelises Estatiacutesticas 70
5 RESULTADOS 71
51 Perfil da populaccedilatildeo estudada 71
52 Determinaccedilatildeo do estado nutricional 78
521 Avaliaccedilatildeo qualitativa do consumo alimentar 78
522 Avaliaccedilatildeo antropomeacutetrica do estado nutricional 88
53 Determinaccedilatildeo da microbiota intestinal 90
531 Padronizaccedilatildeo de reaccedilatildeo de PCR quantitativo (qPCR) por meio de TaqMan para a detecccedilatildeo de
Mollicutes 90
532 Detecccedilatildeo de micro-organismos dos filos Firmicutes e Bacteroidetes aleacutem de bacteacuterias totais
(Eubacterias) por PCR em tempo Real (qPCR) 93
54 Dosagem de citocinas do soro sanguiacuteneo 96
6 DISCUSSAtildeO 97
7 CONCLUSOtildeES 107
REFEREcircNCIAS 108
APEcircNDICE A ndash TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO 127
APEcircNDICE B ndash QUESTIONAacuteRIO 131
APEcircNDICE C- TABELA 10 143
26
1 INTRODUCcedilAtildeO
A obesidade eacute definida pela Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede (WHO 2002)
como o excesso de gordura corporal acumulada no tecido adiposo com implicaccedilotildees
para a sauacutede Algumas estimativas globais recentes indicam que em 2013 mais de
600 milhotildees da populaccedilatildeo mundial adulta (com 18 anos ou mais) eram obesos com
11 dos homens e 15 das mulheres (MARIE 2014) No Brasil em 2014 estimou-
se que na populaccedilatildeo adulta (20 anos ou mais) 105 milhotildees satildeo obesos com 124
dos homens e 169 das mulheres (IBGE 2014) Nesse contexto atualmente a
obesidade estaacute entre os maiores problemas de sauacutede puacuteblica e distuacuterbio da nutriccedilatildeo
A obesidade eacute considerada atualmente uma epidemia (BACON APHRAMOR 2011
OLSHANSKY et al 2005) As alteraccedilotildees nos padrotildees dieteacuteticos e nutricionais da
populaccedilatildeo brasileira tecircm sido analisadas no processo da transiccedilatildeo nutricional (KAC
VELAacuteSQUEZ-MELEacuteNDEZ 2003)
Neste processo verificou-se que ocorreu inversatildeo nos padrotildees de distribuiccedilatildeo
das alteraccedilotildees nutricionais A alta incidecircncia de sobrepeso e obesidade na
populaccedilatildeo implica no aumento da ocorrecircncia de doenccedilas cardiovasculares cacircncer
diabetes mellitus e hipertensatildeo arterial (AMUNA ZOTOR 2008 ARAI et al 2009
DUNCAN et al 1993 GIGANTE et al 1997 JIRTLE SKINNER 2007 KAC
VELAacuteSQUEZ-MELEacuteNDEZ 2003 LESSA 1998 MONDINI MONTEIRO 1998
POPKIN et al 2006) Na obesidade ocorre basicamente o balanccedilo energeacutetico
positivo cuja patogecircnese natildeo estaacute completamente elucidada estando associada a
fatores comportamentais culturais e bioloacutegicos A regulaccedilatildeo do balanccedilo energeacutetico e
do estoque de energia corporal satildeo influenciados pela susceptibilidade individual e
seu contexto social e econocircmico demograacutefico cultural educacional ambiental e
familiar aleacutem de fatores hormonais e de heranccedila geneacutetica (GORAN 2000 VEIGA
SICHIERI 2006)
O mapa gecircnico da obesidade humana estaacute constantemente em mudanccedila pela
identificaccedilatildeo de novos genes e regiotildees cromossocircmicas associadas com a
obesidade As alteraccedilotildees do comportamento alimentar e os haacutebitos sedentaacuterios
indicam ser os principais fatores de interferecircncia nos genes de susceptibilidade a
obesidade e consequentemente no aumento da obesidade mundial Eacute provaacutevel
27
portanto que a obesidade ocorra como a resultante de fatores poligecircnicos
complexos e um ambiente obesogecircnico (dieta e sedentarismo) (BAJZER SEELEY
2006 BOUCHARD 2000 CANI et al 2007 DERAM VILLARES 2009 DUNCAN et
al 2008 TURNBAUGH et al 2009)
A captaccedilatildeo de energia pode justificar em parte o metabolismo de alguns
pacientes obesos que natildeo apresentam ingestatildeo alimentar excessiva sugerindo que
a microbiota intestinal pode predispor o indiviacuteduo agrave obesidade (BACKHED 2004)
Alguns estudos tecircm demonstrado que o desenvolvimento da obesidade em
humanos pode ser determinado pelas proporccedilotildees relativas de dois filos principais de
bacteacuterias da microbiota intestinal humana Bacteroidetes e Firmicutes que diferem
consideravelmente entre indiviacuteduos eutroacuteficos e obesos (DUNCAN et al 2008 LEY
et al 2005 2006 TENNYSON FRIEDMAN 2008) Estudos comparativos
mostraram que ratos obesos possuem significativamente niacuteveis mais baixos de
micro-organismos do Filo Bacteroidetes e niacuteveis mais elevados de Firmicutes Este
uacuteltimo estaacute associado com um aumento de absorccedilatildeo de energia da dieta
(BACKHED 2004 CANI DELZENNE 2009 DIBAISE et al 2012 LEY et al 2005
RAOULT 2008 TURNBAUGH et al 2006) Turnbaugh et al (2008) obtiveram
resultados semelhantes em ratos com obesidade induzida por dieta Curiosamente
embora as alteraccedilotildees nos niacuteveis de Firmicutes e Bacteroidetes foram observadas
nos camundongos obesos por dieta induzida a diferenccedila foi relacionada
principalmente as bacteacuterias da classe dos Mollicutes
As espeacutecies do Filo Bacteriodetes pertencem agrave microbiota intestinal humana e
animal Estas bacteacuterias satildeo bacilos ou cocobacilos gram-negativos anaeroacutebios
obrigatoacuterios heterotroacuteficos mesoacutefilos sacaroliacuteticos natildeo formadores de esporos
imoacuteveis Satildeo resistentes agrave bile natildeo produzem pigmentos Tecircm como principais
produtos finais do metabolismo da glicose os aacutecidos succiacutenico e aceacutetico
(JOHANSSON PETTERSON 2002 MANILOFF 2002) O Filo Firmicutes
encontrado em maior proporccedilatildeo no trato gastrintestinal humano satildeo micro-
organismos Gram positivos na maioria Na classificaccedilatildeo atual o filo divide-se
tipicamente em trecircs classes Bacilli - aeroacutebios facultativos ou obrigatoacuterios Clostridia -
organismos anaeroacutebios e Erysipelotrichia Mollicutes eacute a uacutenica classe do filo
Tenericutes anteriormente classificada dentro do filo Firmicutes (BERGEYrsquos 2009
2010 LUDWIG KLENK 2001 RAZIN et al 1998)
28
Os estudos das interaccedilotildees de Bacteroidetes e Firmicutes na microbiota
intestinal e sua associaccedilatildeo com a obesidade tecircm aumentado No entanto a
participaccedilatildeo dos Mollicutes eacute praticamente desconhecida O gecircnero Mycoplasma foi
introduzido em 1929 para designar micro-organismos atualmente classificados
como membros da famiacutelia Mycoplasmataceae ordem Mycoplasmatales da classe
dos Mollicutes (Mollis = mole cuacutetis = pele) (RAZIN 1992) Os Mollicutes possuem
um genoma pequeno sendo que algumas espeacutecies apresentam o menor genoma
entre os procariotos e em consequecircncia apresentam metabolismo reduzido
(MILES NICHOLAS 1998 NEIMARK 1986 RAZIN TULLY 1983) Distinguem-se
de outros procariotos pela simplicidade celular genoma e metabolismo reduzido A
ausecircncia natural da parede celular confere resistecircncia aos antibioacuteticos beta-
lactamicos Incluem-se as sulfas e rimfapicina respectivamente pela ausecircncia da
siacutentese de aacutecido foacutelico e possuir uma polimerase diferente Com aproximadamente
200 espeacutecies estes micro-organismos infectam humanos animais insetos e
plantas Considerados em geral como oportunistas por excelecircncia colonizam
ldquopreferencialmenterdquo a superfiacutecie de mucosas de mamiacuteferos mas tecircm potencial de
causar infecccedilotildees sistecircmicas dependendo do hospedeiro (DYBVIG 1990 RAZIN
YOGEV NAOT 1998)
29
2 REFERENCIAL TEOacuteRICO
21 Obesidade
A prevalecircncia da obesidade tem crescido rapidamente e representa um dos
principais desafios de sauacutede puacuteblica neste seacuteculo A Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede
(OMS) estima que pelo menos 28 milhotildees de pessoas morrem em decorrecircncia da
obesidade (IMC ge 30 kgm2) A prevalecircncia mundial quase duplicou entre 1980 e
2008 com uma transiccedilatildeo de 5 dos homens e 8 das mulheres em 1980 para
10 dos homens e 14 das mulheres (WHO 2014) A obesidade pode ser definida
como o grau de armazenamento de gordura no organismo associada ao ganho
excessivo de peso corporal total Eacute portanto considerada uma doenccedila crocircnica
podendo acarretar em consequecircncias para a sauacutede devido agraves suas relaccedilotildees com
diversas complicaccedilotildees metaboacutelicas (MS 2006)
A pesquisa dos Orccedilamentos Familiares (POF IBGE 2010) nos uacuteltimos seis
anos indicou que a frequecircncia de pessoas com excesso de peso aumentou em mais
de um ponto percentual ao ano Desta maneira em dez anos o excesso de peso
poderia alcanccedilar dois terccedilos da populaccedilatildeo adulta do Brasil magnitude idecircntica agrave
encontrada na populaccedilatildeo dos Estados Unidos Estimativas de inqueacuteritos nacionais e
internacionais das uacuteltimas deacutecadas indicam que a obesidade em 2025 alcance 40
da populaccedilatildeo nos EUA 30 na Inglaterra e 20 no Brasil (HU 2008)
O excesso de peso e a obesidade na populaccedilatildeo expressam essencialmente
o desequiliacutebrio entre ingestatildeo e utilizaccedilatildeo de calorias A justificativa estaacute na
mudanccedila dos padrotildees de alimentaccedilatildeo e de atividade fiacutesica Em 2002-2003 revelou-
se tendecircncia crescente de substituiccedilatildeo de alimentos baacutesicos e tradicionais na dieta
brasileira (como arroz feijatildeo e hortaliccedilas) por bebidas e alimentos industrializados
(como refrigerantes biscoitos carnes processadas e comida pronta) Caracteriza-se
portanto o aumento na densidade energeacutetica das refeiccedilotildees e padrotildees de
alimentaccedilatildeo capazes de comprometer a auto-regulaccedilatildeo do balanccedilo energeacutetico dos
indiviacuteduos e aumentar o risco de obesidade (LEVY-COSTA et al 2005)
Aleacutem disto em consequecircncia agrave obesidade tem sido observado aumento
consideraacutevel da prevalecircncia de doenccedilas crocircnicas natildeo transmissiacuteveis como doenccedilas
cardiovasculares cacircncer diabetes mellitus e hipertensatildeo arterial Pelo longo tempo
30
de evoluccedilatildeo destas doenccedilas ocorrem lesotildees irreversiacuteveis de intensidade variada
resultando no aumento de incapacidade ou oacutebito vecircm ocupando um maior espaccedilo
no perfil de morbimortalidade de populaccedilotildees latino americanas (DUNCAN et al 1993
LESSA 1998) Em importante estudo entre 1958 e 1951 envolvendo cinco mil
indiviacuteduos de 35 a 75 anos por periacuteodo de ateacute 44 anos a obesidade (IMC gt 30Kgm2)
foi independentemente associada ao maior risco para hipertensatildeo (mulheres
RR=26 IC95 22-31) diabetes tipo 2 (mulheres RR=14 IC95 1-18) e doenccedila
cardiovascular mulheres RR=14 IC95 11-17) (WILSON et al 2002) Os ganhos
na diminuiccedilatildeo das taxas de tabagismo ao longo do seacuteculo XX e as expectativas no
aumento de tempo de vida podem ser neutralizadas pelas prespectivas do aumento
da obesidade (STEWART et al 2009) Especialmente em paiacuteses em
desenvolvimento como o Brasil o custo anual para o Sistema Uacutenico de Sauacutede para
atender as doenccedilas relacionadas ao sobrepeso eacute estimado em US$ 20152102171
(BAHIA et al 2012)
O ganho de peso ocorre pela menor utilizaccedilatildeo de gordura como fonte de
energia do que oxidar carboidratos elevando o coeficiente respiratoacuterio obtido
atraveacutes da razatildeo entre a produccedilatildeo de gaacutes carbocircnico resultante da oxidaccedilatildeo de
carboidratos e o consumo de oxigecircnio determinado atraveacutes de calorimetria (MARRA
et al 2004) Seis lesotildees monogecircnicas principais produzem desordens endoacutecrinas
que resultam na obesidade Deficiecircncia congecircnita de Leptina defeitos no receptor
de Leptina deficiecircncia no proacute-hormocircnio convertase 1(PC1) deficiecircncia em proacute-oacutepio-
melanocortina (POMC) defeitos no receptor da Melanocortina 4 (MC4R) e defeitos
no Receptor Ativado por Proliferadores de Peroxissoma (PPAR) O controle da
ingestatildeo alimentar a curto prazo eacute controlado principalmente por vias de
sinalizaccedilatildeo que emanam do trato gastrintestinal incluindo o peptiacutedeo orexiacutegenico
grelina que ativa os sinais de fome e os peptiacutedeos anorexigecircnicos
colecistoquinina (CCK) peptiacutedeo similar ao glucagon 1- glucagon-like peptide 1
(GLP-1) e peptiacutedeo tirosina-tirosina (PYY) que geram sinais de saciedade Para o
controle da ingestatildeo agrave longo prazo parecem ser primordiais os sinais que emanam a
partir do tecido adiposo (leptina) e pacircncreas (insulina) liberados em resposta agrave
ingestatildeo de alimentos e depoacutesitos de gordura corporal (KONTUREK et al 2004)
Tem sido amplamente documentado na literatura o reganho de peso
sucessivo agraves dietas pois sabe-se que cerca de um a dois terccedilos do peso perdido
31
tendem a ser recuperados no ano seguinte sendo a recuperaccedilatildeo quase total ao final
de cinco anos (GOODRICK et al 1996) A partir disso tem sido questionado o
efeito das dietas restritivas sobre a biologia humana e sua contribuiccedilatildeo para tornar a
obesidade uma condiccedilatildeo que possivelmente se autoperpetua e se agrava de
maneira progressiva Diversos trabalhos mostram que a ciclagem de peso (ou efeito
sanfona) pode aumentar a suscetibilidade para o ganho de massa corporal no
futuro (KORKEILA et al1999 NEUMARK-SZTAINER et al 2006 2007)
22 Microbiota Intestinal
221 Microbiota intestinal uma peccedila chave na sauacutede e na doenccedila
Nas deacutecadas passadas acreditava-se que todos os micro-organismos da
microbiota possuiacuteam potencial de causar infecccedilotildees O estudo da interaccedilatildeo entre
micro-organismos e o desenvolvimento de enfermidades eacute um tema crescente na
justificativa de certas doenccedilas (DETHLEFSEN et al 2007) O termo microbiota
refere-se ao conjunto de micro-organismos no hospedeiro sadio e o termo
microbioma eacute o conjunto de genes microbianos (BACKHED 2004 LANGA 2006
VRIEZE 2010) O estudo da diversidade e distribuiccedilatildeo da microbiota e sua interaccedilatildeo
com hospedeiro tem contribuiacutedo na justificativa de algumas doenccedilas (LEY et al
2008 VENTURA et al 2008) A microbiota do trato gastrintestinal humano eacute o
ecossistema mais complexo constituiacutedo por diversas espeacutecies de micro-organismos
As bacteacuterias constituem o grupo com maior diversidade e abundacircncia Assim como o
genoma de cada indiviacuteduo eacute uma impressatildeo digital a composiccedilatildeo da microbiota
intestinal tambeacutem parece ser (LEY et al 2006 RAJILIĆ-STOJANOVIĆ SMIDT DE
VOS 2007 XU GORDON 2003)
O comensalismo e a simbiose bacteriana refletem uma ldquocorrida dinacircmicardquo
que se inicia no encontro da bacteacuteria com o hospedeiro vulneraacutevel e prossegue com
respostas adaptativas entre os dois organismos Em alguns casos a coevoluccedilatildeo
atenua a virulecircncia e conduz a uma coexistecircncia paciacutefica com ou sem franca
codependecircncia Em outras circunstacircncias a relaccedilatildeo patogecircnica eacute mantida por meio
da superaccedilatildeo dos mecanismos de defesas inatas ou adaptativas do hospedeiro
pelas bacteacuterias (GORDON HOOPER 2001) Estima-se que a microbiota intestinal eacute
composta por mais de 1000 espeacutecies bacterianas O nuacutemero de ceacutelulas microbianas
32
no luacutemen intestinal eacute de 10 vezes maior que as ceacutelulas eucarioacuteticas do organismo
representando em torno de 1 kg de peso corporal (SCARPELLINI 2010) Aleacutem
disso o microbioma eacute 100 vezes maior que o genoma humano podendo-se assim
considerar a microbiota intestinal como um oacutergatildeo virtual exteriorizado
metabolicamente adaptaacutevel e flexiacutevel aleacutem de rapidamente renovaacutevel o que
contribui para metabolismo e desempenha importante papel na obtenccedilatildeo de energia
da dieta (FRANCcedilOIS-PIERRE 2009)
A microbiota intestinal eacute crucial para a vida humana com impacto na fisiologia
e na nutriccedilatildeo do hospedeiro (HATTORI TAYLOR 2008) Considera-se que
humanos satildeo ldquosuperorganismosrdquo com metabolismo mediado pelos atributos
humanos e microbianos (GILL et al 2006) O conceito de ldquosuperorganismordquo
representa importante mudanccedila de paradigma no entendimento da biologia humana
e pode ter impacto expressivo na prevenccedilatildeo e na terapia de doenccedilas no futuro
(NICHOLSON 2006)
222 Colonizaccedilatildeo e composiccedilatildeo da microbiota intestinal
O trato gastrintestinal fetal eacute considerado praticamente esteacuteril No nascimento
eacute rapidamente colonizado por micro-organismos da matildee e do ambiente hospitalar
(PALMER et al 2007) Sugere-se que de trecircs a quatro semanas apoacutes o nascimento
a microbiota intestinal comeccedila a se estabilizar aumentando gradualmente a sua
complexidade Apoacutes um ano assemelha-se agrave microbiota de um adulto (MACKIE et
al 1999 PALMER et al 2007 SCHEacuteLE et al 2013) Contrapondo-se agrave percepccedilatildeo
da ausecircncia de micro-organismos no feto demonstrou-se a presenccedila de DNA
bacteriano na placenta e no cordatildeo umbilical (JIMEacuteNEZ et al 2005 SATOKARI et
al 2009) Aleacutem disso a identificaccedilatildeo de algumas bacteacuterias no mecocircnio explica a
origem dos primeiros micro-organismos colonizadores do intestino antes mesmo do
nascimento possivelmente como um mecanismo adaptativo para o desenvolvimento
do intestino fetal fora do organismo materno (JIMEacuteNEZ et al 2008)
Os micro-organismos presentes no trato gastrintestinal podem ser autoacutectones
ou aloacutectones Linhagens autoacutectones tecircm longa associaccedilatildeo com o hospedeiro e
formam uma populaccedilatildeo estaacutevel de tamanho caracteriacutestico em uma regiatildeo do
intestino Os organismos aloacutectones satildeo adquiridos principalmente atraveacutes dos
alimentos ingeridos e do ecossistema oral Eacute difiacutecil determinar se um organismo eacute
33
um autoacutectone verdadeiro Contudo as bacteacuterias aloacutectones natildeo persistem no
ecossistema e satildeo detectaacuteveis apenas por um periacuteodo limitado (GORDON
HOOPER 2001 LEY et al 2006 WALTER 2008)
Os micro-organismos satildeo encontrados em todo o trato gastrintestinal no
entanto as mudanccedilas nas condiccedilotildees fisioloacutegicas implicam diferenccedilas na
composiccedilatildeo de micro-organismos nos diversos locais No trato gastrintestinal
inferior o fluxo do conteuacutedo torna-se mais lento e o ambiente conteacutem menos
substacircncias antimicrobianas favorecendo a colonizaccedilatildeo microbiana e o
estabelecimento de maior densidade de micro-organismos (QIN et al 2010
ZOETENDAL et al 2006) A partir da cavidade oral ao acircnus tem sido observado o
aumento da densidade microbiana no jejuno iacuteleo e no intestino grosso em
comparaccedilatildeo com o estocircmago e duodeno O coacutelon refere-se a um ecossistema
complexo com ampla diversidade microbiana e presenccedila de diversos gecircneros
bacterianos O pH neutro e a abundacircncia relativa de nutrientes como os
carboidratos natildeo digeriacuteveis e outros componentes alimentares que escapam do
processo digestivo tornam o coacutelon um ambiente favoraacutevel agrave proliferaccedilatildeo microbiana
O coacutelon eacute a regiatildeo do TGI que apresenta maior densidade microbiana podendo
alcanccedilar 1014UFCg-1 Dados tem mostrado que cada indiviacuteduo carrega mais de
1000 filotipos que representam mais de 7000 linhagens (AZAD et al 2013
ECKBURG et al 2005 FRANK et al 2007 HOLZAPFEL 2006 KLEEREBEZEM
VAUGHAN 2009 LEY et al 2008 QUIGLEY 2013 ZOETENDAL et al 2006)
Aproximadamente 99 dos genes identificados por metagenoma do intestino
humano satildeo bacterianos Na maioria dos indiviacuteduos cerca de 90 dos filos satildeo
Firmicutes e Bacteroidetes seguidos por Actinobacterias (famiacutelia Bifidobacteriaceae)
e Proteobacterias (famiacutelia Enterobacteriaceae) O filo mais abundante refere-se ao
Firmicutes apresentando como principais integrantes as classes Bacilli Clostridia e
Molicutes e dos Bacteroidetes as classes Bacteroides Flavobacteria e
Sphingobacterias Os filos Actinobacterias e Proteobacterias se apresentam em
menor proporccedilatildeo (ARUMUGAM et al 2011 DE FILIPPO et al 2010
HUTTENHOWER et al 2012 QIN et al 2010 QUIGLEY 2013 VILLANUEVA-
MILLAacuteN et al 2015 VRIEZE 2010 ZOETENDAL et al 2006)
34
223 Fatores que influenciam a composiccedilatildeo da microbiota intestinal
A microbiota do TGI humano eacute uma comunidade complexa cuja composiccedilatildeo
eacute inconstante diferindo inter e intra-individualmente definida por uma seacuterie de
fatores como geneacutetica do hospedeiro alimentaccedilatildeo sucessatildeo bacteriana funccedilatildeo
imune e estado de sauacutede (LEY et al 2008 EVERARD et al 2011 2014)
2231 Fases da vida
A diversidade bacteriana no intestino infantil eacute inicialmente muito baixa ateacute os
dois anos ao contraacuterio da microbiota de adulto (GAREAU et al 2010 HAJELA et al
2015) A baixa diversidade de bacteacuterias na primeira infacircncia inibe a maturaccedilatildeo
regular da microbiota intestinal e maturaccedilatildeo tardia da mucosa do sistema
imunoloacutegico implicando em riscos do aumento da resposta imune assim como
doenccedilas aleacutergicas Neste contexto envolve o desenvolvimento da toleracircncia oral e a
susceptibilidade da crianccedila a alergias e inflamaccedilatildeo A microbiota sofre portanto
mudanccedilas substanciais nos extremos da vida essas ramificaccedilotildees ainda estatildeo sendo
exploradas (AURELI et al 2011 HAJELA et al 2015 SHERIDAN et al 2014
SMITH et al 2013)
2232 Tipo de parto
A microbiota maternal eacute uma fonte de micro-organismos para a colonizaccedilatildeo do
TGI do receacutem-nascido As bacteacuterias residentes no canal vaginal e na regiatildeo perineal
tambeacutem ganham acesso ao TGI de receacutem-nascidos (BRY et al 1996 MACKIE et
al 1999) Ocorrem diferenccedilas entre o microbioma de um bebecirc receacutem-nascido por
parto normal em comparaccedilatildeo ao bebecirc receacutem-nascido por parto cesaacuterea No parto
vaginal o bebecirc eacute colonizado por bacteacuterias vaginais e fecais maternas cujas
composiccedilatildeo microbiana reflete a microbiota intestinal materna composta
predominantemente pelos gecircneros Lactobacillus Prevotella Atopobium e Sneathia
As amostras fecais de bebecircs nascidos de parto cesariana apresentaram gecircneros
tiacutepicos de microbiota da pele e do ambiente hospitalar predominantemente
Staphylococcus e C difficile Estes bebecircs tambeacutem apresentaram niacuteveis
significativamente mais baixos de Bifidobacterium e diversidade bacteriana menor do
que os bebecircs nascidos por parto normal Estas diferenccedilas podem justificar o
aumento do risco de doenccedilas especiacuteficas em bebecircs receacutem-nascidos por parto
35
cesariana agrave longo prazo (AZAD et al 2013 BELLO et al 2010 COLLADO et al
2012 DOMINGUEZ- PENDERS et al 2006 PRINCE et al 2014)
As diferenccedilas no processo de colonizaccedilatildeo intestinal decorrentes do tipo de
