CAPITULO II
METODOLOGÍA EXPERIMENTAL
En este capítulo describiremos las propiedades y características de las
moléculas utilizadas en este trabajo de tesis, así como el método de preparación
de los liposomas y las técnicas utilizadas para su caracterización.
2.1 MATERIAL 2.1.1 Moléculas Utilizadas. 2.1.1.1 Fosfolípido
El fosfolípido utilizado para la formación de los liposomas es el 1-Stearoyl-2-
oleoyl phosphatidylserine (SOPS) un fosfolípido natural comprado en Avanti polar
lipids con las siguientes propiedades:
Peso molecular: 812.05 gr/mol
Pureza > 99%
Disuelto en cloroformo
2.1.1.2 Agua
El agua utilizada para la preparación de las soluciones es agua ultrapura
tipo millipore Milli-Q.
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2.1.1.3 Soluciones 2.1.1.3.1 Sales
Las sales utilizadas para el estudio del efecto en la forma y el tamaño de las
estructuras liposomales se presentan en la tabla I:
Tabla I. Concentración de sales monovalentes (NaCl, KCl) y divalentes (MgCl2 y
CaCl2) utilizadas en los experimentos.
2.1.1.3.2 Glucosa y Sacarosa
Las concentraciones de las soluciones de glucosa y sacarosa, que se
utilizan para el proceso de re-hidratación de la película de fosfolípido, se presentan
a continuación en la Tabla II.
Tabla II. Concentración de las soluciones de glucosa y sacarosa.
Las concentraciones de glucosa, sacarosa y soluciones salinas se
determinaron experimentalmente con un Osmomolarímetro modelo 3320.
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2.1.1.4 Polielectrolitos
Entre los pares de polielectrolitos de mayor y ampliamente estudiados en
muchos tópicos de multicapas de polielectrolitos y capsulas, se encuentran el
sulfonato de Poliestireno por sus siglas en ingles (PSS) cargado negativamente, e
hidrocloruro polialiamina (PAH) cargado positivamente (Fig.7).
Fig. 7 Monómeros de los polielectrolitos PSS y PAH
Estos son polímeros sintéticos donde el PAH tiene como contraión el Cl- y el
PSS tiene como contraión el Na+. La carga total de PSS no es afectado con los
cambios de pH en la solución. Por otro lado, algunos trabajos han mostrado que el
pH afecta el grado de protonación de PAH, es decir la densidad de carga del
polielectrolito, típicamente tiene una constante de disociación (Pka o Pkb) en el
rango de 2-10, lo que lleva a una disociación parcial protónica a pH intermedios
(densidad de carga parcial del polielectrolito). Por lo tanto, estos tipos de
polielectrolitos, llamados polielectrolitos débiles (weak polyelectrolyte), no son
totalmente cargados en la solución, y más aun su carga fraccional puede ser
modificada cambiando el pH en la solución, (Márquez-Beltrán, C., 2004).
En este trabajo de tesis, se seleccionan ambos polielectrolitos para analizar
su interacción con las vesículas creadas en el laboratorio, con el objeto de
observar los cambios morfológicos de las vesículas, así como estudiar la
adsorción de estos polielectrolitos en las membranas fosfolipídicas.
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2.2 MÉTODO DE PREPARACIÓN
El método utilizado para la formación de liposomas es el de re-hidratación
de una película de fosfolípido. A continuación se presentan los diferentes tipos de
experimentos que se llevaron a cabo, mediante las técnicas de Microscopía
Óptica, Dispersión Dinámica de Luz y Microscopía Electrónica de Criofractura.
2.2.1 Microscopía Óptica. 2.2.1.1 Experimentos sin Sal
El primer tipo de experimento que se realizó fue para formar liposomas con
SOPS. Comenzamos colocando 5 µl de SOPS en un desecador a vacío, durante
aproximadamente 3 h, obteniendo una película de fosfolípido seca. Después se
hidrata la película de fosfolípido con 100 µl de glucosa 200 mOsm/kg y 100 µl de
sacarosa 200 mOsm/kg, agitando solo un poco. Una vez realizada la hidratación,
tomamos 50 µl de analito y lo colocamos en un portamuestra. Finalmente lo
cubrimos con un cubre muestra, para ser observado en el microscopio óptico.
