Conceptos y Técnicas de Biotecnología I, CTBT
Bloque BASH (Biotecnología Animal
y en Salud Humana)
1 Sandra Ruzal CTBT 2013
VACUNAS
SANDRA RUZAL Departamento de Química Biológica
FCEN-UBA
IQUIBICEN-CONICET
2
• VACUNAS → origen siglo XVIII, exposición
voluntaria a agente infeccioso era beneficiosa.
Generaba Protección a reinfección
• Inmunidad: respuesta del sistema inmunológico
→ memoria inmunológica Edward Jenner (médico británico)
inventó en 1796 la primera vacuna
contra la viruela.
El experimento consistió en inyectar
a un niño de 8 años la vacuna
procedente de una pústula del
brazo de una ordeñadora
(contagiada x VACA) a través de
dos cortes superficiales en el brazo,
consiguiendo inmunizar al niño ante
la viruela humana.
Sandra Ruzal CTBT 2013
Sandra Ruzal CTBT 2013 3
Aparición principales vacunas de uso humano:
- 1796: Vacunación contra la viruela
- 1885: Vacuna contra la rabia Pasteur µorg atenuados
- 1925: Toxoide diftérico, Toxoide tetánico y tos combulsa
- 1937: Vacuna contra la fiebre amarilla
- 1943: Vacuna contra influenza
- 1954: Vacuna inactivada contra virus polio
- 1956: Vacuna viva atenuada contra virus polio
- 1960: Vacuna contra el sarampión
- 1966: Vacuna contra la rubeóla
- 1975: Vacuna contra hepatitis B→subunidades
- 1980: Viruela erradicada
- 1986: Primera vacuna recombinante (hepatitis B)
- 1988: Vacuna contra H. influenzae B → conjugada
cultivo celular y
desarrollo de virus
humanos fuera del
organismo vivo
Edad de oro
4
Qué son las vacunas Un preparado complejo
Formado por microorganismos completos
atenuado o inactivado o bien parte o fracción
del mismo
Capaz de inducir una respuesta inmune
protectora y duradera frente al mismo
microorganismo virulento u otros patógenos,
previniendo la infección y enfermedad que
estos causan
Objetivo: PROTECCIÓN POR PREVENCIÓN
Sandra Ruzal CTBT 2013
Antígeno: molécula Inmunogénica
Inmunogénica: molécula capaz de despertar una
respuesta en el sistema inmune y producir memoria
inmunológica
más efectivo y menos costoso
Sandra Ruzal CTBT 2013 6
Respuesta secundaria 1-3 días
Mayor Intensidad IgG, IgA, IgE
Mayor Afinidad de los Ac
Respuesta primaria 5-10 días
Menor Intensidad IgM>IgG
expansión clonal de células T y/o B
específicas, dan lugar a formación
de población de células de memoria.
Sandra Ruzal CTBT 2013 7
Respuestas inmunes que confieren protección:
Microorganismos extracelulares con una fase en sangre
crucial para la patogénesis (viremia o bacteriemia):
Respuesta Humoral
Microorganismos que ingresan por mucosas: Producción
de IgA secretoria neutralizante
Microorganismo intracelulares: Respuesta celular y
humoral.
8 Sandra Ruzal CTBT 2013
modificados para que no puedan generar enfermedad
Patógenos muertos o inactivados
Sólo componentes
Las vacunas inactivadas, de subunidades y las de DNA se consideran seguras, debido
a que no involucran la inoculación de microorganismos vivos que pudieran ser peligroso
en mujeres embarazadas e individuos inmunocomprometidos o incluso en individuos
sanos debido a la posibilidad de reversión a la forma virulenta del microorganismo
subunidades
¿Que tipos de vacunas existen?
Sandra Ruzal CTBT 2013 9
Componentes de una vacuna
Antígeno: molécula capaz de inducir una respuesta inmune (virus, parte
de virus, células infectadas).
Adyuvante: Sustancias que potencian la reacción inmune, presentan el
antígeno en forma gradual y más eficiente, pero de manera inespecífica.
Estabilizantes: Sustancias que confieren protección frente a factores
que degradan el antígenos.
Diluyente: Soluciones a base de ¨buffers¨ que ajustan la concentración
antigénica a la dosis de uso o sirven para la reconstitución de liofilizados.
Ventajas vacunas vivas atenuadas vs. muertos o subunidades?
imitan a la infección, son baratos de producir y
administrar vía oral, menor número de dosis requeridas
asemeja in vivo vacunación primaria a secundaria.
