COLEGIO DE POSTGRADUADOS
INSTITUCIÓN DE ENSEÑANZA E INVESTIGACIÓN EN CIENCIAS AGRÍCOLAS
CAMPUS MONTECILLO POSTGRADO DE FITOSANIDAD
FITOPATOLOGIA
ETIOLOGÍA DE TRES ENFERMEDADES BACTERIANAS
DE MAÍZ (Zea mays) EN VERACRUZ, MEXICO
ADRIANA ROSALÍA GIJÓN HERNÁNDEZ
T E S I S
PRESENTADA COMO REQUISITO PARCIAL
PARA OBTENER EL GRADO DE:
DOCTORA EN CIENCIAS
MONTECILLO, TEXCOCO, EDO. DE MÉXICO
2009
La presente tesis titulada “ETIOLOGIA DE TRES ENFERMEDADES BACTERIANAS DE MAIZ (Zea mays) EN VERACRUZ, MEXICO” realizada por el alumna ADRIANA ROSALÍA GIJÓN HERNÁNDEZ, bajo la dirección del
Consejo Particular indicado, ha sido aprobada por el mismo y aceptada como requisito parcial para la obtención del grado de:
DOCTORA EN CIENCIAS
FITOSANIDAD
FITOPATOLOGÍA
CONSEJO PARTICULAR
Montecillo, Texcoco, Estado, de México, Agosto 2009.
CONSEJERO:
ASESOR:
ASESOR:
ASESOR:
ASESOR:
ASESOR:
DR. RICARDO QUIROGA MADRIGAL
DEDICATORIA
A Dios por demostrarme tantas veces su existencia y con ello
darme fuerza para salir a delante de cada tropiezo.
A mi mami, hermanos, hermanas, sobrinos, porque siempre
han sido fuente de inspiración en todas las cosas que sueño.
Los amo.
A la familia Solís Gutiérrez, por abrirme las puertas de su
corazón, por darme cariño y apoyo incondicional. Los quiero.
Dios hizo de maíz blanco la carne y huesos del hombre
y de maíz amarillo su sangre.
Leyenda maya
i
AGRADECIMIENTOS
Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT), por otórgame la beca
para mis estudios académicos y económicos durante mis estudios doctorales.
Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) y SAGARPA por otorgarme
los recursos económicos en mi proyecto de postgrado a nivel doctorado.
Al Colegio de Postgraduados en Ciencias Agrícolas por ser la institución formadora
de mi superación profesional.
Un especial agradecimiento al Dr. Daniel Téliz Ortiz, por aceptarme para realizar esta
tesis doctoral bajo su dirección. Su apoyo y confianza en mi trabajo y su capacidad
para guiar mis ideas han sido un aporte invaluable, no solamente en el desarrollo de
esta tesis, sino también en mi formación como investigadora.
A los integrantes de mi Consejo Particular: Dr. Daniel Téliz Ortiz, Dr. Rodolfo de la Torre Almaraz, Dr. Carlos de León, Dra. Elizabeth Cárdenas Soriano y Dr. Antonio Mora Aguilera, gracias por su disponibilidad y paciencia, por compartir conmigo sus valiosos conocimientos y no cabe duda que su participación han enriquecido el trabajo realizado y, además, ha significado el surgimiento de una sólida amistad.
A mis profesores y profesoras de fitopatología por guiar mis pasos durante mi estancia doctoral y sobre todo por sus valiosas enseñanzas. A todos ellos gracias. Al Dr. Francisco Osorio Acosta del Colegio de Postgraduados, Campus Veracruz, por todo el apoyo proporcionado para la realización de esta investigación. Ing. Teresa de Jesús Soto Poblete del Comité Estatal de Sanidad Vegetal de Veracruz, por su valioso apoyo en los recorridos de campo.
Al Departamento de Parasitología Agrícola de la Universidad Autónoma Chapingo, por las facilidades para realizar parte de esta investigación en el Laboratorio de Biología Molecular y en el área de invernaderos. Al M.C. Dimas Mejía Sánchez, por sus valiosas aportaciones en la parte de Técnicas moleculares y por demostrarme su amistad incondicional. Al M.C. Juventino Cuevas Ojeda, por su apoyo incondicional y amistad
A Mario Salazar, por su asesoria en los trabajos realizados en el área de virus.
ii
Al al Dr. Daniel Ochoa y Dr. Cristian Nava, por el apoyo y por haber sido parte de mi jurado examinador. A la familia Mata Ortega, por su apoyo incondicional y por su amistad Ing. Salim Rodríguez Salomón del IRPAT, por el tiempo brindado para la conclusión de este trabajo. Ing. Romeo Esponda Gálvez del IRPAT, por el tiempo otorgado y apoyo incondicional para concluir la tesis.
A mis amigos y a migas, los que han pasado y los que han quedado, porque todos
ustedes han sido parte aguas en mi vida y me han enseñado el verdadero valor de la
amistad, gracias: Patricia Rincon, Omar Pérez, Victor Arreola, Ma. Eugenia Cisneros,
Anayanci Sánchez, Camilo Hérnandez, Susana Isabel Robles, Leonides Rosas,
Luciano Martinez, Misael Martinez, Susana Alcántara.
A todos los que en mi cabeza no puedo extraer de mi memoria esta noche.
Detrás de cada línea de llegada, hay una departida. Detrás de cada logro, hay otro desafío. Si extrañas lo que hacías, vuelve a hacerlo. Sigue aunque todos esperen que abandones. No dejes que se oxide el hierro que hay en ti.
ii
iii
CONTENIDO Página
Dedicatoria y agradecimientos i
Contenido iv
Lista de figuras ix
Lista de cuadros xi
INTRODUCCION GENERAL 1
Literatura citada 6
CAPITULO I. BANDEADO DE LAS HOJAS Y PUDRICION DEL TALLO
CAUSADO POR Burkholderia gladioli, UNA NUEVA ENFERMEDAD
DE MAÍZ EN MÉXICO
8
1.1.Resumen 8
1.2.Abstract 9
1.3.Introducción 10
1.4. Materiales y métodos 10
1.4. 1. Muestreo 10
1.4.2. Aislamiento de la bacteria 11
1.4.3. Patogenicidad de los aislamientos 11
1.4.3.1. Reacción de hipersensibilidad en tabaco 12
1.4.4. Caracterización e identificación del patógeno 12
4.4.1. Caracterización fenotípica 12
1.4.5. Caracterización molecular 13
1.4.5.1. Reacción en cadena de la polimerasa 13
1.4.5.2. Identificación del género de la bacteria por PCR 13
1.4.5.3.Secuenciación y alineamiento 14
1.4.5.4. PCR especifico para especie 14
1.4.5.5. RFLP 15
1.4.6. Incidencia del bandeado de la hoja y pudrición del tallo de maíz 15
1.4.7. Severidad del bandeado de la hoja y pudrición del tallo de maíz 15
1.5. Resultados 16
1.5. 1. Muestreo 16
1.5.2. Aislamiento de la bacteria 16
1.5.3. Patogenicidad de los aislamientos 16
1.5.3.1. Reacción de hipersensibilidad en tabaco 17
1.5.4. Caracterización e identificación del patógeno 17
1.5.4.1. Caracterización fenotípica 18
1.5.5. Caracterización molecular 18
1.5.5.1. Reacción en cadena de la polimerasa 18
1.5.5.2. Identificación del género de la bacteria por PCR 18
1.5.5.3.Secuenciación y alineamiento 18
iv
1.5.5.4. PCR especifico para especie 19
1.5.5.5. RFLP 20
1.5.6. Incidencia del bandeado de la hoja y pudrición del tallo de maíz 20
1.5.7. Severidad del bandeado de la hoja y pudrición del tallo de maíz 21
1.6. Discusión 22
1.7. Conclusiones 24
1.8. Literatura citada 31
CAPITULO II. MANCHA FOLIAR DEL MAÍZ OCASIONADA POR
Pantoea ananatis, EN VERACRUZ, MÉXICO.
33
2.1.Resumen 33
2.2.Abstract 34
1.3.Introducción 35
2.4. Materiales y métodos 35
2.4. 1. Muestreo 35
.4.2. Aislamiento de la bacteria del agente causal 36
2.4.3. Patogenicidad de los aislados 36
2.4.3.1. Reacción de hipersensibilidad en tabaco 37
2.4.4. Caracterización e identificación del patógeno 37
2.4.5. Caracterización molecular 38
2.4.5.1. Reacción en cadena de la polimerasa 38
2.4.5.2. Secuenciación y alineamiento 38
2.4.6. Incidencia de la mancha foliar de maíz 38
2.5. Resultados 39
2.5.1. Muestreo 39
2.5.2. Aislamiento de la bacteria 40
2.5.3. Patogenicidad de los aislados 41
2.5.3.1. Reacción de hipersensibilidad en tabaco 42
2.5.4. Caracterización e identificación del patógeno 43
2.5.5. Caracterización molecular 44
2.5.5.1. Reacción en cadena de la polimerasa 44
2.5.5.2. Secuenciación y alineamiento 44
2.5.6. Incidencia de la mancha foliar de maíz 45
2.6. Discusión 45
2.7. Conclusiones 48
2.8. Literatura citada 54
vi
CAPITULO III. RAYADO FOLIAR DEL MAÍZ CAUSADO POR
Acidovorax avenae subsp avenae EN VERACRUZ, MÉXICO
56
3.1. Resumen 56
3.2. Abstract 57
3.3. Introducción 58
3.4. Materiales y métodos 59
3.4. 1. Colecta de material vegetal 59
3.4.2. Aislamiento 59
3.4.3. Patogenicidad de los aislados 60
2.4.3.1. Reacción de hipersensibilidad en tabaco 60
3.4.4. Caracterización e identificación del patógeno 61
3.4.5. Caracterización molecular 61
3.4.5.1. Extracción de DNA 61
3.4.5.2. Reacción en cadena de la polimerasa 61
…… 3.4.5.3.Secuenciación y alineamiento 62
3.4.6. Incidencia, severidad y distribución del rayado foliar del maíz 62
3.4.6.1. Incidencia 62
3.4.6.2. Distribución y severidad del rayado foliar del maíz 63
3.5. Resultados 64
3.5. 1. Colecta de material vegetal 64
3.5.2. Aislamiento 65
3.5.3. Patogenicidad de los aislados 65
2.5.3.1. Reacción de hipersensibilidad en tabaco 65
3.5.4. Caracterización e identificación del patógeno 65
3.5.5. Caracterización molecular 66
3.5.5.1. Extracción de DNA 66
3.5.5.2. Reacción en cadena de la polimerasa 67
…… 3.5.5.3.Secuenciación y alineamiento 67
3.5.6. Incidencia, severidad y distribución del rayado foliar del maíz 67
3.5.6.1. Incidencia 67
3.5.6.2. Distribución y severidad del rayado foliar del maíz 67
3.6. Discusión 68
3.7. Conclusiones 71
3.8. Literatura citada 78
CONCLUSIONES GENERALES 80
vii
Lista de figuras
Página
Figura 1. Síntomas en plantas de maíz ocasionados por Burkholderia
gladioli en Veracruz, México.
25
Figura 2. Síntomas en plantas de maíz inoculadas en invernadero con
Burkholderia gladioli.
25
Figura. 3. Hipersensibilidad en tabaco. 26
Figura 4. Células bacterianas de Burkholderia gladioli mostrando un solo
flagelo polar y la forma bacilar (25000x).
26
Figura 5. Amplificación del producto de aproximadamente 1600 pb del gen
rDNA 16s de Eubacterias.
27
Figura 6. Amplificación del producto de 500 Pb del gen 16s rDNA de
Burkholderia.
27
Figura 7. Amplificación del producto de 700 Pb del gen 23s rDNA de
Burkholderia gladioli.
28
Figura 8. Productos de PCR 23s después de la digestión con HaeIII. 28
Figura 9. Productos de PCR 23s después de la digestión con TaqI. 29
Figura 10. Incidencia porcentual de Burkholderia gladioli en plantaciones de
maíz del cultivar AS7573.
29
Figura 11. Disminución en el tiempo de la incidencia porcentual de
Burkholderia gladioli en plantaciones de maíz del cultivar
AS7573.
30
Figura 12. Distribución y severidad de Burkholderia gladioli en plantaciones
de maíz del cultivar AS7573.
30
Figura 13. Hoja de maíz con manchas irregulares, blanco-grisáceo y color
rojizo ocasionada por Pantoea.ananatis.
49
Figura 14. Prueba de patogenicidad de cuatro cultivares comerciales de
maíz inoculadas con Pantoea ananatis, aisladas de la var.
AS7573, procedentes de tres municipios de Veracruz, México.
49
Figura. 15. Síntomas en plantas de maíz AS7573 inoculadas con Pantoea
ananatis, procedente de Veracruz, México.
50
Figura 16. Hipersensibilidad en hoja de tabaco (Nicotiana tabacum var
xanthi), mostrando la necrosis ocasionada por Pantoea ananatis
infiltrada en la nervadura central.
51
Figura 17. Respuesta de cuatro cultivares comerciales a la inoculación de
cepas de Pantoea ananatis, proveniente de Veracruz, México.
52
Figura 18. Amplificación del producto de aproximadamente 1600 pb del gen
rDNA 16s de Eubacterias.
53
ix
Figura 19. Disminución en el tiempo de la incidencia porcentual de Pantoea
ananatis en plantaciones de maíz del cultivar AS7573 en los
municipios de Tlalixcoyan, Paso de ovejas y Cosoleacaque
durante los años 2005 al 2007 en Veracruz, México.
53
Figura 20. Ubicación de los sítios de muestreo del rayado foliar del maíz
causado por acidovoax avenae subsp avenae, en tres
municípios de Veracruz, México. 2006-2007.
72
Figura 21. Escala arbitraria de severidad para la evaluación del rayado
foliar del maíz causado por Acidovorax avenae subsp. avenae
en Veracruz, México. 2006-2007.
72
Figura 22. Síntomas en campo del rayado foliar del maíz cv AS7573
causado por acidovorax avenae subsp. avenae.
73
Figura 23. Plantas sintomáticas en un corte transversal mostrando necrosis
vascular, en maíz cv AS7573 causado por acidovorax avenae
subsp. avenae
74
Figura 24. Síntomas desarrollados en pruebas de patogenicidad de
acidovorax avenae subsp avenae en maíz cv AS7573.
74
Figura 25 Extracción de DNA mediante el método AP y PLANT-DNAZOL,
de cepas de acidovoax avenae subsp avenae.
