Reacción en cadena de la polimerasa
Biología Molecular, Bioquímica 2016
Ivana Kraiselburd
Clase PCR II
PCR: es una técnica para amplificar ácidos nucleicos in vitro,
que permite la obtención de grandes cantidades de un
fragmento específico de DNA a partir de un molde complejo
El ADN de interés es amplificado exponencialmente mediante
la síntesis enzimática dirigida por una DNA polimerasa
termoestable cebada por 2 oligonucleótidos cebadores (o
primers) y por el agregado de desoxirribonucleótidos
trifosfatos (dNTPs)
Etapas de cada ciclo de la PCRDesnaturalización: el ADN doble hebra se separa en dos hebras a altas temperaturas
(94-95ºC, durante 45 s-1 min). Depende del contenido de GC del molde y su longitud
Hibridación de los cebadores a la zona específica de cada una de las hebras por
complementariedad de bases. Temperaturas más bajas (55-65º C, durante 30 seg-
1min). T y t dependen de las características particulares de los cebadores utilizados
Elongación o extensión del cebador por la DNA polimerasa, la cual cataliza la
incorporación de desoxirribonucleótidos siguiendo la cadena molde en la dirección 5´-3´.
Esta etapa será realizada a la temperatura óptima de reacción de la ADN polimerasa
(72°C para la Taq polimerasa). Los tiempos dependerán de la prosesividad de la enzima
y de la longitud del fragmento a amplificar
Sensibilidad: cantidad mínima de DNA necesaria para que se
produzca la amplificación, es decir, para obtener un producto (banda en
gel). Se relaciona con los falsos negativos, ya que puede ocurrir que
una muestra sea positiva pero sea dada como negativa porque no se
ha amplificado por no tener suficiente cantidad de DNA
Especificidad: se refiere a la obtención de un solo producto
amplificado. Viene determinada por los oligos y la especificidad con la
que se unen al DNA molde. De esta forma, si los oligos tienen más de
un sitio al que se pueden unir aparecerá más de un producto
amplificado
Eficiencia- rendimiento: se refiere a la amplificación máxima que se
puede obtener en un número determinado de ciclos
Fidelidad: se refiere a los errores que comete la DNA polimerasa
durante la amplificación. Este concepto es de especial importancia en la
secuenciación, pero en otros casos no es tan importante. Una buena
fidelidad permite evitar falsos positivos y/o negativos
Conceptos de la PCR
Sensibilidad• N° de moléculas blanco presentes en la muestra• Complejidad de las secuencias blancoSensibilidad• Diseño del Primer• Enzima• Optimización de la Reacción• Concentración de Magnesio• Formulación del Buffer • Temperatura de AnilladoEspecificidad-Fidelidad• T° de anillado (compromiso)• Número de ciclos• Concentración de Magnesio• Concentración y balance de Nucleótidos dNTPs (10-50 M)• Elección de la Enzima• Concentración de Primers-cebadores suficientemente alta para la unión rápida al DNA blanco
Componentes esenciales de la PCR estándar
DNA polimerasa termoestable
Oligonucleótidos iniciadores (primers o cebadores)
Cationes divalentes: Mg2+ (MgCl2)
Buffer (para mantener el pH de la enzima)
DNA molde
Desoxirribonucleótidos trifosfatos dNTPs: se deben
utilizar soluciones equimoleculares de los
desoxirribonucleótidos dATP, dGTP, dCTP y dTTP
H2O de alta calidad (doble destilada estéril o MiliQ).
Cationes monovalentes
Co-Solventes: estabilizan la enzima, influencia la
procesividad y/o la Tm.
DNA polimerasas termoestables
Llevan a cabo la síntesis de DNA dependiente del molde
Diferentes orígenes:Taq Thermus aquaticus, Pwo Pyrococcus
woesei, Pfu Pyrococcus furiosus, Tli Thermococcus littoralis
Estabilidad: Taq 9 min a 97°C (40 min a 95 °C), Pwo >2 hr a
100°C
Procesividad: número promedio de nucleótidos añadidos a la
cadena de ADN que se sintetiza, antes de separarse de la
cadena molde
Fidelidad: frecuencia de incorporación de un nucleótido
equivocado (depende MgCl2, dNTPs, pH, daño térmico, etc).