Desventajas: costos de almacenamiento y
conservación, deben mantener a 4°C, riesgo
afecte al personal, riesgo potencial que revierta
10
VACUNAS Atenuadas: Microorganismos vivos que multiplican con
reducida patogenicidad (infección leve) inmunidad humoral y celular
Sandra Ruzal CTBT 2013
Formas de atenuación de virus:
Aislamiento de virus patógenos de una especie pero que no lo son para otra (viruela
bovina, rotavirus bovino).
Pasajes sucesivos en cultivo celular o en embriones de pollo (sarampión, rubéola)
Pasajes en otro hospedador (Sabin se hace en células de mono)
Por mutagénesis química o térmica o manipulación por técnicas de ingeniería genética
Recombinación entre cepas virales
BCG
Una gran cantidad de estudios demuestran que NO induce
Ac pero sí una rta T CD4+ productora de IFN-. También
CD8+ y CD1. 11 Sandra Ruzal CTBT 2013
Bacillus Calmette Guerin
12
VACUNAS Inactivadas o Muertas:
Microorganismos enteros muertos no multiplican tratamientos
físicos o químicos eliminan infectividad, manteniendo
capacidad inmunogénica
Timerosal, mercurial, no muy efectivo, es tóxico, prohibido en humanos.
Betapropionolactona, efectiva en bajas concentraciones, alto costo.
Bromoetileimida (BEI), cancerígeno.
Inmunidad generada es sólo humoral, requieren adyuvantes
Ventajas: Son más estables que las vacunas vivas
Desventajas: Requiere grandes cantidades del Ag y/o mayor número de
dosis, pueden alterar epítopes Sandra Ruzal CTBT 2013
Sandra Ruzal CTBT 2013 13
· Pertussis acelular, subcomponentes proteicos purificados,
· Salmonella typhi, polisacárido capsular Vi,
· N. meningitidis grupos A y C, polisacáridos capsulares,
· Streptococcus pneumoniae (23-valente), polisacáridos
capsulares,
· Haemophilus influenzae tipo b conjugada, inmunogenicidad
polisacárido incrementada unida a proteína transportadora,
· N. meningitidis grupos A y C conjugadas Polisacáridos
capsulares conjugados con proteínas antigénicas
(meningococo, neumococo)
TOXOIDES: toxinas inactivadas con formol (tetánica, difterica)
Subunidades procedimientos de fermentación y
purificación que han permitido la producción de vacunas a
base de subunidades o antígenos purificadas
14 Sandra Ruzal CTBT 2013
Vacunas acelulares, vacunas con toxoides y vacunas
conjugadas, son débilmente inmunogénicas
Requieren Adyuvantes
Potencian la reacción inmune, presentan el antígeno en forma
gradual y más eficiente, pero de manera inespecífica, estimulan la
producción de citoquinas.
15
Combinadas: varias especies
• Doble bacteriana (dT): difteria + tétanos.
• Triple bacteriana celular y acelular (DTP/Pa): difteria +
tétanos +pertussis.
• Cuádruple celular y acelular (DTP/Pa + Hib): difteria +
tétanos + pertussis + Haemophilus influenzae b.
• Quíntuple celular y acelular (cuádruple + IPV): DTP/Pa
+ Hib + poliomelitis inactivada.
• Quíntuple celular (cuádruple + HB): DTP + Hib +
hepatitis B.
Monovalentes: una
única especie un
antígeno
Polivalentes: única
especie de distintos
antígenos
Sandra Ruzal CTBT 2013
En vacunas multi-componentes (más de un
antígeno) se debe probar que no existe
interferencia entre los componentes.
Otra interferencia común son los agentes
inactivantes de vacunas de virus inactivados
cuando se aplican con otras vacunas que
poseen antígenos vivos
Sandra Ruzal CTBT 2013 16
Requisitos generales: pura, segura, potente y efectiva
Instalaciones adecuadas con personal capacitado
GMP (buenas prácticas de manufactura) uniformidad y consistencia
Registro del producto y control lote a lote.
PRODUCCIÓN DE VACUNAS
Factores a considerar:
•Diseño del producto (tipo de vacuna, modo de producción, eficiencia,
control)
• Registro, Semilla, banco maestro
• Materias primas, medios y soluciones, calidad del agua, suero y aditivos de
origen biológico.
• Sistemas de cultivo celular, Infección, Cosecha
• Concentración y/o purificación
• Inactivación
• Formulación
• Envase y acondicionado: Presentaciones
• Almacenamiento
• Control de calidad y cadena de frío
• Presentación ante organismos oficiales
• Seguimiento de la conformidad del cliente
17
Instalaciones de producción
1) Diseñadas para garantizar la pureza del
producto en todas las etapas de producción
como también proteger la salud del
personal.
2) Fácil limpieza siguiendo normas
bioseguridad y contención de patógenos
para evitar contaminaciones cruzadas y
prevenir la contaminación del personal y los
equipos.
