Biomarcadores: Pronóstico / Diagnóstico Fisiológico en Carya illinoensis
Dr. Luis Alberto Lightbourn Rojas, PhDBIOTEKSA-LIGHTBOURN
RESEARCHCorreo electrónico: [email protected]
Biomarcadores y Fisiología de la Membrana Celular
Respuesta de las Plantas a Estímulos ExternosDado que las plantas son sésiles, deben ser capaces de percibir su entorno natural y experimentar cambios en su fisiología en respuesta a esas señales ambientales. En este proceso la membrana plasmática es fundamental
1) Disrupción osmótica por afectaciones a la membrana plasmática
2) Activación de la señalización mediada por kinasas y segundos mensajeros
3) Síntesis de factores de transcripción
4) Activación de genes
Luz UV
Calor
Frío
Sequía
SalinidadMANEJO
Primero no hacer daño…Segundo no estorbar…
Estructura y Función de la Membrana Plasmática
Rol de la Membrana en Respuesta a Estrés
Activación Osmosensores, enzimas, segundos mensajeros y
proteínas kinasas
SíntesisMúltiples factores de
transcripción
Expresión de genes que codifican
Osmoprotectores, proteínas fibrosas, transportadoers de iones y acuaporinas
Restauración de la homeostasis a través del establecimiento del sistema de
resistencia adaptativa
Estrés Abiótico
Estrés BióticoGeneran disrupción osmótica, con posibles
alteraciones en membrana celular y sus proteínas, lo que desencadena:
Inicio de la Señalización en Membrana PlasmáticaLas señales externas usualmente son reconocidas por receptores en la membrana plasmática que son capaces de controlar procesos moleculares de la activación de la señalización intercelular coordinada durante las respuestas de crecimiento, desarrollo y estrés
Estas señales son recibidas inicialmente por las proteínas de membrana y se transmiten secuencialmente para activar elementos de señalización
Receptores en Membrana PlasmáticaExisten diferentes receptores de membrana que actúan como reguladores en la percepción de señales ambientales. Los receptores de tipo quinasas (RLK) son considerados como moléculas claves en la regulación del crecimiento y desarrollo de la planta bajo diferentes condiciones de estrés. La transcripción de los genes RLK es regulada y modulada en respuesta al estrés a nivel individual o en grupos de genes
Activación de
quinasas
SalinidadEstrés
Osmótico Sequía Frío
Biomarcadores
Factores Ambientales
Activación de factores de transcripción, canales y otros mecanismos de transporte
Mantenimiento de la Homeostasis
Red de Señalización Los receptores de tipo kinasas (RLK) e histidin kinasas (HK) de la membrana celular regulan los mecanismos de homeostasis en respuesta al estrés abiótico y biótico, a través de la activación génica
Tipo 1Predecir las respuestas a las intervenciones terapéuticas
Tipo 0Se utiliza para estimar la aparición o el desarrollo de una enfermedad
Tipo 2En principio se podría utilizar como criterios
de valoración clínicos de sustitución en los curso de ensayos clínicos
Un biomarcador es una característica que puede ser medida objetivamente y puede utilizarse como indicador de los procesos biológicos normales y/o procesos patológicos y/o respuesta farmacológica a un agente terapéutico y/o factor nutricional
Biomarcadores
Los metabolitos son un conjunto de sustancias bioquímicas producidas por la célula durante procesos metabólicos: azúcares,
lípidos, aminoácidos, etc, que pueden se usados como marcadores
En los estudios de la variabilidad genética la clave es el análisis de polimorfismos de nucleótido simple (SNPs)
La principal fuente de datos moleculares para descubrir biomarcadores son los estudios de ADN basados en variaciones, la
expresión de genes (transcriptómica), expresión de proteínas y la medición de los metabolitos (metabolómica)
Algunos de los biomarcadores son ortogonales, es decir biomarcadores con relativamente baja dependencia
estadística, biológica o clínica entre ellos.