Fidelidad: Taq baja; Pfu alta; Pfx alta
Actividad correctora (proofreading, exonucleasa 3’-5’) y/o
reparadora (exonucleasa 5’-3’)
Taq Stoffel Vent Pfu
Fuente Thermus
aquaticus
Taq truncada
sin exo 5´-3´
Thermococus
litoralis
Pirococus
furiosus
Peso
molecular
94 kDa 61 kDa ? 92kDa
Velocidad
Procesividad
75nt/s + 50nt/s + 80nt/s 60 nt/s
Vida ½ (95°C) 40 min 90 min 360 min + 2h
Exo 5´-3´ SI NO SI
Exo 3´-5´ NO NO SI SI
Mg2+ óptima 1,5 mM 3 mM 2 mM 1,5-2 mM
KCl óptima 50 mM 10 mM 10 mM 10 mM
Características de algunas DNA polimerasas
termoestables
Taq polimerasa
Aislada de Thermus aquaticus
Fidelidad baja
Tasa de error total para la Taq polimerasa: introducción de
errores de aproximadamente 1 cada 9.000 nucleótidos
No posee actividad 3´-5´ exonucleasa
Alta procesividad
Es muy importante determinar la concentración adecuada de la
taq polimerasa en la PCR (0.5 y 2.5 U por reacción)
Presenta actividad transferasa terminal en el extremo 3´
(agrega una A al extremo 3´, especialmente si en el extremo
hay una C). Pfu, Pwo y Tli generan extremos romos
DNA molde Puede ser ssDNA o dsDNA (simple o doble cadena)
En general se utilizan cantidades que van desde 10 a 500 ng
dependiendo de la naturaleza de la secuencia a amplificar, ADN
genómico (1-100 ng) o plasmídico (2-10 ng), representación del gen
de interés en el genoma, etc
Usualmente se utilizan varios miles de copias, ej: 1µg de humano, 10
ng de levadura, 1 ng de bacteriano
DNA circular cerrado es levemente menos efectivo que el DNA lineal
Se puede amplificar a partir de una sola molécula de DNA molde,
pero las condiciones deben estar muy optimizadas
Debe estar completamente desnaturalizado (etapa previa)
Calidad del molde (integridad: no fragmentado en trozos más
pequeños de lo que queremos amplificar; proceso de extracción:
que la muestra no presente agentes que inhiban a la actividad de la
polimerasa como trazas de fenol o alcoholes o quelantes como EDTA
que reducen la concentración de iones de Mg en la solución)
Oligonucleótidos iniciadores (primers,
cebadores)
Dos oligonucleótidos cebadores simple hebra
complementarios a los extremos de la secuencia que se
desea amplificar
Presentan entre 18-25 nt de longitud
Se conoce su secuencia
Es el factor más importante para la eficiencia y la
especificidad del proceso
Deben estar presentes en exceso (1013= 30 ciclos, 1kb)
comparado con el DNA molde
Requieren de un cuidadoso diseño
Solución stock 10 µM, se usan 0,1-1 µM final en cantidad
equimolar de cada oligonucleótido
Diseño de cebadores
Manual o por programas de bioinformática
Complementarios a la secuencia deseada
Secuencia del oligo: contenido de GC entre 45-55%
Tamaño estándar: 18 a 25 nt
Extremos 3´ de los oligos quedan enfrentados y deben estar
bien apareados
Evitar formación de estructuras secundarias: dímeros,
autocomplementariedad (palíndromos o largos segmentos de
polipurinas y polimirimidinas) e intercomplementariedad
Agregado de linkers o sitios de restricción
Diseño de cebadores
Consideraciones sobre la Tmelting y Tannealing
Temperatura de melting o fusión es la temperatura a la que la mitad
de los oligos se encuentran hibridados y la mitad se encuentran
como simple hebra. A mayor contenido GC más alta Tm
Si los primers se encuentran mal apareados, la amplificación será
menos eficiente o puede no funcionar. Los cebadores con Tm más
altas pueden aparearse inespecíficamente a temperaturas más
bajas y el cebador con la Tm más baja puede no aparearse a
temperaturas más altas