2.2.1.2 Experimentos con Sal
El segundo tipo de experimento que se realizó fue para estudiar el efecto de
las sales en los liposomas de SOPS. Comenzamos secando 5 µl de SOPS
durante aproximadamente 3 h en un desecador a vacío, obteniendo una película
de fosfolípido seca. A continuación se hidrata la película de fosfolípido con 100 µl
de glucosa 200 mOsm/kg y 100 µl de sacarosa 200 mOsm/kg. De igual manera
que en el experimento anterior agitamos solo un poco. Después de esto
agregamos 30 µl de solución salina. Luego, tomamos 50 µl de analito y lo
colocamos en un portamuestra. Finalmente lo cubrimos con un cubre muestra,
para ser observado en el microscopio óptico.
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Las soluciones salinas utilizadas para este tipo de experimento son cuatro:
a) Cloruro de sodio
b) Cloruro de potasio
c) Cloruro de magnesio
d) Cloruro de calcio
2.2.1.3 Experimentos con Polielectrolitos
El tercer tipo de experimento fue para analizar el efecto del polielectrolito
PAH en los liposomas de SOPS. Comenzamos secando 5 µl de SOPS durante
aproximadamente 3 h en un desecador a vacío; obteniendo una película de
fosfolípido seca. Después se hidrata la película de fosfolípido con 100 µl de
Glucosa 200 mOsm/kg y 100 µl de sacarosa 200 mOsm/kg, de igual manera que
en el experimento anterior agitamos solo un poco. Después de esto agregamos 30
µl de solución salina, luego tomamos 50 µl de analito y lo colocamos en un
portamuestra. Finalmente lo cubrimos con un cubre muestra, para ser observado
en el microscopio óptico.
2.2.2 Experimentos Mediante DLS
2.2.2.1 Experimentos con Sal
Este tipo de experimentos se realizó para analizar el efecto de las sales
sobre los liposomas formados. Comenzamos secando 6 µl de SOPS durante
aproximadamente 3 h en un desecador a vacío, obteniendo una película de
fosfolípido seca. Una vez hidratada la película de fosfolípido con 100 µl de glucosa
200 mOsm/kg y 100 µl de sacarosa 200 mOsm/kg, agitamos solo un poco.
Después de esto agregamos 30 µl de solución salina, luego agregamos 900 µl de
glucosa y 900 µl de sacarosa. Después la muestra se somete a sonicación
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durante un tiempo 5 min. Para finalizar el experimento la muestra es colocada en
contenedor del equipo de DLS y así mismo analizada.
Este tipo de experimento se llevó a cabo con 4 diferentes soluciones
poliméricas:
a) PAH (Poly (alyamine- chloridric acid) 1000ppm
b) PSS (Poly (steryren 4-sulfonate) 1000ppm
c) Complejo PAH-PSS-NaCl 400 ppm PSS, 2500 ppm PAH, 0.1M NaCl
d) Complejo PAH-PSS-NaCl 500 ppm PSS, 2500 ppm PAH, 0.1M NaCl
2.2.2.2 Experimentos con Polielectrolitos
Este tipo de experimentos se realizó para observar el efecto de los
polielectrolitos sobre los liposomas formados. Comenzamos secando 6 µl de
SOPS durante aproximadamente 3 h en un desecador a vacío; obteniendo una
película de fosfolípido seca. Después hidratamos la película de fosfolípido con 100
µl de Glucosa 200 mOsm/kg y 100 µl de sacarosa 200 mOsm/kg y de igual
manera que en los experimentos anteriores agitamos solo un poco. Después de
esto agregamos 20 µl de solución polimérica, 900 µl de glucosa y 900 µl de
sacarosa. Una vez preparada la muestra se somete a sonicación durante un
tiempo de 5 min. Finalizamos el experimento analizando la muestra con la técnica
de DLS.
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2.2.3 Experimentos Mediante Microscopía Electrónica de Criofractura 2.2.3.1 Experimentos con Polielectrolitos
La formación de los liposomas se realiza exactamente igual que en los
experimentos descritos para la técnica de microscopía óptica.
Primeramente secamos 5 µl de SOPS durante aproximadamente 3 h en un
desecador a vacío. Transcurrido ese tiempo se hidrata la película de fosfolípido
seca con 100 µl de Glucosa 200 mOsm/kg y 100 µl de sacarosa 200 mOsm/kg,
agitamos solo un poco, y agregamos 30 µl de solución polimérica. Volvemos a
agitar solo un poco y tomamos una gota de la muestra para después colocarla en
el portamuestra especial para el equipo de criofractura.