Fuentes de Biomarcadores
Biomarcadores Relacionados a Membrana Los receptores tipo kinasa (RLK) modulan la expresión de genes que puede ser utilizados como marcadores del estado fisiológico de la planta
Tipo de RLK
Gen Función
LRR GHR1 Regula la activación de canales iónicos
SRLK Previene el desarrollo de la raíz en condiciones de salinidad
RLK7 Regula la velocidad de germinación y tolerancia al estrés oxidativo
OsSIK1 Permite el incremento de superóxido dismutasa que brinda tolerancia a la sequía y salinidad
RPK1 Resistencia a sequía
PERK PERK4 Inhibe la elongación de la raíz ante perturbaciones de la homeostasis de Ca+2
CRK/DUF26 CRK36 Media la señalización vinculada al estrés osmótico
RLCK CRLK1 Relacionada a la respuesta ante bajas temperaturas
•Grupo de proteínasSe encuentran asociadas a membrana
•EstructuralmenteConstituídas por las subunidades α, β y γ
• Función Participan en la transducción de señales
Proteínas G Heterotriméricas-Biomarcadores Las proteínas G son un grupo de proteínas asociadas a la membrana plasmática, consideradas como moléculas de señalización
Respuesta a Estrés • Hídrico• Salino• Térmico
Respuesta a Hormonas• Auxinas• Giberelinas• Ácido Absícico
Eventos de Desarrollo• Formación de raíces• Elongación del hipocótilo
Diversas• Activación de Canales• Respuesta a Patógenos• Respuesta a la Luz
Proteínas G Heterotriméricas-Biomarcadores • Estas proteínas estan
implicadas en la respuesta mediada por
la membrana plasmática ante
diversos factores, y puede ser utilizados como biomarcadores
del estado fisiológico de la planta
Biomarcadores y Señalización Intrónica-Exónica en Células Meristemáticas
Vegetales
Células Meristemáticas
• Las plantas mantienen poblaciones de células
madre en los tejidos jóvenes no diferenciados llamados
“meristemos”, que conservan su organización a
través de la señalización célula-célula. Los
meristemos mantienen poblaciones de células no
diferenciadas y son esenciales para la
producción de tejidos especializados
Células Meristemáticas
• El crecimiento y desarrollo de las plantas depende de los procesos continuos que
ocurren en las células meristemáticas. A partir de los meristemos se originan
todos lo organos post-embrionarios, como hojas,
tallos y flores
Señalización en Células Meristemáticas
• Las poblaciones de células madre en los meristemos son mantenidas a través de la vía
de señalización CLAVATA (CLV), la cuál se constituye por un pequeño péptido secretado (CLV3), los receptores tipo
quinasa CLV1 y CRN, así como por el receptor CLV2
Señalización en Células Meristemáticas
• El modelo para la vía de señalización CLAVATA sugiere que
CLV1, CLV2 y CRN reconocen el péptido CLV3 produciendo la activación del receptor que conduce a la represión de la
expresión del factor de transcripción del homodominio Wuschel (WUS), el cual es un
pequeño péptido que actúa como un centro de organización
requerido para el control de la población de células madre. En
ausencia de este péptido se produce un aumento en dicha
población
Marcadores Moleculares en Células Meristemáticas
• Estudios de mutagenesis dirigida hacia la región exónica de los genes CLV1, CLV2 y CLV3,
ocasiona un aumento en la población de células madres, lo que se debe a que las células que recientemente se habían
diferenciado, se reconvierten en células madre
El factor de transcripción SHOOTMERISTEMLESS (STM) en conjunto con WUS se requieren para controlar los procesos de diferenciación celular en el meristemo
WUS y STM han sido consideradas como moléculas
biomarcadores para determinar el estado fisiológico de las
células meristemáticas, ya que WUS actúa para mantener la
función de células madre, mientras que STM es necesaria para el mantenimiento de un
estado indiferenciado
Marcadores Moleculares en Células Meristemáticas
Marcadores Moleculares en Células Meristemáticas
