T1. Introduccin a los Cultivos Celulares. Desarrollo histrico.
Tipos de Cultivos de clulas animales. Equipamiento del laboratorio de
cultivos. Biologa de las clulas en cultivo.
T2. Requerimientos de las clulas en cultivo y tcnicas de
mantenimiento.
El ambiente del cultivo. Tcnica de subcultivo. Cultivos en suspensin y
en monocapa. Congelacin y descongelacin. Deteccin de
contaminaciones.
T3. Cultivos primarios y lneas celulares. Cultivos tridimensionales.
Evolucin de los cultivos primarios. Lneas celulares: transformacin celular.
Cultivos de esferoides.
T4. Citometra de flujo y anlisis del ciclo celular. Curvas de crecimiento.
T5. Tema 5. Citotoxicidad y genotoxicidad
Ensayos de viabilidad y supervivencia. Uso de cultivos organotpicos.
Deteccin de dao en el ADN
Programa de teora de TMC Biologa celular
Culture of Animal Cells, A Manual of Basic Tecnique and
Specialized Applications, Freshney R I (2010), sixth edition.
CULTIVO DE CLULAS ANIMALES Y HUMANAS.
APLICACIONES EN MEDICINA REGENERATIVA, Pablo Gil-
Loyzaga , Vision Libros (2011).
Tcnicas en Histologa y Biologa Celular. Montuenga, L.
Esteban F.J. y Calvo, A. (2009)
Tema 1. Introduccin a los Cultivos Celulares.
Desarrollo histrico de los cultivos.
Mtodos de inicio
Tipos de Cultivos de clulas animales.
Equipamiento del laboratorio de cultivos.
Biologa de las clulas en cultivo.
Tcnicas Moleculares y Celulares
Biologa Celular
Curso 2014/15
Cultivos de clulas y tejidos
Tcnica mediante la cual se pueden mantener clulas y
fragmentos de tejidos y rganos en situacin de aislamiento
de un organismo pluricelular.
Se pueden obtener de animales y vegetales.
Los cultivos celulares se obtienen haciendo crecer in vitro clulas
dispersas en las condiciones adecuadas.
Las clulas dispersas se pueden obtener mediante disgregacin
mecnica o enzimtica.
Tambin se usa el trmino cultivo celular para designar cultivos
tridimensionales (de rganos o de tejidos)
Inicialmente se us el trmino Cultivo tisular, porque se realizaban a
partir de explantes
Implantacin en laboratorios de Ciencias Biomdicas
Tcnica adecuada para investigacin en ciencias experimentales y de la salud
Aplicaciones diagnsticas, industriales y teraputicas
Ventajas
Gran control de condiciones fsico-qumicas: permite
el estudio de comportamientos fisiolgicos en diferentes
condiciones
Homogeneidad del comportamiento celular: resultados repetitivos
Desventajas
Requerimiento instrumental y entrenamiento tcnico
Falta de estabilidad del cariotipo celular
Acontecimientos para el desarrollo de cultivos
de clulas animales
Roux (1885): mantiene clulas embrionarias de pollo vivas en solucin
salina
Harrison, 1907: cultivo explantes (mdula espinal anfibio)
Carrel, 1913: - cultiv explantes en plasma coagulado
- asepsia
- mezcla de suero, solucin salina y
extractos de embriones como medio
Matraz de Carrel
Actualmente:
Frascos de Cultivo Cabinas de flujo
1940s-1950s : Desarrollo de los cultivos celulares
- desarrollo de antibiticos
- Enders, 1949: virus polio en clulas tejidos diferentes al nervioso
humano
Cultivos primarios: preparados directamente
de organismo
Tcnicas de subcultivo o transferencia
Cultivos secundarios
Cepas celulares, lneas celulares no transformadas
o lneas celulares primarias: vida media finita en cultivo
Gey, 1952: HeLa, lnea celular
continua de carcinoma cervical
humano
Lneas celulares transformadas: cambio gentico
que les permite un crecimiento indefinido
Eagle, 1955: Primer estudio sistemtico de los requerimientos nutricionales
de las clulas en cultivo
1970-80:
Produccin de AC monoclonales a partir de hibridomas (Kholer y Milstein, 1975).