Antes de introducir la muestra al equipo de criofractura, la gota es
previamente congelada en nitrógeno líquido. Una vez en el equipo la gota ya
congelada, se fractura manualmente con una navaja la cual esta
aproximadamente a una T = -170° C.
Una vez fracturada la gota, la superficie es cubierta con un material
metálico, en nuestro caso Platino y Carbono. Esta cubierta metálica nos da una
réplica de la superficie. Posteriormente la réplica se observa en el microscopio
electrónico de transferencia, y se capturan las imágenes de la misma.
Las muestras analizadas en esta técnica son solo para el sistema de
Liposomas SOPS- Polielectrolito (PAH a diferentes concentraciones).
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2.3 TECNICAS EXPERIMENTALES
2.3.1. Microscopia Óptica
Esta técnica se utilizó para observar los liposomas formados y poder
estimar el número de agregados presentes en la muestra, así como determinar los
diámetros de los agregados obtenidos. Se utilizó un microscopio óptico del tipo
Olympus IX71 (Fig.9).
El microscopio óptico utiliza la luz visible para crear una imagen aumentada
del objeto. El más simple es la lente convexa doble con una distancia focal corta.
Estas lentes pueden aumentar un objeto hasta 15 veces. Por lo general, se utilizan
microscopios compuestos, que disponen de varias lentes con las que se
consiguen aumentos mayores. El microscopio compuesto consiste en dos
sistemas de lentes, el objetivo y el ocular, montados en extremos opuestos de un
tubo cerrado ((Fig. 8). El objetivo está compuesto de varias lentes que crean una
imagen real aumentada del objeto examinado. Las lentes de los microscopios
están dispuestas de forma que el objetivo se encuentre en el punto focal del
ocular. Cuando se mira a través del ocular se ve una imagen virtual aumentada de
la imagen real. El aumento total del microscopio depende de las distancias focales
de los dos sistemas de lentes.
Las muestras que se examinan con un microscopio, son transparentes y se
observan con una luz que los atraviesa; se suelen colocar sobre un rectángulo fino
de vidrio. El soporte tiene un orificio por el que pasa la luz. Bajo el soporte se
encuentra un espejo que refleja la luz para que atraviese la muestra. El
microscopio puede contar con una fuente de luz eléctrica que dirige la luz a través
de la muestra. La resolución del microscopio óptico puede estar limitada a 0.2 µm.
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Fig.8. Partes del microscopio óptico
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Fig.9. Microscopio óptico utilizado para observar los liposomas.
2.3.2 Dispersión Dinámica de Luz (DLS)
La dispersión dinámica de la Luz es una de las técnicas más usadas para
determinar algunos parámetros físicos como el coeficiente de difusión, radio
hidrodinámico, radio de giro y polidispersión de partículas o agregados en
suspensión [Pécora, R, 1985].
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Fig.10. Esquema experimental del equipo de dispersión dinámica de la luz.
La técnica consiste en hacer incidir un haz de radiación con longitud de
onda λ y vector de onda ( 2 /q π λ= ) en una suspensión con partículas en
movimiento. Al interactuar la radiación con las partículas una parte de la energía
es absorbida, otra es transmitida sin modificación del vector de onda incidente y
otra es dispersada en todo el espacio. La luz dispersada a un cierto ángulo θ es
colectada por un detector (fotomultiplicador). Estudiando la dispersión de la
muestra en función del vector de onda de difusión 4 ( / 2)q senπ θλ
= (suponiendo
que la energía incidente es igual a la energía transmitida) y correlacionando las
intensidades de dispersión a diferentes tiempos se puede construir la función de
correlación. Dependiendo del tipo de partículas o estructuras presentes en la
muestra, dicha función de correlación puede ser ajustada por un modelo físico
para determinar el coeficiente de difusión, la distribución de tamaños y la
polidispersión. Para partículas esféricas monodispersas y el vector de onda q , la
función de correlación puede ser ajustada por una función exponencial simple 2
( ) Dq tG t A Be−= + . Donde A y B son parámetros de ajuste y D es el coeficiente de
difusión. En la práctica, la función de correlación está normalizada y el
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experimento puede considerarse confiable si se tiene bien definida la línea base y
la intensidad de dispersión fluctúa alrededor de un valor medio.