El gen LOG, recientemente reportado, es requerido para mantener las funciones del meristemo, este gen codifica un tipo de citoquina que se encarga de bioactivar la síntesis de nuevas citoquinas que inducen la proliferación y diferenciación celular
Región exónica-intrónica del gen
LOG
Ubicación del gen LOG
Deleción del gen LOG
Expresión normal del gen LOG
Biomarcadores y Transcriptómica a Nivel de Retículo Endoplásmico en Células
Parenquimatosas
Retículo endoplásmicoEl retículo endoplásmico (RE) es un organelo involucarado en:
Síntesis de Proteínas
Plegamiento de Proteínas
Ensamble de Proteínas
Degradación de Proteínas
Reciclaje de Proteínas
Permite el mantenimiento de
la Homeostasis
Retículo Endoplásmico
EnzimasQue permiten degradar proteínas defectuosas
ChaperonasQue permiten el correcto plegamiento de proteínas
InducciónDe genes que codifican para chaperonas y enzimas
A B C
Esto se logra a través de:
Transcriptoma y Biomarcadores
En un estudio realizado en nogal por Lightbourn et al (2014), según metodología Wakasa en el cual se analizó su transcriptoma, el trabajo incluyó el análisis de 38,076 genes mediante “RNA-seq”
Después del análisis bioinformático se determino que un total de 374 estaban involucradas en la respuesta a estrés del RE
2 % transporte transmembrana
5% proteolisis
2% metabolismo lipídico
3% plegamiento de proteínas4% regulador de transcripción
9% respuesta a estrés oxidativo
7% metabolismo de carbohidratos
20% a procesos de óxido-reducción
48% funciones diversas
De los 374 genes vinculados al retículo endoplásmico, esta es la distribución con base a su función
Transcriptoma y el Retículo Endoplásmico
Posibles Biomarcadores del Retículo Endoplásmico
• Una chaperona del retículo endoplasmíco, denominada GRP94, regula el desarrollo del meristemo a través del correto plegamiento de las proteínas de la vía CLAVATA
• Apróximadamente la tercera parte del total de las proteínas a la membrana sufren alguna modificación postraduccional en el retículo.
• Esto se logra a través de la inducción de genes que codifican
chaperonas y enzimas relacionadas con el plegamiento de proteínas. Si el estrés es demasiado severo en la
célula el RE induce la muerte celular programada.
Biomarcadores Relacionados al RE• La participación del RE en la
fisiología celular vegetal involucra varias vías de
señalización. En nogal, las proteínas OsbZIP39 y
OsbZIP60 actúan como reguladores transcripcionaels
de ATF6, una proteína transmembrana que
desencadena un tipo de respuesta que conduce a la
proteolisis de algunas proteínas mal plegadas
• Mientras que AtbZIP17 y AtbZIP28 tienen un mecanismo de acción similar al anterior en Arabidopsis.
Biomarcadores Relacionados al RE
• Por otro lado, la proteína IRE1 actúa como sensor que es altamente conservado en plantas, es una
proteína transmembrana que tiene un dominio tipo kinasa y un
dominio tipo ribonuleasa, este último dominio permite realizar el splicing del ARNm que codifican
para diversos factores transcripcionales (HAC1, XBP1,
AtbZIP60 y OsbZIP50) resultando en la activación de una señal que
concluirá en la degradación de ARNm que codifican proteínas durante el período de estrés.
El Instituto de Investigación Lightbourn A.C. “LIGHTBOURN RESEARCH”
Proyecto permanente de Investigación
“Validación de la nutrición coloidal según M.B.L.* e I.M.L.* para maximizar productividad de cultivos, reducir impacto
ambiental y crear nueva metrología de diagnóstico nutricional basada en correlacionar indicadores moleculares y la
respuesta productiva”
Respaldo científico de los beneficios productivos y ambientales de la tecnología
Genes N, P, K,B, Ca, Zn RT-PCR
Biomarcadores Déficit Nutrimental Método de Detección
Resumen Ejecutivo del Proyecto
Objetivo General del Proyecto
Maximizar la productividad de cultivos de manera sustentable mediante un sistema de nutrición coloidal de bajo impacto ambiental y una nueva metrología basada en biomarcadores de deficiencia nutricional.