3) Cada proceso limitado a un área definida
4) Con adecuada ventilación y aire filtrado,
temperatura y suministro de agua.y drenaje
5) vestuarios y otras instalaciones para el
personal accesibles sin pasar a través de
áreas preparación de productos biológicos.
5) Diseño que evita contaminación
ambiental. Material utilizado en producción
tiene que hacerse seguro antes de salir de
la instalación. Sandra Ruzal CTBT 2013
18
Sandra Ruzal CTBT 2013
semilla inoculo
biorreactor
centrifugación
estabilizador liofilizada
encapsulado molienda
Sandra Ruzal CTBT 2013 19
Los virus se cultivan tanto en las células primarias, como
huevos de gallina embrionados (x ej influenza, rabia,
sarampión), Producidas en órganos:
Cerebro de cordero (rabia),
Cerebro de ratón (encefalitis
japonesa)
Producidas en cultivos celulares: primarios, secundarios o
líneas celulares continuas, tales como cultivos de células
humanas (x ej hepatitis A). .
Producidas en organismos
recombinantes: bacterias,
levaduras.
20
1. Investigación pre-clínica se prueban pureza y seguridad en animales
2. Estudios clínicos en humanos:
• Fase I: pequeño grupo de voluntarios que habitan fuera del área endémica.
evalúa la seguridad y potencia de la vacuna.
• Fase II: análisis de la respuesta inmune de los voluntarios.
• Fase III: son pruebas “de campo”, se realizan con comunidades que habitan en
áreas endémicas. Seguimiento clínico de los individuos vacunados.
3. Período de licencia procedimientos legales y administrativos a partir de los
resultados obtenidos en las etapas anteriores para la aprobación (licencia) y
registro de la vacuna.
4. Relevamiento post-licencia evalúa la vacuna durante algunos años.
Se estudian los cambios en la incidencia de la enfermedad y en la transmisión y
se registran los casos de reacciones indeseables. Sólo después de esta etapa se
considera o no la inclusión de la vacuna en los planes de vacunación de la región. Sandra Ruzal CTBT 2013
http://www.anmat.gov.ar/Medicamentos/Medicamentos.asp
Disposición ANMAT 705/2005 Requisitos para la inscripción de vacunas.
21
Bondades de una vacuna ideal
• Precio competitivo.
• De fácil producción y económica
• Ser inocua y segura, pocos o ningún efecto adverso.
• Estabilidad física y genética. Ideal a temperatura ambiente
• Posible inmunización simultánea contra múltiples
componentes protectores de diversos patógenos.
• Protección de larga duración con 1 sola dosis Vía Oral
• Disparar una respuesta inmune de memoria.
• Inducción de inmunidad mucosas en máximo 2 semanas.
• Estimulación de respuesta inmune humoral y celular a
nivel sistémico.
Sandra Ruzal CTBT 2013
22
Problemas
i) no todos los agentes infecciosos son fáciles de crecer en
las condiciones normales de cultivo
ii) el trabajar con los agentes infecciosos requiere de
medidas de bioseguridad muy elevadas
iii) no todas las enfermedades infecciosas son prevenibles
por este tipo de vacunas;
iv) los agentes infecciosos usados en la producción de la
vacuna pueden estar insuficientemente atenuados o
muertos y por lo tanto pueden introducir la virulencia a la
vacuna;
v) componentes tóxicos de los agentes pueden no estar
completamente inactivados y mantener la toxicidad en la
vacuna final
El papel de la biotecnología en el desarrollo de vacunas
Sandra Ruzal CTBT 2013
24
Soluciones
a) identificar genes de virulencia y por lo tanto facilitar su
deleción en los agentes infecciosos creando clones
avirulentos pero que mantienen su habilidad de estimular
la respuesta inmune;
b) crear sistemas vivos no-patogénicos que acarreen los
determinantes antigénicos de un patógeno específico o de
varios;
c) para aquellos agentes de difícil crecimiento, se pueden
aislar los genes de las proteínas que contienen los
determinantes antigénicos críticos para la inmunidad y
expresarlos en otro huésped de mas fácil crecimiento
(bacteria o levadura)
El papel de la biotecnología en el desarrollo de vacunas
Sandra Ruzal CTBT 2013
29 Sandra Ruzal CTBT 2013
La vacunología reversa consiste en
una búsqueda de secuencias de
genoma para la identificación de
putativos antígenos proteicos de
superficie que podrían utilizarse
como candidatos para vacunas
30
•Recombinantes: Se utiliza la manipulación genética para
producir alguno de los componentes del patógeno
Sandra Ruzal CTBT 2013
4 subtipos
El primer antígeno recombinante
comercial para humanos es el
de la proteína de la cápside del
virus de la hepatitis B (HBsAg).