Solamente se puede programar una temperatura en el termociclador
o equipo de PCR. Si los cebadores poseen diferentes Tm se elige
como Tannealing la más baja
Las temperaturas de melting de los oligonucleótidos pueden ser
estimadas usando la fórmula de Wallace:
Tm = 2(A+T) + 4(G+C)
Ta = Tm- 4
(válida para oligos entre 18-25 bases de rango, sino se usan
fórmulas más complejas)
Reglas de diseño:
• Longitud= 18-25bp
• Contenido de GC entre 45-55%
• Ambos cebadores deben tener Tm similares (no mas de 5 ºC de
diferencia entre ambos)
• Evitar las secuencias repetidas. No deberían presentar
estructuras secundarias
Diseño de cebadores
Evitar secuencias repetidas
5´-NNNNNNNNNNNNNNNTATA-3´
5´-NNNNNNNNNNNNNNNTATA-3´
5´- NNNNNNNNNNNNNNNTATA-3´
3´-ATATNNNNNNNNNNNNNNN-5´
1. Caso de extremos 3´ repetidos
5´ 3´
3´ 5´
5´ 3´
3´ 5´Dímero del primer
PCR
Evitar secuencias repetidas
5´-TATANNNNNNNNNNNNNNN-3´
5´-TATANNNNNNNNNNNNNNN-3´
5´- TATANNNNNNNNNNNNNNN-3´
3´-NNNNNNNNNNNNNNNATAT-5´
5´ 3´
3´ 5´
PCR
5´ 3´
3´ 5´No hay extensión
2. Caso de extremos 5´ repetidos
Evitar secuencias repetidas
5´-NNNNNNNNNNNNNNNGCATGC-3´
5´-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3´
5´-NNNNNNNNNNNNNNNGCA3´-CGT
3´ 5´
5´ 3´
PCR
5´ 3´
3´- Productos de PCR
no deseados
3. Caso de formación de horquillas
Temperatura y tiempo de anillado
Rango estándar: entre 50°C - 65°C, 10-120 s
Mejoras en la especificidad:
• Incrementar la temperatura de anillado (incrementos de 2°-5°C
son recomendados) puesto que reduce las posibilidades de
priming no específico y por lo tanto la formación de producto no
específico
• Reducir los tiempos de anillado. Durante el anillado, los primers
se hibridan rápidamente. Tiempos muy largos no mejoran
normalmente la producción y pueden producir un aumento en
el apareamiento inespecífico y así mayores cantidades de
productos no específicos
Estrategias para lograr una selectiva amplificación en los
primeros ciclos evitando el apareamiento inespecífico
Hot start disminuye la inespecificidad causada por el anillado y la
elongación a bajas T° (agregado de la enzima taq polimerasa o el
Mg2+ a altas T°). Exclusión de un reactivo (dNTPs, taq, Mg2+, primers)
de la mezcla de reacción hasta que la reacción llega a la temperatura
de desnaturalización del ciclo 94 °C
También puede ser con anti-Taq (inhibe la actividad de la Taq
polimerasa hasta la etapa de desnaturalización)
Touchdown PCR (TD-PCR). Es una modificación de la PCR en la
cual la temperatura de anillado inicial es mayor que la Tm óptima de
los primers y la Ta es gradualmente reducida en los subsiguientes
ciclos hasta que la Ta óptima es alcanzada. Una reducción gradual
de la temperatura hasta una temperatura más permisiva durante el
curso de los ciclos favorece la amplificación del fragmento deseado
Iones Mg2+
Cofactor requerido para las DNA polimerasas
Estabiliza el DNA de doble cadena y eleva la Tm, es importante para
controlar la especificidad de la reacción
Mg2+ bajo, apareamiento más estricto. Pero muy pocos iones Mg2+
producen un bajo rendimiento de producto de PCR
Mg2+ alto, aumenta el rendimiento de los productos pero favorece la
inespecificidad promoviendo la incorporación errónea
Exceso de Mg2+ reduce la fidelidad de las DNA polimerasas y puede
causar la generación de productos no deseados (en un gel aparecen
como una escalera)
Los dNTPs secuestran iones Mg2+ (un cambio importante en la
concentración de dNTPs en el buffer puede requerir el ajuste de la
concentración de Mg2+ en la mezcla de reacción)