75
Fugura 26 Amplificación del producto de aproximadamente 210pb, con los
iniciadores RST63 y RST64 para el género Acidovorax.
75
Figura 27 Incremento de la incidencia de Acidovorax avenae subs avenae
en plantaciones de maíz del cv AS7573, en tres municipio de
Veracruz, México, del 2006-2007.
76
Figura 28. A) mapa de campo de la distribución y B) mapa tridimensional
de la severidad del rayado foliar del maíz cv AS 7573 causado
por acidovorax avenae subsp avenae. en Tlalixcoyan, Ver. 2006-
2007.
77
Lista de cuadros
Página
Cuadro 1.1. Caracterización molecular por alineamiento de las secuencias
reportadas en el banco de genes del Genbank con las
secuencias de los genes 16s ribosomal RNA de las bacterias
aisladas de plantas de maíz con síntomas de bandeado de la
hoja y pudrición del tallo en Veracruz, México. Año 2007.
19
xi
Cuadro 1.2. Ubicación de 14 parcelas de maíz muestreadas en tres
municipios de Veracruz, México, para la evaluación de la
incidencia y severidad del bandeado de la hoja y pudrición del
tallo. 2005 -2007.
21
Cuadro 2.1. Ubicación de las 14 parcelas de maíz Asgrow 7573 muestreadas
en tres municipios de Veracruz, México para la detección de la
mancha foliar del maíz. 2005-2007.
40
Cuadro 2.2. Cepas bacterianas de aisladas de maíz AS7573 en tres
municipio de Veracruz, México. Período 2005-2007.
41
Cuadro 2.3. Resultados de las pruebas de patogenicidad en cuatro cultivares
comerciales de maíz, inoculados con Pantoea ananatis bajo
invernadero en Chapingo, México. 2007.
42
Cuadro 2.4. Caracterización bioquímica, fisiológica y fenotípica de
aislamientos de Pantoea ananatis procedentes de Veracruz,
México. 2006-2007.
43
Cuadro.2.5. Caracterización molecular por alineamiento de las secuencias
reportadas en el banco de genes con las secuencias de los
genes 16s rDNA de las cepas de Pantoea ananatis aisladas de
hojas de maíz Veracruz, México. 2007.
45
Cuadro 3.1. Ubicación de las parcelas de maíz muestreadas en los
municipios de Veracruz, México para la detección de bacterias
en 2006 -2007.
62
Cuadro 3.2. Caracterización bioquímica y fisiológica de aislamientos de
Acidovorax avenae subsp avenae de maíz cv AS7573 con
síntomas de rayado foliar, procedentes de Veracruz, México.
2006-2007.
66
xii
1
INTRODUCCIÓN GENERAL
El maíz es uno de los principales cereales alimenticios cultivados en el mundo. El maíz
de grano blanco se utiliza en México principalmente para la elaboración de las
tradicionales tortillas y tamales, pero también se puede obtener aceite o en la
fabricación de barnices, pinturas, cauchos artificiales y jabones (Financiera Rural,
2009). El maíz de grano amarillo también se puede utilizar para consumo humano o
para la alimentación del ganado y en la producción de almidones (Financiera Rural,
2009).
El maíz es el cultivo agrícola más importante de México, desde el punto de vista
alimentario, industrial y social. En relación con los demás cereales que se producen en
México (trigo, sorgo, cebada, arroz y avena, principalmente), ha tenido una tasa media
anual de crecimiento de 2.0% de 1996 a 2006 (SIAP, 2007). Se estima que durante
2008, la producción de maíz alcanzó los 25.12 millones de toneladas (Mton) cifra que
representa un incremento del 43.1% a la registrada en el año 2000 (Financiera Rural,
2009). El rendimiento promedio se ubicó en 3.30 ton/ha cifra superior en 34% a la
observada en el año 2000. Durante 2007, el estado de Sinaloa ocupó el primer lugar en
la producción nacional de maíz al producir 5.13 Mton) lo que representa el 22% de la
producción nacional; el rendimiento promedio fue de 8.764 ton/ha, el más alto a nivel
nacional. El estado de Jalisco es el segundo productor con un total de 3.25 (Mton) y un
rendimiento de 5.486 ton/ha. El estado de México ocupo el tercer lugar con una
producción de 2.0 (Mton) y un rendimiento de 3.488 ton/ha.
2
Durante 2007, el 67.7% (8.12 (millones de ha (Mha).) del total de la superficie
sembrada en territorio nacional correspondió al cultivo de maíz, mientras que de la
superficie cosechada representó el 67.5% (7.33 Mha). México participa en la
producción mundial de maíz con 2.86% del total (Financiera Rural, 2009).
La producción de maíz puede ser afectada por enfermedades que reducen la
capacidad de la planta para crecer y producir de manera normal (White, 2004). Las
enfermedades causadas por hongos que afectan al cultivo de maíz incluyen
pudriciones, manchas, marchitez, tizones, mildius, carbones y royas (Shurtleff, 1980.,
De León, 1984., Quiroga, 1995., Zuber et al.,1981). Los virus causan importantes
enfermedades en todo el mundo y algunos están muy distribuidos como el potyvirus del
mosaico enanismo del maíz (MDMV), enanismo clorótico de maíz (MCDV), rhabdovirus
del mosaico del maíz (MMV), moteado clorótico del maíz, rayado fino del maíz y
mosaico del maíz (Games et al., 1979., Bootthroyd and Israel, 1980., Bradfute and Tsai,
1983 y White, 2004). Se han encontrado asociados al maíz nemátodos formadores de
nódulos, como Meloidogyne incognita, M. chitwoodi, M. arenaria, M. javanica, que son
parásitos importantes del maíz en el sudeste de los Estados Unidos y en otras regiones
cálidas del mundo (White, 2004., Windham y Williams, 1987., Santo y O’ Bannon,
1981). También se encuentran los nemátodos de las lesiones como Pratylenchus
hexincisus, P. penetrans, P. zea P. minor, considerados los más importantes, porque
están asociados con las raíces del maíz más que cualquier otro nemátodo parásito y
porque causan pérdidas considerables en la producción (White, 2004., Norton y Hinz,
1976., Tarte, 1971).
3
Las enfermedades bacterianas más importantes en el mundo incluyen a la marchitez
bacteriana causada por Pantoea stewartii (sin. Erwinia stewartii. Smith), que es
frecuentemente cuarentenada por varios países y que ocasiona problemas importantes
en la producción de semillas. Actualmente, más de 50 países exigen certificado
fitosanitario que manifiesten que la semilla importada ha sido cultivada en ausencia de
la enfermedad o que la semilla esté libre de la bacteria (Forgey et al., 1982., De León,
1984., Pataky, 1996., Quiroga, 1995), la marchitez y mancha bacteriana de Goss por
Clavibacter michiganensis subsp. nebraskensis, fue observada en maíz dentado de
Nebraska desde 1969. Las pérdidas de producción pueden sobrepasar el 50% en
híbridos muy susceptibles (White, 2004., Smidt and Vidaver, 1986). Burkholderia
gladioli (anteriormente Pseudomonas gladioli y P. marginata), se describió
primeramente como un patógeno de gladiolos, causando la pudrición de los bulbos de
gladiolo (McCulloch, 1921); otros hospedantes son cebolla, iris, fresia, orquideas, arroz
y maíz (Tsuchiya, 1963., Keith et al., 2005., Lu and Henn, 2007 and., Gijón et al., 2008).
La pudrición suave de la mazorca, causada por Burkholderia gladioli, fue reportada en
Estados Unidos, los síntomas observados en las hojas fueron lesiones irregulares de
aspecto húmedo, las cuales se extendieron hasta 10 cm de diámetro. En la base de las
mazorcas se observó una pudrición de color marrón y su calidad se dañó (Lu and
Henn, 2007). El rayado bacteriano y mancha foliar por Burkholderia andropogonis (Sin.
Pseudomonas andropogonis) (Ullstrup, 1960., White, 2004) en EUA. La podredumbre
del tallo causada por Erwinia chrysanthemi pv. zeae (sin. E. carotovora f. sp. zeae )
(Dickey et al., 1987, De León, 1984., Quiroga, 1995., White, 2004). La marchitez foliar
es una enfermedad que se encuentra distribuida en todo el mundo, el agente causal es
4
Acidovorax avenae subsp. Avenae (sin. Pseudomonas avenae, Pseudomonas
alboprecipitans y Pseudomonas rubrilineans) (Ullasa, 1967, Schaad, 1975., White,
2004); no hay registro de esta enfermedad en México. El bandeado y moteado de la
hoja del sorgo agente causal Herbaspirillum rubrisubalbicans (Sin. Pseudomonas
rubrisubalbicans (Christopher and Edgerton, 1930). Los primeros síntomas de esta
bacteria en hojas de maíz son manchas acuosas y posteriormente bandeado (Hale y
Wilkie, 1972); no hay registro escrito de esta bacteria en México. En Veracruz se ha
registrado la presencia de enfermedades del maíz, destacando el achaparramiento y el
virus del mosaico de la caña de azúcar (Cano et al., 2000). El achaparramiento del
maíz fue identificado por síntomas y molecularmente como el fitoplasma del Maiz
Bushy Stunt en tres municipios de Veracruz (Alcántara, 2009).
Una enfermedad no descrita anteriormente en maíz se presentó durante los ciclos
2003-2004 en tres municipios maiceros importantes en el estado de Veracruz: Paso de
Ovejas, Cosoleacaque y Tlalixcoyan, ocasionando pérdidas estimadas desde 30%
(Chavero, 2004) hasta 70%, estimación de los productores de la región. Los síntomas
se observaron inicialmente en el cultivar comercial de maíz elotero Asgrow-7573
(AS7573); en hojas se observó amarillamiento, enrojecimiento, quemado y manchas,
falta de fecundación, proliferación de mazorcas, pudrición de mazorcas y granos vanos.
En tallo se observó una pudrición semiacuosa en la corona y necrosis en la base de la
mazorca y retraso en su desarrollo. Inicialmente se consideró que el fitoplasma del
achaparramiento del maíz podría estar involucrado. El laboratorio de diagnostico
fitosanitario Latex en Veracruz, reportó a la bacteria Herbaspirillum rubrisubalbicans
(sin. Pseudomonas rubrisubalbicans) como agente causal del problema, diagnostico
5
que confirmó el Centro Nacional de referencia de Sanidad Vegetal en la ciudad de
México. Los síntomas antes mencionados y la agresividad de la enfermedad no se
habían reportado con anterioridad, y la etiología de la enfermedad permanecía
indefinida. Por la reciente aparición de ésta enfermedad y por su importancia
socioeconómica en la región el objetivo de esta investigación fue determinar la etiología
y biología de esta nueva enfermedad. Para lograr este objetivo la investigación se
dividió en tres etapas, según los síntomas observados: I. Determinar la distribución y
etiología del bandeado de las hojas y pudrición del tallo. II. Distribución y etiología de la
mancha foliar del maíz. III. Distribución y etiología del rayado foliar del maíz.
6
LITERATURA CITADA
Alcántara, M. S. 2009. Detección e incidencia del fitoplasma Maize Bushy Stunt y su
relación con el rendimiento en el maíz en el estado de Veracruz, México.Tesis
maestria en ciencias, Colegio de Postgraduados, Montecillo,Texcoco. 36p.
Boothroyd, C. W., and Israel, H. W. 1980. A new mosaic disease of corn. Plant Dis. 64:
218-219.
Bradfute, O. E., and Tsai, J.H. 1983. Identification of maize mosaic virus in Florida.
Plant Dis. 67:1339-1342.
Cano, R. O., Sierra, M., Jeffers, D., Tosquy, O. H., Palafox, C.A., y Preciado, R.E. 2000.
Respuesta de híbridos de maíz QPM y normales a infestación con Dalbulus
maydis vector del achaparramiento del maíz. In: Memorias de la XIII Reunión
Científica Tecnológica Veracruz 2000, s/p.
Chavero, J. J. 2004. Control químico in vitro de la bacteriosis del maíz (Herbaspirillum
rubrisubalbicans). Tesis de licenciatura, departamento de Fitotecnia. Universidad
Autónoma Chapingo. 75 p.
Christopher, W. N., and Edgerton C. W. 1930. Bacterial stripe diseases of sugarcane in
Louisiana. J. Agric. Res. 41:259-267.
Claflin, L. E, Ramundo, B. A, Leach, J. E., and Erinle I. D, 1989. Pseudomonas avenae,
causal agent of bacterial leaf stripe of pearl millet. Plant Dis. 73:1010-1014.
De León, C. 1984. Enfermedades del Maíz. Una guía para su identificación en el
campo. Centro Int. de Mejoramiento de Maíz y Trigo, CIMMYT. 3a Edición. 114
p.
Dickey, R. S., Clafin, E., and Zumoff, C. H. 1987. Erwinia chrysanthemi: Serological
comparisons of strains from Zea mays and other hosts. Phytopathology 77:426-
430.
Financiera rural. 2009. Monografía del maíz grano. Dirección general adjunta de
planeación estratégica y análisis sectorial. www.financierarural.gob.mx.
Información verificada el 1 de junio de 2009.
Forgey, W. M., Blanco, M. H., Darrah, L. L., and Zuber, M. S. 1982. Prediction of
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66:1159-1162.
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Games, R., Kitajima, E. W., and Lin, M. T. 1979. The geographical distribution of maize
rayado fino virus. Plant Dis. 63: 830-833.
Hale, C.N., and Wilkie, J. P. 1972. Bacterial leaf stripe of sorghum in New Zealand
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8
CAPITULO I
BANDEADO DE LAS HOJAS Y PUDRICION DEL TALLO CAUSADO POR
Burkholderia gladioli, UNA NUEVA ENFERMEDAD DE MAÍZ EN MÉXICO
1.1. RESUMEN
Una enfermedad no reportada previamente en siembras comerciales de maíz se
presentó en los municipios de Cosoleacaque, Tlalixcoyan y Paso de Ovejas, Veracruz,
México, durante los ciclos de cultivo 2003-2004. La enfermedad se caracterizó por
manchas acuosas, blanco-amarillentas en las hojas, que al coalescer formaron franjas
longitudinales de 0.3 cm de ancho y 8 cm de largo y algunas de las hojas se tornaron
de color rojizo. La hoja bandera se enrolló y mostró una pudrición semiacuosa. El tallo
desarrolló una pudrición semiacuosa en la corona. En la base de la mazorca se
observaron necrosis y detención del desarrollo. Los síntomas inicialmente se
observaron en el cultivar comercial de maíz elotero AS7573. De forma constante, se
aisló de las plantas enfermas de maíz una bacteria, de forma bacilar, aeróbica, Gram
negativa, color blanco, convexas, de borde liso, húmedas, brillantes, que secretaron un
pigmento difusible amarillo en medio B de King. Las bacterias aisladas de las lesiones
fueron identificadas usando pruebas fisiológicas, bioquímicas convencionales y
confirmadas mediante la amplificación por PCR y secuenciación de un fragmento del
rDNA comprendido entre los genes 16s and 23s. La bacteria fue identificada como
Burkholderia gladioli. Este es el primer reporte de B. gladioli causando bandeado y
pudrición del tallo del maíz en México.