Se produce en Pichia pastori y se
purifica con técnicas de
precipitación de proteínas y
columnas de afinidad con
Anticuerpos monoclonales,
también el antígeno L1 de HPV
31 Sandra Ruzal CTBT 2013
Las vacunas recombinantes de tipo subunidad
producto del gen expresado en bacteria, es cosechado,
purificado y administrado como una vacuna
Antígenos recombinantes
producidas en
bacterias o levaduras,
en plantas.
Sandra Ruzal CTBT 2013 32
proteínas L1 (capside mayor)
recombinantes forman partículas
“tipo-virus” (VLPs, virus-like particles),
carentes del genoma viral, y por lo
tanto no infectivas
Segunda generación
XBio-Leloir
33 Sandra Ruzal CTBT 2013
Las vacunas recombinantes de gen deletado
vacunas con genes deletados asociados con la virulencia
o patogenicidad de una bacteria patógeno;
Las vacunas recombinantes vectoriales consisten de
organismos no patogénicos o de gen deletado en el que se
inserta un material genético específico de otro patógeno
Utilizan virus o bacterias vivos como vectores
34 Sandra Ruzal CTBT 2013
35
• Cumplir normativa sobre ecotoxicidad (Directiva 2001/82/CE y 2001/18/EC -Annex II- ):
• Estudio de virulencia en situaciones de riesgo en diferentes especies
• Estudio de posible transmisión horizontal y recombinación potencial del vector vacunal o de parte de él.
• Estudio de especificidad de especie
• Estudio de la posible instalación en el ambiente.
• Método validado para poder distinguir entre vacuna y microorganismo “salvaje”, especialmente en situaciones de planes de control y erradicación de la enfermedad.
• Utilización de datos obtenidos de ensayos realizados con el mismo vector pero acompañado de otras secuencias.
Sandra Ruzal CTBT 2013
Sandra Ruzal CTBT 2013 36
Differentiating Infected From Vaccinated Animals
¨Marker vaccines¨
Problema: Recombinantes
Se deletean genes
no esenciales
inmunogénicos
permiten diferenciar
la respuesta a la
vacuna de aquellos
de animales
infectados
37
inyectado directamente
en las célula muscular,
in vivo, donde luego es
traducido y expresado
induciendo la
respuesta inmune
Sandra Ruzal CTBT 2013
•Efecto adyuvante
•5´-purina-purina-CG-
pirimidina-pirimidina-3´
• > Frecuencia en bacterias
•Metilados en C vertebrados
Vacunas de ADN desnudo: El gen que codifica para el
antígeno es introducido en el organismo a ser vacunado
y él mismo produce el antígeno a partir de ese gen
38 Sandra Ruzal CTBT 2013
Gene-gun Inmunización
intradérmica
intramuscular
son plásmidos altamente purificados
producidos en alta cantidad (g/L) liofilizado
y luego inyectados codifican para
antígenos que se expresan in situ
El plásmido se mantiene por un tiempo
como episoma en citoplasma.
Vacunas ADN
39
Existen riesgos asociados:
• Integración potencial del plásmido en el genoma de las células hospedadoras.
• Inducción potencial de anticuerpos contra ADN del plásmido inyectado.
• Problema de conformación no nativa de proteínas bacterianas en vacunas con ADN inoculadas en animales.
• Liberación accidental de las construcciones de ADN desnudo pueden favorecer transferencia horizontal de genes
Existen beneficios asociados:
• Efectivas en modelos animales sin necesidad de adyuvantes o sistemas de administración.
• estimulación de la respuesta humoral y celular.
• Solo expresan genes que inducen inmunidad.
• Las produce el mismo animal, siguiendo las instrucciones del gen insertado en el plásmido de expresión en la forma nativa .
• Menor dependencia de la cadena de frío que las vacunas con proteínas.
• Bajo Costo y menor tiempo de preparación
Sandra Ruzal CTBT 2013
Sandra Ruzal CTBT 2013 40
Vacunas comestibles. a partir de plantas modificadas
genéticamente que actúan como bioreactores de
antígenos
Experimental
42
Vacunas orales
Vehículos: células enteras LAB
o esporas Bacillus
sobrevivir aparato gastrointestinal
•retención de 2 a 3 días
•Vehículo de baja inmunogenicidad
•propiedades adyuvantes
•Sistemas genéticos (Food-Grade)
•No necesita aislamiento y purificación del antígeno
•producción IgA
•administración fácil, evita uso agujas
VACUNAS COMESTIBLES
Sandra Ruzal CTBT 2013
Experimental