EDTA en el molde puede afectar la concentración de Mg2+ libre. La
Taq polimerasa requiere Mg2+ libre para su actividad
Concentración de Magnesio
Se utiliza en una concentración entre 1 y 4 mM
La concentración de magnesio afecta los siguientes procesos:
hibridación de los cebadores, temperatura de desnaturalización,
especificidad del producto, formación de dímeros entre cebadores
y la actividad y fidelidad enzimática
Alto Mg2+: alto rendimiento; productos inespecíficos
Bajo Mg2+: bajo rendimiento; alta especificidad
Mejorar la especificidad: disminuir la concentración. Cuidado:
concentraciones inadecuadas de Mg2+ pueden dar lugar a un
más bajo rendimiento
Mejorar la eficiencia: aumentar la concentración. Cuidado:
exceso de Mg2+ tiende a causar reacciones no específicas
dNTPs Las concentraciones de los 4 desoxinucleótidos trifosfato (dATP,
dCTP, dTTP, dGTP) deben ser iguales de modo que ocurra la
incorporación exacta (si un dNTP está en una concentración más
alta que otro será incorporado preferencialmente)
Rango estándar de concentración: 20-200 µM
Las concentraciones de dNTPs utilizados en una reacción son
determinados por la afinidad de la enzima por el sustrato (la Km de la
enzima). Usar concentraciones mayores que la Km (Km para los
dNTPs 10-15 µM)
Se preparan soluciones stock (5-10mM) que contienen cantidades
equimoleculares de los dNTPs
La concentración de dNTPs óptima depende de:
Longitud del producto (200 µM puede alcanzar a sintetizar 12,5 µg DNA
de 400 bp)
MgCl2
Astringencia (exigencias impuestas por el sistema, rigurosidad)
dNTPs
Mejorar la eficiencia: para secuencias molde largas, incrementar la
cantidad de dNTPs
Mejorar la fidelidad: bajar la concentración dNTPs pero tener en
cuenta la concentración de Mg2+ que debe ser disminuida en una
proporción equimolar (cambio en su concentración afecta la
concentración de Mg2+ disponible ya que el Mg2+ forma un complejo
soluble con los dNTPs)
Mejorar la especificidad: reducir la concentración de dNTP pero
observar que la concentración de Mg2+ se debe bajar en una
proporción equimolar
Alto dNTPs baja fidelidad alto rendimiento
Bajo dNTPs alta fidelidad bajo rendimiento
Proporciona las condiciones de reacción, que son importantes para la
actividad de la enzima
Por lo general está formado por:
10 mM tris-HCl (pH=8.4)
50 mM KCl
1.5 mM MgCl2
Adyuvantes o aditivos: pueden ayudar en la práctica a aumentar la
especificidad y fidelidad de la reacción en cadena de la polimerasa. El
dimetilsulfóxido (DMSO) añadido al buffer de la reacción en un 10%
contribuye a la disminución de la estructura secundaria del ADN.
También se pueden usar detergentes como el tween 20, laureth 12
(0.1%) o Tritón x10, que ayudan a estabilizar la enzima. Existen
también protocolos que incorporan polietilenglicol (PEG), glicerol,
formamida, albúmina sérica bovina (BSA), etc, aunque no son
imprescindibles
Agua de buena calidad (destilada, desionizada y estéril o agua
milliQ) para completar el volumen final de la reacción
Buffer de Reacción
Número de ciclos
Rango Estándar: 25-40 ciclos
Se necesitan >25 ciclos para amplificar un gen de copia única a
partir de DNA genómico de mamífero
Pocos ciclos: bajan el rendimiento
Muchos ciclos: aumentan la inespecificidad
Algunos componentes se tornan limitantes después de 30 ciclos
El efecto plateau favorece las amplificaciones inespecíficas por
lo que incrementar el n° de ciclos no incrementa la especificidad o
la eficiencia
Mayor a 40 ciclos: se aumenta cantidad y complejidad de los
productos no específicos.
