Caracterización del
transcriptoma de
parásitos helmintos
Cecilia Fernández
Estudios genómicos en parásitos
Biología básica Identificación/desarrollo de productos
control (drogas, vacunas)diagnóstico (Ag)
Objetivos
Dificultades
Los parásitos no son organismos ‘modelos’ Las especies relevantes son diversas
Análisis del genomaProtozoariosAnálisis del transcriptoma Helmintos
Estrategias “clásicas”
Desarrollos tecnológicos:secuenciación, (bio)informática
Tomado de: ‘Molecular Biology of the Cell’ Alberts y col, 3a Ed, 1994 (Fig 7.24)
Clonas genómicas vs clonas de ADNc
Tomado de: ‘Molecular Biology of the Cell’ Alberts y col, 3a Ed, 1994 (Fig 7.24)
• contienen UTRs 5’ y 3’• incluyen información de ARNnc (que no codifican para proteínas)
• no contienen intrones• frecuencia
nivel de transcripción
Estudios genómicos en parásitos helmintos
Los helmintos son organismos que causan infecciones crónicas, con alta prevalencia en todo el mundo
Importancia
Dificultades
Poseen genomas grandes (108 pb/102
Mb) Las especies relevantes son diversas
Proyectos EST: Secuenciación sistemática
de ADNc seleccionados al azar de genotecas de diferentes estadios
• Nematodos ~ 550,000 ESTs (excl.C. el.) • Trematodos • Algunos cestodos
Datos dbEST (NCBI), 11/09
Estrategia
~ 450,000 ESTs
Ensamblaje (‘clustering’) y análisis de ESTsTomado de Parkinson y Blaxter (2004) Methods in Mol Biol 270: 93-126
‘Genoma parcial’ del organismo
Los helmintos…Nematodos y Platelmintos (Cestodos y Trematodos)
integran grupos distintos de metazoarios
Protostomados
Deuterostomados
Lofotrocozoarios
Ecdisozoarios
Tomado de Balavoine G. ‘Evolution and development of protostomes’
Anelids
Estudios genómicos en “helmintos” de vida libre (organismos modelos)
Genomas de:
● NematodoCaenorhabditis elegans (1997) - http://www.wormbase.org
(Caenorhabditis spp. 4 especies adicionales)
● Platelminto - Turbelario
Schmidtea mediterranea (2008) - http://smedgd.neuro.utah.edu
Estudios genómicos en parásitos helmintos
Genomas de:
● NematodosBrugia malayi y Meloidogyne spp.
- 1a versión terminada y publicada (2007 y 2008)
● Platelmintos
Trematodos
Schistosoma mansoni y S. japonicum - 1a versión terminada y publicada (2009)
Cestodos
Echinococcus multilocularis y Taenia solium- en proceso de ensamblaje
Estudios genómicos en parásitos helmintos
Draft completed
Tomado de Brindley et al. PLoS NTD, 2009
Estudios genómicos en nematodos
http://www.nematode.net
Ver también Martin et al (2009) NAR
NEMBASE:base de datos de ESTs de Nematodos
http://www.nematodes.org
Tomado de: Parkinson et al (2004) NAR 32: D427-D430
Tomado de: Mitreva et al. Trends in Genetics 21(10): 573-81, 2005
Genómica y/otranscriptómic
a de nematodos
Filogenia (ARNr 18S) especies con proyecto EST (‘genoma parcial’) y/o proyecto genoma (*)
Tomado de: Parkinson y col. Nature Genetics 36(12): 1259-67, 2004
Secuencias predichas de “genomas parciales” vs proteoma de C. elegans
C. elegans:20,000 genes (12,000 flías) 22,000 polipéptidos
Otros: 30 especies (28 parásitos)~ 93,000 “genes” (60,000 flías)(> 250,000 ESTs)
‘Espacio génico’ del phylum Nematodos
• 50% sin homólogos fuera del phylum Nematodos• 15% en todos los grupos de nematodos:
la mayoría (90%) con homólogos fuera del phylum
~ 1,300 específicos de nematodos
Tomado de: Parkinson y col. Nature Genetics 36(12): 1259-67, 2004
C. elegans
Aunque poseen un plano corporal uniforme…
• los nematodos son extraordinariamente diversos
• el genoma de C. elegans representa una porción pequeña del espacio génico del phylum
Algunos genes identificados a partir de ESTs
• poseen ortólogos fuera del phylum
• no están presentes en el genoma de C.
elegans
• genes perdidos en la evolución del linaje de C.
elegans
• genes asociados con el parasitismo (?)