parto poderiam refletir-se no desenvolvimento do sistema imunoloacutegico visto que os
micro-organismos gastrintestinais influenciam esse processo por meio do envio de
importantes sinais regulatoacuterios necessaacuterios para o desenvolvimento da adequada
toleracircncia ao ambiente (BIASUCCI et al 2008 CARDWELL et al 2008
DOMINGUEZ-BELLO et al 2010 KOENIG et al 2011 MORELLI et al 2008
RENZ-POLSTER et al 2005)
2233 Tipo de aleitamento
O leite materno humano eacute considerado um dos principais fatores da iniciaccedilatildeo e
no desenvolvimento da microbiota do neonato uma vez que conteacutem substratos
(prebioacuteticos) para estimular o crescimento bacteriano e tambeacutem eacute fonte de micro-
organismos Estima-se que o consumo de 800 ml de leite materno por dia
proporcione 1 x 105 a 1 x 107 micro-organismos comensais durante a amamentaccedilatildeo
(MARTIN et al 2004) Desta maneira a contagem de Bifidobacterium aumenta
drasticamente Lactobacillus e Bacteroides aumentam em menor proporccedilatildeo e
enterobacteacuterias e enterococos diminuem Espeacutecies de Bifidobacterium
correspondem de 80 a 90 do total dos componentes da microbiota fecal infantil
presentes em bebecircs amamentados por leite materno Jaacute em receacutem-nascidos
alimentados com foacutermulas infantis a microbiota tem demonstrado ser muito mais
complexa sendo composta por Bifidobacterium Bacteroides Clostridium e
Streptococcus (ADLERBERTH WOLD 2009 CUMMINS THOMPSON 1997 DE
SANTA BARBARA et al 2003 DONOVAN ODIE 1994 DONOVAN 2006 MACKIE
et al 1999 MARQUES et al 2010 MCCRACKEN LORENZ 2001 PALMER
2011 POROYKO et al 2010)
2234 Uso de antibioacutetico
A eventual antibioticoterapia interfere tambeacutem no equiliacutebrio da microbiota A
disbiose (alteraccedilatildeo da microbiota) depende de fatores como espectro de accedilatildeo da
droga idade e dieta do indiviacuteduo dosagem e duraccedilatildeo do tratamento via de
administraccedilatildeo propriedades farmacocineacuteticas e farmacodinacircmicas aleacutem de grau de
36
resistecircncia da comunidade (LEY 2000 SULLIVAN et al 2001) A seleccedilatildeo de
bacteacuterias resistentes a drogas pela antibioticoterapia eacute um problema mundial Os
genes de resistecircncia passam para diversos gecircneros bacterianos no intestino A
aquisiccedilatildeo de genes de resistecircncia confere benefiacutecios a determinada espeacutecie
bacteriana diante da pressatildeo seletiva exercida pelo antibioacutetico Quando essa
pressatildeo seletiva eacute suspensa a cepa resistente apresenta menor desempenho em
comparaccedilatildeo com a espeacutecie susceptiacutevel No entanto esse clone menos competitivo
pode compensar essa perda de desempenho pela aquisiccedilatildeo de mutaccedilotildees
compensatoacuterias (JERNBERG et al 2010) No intestino os antibioacuteticos aleacutem de
selecionarem bacteacuterias resistentes tambeacutem aumentam o nuacutemero de transferecircncias
do pool de genes de ceacutelulas resistentes (DETHJEFSEN et al 2008 KARAMI et al
2007 YANG et al 2009)
2235 Dieta
Muitos estudos tem sido realizados no intuito de compreender a relaccedilatildeo entre o
consumo alimentar e a composiccedilatildeo da microbiota intestinal principalmente no
sentido de uma dieta ocidentalizada baseada em alimentos ricos em carboidratos
simples lipiacutedios e proteiacutenas de origem animal sal e poucos alimentos in natura
como frutas e hortaliccedilas ao comparar se com a dietas dos nossos antepassados
caracterizada pelo consumo de grandes quantidades de amido fibras e
polissacaacuteridos vegetais aleacutem de pequenas quantidades de gordura e proteiacutena
animal Em modelos murinos de obesidade induzida por padratildeo de dieta ocidental
no qual animais geneticamente idecircnticos que herdaram microbiotas semelhantes a
relaccedilatildeo entre dieta e representantes microbianos eacute dinacircmica e ajustaacutevel impactando
a capacidade da microbiota de promover a adiposidade no hospedeiro (CARMODY
et al 2015 DAVID et al 2014 DE FILIPPO et al 2010 FLEISSNER et al 2010
HILDEBRANDT et al 2009 LEY et al 2008 MENDONCcedilA ANJOS 2004 WALKER
et al 2011 WONG et al 2012 WU et al 2011)
Uma vez que a microbiota foi estabelecida nestes primeiros anos observa-se
um aumento na composiccedilatildeo microbiana tanto na diversidade quanto na riqueza
atingindo a mais alta complexidade em adultos com vaacuterias centenas de filotipos e
niacuteveis de espeacutecie Cada indiviacuteduo humano atinge um cliacutemax de composiccedilatildeo
homeostaacutetico o que provavelmente permanece relativamente estaacutevel durante a
37
maior parte da vida de um adulto saudaacutevel Nas fases tardias da vida a composiccedilatildeo
da microbiota torna-se novamente menos diversificada e mais dinacircmica
caracterizada por uma maior proporccedilatildeo de Bacteroidetes para Firmicutes aumento
de Proteobacteria e diminuiccedilatildeo da Bifidobacterium (MACKIE 1999 OTTMAN et al
2012 RAUTAVA et al 2012 VILLANUEVA-MILLAacuteN et al 2015) (Figura 1)
Figura 1 ndash Fatores envolvidos no estabelecimento da microbiota humana ao longo
da vida
Adaptado de MJ Villanueva-Millaacuten et al 2015
38
224 Microbiota intestinal e a fisiologia do hospedeiro
O intestino representa a interface natural entre microbiota intestinal e o
hospedeiro sendo a mucosa intestinal a localizaccedilatildeo principal para a interaccedilatildeo de
micro-organismos e antiacutegenos com o hospedeiro por meio de intenso cross-talk
(KINROSS et al 2011) Os achados de estudos cliacutenicos e experimentais tecircm
evidenciado que a interaccedilatildeo microbiotahospedeiro pode influenciar favoravelmente
a sauacutede do hospedeiro de diversas maneiras Ateacute agora as principais funccedilotildees
conhecidas da microbiota podem ser classificadas em quatro grupos metaboacutelica
(nutriccedilatildeo e digestatildeo) proteccedilatildeo (proteccedilatildeo contra agentes patogecircnicos
imunomodulaccedilatildeo) troacutefica (controle da proliferaccedilatildeo de ceacutelulas epiteliais e
diferenciaccedilatildeo) e regulaccedilatildeo da adiposidade
2241 Nutriccedilatildeo e Metabolismo
A microbiota intestinal eacute um importante fator que afeta a extraccedilatildeo de energia a
partir da dieta e do armazenamento de energia no hospedeiro A fim de realizar
estas funccedilotildees as enzimas metaboacutelicas da microbiota intestinal como as glicosidases
e polissacaridases tecircm a capacidade de extrair energia a partir de nutrientes
inacessiacuteveis uma vez que estas enzimas satildeo capazes de clivar ligaccedilotildees glicosiacutedicas
presentes em alguns polissacariacutedeos de plantas e fibras dieteacuteticas (BACKHED et al
2004 2005 GUARNER MALAGELADA 2003) Os polissacariacutedeos natildeo digeriacuteveis
como a oligofrutose (inulina) satildeo metabolizados pela microbiota colocircnica em
oligossacariacutedeos e monossacariacutedeos e entatildeo fermentados a aacutecidos graxos de
cadeia curta (AGCC) particularmente acetato propionato e butirato Estes AGCC
satildeo rapidamente absorvidos O Butirato fornece energia para o metabolismo celular
enquanto acetato e propionato seguem para a corrente sanguiacutenea sendo
transportados para o fiacutegado e oacutergatildeos perifeacutericos onde podem atuar como substratos
para a gliconeogecircnese e lipogecircnese (SHEN et al 2013 ZAIBI et al 2010)
A microbiota intestinal tambeacutem induz a expressatildeo do peptiacutedeo YY (PYY)
anorexigecircnico que geram sinais de saciedade atraveacutes de um mecanismo
dependente do receptor GPR41 Assim a produccedilatildeo de AGCC pela microbiota
intestinal estaacute associada com um aumento na saciedade e uma reduccedilatildeo na ingestatildeo
de alimentos no hospedeiro o qual por sua vez controla o ganho de peso corporal
(CLUNY et al 2015 SHEN et al 2013 ZAIBI et al 2010) Outros mecanismos
39
pelos quais as bacteacuterias do intestino podem influenciar metabolismo do colesterol
satildeo induzidos atraveacutes de Fasting Induced Adipocyte Factor (FIAF) que eacute
seletivamente suprimida no epiteacutelio intestinal pela microbiota intestinal (MARTINEZ
et al 2009)
Tambeacutem tem sido relatado o envolvimento da microbiota intestinal na
metabolizaccedilatildeo de polifenoacuteis que contribuem para o seu potencial antioxidante e
accedilotildees beneacuteficas aleacutem de siacutentese de algumas vitaminas como B12 e K aleacutem da
induccedilatildeo da expressatildeo do receptor de vitamina D pelos AGCC aumentando a sua
absorccedilatildeo e regulando o metabolismo do caacutelcio (BRENCHLEY DOUEK 2012
GUARNER MALAGELADA 2003 KIM et al 1998 MANACH DONOVAN 2004
RESTA 2009 SCALBERT WILLIAMSON 2000) Finalmente a microbiota intestinal
tambeacutem eacute capaz de executar uma seacuterie de biotransformaccedilotildees em xenobioacuteticos
como drogas e seus metaboacutelitos em formas que podem afetar sua absorccedilatildeo e
biodisponibilidade (WILSON NICHOLSON 2009) Neste contexto tem sido
demonstrado que a microbiota intestinal metaboliza toacutexicos e compostos
potencialmente canceriacutegenos tais como pirolisatos (BRENCHLEY DOUEK 2012)
2242 Proteccedilatildeo
Tem sido observado que a ausecircncia da microbiota intestinal torna o organismo
suscetiacutevel agrave infecccedilatildeo Alguns dos mecanismos envolvidos nessas accedilotildees protetoras
incluem competiccedilatildeo direta de nutrientes limitados e a modulaccedilatildeo de respostas
imunoloacutegicas no hospedeiro (GUARNER MALAGELADA 2003 KAMADA et al
2013 SEKIROV et al 2010)
22421 Competiccedilatildeo direta de nutrientes
Vaacuterios mecanismos tecircm sido implicados na resistecircncia agrave colonizaccedilatildeo do trato
gastrintestinal por patoacutegenos A camada de muco intestinal eacute capaz de manter
mutualismos mantendo as bacteacuterias no compartimento e restringindo estimulaccedilatildeo
imunoloacutegica ostensiva O hospedeiro fornece ativamente os nutrientes que a
microbiota precisa e a microbiota indica a quantidade de nutrientes que satildeo
necessaacuterios para o hospedeiro Esta relaccedilatildeo impede superproduccedilatildeo indesejada do
nutriente o que favoreceria a intrusatildeo de micro-organismos competitivos com
potencial de patogenicidade Finalmente as bacteacuterias podem inibir o crescimento
40
dos seus concorrentes produzindo peptiacutedeos antimicrobianos ou proteiacutenas
conhecidas como bacteriocinas que satildeo sintetizadas em ribossomos (GUARNER
MALAGELADA 2003 MONTALTO et al 2009 PURCHIARONI et al 2013
SEKIROV et al 2010)
22422 Imunomodulaccedilatildeo
As interaccedilotildees entre micro-organismos e ceacutelulas epiteliais e imunes baseiam-se
no reconhecimento de padrotildees moleculares associados agrave micro-organismos
(MAMPs) sendo mediado por receptores de reconhecimento padratildeo representados
pelos receptores do tipo toll (TLR) encontrados na superfiacutecie de ceacutelulas epiteliais e
imunes e pelos receptores de domiacutenio de digomerizaccedilatildeo de ligaccedilatildeo de nucleotiacutedeos
(NOD) que se encontram no citoplasma Esses receptores desempenham um
importante papel na gecircnese e na modulaccedilatildeo da resposta inflamatoacuteria (FRANCHI et
al 2009 MARANDUBA et al 2014 MONTALTO et al 2009 PURCHIARONI et al
2013)
A interaccedilatildeo funcional entre microbiota intestinal e sistema imunoloacutegico inicia-
se com a promoccedilatildeo de um ambiente anti-inflamatoacuterio pelas bacteacuterias (Figura 2) Em
um contexto simbioacutetico MAMPs estimulam continuamente atraveacutes das IECs (ceacutelulas
epiteliais intestinais) a secreccedilatildeo das proteiacutenas antimicrobianas intestinais REGIIIγ
para o luacutemen aleacutem de linfopoietina estromal tiacutemica (TSLP) IL-33 IL-25 e o fator de
crescimento tumoral-β (TGF-β) sob o epiteacutelio Esses mediadores imunoloacutegicos
induzem o desenvolvimento de macroacutefagos tolerogecircnicos e ceacutelulas dendriacuteticas
(DCs) tolerogecircnicas (KAMADA et al 2013 MAYNARD et al 2012)
Ceacutelulas Dendriacuteticas (DCs) tolerogecircnicas produzem TGF-β e aacutecido retinoacuteico
(RA) que estimulam o desenvolvimento de Ceacutelulas T regulatoacuterias (Treg) Assim
atraveacutes das ceacutelulas Treg (que utilizam diversos mecanismos de regulaccedilatildeo)
macroacutefagos (que produzem IL-10) e DCs tolerogecircncicos o sistema imunoloacutegico
intestinal eacute capaz de estabelecer e manter um ambiente anti-inflamatoacuterio Aleacutem dos
papeacuteis reguladores essenciais de TGF-β esta citocina tem sido associada com
outras substacircncias derivadas do epiteacutelio tais como fator de ativaccedilatildeo de ceacutelulas β
(FABF) e ligante indutor de proliferaccedilatildeo (APRILL) com o intuito de induzir o
desenvolvimento de ceacutelulas produtoras de IgA (plasmoacutecitos) (FAGARASAN et al
2010) Esta imunoglobulina eacute capaz de prevenir a ligaccedilatildeo de bacteacuterias comensais no
41
epiteacutelio do hospedeiro estando portanto envolvida na formaccedilatildeo da microbiota
intestinal (MACPHERSON et al 2012)
Aleacutem disto tem sido relatada que a produccedilatildeo de alguns tipos de peptiacutedeos
antimicrobianos bacterianos (AMPs) como a secreccedilatildeo das proteiacutenas
antimicrobianas intestinais REGIIIγ REGIIIβ e angiogenina-4 eacute influenciada pela
micro-organismos comensais via TLR MyD88 (FRANCHI et al 2009 GOTO
IVANOV 2013 VAN VLIET et al 2010) Desse modo verifica-se que no intestino
humano saudaacutevel a microbiota promove constante exposiccedilatildeo de ligantes aos TLR
garantindo a ativaccedilatildeo basal contiacutenua de vias de sinalizaccedilatildeo resultando em
inflamaccedilatildeo fisioloacutegica de baixa intensidade Aleacutem disso micro-organismos
comensais tambeacutem satildeo capazes de suprimir respostas inflamatoacuterias intensas (VAN
VLIET et al 2010)
42
Figura 2 ndash Interaccedilatildeo funcional entre a microbiota intestinal humana e o sistema
imunoloacutegico
Legenda ndash O equiliacutebrio evolutivo eacute formado ao longo do tempo sendo modulado por pressatildeo ambiental A
microbiota intestinal e o ambiente intestinal satildeo desenvolvidas em conjunto sendo necessaacuterio para o benefiacutecio de ambos tolerar um ao outro O sistema imunoloacutegico monitora essa interaccedilatildeo garantindo a homeostase e contribuindo para a simbiose No entanto o desequiliacutebrio causado na presenccedila de disbiose pode causar a reaccedilatildeo do sistema imunoloacutegico Simbiose e disbiose dependem de equiliacutebrio entre bacteacuterias comensais e patogecircnicas Bacteacuterias comensais promovem um ambiente anti-inflamatoacuterio Em um contexto de simbiose MAMPs estimulam continuamente as IECs a secretarem moleacuteculas que atuam protegendo o epiteacutelio e produzindo um ambiente tolerogecircnico Em disbiose haacute uma liberaccedilatildeo significativa de MAMPs que podem induzir IECs DCs ativadas e macroacutefagos a secretar citocinas inflamatoacuterias Consequentemente haacute um desenvolvimento de efetores imunoloacutegicos IL-22 eacute produzida em ambas as situaccedilotildees mas a contribuiccedilatildeo para a remodelaccedilatildeo da barreira epitelial eacute controlada por regulaccedilatildeo imune M macroacutefago Com bacteacuterias comensais Pato bacteacuterias patogecircnicas
Adaptado de MARANDUBA et al 2014
43
2243 Funccedilatildeo Troacutefica
A microbiota intestinal desempenha funccedilotildees troacuteficas modulando a proliferaccedilatildeo
e diferenciaccedilatildeo de ceacutelulas epiteliais do coacutelon atraveacutes dos AGCC produzidos na
fermentaccedilatildeo de hidratos de carbono natildeo digeriacuteveis Neste contexto o butirato eacute
considerado o AGCC com maior efeito pois promove o crescimento e o turnover das
ceacutelulas epiteliais acelerando a maturaccedilatildeo intestinal da mucosa durante o seu
desenvolvimento ou para induzir seu reparo apoacutes uma lesatildeo O butirato eacute capaz de
aumentar proliferaccedilatildeo diferenciaccedilatildeo e maturaccedilatildeo aleacutem de reduzir apoptose de
enteroacutecitos normais no intestino delgado atraveacutes de sua influecircncia sobre a
expressatildeo de genes e a siacutentese de proteiacutenas (GUILLOTEAU et al 2010 HAMER et
al 2008)
O butirato parece exercer um efeito troacutefico em ceacutelulas epiteliais do iacuteleo e do
jejuno atraveacutes de um mecanismo de neuro-hormonal sugerindo um efeito indireto
No coacutelon a ausecircncia de butirato induziu apoptose massiva nos colonoacutecitos podendo
ser explicado pelo fato de que o butirato eacute a fonte principal de energia para estas
ceacutelulas aleacutem de estimular a liberaccedilatildeo de peacuteptidos gastrointestinais eou fatores de
crescimento que desempenham um papel fundamental na proliferaccedilatildeo celular
(GUILLOTEAU et al 2010 HAMER et al 2008)
2244 Regulaccedilatildeo da adiposidade
Tem sido evidenciado que a microbiota intestinal influecircncia a adiposidade do
hospedeiro A primeira evidecircncia do papel da microbiota intestinal na regulaccedilatildeo da
homeostase energeacutetica e adiposidade do hospedeiro foi demonstrada por Backhed
et al (2004) em estudo que foi demonstrado que ratos germ-free apresentavam
menor conteuacutedo de gordura corporal do que ratos convencionais mesmo ao
consumirem a mesma quantidade de alimentos Diferentes mecanismos tecircm sido
propostos para explicar a relaccedilatildeo entre microbiota intestinal e a adiposidade Assim
dependendo da sua composiccedilatildeo a microbiota pode aumentar a extraccedilatildeo energeacutetica
da dieta a partir de polissacariacutedeos natildeo digeriacuteveis com menor conteuacutedo de energia
disponiacutevel nas fezes aleacutem de maiores niacuteveis de AGCC no intestino Propotildee-se
ainda que a microbiota intestinal seja capaz de induzir a regulaccedilatildeo de genes do
hospedeiro que modulam o metabolismo energeacutetico (MUSSO et al 2011)
44
225 Microbiota intestinal e disbiose
Em condiccedilotildees saudaacuteveis existe um equiliacutebrio entre todos os micro-organismos
presentes no intestino estando as bacteacuterias beneacuteficas em maior quantidade
(eubiose) Entretanto pode ocorrer desequiliacutebrio na microbiota com consequente
predomiacutenio das bacteacuterias potencialmente patogecircnicas sobre as beneacuteficas Esse
desequiliacutebrio eacute definido como disbiose e pode comprometer a sauacutede do hospedeiro
uma vez que se associa agrave patogecircnese de vaacuterias doenccedilas (HAWRELAK MYERS
2004)
O uso de antibioacuteticos anti-inflamatoacuterios hormonais e natildeo hormonais abuso de
laxantes consumo excessivo de alimentos processados baixo consumo de
alimentos crus excessiva exposiccedilatildeo a toxinas ambientais incluindo alguns metais
pesados doenccedilas consumptivas como cacircncer e siacutendrome da imunodeficiecircncia
adquirida (AIDS) disfunccedilotildees hepatopancreaacuteticas estresse divertiacuteculos idade
tempo de tracircnsito e pH intestinal disponibilidade de material fermentaacutevel estado
imunoloacutegico do hospedeiro e infecccedilotildees satildeo fatores importantes para promover
alteraccedilatildeo da microbiota acarretando em disbiose intestinal e consequentemente
modificando vaacuterias funccedilotildees do TGI incluindo a digestatildeo a
biodisponibilidadeabsorccedilatildeo eliminaccedilatildeo desintoxicaccedilatildeo e funccedilatildeo imunoloacutegica
(ALMEIDA et al 2009 HAWRELA MYERS 2004 SEARS GENUIS 2012)
Em um contexto de disbiose (Figura 2) a presenccedila de agentes patogeacutenicos
pode perturbar a regulaccedilatildeo do ambiente anti-inflamatoacuterio Quando patoacutegenos
enteacutericos superam as bacteacuterias comensais o desequiliacutebrio entre comensais e
bacteacuterias patogecircnicas provoca uma liberaccedilatildeo significativa de MAMPs Este aumento
pode induzir IECs DCs e macroacutefagos ativados a secretar citocinas inflamatoacuterias
como a IL-1β IL-6 IL-12 e IL-23 Estas citocinas estimulam o desenvolvimento de
ceacutelulas CD4+ T auxiliares (T helper - TH1) e ceacutelulas TH17 (produzem IL-17A IL-
17F e IL-22) resultando na inflamaccedilatildeo crocircnica (MAYNARD et al 2012)
Na vigecircncia da disbiose intestinal pode ocorrer perda de funccedilotildees importantes
da microbiota do hospedeiro As alteraccedilotildees qualitativas e quantitativas na microbiota
intestinal aleacutem das alteraccedilotildees nas atividades metaboacutelicas e na distribuiccedilatildeo dos
micro-organismos ao longo do intestino associam-se a diversas condiccedilotildees tais
como diarreias deacuteficits nutricionais doenccedila celiacuteaca cacircncer colorretal doenccedilas
45
inflamatoacuterias intestinais siacutendrome do coacutelon irritaacutevel e supercrescimento bacteriano
(ALMEIDA et al 2009 HAWRELAK MYERS 2004)
A disbiose pode provocar aumento da permeabilidade intestinal alterando uma
importante funccedilatildeo da mucosa intestinal que eacute a atividade de barreira Assim
moleacuteculas antigecircnicas ou toacutexicas e micro-organismos nocivos podem se translocar
atraveacutes da barreira promovendo a passagem destas substacircncias atraveacutes da mucosa
epitelial para o sangue ou sistema linfaacutetico gerando uma resposta inflamatoacuteria
sistecircmica A ligaccedilatildeo entre disbiose e desenvolvimento de doenccedilas como obesidade
diabetes e doenccedilas cardiovasculares vem sendo explorada A obesidade representa
uma das doenccedilas mais estudadas associadas agrave perturbaccedilotildees na microbiota
intestinal no entanto requer mais estudos (Figura 3) (ALMEIDA et al 2009
HAWRELAK MYERS 2004 KINROSS et al 2011)
46
Figura 3 ndash Doenccedilas influenciadas pelo metabolismo microbiano intestinal
Legenda ndash A variedade de doenccedilas sistecircmicas que satildeo diretamente influenciadas pelo metabolismo da microbiota intestinal e a sua influecircncia sobre outras vias em mamiacuteferos tais como o sistema imunitaacuterio inato tem sido demonstradas Especificamente em destaque incluem as vias metaboacutelicas envolvidas com o metabolismo de drogas e a obesidade que satildeo diretamente influenciados pelo teor microbiano intestinal Ags antigeacutenios C bolteae Clostridium Bolteae DCs ceacutelulas dendriacuteticas AGCC aacutecidos graxos de cadeia curta TLR receptor Toll-like
Adaptado de Kinross et al 2011
47
226 Microbiota Intestinal e obesidade
A partir de 2004 mais um fator ambiental passou a ser apontado como
importante para o controle do peso e da homeostase energeacutetica a microbiota
intestinal As primeiras evidecircncias da relaccedilatildeo microbiota intestinal versus obesidade
foram constatadas em animais germ-free convencionalizados Esses animais
demonstraram que mesmo ao consumir uma menor quantidade de dieta e portanto
menos calorias em comparaccedilatildeo aos animais germ-free apresentaram aumento da
quantidade de gordura corporal (BACKHED et al 2004)
Especificamente tem-se observado que a microbiota de ratos obesos tem uma
maior capacidade de extraccedilatildeo de energia da dieta e esta caracteriacutestica pode ser
transmissiacutevel atraveacutes da colonizaccedilatildeo de ratos germ-free com a microbiota fecal de