Palabra clave: Zea mays, PCR, bacteria.
9
1.1. ABSTRACT
A maize disease epidemy appeared in commercial maize plantings in Cosoleacaque,
Tlalixcoyan and Paso de Ovejas counties, in the state of Veracruz, Mexico in 2003-
2004. Symptoms on leaves were small white-yellow watery spots which coalesced into
dry necrotic stripes 0.3 cm wide and 8 cm long. Some of the infected leaves turned red.
The flag leaf developed rot and necrosis at the basis, inward rolling and dried out. Stem
crown rot and necrosis at the basis of the ears were also observed. These symptoms
were initially observed in the cultivar AS7573 commercial maize plantings. A bacterium
was consistently isolated from diseased maize plants and was characterized by round
white colonies Gram negative, aerobic, rod-shape, opaque, colonies with entire margins
on casaaminoacid peptone and glucose (CPG) media. On B King, the isolates produced
yellow, nonmucoid colonies, with the majority of the strains secreting a diffusible yellow
pigment in the media. The bacterium identity was confirmed by PCR amplification and
sequencing of 16S and 23s genes rDNA fragment. The bacterium was identified as
Burkholderia gladioli. This is the first report of B. gladioli causing leaf stripes and stem
rot of maize in Mexico.
Additional keyword: Zea mays, PCR, bacteria
10
1.3. INTRODUCCION
Una enfermedad no descrita anteriormente en maíz se presentó durante los ciclos
2003-2004, en Paso de Ovejas, Cosoleacaque y Tlalixcoyan, tres municipios maiceros
importantes en el estado de Veracruz, ocasionando pérdidas en la producción
estimadas desde 30% (Chavero, 2004) hasta 70%, según algunos productores. Los
síntomas se observaron inicialmente en el cultivar de maíz elotero AS7573. En hojas,
los síntomas iniciaron como manchas pequeñas acuosas, blanco-amarillo, que al
coalescer formaron franjas longitudinales y algunas de las hojas se tornaron de color
rojizo. Una pudrición semiacuosa y necrosis en la corona del tallo y en la base de los
elotes y retraso en el desarrollo indicaron la posibilidad de una etiología bacteriana. Los
síntomas antes mencionados y la agresividad de la enfermedad no se conocían en
Veracruz, ni el agente causal. Con anterioridad se habían mencionado como posibles
causantes a una bacteria (Herbaspirillum rubrisubalbicans) (Chavero, 2004), dos virus
(potyvirus y geminivirus) y un fitoplasma. Por la reciente introducción de ésta epidemia
y por su importancia socioeconómica en la región, el objetivo de esta investigación fue
determinar la causa del bandeado de las hojas y pudrición del tallo del maíz.
1.4. MATERIALES Y MÉTODOS
1.4.1. Muestreo
Plantaciones comerciales de maíz AS7573 se muestrearon durante los ciclos
primavera-verano y otoño-inverno de 2005-2007, en los municipios de Cosoleacaque,
Tlalixcoyan y Paso de Ovejas, del estado de Veracruz, México, para un total de 480
muestras que incluyeron hojas, tallos y mazorcas.
11
1.4.2. Aislamiento de la bacteria
El material con síntomas, aparentemente causados por bacterias, fue seccionado y
desinfestado con hipoclorito de sodio al 1% durante 1min, enseguida se lavó tres veces
durante 30 segundos con agua destilada estéril. Se hicieron cortes que se colocaron en
tubos de ensayo con 10 mL de agua estéril y se dejaron reposar durante 10 min. Parte
de la suspensión se sembró por estría cruzada en los medios casaaminoácidos
peptona glucosa (CPG), B de King (BK) y agar nutritivo (AN). Los cultivos fueron
incubados a 28ºC durante 72 h. Las colonias bacterianas individuales fueron
purificadas y almacenadas a -80ºC en glicerol al 15%.
1.4.3. Patogenicidad de los aislamientos
De 480 muestras de hojas y tallos, se obtuvieron 240 aislamientos bacterianos de
morfología constante y única, de los cuales se seleccionaron 10 de ellos al azar para
tipificarlos y probar su patogenicidad. Se usaron 30 plantas sanas de maíz del cultivar
comercial AS7573 de 45 días de edad. El inóculo se obtuvo de un cultivo de la bacteria
cultivada en medio BK a 30ºC durante 48 h, que se resuspendió en 100 mL de solución
estéril de buffer de fosfatos PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM de KCl, 0.01 M Na2HPO4, 1.8
mM de KH2PO4, pH 7.4). La base del tallo de las plantas se inyectó con una suspensión
bacteriana de 1x107 UFC/mL ajustado en un espectrofotómetro (Jenway 6405 UV/vis);
posteriormente las plantas inoculadas se cubrieron con bolsas de plástico y se
mantuvieron en un invernadero a 25-30ºC y 80% HR. Después de 8 días, las bolsas de
plástico se retiraron y las plantas se mantuvieron en el mismo invernadero. Los testigos
se inocularon con agua estéril y se mantuvieron bajo las mismas condiciones. El
desarrollo de los síntomas se observó durante 45 días. La bacteria fue reaislada en
12
medio BK a partir del tejido cercano a las áreas infectadas para confirmar la identidad
del organismo.
1.4.3.1. Reacción de hipersensibilidad en tabaco
Una suspensión bacteriana de 107 UFC/mL, se infiltró en la nervadura central de cinco
hojas de tabaco (Nicotiana tabacum var xanthi). Las dos plantas tratadas se
mantuvieron a 28ºC durante 24 h. Los testigos se infiltraron con agua estéril.
1.4.4. Caracterización e identificación del patógeno
Los 10 aislamientos se caracterizaron mediante la reacción de Gram (Gregersen,
1978), la citocromo oxidasa C (Kovacs, 1956), el metabolismo oxidativo- fermentativo y
la fluorescencia en medio BK (Schaad et al., 2001). Con propósitos comparativos, se
empleo la guía para la identificación de bacterias fitopatógenas (Schaad et al., 2001).
1.4.4.1. Caracterización fenotípica
Los 10 aislamientos bacterianos se sembraron en medio B de King y se incubaron
durante 5 y 7 días a 30°C. Los crecimientos bacterianos se lavaron tres veces con agua
destilada estéril, con pipeta Pasteur se tomó una alicuota del último lavado, se colocó
una gota en un portaobjetos y se mezcló con una gota de ácido fofostúngstico (1% en
agua destilada, pH 6.9). Las rejillas de cobre con membrana se sumergieron por el lado
de la membrana en la mezcla, se secaron en una caja Petri con papel filtro esterilizado
para su almacenamiento. Las células bacterianas se fotografiaron observando las
rejillas al microscopio electrónico de transmisión (modelo Imaging).
13
1.4.5. Caracterización molecular
1.4.5.1. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
El DNA se extrajo con el protocolo comercial Plant DNAZOL® (Invitrogen) de las 10
cepas bacterianas aisladas de tallo y hojas. Los oligonucleótidos bacterianos
específicos para Eubacterias fueron FD1 (5’AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3’) que
corresponde a la posición 8-28 del gen rRNA 16s de E. coli, y el iniciador RD1
(5’AAGGAGGTGATCCAGCC3’) que corresponde a la posición 1526-1542 del gen gyrB
de Xylella fastidiosa y que rinde un fragmento de aproximadamente 1600 Kb. La
amplificación del DNA se desarrolló en una reacción con 25 µL conteniendo 0.2 µM de
cada iniciador, 200 µM dNTP, 1X buffer para PCR, 1.5 mM MgCl2, 2U Taq polimerasa
(todos los reactivos utilizados de Invitrogen) y 10 ng de ADN molde. La PCR consistió
de una desnaturalización inicial de un ciclo de 94 ºC durante 3 min, seguido de 30
ciclos con 94 ºC durante 1 min, 55 ºC por 30 segundos y 72 ºC por 1 min, con una
extensión final de 72 ºC durante 7 min (Rodrígues et al., 2003). Una alicuota de 10 µL
de la reacción fue analizada por electroforesis en un gel de agarosa al 1% a 80 V por
90 min en buffer TBE. El gel se tiñó con bromuro de etidio. Se empleó un marcador
molecular de 100 Pb (Invitrogen).
1.4.5.2. Identificación del género de la bacteria por PCR
La identificación de los 10 aislamientos se confirmó usando los iniciadores RHG-F
(5´GGGATTCATTTCCTTAGTAAC3´) cuya posición es 835-851 del 16S rDNA y RHG-
R (5´GCGATTACTAGCGATTCCAGC3´) cuya posición corresponde a 1324-1345 16S
rDNA, específicos para género (LiPuma et al., 1999). La amplificación se desarrolló en
una reacción de 25 µL conteniendo 0.2 µM de cada iniciador, 200 µM dNTP, 1X buffer
14
de PCR, 1.5 mM MgCl2, 2U Taq polimerasa y 10 ng de ADN molde. La amplificación
se inició con una desnaturalización a 95 ºC durante 3 min, seguido de 35 ciclos con 94
ºC durante 1 min, 55 ºC por 30 segundos y 72 ºC por 2 min, con una extensión final de
72 ºC durante 7 min. Los productos amplificados fueron analizados por electroforesis
como se mencionó anteriormente.
1.4.5.3. Secuenciación y alineamiento
El DNA fue secuenciado en un equipo Genetic Analyzer 3100 (Applied Biosystem
Corp). Las secuencias fueron alineadas y la homología se determinó en el servidor del
National Center of Biological Information (NCBI, 2008).
Una alineación múltiple se construyó usando Clustalx. Un árbol filogenético fue
construido por el método neighbor-joining derivado de las secuencias 16s rDNA, con
10000 repeticiones de bootstrat en el software MEGA 4 (Tamura et al., 2007).
1.4.5.4. PCR especifico para especie
La identificación para especie fue confirmada usando el par de primers LP1
(´5GGGGGGTCCATTGCG´3 cuya posición es 872-886) y LP4 (´5
AGAAGCTCGCGCCACG´3, posición 1523-1508) dirigido a una región específica del
gen rRNA 23S (Whitby et al., 2000). La amplificación se desarrolló en una reacción de
25 µL conteniendo 0.2 µM de cada iniciador, 200 µM dNTP, buffer 1X, MgCl2 1.5 mM,
Taq polimerasa 2U y 10 ng de ADN molde. La amplificación se inició con una
desnaturalización a 95 ºC durante 3 min, seguido de 35 ciclos con 94 ºC durante 1 min,
55 ºC por 30 segundos y 72 ºC por 2 min, con una extensión final de 72 ºC durante 7
15
min. Todos los productos amplificados fueron visualizados por electroforesis como se
mencionó anteriormente.
1.4.5.5. RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)
10 µL del producto de PCR fueron digeridos con las enzimas HaeIII (Roche®), Taq1 y
ApaI (Fermentas®) en un termociclador (Applied Biosystems 2720), utilizando los
programa: HaeIII y ApaI a 37ºC durante 20 h y Taq1 a 65ºC durante 20 h. Los
productos de la digestión fueron analizados en un gel de agarosa al 2%.
1.4.6. Incidencia del bandeado de las hojas y pudrición del tallo de maíz.
La incidencia y severidad del bandeado de las hojas y pudrición del tallo de maíz se
evaluó en 14 parcelas comerciales del cultivar AS7573 en los municipios de Tlalixcoyan
(7 parcelas), Cosoleacaque (9 parcelas) y Paso de Ovejas(1 parcela), Ver. En el centro
de cada parcela se eligieron 25 surcos contínuos y 25 plantas por surco, para un total
de 625 plantas evaluadas. La incidencia se evaluó con 0= ausencia, 1= presencia de la
enfermedad. La incidencia se calculó dividiendo el Número de plantas enfermas entre
el total de las plantas muestreadas y el cociente se multiplicó por cien. Las parcelas
con síntomas fueron georeferenciadas con el sistema de posicionamiento global
(GPS38 Personal Navigator) con el fin de registrar y determinar la distribución de la
enfermedad en la región.
1.4.7. Severidad del bandeado de las hojas y pudrición del tallo de maíz
La severidad de la enfermedad se evaluó con base en una escala desarrollada con
fotografías de 50 plantas completas. Planta sana y valores máximos de severidad
fueron cuidadosamente seleccionados. La escala arbitraria del tejido dañado estuvo
16
conformada de cinco clases: clase 0= 0%, clase 1= 8%, clase 2= 15%, clase 3= 25%,
clase 4= 30% y clase 5= >50 %. Los mapas de distribución y severidad de la bacteria
se generaron con el programa SURFEL®).
1.5. RESULTADOS
1.5.1. Muestreo
De los muestreos realizados en los municipios de Cosoleacaque, Tlalixcoyan y Paso de
Ovejas, Veracruz, se obtuvieron un total de 480 muestras de maíz del cultivar comercial
AS7573. Los síntomas observados en campo fueron manchas acuosas, blanco-
amarillentas en hojas, que al coalescer formaron franjas longitudinales y algunas de las
hojas se tornaron de color rojizo. En tallo, una pudrición semiacuosa en la corona y
necrosis, en la base de la mazorca necrosis y detención del desarrollo (Figura 1A, B y
C).
1.5.2. Aislamiento de la bacteria
De las 480 muestras colectadas, en 240 de ellas se aislaron colonias bacterianas en
los medios BK, AN y CPG de morfología constante y única, de los cuales se
seleccionaron 10 al azar para tipificarlos. Los 10 aislamientos bacterianos
seleccionados se caracterizaron como colonias blancas, convexas, de bordes lisos,
húmedos y brillantes.