Mejorar la especificidad: Reducir el número de ciclos
Ejemplo de un protocolo de PCR
COMPONENTE VOLUMEN (µL) CONCENTRACIÓN FINAL
Agua autoclavada y ultra filtrada (pH 7) 20,7
10X Buffer de PCR 2,5 1X
Mezcla dNTPs (25mM de cada nucleótido) 0,2 200 µM (cada nucleótido)
Mezcla de primers (25 pmoles/µL cada uno) 0,4 0,4 µM (cada primer)
Taq DNA polimerasa (10U/ µL) 0,2 2 U totales en 25 µL
Molde DNA genómico (100 ng/ µL) 1 100 ng totales en 25 µL
c.s.p. 25
2’ 95 oC
30x 30’’ 94 oC
30’’ 65 oC
2’ 72 oC
10’ 72 oC
Cebadores
Enzima,
longitud
producto
Molde
Detección y Análisis de los resultados
Línea 1: fragmento de PCR de aproximadamente 1850 pares de bases
de longitud. Línea 2 y 4: los fragmentos son de aproximadamente 800
bases de longitud. Línea 3: no hay producto formado, la PCR falló.
Línea 5: múltiples bandas son formadas a causa de que uno de los
primers se unió a diferentes regiones del molde de DNA.
PCR es una técnica muy sensible: evitar contaminaciones, ya que es
posible que cantidades traza de ADN contaminante sirvan de ADN molde
(producto no deseado, falsos positivos)
1. Contaminación por arrastre de ADN diana amplificado en PCR anteriores
2. Contaminación cruzada entre muestras, lo que supone la transferencia de
ADN diana de una muestra a otra
3. ADN genómico de preparados de muestras anteriores
Normas que ayudan a evitar las contaminaciones:
• Zonas de trabajo exclusivas para PCR, dotadas de su propio material,
separadas de los pasos anteriores (extracción de ADN genómico, etc) y
posteriores (corrida electroforética de los productos)
• Uso de guantes por el manipulador
• Utilización de reactivos y tubos estériles
• Cuidado en pipeteo del ADN (evitarse la formación de aerosoles)
• Las mesas y estantes se lavados periódicamente con lavandina al 10 %,
seguida de etanol al 70 % y de ser posible tratadas con luz UV
• Preparación de la mezcla para la PCR (mezcla maestra)
• Controles: negativo (todos los componentes de la reacción excepto el ADN
molde); positivo (material que se haya utilizado con éxito en PCR anteriores)
Consideraciones prácticas importantes
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Introducir sitios de restricción mediante PCRUno distinto en cada extremo: clonado direccional. Ventaja: no se puede ligar sobre sí
mismo y entra en la orientación correcta.
Hay dos formas de introducir sitios: 1) agregar el sitio en el 5’ del primer o 2) agregarlo
internamente introduciendo mismatch.
1) Introducir un sitio BamHI (GGATCC) en el 5’ del primer
Secuencia del gen: 5’ CTTCTGCACACAACTGATGTTCACTAGCAACCTC 3’
Primer directo o forward:
5’ GCGGATCCCTTCTGCACACAACTG 3’ 24 nt Tm1= 48= Ta1= 44
Tm2= 76 Ta2=72
Tm1= sólo con la parte que hibrida inicialmente; Tm2= con el oligo completo
Anillado de la PCR: primeros 5-10 ciclos a 44º, siguientes a 72º
2) Interno: secuencia del gen: 5’ CTTCTGCACACAACTGATGTTCACTAGCAACCTC 3’
GgA t cC
Primer directo: 5’ CTTCTGGATCCAACTGATG TTCAC 3’
Restar 4º por cada mismatch
Tm= 70 Ta= 70 – 12= 58º Hacer la PCR completa con esta temperatura
Sambrook & Russel - Molecular Cloning - Vol. 1, 2, 3 - 3rd edition
– Chapter 8, 8.1-8.126, c2000 CSHL Press
PCR: Clinical Diagnostics and Research, Rolfs, Schuller, Finckh
and Weber-Rolfs, Chapter 1: PCR Principles and Reaction
Components, Pag. 1-21, Springer-Verlag.
Bibliografía