doadores obesos resultando em um aumento significativamente maior no percentual
de gordura corporal total com o intuito de armazenar os lipiacutedeos produzidos Estes
estudos demonstraram que microbiota intestinal eacute um potencial fator de contribuiccedilatildeo
adicional agrave fisiopatologia da obesidade (BACKHED et al 2004 HARRIS et al 2012
LEY et al 2005 TURNBAUGH et al 2006)
A definiccedilatildeo da alteraccedilatildeo na composiccedilatildeo da microbiota intestinal de obesos
ainda permanece controversa na literatura tanto no que se refere agrave abordagem em
niacutevel de filo quanto de espeacutecies em humanos (LYRA et al 2010) Aleacutem destes
estudos realizados com animais germ-free outros observaram associaccedilotildees
importantes entre obesidade e mudanccedilas na composiccedilatildeo da microbiota intestinal tal
como uma diversidade bacteriana reduzida (no filo eou outros niacuteveis) eou
representaccedilatildeo alterada de genes e vias metaboacutelicas bacterianas (DE LA SERRE et
al 2010 LEY et al 2006 TURNBAUGH et al 2006)
Em geral vaacuterios autores tecircm demonstrado associaccedilotildees entre obesidade e
mudanccedilas na abundacircncia relativa dos dois filos bacterianos dominantes
Bacteroidetes e Firmicutes Mais especificamente um aumento do filo Firmicutes e
uma diminuiccedilatildeo do filo Bacteroidetes em modelos de ratos obesos e pacientes tecircm
sido observado Aleacutem disso indiviacuteduos magros e pessoas que perderam peso
apresentaram maior abundacircncia do filo Bacteroidetes (ABDALLAH et al 2011
BACKHED et al 2007 CANI et al 2008 LEY et al 2005 2006 TURNBAUGH et
al 2006 VERDAM et al 2013)
48
O aumento da razatildeo FirmicutesBacteroidetes em ratos obesos pode estar
associada com possiacuteveis mediaccedilotildees de respostas adaptativas pelo hospedeiro para
limitar a absorccedilatildeo de armazenamento de energia eou para promover a adiposidade
(LEY et al 2005) Embora os resultados dos estudos demonstrem diferenccedilas na
proporccedilatildeo de grupos bacterianos entre indiviacuteduos eutroacuteficos e obesos ainda natildeo se
sabe se algum grupo de micro-organismos em especial contribui de maneira direta
para o desenvolvimento da obesidade e de alteraccedilotildees metaboacutelicas Associaccedilotildees
entre tipos de bacteacuteria e as variaacuteveis metaboacutelicas tecircm sido observadas seja em
humanos ou em modelo animal indicando que a modulaccedilatildeo de determinados
grupos bacterianos possa exercer efeito no contexto da obesidade Os desafios
enfrentados agora se referem ao entendimento dos mecanismos pelos quais grupos
bacterianos influenciam paracircmetros metaboacutelicos e se intervenccedilotildees dieteacuteticas ou
medicamentosas utilizadas para modular a proporccedilatildeo desses grupos bacterianos
podem melhorar o perfil metaboacutelico ou ao contraacuterio agravaacute-lo (TURNBAUGH et al
2009)
Em relaccedilatildeo agrave composiccedilatildeo da microbiota intestinal seguida agrave perda de peso de
acordo com estudos de coorte a proporccedilatildeo de Bacteroidetes aumentou enquanto o
nuacutemero de Firmicutes diminuiu parecendo restaurar a relaccedilatildeo
FirmicutesBacteroides que estava inicialmente aumentada em indiviacuteduos obesos
Na verdade apoacutes 10 semanas de restriccedilatildeo energeacutetica e de exerciacutecio os
participantes que perderam mais de quatro quilogramas (kg) de peso corporal
mostraram um aumento significativo na populaccedilatildeo de Grupo B fragilis bem como
um aumento na proporccedilatildeo BacteroidesPrevotella positivamente correlacionada com
a perda de peso (HARRIS et al 2012 NADAL et al 2009 SANTACRUZ et al
2009)
No que se diz respeito aos efeitos do exerciacutecio fiacutesico na microbiota intestinal
Evans et al (2014) demonstraram que o exerciacutecio teve efeitos significativos tanto em
camundongos eutroacuteficos quanto em camundongos obesos que ingeriam dieta rica
em gordura sobre o equiliacutebrio relativo dos principais filos bacterianos juntamente
com a prevenccedilatildeo de obesidade e normalizaccedilatildeo da toleracircncia agrave glicose induzida por
dieta De fato a distacircncia percorrida eacute proporcional agrave diminuiccedilatildeo observada para a
razatildeo FirmicutesBacteroides (EVANS et al 2014) Tambeacutem eacute importante ressaltar
que o exerciacutecio aumentou significativamente a proporccedilatildeo relativa de bacteacuterias
49
produtoras de butirato tais como Bacteroidales S24-7 que estatildeo associados com a
sauacutede da ceacutelula epitelial intestinal Aleacutem disso o exerciacutecio fiacutesico aumentou a
diversidade da microbiota intestinal apenas em ratinhos alimentados com uma dieta
rica em gordura No entanto sugere-se que o exerciacutecio pode agir de forma
independente da microbiota intestinal aumentando a utilizaccedilatildeo de energia apesar
de um consumo de uma dieta rica em gordura
227 Mecanismos pelos quais a microbiota intestinal contribui para a obesidade
2271 Extraccedilatildeo de energia adicional da dieta
A noccedilatildeo de que a microbiota intestinal fornece energia para o hospedeiro eacute
suportada por achados em ratos germ-free natildeo naturalmente colonizados com
micro-organismos que apresentaram um menor ganho de peso quando alimentados
com uma dieta rica em gordura do que os ratos germ-free controles (BACKHED et
al 2007 CAESAR et al 2012 DING et al 2010 TREMAROLI BACKHED 2012)
Esses resultados evidenciam que na ausecircncia da microbiota o consumo de uma
dieta obesogecircnica parece natildeo estimular o desenvolvimento da obesidade A
Microbiota intestinal pode afetar ambos os lados da equaccedilatildeo do balanccedilo energeacutetico
natildeo apenas como um fator que influencia a colheita de energia a partir de
componentes da dieta mas tambeacutem como um fator que afeta genes do hospedeiro
que regulam o gasto de energia eou de armazenamento (BACKHED et al 2004
GILL et al 2006 WOLEVER et al 1991)
A fermentaccedilatildeo de polissacariacutedeos pela microbiota pode gerar um aumento no
fluxo de monossacariacutedeos para o fiacutegado e adipoacutecitos favorecendo a lipogecircnese de
novo atraveacutes da ativaccedilatildeo da expressatildeo de dois reguladores nucleares de enzimas
lipogecircnicas- carbohydrate response element-binding protein (ChREBP) e liver sterol
response element binding protein type-1 (SREBP-1) - os quais ativam as enzimas
lipogecircnicas acetil-CoA carboxilase e aacutecido graxo sintase (BACKHED et al 2004
MUSSO et al 2011 TSUKUMO et al 2009) Nesse contexto o menor acuacutemulo de
gordura corporal demonstrado em animais germ-free que consumiram dieta
hiperlipiacutedica e apresentaram absorccedilatildeo semelhante aos animais convencionalizados
indica que a microbiota pode exercer efeito sobre o fluxo de lipiacutedios entre os tecidos
reduzindo o acuacutemulo de gordura (BACKHED et al 2007)
50
A proteiacutena Fasting Induced Adipose Factor (FIAF) eacute suprimida pela presenccedila
de microbiota sendo um inibidor da lipase lipoproteacuteica (LPL) produzido pelo
intestino fiacutegado e tecido adiposo limitando a captaccedilatildeo de aacutecidos graxos e
favorecendo o acuacutemulo de triacilgriceroacuteis nesse tecido Tem sido demonstrado que
animais germ-free apresentaram uma maior expressatildeo de FIAF e fenoacutetipo resistente
agrave obesidade (BACKHED et al 2004 2005 2007) A participaccedilatildeo de FIAF no
metabolismo lipiacutedico foi reforccedilada atraveacutes de estudos com ratos germ-free que
diferiram apenas na expressatildeo dessa proteiacutena (FIAF ++ versus FIAF --) onde
verificou-se que a deficiecircncia dessa proteiacutena induzida geneticamente natildeo eacute um fator
protetor para animais germ-free contra o ganho de peso promovido pela dieta
hiperlipiacutedica (BACKHED et al 2007)
Aleacutem de promover a lipogecircnese (atraveacutes das enzimas lipogecircnicas e inibiccedilatildeo da
FIAF) a microbiota tambeacutem desempenha um papel importante no gasto de energia
obtida a partir da dieta Mais especificamente a microbiota de obesos parece
favorecer uma inibiccedilatildeo de oxidaccedilatildeo de aacutecidos graxos (que por sua vez favorecem a
deposiccedilatildeo e armazenamento de lipiacutedios no tecido adiposo fiacutegado eou tecido
muscular) por mecanismos complementares mas independentes (HARDIE
SAKAMOTO 2006 PUIGSERVER SPIEGELMAN 2003 RABOT et al 2010)
A microbiota tambeacutem pode influenciar a homeostase energeacutetica por meio da
sinalizaccedilatildeo exercida pelos aacutecidos graxos de cadeia curta (AGCC) Os AGCC agem
natildeo apenas como fonte de energia mas tambeacutem como moleacuteculas de sinalizaccedilatildeo
atraveacutes de receptores acoplados agrave proteiacutena G (GPRs) GPRs satildeo um grupo de
receptores transmembracircnicos intestinais que respondem aos aacutecidos graxos Entre
os receptores dessa famiacutelia os receptores Gpr41 e Gpr43 satildeo fundamentais sendo
expressos abundantemente no intestino delgado distal no coacutelon e nos adipoacutecitos
Essa ligaccedilatildeo resulta na ativaccedilatildeo desses receptores induzindo a secreccedilatildeo de
polipeptiacutedeo YY (PYY) e leptina hormocircnios que influenciam nas funccedilotildees intestinais
e na regulaccedilatildeo do apetite (BELLAHCENE et al 2013 BINDELS et al 2013
HARDIE SAKAMOTO 2006 INOUE et al 2014 MUSSO et al 2011 ZAIBI et al
2010)
51
2272 Induccedilatildeo da inflamaccedilatildeo por meio da alteraccedilatildeo da permeabilidade intestinal
As concentraccedilotildees sanguiacuteneas de lipopolissacariacutedeos (LPS) sofrem significativa
influecircncia da microbiota intestinal Principalmente as bacteacuterias Gram-negativas
apresentam em sua superfiacutecie celular os LPS que funcionam como antiacutegenos
estimulando a resposta imune do hospedeiro Assim a microbiota intestinal
representa um grande reservatoacuterio dessa endotoxina especialmente naqueles
indiviacuteduos que habitualmente consomem dieta com alto teor de gorduras
(HOTAMISLIGIL 2010)
A principal via de sinalizaccedilatildeo do LPS envolve o fator nuclear Kappa B (NF-KB)
O LPS pode aumentar os niacuteveis circulantes de resistina espeacutecies reativas de
oxigecircnio (ERO) e proteiacutenas supressoras da sinalizaccedilatildeo de citocinas-1 e 3 (SOCS-1 e
SOCS-3) A elevaccedilatildeo de citocinas proacute-inflamatoacuterias como interferon-gama (IFN-α)
TNF- α interleucina (IL)-6 e IL-1β geralmente observada em pacientes obesos
pode ser originada de macroacutefagos no tecido adiposo ou da interaccedilatildeo do LPS com
seu receptor O aumento dessas citocinas pode contribuir para a translocaccedilatildeo de
LPS favorecendo a ocorrecircncia de endotoxemia metaboacutelica e consequentemente
potencializar a inflamaccedilatildeo subcliacutenica por meio da reduccedilatildeo da expressatildeodistribuiccedilatildeo
de proteiacutenas formadoras de junccedilotildees oclusivas (tight junctions) como zocircnula de
oclusatildeo-1 (ZO-1) e ocludina aumentando a permeabilidade intestinal (CANI et al
2008 LAM et al 2012)
Aleacutem da reduccedilatildeo da expressatildeo das junccedilotildees oclusivas intestinais haacute tambeacutem
uma evidecircncia de que a microbiota intestinal pode regular a permeabilidade
intestinal atraveacutes do sistema endocanabinoacuteide Em um estudo realizado por Muccioli
et al (2010) a modulaccedilatildeo da composiccedilatildeo microbiana do intestino seja por
colonizaccedilatildeo em ratos germ-free ou por tratamento com antibioacuteticos reduziu a
expressatildeo dos receptores canabinoacuteides (Cb-1) tanto do coacutelon quanto do tecido
adiposo enquanto em animais alimentados com uma dieta rica em gordura foi
observado aumento da expressatildeo Cb1 (EVERARD et al 2013 GEURTS et al
2011 MUCCIOLI et al 2010)
52
23 MOLLICUTES
231 Caracteriacutesticas Gerais dos Mollicutes
Os micoplasmas foram primeiramente isolados por Norcard e Roux em 1898
que estudavam a Pleuropneumonia Bovina doenccedila descrita haacute mais de um seacuteculo
na Europa e na Aacutefrica Em seguida micro-organismos semelhantes isolados de
humanos e de animais foram descritos por outros pesquisadores e denominados de
PPLO ndash ldquoPleuropneumonia-Like Organismsrdquo (MOROWITZ 2002 RAZIN JACOBS
1992)
O termo ldquomicoplasmardquo foi usado para denominar os micro-organismos da
Classe Mollicutes (Mollis = mole cuacutetis = pele) mas sugeriu-se o uso do termo
geneacuterico molicutes como nome trivial para designar qualquer microrganismo desta
classe O termo micoplasma aplica-se apenas aos membros do gecircnero Mycoplasma
Recentemente algumas riqueacutetsias e outras bacteacuterias de taxonomia indefinida foram
incluiacutedas aos Mollicutes A classe eacute composta por quatro ordens (Mycoplasmatales
Entomoplasmatales Acholeplasmatales Anaeroplasmatales) sete famiacutelias
(Mycoplasmataceae Incertae sedis (ordem Mycoplasmatales)
Entomoplasmataceae Spiroplasmataceae Acholeplasmataceae Incertae sedis
(ordem Acholeplasmatales) e Anaeroplasmataceae) 11 gecircneros (Mycoplasma
Ureaplasma Eperythozoon Haemobartonella Entomoplasma Mesoplasma
Spiroplasma Acholeplasma Phytoplasma Anaeroplasma Asteroplasma) e mais de
200 espeacutecies A famiacutelia Mycoplasmataceae conteacutem os principais micro-organismos
de interesse meacutedico dentre os quais estatildeo os gecircneros Mycoplasma Os molicutes
compreendem aproximadamente 200 espeacutecies distribuiacutedas ente plantas insetos
animais e humanos (BERGEYrsquos 2010 RAZIN 1992 RAZIN YOGEV NAOT
1998)
Mollicutes eacute a uacutenica classe do filo Tenericutes sendo anteriormente
classificado dentro do filo Firmicutes tendo essa mudanccedila justificada em parte
pela anaacutelise de uma seacuterie de marcadores filogeneacuteticos conservados Esta
classificaccedilatildeo eacute ainda apoiada pela ausecircncia de parede celular caracteriacutestica desses
micro-organismos As sequecircncias do gene 16S rRNA contribuem para sua
classificaccedilatildeo em grupos filogeneacuteticos sendo essa sequecircncia obrigatoacuteria para a
caracterizaccedilatildeo de novas espeacutecies Aleacutem disso a atribuiccedilatildeo de espeacutecie aos grupos eacute
53
feita principalmente por hibridaccedilatildeo DNA-DNA sorologia e semelhanccedila na sequecircncia
do gene 16rRNA Algumas espeacutecies foram atribuiacutedas individualmente a grupos
filogeneacuteticos clusters e subclusters que tambeacutem compartilham outras
caracteriacutesticas (BERGEYrsquos 2009 2010 BROWN WHITCOMB BRADBURY 2007
WEISBURG et al 1989)
A natureza dos molicutes tem representado um desafio na compreensatildeo da
sua biologia classificaccedilatildeo e taxonomia Por muito tempo os micoplasmas foram
considerados viacuterus devido a capacidade de transpor filtros que bloqueavam a
passagem de bacteacuterias (RAZIN 1992) Os membros da classe Mollicutes satildeo
caracterizadas pelo genoma de tamanho reduzido (058 - 22 Mb) ausecircncia de
parede celular (RAZIN 1998) e por apresentarem requerimentos nutricionais
diferenciados quando comparados agrave maioria das bacteacuterias de interesse veterinaacuterio e
humano Aminoaacutecidos nucleotiacutedeos e esteroacuteis exoacutegenos satildeo utilizados para seu
crescimento in vitro O esterol presente no soro ou ceacutelulas do hospedeiro eacute
incorporado pela membrana da maioria das espeacutecies Este composto contribui na
fluidez necessaacuteria agrave membrana e confere resistecircncia parcial agrave lise osmoacutetica
(RUHNKE ROSENDAL 1994)
A membrana dos micoplasmas tem composiccedilatildeo semelhante agraves das eubacteacuterias
e estaacute exposta ao ambiente com exceccedilatildeo de poucas espeacutecies que possuem
glicocaacutelice (WIESLANDER et al 1992) Localizam-se principalmente nas ceacutelulas de
mucosas e com potencial de invasatildeo (VOELKER DYBVIG 1996) As mutaccedilotildees tecircm
sido mencionadas como estrateacutegia de sobrevivecircncia que podem ter ocorrido em
funccedilatildeo da evoluccedilatildeo associada a perdas genocircmicas (DAVID et al 2002)
Natildeo apresentam flagelos entretanto algumas espeacutecies exibem deslizamento
sobre superfiacutecies liacutequidas Alguns micoplasmas possuem um tipo de estrutura ou
prolongamento polar em sua superfiacutecie onde haacute alta concentraccedilatildeo de moleacuteculas de
adesatildeo que permitem a sua aderecircncia agrave ceacutelula hospedeira (RAZIN 1992) Acredita-
se que estas estruturas em algumas espeacutecies como Mycolasma penetrans de
origem humana estejam envolvidas na invasatildeo celular (LO et al 1992)
Os molicutes exibem estrita relaccedilatildeo aos hospedeiros e especificidade a tecidos
e oacutergatildeos que reflete as suas caracteriacutesticas nutricionais e adaptaccedilatildeo parasitaacuteria
Estas bacteacuterias podem ocorrer em hospedeiros e tecidos diferentes de seu ldquohabitatrdquo
normal entretanto como observado por Goulet et al (1995) existem variaccedilotildees e
54
eventualmente eacute possiacutevel isolar espeacutecies de siacutetios e hospedeiros diferentes
daqueles habituais (ERICKSON ROSS BOVE 1988 HORNOK et al 2012 ISO et
al 2013 RAZIN 1992 RAZIN YOGEV NAOT 1998 WAITES et al 1987)
A maioria dos molicutes vivem como comensais e em muitos artroacutepodes
podem mesmo ser considerados simbiontes Infecccedilotildees com micoplasmas
patogecircnicos satildeo raramente agudas e usualmente seguem um curso crocircnico (RAZIN
YOGEV NAOT 1998) Os Mollicutes principalmente as espeacutecies encontradas em
mamiacuteferos apesentam-se como parasitas ideais geralmente vivendo em harmonia
com seu hospedeiro mas por outro lado satildeo tambeacutem considerados como
ldquooportunistas ideaisrdquo Diversas doenccedilas nos seus respectivos hospedeiros satildeo
causadas ou associadas aos Mollicutes (RAZIN YOGEV NAOT 1998) Estas
bacteacuterias parecem preferir estabelecerem-se em nichos com ceacutelulas em constante
renovaccedilatildeo favorecendo a sua adesatildeo (GABRIDGE CHANDLER DANIELS 1985)
Micoplasmas em especial as espeacutecies com os menores genomas tecircm altas
taxas de mutaccedilatildeo o que sugere que eles estatildeo em um estado de evoluccedilatildeo raacutepida
Esses dados foram confirmados por estudos de sequecircncias de genes 5S rRNA que
incluiu uma seacuterie de acholeplasmas anaeroplasmas micoplasmas ureaplasmas e
Clostridium innocuum (BOVEacute 1999 RAZIN 1995 ROGERS et al 1985)
Quanto ao seu metabolismo os Mollicutes podem ser divididos em
fermentadores e natildeo-fermentadores Os fermentadores produzem aacutecidos por meio
da metabolizaccedilatildeo de glicose e de outros carboidratos diminuindo o pH do meio de
cultivo e os natildeo- fermentadores possuem a via da arginina-deidrolase para
obtenccedilatildeo de ATP aumentando o pH (RAZIN 1978 2004) Quando ambas as vias
ocorrem os aacutecidos produzidos da glicoacutelise podem mascarar a alcalinizaccedilatildeo do caldo
causada pela hidroacutelise da arginina (BASEMAN TULLY 1997 OLSON et al 1993
RAZIN 2004)
Um dos maiores empecilhos na pesquisa e no diagnoacutestico laboratorial das
infecccedilotildees causadas por molicutes tem sido a dificuldade em cultivaacute-los in vitro
Apresentam crescimento lento mesmo utilizando-se o meio de cultivo adequado
(RAZIN 1994) A temperatura de aproximadamente 37 ordmC eacute indicativa do ldquohabitatrdquo
natural dos molicutes que corresponde agrave dos mamiacuteferos reacutepteis peixes artroacutepodes
e plantas O crescimento e sobrevivecircncia dos molicutes em meio de cultura satildeo
dependentes do pH Para espeacutecies originaacuterias de plantas e vertebrados o pH oacutetimo
55
eacute de 74 e o crescimento ocorre entre pH 65 a 80 (RAZIN et al 1978) A inibiccedilatildeo
do crescimento pode ocorrer pela excessiva produccedilatildeo de aacutecidos ou aacutelcalis gerados
pelo metabolismo microbiano primaacuterio
Esses micro-organismos apresentam colocircnias de 50 ndash 500 μm de diacircmetro
usualmente em forma de ldquoovo fritordquo quando cultivados em meio soacutelido visualizadas
com o auxiacutelio de microscoacutepio estereoscoacutepio (Figura 4) Em meio liacutequido o
crescimento geralmente natildeo causa turvaccedilatildeo provocando somente alteraccedilatildeo no pH
revelado por um indicador presente no meio de cultura (MILES 1992 RAZIN 1998)
A complexidade dos requerimentos nutricionais a variaccedilatildeo na forma celular e a
fragilidade osmoacutetica fazem com que os Mollicutes estejam sob constantes
investigaccedilotildees quanto a sua fisiologia para relatar seu crescimento e ecologia As
condiccedilotildees sob as quais eles crescem podem influenciar na estrutura e
funcionamento das ceacutelulas hospedeiras sendo importante natildeo somente para os
fisiologistas como tambeacutem para todos micoplasmologistas envolvidos em estudos
quantitativos (BALABANOV et al 2006 MILLES 1992 RAZIN et al 1978
RODWELL 1983 TULLY 1985)
Figura 4 ndash Crescimento de M hominis em meio SP4 com a produccedilatildeo de colocircnia em forma de ldquoovo fritordquo (aumento 40X)
Fonte Arquivo pessoal
56
232 Mollicutes Microbiota Intestinal e Obesidade
A ocorrecircncia e participaccedilatildeo da classe Mollicutes na microbiota intestinal e sua
relaccedilatildeo com a obesidade ainda eacute praticamente desconhecida No entanto
Turnbaugh et al (2008) investigaram a relaccedilatildeo dieta ecologia microbiana intestinal e
o balanccedilo energeacutetico a partir de um modelo murino de obesidade induzido por meio
do consumo de uma dieta ocidental Observou-se que a dieta ocidental estimulou o
crescimento de organismos da classe Mollicutes que posteriormente foram
reduzidos por subsequentes manipulaccedilotildees dieteacuteticas para limitar o ganho de peso
O transplante de microbiota de ratos com obesidade induzida por dieta para
destinataacuterios germ-free promoveu uma maior deposiccedilatildeo de gordura do que em
animais que receberam o transplante a partir de doadores eutroacuteficos Metagenocircmica
e anaacutelises bioquiacutemicas do microbioma intestinal em conjunto com sequenciamento e
reconstruccedilotildees metaboacutelicas associadas ao intestino humano revelaram que a
bacteacuteria Eubacterium dolichum) (um membro da classe Mollicutes) apresenta
caracteriacutesticas que podem fornecer uma vantagem competitiva aos membros desse
ramo em relaccedilatildeo aos nutrientes da dieta ocidental Essas vantagens relacionam-se
com a importaccedilatildeo e transformaccedilatildeo de accediluacutecares simples atraveacutes do Sistema
fosfotransferase (PTS)
Sistemas fosfotransferase (PTS) satildeo uma classe de sistemas de transporte
envolvidas na absorccedilatildeo e na fosforilaccedilatildeo de uma grande variedade de hidratos de
carbono (DEUTSCHER et al 2006) Cada transportador envolve trecircs enzimas de
ligaccedilatildeo que atuam como receptores e doadores de grupos fosforil duas enzimas
citoplasmaacuteticas que atuam em todos os hidratos de carbono PTS importados (HPR e
EI) e o outro eacute um complexo de hidratos de carbono especiacutefico (EII)
compreendendo um ou dois domiacutenios integrais de membrana hidrofoacutebicos (EIIC D)
e dois domiacutenios hidrofiacutelicos (EIIA B) (DEUTSCHER et al 2006) Fosfoenolpiruvato