1.5.3. Patogenicidad de los aislamientos
Las 30 plantas de maíz de 45 días de edad del cultivar comercial AS7573 infiltradas
con la bacteria en invernadero mostraron síntomas similares a los observados en
campo. Los síntomas en hojas iniciaron 8 h después de la inoculación como manchas
acuosas, blanco-amarillas (Figura 2A). A las 72, h las manchas coalescieron y formaron
17
franjas longitudinales de 0.3 cm de ancho y 8 cm de largo las cuales se necrosaron
(Figura 2B) y algunas hojas se tornaron rojizas. La corona del tallo desarrolló una
pudrición semiacuosa (Figura 2C) y el tallo se necrosó (Figura 2D). La hoja bandera se
enrolló y se necrosó (Figura 2E). La base de la mazorca se necrosó y la mazorca no
desarrolló (Figura 2F). Las plantas testigo permanecieron sanas. Los postulados de
Koch se completaron con el reaislamiento y reidentificación de la bacteria como
Burkholderia gladioli (Schaad et al., 2001).
1.5.3.1. Reacción de hipersensibilidad en tabaco
Las bacterias aisladas de las lesiones de hojas y Tallo en maíz fueron positivas a la
reacción de hipersensibilidad en las cinco hojas de tabaco; sin embargo, su virulencia
fue evidente ya que a las 24 h se presentó una flacidez y necrosis de la lámina foliar
completa y no solo del área infiltrada (Figura 3). Los testigos no presentaron la reacción
de hipersensibilidad.
1.5.4. Caracterización e identificación del patógeno
Las 10 cepas bacterianas seleccionadas para este estudio fueron Gram-negativas,
aeróbicas. En medio BK, las cepas produjeron un pigmento difusible de color verde-
amarillo. Todos los aislamientos mostraron reacción de oxidasa negativa, crecieron a
pH 4.0 y utilizaron glucosa, manitol, arabinosa, trealosa, xilosa, sacarosa, celobiosa y
sorbitol, pero no L-rhamnosa ni maltosa. Ninguna de las cepas produjo indol. La
hidrólisis del almidón, levana, licuefacción de gelatina y reducción de nitratos fueron
positivas. Con base en la morfología, fisiología y características bioquímicas, los 10
aislamientos se identificaron como Burkholderia gladioli (Schaad et al., 2001).
B
18
1.5.4. 1. Caracterización fenotípica
Las células bacterianas presentaron forma bacilar con un flagelo polar, como lo
reportan Schaad et al. (2001) para Burkholderia gladioli. (Figura 4).
1.5.5. Caracterización molecular
1.5.5.1. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
Las 10 cepas bacterianas selecionadas generaron un producto de aproximadamente
1600 pb cuando se amplificaron por PCR con el juego de iniciadores FD1 y RD1, que
amplifican el gen rDNA 16s de Eubacterias (Figura 5). El análisis en BLAST de las 10
secuencias nucleotidicas del gene rDNA 16s de los aislados bacterianos de maíz con
los sintomas bandeado de las hojas y pudrición del tallo mostraron una homologia de
97 % con secuencias de Burkholderia gladioli.
1.5.5.2. PCR para género
La confirmación del género de los aislados que preliminarmente se identificarón como
Burkholderia se realizó con los iniciadores específicos reportados por LiPuma et al.
(1999), amplificando un fragmento de aproximadamente 500pb. No hubo amplificación
con la cepa de Xanthomonas campestris usada como testigo negativo (Figura 6).
1.5.5.3. Secuenciación y alineamiento
La identidad de los aislamientos se confirmó mediante la alineación de las secuencias.
La secuencia de nucleótidos (Acc. No. EU161873 a EU161878 y EU382089 a
EU382092) tuvieron 100% de similitud entre los aislamientos de las tres localidades y
99% de similitud con secuencias de Burkholderia gladioli depositadas en el Genbank
19
(Cuadro 1.1). Los árboles filogenéticos generados a través de las secuencias del RNA
16s indicaron variación en la secuencias de nucleótidos del fragmento amplificado.
Cuadro 1.1. Caracterización molecular por alineamiento de las secuencias reportadas
en el banco de genes del Genbank con las secuencias de los genes 16s rRNA de las
bacterias aisladas de plantas de maíz con síntomas de bandeado de la hoja y pudrición
del tallo en Veracruz, México. Año 2007.
1= Número de nucleótidos amplificado por PCR con los iniciadores RHG-F y RHG-R 2 = Base de datos del NCBI (National Center for Biotechnology Information) 3= Índice de similaridad entre la secuencia de las bacterias aislada y la especie comparada
1.5.5.4. PCR específico para especie
La confirmación de los 10 aislados para la especie gladioli se realizó con los
oligonucleótidos LP1 y LP4 reportados por Whitby et al (2000). Las 10 cepas generaron
un fragmento de aproximadamente 700 pb, el cual coincide con lo reportado por Whitby
et al. (2000) y Keith et al. (2005). No hubo amplificación del fragmento con la cepa
Bacteria aislada Localidad N
1 Num. acc
Banco de Genes
2
Espécie alineada IS
3 Num. acc.
B. gladioli Tlalixcoyan 495 EU161873 B. gladioli 99 EU560426
B. gladioli Tlalixcoyan 493 EU161874 B. gladioli 99 EU090890
B. gladioli Tlalixcoyan 495 EU161875 B. gladioli 99 EU024170
B. gladioli Cosoleacaque 494 EU161876 B. gladioli 99 EU024168
B. gladioli Paso de ovejas 496 EU161877 B. gladioli 99 AY586517
B. gladioli Tlalixcoyan 495 EU161878 B. gladioli 99 EU560426
B. gladioli Paso de ovejas 498 EU382089 B. gladioli 99 EU024170
B. gladioli Tlalixcoyan 498 EU382090 B. gladioli 99 EU560426
B. gladioli Paso de ovejas 493 EU382091 B. gladioli 99 AY268165
B. gladioli Paso de ovejas 494 EU382092 B. gladioli 99 EU560426
20
bacteriana de Xanthomonas campestris usada como testigo negativo (Figura 7). El
análisis del rDNA 16s, rRNA 23 y con iniciadores para dominio, género y especie
confirmaron los resultados morfológicos, fisiológicos y bioquímicos indicando que los
aislamientos fueron de Burkholderia gladioli.
1.5.5.5. RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism).
De los 10 aislamientos en estudio y cuyos productos de amplificación con los
oligonucleótidos RGH-F y RGH-R, se sometieron a digestión con la enzima HaeIII, se
obtuvieron fragmentos de 150, 350, 400 y 500 pb. TaqI generó 3 fragmentos de 150,
300 y 350 (Figura 8 y 9), mientras que ApaI no mostró ningún corte de restricción. Los
patrones de restricción originados por las dos digestiones enzimáticas fueron los
mismos en todas las cepas. Al no obtener diferencias en los patrones de restricción
entre las diferentes cepas se deduce que los sitios de corte de las enzimas utilizadas
están relacionados con regiones conservadas del rDNA 23s.
1.5.6. Incidencia del bandeado de las hojas y pudrición del tallo de maiz
Tlalixcoyan fue el municipio que, en el 2005, presentó mayor incidencia (37.6%),
seguido por Cosoleacaque (17.6%) y Paso de Ovejas (9.76%) (Figura 10 y 11). La
incidencia disminuyó en 2006 a 16.32% en Tlalixcoyan, seguido de 10.72% en
Cosoloacaque y 3.89 % en Paso de Ovejas. La incidencia disminuyó aún más en el
2007, Cosoleacaque 0%, Paso de Ovejas 1.12% y Tlalixcoyan 3.36% (Figura 10 y 11).
Las 14 parcelas muestreadas y georeferenciadas fueron del cultivar comercial AS7573
(Cuadro 1.2).
21
Cuadro 1.2. Ubicación de 14 parcelas de maíz muestreadas en tres municipios de
Veracruz, México, para la evaluación de la incidencia y severidad del bandeado de la
hoja y pudrición del tallo. 2005 -2007.
Clave Municipio Coordenadas Altitud msnm
Ciclo de muestreo
Lat Norte Long Oeste
PCOS1 Cosoleacaque 17.89274 94.63544 21 PV-07 PCOS2 Cosoleacaque 17.89663 94.63498 32 PV-07 PCOS3 Cosoleacaque 17.89242 94.63241 4 PV-07 PCOS4 Cosoleacaque 17.91579 94.62561 11 PV-07 PCOS5 Cosoleacaque 17.89521 94.62979 9 Inv-06 PCOS6 Cosoleacaque 17.89798 94.63171 23 Inv-06 PCOS7 Cosoleacaque 17.89006 94.63934 14 Inv-06 TLAX1 Tlalixcoyan 18.71789 96.12835 9 PV-06 TLAX2 Tlalixcoyan 18.72726 96.11682 24 PV-06 TLAX3 Tlalixcoyan 18.72762 96.11543 21 PV-06 TLAX4 Tlalixcoyan 18.72784 96.11473 22 Inv-06/07 TLAX5 Tlalixcoyan 18.71771 96.12835 12 Inv 06/07 TLAX6 Tlalixcoyan 18.71789 96.11365 8.5 Inv-06/07
PASO1 Paso de Ovejas 19.11247 96.20810 25 OI-06
PV= Primavera-Verano; INV= Invierno; OI= Otoño-Invierno, msnm= Metros sobre nivel del mar
1.5.7. Severidad del bandeado de las hojas y pudrición del tallo de maíz
La distribución espacial de la severidad sugiere el lento desarrollo de focos de
infección. Al inicio de la floración la severidad fue de 30 a 50%. No se observaron
agregados definidos. Los inicios de focos se presentaron en forma aleatoria dentro de
la plantación y en algunos en los márgenes de la parcela. La distribución aleatoria que
presenta la enfermedad sugiere que la fuente de contagio o de inóculo podría ser la
semilla. Los focos marginales no descartan un factor biológico o de manejo en la
dispersión de la enfermedad (Figura 11).
22
1.6. DISCUSION
Esta nueva enfermedad se presentó en forma epidémica en 2003-2004, inicialmente en
siembras de maíz elotero del cultivar comercial AS7573 y causó alarma entre los
productores de los municipios de Tlalixcoyan, Cosoleacaque y Paso de Ovejas,
Veracruz, México. En el presente trabajo, se aisló constantemente de tejidos afectados,
una cepa bacteriana que en medio de cultivo BK, CPG y AN generaron colonias
blanco-grisaceo, convexas, de borde liso, húmedas y brillantes. Los postulados de
Koch se siguieron con 10 cultivos puros seleccionados y los síntomas de las plantas
inoculadas fueron idénticos a los observados en campo. La inoculación artificial de
plantas de tabaco y maíz evidenciaron la alta virulencia de estas cepas, ya que en
tabaco ocasionó la flacidez de la lámina foliar y no solo en la zona infiltrada, lo que
sugiere que la bacteria probablemente tiene la capacidad de desplazamiento inter e
intracelular, posiblemente debido a la presencia de enzimas y/o toxinas de alta
capacidad biodegradante (López, 1994). El análisis del rDNA 16s empleando
iniciadores universales, así como la secuencia parcial de dicha región, confirmaron los
estudios bioquímicos y fisiológicos. El empleo de los iniciadores sugeridos por LiPuma
et al. (1999), aproximó con un 95% de similitud a B. gladioli de todos los aislamientos
analizados. La confirmación definitiva de B. gladioli la soportó el análisis de rDNA 23s
mediante el par de iniciadores LP1 y LP4 (Whitby et al., 2000).
No hay reportes previos en México de B. gladioli en maíz, ni de los síntomas descritos.
En el Estado de Veracruz también se cultiva arroz, sorgo, caña de azúcar que, de
acuerdo con la literatura, son hospedantes de B. gladioli (Hiroyuki et al., 2006.,
McCulloch, 1921). La presencia de esta enfermedad representa un riesgo para dichos
23
cultivos y para hospedantes alternos desconocidos. De acuerdo al analisis de
compararcion nucleotidicas de los tres aislamientos y del patrón electroforético de
restricción indican que esta presente una cepa ampliamente distribuida en las tres
regiones. El análisis de los resultado de detección de la bacteria indicó que se aisló de
cultivares AS7573, no se encontró en criollos y al rededores, probablemente porque fue
introducido por semilla. La adaptabilidad de especies de Burkholderia es en gran parte
desconocida (Keith et al., 2005). La identificación correcta y la determinación de los
factores de virulencia de la bacteria son importantes para la evaluación de riesgo y el
control de la enfermedad en campo (Coenye y Vandamme, 2003). En 2007 la
incidencia del bandeado de las hojas y pudrición del tallo de maíz han disminuido
aproximadamente a un 1%.
A este respecto, se han registrado enfermedades del maíz en diferentes países que
aparecieron alarmantemente y que en poco tiempo desaparecieron. Como ejemplos se
pueden citar casos como el de la roya del maíz causada por Puccinia polysora que en
la década de los 50s se presentó afectando maíces cultivados en Kenia y Tanzania y
que al poco tiempo desapareció (Robinson, 2000., Rhind et al., 1952). Otro caso es el
de la roya común ( Puccinia sorghi) que se presentó en EEUU a inicios de los años
50s, reportándose un incremento en su incidencia y que al poco tiempo desapareció
(White, 2004 ). La mancha anular del maíz causada por el hongo Hyalothyridium
maydis, se presentó en forma severa en 1999 y 2000 en siembras comerciales de maíz
en la región de Caicedonia, Cauca, en Colombia. Despues de estos dos años, la
enfermedad no se volvió a presentar, aún cuando siguieron sembrándose los mismos
híbridos comerciales que habían mostrado susceptibilidad (Varón et al., 2000.,
24
CIMMYT, 2004., White, 2004). En México, un ejemplo similar es el caso del mildiu
velloso de sorgo causado por Peronosclerospora sorghi (sin. Sclerospora sorghi),
afectando tanto maíz como sorgo. Reportado en México en 1968 y que se distribuyó
eficientemente en la mayoría de los estados del país en donde se sembraba maíz y/o
sorgo. Las instituciones de investigación agrícola del país iniciaron inmediatamente
programas de selección de resistencia a la enfermedad. Sorprendentemente, hacia los
años 80s la enfermedad fue desapareciendo y en la actualidad se le observa solamente
como una curiosidad (De León, comunicación personal).