En términos generales todos los equipos de dispersión de luz contienen los
mismos componentes como son: una fuente de radiación, un detector situado al
ángulo de dispersión y un correlador (Fig.10).
Esta técnica fue utilizada para estudiar la distribución de tamaños de los
liposomas con sales y polielectrolitos. El equipo utilizado es el tipo ALV/DLS/SLS-
5022F (Fig.11), funcionando con un laser de longitud de onda de 653 m. El
sistema de enfriamiento consiste de un contenedor cilíndrico de cuarzo donde se
deposita el tubo con la muestra, el cual se encuentra inmerso en un baño con
tolueno.
Fig. 11. Equipo de DLS (visto desde varios ángulos) utilizado en los experimentos
realizados para el estudio de la distribución de tamaños de los liposomas puros,
con sal y con polielectrolitos.
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2.3.3 Microscopia Electrónica de Criofractura.
La técnica de Microscopia Electrónica de criofractura, ha sido un método
muy popular en biología de membranas durante varias décadas y ha sido de gran
valor, en el estudio de los detalles estructurales de dispersiones lipídicas en
medio acuoso. La técnica de microscopía electrónica de criofractura da
información sobre características que no pueden ser detectadas por otras
técnicas. Esto se debe a que la técnica provee una visualización directa de la
estructura molecular, más que información promediada surgiendo
simultáneamente de algún lugar de la muestra. Esta técnica se divide en dos
partes; primeramente se realiza la criofractura y una vez obtenida la réplica de la
muestra, se obtiene la información mediante microscopía electrónica.
2.3.3.1 Criofractura
En la técnica de criofractura existen tres pasos importantes que pueden
considerarse esenciales en el método:
a) Rápido congelamiento de la muestra,
b) Fracturación
c) Sombreado y replicación.
En el primer paso, la muestra es enfriada muy rápidamente en nitrógeno
líquido para preservar las estructuras moleculares. En el segundo paso del
procedimiento, el espécimen es fracturado bajo alto vacío para evitar problemas
de contaminación (principalmente agua) que puede llevar a una falsa replicación
de las caras fracturadas.
En el último paso, el espécimen fracturado es replicado sombreando con
platino/carbono, seguido de sombreado de carbono para asegurar la estabilidad
mecánica de la réplica para su subsecuente microscopia electrónica. La réplica
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limpiada es inerte al rayo electrónico, así que se excluyen artefactos o estructuras
inducidas por el daño del rayo electrónico. La resolución del método está
determinada por el tamaño del grano de platino que es alrededor de 30 Å.
a) b)
Fig.12. a) Equipo de criofractura utilizado en los experimentos b) zoom en la
sección del equipo donde se realiza la fractura de muestra ya congelada, y se
deposita el platino y el carbono.
a) b)
Fig. 13. a) Microscopio donde es visualizada la réplica de la muestra b) Viales
con las muestras de los liposomas con polielectrolitos a diferentes diluciones
utilizados en los experimentos de microscopia electrónica de criofractura.
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2.3.3.2 Microscopia Electrónica de Transmisión
Ésta técnica se rige bajo los mismos principios que la microscopía óptica,
solo que la luz se sustituye por un haz de electrones que pasan por un tubo (para
mejorar el paso de los electrones, en el tubo se ha hecho el vacío). Permite la
observación de las estructuras interiores de las células.
El haz de electrones es lanzado por un cañón en el que se establece una
diferencia de potencial, entre el cátodo y el ánodo. El chorro de electrones pasa a
través de la muestra a observar, la cual está colocada en una rejilla (d < 1 mm).
Los electrones chocan con la muestra y se desvían, y estas desviaciones son
recogidas por la pantalla. La imagen se observa a través de una pantalla que es
excitada por los electrones que llegan a ella (mecanismo parecido a la televisión).
Las imágenes las recogemos mediante una placa fotográfica que es impresionada
directamente por los electrones.
Los electrones tienen poco poder de penetración en el medio normal, por lo
que para permitir/facilitar su desplazamiento, hay que realizar vacío en el tubo a
través del que se desplazan. Existen electroimanes que dirigen la dirección del
haz. El equipo utilizado se describe en la Fig.14.
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Fig.14. Microscopio electrónico de transmisión marca JEOL-JEM2010F utilizado
para el estudio de las muestras preparadas por criofractura.
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