embora produzidos atraveacutes da glicoacutelise pode ser usado para gerar ATP (atraveacutes da
piruvatoquinase) ou usado para conduzir a importaccedilatildeo de accediluacutecares adicionais
atraveacutes da transferecircncia de um grupo fosfato para EI do PTS
Genes PTS satildeo encontrados em vaacuterias divisotildees de bacteacuterias incluindo
Proteobacterias tais como E coli bem como vaacuterios Firmicutes e Mollicutes
sequenciados (Por exemplo Mycoplasma genitalium M pneumoniae M pulmonis
M penetrans M gallisepticum M mycoides M mobile M hyopneumoniae M
57
synoviae e M capricolum) (KANEHISA et al 2004) O PTS tambeacutem desempenha
um papel na regulaccedilatildeo da expressatildeo do gene microbiano atraveacutes da repressatildeo
cataboacutelica permitindo que a ceacutelula passe a importar preferencialmente accediluacutecares
simples em relaccedilatildeo a outros hidratos de carbono (DEUTSCHER et al 2006)
Muacuteltiplos componentes do PTS estatildeo presentes no microbioma da dieta ocidental (EI
e HPr mais EII) o que poderia permitir a importaccedilatildeo de accediluacutecares simples (por
exemplo glicose e frutose que juntos formam sacarose um componente abundante
da dieta ocidental) bem como accediluacutecares associados com a mucosa do intestino do
hospedeiro (N-acetil-galactosamina) O microbioma da dieta ocidental tambeacutem
conteacutem genes que suportam o metabolismo destes accediluacutecares fosforilados para vaacuterios
produtos finais de fermentaccedilatildeo anaeroacutebia (por exemplo lactato e a cadeia curta de
aacutecidos graxos butirato e acetato (DEUTSCHER et al 2006)
58
3 OBJETIVOS
31 Objetivo geral
Analisar a participaccedilatildeo da Classe Mollicutes e dos Filos Firmicutes e Bacteroidetes
na microbiota intestinal de mulheres obesas e eutroacuteficas
32 Objetivos especiacuteficos
Determinar o estado nutricional das mulheres obesas do grupo caso e
eutroacuteficas do grupo controle
Determinar o consumo alimentar das mulheres obesas do grupo caso e
eutroacuteficas do grupo controle
Desenvolver um ensaio quantitativo por meio de TaqMan PCR para a
detecccedilatildeo de Mollicutes na microbiota intestinal de mulheres obesas e
eutroacuteficas
Quantificar os micro-organismos da Classe Mollicutes e dos Filos Firmicutes e
Bacteroidetes aleacutem de Bacteacuterias Totais por meio da PCR em tempo real em
amostras de fezes de mulheres obesas e eutroacuteficas
Analisar a liberaccedilatildeo de citocinas proacute-inflamatoacuterias IL-1 IL6 IL17-A e TNF-α
em amostras de sangue coletadas de mulheres obesas e eutroacuteficas
59
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
41 Protocolo do estudo
O presente estudo foi desenvolvido no laboratoacuterio de Micoplasmas do
Departamento de Microbiologia do Instituto de Ciecircncias Biomeacutedicas da Universidade
de Satildeo Paulo (ICB IIUSP) com o Ambulatoacuterio de Obesidade e Siacutendrome Metaboacutelica
do Serviccedilo de Endocrinologia do Hospital das Cliacutenicas da Universidade de Satildeo
Paulo (HC-FMUSP) O estudo foi aprovado pela Comissatildeo de Eacutetica em Pesquisa
Envolvendo Seres Humanos (CEPSH) do Instituto de Ciecircncias Biomeacutedicas da
Universidade de Satildeo Paulo (ICBUSP) (protocolo de pesquisa ndeg 110713) e pela
Comissatildeo de Eacutetica da Instituiccedilatildeo HC-FMUSP Todas as mulheres foram recrutadas a
partir da demanda espontacircnea do serviccedilo tendo sido inseridas no protocolo apoacutes
explicaccedilatildeo sucinta e individual do mesmo e assinatura do Termo de Consentimento
Livre e Esclarecido (TCLE) conforme preconiza a resoluccedilatildeo 19606 do Conselho
Nacional de Sauacutede
42 Casuiacutestica
As coletas foram realizadas entre os meses de Outubro de 2013 agrave Dezembro
de 2014 Para obtenccedilatildeo de resultados pela metodologia proposta para este estudo
a casuiacutestica foi de 40 mulheres sendo 20 diagnosticadas com obesidade
apresentando Iacutendice de massa corporal (IMCgt 30 kgm2) e 20 mulheres em eutrofia
(IMC entre 185 e 249 kgm2) As mulheres diagnosticadas com obesidade foram
recrutadas no grupo de Obesidade e Siacutendrome Metaboacutelica do serviccedilo de
Endocrinologia do Hospital das Cliacutenicas da Universidade de Satildeo Paulo (HC-
FMUSP)
Foram utilizados como criteacuterios de exclusatildeo para esse grupo a presenccedila de
quadros infecciosos com sinais cliacutenicos uso de antibioacuteticos (3 meses antes do
estudo) quimioterapia radioterapia gravidez uso de probioacuteticos cirurgias preacutevias
no Trato Gastrointestinal doenccedilas do Trato Gastrointestinal como Doenccedila de Crohn
e Siacutendrome do Coacutelon Irritaacutevel Devido ao fato de haver dificuldade para distinccedilatildeo de
alimentos classificados como prebioacuteticos a ingestatildeo destes natildeo foi incluiacuteda como
criteacuterio de exclusatildeo do estudo O grupo controle foi composto por mulheres adultas
60
eutroacuteficas recrutadas na comunidade sem nenhuma enfermidade aparente tendo
sido fixados os mesmos criteacuterios de exclusatildeo adotados para o grupo controle
43 Delineamento experimental
As mulheres foram submetidas agrave coleta de material fecal e de sangue aleacutem de
questionaacuterio semiestruturado como instrumento de coleta Tal instrumento foi
construiacutedo atraveacutes de consulta em perioacutedicos cientiacuteficos e livros acadecircmicos que
descrevem preditores importantes em relaccedilatildeo a fatores etioloacutegicos predisponentes e
mantedenores da obesidade e possiacutevel associaccedilatildeo com microbiota intestinal e
ambiente Foram consideradas questotildees que avaliavam histoacuteria familiar cliacutenica
obsteacutetrica ginecoloacutegica consumo de aacutelcool e tabaco aleacutem de questotildees que
avaliavam os haacutebitos alimentares como a praacutetica de dietas para emagrecer e
nuacutemero de refeiccedilotildees realizadas Foi utilizado para esse estudo o IPAQ (International
Physical Activity Questionnaire) versatildeo curta originalmente desenvolvido com
finalidade de estimar o niacutevel de praacutetica habitual de atividade fiacutesica de populaccedilotildees de
diferentes paiacuteses (BARROS NAHAS 2000) O questionaacuterio foi elaborado de modo a
facilitar a obtenccedilatildeo de informaccedilotildees durante a consulta com os pacientes e realizadas
por indiviacuteduos previamente instruiacutedos para o desenvolvimento do estudo tendo as
variaacuteveis sido agrupadas em 9 Seccedilotildees que representam a subcategorizaccedilatildeo das
variaacuteveis independentes para determinaccedilatildeo do perfil da populaccedilatildeo estudada (Anexo
B)
44 Determinaccedilatildeo do estado nutricional
441 Avaliaccedilatildeo qualitativa do consumo alimentar
Para investigar possiacuteveis relaccedilotildees entre alimentos e nutrientes da dieta e
microbiota intestinal utilizou-se o questionaacuterio de frequecircncia alimentar semi-quantitativo
(QFA) composto por 62 itens alimentares proposto por Fisberg et al (2008) que
desenvolveram um QFA para utilizaccedilatildeo em estudos epidemioloacutegicos com indiviacuteduos
adultos desenhados para testar hipoacuteteses epidemioloacutegicas e nutricionais em estudos
conduzidos primariamente em Satildeo Paulo para estimar o teor de nutrientes da dieta
61
habitual o que eacute de fundamental importacircncia para estimar a medida de exposiccedilatildeo aos
fatores dieteacuteticos e investigar as possiacuteveis associaccedilotildees com desfechos de interesse
Representou-se a frequecircncia de consumo alimentar em 8 categorias a saber
diaacuterio (mais de trecircs vezes por dia duas a trecircs vezes por dia uma vez por dia) semanal
(cinco a seis vezes por semana duas a quatro vezes por semana uma vez por
semana) mensal (uma a trecircs vezes por mecircs) e nunca ou quase nunca Os dados sobre
o consumo alimentar foram inseridos em planilha eletrocircnica com auxiacutelio do estudo de
Giacomello et al (2008) Inicialmente converteu-se a frequecircncia de consumo de cada
alimento em frequecircncia diaacuteria como proposto por Coelho et al (2011) Para tanto
atribuiu-se ao alimento valor 1 (um) quando consumido 1 vez ao dia Caso o alimento
fosse consumido mais de uma vez ao dia multiplicava-se o valor 1 pelo intervalo da
frequecircncia diaacuteria relatada Para as opccedilotildees que contemplaram intervalos de tempo
semanal e mensal utilizou-se a meacutedia do intervalo das frequecircncias dividido pelo
periacuteodo se semanal (7) e mensal (30) conforme descritos no Quadro 01
Quadro 01ndash Criteacuterios utilizados na estimativa da frequecircncia diaacuteria de consumo dos alimentos incluiacutedos no Questionaacuterio de Frequecircncia Alimentar
Frequecircncia Relatada Frequecircncia diaacuteria
3 ou mais vezesdia 31=3
2 a 3 vezesdia 251= 25
1 vezdia 11= 1
5 a 6 vezessemana 557= 079
2 a 4 vezessemana 37= 043
1vezsemana 17= 014
1 a 3 vezesmecircs 230= 007
1 vezmecircs 130= 003
NuncaQuase nunca 0
COELHO et al 2011
62
Posteriormente foram construiacutedos os grupos dos alimentos segundo o registro do
QFA Adotou-se como criteacuterio para a inclusatildeo do alimento no respectivo grupo o
consumo igual ou maior a 10 e as caracteriacutesticas nutricionais (HAIR et al 2005)
Considerando este criteacuterio foram construiacutedos 16 grupos de alimentos (1) massas (2)
preparaccedilotildees (3) carne vermelha e ovos (4) embutidos (5) carne branca (6) leite e
derivados (7) leguminosas (8) cereais raiacutezes e tubeacuterculos (9) hortaliccedilas (10) frutas
(11) industrializados (12) infusatildeo (13) bebida alcooacutelica (14) oacuteleos e gorduras (15)
lanches (16) accediluacutecares e doces
Os dados referentes ao QFA tambeacutem foram utilizados para calcular o consumo
energeacutetico e de nutrientes Primeiramente estes foram transformados em gramas
utilizando-se uma tabela para avaliaccedilatildeo de consumo alimentar em medidas caseiras
(PINHEIRO et al 2002) e em seguida lanccedilados no Software Excel para digitaccedilatildeo dos
dados do consumo alimentar e para o caacutelculo de consumo de macro e micronutrientes
Para preencher o banco de dados do Software com alimentos e preparaccedilotildees
consumidas pelas participantes foram utilizadas as Tabelas de composiccedilatildeo de
alimentos PHILIPPI (2002) e TACO (2006) com a Tabela de medidas caseiras
(PINHEIRO et al 2005) aleacutem de dados adicionais de Composiccedilatildeo quiacutemica de alimentos
compilados da Tabela de Composiccedilatildeo de Alimentos da Fundaccedilatildeo Instituto brasileiro de
Geografia e Estatiacutestica (IBGE) Os valores obtidos foram comparados com os valores de
recomendaccedilatildeo propostos pelo United States Departament of Agriculture (USDA) em
seus documentos Dietary References Intakes (DRI) referentes aos valores de Estimated
Average Requirements (EAR) e para os nutrientes que ainda natildeo possuem esse valor
definido utilizou-se como paracircmetro valores de Adequate Intake (AI)
442 Avaliaccedilatildeo antropomeacutetrica do estado nutricional
A mensuraccedilatildeo do peso corporal em quilogramas (kg) foi realizada em
duplicata considerando-se o peso meacutedio Para tal foi utilizada uma balanccedila digital
Filizolareg com capacidade maacutexima para 150 kg e precisatildeo de 100 g estando as
participantes da pesquisa descalccedilas e com roupas leves A estatura em centiacutemetros
(cm) foi realizada em duplicata considerando-se a estatura meacutedia As medidas
foram determinadas por meio de um estadiocircmetro graduado em centiacutemetros com
precisatildeo de 10 mm apresentando barra de madeira vertical e fixa com esquadro
moacutevel para posicionamento sobre a cabeccedila do indiviacuteduo quando os mesmos
63
estavam descalccedilos em posiccedilatildeo ereta com os peacutes paralelos calcanhares
panturrilhas gluacuteteos ombros e cabeccedila encostados no estadiocircmetro olhando-se
para frente
O Iacutendice de Massa Corpoacuterea (IMC) foi calculado pelo peso e estatura a partir
das quais foi determinada a relaccedilatildeo entre o peso e altura em metros ao quadrado e
avaliado segundo os pontos de corte preconizados pela OMS assim designados
baixo peso (IMC lt 185 Kgaltura2) eutrofia (IMC= 185 a 249 kgaltura2) sobrepeso
(IMC= 25 a 299 Kgaltura2) e obesidade (IMC gt30 Kg altura2) (WHO 1998)
4421 Anaacutelise da Composiccedilatildeo Corporal pelo Meacutetodo de Bioimpedacircncia
O aparelho de bioimpedacircncia eleacutetrica utilizado para a avaliaccedilatildeo da composiccedilatildeo
corporal foi o InBody 720 (Biospace Coreia) que consiste em bioimpedacircncia
octopolar atraveacutes de oito pontos de contato pelos quais passa a corrente eleacutetrica na
extremidade dos quatro membros determinando a porcentagem de gordura e massa
magra em cada membro assim como no tronco
A avaliaccedilatildeo foi realizada respeitando os procedimentos apresentados no
respectivo manual de uso do aparelho atendendo as seguintes condiccedilotildees de preacute-
teste (1) estar em jejum (2) natildeo consumir aacutelcool 48 horas antes do teste (3) natildeo
realizar exerciacutecio de intensidade moderada a elevada nas 12 horas antes da
avaliaccedilatildeo (4) natildeo efetuar o exame perante em estado febril ou de desidrataccedilatildeo (5)
natildeo utilizar bijuterias metaacutelicas ou implantes dentaacuterios com metal (6) natildeo ingerir cafeacute
e (7) realizar a avaliaccedilatildeo com roupa de banho ou roupas iacutentimas
O relatoacuterio da bioimpedacircncia Octopolar eacute dividido em quatro partes
informativas de dados obtidos
1 Anaacutelise da Composiccedilatildeo Corporal identifica como estaacute distribuiacuteda a aacutegua
corporal total percentual de massa magra e massa de gordura livre
2 Anaacutelise Muacutesculo-gordura mostra em kg o peso a massa de muacutesculo
esqueleacutetico e a massa de gordura
3 Diagnoacutestico da obesidade discrimina o IMC PGC (porcentagem de
gordura corporal) e RCQ (relaccedilatildeo cintura-quadril)
4 Aacuterea de Gordura Visceral informa a aacuterea de gordura visceral em cm2
64
45 Coleta das amostras cliacutenicas
Para a obtenccedilatildeo das amostras de fezes as mulheres foram previamente
instruiacutedas de acordo com o National Committee for Clinical Laboratory Standards
NCCCLS (2007) evacuando diretamente no coletor plaacutestico esteacuteril fornecido
juntamente com luvas espaacutetula coletora e etiqueta de identificaccedilatildeo O material foi
acondicionado em caixa isoteacutermica resfriada com gelo e transportado
imediatamente ao Laboratoacuterio de Micoplasmas ICBUSP As amostras de fezes
foram distribuiacutedas em aliquotas (180-200 ug) em microtubos e acondicionadas -80oC
ateacute a anaacutelise laboratorial
Para a realizaccedilatildeo da coleta do material sanguiacuteneo o operador munido de EPIs
realizou punccedilatildeo venosa perifeacuterica preferencialmente em membro superior natildeo
dominante Foram coletados cerca de 5 mL de sangue por tubopaciente tendo sido
utilizados tubos natildeo-heparinizados que foram conservados de forma similar aos
coletores em caixa isoteacutermica refrigerada O material obtido foi levado ateacute o
Laboratoacuterio de Micoplasmas ICBUSP onde as amostras foram centrifugadas a
3500 rpm para obtenccedilatildeo do soro seguido de sua distribuiccedilatildeo em aliacutequotas de cerca
de 1 mL e estocados a -80 degC ateacute o uso
65
46 Determinaccedilatildeo da microbiota intestinal
461 Padronizaccedilatildeo de reaccedilatildeo de PCR quantitativo (qPCR) por meio de TaqMan para a detecccedilatildeo de Mollicutes
4611 Cepas bacterianas e condiccedilotildees de cultura
Como controle positivo utilizou-se a cepa ATCC 23114 (PG-21) de M hominis
Tambeacutem foram utilizados como controle os seguintes micro-organismos obtidos da
coleccedilatildeo do Laboratoacuterio de Micoplasmas ICBUSP Mycoplasma bovis Donetta M
arginini G230 M dispar M2979 M pneumoniae M pulmonis PG34 M
gallisepticum PG31 M synoviae WUU1853 M penetrans ATCC 55252 (GTU 54)
M fermentans PG18 M pulmonis PG34 M hyorhinis M genitalium ATCC 33530
(G37) M buccale M edwardii PG24 M gateae M faucium M felis CO M bovis
Spiroplasma mirum (SMCA) Acholeplasma laidlawii PG38 Ureaplasma diversum
ATCC 449782 U urealyticum T960 Escherichia coli ATCC 25922 Klebsiella
pneumoniae ATCC 13883 Streptococcus pyogenes ATCC 12345 Salmonella
typhimurium C5 CIP Pseudomonas aeruginosa ATCC 10145 Staphylococcus
aureus ATCC 25293 e Bacillus cereus As cepas referentes aos micro-organismos
Bacteroides fragilis C45A AUS 00306 e Clostridium perfringens foram cedidas pelo
Professor Dr Jorge Luiz Melo Sampaio pesquisador associado do Instituto Fleury
As espeacutecies de Ureaplasmas foram cultivadas em meio UB especiacutefico para
ureaplasma com 5 de CMRL-1066 (com glutamina e sem bicarbonato) enquanto
as espeacutecies de Micoplasmas foram cultivadas em meio de cultura SP4 como
descrito por Tully et al (1995) As bacteacuterias com parede celular incluiacutedas como
controles foram cultivadas em meio de infusatildeo de ceacuterebro-coraccedilatildeo (BHI) Destas
cepas o DNA foi extraiacutedo a partir de culturas em fase logariacutetmica por meio do kit
Pure Linktrade Genomic DNA da Invitrogenreg
4612 Desenvolvimento de primers e sonda para a detecccedilatildeo de Mollicutes pela PCR quantitativa
Os oligonucleotiacutedeos iniciadores e as sondas foram selecionadas com base no
fragmento conservado do gene 16S rRNA especiacutefico para a classe Mollicutes As
sequecircncias do gene 16S rRNA de micoplasmas foram alinhadas utilizando o
algoritmo ClustalW do Software MEGA4 As regiotildees variaacuteveis foram selecionadas
66
manualmente para o sequencionamento dos iniciadores e sondas utilizadas neste
ensaio Propriedades dos oligonucleotiacutedeos foram tambeacutem analisadas pelo Software
Primer Express ver 30 (Applied Biosystems Life Technologies Corporation
Carlsbad CA EUA) A especificidade dos iniciadores e da sonda foi testada ldquoin
silicordquo utilizando algoritmos BLAST
O quadro 02 mostra as sequecircncias forward e reverse selecionadas para
amplificar um fragmento conservado do gene 16S rRNA especiacutefico de Mollicutes A
sonda TaqMan especiacutefica para o fragmento amplificado foi desenvolvida por uma
fonte comercial (Applied Biosystems Life Technologies Corporation)
Quadro 2 - Sequecircncias dos iniciadores utilizados para amplificaccedilatildeo do gene 16S rRNA para Mollicutes
Iniciadores Sequecircncia
Molli1 5 GCA TTA GAT GAT CCG CCT GAG T 3
Molli2 5 GTC CCC GTC AAT TCC TTT AAG TT 3
Sonda 5 GTC CCC GTC AAT TCC TTT AAG TT 3
4613 PCR quantitativa
Ensaios de quantificaccedilatildeo absoluta do DNA alvo foram realizados com sistema
de PCR em tempo real (qPCR) StepOne (Applied Biosystems Life Technologies
Corporation) Diferentes concentraccedilotildees de cada primer iniciador e sonda foram
testados para aprimorar a reaccedilatildeo de qPCR Considerou-se ideal as seguintes
caracteriacutesticas r2 ge 0950 eficiecircncia entre 95 a 105 e slope proacuteximo de -332
A melhor reaccedilatildeo obtida foi a partir de 625 microl de Universal PCR Master Mix
(Applied Biosystems) 1 microM de cada iniciador 05 microM de sonda TaqMan MGB
marcada com corante fluorescente 25 microl de DNA extraiacutedo e aacutegua sem RNase para
o volume final de 125 microl As condiccedilotildees de amplificaccedilatildeo foram 50 degC por 10 min 95
degC por 10 min e 45 ciclos de desnaturaccedilatildeo a 95 degC durante 15 s anelamento a 59
degC durante 1 min Todas as reaccedilotildees foram realizadas em duplicata no aparelho
PCR em tempo real StepOnePlus (Applied Biosystems)
67
Para a construccedilatildeo de padrotildees de DNA para a quantificaccedilatildeo absoluta utilizou-
se como controle positivo a cepa de referecircncia ndash M hominis ATCC 23114 (PG-21)
que foi inicialmente cultivada em 1 ml de caldo SP4 a 37 degC e expandidos ateacute 100
ml Na fase de crescimento logariacutetmico (com base em alteraccedilotildees colorimeacutetricas) a
cultura foi centrifugada a 20600 rpm durante 30 minutos a 25 degC O DNA foi extraiacutedo
usando o kit PureLinktrade Genomic DNA Mini O nuacutemero de coacutepias de DNA genocircmico
foi calculado por espectrofotometria (NanoDrop ND -1000 WITec Ag Littau Suiacuteccedila)
Diluiccedilotildees decimais (107- 1 coacutepiasl) do DNA de M hominis para curva padratildeo foram
preparadas e analisadas
Os dados foram obtidos durante a etapa de anelamento e analisados pelo
Software StepOne 21 (Applied Biosystems Life Technologies Corporation) O limiar
foi ajustado manualmente dentro da curva logariacutetmica acima do niacutevel de detecccedilatildeo
basal e abaixo da fase linear e do platocirc O ciclo limiar (Ct-threshold cycle) das
diluiccedilotildees do genoma foi plotado contra o nuacutemero de log de coacutepias do genoma e
utilizado como entrada para criar a curva padratildeo Anaacutelises de regressatildeo linear foram
aplicadas para calcular os valores de r2 e do slope Assumindo a eficiecircncia de 100
se o molde de DNA eacute duplicado em cada ciclo a eficiecircncia da PCR foi calculada
como E= 10 (-1slope) - 1 onde E eacute a eficiecircncia da PCR
4614 Especificidade da qPCR e repetibilidade intra e inter-ensaios
O DNA dos micro-organismos utilizados como controles foi testado para
verificar a especificidade dos ensaios de qPCR (descrito em cepas bacterianas) A
repetibilidade intra-ensaio foi determinada executando cinco repeticcedilotildees das diluiccedilotildees
do genoma de M hominis (107 a 1 coacutepia do genoma bacterianoreaccedilatildeo) na mesma
reaccedilatildeo A curva padratildeo foi gerada utilizando o software StepOne 21 (Applied
Biosystems Life Technologies Corporation) A repetibilidade inter-ensaio foi obtida
por reaccedilotildees em triplicatas com a mesma diluiccedilatildeo do genoma em trecircs ensaios
diferentes em dias separados e consecutivos Estas repeticcedilotildees foram aplicadas
para determinar a meacutedia o desvio padratildeo e o coeficiente de variaccedilatildeo em valores de
Ct para cada diluiccedilatildeo do genoma
68
462 Reaccedilatildeo em cadeia da polimerase (PCR) convencional
As amostras cliacutenicas tambeacutem foram submetidas a PCR convencional para a
detecccedilatildeo da Classe Mollicutes utilizando-se dos os iniciadores descritos por Van
Kuppeveld et al (1992) Aacutegua livre de nuclease foi utilizada como controle negativo
em ambos os ensaios Os produtos amplificados foram analisados em gel de
agarose a 15 com brometo de etiacutedio 05 mmmL e tampatildeo TAE (Trisacetate 40
mM EDTA 2 mM pH 80) Os produtos foram visualizados e foto documentados sob
luz ultravioleta utilizando um sistema foto documentador (Vilber Lourmat Marne-la-
Vallee Franccedila)
463 Detecccedilatildeo de micro-organismos dos filos Firmicutes e Bacteroidetes e bacteacuterias totais (Eubacterias) por PCR em tempo Real (qPCR)
Para a construccedilatildeo de padrotildees de DNA para a quantificaccedilatildeo absoluta de
Firmicutes e Bacteroidetes utilizou-se como controles positivos as cepas de
referecircncias ndash Clostridium perfringens e Bacteroides fragilis respectivamente Para a
quantificaccedilatildeo de Bacteacuterias Totais (Eubacteacuterias) foi utilizado como controle positivo
