Buscandoelmecanismoylavelocidaddereacciónconlaciné3caenzimá3ca
Laciné(caenzimá(casirvepara:
•Determinarlasafinidadesdefijacióndesustratoseinhibidoresdeunaenzima.
•Si conocemos la forma en que varía la velocidad de reacción(además de otra información), se puede elucidar elmecanismocatalí(codelaenzima.
•Conocerelpapeldelaenzimaenunprocesometabólicoglobal.
•Casi siempre, la velocidad de la reacción es proporcional a lacan(dad de enzima presente, por lo que las determinacionesenzimá(cassebasanenestudiosciné(cos.
DeduciendoelmodelodeMichaelis‐Menten
LeonorMichaelis MaudMenten
Análisisdeloscomponentesdeunareacciónenzimá3ca
Seconsideraqueelsustratoestáenexcesoconrespectoalaenzima.
Estadoestacionario.Premisamás
importanteenelmodelode
MichaelisMenten
Lafasetransitoriaoestadopre‐
estacionario,seencuentradentrode
losprimerosmomentosdereacción
EnestaetapalaconcentracióndeESaumenta
Elefectodelaconcentracióndesustratosobrelavelocidaddereacciónseexplicaconlaecuaciónde
Michaelis‐Menten
Enzimasaturada.TodaenformaES
Hipérbolarectangular
KM=Vmax/2
Ejey=Velocidadinicial(Vo).Antesdequeel10%delSseconviertaenP.
Ejex=[S]
(Vo)
Nisiquieraa10KMseob(eneunvalorcerterodeVmáx.
Saturacióndeunaenzimaporsusustrato
Baja[S]50%[S]oKmAlta,saturante[S]oVmax(TodoenES)
Linearizandolagráficahiperbólicacondoblesrecíprocos…
EcuacióndeLineweaver‐Burk
Vo=VelocidadinicialVmáx=Velocidadmáxima[S]=ConcentracióndesustratoKm=ConstantedeMichaelis
GráficadeLineweaver‐Burk
y = m x + b
Ecuaciónde la recta
Significadodelosparámetrosciné3cos
Laconcentracióndesustratoalaquelavelocidaddereaccióneslamitaddelamáxima.
Esunamedidadelaafinidaddelaenzimaporelsustrato.
UnaenzimaconunKMpequeñolograunaeficeinciacatalí(caaltaaunaconcentracióndesustratopequeña.
KMVmáx
KM=Vmax/2
Cuandolaenzimaestácompletamentesaturada
CuandopredominalaformaES
Cuandose(enenALTAS[S],osea[S]>>Km,Vo=Vmáx
Constantecatalí3caonúmeroderecambio.Númerodemoléculasdesustratoquesontransformadasporunamoléculadeenzimaporunidadde(empo.Medidadeeficienciacatalí3ca.
kcat KM
Parámetroquepermitecompararlaseficienciascatalí3casdelasrxs
Constantedeespecificidad
ValoresdeKM,kcatykcat/KMdealgunasenzimasysustratos
Inhibiciónenzimá3ca:Reducciónenlaac3vidadcatalí3cadelaenzima
Inhibición
Irreversible
Reversible
Modificaciónirreversibledelaenzima.UniónCOVALENTEdelinhibidoralosaminoácidosdelaenzima(si(oac(vo).
Unión NO COVALENTE del inhibidor al si(oac(vooaotro si(ode laenzima, limitandoasísucapacidaddecatalizarunareacción.
La ac(vidad enzimá(ca se restaura cuando elinhibidoresremovidodelmedio.
InhibiciónReversible
•COMPETITIVA•NOCOMPETITIVA(MIXTA)•ACOMPETITIVA
Inhibicióncompe33va
Inhibidorcompe33vo.Sustanciaquecompitedirectamenteconunsustratonormalporunsi(odefijaciónenzimá(co.Separecealsustratopuessefijaalsi(oac(voperodifiereenquenoesreac(vo.
Reducela[E]libredisponibleparalafijacióndelsustrato.Noproduc(vo
GráficadeMichaelis‐Mentenenpresenciadeuninhibidorcompe33vo
Donde:
αKm= Km aparente
GráficadeLineweaver‐Burkenpresenciadeuninhibidorcompe33vo
y = m x + b
-1/Km
•LaKmaumentaporelfactorα.SenecesitamayorconcentracióndesustratoparaalcanzarVmax/2
•Unacan(dadaltadesustratopuededesplazaralinhibidor,alcanzandolaVmaxnormal
Km aumentaVmax no cambia
Elmalonatoesuninhibidorcompe33vo
Enzima: Succinato deshidrogenasa (SDH)
Inhibiciónnocompe33vao
mixta
•Elinhibidorseuneaunsi(odis(ntodelsi(oac(vodelaenzima,esindependientedelsustrato.
•PuedeunirsetantoalaenzimaEcomoalcomplejoES.
•Laconformacióndelaenzimacambiayseafectaunpasocatalí(coquedisminuyeoeliminalaac(vidad.
Noproduc(vos
GráficadeMichaelis‐Mentenenpresenciadeuninhibidornocompe33vo
Donde:
GráficadeLineweaver‐Burkenpresenciadeuninhibidornocompe33voomixto
y = m x + b
VmaxdisminuyeKmNOcambia
•Elinhibidornoafectalaunióndelsustrato.LaKmnocambia.•Inac(vaalaenzima,unavezqueseuneaellayformaelcomplejoEI•MientrasmásEIseforme,menosESsetendráydisminuirálaVmax.
Inhibiciónacompe33va(incompe33va,uncompe33ve)
Elinhibidoracompe((voseunedirectamentealcomplejoenzima‐sustratoperonoalaenzimalibre,porloquelaunióndelsustratoesindispensableparalaunióndelinhibidor.
Noproduc(vo
GráficadeMichaelis‐Mentenenpresenciadeuninhibidoracompe33vo
[S]
Vo
+ inhibidor
Control
Vmax /2
Km
Donde:
GráficadeLineweaver‐Burkenpresenciadeuninhibidoracompe33vo(incompe33vo)
y = m x + b
•Enaltas[S],Voesaprox.Vmax/α’.•PorlotantoesteinhibidordisminuyeVmax•LaKmaparentedisminuye.
VmaxdisminuyeKmdisminuye
Ejemplodeinhibidoracompe33vo:Inhibicióndelafosfatasaalcalinaporfenilalanina
•Catalizalaliberacióndefosfatoinorgánicoapar(rdeésteresdefosfato.•Involucradaenladeposicióndehidroxiapa(taencélulasosteoidesdurantelaformacióndehueso.•Esunmarcadorclínico:SuaumentopuedesercausadeenfermedadóseadePaget,hepa((s,etc.
Noolvidesladiferencia!Inhibidorcompe33vovs.nocompe33vo
ResumendelcambiodelosparámetrosdeMichaelis‐Mentenendiferentes3posdeinhibición
Resumendelefectodelosinhibidores