1.7. CONCLUSIONES
Las plantas enfermas de maíz, colectadas en Tlalixcoyan, Cosoleacaque y Paso de
Ovejas, Veracruz estaban infectadas por Burkholderia gladioli. La identificación de B.
galdioli, se confirmó utilizando el análisis del rDNA 16s, rRNA 23s y con iniciadores
para dominio, género y especie. De acuerdo al analisis de compararcion nucleotidicas
de los tres aislamientos y del patrón electroforético de restricción indican que esta
presente una sola cepa ampliamente distribuida en las tres regiones. El análisis de los
resultados de detección de la bacteria indicó que se aisló de cultivares AS7573, no se
encontró en criollos y al rededores, probablemente porque fue introducido a México por
semilla. La alta incidencia con que se presentó esta enfermedad en el 2003 disminuyó
con el tiempo y en 2007 la incidencia disminuyó aproximadamente a un 1%. Este es el
primer reporte de Burkholderia gladioli como patógeno del maíz (Zea mays) en México.
25
Figura 1. Síntomas en plantas de maíz ocasionados por Burkholderia gladioli en Veracruz, México. A. Los síntomas iniciales en hojas de maíz aparecen como manchas semiacuosas, blanco amarillentas, B. Necrosis en tallo, C. Necrosis en la base de la mazorca cuyo desarrollo se detiene.
Figura 2. Síntomas en plantas de maíz inoculadas en invernadero con Burkholderia gladioli, proveniente de Veracruz, México. A. Manchas semiacuosas, blanco amarillentas, en hojas, B. Franjas longitudinales en hojas C. Pudrición semiacuosa en la corona, D. Necrosis en tallo, E. Enrollamiento y necrosis de la hoja bandera, F. Necrosis en mazorca cuyo desarrollo se detiene. Año 2007.
C C B A
F D E
C B A
26
Figura. 3. Hipersensibilidad en hoja de tabaco var xanthi, mostrando la necrosis ocasionada por Burkholderia gladioli a las 24 h de haber sido infiltrada en la nervadura central. Año 2007.
Figura 4. Células bacterianas de Burkholderia gladioli mostrando un solo flagelo polar y la forma bacilar (25000x).
27
Figura 5. Amplificación del producto de aproximadamente 1600 pb del gen rDNA 16s de Eubacterias. Línea 1 a la 10 son diez diferentes cepas de Burkholderia aislada de plantaciones
comerciales de maíz Asgrow 7573 con síntomas de bandeado y pudrición del tallo en Veracruz. Línea 11, Erwinia sp control positivo. Línea 12, control negativo (agua estéril). M. Marcador molecular de 1Kb (Invitrogen).
Figura 6. Amplificación del producto de 500 Pb del gen 16s rDNA de Burkholderia, Línea 1 a la 10 son diez diferentes cepas de Burkholderia aislada de plantaciones comerciales de maíz Asgrow 7573 con síntomas de bandeado y pudrición del tallo de Veracruz. Línea 11, Xanthomonas campestris utilizado como control negativo. M. Marcador molecular de 100 pb (Invitrogen).año 2007.
1600 Pb
250 Pb
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
500 Pb
1500 Pb
28
Figura 7. Amplificación del producto de 700 Pb del gen 23s rDNA de Burkholderia gladioli. Línea 1 a la 10 son diez diferentes cepas de Burkholderia gladioli aislada de plantaciones comerciales de maíz Asgrow 7573 con síntomas de bandeado y pudrición del tallo de Veracruz con síntomas de bandeado y pudrición del tallo. Línea 11, control negativo (agua estéril). M. Derecha marcador molecular de 1Kb y 100 pb izquierda (Invitrogen). Año 2007.
Figura 8. Productos de PCR 23s después de la digestión con HaeIII, en gel de agarosa al 2%. Línea de la 1 a la 10 producto de PCR de Burkolderia gladioli aislada de plantaciones comerciales de maíz Asgrow 7573 con síntomas de bandeado y pudrición del tallo .de Veracruz. M (izquierda) Marcador molecular de 100 Pb y M (derecha) Marcador molecular de 50 Pb (Invitrogen). Año 2007.
700 Pb 700 Pb
1500 Pb
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M
500 Pb 450 Pb
350 Pb
150 Pb
1500 Pb
29
Figura 9. Productos de PCR 23s después de la digestión con TaqI, en gel de agarosa al 2%. Línea de la 1 al 10 producto de PCR de Burkolderia gladioli aislada de plantaciones comerciales de maíz Asgrow 7573 con síntomas de bandeado y pudrición del tallo de Veracruz. M (izquierda) Marcador
molecular de 100 Pb y M (derecha) Marcador molecular de 50 Pb. Año 2007.
Figura 10. Incidencia porcentual de Burkholderia gladioli en plantaciones de maíz del cultivar AS7573 con síntomas de bandeado y pudrición del tallo en los municipios de Tlalixcoyan, Paso de ovejas y Cosoleacaque durante los años 2005 al 2007 en Veracruz, México.
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M
350 Pb 300 Pb 150 Pb
1500 Pb
350 Pb
300 Pb
150 Pb
30
Figura 11. Disminución en el tiempo de la incidencia porcentual de Burkholderia gladioli en plantaciones de maíz del cultivar AS7573 con síntomas de bandeado y pudrición del tallo en los municipios de Tlalixcoyan, Paso de ovejas y Cosoleacaque durante los años 2005 al 2007 en Veracruz, México.
Figura 12. Distribución y severidad de Burkholderia gladioli en plantaciones de maíz del cultivar AS7573 con síntomas de bandeado de la hoja y pudrición del tallo en el ciclo Primavera-Verano 2005 (Abril-Agosto), en Tlalixcoyan, Ver.
31
1.8. LITERATURA CITADA
Chavero, J. J. 2004. Control químico in vitro de la bacteriosis del maíz (Herbaspirillum rubrisubalbicans). Tesis de licenciatura, departamento de Fitotecnia. Universidad Autónoma Chapingo.75p.
Coenye, T., and Vandamme, P. 2003. Diversity and significance of Burkholderia species occupying diverse ecological niches. Environ.Microbiol. 5:719-729.
CIMMYT. 2004. Enfermedades del Maíz: Una guía para su identificación en el campo. 4ed. 119p.
Gregersen, T. 1978. Rapid method for distinction of gram-negative from gram-positive bacteria. Eur. J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 5:123-127.
Hiroyuki, U., Naruto, F., Kazuhiro, L., Masatomo H., Kenichi, T., and Nobuaki, M. 2006. Burkholderia gladioli associated with symptoms of bacterial grain rot and leaf- sheath browning of rice plants. J .Gen Plant Pathol. 72:98–103.
Keith, L. M., Sewake, K. T., and Zee, F. T. 2005. Isolation and characterization of Burkholderia gladioli from orchids in Hawaii. Plant Dis. 89:1273-1278.
Kovacs, N. 1956. Identification of Pseudomonas pyocyanea by the oxidase reaction. Nature. 78:703.
LiPuma, J. J., Dulaney, B., Mcmenamin, J. D., Whitby, P. W., Stull, T. L., Coenye, T., and Bandammen, P. 1999. Development of rRNA-based PCR assays for identification of Burkholderia cepacia complex isolates recovered from cystic fibrosis patients. Journal of Clinical Microbiology 37:3167-3170.
López, F. M. C. 1994. Los caminos de la fitobacteriología. Universidad Autónoma Chapingo. 1a Ed. 216p.
McCulloch, L. 1921. A bacterial disease of gladiolus. Science 54:115-116.
NCBI. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/. Información verificada el 1 de junio 2008.
Rhind, D., Waterston J. M, Deighton F. C, 1952. Occurrence of Puccinia polysora Underw. in West Africa. Nature (London)169:631.
32
Robinson, R. A. 2000. Retorno a la Resistencia. Fitomejoramiento para Depender Menos de los Plaguicidas. Colegio de Posgraduados.Instituto de Fitosanidad Montecillo, Mexico. 291p.
Rodrigues, L. M., Silva, S., Gomes, J. E., Lopez., and Tsai, S. M. 2003. Detection and diversity assessment of Xylella fastidiosa in field-collected plant and insect samples by using 16S rRNA and gyrB secuence. Aplplied and Environmental Microbiology 69:4249-4255.
Schaad, N. W., Jones, J. B., and Chun, W. 2001. Laboratory Guide for Identification of Plant pathogenic Bacteria. 3ª ed. APS Press.St. Paul, Minnesota. pp 373.
Tamura, K., Dudley, J., Nei, M., and Kumar, S. 2007. MEGA 4 molecular evolutionary genetics analysis (MEGA) software version 4.0. Molecular biology and evolution 24:1596-1599.
Varón de A. F., De león, C., Huerta, C. A., Grajales, R. O. Mancha anular, nueva enfermedad foliar del maíz en el valle del Cauca. Fondo Nacional Cerealista. Ascolfi informa 27:24-25.
Veracruz. 2005. Enciclopedia de los municipios de México. http://elocal.gob.mx/work/templates/enciclo/veracruz/municipios/30126a.htm. Información verifivada el 23 de junio del 2009.
Whitby, P. W., Pope, L. C., Carter, K. B., LiPuma, J. J., and Stull, T. L. 2000. Species specific PCR as a tool for the identification of Burkholderia gladioli. J. Clin. Microbiol 38:282-285.
White, G. D. 2004. Plagas y Enfermedades del Maíz. The American Phytopathological Society. Ed. Mundi-prensa.78p.
33
CAPITULO II
MANCHA FOLIAR DEL MAÍZ OCASIONADA POR Pantoea ananatis, EN
VERACRUZ, MÉXICO.
2.1. RESUMEN
Una nueva enfermedad en siembras comerciales de maíz Asgrow 7573 se presentó
epidémicamente en los municipios de Cosoleacaque, Tlalixcoyan y Paso de Ovejas,
estado de Veracruz, México, durante el 2003-2004. Los síntomas en hojas fueron
manchas acuosas, verde oscuro, que posteriormente se necrosaron, y tomaron un
aspecto blanco-grisáceo. Las bacterias aisladas de las lesiones fueron identificadas
usando pruebas fisiológicas, bioquímicas convencionales y se caracterizaron
molecularmente mediante la amplificación por PCR de un fragmento del rDNA del gene
16s y secuenciación. El agente causal de la mancha foliar del maíz en Veracruz,
México fue Pantoea ananatis (Sin. Erwinia ananas). Las secuencias de nucleótidos
obtenidas se depositaron en el National Center for Biotechnology Information (NCBI).
Este es el primer hallazgo de Pantoea ananatis en maíz en México.
Palabra clave: Erwinia ananas, PCR, Zea mays, secuenciación.
34
2.2. ABSTRACT
A new disease in maize plants Asgrow 7573 occurred during 2003-2004 in the counties
of Cosoleacaque, Tlalixcoyan and Paso de Ovejas, in the state of Veracruz, Mexico.
Leaf symptoms consisted in of dark green, water-soaked which later became white-gray
to necrotic. Bacteria isolated from the lesions were identified by physiological and
biochemical tests, and were molecularly characterized by PCR amplification of a
fragment of the 16s rDNA gene and sequencing. The causal agent of the leaf spot
disease of maize in Veracruz, Mexico was identified as Pantoea ananatis (Syn. Erwinia
ananas). Nucleotide sequences were deposited at the National Center for
Biotechnology Information (NCBI). This is the first report of Pantoea ananatis in maize
in México.
Keywords: Erwinia ananas, PCR, Zea mays, sequencing.
35
2.3. INTRODUCCION
El maíz proporciona el 39% de la proteína y el 59 % de la energía de los mexicanos,
como resultado de un consumo anual per capita de 209.8 kg (Morris y López, 2000). En
el 2009 se sembraron con maíz 193,326 ha en el estado de Veracruz, con una
producción de 217,145 toneladas y un rendimiento de 2.2 ton/ha (Oeidrus, 2009).
La producción de maíz puede ser afectada por enfermedades que reducen la
capacidad de la planta para crecer y producir de manera normal (White, 2004). En este
Una enfermedad de etiología desconocida se presentó epidémicamente en 2003-2004
en siembras de maíz del cultivar comercial Asgrow 7573 en los municipios de
Tlalixcoyan, Cosaloacaque y Paso de Ovejas, del estado de Veracruz. Los síntomas en
hojas consistieron de manchas irregulares, acuosas, color verde oscuro, que después
se necrosaron y tomaron un color blanco-grisáceo; la hoja finalmente se tornó de color
rojizo. Estos síntomas no se habían reportado anteriormente en el cultivo de maíz en
México. El objetivo del presente estudio fue identificar la causal de esta mancha foliar
del maíz en el estado de Veracruz, México.
2.4. MATERIALES Y MÉTODOS
2.4.1. Muestreo
En los municipios de Cosoleacaque, Tlalixcoyan y Paso de Ovejas, del estado de
Veracruz, México, se muestrearon 14 parcelas de maíz del cultivar comercial AS7573,
durante 2005-2007. EL muestreo en cada plantación comercial consistió en seleccionar
7 surcos sembrados y dentro de cada surco se muestreó una de cada cinco plantas. En
total de seleccionaron 60 plantas por municipio. Las parcelas muestreadas fueron
36
georeferenciadas, utilizando el sistema de posicionamiento global (GPS38 Personal
Navigator) para determinar la distribución de la enfermedad en las diferentes regiones.
2.4.2. Aislamiento del agente causal
El aislamiento se realizó de hojas que mostraban manchas irregulares, acuosas que
sugerían la posibilidad de una etiología bacteriana. El material fue seccionado y
desinfestado con hipoclorito de sodio al 1% durante 1 min, se lavó tres veces durante
con agua destilada estéril. Los cortes fueron colocados en tubos de ensayo con 10 mL
de agua estéril y se dejaron reposar durante 10 min. Parte de la suspensión se sembró
por estría cruzada en los medios casaminoácidos peptona glucosa (CPG), B de King
(BK), agar nutritivo (AN) y tripticasa de soya agar (TSA). Los cultivos fueron incubados
a 28C durante 72 h. Las colonias bacterianas individuales fueron purificadas y
almacenadas a -80C en glicerol al 15%.
2.4.3. Patogenicidad de los aislamientos
De 180 muestras colectadas, se obtuvieron 100 aislamientos bacterianos de morfología
constante y única, de los cuales se seleccionaron 10 cepas al azar para tipificarlos y
probar su patogenicidad. Para esto, se inocularon 20 plantas sanas de maíz de 45 días
de edad de cada uno de los cultivares comerciales AS7573, Nutria, Orca y CP560.