Clostridium perfringens Os controles foram submetidos agrave extraccedilatildeo de DNA por meio
do kit QIAamp DNA stool ndash QIAGEN baseado no protocolo de extraccedilatildeo sugerido
pelo fabricante Para os filos Firmicutes Bacteroidetes assim como Bacteacuterias totais
foram utilizadas sequencias de iniciadores descritos por Guo et al (2008)
apresentadas no quadro 3
69
Quadro 3 ndash Sequecircncias dos iniciadores utilizados para amplificaccedilatildeo do gene 16S rRNA para Firmicutes Bacteroidetes e Bacteacuterias Totais (Eubacteacuterias)
Iniciadores Sequecircncia Referecircncia
Firm934F 5 GGA GYA TGT GGT TTA ATT CGA AGC A 3 GUO et al 2008
Firm1060R 5 AGC TGA CGA CAA CCA TGC AC 3
Bact934F 5 GGA RCA TGT GGT TTA ATT CGA TGA T 3 GUO et al 2008
Bact1060R 5 AGC TGA CGA CAA CCA TGC AG 3
Eub338F 5 ACT CCT ACG GGA GGC AGC AG 3 FIERER et al 2005
Eub518R 5 ATT ACC GCG GCT GCT GG 3
Os micro-organismos foram quantificados de modo absoluto baseando-se em
curva padratildeo previamente estabelecida Para cada reaccedilatildeo finalizada uma nova
curva padratildeo foi adicionada e paracircmetros de qualidade foram adotados na anaacutelise
sendo estes r2 ge 0950 eficiecircncia da reaccedilatildeo variando de 95 a 105 e slope
proacuteximo de -332
As reaccedilotildees de qPCR foram realizadas em volume final de 125 μL com 625
μL da mistura universal SYBR Green (Applied Biosystems Satildeo Paulo SP Brasil)
0 25 μM de cada primer especiacutefico 45μL de aacutegua e 125 μl de DNA extraiacutedo com
volume final de 125 μL As quantificaccedilotildees foram realizadas utilizando-se a
plataforma Applied Biosystems (Life Technologies Corporation) com os seguintes
paracircmetros 50 degC por 10 minutos 95 degC por 10 minutos seguidos de 45 ciclos de
95 degC por 15 segundos e 60degC por 1 minuto seguidas da curva de melting (15
segundos a 95 degC 1 minuto a 60 degC 15 segundos a 95 degC e 15 segundos e 60 degC)
47 Dosagem de citocinas do soro sanguiacuteneo
A dosagem das citocinas IL-1β TNF-α IL-10 e IL17-A foram realizadas
utilizando-se kit de ELISA de captura (eBioscience San Diego C A Estados
Unidos) em placas de poliestireno com 96 orifiacutecios e alta absorccedilatildeo de acordo com
protocolo indicado pelo fabricante Apoacutes padronizaccedilatildeo da curva padratildeo a aliacutequota
de 100 microL do sobrenadante das ceacutelulas foi utilizada para dosar as citocinas IL-1β
TNF-α IL-10 e IL17-A A leitura foi realizada com instrumento leitor de ELISA Vivid
70
Vision com comprimento de onda de 450 nm Os dados obtidos em absorbacircncia
foram transformados em picomols por meio de foacutermula matemaacutetica
48 Anaacutelises Estatiacutesticas
As anaacutelises estatiacutesticas da presenccedila dos microrganismos da classe Mollicutes
detectados nas amostras cliacutenicas e dos dados obtidos dos questionaacuterios foram
avaliados por meio do software SPSS 200 (SPSSreg Inc Chicago Estados Unidos)
Para comparar variaacuteveis de consumo alimentar e as variaacuteveis relacionadas ao perfil
da populaccedilatildeo estudada entre os grupos caso e controle foi aplicado Teste de qui-
quadrado de Pearson ou Teste Exato de Fisher tendo sido considerado plt005 e IC
95 O teste t que compara meacutedia entre grupos foi utilizado para verificar a
existecircncia de associaccedilatildeo entre as variaacuteveis desfecho (mulheres obesas x mulheres
eutroacuteficas) e as variaacuteveis Mollicutes (presenccedila x ausecircncia) com o consumo
alimentar dos macronutrientes carboidratos proteiacutenas lipiacutedeos e fibras (p le 005)
Unidos) Aleacutem disso para verificaccedilatildeo de associaccedilatildeo entre as variaacuteveis desfecho e a
presenccedila de Mollicutes foi aplicado Teste de qui-quadrado de Pearson ou Teste
Exato de Fisher tendo sido calculada a razatildeo de chances (odds ratio) (IC 95)
com o objetivo de verificar o poder da associaccedilatildeo entre as variaacuteveis supracitadas
Para verificar as distribuiccedilotildees de cargas dos micro-organismos estudados em
ambos os grupos avaliados inicialmente foi utilizado o teste de normalidade de
Shapiro-Wilk que demonstrou natildeo satisfazer a preacute-suposiccedilatildeo para utilizaccedilatildeo de um
teste parameacutetrico A partir desse resultado foi utilizado o teste natildeo-parameacutetrico de
Mann-Whitney amplamente utilizado para amostras pareadas que natildeo seguem
distribuiccedilatildeo normal As anaacutelises foram realizadas utilizando o programa estatiacutestico
GraphPad Prism versatildeo 500 (GraphPad Software San Diego California USA)
sendo estabelecida a existecircncia de significacircncia estatiacutestica quando o valor de p le
005 em todas as anaacutelises
Para anaacutelise dos dados de quantificaccedilatildeo das citocinas tambeacutem foi utilizado o
programa GraphPad Prism versatildeo 500 (GraphPad Software San Diego California
USA) tendo sido realizado o teste natildeo-parameacutetrico de Mann-Whitney
71
5 RESULTADOS
51 Perfil da populaccedilatildeo estudada
A amostragem do estudo envolveu 40 mulheres sendo 20 classificadas com
obesidade (IMC gt30 Kgm2) e 20 em eutrofia (IMC 185 - 249 Kgm2) com meacutedia de
idade de 38 anos para todas as mulheres 44 anos (DP 93 Amplitude 28-57) para
as mulheres obesas do grupo caso e 33 anos (DP 1204 Amplitude22-66) para as
mulheres eutroacuteficas do grupo controle
No presente estudo as variaacuteveis foram agrupadas em 9 Seccedilotildees com
resultados descritivos representados nas tabelas de 1 a 9 que representam a
subcategorizaccedilatildeo das variaacuteveis independentes para determinaccedilatildeo do perfil da
populaccedilatildeo estudada
O grupo das mulheres obesas foi caracterizado pela maioria de cor preta
parda ou indiacutegena (70) onde as moleacutestias atuais associadas mais frequentes
foram hipertensatildeo (30) dispneia (35) constipaccedilatildeo (35) refluxo (35) e
alteraccedilatildeo menstrual (55) A maioria das mulheres nasceram de parto normal
(75) foram amamentadas (90) jaacute tiveram filhos (70) e foram classificadas
como fisicamente ativas (60) Aleacutem disso 13 (65) das mulheres do grupo caso
referiram fazer trecircs ou mais refeiccedilotildees por dia Em relaccedilatildeo ao grupo das mulheres
eutroacuteficas esse foi caracterizado pela maioria de cor branca ou amarela (55) onde
as moleacutestias atuais associadas mais frequentes foram hipercolesterolemia (5)
dispneia (5) gastrite (15) e constipaccedilatildeo (20) Metade das mulheres nasceram
de parto normal (50) e foram amamentadas (85) enquanto 2 (10) tiveram
filhos e 9 (55) foram classificadas como fisicamente ativas Assim como o grupo
caso 13 (65) das mulheres do grupo controle referiram fracionar sua refeiccedilatildeo em
trecircs ou mais por dia
Aleacutem disso observa-se com base nos resultados estatiacutesticos que houve
variaccedilatildeo significativa na comparaccedilatildeo das variaacuteveis relacionadas ao perfil da
populaccedilatildeo estudada Em relaccedilatildeo agrave Seccedilatildeo 1 Histoacuteria Cliacutenica foram encontradas
variaccedilotildees significativas para as variaacuteveis associadas ao trato gastrintestinal
flatulecircncia (p=0008) refluxo (p=0018) azia (p=0008) e para as variaacuteveis
associadas agrave Moleacutestia atual hipertensatildeo (p=0008) dispneacuteia (p=0008) e alteraccedilatildeo
menstrual (p=0000) Em relaccedilatildeo agrave Seccedilatildeo 4 Histoacuteria Obsteacutetrica foi encontrada
72
variaccedilatildeo significativa para a variaacutevel gestaccedilatildeo (p=0000) Para a Seccedilatildeo 5 Histoacuteria
ginecoloacutegica observou-se variaccedilatildeo estatiacutestica para a variaacutevel menopausa (p=0038)
Tabela 1 ndash Determinaccedilatildeo do perfil da populaccedilatildeo estudada referente agrave Seccedilatildeo 1 Dados socioeconocircmicos Satildeo Paulo SP 2013-2014
Nota n= 20 mulheresa ndash Considerou-se como valor de Salaacuterio Miacutenimo (R$ 67800) ndash Significacircncia estatiacutestica quando p-valor le 005
Tabela 2 ndash Determinaccedilatildeo do perfil da populaccedilatildeo estudada referente agrave Seccedilatildeo 2 Histoacuteria Familiar Satildeo Paulo SP 2013-2014
Nota n= 20 mulheres a ndash Referente agrave parentes de primeiro grau paternos e maternos aleacutem de irmatildeos ndash Significacircncia estatiacutestica quando p-valor le 005
Variaacuteveis
Grupo Caso n ()
Grupo Controle n ()
IC 95 P
Raccedilacor
009-128 0110 PretaPardaIndiacutegena BrancaAmarela
14 (70) 6 (30)
9 (45) 11 (55)
Escolaridade
096-128 0147 lt Ensino Meacutedio ge Ensino Meacutedio
1 (5) 19(95)
0 (0) 20 (100)
Relaccedilatildeo Estaacutevel
023-283 0752 Sim Natildeo
11 (55) 9 (45)
10 (50) 10 (50)
Renda familiar
010-155 0185 lt 2 salaacuterios miacutenimosa ge 2 salaacuterios miacutenimosa
9 (45) 11 (55)
5 (25) 15 (75 )
Variaacuteveis
Grupo Caso n ()
Grupo Controle n ()
IC 95 P
Famiacutelia hipertensatildeo
006-120 0077 Sim Natildeo
17 (85) 3 (15)
12 (60) 8 (40)
Famiacutelia diabetesa
013-157 0206 Sim Natildeo
12 (60) 8 (40)
8 (40) 12 (60)
Famiacutelia obesidadea
007-106 0058 Sim Natildeo
13 (65) 7(35)
7 (35) 13 (65)
Famiacutelia hipercolesterolemiaa
035-430 0749 Sim Natildeo
11 (55) 9 (45)
12 (60) 8 (40)
Famiacutelia Doenccedilas Caacuterdio-vasculares (DCV)a
029-345 1000 Sim Natildeo
10 (50) 10 (50)
10 (50) 10 (50)
73
Tabela 3 ndash Determinaccedilatildeo do perfil da populaccedilatildeo estudada referente agrave Seccedilatildeo 3 Histoacuteria Cliacutenica Satildeo Paulo SP 2013-2014
Nota n=20 mulheres a- Histoacuterico cliacutenico das pacientes em relaccedilatildeo agrave alteraccedilotildees gastrintestinais moleacutestia atual e uso de laxantes- Diferenccedila estatiacutestica natildeo computada pois a variaacutevel eacute uma constante
Variaacuteveis
Grupo Caso n ()
Grupo Controle n ()
IC 95 P
TGI constipaccedilatildeoa
003-115 0058 Sim Natildeo
7 (35) 13 (65)
2 (10) 18 (90)
TGI flatulecircnciaa
107-190 0008 Sim Natildeo
6 (30) 14 (70)
0 (0) 20 (100)
TGI refluxoa
001-089 0018 Sim Natildeo
7 (35) 13 (65)
1 (5) 19 (95)
TGI aziaa
107-190 0008 Sim Natildeo
6 (30) 14 (70)
0 (0) 20 (100)
TGI uacutelceraa
095-116 0311 Sim Natildeo
1 (5) 19 (95)
0 00) 20 (100)
TGI gastritea Sim Natildeo
2 (10)
18 (90)
3 (15)
17 (85) 023-107 0633
TGI naacuteuseasa Sim Natildeo
3 (15)
17(85)
1 (5)
19 (95) 002-314 0292
TGI vocircmitosa Sim Natildeo
1 (5)
19 (95)
0 (0)
20 (100) 095-116 0311
TGI diarreacuteiaa Sim Natildeo
0 (0)
20(100)
0 (0)
20 (100)
Moleacutestia atual hipertensatildeoa Sim Natildeo
6 (30)
14 (70)
0 (0)
20 (100) 107-190 0008
Moleacutestia atual diabetesa Sim Natildeo
0 (0)
20 (100)
0 (0)
20 (100)
Moleacutestia atual hipercolesterolemiaa Sim Natildeo
5 (25)
15 (75)
1 (5)
19 (95) 001-150 0077
Moleacutestia atual DCVa Sim Natildeo
2 (10)
18 (90)
0 (0)
20 (100) 096-128 0147
Moleacutestia atual Dispneacuteiaa Sim Natildeo
7 (35)
13 (65)
1 (5)
19 (95) 001-089 0018
Moleacutestia atual alteraccedilatildeo menstruala Sim Natildeo
11 (55)
9 (45)
0 (0)
20 (100) 136-360 0000
Uso de laxantesa Sim Natildeo
3 (15)
17 (85)
0 (0)
20 (100) 097-141 0072
74
Tabela 4 ndash Determinaccedilatildeo do perfil da populaccedilatildeo estudada referente agrave Seccedilatildeo 4 Histoacuteria Obsteacutetrica Satildeo Paulo SP 2013-2014
Nota n= 20 mulheres andash Foram considerados aspectos relacionados as pacientes em seu nascimento e na maternidade ndash Significacircncia estatiacutestica quando p-valor le 005
Variaacuteveis
Grupo Caso n ()
Grupo controle n ()
IC 95 P
Nascimento por parto cesaacutereaa
078-1144 0102 Sim Natildeo
5 (25) 15(75)
10 (50) 10 (50)
Nascimento por parto normala
008-127 0102 Sim Natildeo
15 (75) 5 (25)
10 (50) 10 (50)
Foi amamentadaa
009-424 0633 Sim Natildeo
18 (90) 2 (30)
17 (85) 3 (15)
Teve alguma gestaccedilatildeoa
0008-0273 0000 Sim Natildeo
14 (70) 6 (30)
2 (10) 18 (90)
Sofreu algum abortoa Sim Natildeo
2 (10)
18 (90)
2 (10)
18 (90) 096-128 0147
75
Tabela 5 ndash Determinaccedilatildeo do perfil da populaccedilatildeo estudada referente agrave Seccedilatildeo 5 Histoacuteria Ginecoloacutegica Satildeo Paulo SP 2013-2014
Nota n= 20 mulheres andash Idade meacutedia em que todas as mulheres estudadas comeccedilaram a ingerir
contraceptivo 22 anos ndash Significacircncia estatiacutestica quando p-valor le 0005
Tabela 6 ndash Determinaccedilatildeo do perfil da populaccedilatildeo estudada referente agrave Seccedilatildeo 6 Consumo atual de tabaco Satildeo Paulo SP 2013-2014
Nota n= 20 mulheres ndash Significacircncia estatiacutestica quando p-valor le 005
Variaacuteveis
Grupo Caso n ()
Grupo Controle n ()
IC 95 P
Menopausa
004-097 0038 Sim Natildeo
9 (45) 11(55)
3 (15) 17 (85)
Usou ou estaacute usando contraceptivo
021-470 1000 Sim Natildeo
16 (80) 4 (20)
16 (80) 14 (20)
Contraceptivo hormonal
041-633 0490 Sim Natildeo
13 (65) 7 (35)
15 (75) 5 (25)
Contraceptivo natildeo hormonal
002-314 0292 Sim Natildeo
3 (15) 17(85)
1 (5) 19 (95)
Idade que comeccedilou a ingerir ge 22 anosa
011-156 0197 Sim Natildeo
10 (50) 10 (50)
6 (30) 14 (70)
Idade que comeccedilou a ingerir lt 22 anosa Sim Natildeo
2 (10)
18 (90)
2 (10)
18 (90) 063-853 0197
Variaacuteveis
Grupo Caso n ()
Grupo Controle n ()
IC 95 P
Consumo atual de tabaco
002-207 0151 Sim Natildeo
4 (20) 16 (80)
1 (5) 19 (95)
Jaacute consumiu tabaco
023-418 1000 Sim Natildeo
5 (25) 15 (75)
5 (25) 15 (75)
76
Tabela 7 ndash Determinaccedilatildeo do perfil da populaccedilatildeo estudada referente agrave Seccedilatildeo 7 Consumo atual de aacutelcool Satildeo Paulo SP 2013-2014
Nota n= 20 mulheres ndash Significacircncia estatiacutestica quando p-valor le 005
Tabela 8 ndash Tabela de determinaccedilatildeo do perfil da populaccedilatildeo estudada referente agrave Seccedilatildeo 8 Atividade Fiacutesica (IPAQ versatildeo curta) Satildeo Paulo SP 2013-2014
Nota n= 20 mulheres andash Para a classificaccedilatildeo foi utilizado o IPAQ (International Physical Activity Questionnaire) versatildeo curta Irregularmente ativa Irregularmente ativa A e B ndash Significacircncia estatiacutestica quando p-valor le 005
Variaacuteveis
Grupo Caso n ()
Grupo Controle n ()
IC 95 P
Consumo atual de aacutelcool
052-643 0342 Sim Natildeo
8 (40) 12 (60)
11 (55) 9 (45)
Variaacuteveis
Grupo Caso n ()
Grupo Controle
IC 95 P
Niacutevel de atividade fiacutesica
015-191 0342 Ativaa Irregularmente ativaa
12 (60) 8 (40)
9 (45) 11 (55)
77
Tabela 9 ndash Tabela de determinaccedilatildeo do perfil da populaccedilatildeo estudada referente agrave Seccedilatildeo 9 Mudanccedilas recentes nos haacutebitos alimentares Satildeo Paulo SP 2013-2014
Nota n= 20 mulheres andash Meacutedia de refeiccedilotildees diaacuterias 3 refeiccedilotildees - Diferenccedila estatiacutestica natildeo
computada pois a variaacutevel eacute uma constante ndash Significacircncia estatiacutestica quando p-valor le 005
Variaacuteveis
Grupo Caso n ()
Grupo Controle
n ()
IC 95 P
Mudou haacutebitos alimentares recentemente
007-151 0144 Sim Natildeo
7 (35) 13 (65)
3 (15) 17 (85)
Mudou haacutebitos alimentares recentemente para perda de peso
007-151 0144 Sim Natildeo
7 (35) 13 (65)
3 (15) 17 (85)
Mudou haacutebitos alimentares recentemente para dieta vegetariana ou restriccedilatildeo de consumo carne
Sim Natildeo
0(0) 20(100)
0(0) 20(100)
Mudou haacutebitos alimentares recentemente restriccedilatildeo de consumo sal
Sim Natildeo
0(0) 20(100)
0(0) 20(100)
Mudou haacutebitos alimentares recentemente para reduccedilatildeo do colesterol
Sim Natildeo
0(0) 20(100)
0(0) 20(100)
ge refeiccedilotildeesdiaa
Sim Natildeo
13(65) 7(35)
14(70) 6(30)
033-473 0736
lt refeiccedilotildeesdiaa
Sim Natildeo
7(35)
13(65) 7(35)
13(65) 027-366 1000
Desjejum diariamente
051-900 0288 Sim Natildeo
13 (35) 7(65)
16 (80) 4 (20)
Costuma beliscar entre as refeiccedilotildees
035-430 0749 Sim Natildeo
11 (55) 9 (45)
12 (60) 8 (40)
Costuma ingerir liacutequidos durante as refeiccedilotildees
009-154 0168 Sim Natildeo
16 (80) 4 (20)
12 (60) 8 (40)
Costuma fazer refeiccedilotildees fora de casa
112-933 0018 Sim Natildeo
12 (60) 8 (40)
19 (95) 1 (5)
78
52 Determinaccedilatildeo do estado nutricional
521 Avaliaccedilatildeo qualitativa do consumo alimentar
Na Tabela 10 (apecircndice) encontra-se a participaccedilatildeo dos alimentos nos grupos
e meacutedias de consumo diaacuterio dos alimentos pela populaccedilatildeo estudada Os alimentos
mais consumidos e que apresentaram frequecircncia diaacuteria de uma vez ao dia ou mais
em relaccedilatildeo ao grupo caso foram feijatildeo arroz alface tomate e oacuteleo azeite ou
vinagre para tempero de salada Em relaccedilatildeo ao grupo controle os que apresentaram
consumo diaacuterio de uma vez ou mais foram arroz e patildeo francecircs patildeo de forma
integral patildeo doce ou torrada
O percentual de consumo dos 16 grupos alimentares identificados derivados
do QFA (Tabela 11) em relaccedilatildeo ao grupo caso que foram consumidos por 80 ou
mais da populaccedilatildeo foram massas carne vermelha e ovos embutidos carne branca
cereais raiacutezes e tubeacuterculos hortaliccedilas e frutas No mesmo grupo populacional os
grupos alimentares de menor consumo foram bebida alcooacutelica leite e derivados e
preparaccedilotildees com percentuais de consumo de 30 493 e 525
respectivamente Os grupos que apresentaram consumo intermediaacuterio foram
Infusatildeo Oacuteleos e gorduras accediluacutecar e doces lanches leguminosas e alimentos
industrializados com percentuais de consumo de 60 616 65 783 783 e
79 respectivamente No grupo controle os grupos alimentares que apresentaram
consumo de 80 ou mais da populaccedilatildeo foram massa carne vermelha e ovos carne
branca cereais raiacutezes e tubeacuterculos hortaliccedilas lanches e accediluacutecar e doces Ainda
nesse grupo populacional os grupos alimentares de menor consumo assim como no
grupo caso foram bebida alcooacutelica preparaccedilotildees e leite e derivados com
percentuais de consumo de 45 45 e 486 respectivamente Os grupos que
apresentaram consumo intermediaacuterio foram oacuteleos e gorduras Infusatildeo alimentos
embutidos leguminosas alimentos industrializados e frutas com percentuais de
consumo de 616 65 65 65 657 731 respectivamente
79
Tabela 11 ndash Definiccedilatildeo dos grupos alimentares derivados do Questionaacuterio de Frequecircncia Alimentar (QFA) e percentual de consumo da populaccedilatildeo estudada Satildeo Paulo SP 2013-2014
Grupo Alimentar
Grupo Consumo Alimentos
Massas
Caso 90 Macarratildeo com molho sem carne macarratildeo com molho com
carne lasanha nhoque pizza e panqueca Controle 916
Preparaccedilatildeo Caso
525 Sopas polenta cozida ou frita
Controle 45
Carne vermelha e ovos
Caso 888 Carne bovina Carne de porco carne de sol bacon e ovo
Controle 813
Embutidos Caso 825 Linguiccedila e embutidos (presunto mortadela salsicha)
Controle 65
Carne branca Caso 975 Frango peixe e frutos do mar
Controle 95
Leite e derivados
Caso 493 Leite integral leite desnatado leite semi-desnatado iogurte
natural iogurte com frutas queijo mussarela queijo prato
parmesatildeo provolone queijo minas e ricota
Controle 486
Leguminosas
Caso 783 Feijatildeo lentilha ervilha seca gratildeo de bico soja feijoada feijatildeo tropeiro
Controle 65
Cereais raiacutezes e tubeacuterculos
Caso
813
Arroz branco integral cozido com oacuteleo e temperos batata frita
mandioca frita batata cozida mandioca cozida inhame purecirc
de batatas ou mandioca farinha de mandioca farofa cuscuz
tapioca aveia patildeo francecircs patildeo de forma torrada biscoito
sem recheio doce e salgado biscoito recheado biscoito
amanteigado waffer bolo simples bolo recheado
Controle
887
Hortaliccedilas
Caso 964 Alface tomate cenoura outros legumes (abobrinha berinjela chuchu pepino) outras verduras cruas (acelga ruacutecula agriatildeo) outras verduras cozidas (acelga espinafre escarola couve) broacutecolis couve-flor e repolho
Controle 926
Frutas Caso 825 Laranja mexerica abacaxi banana maccedila pecircra melatildeo
melancia mamatildeo goiaba abacate suco natural Controle 731
Industrializados
Caso
79
Maionese condimentos molho para salada patecirc chantilly suco industrializado refrigerante comum diet e light hambuacuterguer nuggets almondegas Controle 657
Infusatildeo Caso 60 Chaacute e cafeacute sem accediluacutecar chaacute e cafeacute com accediluacutecar
Controle 65
Bebida alcooacutelica Caso 30 Cerveja
Controle 45
Oacuteleos e gorduras Caso 616 Oacuteleo azeite vinagre manteiga ou margarina comum
manteiga ou margarina light Controle 616
Lanches Caso 783 Salgados fritos salgados assados sanduiacuteche
Controle 833
Aacutecuacutecar e doces Caso 65 Chocolate bombom brigadeiro chocolate em poacute sobremesas doces tortas e pudins accediluacutecar mel geleacuteia Controle 888
80
Todos os indiviacuteduos da pesquisa foram avaliados quanto a ingestatildeo dieteacutetica
Os dados dieteacuteticos obtidos foram traduzidos em energia macro e micronutrientes
(Tabela 12) Observa-se com base nos resultados estatiacutesticos que natildeo houve
variaccedilatildeo significativa no consumo alimentar das mulheres estudadas tendo sido
semelhante entre os grupos caso e controle Aleacutem disso ao realizar-se o teste t
comparando as meacutedias de consumo dos macronutrientes carboidratos proteiacutenas
lipiacutedios e fibras com as variaacuteveis desfecho (mulheres obesas x mulheres eutroacuteficas)
tambeacutem natildeo foram observadas associaccedilotildees estatisticamente significantes
Analisando a razatildeo de ingestatildeo quilocaloriasquilograma de peso corporal
tem-se que o grupo caso teve meacutedia de ingestatildeo energeacutetica de 199 kcalkgdia e o
grupo controle 279 kcalkgdia (Tabela 13) O grupo controle evidenciou consumo
compatiacutevel para a manutenccedilatildeo do seu peso (faixa de recomendaccedilatildeo 25-30
kcalkgdia) enquanto o grupo caso apresentou um niacutevel meacutedio de ingestatildeo abaixo
do valor de manutenccedilatildeo a ingestatildeo energeacutetica foi 204 menor do que a
recomendaccedilatildeo considerando-se o limite inferior de 25 kcalkgdia
Outra razatildeo de ingestatildeo gramas de proteiacutenasquilograma de peso corporal eacute
utilizada para caacutelculo e recomendaccedilatildeo de consumo proteacuteico sem prejuiacutezo da funccedilatildeo
renal (recomendaccedilatildeo de ingestatildeo 06 a 08 g de proteiacutenaskg de pesodia) O grupo
controle apresentou ingestatildeo proteacuteica acima do recomendado 12 g de proteiacutenaskg
de pesodia enquanto o grupo caso apresentou um niacutevel meacutedio de consumo
compatiacutevel com a recomendaccedilatildeo 078 g de proteiacutenaskg de pesodia apresentando-
se no limite maacuteximo preconizado (Tabela 13)
81
Tabela 12 ndash Anaacutelise de consumo de energia e nutrientes da populaccedilatildeo estudada Satildeo Paulo SP 2013-2014
Variaacuteveis Grupo Meacutedia de consumo
Desvio Padratildeo
IC 95 P
Energiadia (kcal)
Caso 18571 93622 (137401 ndash 205869) 093
Controle 1692 98334 (120438 ndash 217822)
Carboidratodia (g)
Caso 24345 16826 (16706 ndash 25787)
090 Controle 20785
10997 (15402 ndash 26294)
Gordura totaldia (g)
Caso
658
276
(5205 ndash 7926) 086
Controle
627
4714 (3998 ndash 8673)
Gordura polinsaturadadia
(g)
Caso 795 416 (617 ndash 937) 048