Tecnologa de ADN recombinante: produccin de molculas de inters
(en bacterias: Insulina )
en eucariotas: activador de plasmingeno
1990: aislamiento de clulas madre
Mtodos de
inicio de
cultivos
adulto
embrin
diseccin
Digestin
enzimtica Diseccin
fina
Cultivo celular Explantes
primarios Cultivo
tridimensional
Organismo
Clulas
poco
adherentes
Cultivo
en suspensin
Algunas aplicaciones de los cultivos de clulas
Investigacin de la fisiologa y bioqumica celular; anlisis gentico.
Anlisis de los efectos de compuestos en determinados tipos celulares
* metabolitos, hormonas, factores de
crecimiento
* compuestos potencialmente txicos o
mutagnicos
Terapia celular y medicina regenerativa: * cultivos de condrocitos autlogos
*produccin de tejido artificial: sustitutos
drmicos (Apligraft)
Obtencin de productos de inters
- vacunas
- protenas de uso teraputico (factores de
coagulacin VIII y IX para la hemofilia,
eritropoyetina)
- AC monoclonales de hibridomas
Cultivos de tejidos y rganos
Cultivos de clulas: disgregadas o dispersas
(de cultivo primario o de lnea celular)
Cultivo histotpico: re-agregacin de clulas y
reconstruccin tridimensional
Cultivo organotpico: similar a histotpico, con
distintos tipos celulares
Tipos de cultivos de clulas animales
Tipos celulares usados en cultivos celulares
* Epitelial
* Conjuntivo: FIBROBLASTOS
* Muscular
* Nervioso
* Sangre
* Clulas madre embrionarias
* Clulas madre adultas
https://www.youtube.com/watch?v=pqia6TZdVa4
Colecciones o bancos de clulas
The American Type Culture Collection
(ATCC)
The European Collection of Animal Cell
Culture (ECACC)
http://www.lgcstandards-atcc.org/
Fibroblastos humanos
Epiteliales
SH-SY5Y (neuroblastoma)
Esterilidad
Laboratorio de cultivos:
Equipamiento
Seguridad
La esterilidad: es condicin fundamental mantener los cultivos de clulas estriles puesto que los microorganismos crecen rpidamente.
Equipos del laboratorio de Cultivo Celular
Cabinas de flujo laminar
Incubador de CO2
Microscopio invertido
Cabina de flujo laminar
Sirven para mantener un ambiente estril Luz UV
Filtros HEPA (tamao poro 0.2 m): no permite el paso
de esporas, microorganismos, partculas de polvo, etc.
Tipos: de flujo laminar horizontal de flujo laminar vertical
Tipos de cabinas de flujo laminar (laminar flow hoods) :
Filtros HEPA ((High Efficiency Particulate Air)
Buena proteccin del personal
Mayor proteccin
estril del cultivo
Mayor proteccin
del operador
Qu tipo de cabina se deben usar para cultivos de
clulas de primates incluidas las humanas?
El riesgo biolgico del trabajo con cultivos de clulas
animales procede de
Incubadores de CO2
Temperatura: 37C
CO2: 5%
Seguimiento del cultivo: viabilidad,
multiplicacin, contaminacin.
Son microscopios pticos con la fuente de luz
situada en la parte superior y los objetivos en
la inferior.
Microscopio invertido
Biologa de las clulas en cultivo
Mayor proliferacin
Menos interacciones intercelulares
Menos interacciones con la matriz
Distintos nutrientes, hormonas y factores
de crecimiento
condiciones antagnicas a diferenciacin Energa metablica: glucolisis