AS7573 fue seleccionado, porque en este cultivar se presento la epidemia del 2003 y
porque es el más común en la región. Algunos productores mencionaron que habían
probado a Orca y Nutria y las encontraron con cierta tolerancia. CP560 se incluyó
porque el Colegio de Postgraduados, Campus, Veracruz la estaba promocionando en
la región. El inóculo se obtuvo de un cultivo de la bacteria en caldo tripticasa de soya
(TSB) que se incubo a 30C durante 48 h. Un ml de este cultivo se resuspendió en 100
37
ml de medio TSB, se incubó en agitación durante 4 h. El cultivo fue centrifugado
durante 1 min. a 12000 rpm y el sedimento fue resuspendido en solución estéril de
buffer de fosfatos PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM de KCl, 0.01 M Na2HPO4, 1.8 mM de
KH2PO4, pH 7.4). La concentración del inóculo se ajustó en un espectrofotómetro
(Jenway 6405 UV/vis). A las hojas se les hicieron heridas con una aguja de 29 G y
posteriormente fueron asperjadas con una suspensión bacteriana de 1x106 UFC/ml
(Paccola et al., 2001). Posteriormente, las plantas se cubrieron con bolsas de plástico y
se mantuvieron en un invernadero (28-32C con 80% HR). Las 30 plantas testigo de
cada cultivar comercial fueron inoculados con agua estéril y se mantuvieron bajo las
mismas condiciones. El desarrollo de los síntomas se supervisó durante 60 días. La
bacteria fue reaislada en TSA a partir del tejido cercano a las áreas infectadas para
confirmar la identidad del organismo.
2.4.3.1. Reacción de hipersensibilidad en tabaco
Una suspensión bacteriana de 106 UFC/mL, se infiltró en los espacios intercelulares de
la nervadura central de hojas de tabaco (Nicotiana tabacum var. xanthi). Las plantas
tratadas se mantuvieron a 28ºC durante 24h. Las plantas de tabaco testigo fueron
infiltradas con agua estéril.
2.4.4. Caracterización e identificación del patógeno
Las cepas se caracterizaron por la morfología de la colonia en TSA, la movilidad,
morfología celular, prueba de Ryu (Suslow, 1982; Schaad et al., 2001), y por la
producción de catalasa, oxidasa, oxidación y fermentación de la glucosa, producción de
indol y la producción de ácido a partir de azúcares (Schaad et al., 2001 y Paccola et al.,
2001).
38
2.4.5. Caracterización molecular
2.4.5.1. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
El DNA se extrajo de las 10 cepas bacterianas seleccionadas con el protocolo
comercial Plant DNA Zol® (Invitrogen). Los iniciadores bacterianos universales usados
fueron FD1 Eubacteria (5’AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3’) del gen rRNA 16s y el
iniciador RD1 Eubacteria (5’AAGGAGGTGATCCAGCC3’) (Rodrigues et al., 2003). La
amplificación del DNA se desarrolló en una reacción con 25 µL conteniendo 0.2 µM de
cada iniciador, 200 µM dNTP, 1X buffer para PCR, 1.5 mM MgCl2, 2U Taq polimerasa
(Invitrogen) y 10 ng de ADN molde. La PCR consistió de una desnaturalización inicial
de un ciclo de 94 ºC durante 3 min, seguido de 30 ciclos con 94 ºC durante 1 min, 55
ºC por 30 seg y 72 ºC por 1 min, con una extensión final de 72 ºC durante 7 min
(Rodrígues, et al., 2003). Una alícuota de 10 µL de la reacción fue analizada por
electroforesis en un gel de agarosa al 1% a 80 V por 80 min en buffer TBE. El gel se
tiñó con bromuro de etidio. Se empleó un marcador molecular de 1Kb (Invitrogen).
2.4.5.2. Secuenciación y alineamiento
El DNA fue secuenciado (cepas ADVER07, ADVER08 Y ADVER09) en un equipo
Genetic Analyzer 3100 (Applied Biosystem Corp). Las secuencias fueron alineadas y la
homología se determinó en el servidor del National Center for Biological Information
(NCBI, 2008).
2.4.6. Incidencia de la mancha foliar del maíz
La incidencia de la mancha foliar de maíz se evaluó en 14 parcelas comerciales del
cultivar AS7573 en los municipios de Tlalixcoyan (7 parcelas), Cosoleacaque (9
parcelas) y Paso de Ovejas(1 parcela), Ver. En el centro de cada parcela se eligieron
39
25 surcos contínuos y 25 plantas por surco, para un total de 625 plantas evaluadas. La
incidencia se evaluó con 0= ausencia, 1= presencia de la enfermedad. La incidencia se
calculó dividiendo el Número de plantas enfermas entre el total de las plantas
muestreadas y el cociente se multiplicó por cien. Las parcelas con síntomas fueron
georeferenciadas con el sistema de posicionamiento global (GPS38 Personal
Navigator) con el fin de registrar y determinar la distribución de la enfermedad en la
región.
2.5. RESULTADOS
2.5.1. Muestreo
De las 14 parcelas muestreadas, se obtuvieron 360 muestras (Cuadro 2.1).
Los síntomas observados en campo fueron hojas con manchas irregulares, verde
oscuro de aspecto húmedo, y con un halo amarillo. En síntomas avanzados las
manchas adquirieron un color blanco-grisáceo y las hojas se tornaron de una
coloración rojiza (Figura 13).
40
Cuadro 2.1. Ubicación de las 14 parcelas de maíz Asgrow 7573 muestreadas en tres
municipios de Veracruz, México para la detección de la mancha foliar del maíz. 2005-
2007.
Clave Municipio Coordenadas Altitud msnm
Ciclo de muestreo
Lat Norte Long Oeste
PCOS1 Cosoleacaque 17.89274 94.63544 21 PV-07 PCOS2 Cosoleacaque 17.89663 94.63498 32 PV-07 PCOS3 Cosoleacaque 17.89242 94.63241 4 PV-07 PCOS4 Cosoleacaque 17.91579 94.62561 11 PV-07 PCOS5 Cosoleacaque 17.89521 94.62979 9 Inv-06 PCOS6 Cosoleacaque 17.89798 94.63171 23 Inv-06 PCOS7 Cosoleacaque 17.89006 94.63934 14 Inv-06 TLAX1 Tlalixcoyan 18.71789 96.12835 9 PV-06 TLAX2 Tlalixcoyan 18.72726 96.11682 24 PV-06 TLAX3 Tlalixcoyan 18.72762 96.11543 21 PV-06 TLAX4 Tlalixcoyan 18.72784 96.11473 22 Inv-06/07 TLAX5 Tlalixcoyan 18.71771 96.12835 12 Inv 06/07 TLAX6 Tlalixcoyan 18.71789 96.11365 8.5 Inv-06/07
PASO1 Paso de Ovejas 19.11247 96.20810 25 OI-06
PV= Primavera-Verano; INV= Invierno; OI= Otoño-Invierno, msnm= metros sobre nivel del mar
2.5.2. Aislamiento del agente causal
De las 380 muestras analizadas, en 130 se aisló un tipo de colonia bacteriana en los
medios BK, AN, CPG, y TSA (cuadro 2.2). Los 10 aislamientos bacterianos
seleccionados se caracterizaron como colonias amarillas de consistencia húmeda,
elevación convexa de borde liso (Schaad et al., 2001).
41
Cuadro. 2.2. Cepas bacterianas de aisladas de maíz AS7573 en tres municipio de
Veracruz, México. Período 2005-2007.
2.5.3. Patogenicidad de los aislamientos
De las 120 plantas de maíz AS7573 inoculadas con las cepas CECOSO, CETLALIX
CEPASO, el 100 % de las plantas fueron afectadas por la bacteria. El cultivar Orca
presentó una incidencia de solamente 11.6%, siendo la variedad con el menor
porcentaje de plantas afectadas (Cuadro 2.3, Figura 14). Los síntomas se expresaron a
los 8 días en AS7573 y a los 15 días en el resto de los cultivares. En los puntos donde
se realizaron las heridas se observaron pequeñas manchas irregulares color verde
oscuro de aspecto húmedo (Figura 15A) (Paccola et al., 2001). A los 20 días después de
la inoculación (DDI), se observaron los halos amarillos alrededor de las manchas (Figura
15 B). A los 30 DDI las manchas coalecieron y tomaron un color blanco-grisáceo (Figura
15 C); finalmente la hoja tomó una coloración rojiza (Figura 15 D): Estos síntomas son
similares a los reportados en Brasil por Paccola et al (2001). En la espiga se desarrolló
una pudrición semi-acuosa, tomaron color obscuro y las hojas cercanas se necrosaron
(Figura 15 E). Los testigos permanecieron sanos (Figura 15 F). Los postulados de Koch
se completaron con el reaislamiento e identificación de la bacteria de los tejidos
Municipio No. de muestras colectadas
No. de cepas aisladas
Tlalixcoyan 120 70
Cosoleacaque 120 20
Paso de Ovejas 120 40
Total 360 130
42
inoculados. Los síntomas se observaron en las lesiones producidas artificialmente, y
también donde cayeron las gotas producidas por la aspersión, lo que indica que la
bacteria encontró las condiciones adecuadas de humedad y temperatura para
desarrollarse.
Cuadro 2.3. Resultados de las pruebas de patogenicidad en cuatro cultivares
comerciales de maíz, inoculados con Pantoea ananatis bajo invernadero en Chapingo,
México. 2007.
2.5.3.1. Reacción de hipersensibilidad en tabaco
Las bacterias aisladas de las lesiones en maíz a las 24 h después de la infiltración con
la bacteria causaron necrosis en hojas de tabaco por lo que la reacción se consideró
positiva (Figura 16).
Cultivar comercial
CEPAS No. de plantas inoculadas
No. de plantas enfermas
(%) Plantas enfermas
CECOSO 40 40 100 Asgrow 7573 CETLALIX 40 40 100
CEPASO 40 40 100 Total 120 120 100
Nutria CECOSO 40 28 70 CETLALIX 40 35 85.5 CEPASO 40 32 80
Total 120 105 78.5
Orca CECOSO 40 2 5 CETLALIX 40 7 17.5 CEPASO 40 5 12.5
Total 120 14 11.6 CP-560 CECOSO 40 10 25
CETLALIX 40 19 47.5 CEPASO 40 11 27.5
Total 120 40 33.3
43
2.5.4. Caracterización e identificación del patógeno
Las cepas bacterianas fueron Gram-negativas, móviles, anaeróbicas facultativas,
oxidasa negativa, catalasa e indol positivo. Las características morfológicas, fisiológicas
y bioquímicas se muestran en el Cuadro 2.4. Con base en la morfología, fisiología y
características bioquímicas los 10 aislamientos se identificaron como Pantoea ananatis
(Schaad et al., 2001., Paccola et al., 2001).
Cuadro 2.4. Caracterización bioquímica, fisiológica y fenotípica de aislamientos de
Pantoea ananatis procedentes de Veracruz, México. 2006-2007.
(+) Reacción positiva, (-) Reacción negativa, (NR) No Reportado,
a Datos de Paccola et al. 2001,
b
Datos Schaad et al., 2001.
Características Cepas aisladas de maíz Reportada
a Reportada
b
Hipersensibilidad en tabaco
+ + -
Morfología celular Bacilar Bacilar Bacilar Producción de pigmento amarillo
+ + +
Producción de Indol + + + Reducción de nitrato - - - Producción de H2S - - - Producción de ácido apartir de:
Glucosa + + NR D-manosa + + NR Sorbitol + + + L-rhannosa + + + Sacarosa + + + Melobiosa + + + D-arabinosa + + + Manitol + + + Maltosa + + + Celobiosa + + + Ureasa - - - Oxidasa - - - Catalasa + + + Licuefacción de la Gelatina
+ + +
Hidrolasa de arginina - - -
44
2.5.5. Caracterización molecular
2.5.5.1. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
Las tres cepas seleccionadas para la amplificación generaron un producto de
aproximadamente 1600 Pb cuando se amplificaron por PCR con el juego de iniciadores
FD1 y RD1, que amplifican el gen rDNA 16s (Rodrígues et al., 2003). (Figura 17).
2.5.5.2. Secuenciación y alineamiento
La secuenciación del fragmento de ADN amplificado con los iniciadores FD1 y RD1,
permitió identificar a Pantoea ananatis por comparación con las secuencias
depositadas en el Genbank. La secuencia de nucleótidos (Acc. No. EU189058,
EU189059 y EU189060) mostraron un 100% de homología entre los aislamientos de
las tres localidades. La cepa ADVER07 y ADVER09 (Pantoea ananatis de Tlalixcoyan y
Cosoleacaque) presentaron una homología del 99% con un aislado de China (acc.
DQ517335), reportado por Fei (2006). La cepa ADVER08 (Pantoea ananatis de Paso
de Ovejas) presentó una homología del 99% con un aislado de Sudáfrica (acc.
DQ512490), reportado por Goszczynska (2006) (Cuadro 2.5).
45
Cuadro. 2.5. Caracterización molecular por alineamiento de las secuencias reportadas
en el banco de genes con las secuencias de los genes 16s rDNA de las cepas de
Pantoea ananatis aisladas de hojas de maíz Veracruz, México. 2007.
1 = Número de nucleótidos amplificado por PCR con los iniciadores RHG-F y RHG-R 2= Base de datos del NCBI (National Center for Biotechnology Information) 3= Índice de similaridad entre la secuencia de las bacterias aislada y la especie comparada
1.5.6. Incidencia de la mancha foliar de maíz
Tlalixcoyan fue el municipio que, en el 2005, presentó mayor incidencia (14.4%),
seguido Paso de Ovejas (7.5%) por Cosoleacaque (6.2%) y (Figura 17). La incidencia
disminuyó en 2006 a 4% en Tlalixcoyan, 3% en Paso de Ovejas, 0% en Cosoloacaque
y. La incidencia disminuyó aún más en el 2007, Cosoleacaque 0%, Paso de Ovejas
1.9% y Tlalixcoyan 1.2% (Figura 18). Las 14 parcelas muestreadas y georeferenciadas
fueron del cultivar comercial AS7573 (Cuadro 2.1).