Controle 85 675 (575 ndash 1237)
Gordura monoinsaturadadia
(g)
Caso 206 925 (1640 ndash 2553)
059 Controle 182 1598
(1077 ndash 2651)
Gordura saturadadia (g)
Caso 2185 1149 (1670 ndash 2808)
075 Controle 204 1698 (1239 ndash 2924)
Proteiacutenadia (g) Caso 7355 3508 (5531 ndash 8905)
091 Controle 7285 4985 (4914 ndash 9849)
Fibra totaldia (g) Caso 168 902 (1247 ndash 1953)
027 Controle 1265 765 (944 ndash1699)
Fibra soluacuteveldia (g) Caso 4 332 (273 ndash 563)
029 Controle 285 23 (215 ndash 437)
Fibra insoluacuteveldia (g)
Caso 56 391 (404 ndash 703) 025
Controle 395 232 (338 ndash 562)
Colesteroldia (g) Caso 23635 13965 (17127 ndash 30877)
077 Controle 26105 26790 (12780 ndash 39313)
Vitamina Adia (UI) Caso 95885 55538 (70451 ndash 124904)
055 Controle 872 47033 (64231 ndash 110801)
Vitamina Cdia (mg) Caso 2105 18857 (11025 ndash 29152)
011 Controle 12035 8752 (7936 ndash 16565)
Vitamina B1dia (mg)
Caso 13 117 (131 ndash 204) 072
Controle 13 166 (104 ndash 260)
Vitamina B2dia (mg)
Caso 08 083 (107 ndash 174) 079
Controle 105 089 (103 ndash 193)
82
Tabela 12 ndash Anaacutelise de consumo de energia e nutrientes da populaccedilatildeo estudada Satildeo Paulo SP 2013-2014
(Continuaccedilatildeo)
Variaacuteveis Grupo Meacutedia
de consumo Desvio Padratildeo
IC 95 P
Vitamina B6dia (ug)
Caso 110 102 (121 ndash 197)
085 Controle 105 088 (110 ndash 197)
Vitamina B12dia (ug)
Caso 38 253 (309 ndash 562) 096
Controle 385 285 (302 ndash 578)
Vitamina Ddia (mg)
Caso 915 1620 (211 ndash 1803) 012
Controle 23 3357 (733 ndash 4061)
Niacinadia (mg)
Caso 19 1005 (1402 ndash 2191)
059 Controle 193
1303 (1339 ndash 2641)
Folatodia (mg)
Caso
24010
11621
(17758 ndash 28351) 054
Controle 20495 12117 (14708 ndash 26684)
Aacutecido pantotecircnicodia
(mg)
Caso 35 216 (292 ndash 443) 074
Controle 29 251 (220 ndash 469)
VitaminaEdia (mg)
Caso 1155 651 (894 ndash 1309) 079
Controle 99 625 (738 ndash 1368)
Iododia (mg) Caso 547 4984 (3206 ndash 8098)
049 Controle 4515 3674 (2814 ndash 6439)
Soacutediodia (mg) Caso 230285 159724 (155816 ndash 246261)
099 Controle 201715 148254 (127647 ndash 274446)
Caacutelciodia (mg) Caso 69045 42353 (47627 ndash 89502)
068 Controle 62645 33992 (46373 ndash 79973)
Magneacutesiodia (mg)
Caso 2325 10339 (17818 ndash 25995) 044
Controle 1947 9452 (14888 ndash 24255)
Zincodia (mg) Caso 85 523 (617 ndash 1115)
086 Controle 78 476 (603 ndash 1068)
Manganecircsdia (mg)
Caso 6 85 (206 ndash 1045) 064
Controle 1095 2019 (148 ndash 1446)
Potaacutessiodia (mg)
Caso 271955 117073 (208408 ndash 3131423) 029
Controle 220685 115874 (164415 ndash 279085)
Foacutesforodia (mg)
Caso 9754 44188 (73698 ndash 1151535) 086
Controle 9085 56939 (63379 ndash 119689)
83
Tabela 12 ndash Anaacutelise de consumo de energia e nutrientes da populaccedilatildeo estudada Satildeo Paulo SP 2013-2014
(Continuaccedilatildeo)
Variaacuteveis Grupo Meacutedia
de consumo Desvio Padratildeo
IC 95 P
Ferrodia (mg) Caso 137 859
(996 ndash 1538)
069
Controle 1145 616 (885 ndash 1492)
Cobredia (mg) Caso 1 0 917 (1 ndash 167)
090 Controle 085 109 (094 ndash 167)
Selecircniodia (ug) Caso 33475 21854 (23251 ndash 44777)
068 Controle 400 5844 (11179 ndash 69057)
Nota significacircncia estatiacutestica quando p-valor le 005
Tabela 13 ndash Comparaccedilatildeo das variaacuteveis dieteacuteticas relacionadas agraves razotildees de ingestatildeo e Valor Energeacutetico Total (VET) da populaccedilatildeo estudada Satildeo Paulo SP 2013-2014
Variaacuteveis Grupo Caso
Grupo controle
Energia (Kcal) 18571
1692
Kcalkgdia 199
279
Carboidrato (g) 24345
20785
Carboidrato (VET) 5241
4913
Proteiacutena (g) 7355
7285
Grama de proteiacutenakgdia
078
12
Proteiacutena (VET) 1584
1722
Lipiacutedeo (g) 658
627
Lipiacutedeo ( VET) 3188
3335
84
A partir de dados de meacutedia de ingestatildeo de macronutrientes comparou-se a
porcentagem que cada um deles carboidratos proteiacutenas e lipiacutedeos (Tabela 13)
representa no Valor Energeacutetico total (VET) ingerido com o intervalo de
balanceamento dieteacutetico proposto pelas Dietary References Intake (DRI) Assim
tem-se que os grupos caso e controle balancearam suas dietas conforme o intervalo
de distribuiccedilatildeo energeacutetica recomendado visualizado na figura 5 Em relaccedilatildeo ao
consumo de fibras foi observado que ambos os grupos apresentaram um consumo
inferior ao Adequate Intake (AI) com consumo de 168 e 1265 para os grupos
caso e controle respectivamente Em relaccedilatildeo ao consumo de lipiacutedios o consumo de
gordura saturada mostrou-se maior que os 7 recomendado pela Sociedade
Brasileira de Cardiologia (2007) em consonacircncia com a National Heart Lung e Blood
Institute dos Estados Unidos tanto no grupo caso quanto no grupo controle de
1058 e 1085 respectivamente
Figura 5 ndash Comparaccedilatildeo entre as meacutedias de consumo de macronutrientes dos Grupos Caso e Controle com a Faixa de Distribuiccedilatildeo Aceitaacutevel de macronutrientes (AMDRDRI) e AI (Adequate Intake) para a faixa etaacuteria de 20 a 70 anos Satildeo Paulo SP 2013-2014
Legenda ndash A recomendaccedilatildeo de consumo de macronutrientes para tal faixa etaacuteria eacute
para Carboidratos 45 a 65 do VET (Valor Energeacutetico Total) Proteiacutenas 10 a 35 do VET Lipiacutedeos 20 a 35 do VET e Fibras 21 a 26 gramasdia
85
A comparaccedilatildeo da meacutedia da ingestatildeo das vitaminas A C E e folato dos
grupos caso e controle com as recomendaccedilotildees de ingestatildeo mostrou que a meacutedia de
consumo dos grupos foi semelhante e de acordo com a recomendaccedilatildeo exceto para
folato e vitamina E em que ambos os grupos mostraram meacutedias de ingestatildeo abaixo
do recomendado (Figura 6)
Figura 6 ndash Comparaccedilatildeo entre as meacutedias de consumo das Vitaminas A C E e folato dos Grupos Caso e Controle com a Faixa de Distribuiccedilatildeo Aceitaacutevel de macronutrientes (AMDRDRI) e AI (Adequate Intake) para a faixa etaacuteria de 20 a 70 anos Satildeo Paulo SP 2013-2014
A comparaccedilatildeo da meacutedia das ingestotildees das Vitaminas B1 B2 B6 B12 D
Niacina e Aacutecido pantotecircnico dos grupos caso e controle com as recomendaccedilotildees de
ingestatildeo demonstrou que a meacutedia de consumo em relaccedilatildeo agraves vitaminas B1 e B12
estavam acima do recomendado nos dois grupos As vitaminas B6 e aacutecido
pantotecircnico apresentaram ingestatildeo inferior ao preconizado nos grupos caso e
controle Ambos os grupos estudados apresentaram consumo em concordacircncia com
as recomendaccedilotildees em relaccedilatildeo agrave niacina No entanto as vitaminas B2 e D
apresentaram consumo pelo grupo caso inferior enquanto o grupo controle
apresentou-se de acordo com a recomendaccedilatildeo (Figura 7)
86
Figura 7 ndash Comparaccedilatildeo entre as meacutedias de consumo das Vitaminas B1 B2 B6 B12 D Niacina e Aacutecido pantotecircnico dos Grupos Caso e Controle com a Faixa de Distribuiccedilatildeo Aceitaacutevel de macronutrientes (AMDRDRI)e AI (Adequate Intake) para a faixa etaacuteria de 20 a 70 anos Satildeo Paulo SP 2013-2014
Para os minerais foacutesforo e selecircnio a ingestatildeo dos grupos Caso e Controle
tambeacutem foi adequada Exceto para iodo caacutelcio e magneacutesio que tiveram a ingestatildeo
menor que a recomendaccedilatildeo e o cobre que apresentou uma ingestatildeo inferior ao
preconizado no grupo controle enquanto o grupo caso demonstrou uma ingestatildeo
adequada dentro dos limites de recomendaccedilatildeo (Figura 8)
87
Figura 8 ndash Comparaccedilatildeo entre as meacutedias de consumo de Sais Minerais dos Grupos Caso e Controle com a Faixa de Distribuiccedilatildeo Aceitaacutevel de macronutrientes (AMDRDRI)e AI (Adequate Intake) para a faixa etaacuteria de 20 a 70 anos Satildeo Paulo SP 2013-2014
Para os minerais e nutrientes soacutedio manganecircs e potaacutessio a ingestatildeo dos
grupos Caso e Controle foi adequada Exceto para ferro que apresentou ingestatildeo
menor que a recomendaccedilatildeo e o zinco que apresentou ingestatildeo um pouco inferior ao
preconizado no grupo controle enquanto o grupo caso demonstrou ingestatildeo
adequada dentro dos limites de recomendaccedilatildeo (Figura 9)
Figura 9 ndash Comparaccedilatildeo entre as meacutedias de consumo de Sais Minerais e outros nutrientes dos Grupos Caso e Controle com a Faixa de Distribuiccedilatildeo Aceitaacutevel de macronutrientes (AMDRDRI)e AI (Adequate Intake) para a faixa etaacuteria de 20 a 70 anos Satildeo Paulo SP 2013-2014
88
522 Avaliaccedilatildeo antropomeacutetrica do estado nutricional
Os resultados da avaliaccedilatildeo antropomeacutetrica estatildeo apresentados na tabela 14
Foi observado que as mulheres estudadas do grupo caso apresentaram meacutedia de
IMC (Iacutendice de massa corporal) de 365 kgm2 (DP 441 Amplitude 306-449) Ao
classificar as pacientes em classes de obesidade de acordo com os criteacuterios
determinados pela OMS (Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede) (1995) verificou-se que
nove (45) das mulheres apresentam obesidade grau I (IMC 30-3499 kgm2) sete
(35) apresentam obesidade grau II (IMC 35-3999 kgm2) e quatro (20) das
mulheres apresentam obesidade grau III (IMC ge 40 kgm2) As mulheres do grupo
controle apresentaram IMC meacutedio de 224 kgm2 (DP 204 Amplitude 188-249)
Em relaccedilatildeo ao percentual de gordura observou-se a meacutedia de 4535 (DP
518 Amplitude 354-534) de gordura corporal no grupo caso e 3004 (DP 671
Amplitude 113-404) no grupo controle indicando um excesso de gordura corporal
em ambos os grupos de acordo com LOHMAN (1992) Em relaccedilatildeo agrave essa
classificaccedilatildeo no grupo caso todas as mulheres apresentam riscos de doenccedilas
associadas agrave obesidade apresentando um percentual de gordura corporal maior que
32 Das mulheres do grupo controle 2 (10) apresentaram-se abaixo da meacutedia 1
(5) na meacutedia 8 (40) acima da meacutedia e 9 (45) apresentaram risco de
desenvolvimento de doenccedilas relacionadas com a obesidade
A avaliaccedilatildeo da Razatildeo cintura-quadril (RCQ) importante indicador de
obesidade central Comparando-se os resultados obtidos com o ponto de corte
recomendado pela OMS (Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede 1995) de 085 para
mulheres observou-se que todas as pacientes avaliadas do grupo caso apresentam-
se acima do recomendado com a meacutedia de RCQ de 099 (DP 0074 Amplitude
087-119) enquanto as mulheres do grupo controle apresentaram uma razatildeo meacutedia
de 083 (DP 0047 Amplitude 077-096) onde sete (35) mulheres apresentaram
a RCQ acima do valor referecircncia preconizado pela OMS No entanto ao avaliar a
Razatildeo cintura quadril de acordo com os pontos de corte propostos por LOHMAN et
al (1988) em relaccedilatildeo ao risco de desenvolvimento de doenccedilas associadas agrave
Siacutendrome Metaboacutelica (Doenccedilas cardiovasculares hipertensatildeo dislipidemia e
alteraccedilatildeo no metabolismo de carboidratos) os resultados demonstraram que em
relaccedilatildeo ao grupo caso 18 (90) das mulheres apresentaram alto risco para o
desenvolvimento dessas doenccedilas enquanto 2 (10) apresentaram risco moderado
89
Em relaccedilatildeo ao grupo controle foi observado que 3 (15) natildeo apresentaram riscos
13 (65) apresentaram baixo risco 1(5) apresentou risco moderado e 3 (15)
apresentaram alto risco para o desenvolvimento dessas doenccedilas
Tabela 14 ndash Comparaccedilatildeo de variaacuteveis antropomeacutetricas da populaccedilatildeo estudada
Variaacuteveis Grupo Meacutedia
Desvio Padratildeo
Miacutenimo Maacuteximo
Peso (kg) Caso 9329 105 7574 1075
Controle 6054 787 4575 7422
Estatura (m2) Caso 160 007 149 172
Controle 164 007 151 18
IMC (Kgm2) Caso 3645 452 306 449
Controle 2241 204 188 249
Razatildeo cintura-quadril (RCQ)
Caso 099 007 088 119
Controle 083 005 077 096
Gordura corporal total
()
Caso
4535
519
354
531
Controle
30035
671
113 404
90
53 Determinaccedilatildeo da microbiota intestinal
531 Padronizaccedilatildeo de reaccedilatildeo de PCR quantitativo (qPCR) por meio de TaqMan para a detecccedilatildeo de Mollicutes
Pela qPCR quantificou-se carga de Mollicutes representadas por unidades
formadoras de colocircnias (UFCmicrol) nas amostras de fezes O ensaio de qPCR
demonstrou eficiecircncia de reaccedilatildeo de E= 1033 (r2= 095) A sensibilidade do teste
foi de detecccedilatildeo de no miacutenimo dez coacutepias de genomareaccedilatildeo quando utilizados os
padrotildees de nuacutemero de coacutepias de DNA genocircmico diluiacutedo (Figura 10)
Figura 10 ndash Curva-padratildeo gerada a partir dos pontos de Ct obtidos com o graacutefico de amplificaccedilatildeo de diluiccedilotildees seriadas do controle positivo Mycoplasma hominis calculado pelo software StepOne 21 (Applied Biosystems Life Technologies Corporation) Satildeo Paulo SP 2013-2014
A repetibilidade testada por meio dos testes intra-ensaio e inter-ensaio da
qPCR estaacute apresentada na tabela 15 O ensaio foi especiacutefico para Mollicutes natildeo
tendo sido visualizada amplificaccedilatildeo dos controles microbianos de outros micro-
organismos utilizados
91
Tabela 15 ndash Repetibilidade intra-ensaio e inter-ensaio da qPCR para Mollicutes Satildeo Paulo SP 2013-2014
Nordm de coacutepias do Genoma
Repetibilidade intra-ensaio Repetibilidade inter-ensaio
Genoma bacteriano diluiacutedo
em 1times TE Genoma bacteriano diluiacutedo
em 1times TE
Ponto meacutedio de corte
(Ct plusmn SD) CV ()
Ponto meacutedio de corte (Ct plusmn SD)
CV ()
10 3537 plusmn 015 045 3494 plusmn 045 129
102 3425 plusmn 017 050 3379plusmn 029 087
103 3099 plusmn 021 070 3074 plusmn 039 128
104 2739 plusmn 023 084 2739 plusmn 038 142
105 2356 plusmn 012 054 2291plusmn 025 110
106 1874 plusmn 066 352 1915 plusmn 077 403
CV coeficiente de variaccedilatildeo
A PCR geneacuterica para Mollicutes foi positiva em 17 (85) das amostras
cliacutenicas do grupo caso e 8 (40) das amostras do grupo controle obtidas No
entanto nem todas as amostras positivas em cPCR para Mollicutes foram positivas
em qPCR 13 (65) das amostras do grupo caso e trecircs (15) do grupo controle
foram positivas em qPCR (Tabela 16)
Tabela 16 ndash Comparaccedilatildeo entre os resultados obtidos no teste de sensibilidade pelas teacutecnicas de PCR convencional e qPCR para detecccedilatildeo de Mollicutes Satildeo Paulo SP 2013-2014
Amostra
Grupo PCR convencional qPCR
n () n ()
Positivaa Caso 17 (85) 13 (65) Negativab 3 (15) 7 (35)
Positivaa
Negativab Controle 8 (40)
12 (60) 3 (15) 17 (85)
Nota n= 20 mulheres aPositiva - Detecccedilatildeo de produto de DNA esperado bNegativa - Ausecircncia de produto de DNA esperado
92
Por meio da PCR em tempo real foi possiacutevel quantificar o DNA e
consequentemente a carga do microrganismo representada por unidades
formadoras de colocircnias - ufcmicrol nas amostras de fezes coletadas Os resultados da
qPCR demonstraram uma carga meacutedia de Mollicutes nas amostras de fezes
analisadas referentes ao grupo caso de 584 x 103 ufcmicrol e de 156 ufcmicrol referentes
ao grupo controle Observa-se na figura 11 graacutefico de dispersatildeo referente agraves
cargas meacutedias das amostras positivas com detecccedilotildees de aproximadamente 101 a
103 UFCml de Mollicutes Contudo as meacutedias das dosagens foram maiores nas
mulheres do grupo caso E apoacutes anaacutelise estatiacutestica por Mann-Whitney foi possiacutevel
observar diferenccedila estatisticamente significante para a espeacutecie Mollicutes (p =
00023) Em seguida foi testada atraveacutes do teste de Odds Ratio a associaccedilatildeo
epidemioloacutegica entre as variaacuteveis desfecho (mulheres obesas x mulheres eutroacuteficas)
e as variaacuteveis Mollicutes (presenccedila x ausecircncia) tendo sido detectada uma
associaccedilatildeo positiva estatisticamente significante entre a presenccedila de Mollicutes e
mulheres obesas (OR= 115 IC= 242-554) Aleacutem disso ao realizar-se o teste t
comparando as meacutedias de consumo dos macronutrientes carboidratos proteiacutenas
lipiacutedios e fibras com as variaacuteveis Mollicutes (presenccedila x ausecircncia) natildeo foram
observadas associaccedilotildees estatisticamente significantes
Figura 11 - Quantificaccedilatildeo por qPCR de Mollicutes (UFCmicrol) a partir das amostras de fezes nos grupos caso e controle Satildeo Paulo SP 2013-2014
Legenda ndash Concentraccedilatildeo meacutedia de Mollicutes entre as mulheres do grupo caso (~584 x 103 UFC
microL) e controle (~156 UFC microL) estudadas e positivas para Mollicutes pelo qPCR (p-valor=00023)
Mediana e desvio padratildeo indicadas por linhas soacutelidas no graacutefico Anaacutelise estatiacutestica realizada por
Mann Whitney assumindo p-valor le 005
93
532 Detecccedilatildeo de micro-organismos dos filos Firmicutes e Bacteroidetes aleacutem de bacteacuterias totais (Eubacterias) por PCR em tempo Real (qPCR)
Todas as amostras 40 (100) foram positivas para Firmicutes e Bacteroidetes
na qPCR tanto para o grupo caso como para o controle Natildeo foram observadas
diferenccedilas estatisticamente significantes para as cargas de Firmicutes Bacteroidetes
e Bacteacuterias totais entre as mulheres do grupo caso e controle No entanto as cargas
meacutedias de Firmicutes e Eubacteacuterias no grupo caso foram maiores que no grupo
controle enquanto Bacteroidetes apresentou uma maior carga no grupo controle A
figura 12 representa os graacuteficos de dispersatildeo referentes agraves cargas meacutedias das
amostras de fezes para esses micro-organismos
Figura 12 - Quantificaccedilatildeo por qPCR de Firmicutes Bacteroidetes e Eubacterias (UFCmicrol) a partir das amostras de fezes nos grupos caso e controle Satildeo Paulo SP 2013-2014
Legenda ndash (a) Concentraccedilatildeo de Firmicutes (UFCmicroL) entre as mulheres do grupo caso (~869 x 1018 UFCmicrol) e controle (~504 x 1014 UFCmicrol) (b) Concentraccedilatildeo de Bacteroidetes (UFCmicroL) entre as mulheres do grupo caso (~879 x 108 UFCmicrol) e controle (~146 x 109 UFCmicrol) (c) Concentraccedilatildeo de Eubacterias (UFCmicroL) entre as mulheres do grupo caso (~731 x 1024 UFCmicrol) e controle (~619 x 1021 UFCmicrol) Mediana e amplitude interquartiacutelica indicadas por linhas soacutelidas no graacutefico Anaacutelise estatiacutestica realizada por Mann Whitney assumindo p-valor le 005
94
Com o intuito de verificar o percentual de micro-organismos da classe
Mollicutes frente agrave carga meacutedia de Firmicutes foi realizada a anaacutelise do percentual
meacutedio dos referidos micro-organismos onde verificou-se que Mollicutes representam
424 do nuacutemero meacutedio de Firmicutes detectados na qPCR especiacutefica para o
mesmo nas amostras analisadas no grupo caso e 25 x 10-4 no grupo controle
(Tabela 17)
Tabela 17 ndash Nuacutemero meacutedio de coacutepias e percentual dos grupos Mollicutes estudados frente ao Filo Firmicutes na populaccedilatildeo estudada Satildeo Paulo SP 2013-2014
Nota Meacutedia de coacutepiasgrama de fezes Percentual de coacutepias de Mollicutes em relaccedilatildeo ao Filo Firmicutes
Os resultados da qPCR demonstraram carga meacutedia de Bacteacuterias totais
(Eubacteacuterias) nas amostras de fezes analisadas do grupo caso (~731 x 1024 UFCmicrol)
e controle (~619 x 1021 UFCmicrol) As anaacutelises de percentual entre a carga meacutedia de
Bacteroidetes Firmicutes e Mollicutes e a carga meacutedia de bacteacuterias totais estatildeo
representadas na Tabela 18
Grupo Firmicutes Mollicutes
Meacutedia coacutepias g de fezes
Meacutedia coacutepias g de fezes
Caso 869x1018
584x103
424
Controle 504x1014
16
25x10-4
95
Tabela 18 ndash Nuacutemero meacutedio de coacutepias e percentual dos grupos de bacterianos estudados frente agraves bacteacuterias totais na populaccedilatildeo estudada Satildeo Paulo SP 2013-2014
Nota Meacutedia de coacutepiasgrama de fezes Percentual de coacutepias de cada bacteacuteria em relaccedilatildeo agraves bacteacuterias totais
Foi calculada a proporccedilatildeo de Firmicutes em relaccedilatildeo aos Bacteroidetes na
microbiota intestinal das mulheres estudadas tendo sido observada maior proporccedilatildeo
na microbiota intestinal das mulheres obesas em relaccedilatildeo agraves eutroacuteficas do grupo
controle (Tabela 19) A relaccedilatildeo entre o percentual de Firmicutes e Bacteroidetes na
microbiota intestinal das mulheres do grupo caso foi cerca de 29 x 107 maior entre
as mulheres obesas do grupo caso em comparaccedilatildeo com o grupo controle
Tabela 19 ndash Proporccedilatildeo de Firmicutes em relaccedilatildeo agrave Bacteroidetes na populaccedilatildeo estudada Satildeo Paulo SP 2013-2014
Nota Meacutedia de coacutepiasgrama de fezes
Grupo Bacteacuterias totais
Firmicutes Bacteroidetes Mollicutes
Meacutedia coacutepias g de fezes
Meacutedia coacutepias g de
fezes
Meacutedia coacutepias g de
fezes
Meacutedia coacutepias g de fezes
Caso 731x 1024
869x1018
442x105
879x108
718x10-2
584x103
28x 10-2
Controle 619x 1021
504x1014
171x105
146x109
624x102 16
22x10-11
Grupo Firmicutes Bacteroidetes Proporccedilatildeo FirmicutesBacteroidetes
Meacutedia coacutepias g de fezes
Meacutedia coacutepias g de fezes
Meacutedia coacutepias g de fezes
Caso 869x1018 879x108
134x1013
Controle 504x1014
146x109
45x 105
96
54 Dosagem de citocinas do soro sanguiacuteneo
Ao serem quantificadas as citocinas IL-1β IL-10 IL17-A e TNF-α pela
teacutecnica de ELISA no plasma sanguiacuteneo das mulheres natildeo foi observada diferenccedila
estatisticamente significante entre os grupos caso e controle para nenhuma das
citocinas avaliadas IL-1β (p= 02249) IL-10 (p=1) IL17-A (p=03169) e TNF-α
(p=02235) (Figura 13)
Figura 13 ndash Quantificaccedilatildeo de IL-1β IL-10 IL17-A e TNF-α (pgmL) no plasma sanguiacuteneo por meio do ELISA nos grupos caso e controle da populaccedilatildeo estudada Satildeo Paulo SP 2013-2014
Legenda- (a) Concentraccedilatildeo de IL-1β (pgml) no plasma sanguiacuteneo das mulheres casos e controles (b) Concentraccedilatildeo de IL-10 (pgml) no plasma sanguiacuteneo das mulheres casos e controles (c) Concentraccedilatildeo de TNF-α (pgml) no plasma sanguiacuteneo das mulheres casos e controles (d) Concentraccedilatildeo de IL17-A (pgml) no plasma sanguiacuteneo das mulheres casos e controles Desvio padratildeo e meacutedia indicados por linhas soacutelidas no graacutefico Anaacutelise estatiacutestica por Mann Whitney p lt 005
97
6 DISCUSSAtildeO
A microbiota intestinal eacute um ecossistema complexo que desempenha um
importante papel na gecircnese da obesidade associada com o desenvolvimento das
respostas imunoloacutegicas aleacutem do estado nutricional do hospedeiro Projetos
mundiais de pesquisa estatildeo em desenvolvimento para compreender esta
complexidade microbiana na sauacutede humana (SHETTY et al 2013) O presente
estudo avaliou a participaccedilatildeo dos micro-organismos da Classe Mollicutes e dos Filos
Firmicutes e Bacteroidetes na microbiota intestinal de mulheres obesas e eutroacuteficas
Na diversidade das populaccedilotildees humanas e a ocorrecircncia da obesidade eacute
importante estudar a distribuiccedilatildeo da microbiota intestinal fazendo-se necessaacuterio e