Identificar y validar la expresión de
biomarcardores candidatos de la
deficiencia de nutrientes1
Estandarizar una técnica
de cuantificación múltiple y simultánea
de los biomarcador
es
2
Objetivos Específicos del Proyecto
Estimar las recomendaciones correctivas
necesarias para maximizar
los rendimientos
de manera sustentable
5
Validar el efecto benéfico de la
nutrición coloidal en la ecología microbiana y
estructura del suelo
4
Demostrar la disminución del
impacto ambiental de la
nutrición coloidal
3
Muestras
Datos Omic
Diferencias Entre tipos de Muestras
Modelado Integral-Predictivo
Potencial Biomarcador: Modelos Predictivos
Validación Independiente
Diagnóstico Pronóstico
Los principales resultados esperados desde la perspectiva de investigación, podrían ser (desarrollo de nuevos sistemas de diagnóstico y pronóstico =
biochip) y predicción computacional para la detección y diagnóstico
Muestra de Plantas
Integración de los Datos
Expresión Génica
Acumulación de Metabolitos
Genes
Metabolitos
Análisis Multivariado
de Datos
Procesamiento de Datos
Análisis del Metaboloma
Análisis del Transcritoma
MBLIML
Datos de la matriz de
metabolitos
Datos de la expresión de los
genes
Extracción y pre-Tratamiento
Los modelos de clasificación de enfermedades y predicción de riesgo se basan en modelos estadísticos multivariantes. Este modelo puede ser
implementado con funciones matemáticas
S (t) = = f (x) = x1 + x-2
11 + e-t
11 + e-t
= 1 + x-2
x
Plan General de Operación
PGO
DiseñoMultifactorial
Hipótesis Científica
ExperimentaciónBiológica
Muestreo y Preparación de la Muestra
Interpretación Biológica
Quimiometría Estadística
Medidas Procesamiento de Datos
2e-t + 1 ≠ 0, et + 1 ≠ 0
X = et
2et + 1
et
2et + 1X = -
4
Formación y capacitación de recursos humanos altamente calificados
5
Expresión de biomarcardores candidatos de la deficiencia de nitrógeno, fósforo y potasio, boro, calcio, zinc y actividad fotosintética.
Resultados Esperados del Proyecto
6
Registro patentes posibles identificadas
sobre las áreas de investigación
mencionadas
Programas de nutrición coloidal validados científicamente
1
Identificación de biomarcadores de
desbalances nutricionales 3
Maximización de la productividad de cultivos
2
“La ciencia será siempre una búsqueda, jamás un descubrimiento real. Es un viaje, nunca
una llegada”
Karl Popper
Gracias
Marcadores Moleculares: Indicadores de la Aparición y Progresión de Enfermedad
Dr. Luis Alberto Lightbourn Rojas, PhD
BIOTEKSA-LIGHTBOURN RESEARCHCorreo electrónico:
5Para ello se requiere la apropiada
colección de las muestras biológicas (líquidos y sólidos)
4
Confiriendo la capacidad de predecir los acontecimiento, en lugar de tan sólo describirlos
3
Esto requiere la visualización del análsis, modelado e integración adecuada de los diferentes tipos de datos
disponibles
2
La bioinformática y la investigación para el diseño, implementación y aplicación de
tecnología computacional, métodos y herramientas para optener datos significativos
“OMICS”
Indicadores
1El mayor reto es el
demostrar su eficacia en un entorno clínico
Tipo 1Predecir las respuestas a las intervenciones terapéuticas
Tipo 0Se utiliza para estimar la aparición o el desarrollo de una enfermedad
Tipo 2En principio se podría utilizar como criterios
de valoración clínicos de sustitución en los curso de ensayos clínicos
Un biomarcador es una característica que puede ser medida objetivamente y puede utilizarse como indicador de los procesos biológicos normales y/o procesos patológicos y/o respuesta farmacológica a un agente terapéutico (factor nutricional)
Biomarcadores
CLÍNICA• Cuestionamientos y requerimientos clínicos• Extracción de la muestra• Adquisición de datos fenotípicos
COMPUTACIONAL• Procesamiento de datos• Selección de la característica• Análsis estadístico• Modelo predictivo• Refinamiento / Nueva hipótesis
LABORATORIO• Procesamiento de la muestra• Generación de datos moleculares “omics”• Hipótesis
DIAGNÓSTICO• Evaluación de los individuos sospechosos de sufrir la
enfermedad
PRONÓSTICO• Predicción del estado
del que sufre la enfermedad
Adquisición de Datos
Los metabolitos son un conjunto de sustancias bioquímicas producidas por la célula durante procesos metabólicos: azúcares,
lípidos, aminoácidos, etc, que pueden se usados como marcadores
En los estudios de la variabilidad genética la clave es el análisis de polimorfismos de nucleótido simple (SNPs)
La principal fuente de datos moleculares para descubrir biomarcadores son los estudios de ADN basados en variaciones, la
expresión de genes (transcriptómica), expresión de proteínas y la medición de los metabolitos (metabolómica)
Algunos de los biomarcadores son ortogonales, es decir biomarcadores con relativamente baja dependencia
estadística, biológica o clínica entre ellos.