2.6. DISCUSIÓN
En este estudio, se describe “la mancha foliar como una nueva enfermedad del maíz en
el estado de Veracruz. Las bacterias aisladas de las muestras de maíz de los
municipios de Tlalixcoyan, Cosoleacaque y Paso de Ovejas, Veracruz, fueron Gram
Bacteria aislada N1 Num. acceso
Banco de genes
2
Especie alineada IS3 Num. acceso
Pantoea ananatis 594 EU189058 Pantoea ananatis 99 DQ517335
Pantoea ananatis 717 EU189059 Pantoea ananatis 99 DQ512490
Pantoea ananatis 847 EU189060 Pantoea ananatis 99 DQ517335
46
negativa, de color amarillo de consistencia húmeda, y fueron identificadas como
Pantoea ananatis (Sin. Erwinia ananas) (Schaad et al., 2001 y Paccola et al., 2001).
Esta bacteria se describió por primera vez por Serrano en 1928, como el agente causal
de la pudrición del fruto de piña. El género Erwinia ananas fue transferido al género
Pantoea como Pantoea ananas en base a los estudios de hibridación de ADN
(Mergaert et al., 1993) y en 1997, la especie fue corregida con el nombre de “ananatis”
(Trüper y De Clari, 1997).
Las pruebas de patogenicidad en plantas de tabaco y maíz evidenciaron la
patogenicidad de la bacteria ya que en tabaco la reacción de hipersensibilidad fue
positiva a las 24 h, lo cual coincide con lo reportado por Paccola et al. (2001) y Azad et
al. (2000). Los síntomas en las plantas de maíz de los cultivares comerciales AS7573,
Nutria, Orca y CP-560, iniciaron a los 15 DDI, mostrando pequeñas manchas
irregulares color verde oscuro de aspecto húmedo. A los 30 DDI las manchas en las
hojas coalecieron y finalmente se tornaron de color blanco-grisaceo. Síntomas similares
fueron observados por Paccola et al. (2001). Los síntomas se observaron en las
lesiones producidas artificialmente, y también y más rápido sobre la superficie
asperjada, lo cual coincide con Azad et al. (2000). El factor ambiental fue fundamental
para la expresión de los síntomas; temperaturas de 28-32°C y humedad relativa de
80% fueron adecuadas para el desarrollo de la enfermedad, lo cual coincide con Azad
et al. (2000)
Los factores ambientales influyen en la gravedad de las enfermedades causadas por P.
ananatis. En el caso del maíz y eucalipto, alta humedad y temperaturas moderadas
entre 20 y 25°C, aumentan la incidencia de la enfermedad (Paccola et al., 2001;
47
Coutinho et al., 2000). En contraste, en pasto Sudán (Sorghum sudanense), la
infección aumentó a los 32°C con una humedad relativa alta (Azad et al., 2000).
Condiciones calientes, secas y con vientos han agravado la severidad de la necrosis
del tallo del arroz causada por P. ananatis (Cother et al., 2004). Las heridas naturales,
daño por insectos y por contacto de planta a planta, podrían ser un factor crucial en la
entrada del patógeno y desarrollo de la enfermedad, debido a que P. ananatis
probablemente reside epifíticamente en las hojas de maíz, como en el cultivo de arroz y
pasto Sudán (Watanabe et al., 1996; Azad et al., 2000). La caracterización bioquímica
mostró que las 10 cepas seleccionadas presentaron características semejantes a las
de P. ananatis, debido a que todas las cepas fueron positivas a indol, glucosa, D-
manosa, sacarosa, melobiosa, D-arabinosa y catalasa, mientras que fueron negativas a
la oxidasa, ureasa e hidrolasa de arginina (Schaad et al., 2001; Paccola et al., 2001).
La confirmación definitiva de P.ananatis la soportó el analisis de rADN 16s mediante el
par de iniciadores universales para eubacterias FD1 y RD1 (Rodrigues et al., 2003), el
cual aproximó con un 99% de homología a P. ananatis para las tres cepas
secuenciadas. Brady et al (2006), mencionaron que la secuenciación del rDNA 16s
debe ser combinado con el análisis de AFLPs como una herramienta de diagnóstico
para distinguir entre especies del género.
No hay reportes previos en México de los síntomas causados por P. ananatis en maíz.
Considerando que en el estado de Veracruz también se cultiva arroz, melón, pasto
Sudán, eucalipto, cebolla y piña, todos ellos hospedantes de P. ananatis (Watanabe et
al.,1996; Wells et al. 1987; Cother et al., 2004; Azad et al., 2000; Coutinho et al, 2000;
Gitaitis y Gay, 1998., Serrano, 1928), la presencia de esta enfermedad representa un
48
riesgo para dichos cultivos, ya que P. ananatis puede ocasionar graves pérdidas
económicas. En pasto Sudán puede llegar a causar 50% de pérdida del área foliar
(Azad et al., 2000). En cebolla se han registrado pérdidas del 100% (Gitaitis y Gay,
1997). En maíz provoca la senescencia foliar y una drástica disminución en el tamaño y
el peso de grano (Pinto, 1995, citado por Paccola et al., 2001).
En 2007 la incidencia de la mancha foliar de maíz han disminuido en promedio a 4%.
En México, aun no se ha determinado el impacto en el rendimiento y la calidad del
grano ocasionada por P. ananatis, por lo cual es necesario continuar con las
investigaciones necesarias para entender la epidemiología de esta nueva enfermedad y
desarrollar estrategias de manejo para reducir los riesgos y diseminación en zonas
productoras de maíz y de cultivos alternos de importancia económica.
2.7. CONCLUSIONES
El agente causal de la mancha foliar del maíz fue Pantoea ananatis, de acuerdo con las
pruebas fisiológicas, bioquímicas, PCR y secuenciación. Este es el primer reporte de
esta enfermedad y del patógeno en México.Las pruebas de patogenicidad demostraron
que el 100% de plantas inoculadas del cultivar comercial AS7573 se infectaron,
mientras que en el cultivar Orca solamente hubo una incidencia de 11.6 %. En 2007 la
incidencia de la mancha foliar de maíz ha disminuido en promedio a 4%.
El impacto en el rendimiento y la calidad del grano de maíz ocasionada por Pantoea
ananatis en México no se ha determinado
49
Figura 13. Hoja de maíz con manchas irregulares, blanco-grisáceo y color rojizo ocasionada por Pantoea.ananatis.
Figura 14. Prueba de patogenicidad de cuatro cultivares comerciales de maíz inoculadas con Pantoea ananatis, aisladas de la var. AS7573, procedentes de tres municipios de Veracruz, México: Cosoleacaque (CECOSO), Tlalixcoyan (CETLALIX) y Paso de Ovejas (CEPASO). 2007.
50
Figura 15. Síntomas en plantas de maíz AS7573 inoculadas con Pantoea ananatis, procedente de Veracruz, México. A. Manchas pequeñas irregulares color verde oscuro de aspecto húmedo B. Mancha con presencia de halos amarillos 20 días después de la inoculación (DDI) C. Manchas blanco-grisáceo 30 DDI. D. Hoja de color rojizo E. Espiga con pudrición. F. Hoja de planta Testigo inoculada con agua estéril.
A B
C D
E F
51
Figura 16. Hipersensibilidad en hoja de tabaco (Nicotiana tabacum var xanthi), mostrando la necrosis ocasionada por Pantoea ananatis infiltrada en la nervadura central.
52
Figura 17. Respuesta de cuatro cultivares comerciales a la inoculación de cepas de Pantoea ananatis, proveniente de Veracruz, México. A. Orca, B. CP-560, C. ASGROW-7573. D. Nutria.
B
C D
A
53
Figura 18. Amplificación del producto de aproximadamente 1600 pb del gen rDNA 16s de Eubacterias. Línea 1 a la 11 son cepas de Pantoea ananatis aisladas de maíz Asgrow 7573, procedentes de Veracruz, México. Línea 12, control positivo(Erwinia sp). Línea 13, control negativo (agua estéril libre de nucleasas), M= Marcador molecular de 1Kb (Invitrogen).
Figura 19. Disminución en el tiempo de la incidencia porcentual de Pantoea ananatis en plantaciones de maíz del cultivar AS7573 con síntomas de mancha foliar en los municipios de Tlalixcoyan, Paso de ovejas y Cosoleacaque durante los años 2005 al 2007 en Veracruz, México.
1600 Pb
250 Pb
1000 Pb
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
54
2.8. LITERATURA CITADA
Azad, H. R., Holmes, G. J., and Cooksey, D. A. 2000. A new leaf blotch disease of sudangrass caused by Pantoea ananas and Pantoea stewartii. Plant Dis. 84:973-979.
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CIMMYT. 2004. Enfermedades del Maíz: Una guía para su identificación en el campo.
Centro Internacional de Mejoramiento de Maíz y Trigo, CIMMYT. 4ªEdición.119p. Cother, E. J., Reinke, R., McKenzie, C., Lanoiselef, V. M., and Noble, D. H. 2004. An
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Coutinho, T. A., Preisig. O., Mergaert, J., Cnockaert, M. C., Riedel, K. H., Swings, J.,
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Gitaitis, R. D., and Gay, J. D. 1997. First report of a leaf blight, seed stalk rot, and bulb
decay on onion by Pantoea ananas in Georgia. Plant Dis. 81:1096. Mergaert, J., Verdonck, L., and Kersters, K. 1993. Transfer of Erwinia ananas
(synonym. Erwinia uredovora) and Erwinia stewartii to the genus Pantoea emend. as Pantoea ananas (Serrano 1928) comb. nov. and Pantoea stewartii (Smith 1898) comb. nov. respectively, and description of Pantoea stewartii subsp. indologenes. nov. Int. J. Syst. Bacteriology. 43:162-173.
Morris, L. y López, M. A. 2000. Impacto del mejoramiento genético de maíz en América
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Paccola, M. L. D., Ferreira, A. S., Meirelles, W. F., Marriel, I. E., and Casela, C. R.
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Rodrígues, L. M., Silva, S., Gomes, J. E., Lopez., and Tsai, S. M. 2003. Detection and diversity assessment of Xylella fastidiosa in field-collected plant and insect samples by using 16s rRNA and gyrB secuence. Applied and Environmental Microbiology 69:4249-4255.
55
Schaad, N. W., Jones, J. B., and Chun, W. 2001. Laboratory Guide for Identification of Plant Pathogenic Bacteria. 3ª ed. APS Press.St. Paul, Minnesota. pp 373.
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Watanabe, K., Kawakita, H., and Sato, M. 1996. Epiphytic bacterium Erwinia ananas,
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White, G. D. 2004. Plagas y Enfermedades del Maíz. The American Phytopathological
Society. Ed. Mundi-prensa.pp.78.
56
CAPITULO III
RAYADO FOLIAR DEL MAÍZ CAUSADO POR Acidovorax avenae subsp avenae EN VERACRUZ, MÉXICO
3.1. RESUMEN
Siembras comerciales de maíz Asgrow 7573 en los municipios de Tlalixcoyan, Paso de
Ovejas y Cosoleacaque en 2006-2007 mostraron una enfermedad caracterizada por
presentar manchas pequeñas irregulares de aspecto húmedo en hojas, que se
extendieron a lo largo de la lámina foliar, formando una raya translucida, que se tornó
color blanco-pajizo y frecuentemente el tejido presentó desgarramiento y aspecto
atizonado. En la espiga, en ocasiones, se observó una pudrición, debido a que las
hojas superiores enfermas la envolvían. En algunas de las plantas sintomáticas se
hicieron cortes transversales, y en todas se observó necrosis vascular. En los medios
de cultivo BK, AN y CPG se aislaron constantemente colonias bacterianas, las cuales
se caracterizaron por su color blanco-cremoso, redondas y convexas. La patogenicidad
se confirmó en plántulas sanas de maíz. Las cepas bacterianas se identificaron como
Acidovorax avenae subsp avenae con base en pruebas fisiológicas y bioquímicas. EL
género Acidovorax fue confirmado mediante PCR utilizando el par de iniciadores
RST63 y RST64 que amplifican un fragmento de 210 pares de bases de DNA
ribosomal. El incremento de la enfermedad del 2006 al 2007 señala su importancia
potencial y la necesidad de considerarla en los programas de manejo del cultivo.
Palabra clave: Asgrow 7573, PCR, bacteria, pruebas bioquímicas, pudrición de espiga.
57
3.2. ABSTRACT
An epidemic disease developed in commercial plantings of maize cv 7573
Asgrow in 2006-2007 in Tlalixcoyan, Paso de Ovejas and Cosoleacaque counties
in the State of Veracruz, Mexico. Symptoms consisted in small irregular watery
spots on the leaves, which coalesced into translucent strips, initially white-brown
in color; later the tissue in the strips teared off and got a papery appearance.
Ears wrapped by the upper diseased leaves sometimes became rot. Vascular
necrosis was observed in cross sections of stems of symptomatic plants.
Bacterial colonies constantly isolated in BK, AN and CPG media were creamy-
white, round and convex. Pathogenicity was confirmed in healthy maize
seedlings. Bacterial isolates were identified as Acidovorax avenae subsp avenae
based on physiological and biochemical tests. Genus Acidovorax was confirmed
by PCR using the pair of primers RST63 and RST64 which amplify a fragment of
210 bp. Disease incidence increased in a regional average from 2006 (%) to
2007 (%) which indicates its potential importance and the need to consider it in
crop management programs.
Keywords: Zea mays, Acidovorax Asgrow 75-73, PCR, bacteria, biochemical
tests, ear rot.
58
3.3. INTRODUCCION
Una enfermedad no descrita anteriormente en maíz en México se presentó durante los
ciclos 2003-2004 en tres municipios maiceros importantes en el estado de Veracruz:
Paso de Ovejas, Cosoleacaque y Tlalixcoyan., ocasionando pérdidas estimadas desde
30% (Chavero, 2004) hasta 70%, según comentarios de los productores. Los
patógenos que se han encontrado asociados a este síndrome son Burkholderia gladioli
asociado con síntomas de manchas acuosas, blanco-amarillentas en hojas, que al
coalescer formaron franjas longitudinales y algunas de las hojas se tornaron de color
rojizo. En la corona se observó una pudrición semiacuosa y necrosis. La mazorca
mostró necrosis y detención del desarrollo (Gijón et al., 2008). Pantoea ananatis se
asoció con síntomas de manchas irregulares, verde oscuro de aspecto húmedo, y con
un halo amarillo en hojas. En síntomas avanzados las manchas adquirieron un color
blanco-grisáceo y las hojas se tornaron de una coloración rojiza. El fitoplasma del
enanismo arbustivo del maíz (MBS) se asoció con síntomas de amarillamiento,
enrojecimiento y secado del follaje, reducción en el crecimiento de la planta, falta de
fecundación y proliferación de mazorcas (Alcántara et al., 2009).