imprescindiacutevel a caracterizaccedilatildeo da populaccedilatildeo estudada em relaccedilatildeo agrave preditores
importantes associados com a obesidade microbiota intestinal e ambiente
(KALLIOMAKI et al 2008 PENDERS et al 2006) No presente estudo observou-
se variaccedilatildeo estatiacutestica em relaccedilatildeo agrave variaacutevel gestaccedilatildeo onde 14 (70) das mulheres
do grupo caso e 2 (10) do controle relataram jaacute terem tido filhos Aagaard et al
(2012) verificaram que o microbioma era semelhante em mulheres gravidas ou natildeo
No entanto as mulheres graacutevidas apresentaram microbioma menos diversificado
Sugeriu-se que entre as mulheres em idade reprodutiva o microbioma permanece
como uma comunidade dinacircmica na vida reprodutiva do adulto e que a estrutura da
comunidade natildeo-graacutevida pode retornar em alguma medida nas uacuteltimas semanas de
gestaccedilatildeo Aleacutem disso alguns autores tecircm sugerido que o acuacutemulo de gordura
corporal na obesidade pode acarretar vaacuterias consequecircncias agrave sauacutede como diabetes
mellitus tipo 2 hipertensatildeo arterial dispneacuteia cacircncer dislipidemia doenccedilas
cardiacuteacas doenccedilas hepatobiliares osteoartrite alteraccedilotildees gastrintestinais e
distuacuterbios psicossociais o que corrobora com os achados em relaccedilatildeo agrave histoacuteria
cliacutenica das mulheres estudadas (FRANCISCHI et al 2000 PEREIRA et al 2003
SILVA 2005)
Para as mulheres em especial a menopausa tem sido associada como
colaboradora para o desenvolvimento de obesidade e acuacutemulo de gordura corporal
(SOWERS et al 2007) No presente estudo encontraram-se diferenccedilas estatiacutesticas
em relaccedilatildeo agrave variaacutevel menopausa onde 9 (45) das mulheres obesas do grupo
caso e 3 (15) das mulheres do grupo controle relataram ter entrado na
98
menopausa Entretanto Sternfeld et al (2004) em estudo de coorte feminina entre
42-52 anos de idade nos EUA natildeo encontraram associaccedilatildeo entre a menopausa e o
aumento de circunferecircncia da cintura bem como aumento do peso dessa forma
sugerindo que somente um fator pode natildeo ser o responsaacutevel pelo desenvolvimento
de obesidade No presente trabalho observou-se que 75 das mulheres do grupo
caso e 50 do grupo controle nasceram de parto normal Tem sido evidenciado na
literatura que o tipo de parto pode interferir na composiccedilatildeo da microbiota pela forma
de colonizaccedilatildeo do receacutem-nascido O parto via cesariana aumentaria o risco de
obesidade em relaccedilatildeo ao parto normal (HUH et al 2012 PEI et al 2014) Nesse
sentido Ajslev et al (2011) em estudo longitudinal prospectivo na infacircncia com
acompanhamento ateacute os sete anos observaram que uma combinaccedilatildeo de
exposiccedilotildees precoces que inclui o tipo de parto o IMC maternal preacute-gestacional e
uso de antibioacuteticos na primeira infacircncia (lt6 meses) influenciaram o risco de excesso
de peso
Existem diversos estudos em relaccedilatildeo aos fatores dieteacuteticos e a gecircnese da
obesidade (DAILEY 2014 ISOMAA et al 2001 MORENO-INDIAS et al 2014
PEREIRA et al 2002 ROMERO ZANESCO 2006 SANTOS et al 2006) No
entanto no presente estudo o valor energeacutetico encontrado em relaccedilatildeo ao grupo
caso ao analisar-se a razatildeo quilocaloriasquilograma de peso corporal foi inferior agrave
recomendaccedilatildeo caracterizando alimentaccedilatildeo insuficiente em energia (WHO 2003)
Da mesma maneira que no presente estudo Pereira et al (2012) natildeo encontraram
diferenccedilas significativas entre o consumo energeacutetico entre indiviacuteduos eutroacuteficos e
obesos Souza et al (2010) estudaram a ingestatildeo alimentar e balanccedilo energeacutetico da
populaccedilatildeo adulta de Niteroacutei- RJ e encontraram que a ingestatildeo energeacutetica mostrou-
se decrescente com o aumento do IMC para as mulheres A ingestatildeo energeacutetica em
menor quantidade parece indicar que embora o corpo esteja obeso os tecidos vitais
satildeo inadequadamente nutridos pois a alimentaccedilatildeo insuficiente fornece poucos
nutrientes (HUTSON et al 1965) Sawaya et al (2003) em estudo com mulheres
realizado em Maceioacute tambeacutem observaram que a ingestatildeo energeacutetica entre os
grupos eutroacutefico e obesos natildeo apresentou diferenccedila significativa Em outro estudo
com mulheres no Rio Grande do Sul tambeacutem foi verificado que o consumo alimentar
energeacutetico natildeo apresentou diferenccedila significativa (p=0157) entre os grupos (baixo
peso eutroacutefico e excesso de pesoobesidade) (FRANKE et al 2007) Com isto
99
provavelmente a ingestatildeo energeacutetica natildeo seja a causa da obesidade nas mulheres
estudadas sendo que a baixa ingestatildeo aliada a algumas deficiecircncias nutricionais e
predisposiccedilatildeo geneacutetica possa criar mecanismos de adaptaccedilatildeo levando a um ciclo
metaboacutelico cujo o desfecho seja o armazenamento de gordura na regiatildeo abdominal
(BALAMURUGAN et al 2010 CANI DELZENNE 2009 DAVID et al 2014
HANSON et al 2009 JIMENEZ MARTIN-MORENO 1995) Nesse contexto
devem ser considerados outros fatores de economia energeacutetica tais como o
desequiliacutebrio na microbiota intestinal aleacutem da adaptaccedilatildeo dos mecanismos de
consumo energeacutetico acarretando maior rendimento das calorias absorvidas
BALAMURUGAN et al 2010 CANI DELZENNE 2009 DAVID et al 2014
DEWULF et al 2013 DIBAISE FRANK MATHUR 2012 FRANKE 2007 GRAF et
al 2015 KOENIGA et al 2011 LE CHATELIER et al 2013 LEY et al 2006
PATIL et al 2012 RAOULT 2008 SAWAYA et al 2003 WICHMANN et al
2013)
Analisando a contribuiccedilatildeo do consumo dos macronutrientes e das fibras os
resultados do presente estudo demonstraram que este consumo estaacute dentro dos
criteacuterios exceto para o consumo de fibras que foi abaixo da recomendaccedilatildeo em
ambos os grupos Aleacutem disso comparando-se as meacutedias de consumo dos
macronutrientes e das fibras com as variaacuteveis desfecho (obesas x eutroacuteficas)
tambeacutem natildeo houve associaccedilotildees estatisticamente significantes Em Satildeo Paulo
observou-se que 295 dos indiviacuteduos entrevistados relataram ingestatildeo inferior agraves
necessidades fisioloacutegicas dos quais 58 eram indiviacuteduos obesos (SALVO
GIMENO 2002) Em outro estudo realizado com trabalhadores adultos de ambos os
sexos tambeacutem no Estado de Satildeo Paulo para avaliaccedilatildeo da ingestatildeo alimentar e
consumo de fibras dieteacuteticas foi encontrado que o consumo individual de fibras
dieteacuteticas diaacuteria variou 587 g a 2957 g sendo o consumo meacutedio da populaccedilatildeo
1461 g (PASSOS SHEID 2008) Fisberg et al (2009) em estudo realizado sobre
iacutendice de qualidade da dieta observaram padratildeo dieteacutetico com alto conteuacutedo de
gorduras totais colesterol e accediluacutecar refinado e com baixo teor de fibra alimentar
Estes resultados diferem em parte do padratildeo alimentar da populaccedilatildeo estudada no
entanto demonstra a necessidade de estiacutemulo ao maior consumo de alimentos ricos
em fibra
100
A partir dos resultados do estudo evidencia-se a adequaccedilatildeo comprometida
na alimentaccedilatildeo devido agrave elevada ingestatildeo de lipiacutedios (gordura saturada) e ingestatildeo
reduzida de fibras em ambos os grupos estudados contribuindo tanto para a
obesidade quanto em relaccedilatildeo ao acuacutemulo de tecido adiposo nas mulheres obesas e
eutroacuteficas Esses dados estatildeo em conformidade com o presente estudo em relaccedilatildeo
agraves variaacuteveis antropomeacutetricas analisadas Percentual de gordura corporal e Razatildeo
cintura-quadril onde ambos os grupos se apresentaram acima da meacutedia referecircncia
indicando excesso de gordura corporal Assim como no presente estudo outros
trabalhos tecircm demonstrado limitaccedilotildees e evidenciado que natildeo existe correlaccedilatildeo
precisa entre o IMC e o porcentual de gordura corpoacuterea Isso explica o fato de
indiviacuteduos que apresentam IMC dentro do padratildeo de normalidade mas possuem
uma quantidade de gordura corporal acima do ideal confirmando relatos de que o
IMC natildeo eacute um bom indicador quantitativo de adiposidade corporal e que pode
subestimar o percentual de gordura e classificando de forma errocircnea indiviacuteduos com
excesso de adiposidade (COSTA et al 2007 GLANER 2005) Dessa forma o
aumento de gordura corporal principalmente na regiatildeo abdominal pode tornar a
utilizaccedilatildeo do IMC cada vez mais limitada na avaliaccedilatildeo do estado nutricional jaacute que
indiviacuteduos com sobrepeso ou ateacute mesmo eutroacuteficos podem apresentar risco de
alteraccedilotildees metaboacutelicas devido a valores elevados de circunferecircncia da cintura
(REZENDE 2010) Aleacutem disso nossos resultados evidenciaram valores elevados
para RCQ o que pode explicar a porcentagem de algumas moleacutestias atuais
associadas agrave obesidade encontradas em ambos os grupos no presente trabalho
(OMS 2002 DAcircMASO BERNARDES 2003 OCHS-BALCOM et al 2006)
Diversos estudos tambeacutem contribuiacuteram na melhor compreensatildeo entre as
influecircncias da nutriccedilatildeo e da composiccedilatildeo corporal na composiccedilatildeo da microbiota
intestinal (BALAMURUGAN et al 2010 DAVID et al 2014 DEWULF et al 2013
GRAF et al 2015 WICHMANN et al 2013) No entanto pouco se conhece sobre a
participaccedilatildeo dos micro-organismos da classe Mollicutes na microbiota
principalmente quando associadas com fatores dieteacuteticos e antropomeacutetricos
Constatou-se no presente estudo diferenccedila estatisticamente significante para micro-
organismos da classe dos Mollicutes (p = 00023) Foi detectada associaccedilatildeo
estatisticamente significante entre a presenccedila de Mollicutes e mulheres obesas
(OR= 115 IC= 242-554) Nesse contexto Turnbaugh et al (2008) avaliaram a
101
microbiota de modelos experimentais de ratos geneticamente idecircnticos de
obesidade induzida pelo consumo de dieta ocidentalizada caracterizada por alto teor
de gordura e accediluacutecar Todos os animais herdaram uma microbiota semelhante e no
estado de obesidade observou-se maior crescimento da bacteacuteria Eubacterium
dolichum (membro da classe Mollicutes) que foram posteriormente reduzidos por
subsequentes manipulaccedilotildees dieteacuteticas para limitar o ganho de peso Ainda neste
estudo observou-se que a abundacircncia da classe dos Mollicutes foi acompanhada
pela supressatildeo de toda a divisatildeo de Bacteroidetes indicando que a classe
Mollicutes teve aptidatildeo aumentada em relaccedilatildeo a Firmicutes e todos os outros
Bacteroidetes identificados na populaccedilatildeo estudada Os autores observaram que os
molicutes evoluiacuteram a capacidade para importar o tipo de hidratos de carbono
encontradas na dieta ocidental administrada nos modelos experimentais estando
essas vantagens principalmente relacionadas com o Sistema fosfotransferase (PTS)
De acordo com Deutscher et al (2006) o PTS desempenha um papel na regulaccedilatildeo
da expressatildeo do gene microbiano atraveacutes da repressatildeo cataboacutelica permitindo que a
ceacutelula passe a utilizar preferencialmente accediluacutecares simples em relaccedilatildeo a outros
hidratos de carbono Anaacutelises de fragmentos do gene 16S rRNA dos dados de
metagenocircmica confirmaram a presenccedila dos molicutes no microbioma cecal quando
associados agrave uma dieta ocidental Em contrapartida Hildebrandt et al (2009) por
meio de metagenocircmica de fezes de camundongos magros inicialmente submetidos
a dieta de raccedilatildeo padratildeo com posterior mudanccedila para dieta rica em gordura natildeo
relataram encontrar molicutes em dieta de alto teor de gordura
No presente estudo ao se comparar as meacutedias de consumo dos
macronutrientes carboidratos proteiacutenas lipiacutedios e fibras com as variaacuteveis Mollicutes
(presenccedila x ausecircncia) natildeo foram observadas associaccedilotildees estatisticamente
significantes No entanto foi observado alto consumo de gorduras saturadas nas
mulheres estudadas com diferenccedila estatisticamente significante entre a quantidade
de molicutes na microbiota intestinal Esses resultados associados com as
evidecircncias encontradas na literatura acerca da participaccedilatildeo desses micro-
organismos na microbiota de pessoas obesas fornecem importantes evidecircncias de
que natildeo apenas o consumo alimentar e o percentual de gordura ingerida possam
influenciar o aumento de molicutes na microbiota intestinal Mas que esse aumento
tambeacutem pode estar associado ao possiacutevel enriquecimento de rotas metaboacutelicas
102
envolvidas na utilizaccedilatildeo de accediluacutecares simples relacionadas ao sistema PTS Aleacutem
disso tem sido evidenciado na literatura que em experimentos com animais germ-
free o consumo de uma dieta obesogecircnica parece natildeo estimular o desenvolvimento
da obesidade e que sucessivas manipulaccedilotildees dieteacuteticas para limitar o ganho de
peso possivelmente promovam subsequentes variaccedilotildees em relaccedilatildeo agrave populaccedilatildeo
microbiana na microbiota intestinal (GOODMAN et al 2011 TURNBAUGH et al
2009 WALKER et al 2011 YI LI 2012) Este achado foi sustentado por um estudo
recente em camundongos que mostrou que a composiccedilatildeo microbiana do intestino
natildeo eacute determinada apenas pela dieta atual mas tambeacutem em parte pela histoacuteria
dieteacutetica Aleacutem disso um estudo em seres humanos concluiu que a mudanccedila no
padratildeo de consumo de fibras pode produzir fortes mudanccedilas na microbiota
intestinal mas que estas dependem da composiccedilatildeo inicial da microbiota intestinal do
indiviacuteduo (AAFKE et al 2015 CARMODY et al 2015)
Estudos recentes tecircm demonstrado que a microbiota intestinal humana pode
estar alterada em indiviacuteduos obesos Nesse contexto tem sido amplamente
discutida a participaccedilatildeo dos filos Firmicutes e Bacteroidetes na microbiota desses
indiviacuteduos Aleacutem disso tem sido evidenciado que o filo Firmicutes representam mais
de 90 das categorias filogeneacuteticas conhecidas dominando a microbiota distal
Nesse sentido a obesidade estaacute associada com as diferenccedilas da microbiota
intestinal em niacutevel filo com menor diversidade geral e maior proporccedilatildeo relativa de
Firmicutes em relaccedilatildeo agrave Bacteroidetes em indiviacuteduos obesos em comparaccedilatildeo com
indiviacuteduos eutroacuteficos (ECKBURG et al 2005 LEY et al 2006 MORAN
SHANAHAN 2014 TURNBAUGH et al 2009) Nesse contexto os resultados do
presente estudo demonstraram que a relaccedilatildeo entre o percentual de Firmicutes e
Bacteroidetes na microbiota intestinal das mulheres do grupo caso foi cerca de 29x
107 maior entre as mulheres obesas em comparaccedilatildeo com o grupo controle
Estudos demonstraram que a relaccedilatildeo entre percentual de Firmicutes e Bacteroidetes
na microbiota intestinal eacute de cerca de 7020 para os natildeo obesos e ateacute 855 para os
obesos O que significa cerca de cinco vezes maior em obesos em comparaccedilatildeo com
natildeo obesos (BALAMURUGAN et al 2010 ECKBURG et al 2005 KOENIGA et al
2011 LE CHATELIER et al 2013 PATIL et al 2012) Os nossos achados estatildeo
em conformidade com alguns resultados da literatura Em estudo realizado por
Ridaura et al (2013) transplantaram-se micro-organismos intestinais de humanos
103
obesos e eutroacuteficos em intestinos de ratos com peso meacutedio Aqueles que receberam
a microbiota de humanos obesos tornaram-se ratos obesos e aqueles que
receberam microbiota de humanos magros permaneceram magros Outro estudo
realizado por Remely et al (2015) que tambeacutem investigaram atraveacutes de qPCR a
microbiota de humanos obesos durante a intervenccedilatildeo dieteacutetica para perda de peso
induzida observaram diminuiccedilatildeo na proporccedilatildeo de FirmicutesBacteroidetes nos
obesos apoacutes a intervenccedilatildeo dieteacutetica
A proporccedilatildeo FirmicutesBacteroidetes tem sido associada como um marcador
de sauacutede para um indiviacuteduo e um desequiliacutebrio nesta proporccedilatildeo estaacute associada com
diferentes doenccedilas (MARIAT et al 2009) A mudanccedila na abundacircncia relativa destes
filos resulta no aumento da capacidade de captaccedilatildeo de energia a partir dos
alimentos aleacutem de induzir a inflamaccedilatildeo de baixo grau A reduccedilatildeo de Bacteroidetes
tem sido relacionada com dieta rica em gordura que pode resultar em aumento dos
niacuteveis plasmaacuteticos de LPS (CANI et al 2007 EVERARD CANI 2013) enquanto o
aumento Firmicutes tem sido associado com o consumo de carnes (EVERARD
CANI 2013) Aleacutem disso vaacuterios estudos tecircm mostrado mudanccedila da relaccedilatildeo de
FirmicutesBacteroidetes em pessoas obesas durante intervenccedilotildees dieteacuteticas para
perda de peso corporal sugerindo que as mudanccedilas na concentraccedilatildeo de bacteacuterias
nos indiviacuteduos obesos podem ser revertidas depois da perda de peso induzida por
dieta fazendo com que a microbiota do indiviacuteduo obeso se assemelhe ao indiviacuteduo
eutroacutefico (CLEMENTE et al 2012 DEWULF et al 2013 DIBAISE et al 2012
REMELY et al 2013 2015) Em contrapartida estes resultados natildeo satildeo universais
outros estudos demonstraram padrotildees variaacuteveis em mudanccedilas de niacutevel de filo
medidos na composiccedilatildeo da microbiota de indiviacuteduos obesos (MORAN SHANAHAN
2014 SCHWIERTZ et al 2010 ZHANG et al 2009) Duncan et al (2008) avaliaram
a relaccedilatildeo entre IMC perda de peso e a predominacircncia de grupos de bacteacuterias em
amostras fecais de pessoas obesas e natildeo obesas Estes indiviacuteduos foram
submetidos a duas dietas para perda de peso por quatro semanas Natildeo foi
encontrada diferenccedila entre Bacteroidetes nas amostras entre indiviacuteduos obesos e
natildeo obesos No entanto houve reduccedilotildees no grupo de Firmicutes em obesos
submetidos a dietas hipocaloacutericas Em outro estudo realizado por Schwiertz et al
(2010) tambeacutem natildeo foram observadas diferenccedilas nas contagens de Bacteroidetes e
Firmicutes entre os grupos de estudo Xiao et al (2014) em estudo com intervenccedilatildeo
104
dieteacutetica baseada em gratildeos integrais onde analisaram a microbiota intestinal de 123
voluntaacuterios obesos antes e depois da intervenccedilatildeo de 9 semanas seguida por um
periacuteodo de manutenccedilatildeo de 14 semanas tambeacutem natildeo observaram alteraccedilotildees
significativas na abundacircncia de Bacteroidetes e Firmicutes ou na proporccedilatildeo destes
dois filos durante a intervenccedilatildeo dieteacutetica mesmo quando os voluntaacuterios perderam
uma quantidade significativa de peso Estudos recentes do Projeto Microbioma
Humano natildeo encontraram associaccedilatildeo entre a proporccedilatildeo FirmicutesBacteroidetes e
obesidade ou Iacutendice de Massa Corporal (IMC) Nesse sentido tem sido sugerido por
alguns autores que a utilizaccedilatildeo dessa relaccedilatildeo como um biomarcador para a
obesidade permanece incerto devido a variabilidade dos dados na literatura
(FINUCANE et al 2014 MURPHY et al 2010)
Recentemente tem sido proposta uma nova hipoacutetese que associa a
microbiota intestinal com a homeostase metaboacutelica demonstrando-a como uma das
fontes potenciais de inflamaccedilatildeo de baixo grau (ARAKI et al 2005 OKAYASU et al
1990 RAKOFF-NAHOUM 2004 XIAO et al 2014 ZHAO 2013) Nesse contexto
tem sido demonstrado que dietas com alto teor de gordura tambeacutem podem aumentar
as concentraccedilotildees de LPS no plasma de humanos Estudo realizado por Cani et al
(2007) mostrou em camundongos que o maior consumo de gordura levou ao maior
aumento nas concentraccedilotildees de LPS no plasma A absorccedilatildeo de LPS reforccedilada pela
alta ingestatildeo de gordura pode estimular a secreccedilatildeo das citocinas TNF-α e IL-6
resultando em inflamaccedilatildeo sistecircmica de baixo grau dessa forma a microbiota
intestinal pode ter papel ativo na promoccedilatildeo eou inibiccedilatildeo da inflamaccedilatildeo e portanto
um efeito no metabolismo lipiacutedico (FLOCK GREEN KRIS-ETHERTON 2011) Os
resultados do presente estudo natildeo demonstraram diferenccedilas estatisticamente
significantes entre os grupos caso e controle para nenhuma das citocinas avaliadas
No entanto estudos in vitro mostraram que o consumo de aacutecidos graxos saturados
tambeacutem observado no presente estudo em ambos os grupos promovem processo
inflamatoacuterio com aumento da expressatildeo de IL-6 e TNF-α de TLR- 4 e consequente
aumento da ativaccedilatildeo da via NF-kβ (AJUWON SPURLOCK 2005 CALDER et al
2011 WEATHERILL et al 2005) Em estudos experimentais a dieta hiperlipiacutedica
rica em gordura saturada demonstrou promover obesidade com consequente
aumento de peso corporal adiposidade e marcadores inflamatoacuterios (FERNANDEZ-
REAL et al 2003 PEREIRA et al 2012) Esses achados podem explicar o fato de
105
que no presente estudo natildeo foram observadas diferenccedilas estatisticamente
significantes em relaccedilatildeo a liberaccedilatildeo de TNF-α e IL1-β entre os grupos estudados
Em relaccedilatildeo agrave liberaccedilatildeo da citocina IL-17 tambeacutem natildeo foram observadas diferenccedilas
estatisticamente significantes no entanto os achados da literatura teumlm sugerido
que no contexto de disbiose a presenccedila de agentes patogecircnicos pode perturbar a
regulaccedilatildeo do ambiente anti-inflamatoacuterio e que quando patoacutegenos enteacutericos superam
as bacteacuterias comensais o desequiliacutebrio entre comensais e bacteacuterias patogecircnicas
provocam liberaccedilatildeo significativa de MAMPs Este aumento pode induzir IECs DCs e
macroacutefagos ativados a secretar citocinas inflamatoacuterias como a IL-1β IL-6 IL-12 e
IL-23 Estas citocinas estimulam o desenvolvimento de ceacutelulas CD4+ T auxiliares
(T helper-TH1) e ceacutelulas TH17 (produzem IL-17A IL-17F e IL-22) resultando na
inflamaccedilatildeo crocircnica (MAYNARD et al 2012)
O estudo da influecircncia de diferentes elementos da dieta e composiccedilatildeo
corporal sobre a variaccedilatildeo da composiccedilatildeo da microbiota tornou-se uma aacuterea de
crescente interesse cientiacutefico Com efeito a relaccedilatildeo entre a microbiota intestinal e a
obesidade estaacute bastante reconhecida No entanto a participaccedilatildeo dos micro-
organismos da classe dos Mollicutes e alguns mecanismos subjacentes a essas
interaccedilotildees permanecem pouco estudados Em relaccedilatildeo agraves limitaccedilotildees do estudo
deve-se considerar o desenho transversal natildeo sendo possiacutevel estabelecer relaccedilatildeo
de causa e efeito No entanto o estudo mostra-se relevante destacando como
ponto forte o cuidado metodoloacutegico e a relevacircncia dos resultados encontrados