Tomado de: Aboobaker y Blaxter, Current Biology 13: 37-40, 2003
El complejo de genes Hox en la evolución de los nematodos
Genes asociados con el parasitismo: ‘factores de virulencia’ adquiridos por transferencia
horizontal
Meloidogyne spp. (parásitos de las raíces de plantas) habrían adquirido 12 genes de bacterias del suelo por transferencia horizontal (HGT)
Varios genes habrían sido “donados” por rizobios (bacterias fijadoras de nitrógeno en nódulos en raíces de
leguminosas) con los que estos nematodos comparten
. el nicho. los mecanismos de interacción con la
planta
Tomado de: Mitreva et al. TIG 21(10): 573-81, 2005
NodL: N-acetil transferasa que participa en la síntesis del factor Nod,
glicolípido involucrado en el intercambio de señales entre la bacteria y la planta
Incongruencia entre las filogenias del gen y de la especie
Caracterización del transcriptoma de Ancylostoma caninum
Tomado de: Wang y col. BMC Genomics 211:307, 2010
La comparación revela que: • el transcriptoma de los nematodos es diverso (tanto A. caninum como C. elegans integran el Clado V)
• existirían genes “relacionados con el parasitismo”(A. caninum (Clado V) y B. malayi (Clado III) integran clados distintos)
Análisis del transcriptoma de trematodos
S. mansoniS. japonicum
El transcriptoma de S. mansoniNúmero de secuencias
Total de secuencias 163,586
Total de secuencias analizadas Adultos Huevos Miracidios B. Germinales Cercarias Esquistosómulas (7 días)
33,18019,07718,63816,71510,01427,016
124,640
Tamaño promedio de ESTs (pb) 385
Total de SmAEs SmAEs con más de una EST (‘contigs’) SmAEs con una EST (‘singlets’)
12,32218,666
30,988
Tamaño promedio de un contig (pb) 505
SmAEs de secuencias conocidas de S. mansoni Genes conocidos (GenBank) ESTs conocidas (dbEST)
639 (2%)6,447 (21%)
7086 (23%)
SmAEs de genes nuevos de S. mansoni Similares a proteínas de S. mansoni (nuevos parálogos) Similares a genes de otros organismos (nuevos ortólogos) Sin similitud con otros genes (función desconocida)
449 (1%)6,274 (20%)17,179 (55%)
23,902 (77%)
Total de genes (estimado) 13,960-14,200
Tomado de: Verjovski-Almeida et al . 2003
Assembled S. mansoni EST sequences
S. mansoni EST Genome Project
http://bioinfo.iq.usp.br/schisto/
‘Otras estrategias’ / Desarrollos futuros
Genotecas enriquecidas en tipos particulares de ADNc
• normalizadas y sustraídas enriquecidas en genes poco expresados [hasta 50% - 15,000 – 20,000 ARNm de célula somática típica]
• de expresión diferencialenriquecidas en genes expresados
diferencialmente
Genotecas enriquecidas en ADNc completos
Análisis del transcriptoma sin clonar (RNA Seq)
Desafíos de la era ‘post-genómica’...
• interpretar el genoma (ADN) y el transcriptoma (ADNc derivados de genes expresados en distintos estadios) junto con estudios de las proteínas expresadas (proteoma) y vías metabólicas (metaboloma) de los organismos
• comparar estos procesos fisiológicos con los de los hospederos para contribuir al desarrollo de nuevas estrategias de control de las parasitosis
Bibliografía
• Brindley et al (2009) Helminth genomics: the implications for human health. PLoS NTD
3(10):e538
Una revisión actualizada a 2009 de los proyectos genoma y transcriptoma de helmintos patógenos del
hombre.
• Parkinson et al (2004) A transcriptomic analysis of the phylum Nematoda. Nat Genet
36(12):1259
Una estudio global del transcriptoma de 30 especies de nematodos, incluyendo 28 parásitos.
• Mitreva et al (2005) Comparative genomics of nematodes. Trends in genetics 21(10): 573
Otra revisión que enfatiza la idea de diversidad molecular del Phylum; incluye las evidencias de adquisición
de genes de bacterias fijadoras de nitrógeno por transferencia horizontal por parte de los nematodos de
plantas.
• Wang et al (2010) Characterizing Ancylostoma caninum transcriptome and nematode
diversity. BMC Genomics 11:307
Caracterización muy completa del transcriptoma de un helminto, utilizando tanto estrategias de generación
de ESTs “clásicas” como con las nuevas herramientas de secuenciación.
• Verjovski-Almeida et al (2003) Transcriptome analysis of the acoelomate human parasite
Schistosoma mansoni. Nat Genet 35(2):148
• Hu et al (2003) Evolutionary and biomedical implications of a Schistosoma japonicum
complementary DNA resource. Nat Genet 35(2):139
Artículos que describen análisis exhaustivos del transcriptoma de dos especies de Schistosoma, ambas
patógenas del hombre.
• Parkinson & Blaxter (2004) Expressed sequence tags: analysis and annotation. Methods Mol
Biol 270: 93
Capítulo de un volumen de protocolos experimentales que describe una plataforma de herramientas para el
análisis de ESTs.