Fuentes de Biomarcadores
ProspectivoRetrospectivo
Estrategias para la Obtención de Datos
Basado en muestras clínicas recolectadas antes del estudio diseñado y antes de cualquier comparación con muestras
control. Se efectúa con una mira atrás en los datos de registrados anteriormente
para encontrar evidencia de las relaciones marcador-enfermedad.
Requiere de covariables (otros cofactores predictivos)
El modelo se aplica al mismo tiempo en el que ocurre un fenómeno o proceso,
con una mirada hacia el futuro. La información se adquiere y analiza para evaluar la capacidad de predicción o la
discriminación que poseen los biomarcadores
Descubrimiento de Biomarcadores
El objetivo principal es detectar una respuesta a una enfermedad o complicación durante una etapa en la que se pueda ayudar a la selección del tratamiento
La identificación basada en umbrales de referencia,
umbrales de discriminación o umbrales de riesgo
3
La comparación de estados fisiológicos, fenotípicos o cambios a
través de casos y controles
1
A nivel molecular; la actividad diferencial de genes,
concentración de proteínas, metabolitos y vías de señalización
2
Las fuentes potenciales de variabilidad experimental están relacionados con la extracción de la muestra, almacenamiento y procesamiento de datos. Provocando variabilidad inter laboratorio debido a diferencias en reactivos y protocolos experimentales
Se vislumbra como un poderoso complemento a nivel molecular para la célula en un determinado momento
Un desafío clave en el desarrollo de biomarcadores es la reducción de la variabilidad experimental y ruido en los datos, así como asegurar la reproducibilidad de la toma de muestra, análisis y evaluación de datos
Adquisición de la Muestra y Análsis de Datos
Muestras
Datos Omic
Diferencias Entre tipos de Muestras
Modelado Integral-Predictivo
Potencial Biomarcador: Modelos Predictivos
Validación Independiente
Diagnóstico Pronóstico
Los principales resultados esperados desde la perspectiva de investigación, podrían ser (desarrollo de nuevos sistemas de diagnóstico y pronóstico =
biochip) y predicción computacional para la detección y diagnóstico
Muestra de Plantas
Integración de los Datos
Expresión Génica
Acumulación de Metabolitos
Genes
Metabolitos
Análisis Multivariado
de Datos
Procesamiento de Datos
Análisis del Metaboloma
Análisis del Transcritoma
MBLIML
Datos de la matriz de
metabolitos
Datos de la expresión de los
genes
Extracción y pre-Tratamiento
Los modelos de clasificación de enfermedades y predicción de riesgo se basan en modelos estadísticos multivariantes. Este modelo puede ser
implementado con funciones matemáticas
S (t) = = f (x) = x1 + x-2
11 + e-t
11 + e-t
= 1 + x-2
x
Plan General de Operación
PGO
DiseñoMultifactorial
Hipótesis Científica
ExperimentaciónBiológica
Muestreo y Preparación de la Muestra
Interpretación Biológica
Quimiometría Estadística
Medidas Procesamiento de Datos
2e-t + 1 ≠ 0, et + 1 ≠ 0
X = et
2et + 1
et
2et + 1X = -
STAT ML GNT IV KE SD SMActividad
Acceso a datos e información
Análisis de datos para predicciónInformación de laboratorio
Biomarcadores
Búsqueda
Información aportada por los datos
Búsqueda en la literatura
Selección del marcador óptimo
Clasificación y valoración del riesgo
Estimación de la significacía
STAT: Análisis estadísticoML: Estadística y aprendizaje GNT: Teoría de redesIV: Información, visualizaciónKE: Ingeniería de aprendizajeSD: Desarrollo de software SM: Modelado de sistemas complejos
“La ciencia será siempre una búsqueda, jamás un descubrimiento real. Es un viaje, nunca
una llegada”
Karl Popper
Gracias