contribuindo para o avanccedilo dos estudos da relaccedilatildeo entre os molicutes microbiota
intestinal e obesidade Nesse contexto a importacircncia e validade de estudos como
este eacute apontar os possiacuteveis fatores de risco que contribuam para obesidade sendo
que a cuidadosa interpretaccedilatildeo dos resultados eacute importante para a geraccedilatildeo de
hipoacuteteses
Nesse contexto uma pesquisa acerca da relaccedilatildeo causa-efeito entre a
microbiota intestinal e a obesidade eacute altamente justificaacutevel uma vez que diferentes
espeacutecies de bacteacuterias podem desempenhar um papel significativo na safra de
energia humana e regulaccedilatildeo do peso corporal Aleacutem disso a consideraccedilatildeo de
fatores de estilo de vida em estudos da microbiota intestinal eacute altamente
recomendada uma vez que mudanccedilas no padratildeo alimentar e atividade fiacutesica podem
influenciar a composiccedilatildeo da microbiota intestinal para o desenvolvimento da
106
obesidade A partir disso o presente estudo fornece evidecircncias de que alteraccedilotildees e
interaccedilotildees na microbiota intestinal possam definir subconjuntos de indiviacuteduos com
diferentes perfis de risco metaboacutelico e assim contribuir para a investigaccedilatildeo da
heterogeneidade associada a fenoacutetipos relacionados com a adiposidade
especialmente em sociedades que estatildeo passando por transformaccedilotildees
socioeconocircmicas tecnoloacutegicas e culturais para um estilo de vida moderno
107
7 CONCLUSOtildeES
Os grupos caso e controle balancearam suas dietas conforme o intervalo de
distribuiccedilatildeo energeacutetica recomendado no entanto foi observado um consumo
de fibras inferior e de gorduras saturadas superior ao recomendado em
ambos os grupos
As mulheres de ambos os grupos apresentaram excesso de gordura corporal
Foi desenvolvido um ensaio de PCR em tempo real especiacutefico sensiacutevel
reprodutiacutevel e quantitativo para a detecccedilatildeo de Mollicutes nas fezes humanas
Foram encontradas associaccedilotildees estatisticamente significantes entre a
presenccedila de Mollicutes e mulheres obesas
Natildeo foram observadas associaccedilotildees estatisticamente significantes em relaccedilatildeo
as meacutedias de consumo dos macronutrientes carboidratos proteiacutenas lipiacutedios e
fibras com a presenccedila de Mollicutes
Natildeo foram observadas diferenccedilas estatisticamente significantes para as
cargas de Firmicutes Bacteroidetes e Bacteacuterias totais entre as mulheres do
grupo caso e controle
A proporccedilatildeo de Firmicutes em relaccedilatildeo aos Bacteroidetes foi maior na
microbiota intestinal das mulheres obesas em relaccedilatildeo agraves eutroacuteficas
Natildeo foi observada diferenccedila estatisticamente significante entre os grupos
caso e controle para nenhuma das citocinas avaliadas
108
De acordo com ASSOCIACcedilAcircO BRASILEIRA DE NORMAS TEacuteCNICAS NBR 6023 informaccedilatildeo e documentaccedilatildeo referecircncias elaboraccedilatildeo Rio de Janeiro 2002
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ZAIBI M S STOCKER C J ODOWD J DAVIES A BELLAHCENE M CAWTHORNE M A BROWN A J SMITH D M ARCH J R Roles of GPR41 and GPR43 in leptin secretory responses of murine adipocytes to short chain fatty acids FEBS v584 p2381ndash2386 2010
ZHANG H DIBIASE J K ZUCCOLO A KUDRNA D BRAIDOTTI M YU Y PARAMESWARAN P CROWELL M D WING R RITTMANN B E KRAJMALNIK-BROWNA R Human gut microbiota in obesity and after gastric bypass Proc Natl Acad Sci U S A v106 n7 p 2365ndash2370 2009
ZOETENDAL E G VAUGHAN E E DE VOS W M A microbial world within us Mol Microbiol v59 n6 p1636-1650 2006
127
APEcircNDICE A ndash TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
128
Universidade de Satildeo Paulo
Instituto de Ciecircncias Biomeacutedicas
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
ESTUDO Avaliaccedilatildeo da participaccedilatildeo dos microrganismos da Classe Mollicutes na microbiota intestinal de mulheres eutroacuteficas e obesas
Vocecirc estaacute sendo convidado (a) a participar do projeto de pesquisa acima citado O documento
abaixo conteacutem todas as informaccedilotildees necessaacuterias sobre a pesquisa que estamos fazendo Sua
colaboraccedilatildeo neste estudo seraacute de muita importacircncia para noacutes mas se desistir a qualquer momento
isso natildeo causaraacute nenhum prejuiacutezo a vocecirc
Eu _________________________________________________________________ profissatildeo ____________________________
residente e domiciliado na
_______________________________________________________________________________________________________________
______________________________________________________________ portador da Ceacutedula de identidade RG
___________________________ e inscrito no CPFMF______________________________ nascido(a) em _____
_____ _______ abaixo assinado(a) concordo de livre e espontacircnea vontade em participar como
voluntaacuterio(a) do estudo ldquoAvaliaccedilatildeo da participaccedilatildeo dos microrganismos da Classe Mollicutes
na microbiota intestinal de mulheres eutroacuteficas e obesasrdquo Declaro que obtive todas as
informaccedilotildees necessaacuterias bem como todos os eventuais esclarecimentos quanto agraves duacutevidas por
mim apresentadas
Estou ciente que
I) O estudo se faz necessaacuterio para que se possam descobrir as possiacuteveis causas da doenccedila
denominada vaginoses bacterianas a ser estudada no projeto ldquoAvaliaccedilatildeo da
participaccedilatildeo dos microrganismos da Classe Mollicutes na microbiota intestinal de
mulheres eutroacuteficas e obesasrdquo
II) Seratildeo feitas uma coleta de 5ml de sangue e fezes em periacuteodo uacutenico
III) A participaccedilatildeo neste projeto natildeo tem objetivo de me submeter a um tratamento bem
como natildeo me acarretaraacute qualquer despesa financeira com relaccedilatildeo aos procedimentos
meacutedico-cliacutenico-terapecircuticos efetuados no estudo
129
IV) Tenho a liberdade de desistir ou de interromper a colaboraccedilatildeo neste estudo no momento
em que desejar sem necessidade de qualquer explicaccedilatildeo
V) A desistecircncia natildeo causaraacute nenhum prejuiacutezo agrave minha sauacutede ou bem estar fiacutesico Natildeo viraacute
interferir no atendimento ou tratamento meacutedico
VI) Os resultados obtidos durante este ensaio seratildeo mantidos em sigilo mas concordo que
sejam divulgados em publicaccedilotildees cientiacuteficas desde que meus dados pessoais natildeo sejam
mencionados
VII) Caso eu desejar poderei pessoalmente tomar conhecimento dos resultados ao final
desta pesquisa
( ) Desejo conhecer os resultados desta pesquisa
( ) Natildeo desejo conhecer os resultados desta pesquisa
VIII) Concordo que o material possa ser utilizado em outros projetos desde que autorizado
pela Comissatildeo de Eacutetica deste Instituto e pelo responsaacutevel por esta pesquisa Caso minha
manifestaccedilatildeo seja positiva poderei retirar essa autorizaccedilatildeo a qualquer momento sem
qualquer prejuiacutezo para mim
( ) Sim ou ( ) Natildeo
IX ) Poderei contatar a Secretaria da Comissatildeo de Eacutetica em Pesquisa com Seres Humanos ndash
ICBUSP - no Fone 30917733 (e-mail cepicbuspbr) ou (11 3091-7297 jotiuspbr)
para recursos ou reclamaccedilotildees em relaccedilatildeo ao presente estudo
X) O sujeito de pesquisa ou seu representante quando for o caso deveraacute rubricar todas as
folhas do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido ndash TCLE - apondo sua assinatura na uacuteltima
paacutegina do referido Termo
XI) O pesquisador responsaacutevel deveraacute da mesma forma rubricar todas as folhas do Termo de
Consentimento Livre e Esclarecido ndash TCLEndash apondo sua assinatura na uacuteltima paacutegina do
referido Termo
XII) Resoluccedilatildeo 19696 - Estou recebendo uma coacutepia deste Termo de Consentimento Livre e
Esclarecido
Satildeo Paulo___________de________________de 20_____ ( ) Paciente ( ) Responsaacutevel
Testemunha 1 _______________________________________________
Nome RG Telefone
130
Testemunha 2 ___________________________________________________
Nome RG Telefone
Responsaacutevel pelo Projeto _____________________________________________________
PROF DR JORGE TIMENETSKY
131
APEcircNDICE B ndash QUESTIONAacuteRIO
132
UNIVERSIDADE DE SAtildeO PAULO
INSTITUTO DE CIEcircNCIAS BIOMEacuteDICAS
MESTRADO EM MICROBIOLOGIA
Seccedilatildeo 1 IDENTIFICACcedilAtildeO E DADOS PESSOAIS
Nome Idade ID
Telefone Data
Profissatildeo
Estado civil 1 Casada 2 Solteira 3 Mora com companheiro 4 Viuacuteva 5 Divorciada
Raccedilacor 1 Branca 2 Preta 3 Amarela 4 Parda 5 Indiacutegena
Escolaridade 1 Analfabeto 2 1ordm grau incompleto 3 1ordm grau Completo
4 2ordm grau incompleto 5 2ordm grau completo 6 Superior incompleto 7 superior completo
Condiccedilatildeo Socioeconocircmica Indicar aproximadamente a renda domiciliarfamiliar mensal (soma de todos os ganhos
das pessoas que dividem as despesas) (valor SM R$ 67800)
ateacute 1 salaacuterio miacutenimo (ateacute R$ 61800)
1 a 2 salaacuterios miacutenimos (mais de R$ 61800 a R$ 123600)
2 a 5 salaacuterios miacutenimos (mais de R$ 123600 a R$ 309000)
5 a 10 salaacuterios miacutenimos (mais de R$ 309000 a R$ 618000)
mais de 10 salaacuterios miacutenimos (mais de R$ 618000)
Seccedilatildeo 2 HISTOacuteRIA FAMILIAR (parentes de 1ordm grau paternos e maternos e irmatildeos)
1 HAS 2 Diabetes 3 Obesidade 4 Hipercolesterolemia 5 DCV
Seccedilatildeo 3 HISTOacuteRIA CLIacuteNICA
133
Alteraccedilotildees gastrointestinais 1 Constipaccedilatildeo Flatulecircncia 3 Refluxo 4 Azia
5 Ulcera 6 Gastrite 7 Naacuteuseas 8 Vocircmitos
Como o intestino se comporta habitualmente 1 Normal 2 Constipaccedilatildeo 3 Diarreacuteia
Moleacutestia atual 1 HAS 2 Diabetes 3 Obesidade 4 Hipercolesterolemia
5 DCV 6 Dispneacuteia 7 Alteraccedilatildeo Menstrual
Uso de laxantes 1 Sim 2 Natildeo
Seccedilatildeo 4 HISTOacuteRIA OBSTEacuteTRICA
Tipo de parto 1 Normal 2 Cesaacuterea
Foi amamentada 1 Natildeo 2 1 a 3 meses 3 4 a 6 meses 4 7 a 9 meses
5 10 a 12 meses 6 gt12 meses
Teve alguma gestaccedilatildeo 1 Sim 2 Natildeo
Quantos filhos 1 1 a 2 2 3 a 4 3 ge5
Quantos partos foram normais 1 1 a 2 2 3 a 4 3 ge5
Quantos partos foram cesaacuterea 1 1 a 2 2 3 a 4 3 ge5
Tempo de amamentaccedilatildeo dos filhos 1 Natildeo 2 1 a 3 meses 3 4 a 6 meses 4 7 a 9 meses
5 10 a 12 meses 6 gt12 meses
Seccedilatildeo 5 HISTOacuteRIA GINECOLOacuteGICA
Usou ou estaacute usando algum anticoncepcional (adesivo piacutelula anel vaginal DIU de hormocircnio injetaacutevel ou
bastatildeo subcutacircneo) 1 Sim 2 Natildeo
Com que idade comeccedilou a tomar
Parou de usar por algum tempo
Por quanto tempo parou
Seccedilatildeo 6 CONSUMO DE TABACO
134
Jaacute fumou mais de 20 maccedilos de cigarro (cachimbo ou charuto) em toda sua vida
1 Natildeo 2 Sim e fumo atualmente 3 Sim mas parei de fumar 4 Natildeo sabe natildeo informa
Se fumafumou o faz haacute quanto tempo
Quantos cigarros em meacutedia fumafumava por dia
____cigarros
____cachimbos
____charutos
Se parou de fumar haacute quanto tempo ocorreu
Seccedilatildeo 7 CONSUMO DE AacuteLCOOL
Etilista 1 Sim 2 Natildeo
Frequencia de ingestatildeo
Tipo de bebida ingerida
Haacute quanto tempo ingere
Seccedilatildeo 8 ATIVIDADE FIacuteSICA (IPAQ versatildeo curta)
As perguntas estatildeo relacionadas ao tempo que vocecirc gasta fazendo atividade fiacutesica na UacuteLTIMA
semana As perguntas incluem as atividades que vocecirc faz no trabalho para ir de um lugar a outro
por lazer por esporte por exerciacutecio ou como parte das suas atividades em casa ou no jardim
Para responder as questotildees lembre que
atividades fiacutesicas VIGOROSAS satildeo aquelas que precisam de um grande esforccedilo fiacutesico e que fazem respirar MUITO mais forte que o normal
atividades fiacutesicas MODERADAS satildeo aquelas que precisam de algum esforccedilo fiacutesico e que fazem respirar UM POUCO mais forte que o normal
Para responder as perguntas pense somente nas atividades que vocecirc realiza por pelo menos 10
minutos contiacutenuos de cada vez
135
1a Em quantos dias da uacuteltima semana vocecirc caminhou por pelo menos 10 minutos contiacutenuos em casa
ou no trabalho como forma de transporte para ir de um lugar para outro por lazer por prazer ou
como forma de exerciacutecio dias _____ por SEMANA ( ) Nenhum
1b Nos dias em que vocecirc caminhou por pelo menos 10 minutos contiacutenuos quanto tempo no total
vocecirc gastou caminhando por dia horas ______ Minutos _____
2a Em quantos dias da uacuteltima semana vocecirc realizou atividades MODERADAS por pelo menos 10
minutos contiacutenuos como por exemplo pedalar leve na bicicleta nadar danccedilar fazer ginaacutestica
aeroacutebica leve jogar volei recreativo carregar pesos leves fazer serviccedilos domeacutesticos na casa no
quintal ou no jardim como varrer aspirar cuidar do jardim ou qualquer atividade que fez aumentar
moderadamente sua respiraccedilatildeo ou batimentos do coraccedilatildeo (POR FAVOR NAtildeO INCLUA CAMINHADA)
dias _____ por SEMANA ( ) Nenhum
2b Nos dias em que vocecirc fez essas atividades moderadas por pelo menos 10 minutos contiacutenuos
quanto tempo no total vocecirc gastou fazendo essas atividades por dia
horas ______ Minutos _____
3a Em quantos dias da uacuteltima semana vocecirc realizou atividades VIGOROSAS por pelo menos 10
minutos contiacutenuos como por exemplo correr fazer ginaacutestica aeroacutebica jogar futebol pedalar raacutepido
na bicicleta jogar basquete fazer serviccedilos domeacutesticos pesados em casa no quintal ou cavoucar no
jardim carregar pesos elevados ou qualquer atividade que fez aumentar MUITO sua respiraccedilatildeo ou
batimentos do coraccedilatildeo dias _____ por SEMANA ( ) Nenhum
3b Nos dias em que vocecirc fez essas atividades vigorosas por pelo menos 10 minutos contiacutenuos quanto
tempo no total vocecirc gastou fazendo essas atividades por dia
horas ______ Minutos _____
Seccedilatildeo 9 HAacuteBITOS ALIMENTARES
Vocecirc mudou seus haacutebitos alimentares recentemente ou estaacute fazendo dieta para emagrecer ou por qualquer
outro motivo
1 Natildeo 5 Sim para reduccedilatildeo de sal
2 Sim para perda de peso 6 Sim para reduccedilatildeo de colesterol
3 Sim por orientaccedilatildeo meacutedica
136
4 Sim para dieta vegetariana ou reduccedilatildeo do consumo de carne
Vocecirc estaacute tomando algo para suplementar sua dieta (vitaminas minerais e outros produtos)
1 Natildeo 2 Sim regularmente 3 Sim mas natildeo regularmente
Se a resposta da pergunta anterior for sim favor preencher o quadro abaixo
Suplemento
Nome comercial Dose
Frequencia
Nuacutemero de refeiccedilotildees que costuma fazer por dia
Costuma fazer desjejum diariamente 1 Sim 2 Natildeo
Costuma beliscar entre as refeiccedilotildees 1 Sim 2 Natildeo
Costuma ingerir liacutequidos durante as refeiccedilotildees 1 Sim 2 Natildeo
Quantas refeiccedilotildees costuma fazer fora de casa por semana
Em que local costuma fazer as refeiccedilotildees fora de casa
1 Restaurantes 5 Natildeo faz
2 Lanches raacutepidos 6 Outro
3 Marmita
4 No trabalho
137
As questotildees seguintes relacionam-se ao seu haacutebito alimentar usual no PERIacuteODO DE UM ANO Para cada quadro responda por favor a frequecircncia que melhor descreva QUANTAS VEZES vocecirc costuma comer cada item e a respectiva UNIDADE DE TEMPO (se por dia por semana por mecircs ou no ano) Depois responda qual a sua PORCcedilAtildeO INDIVIDUAL USUAL em relaccedilatildeo agrave porccedilatildeo meacutedia indicada ESCOLHA SOMENTE UM CIacuteRCULO PARA CADA COLUNA Muitos grupos de alimentos incluem exemplos Eles satildeo sugestotildees e vocecirc pode pode consumir todos os itens indicados Se vocecirc natildeo come ou raramente come um determinado iacutetem preeencha o ciacuterculo da primeira coluna (N=nunca come) NAtildeO DEIXE ITENS EM BRANCO
138
139
140
141
Por favor liste qualquer outro alimento ou preparaccedilatildeo importante que vocecirc costuma comer ou beber pelo menos UMA VEZ POR SEMANA que natildeo foram citados aqui (por exemplo leite-de-coco outros tipos de carnes receitas caseiras creme de leite leite condensado gelatina e outros doces etc )
Alimento Frequecircncia por semana Quantidade Consumida
Quando vocecirc come carne bovina ou suiacutena vocecirc costuma comer a gordura visiacutevel 1 nunca ou raramente 2 algumas vezes 3 sempre 4 natildeo sabe Quando vocecirc come frango ou peru vocecirc costuma comer a pele 1 nunca ou raramente 2 algumas vezes 3 sempre 4 natildeo sabe
142
Seccedilatildeo 10 DADOS ANTROPOMEacuteTRICOS
Peso
_____________Kg
_____________Kg
Estatura
_____________m
_____________m
IMC
__________Calcular IMC= peso em Kg altura em m2
Circunferecircncia Abdominal
_____________cm
_____________cm
Reactacircncia
Resistecircncia ___________MG
_____________MLG
Peso MG_________kg
Peso MGL_________kg
TMB __________
aacutegua de massa magra
143
APEcircNDICE C- TABELA 10
144
Tabela 10 Participaccedilatildeo dos alimentos nos grupos meacutedias de consumo por dia dos alimentos consumidos pela populaccedilatildeo estudada Satildeo Paulo SP 2013-2014
Grupo Alimentar
Alimentos Grupo Frequecircncia diaacuteria (dp)
Frequecircncia diaacuteria (amplitude)
Massas
Macarratildeo com molho sem carne
Caso
02 (05)
(0-25)
Controle
02 (02) (0-043)
Macarratildeo com molho com carne lasanha nhoque
Caso 01 (012) (0-043)
Controle
02 (02) (0-079)
Pizza panqueca
Caso 015 (022) (0-1)
Controle 02 (01) (003-043)
Preparaccedilatildeo
Sopas
Caso 015 (018) (0-043)
Controle 014 (02) (0-043)
Polenta cozida ou frita
Caso 003 (005) (0-014)
Controle 0008 (003) (0-014)
Carne vermelha e
ovos
Carne bovina
Caso 06 (06) (008-25)
Controle 05 (018) (014-079)
Carne de porco Caso 008 (009) (0-043)
Controle 02 (05) (0-25)
Carne seca carne do sol bacon
Caso 006 (005) (0-014)
Controle 004 (006) (0-014)
Ovos Caso 02 (02) (0-1)
Controle 03 (05) (0-25)
Embutidos
Linguiccedila
Caso 011 (009) (0-043)
Controle 02 (05) (0-25)
Embutidos (presunto mortadela salsicha)
Caso 015 (023) (0-1)
Controle 02 (02) (0-043)
Carne branca
Frango Caso 06 (09) (003-3)
Controle 05 (05) (014-25)
Peixe e frutos do mar Caso 01 (01) (0-043)
Controle 01 (02) (0-043)
Leite e derivados
Leite integral Caso 07 (09) (0-3)
Controle 04 (06) (0-25)
Leite desnatado Caso 04 (09) (0-3)
Controle 002 (005) (0-014)
Leite semi-desnatado Caso 03 (08) (0-25)
Controle 0004 (002) (0-008)
Iogurte natural Caso 05 (09) (0-25)
Controle 03 (03) (0-079)
Iogurte com frutas Caso 03 (08) (0-25)
Controle 02 (02) (0-079)
145
Tabela 10 Participaccedilatildeo dos alimentos nos grupos meacutedias de consumo ao dia dos alimentos consumidos pela populaccedilatildeo estudada Satildeo Paulo SP 2013-2014
(Continuaccedilatildeo)
Grupo Alimentar
Alimentos Grupo Frequecircncia diaacuteria (dp)
Frequecircncia diaacuteria
(amplitude)
Leite e derivados
Queijo mussarela prato parmesatildeo e provolone
Caso 05 (07) (0-25)
Controle 05 (06) (003-25)
Queijo minas e ricota Caso 04 (08) (0-25)
Controle 04 (06) (0-25)
Leguminosas
Feijatildeo Caso 12 (09) (014-25)
Controle 06 (05) (008-25)
Lentilha ervilha seca gratildeo de bico soja
Caso 005 (009) (0-043)
Controle 006 (01) (0-043)
Feijatildeo tropeiro e feijoada
Caso 003 (003) (0-014)
Controle 002 (004) (0-014)
Cereais raiacutezes e
tubeacuterculos
Arroz branco ou integral cozido com
oacuteleo e temperos
Caso 15 (09) (043-25)
Controle 14 (07) (043-25)
Batata frita ou mandioca frita
Caso 007 (01) (0-043)
Controle 02 (01) (003-043)
Batata mandioca inhame (cozida ou assada) purecirc
Caso 01 (012) (0-043)
Controle 02 (02) (0-043)
Farinha de mandioca farofa cuscuz aveia tapioca
Caso 02 (03) (0-1)
Controle 01 (02) (0-1)
Patildeo francecircs patildeo de forma integral patildeo doce torrada
Caso 07 (06) (014-3)
Controle 17 (08) (0-25)
Biscoito sem recheio (doce salgado) Caso 04 (06) (0-25)
Controle 05 (06) (0-25)
Biscoito recheado waffer amanteigado
Caso 01 (03) (0-1)
Controle 009 (02) (0-043)
Bolo (simples recheado) Caso 01 (013) (0-043)
Controle 01 (013) (0-043)
Hortaliccedilas
Alface
Caso 12 (09) (008-3)
Controle 08 (06) (014-25)
Tomate Caso 14 (107) (008-3)
Controle 08 (06) (003-25)
Cenoura Caso 06 (07) (008-25)
Controle 04 (02) (0-1)
Outros legumes (abobrinha berinjela chuchu pepino)
Caso 04 (03) (008-1)
Controle 05 (07) (0-25)
Outras verduras cruas (acelga ruacutecula agriatildeo)
Caso 04 (03) (008-1)
Controle 04 (02) (0-1)
146
Tabela 10 Participaccedilatildeo dos alimentos nos grupos meacutedias de consumo ao dia dos alimentos consumidos pela populaccedilatildeo estudada Satildeo Paulo SP 2013-2014
(Continuaccedilatildeo)
Grupo Alimentar Alimentos Grupo Frequecircncia diaacuteria (dp)
Frequecircncia diaacuteria
(amplitude)
Hortaliccedilas
Outras verduras cozidas (acelga espinafre escarola couve)
Caso 03 (02) (0-1)
Controle 03 (02) (0-079)
Broacutecolis couve-flor repolho Caso 02 (015) (0-043)
Controle 03 (03) (0-1)
Frutas
Laranja mexerica abacaxi Caso 08 (09) (0-3)
Controle 04 (05) (003-25)
Banana Caso 08 (09) (0-3)
Controle 04 (02) (008-1)
Maccedilatilde pecircra Caso 05 (07) (0-3)
Controle 03 (03) (0-1)
Melatildeo melancia Caso 03 (07) (0-1)
Controle 01 (01) (0-043)
Mamatildeo Caso 03 (03) (0-1)
Controle 008 (006) (0-014)
Goiaba Caso 01 (02) (0-1)
Controle 0008 (002) (0-008)
Abacate Caso 08 (02) (0-1)
Controle 007 (001) (0-003)
Suco natural Caso 07 (09) (0-3)
Controle 03 (02) (0-1)
Industrializados
Maionese molho para salada patecirc chantily
Caso 01 (016) (0-043)
Controle 01 (02) (0-1)
Condimentos
Caso 04 (06) (0-25)
Controle 02 (03) (0-079)
Hamburguer nuggets almocircndega Caso 006 (009) (0-043)
Controle 005 (009) (0-043)
Suco industrializado Caso 08 (105) (0-3)
Controle 05 (03) (0-1)
Refrigerante comum Caso 02 (02) (0-079)
Controle 02 (02) (0-043)
Refrigerante light diet Caso 0 0
Controle 007 (02) (0-043)
147
Tabela 10 Participaccedilatildeo dos alimentos nos grupos meacutedias de consumo ao dia dos alimentos consumidos pela populaccedilatildeo estudada Satildeo Paulo SP 2013-2014
(Continuaccedilatildeo)
Grupo Alimentar Alimentos Grupo Frequecircncia diaacuteria (dp)
Frequecircncia diaacuteria
(amplitude)
Infusatildeo
Chaacute e cafeacute sem accediluacutecar Caso 09 (1) (0-25)
Controle 06 (07) (0-25)
Chaacute e cafeacute com accediluacutecar Caso 08 (08) (0-25)
Controle 07 (08) (0-3)
Bebida alcooacutelica
Cerveja
Caso 003 (005) (0-014)
Controle 0074 (01) (0-043)
Oacuteleos e gorduras
Oacuteleo azeite ou vinagre para tempero de salada
Caso 1 (09) (0-25)
Controle 03 (03) (0-1)
Manteiga ou margarina comum Caso 09 (09) (0-25)
Controle 07 (07) (0-25)
Manteiga ou margarina light Caso 02 (06) (0-25)
Controle 007 (003) (0-014)
Lanches
Salgado frito Caso 02 (03) (0-1)
Controle 01 (01) (0-043)
Salgado assado Caso 014 (02) (0-1)
Controle 02 (02) (0-043)
Sanduiche Caso 006 (009) (0-043)
Controle 005 (004) (0-014)
Accediluacutecar e doces
Chocolate bombom brigadeiro Caso 04 (04) (0-1)
Controle 06 (04) (003-2)
Achocolatado em poacute (adicionado ao leite)
Caso 013 (03) (0-1)
Controle 02 (03) (0-1)
Sobremesas doces tortas e pudins
Caso 02 (03) (0-1)
Controle 03 (03) (003-1)
Accediluacutecar mel e geleacuteia Caso 05 (07) (0-3)
Controle 08 (1) (0-3)