Dentro del síndrome se observaron síntomas diferentes a los antes descritos, como
plantas de maíz amarillentas, hojas con rayado translúcido a lo largo de la lámina foliar,
que posteriormente tomó un color blanco café, se desgarró y terminó con un aspecto
atizonado. Necrosis en los haces vasculares fue observada en cortes transversales del
tallo. En la espiga en ocasiones se observó una pudrición, debido a que las hojas
superiores enfermas la envolvían. Estos síntomas, al igual que los causados por
Burkholderia gladioli, Pantoea anantis y el fitoplasma MBS, inicialmente fueron
59
observados en el cultivar comercial AS7573 en los municipios de Tlalixcoyan,
Cosoleacaque y Paso de Ovejas, Veracruz.
Por la alarma epidémica con que se presentó este síndrome, por las pérdidas de
cosecha (hasta 70%) consignadas por los productores, por la importancia del maíz en
el Estado de Veracruz, y por que la etiología del rayado foliar permanecía indefinida el
objetivo de esta investigación fue identificar el patógeno y determinar la distribución de
la enfermedad.
3.4. MATERIALES Y METODOS
3.4.1. Colecta de material vegetal
Muestras de plantas amarillentas, hojas con rayado translucido a lo largo de las
nervaduras, que posteriormente se tornaron color blanco-pajizo y el tejido presentó
desgarramiento o aspecto papeloso, se colectaron en los municipios de Cosoleacaque,
Tlalixcoyan y Paso de Ovejas, Veracruz, en 2006-2007. De 14 parcelas comerciales
con el cultivar comercial (cv) Asgrow 7573, se colectaron de 1 a 60 muestras en cada
parcela según la incidencia de la enfermedad, para un total de 180 muestras.
3.4.2. Aislamiento
El material con síntomas de rayado acuoso, pudrición en la espiga y necrosis vascular
el tallo fue seccionado y desinfestado con hipoclorito de sodio al 1% durante un min,
enseguida se lavó tres veces durante 30 segundos con agua destilada estéril. Los
cortes fueron colocados en tubos de ensayo con 10 mL de agua estéril y se dejaron
reposar durante 20 min. Parte de la suspensión se sembró por estría cruzada en los
medios casaaminoácidos peptona glucosa (CPG), B de King (BK) y agar nutritivo (AN).
60
Los cultivos fueron incubados a 30ºC durante 72 h. Las colonias bacterianas
individuales fueron purificadas y almacenadas a -80 ºC en glicerol al 15%.
3.4.3. Patogenicidad de los aislamientos
De las 180 muestras colectadas en 100 se aisló un tipo de colonia bacteriana en los
medios BK, AN y CPG, de morfología constante y única, de los cuales se seleccionaron
10 cepas al azar para tipificarlas y probar su patogenicidad. Se emplearon 50 plantas
sanas de maíz de 45 días de edad del cv. comercial AS7573. El inoculo se obtuvo de
un cultivo de la bacteria en BK a 30ºC durante 48 h, el cual se resuspendió en 100 mL
de solución estéril de buffer fosfatos PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM de KCl, 0.01 M
Na2HPO4, 1.8 mM de KH2PO4, pH 7.4). Las hojas fueron picadas superficialmente con
una aguja de 29 G y asperjadas con una suspensión bacteriana de 108 Cel/ml,
tomando como referencia el tubo número 2 de la escala de Mc Farland, citado por
Barret (1975). Veinte plantas testigo se asperjaron con agua destilada. Las plantas se
cubrieron con bolsas de plástico, con pequeñas perforaciones, por una semana, y se
mantuvieron en un invernadero (28-30ºC y 80% HR). El desarrollo de los síntomas se
supervisó durante 60 días, y de los tejidos infectados se hicieron reaislamientos en BK
para confirmar la identidad del organismo.
3.4.3.1. Reacción de hipersensibilidad en tabaco
Una suspensión bacteriana 108 Cel/ml se infiltró en los espacios intercelulares de hojas
de tabaco (Nicotiana tabacum var. Xanthi) a través de la nervadura central. Las plantas
tratadas se mantuvieron a 30ºC durante 24h. Las hojas de tabaco testigo fueron
infiltradas con agua estéril.
61
3.4.4. Caracterización e identificación del patógeno
Los aislamientos se caracterizaron mediante la prueba Gram (Barret, 1967), prueba de
KOH al 3% (Suslow et al., 1982), la prueba de catalasa, oxidasa (Weller et al., 1975.,
Trujillo y Hernández, 1992), La hidrólisis del almidón, licuefacción de la gelatina,
hidrolasa de arginina, producción de H2S (Schaad, 1998) y el crecimiento en D-xylosa,
fructuosa, D-manitol, sorbitol y sacarosa (Schaad et al., 2001).
3.4.5. Caracterización molecular
3.4.5.1. Extracción del DNA
Se probaron dos protocolos con la finalidad de obtener el mejor método para la
extracción del DNA de cepas bacterianas aisladas de síntomas de rayado foliar del
maíz: EL método AP (Sambrook et al., 2001) y el método comercial de PLANT-
DNAZOL®. La integridad del DNA se verifico por electroforesis utilizando un gel de
agarosa al 1 % a 80 V por 70 min en buffer TBE. El gel se tiñó con bromuro de etidio.
3.4.5.2. Reacción en cadena de la polimersa (PCR)
Para la amplificación de los productos de PCR, se utilizaron los iniciadores RST63
(5´TCCGGCGGCGCGCTCACCGTGGTGCTG3`) y RST64
(5´AGCGCGGCGGCGTAGGCGCGCGAG3´) sugeridos por (Schaad et al., 2001). La
amplificación del DNA se desarrolló en una reacción con 25 µL conteniendo 0.2 µM de
cada iniciador, 200 µM dNTP, 1X buffer para PCR, 1.5 mM MgCl2, 2U Taq polimerasa
(Invitrogen) y 10 ng de DNA molde. La PCR consistió de una desnaturalización inicial
de un ciclo de 94ºC durante 3 min, seguido de 30 ciclos con 94ºC durante 1 min, 55ºC
por 30 segundos y 72ºC por 2 min, con una extensión final de 72ºC durante 7 min. Una
62
alicuota de 10 µL de la reacción fue analizada por electroforesis en un gel de agarosa
al 1% a 80 V por 90 min en buffer TBE. El gel se tiñó con bromuro de etidio.
(Rodrigues, 2003). Se empleó un marcador molecular de 100 Pb (Invitrogen).
3.4.5.3. Secuenciación y alineamiento
Se realizó la secuenciación del DNA de 3 cepas (ACITLALIX, ACICOSO ACIPASO) en
un equipo Genetic Analyzer 3100 (Applied Biosystem Corp). Las secuencias fueron
alineadas y la homología se determinó en el servidor del National Center for Biological
Information (NCBI, 2008).
3.4.6. Incidencia, severidad y distribución del rayado foliar del maíz
3.4.6.1. Incidencia
Catorce parcelas de maíz cv AS7573 en etapa de espiga con síntomas de rayado foliar,
amarillamiento completo de la planta, desgarramiento y aspecto papeloso y
enrojecimiento foliar, se localizaron para evaluar la incidencia de los síntomas en los
municipios de Tlalixcoyan, Cosoleacaque y Paso de Ovejas, Ver. En cada parcela se
seleccionaron 20 puntos en forma de zigzag y en cada punto se eligió un surco al azar.
De diez plantas continuas por surco se contó el número de plantas con síntomas de la
enfermedad y se calculó el porcentaje de incidencia. El porcentaje de incidencia en la
parcela se obtuvo promediando el porcentaje de incidencia en cada punto. Las parcelas
con plantas de rayado foliar se georeferenciaron (GPS38 personal navigator), con el fin
de localizar la ubicación de la plantación en la región. Con los puntos georeferenciados
se generó un mapa de ubicación geográfica de los sitios muestreados con el programa
ArcMap 9.3® (Cuadro 3.1 y Figura 20).
63
Cuadro 3.1. Ubicación de las parcelas de maíz muestreadas en los municipios de
Veracruz, México para la detección de bacterias en 2006 -2007.
PV= Primavera-Verano; INV= Invierno; OI= Otoño-Invierno. Msnm= metros sobre nivel del mar
3.4.6.2. Distribución y severidad del rayado foliar del maíz
La severidad de la enfermedad se midió utilizando una escala visual arbitraria de los
síntomas. Se fotografiaron al menos 50 hojas con el fin de obtener diferentes grados de
severidad ocasionada por el patógeno. Planta sana y valores máximos de severidad
Clave Municipio Coordenadas Altitud
msnm Ciclo de
muestreo
Lat Norte Long Oeste
PCOS1 Cosoleacaque 17.89274 94.63544 21 PV-07
PCOS2 Cosoleacaque 17.89663 94.63498 32 PV-07
PCOS3 Cosoleacaque 17.89242 94.63241 4 PV-07
PCOS4 Cosoleacaque 17.91579 94.62561 11 PV-07
PCOS5 Cosoleacaque 17.89521 94.62979 9 Inv-06
PCOS6 Cosoleacaque 17.89798 94.63171 23 Inv-06
PCOS7 Cosoleacaque 17.89006 94.63934 14 Inv-06
TLAX1 Tlalixcoyan 18.71789 96.12835 9 PV-06
TLAX2 Tlalixcoyan 18.72726 96.11682 24 PV-06
TLAX3 Tlalixcoyan 18.72762 96.11543 21 PV-06
TLAX4 Tlalixcoyan 18.72784 96.11473 22 Inv-06/07
TLAX5 Tlalixcoyan 18.71771 96.12835 12 Inv 06/07
TLAX6 Tlalixcoyan 18.71789 96.11365 8.5 Inv-06/07
PASO1 Paso de Ovejas 19.11247 96.20810 25 OI-06
64
fueron cuidadosamente seleccionados. La escala arbitraria estuvo conformada de cinco
clases 0= 0% 1= 8%, 2= 15%, 3= 25%, 4= 30%, 5= >50% (Figura 21).
En una parcela de maíz del genotipo Asgrow 7573, en el municipio de Tlalixcoyan, a
18º 42.892' latitud norte y 96º 07.401' longitud oeste se validó la escala diseñada y se
determinó la severidad de la enfermedad durante el ciclo de cultivo primavera-verano
2007. En el centro de la parcela se eligieron 25 surcos continuos y 25 plantas por surco
y se evaluó la severidad de cada planta y la posición de la planta en el surco.
El mapa de distribución y severidad de la enfermedad dentro de la parcela se elaboró
con el programa Surfer. La severidad de cada planta se representó con la escala
arbitraria establecida.
3.5. RESULTADOS
3.5.1. Colecta de material vegetal
De cada uno de los tres municipios se colectaron 60 muestras de plantas enfermas de
maíz cv AS7573, haciendo un total de 180 muestras. Los síntomas de las plantas
muestreadas eran hojas con manchas pequeñas irregulares de aspecto húmedo, que
se extendieron a lo largo de la lámina foliar, formado un rayado translucido, que se
tornó color blanco-pajizo y frecuentemente el tejido presentó desgarramiento y aspecto
papeloso. En la espiga en ocasiones se observó una pudrición, debido a que las hojas
superiores afectadas la envolvían (De León, 1984., CIMMYT, 2004) (Figura 22 A, B, C,
D y E). En algunas de las plantas sintomáticas se hicieron cortes transversales, y en
algunas se observó necrosis vascular (Figura 23).
65
3.5.2. Aislamiento
De las 180 muestras colectadas en 100 se aisló un tipo de colonia bacteriana en los
medios BK, AN y CPG. De los 100 se seleccionaron 10 y se caracterizaron como
colonias color blanco-cremoso, redonda y convexa (Schaad et al., 2001).
3.5.3. Patogenicidad de los aislamientos
Las 40 plantas de maíz de 45 días de edad del cv AS7573, infiltradas con la bacteria en
invernadero mostraron los síntomas similares a los observados en campo. El 100% de
las plantas presentaron síntomas a los 15 días después de la inoculación (DDI). En las
hojas se observaron manchas acuosas color verde olivo. A los 30 DDI Ias manchas
coalecieron y formaron rayas extendidas a lo largo de la hoja. A los 40 DDI el rayado se
tornó de color blanco-pajizo (Figura 24 A, B, C)
3.5.3.1. Reacción de hipersensibilidad en tabaco
La reacción de hipersensibilidad en hojas de tabaco fue positiva a las 24 h después de
la inoculación, la lámina foliar del área infiltrada presentó perdida de turgencia y
necrosis.
3.5.4. Caracterización e identificación del patógeno
Las 10 cepas bacterianas seleccionadas fueron Gram-negativas, aeróbicas. Todas
mostraron respuesta positiva a catalasa, oxidasa, hidrólisis del almidón, licuefacción de
la gelatina, la producción de H2S y reducción de nitratos (Weller et al., 1975., Schaad,
1998). En BK no produjeron fluorescencia ni hidrolasa de arginina. Las 10 cepas
utilizaron D-xilosa, D-manitol, sorbitol, pero no sacarosa (Schaad et al., 2001) (Cuadro
66
3.2). Con base en la morfología, fisiología y características bioquímicas los 10
aislamientos se identificaron como Acidovorax avenae subs avenae (Sin.
(Pseudomonas avenae) (Schaad et al., 2001).
Cuadro 3.2. Caracterización bioquímica y fisiológica de aislamientos de Acidovorax
avenae subsp avenae de maíz cv AS7573 con síntomas de rayado foliar, procedentes
de Veracruz, México. 2006-2007.
(+)Reacción positiva, (-) Reacción negativa, (NR) no reportado aDatos Schaad et al., 2001.
3.5.5. Caracterización molecular
3.5.5.1. Extracción del DNA
El mejor método para la extracción de DNA de bacterias fue el AP, ya que permitió
obtener el DNA íntegro, de buena calidad, sin signos de degradación o fragmentación
(Figura 25). Con el método comercial de PLANT-DNAZOL, el DNA extraído mostró
presencia de RNA, que puede interferir en la correcta amplificación del DNA (Figura
25). Estos resultados evidencian la efectividad del protocolo de AP.
Características Cepas aisladas de Maíz Reportada
a
Hipersensibilidad en tabaco + + Reducción de nitrato + + Producción de H2S + + Hidrólisis de almidón + + Fluorescencia en BK - - Licuefacción de gelatina + + Hidrolisis de arginina + + Utilización de fuentes de carbono:
Sorbitol + + Manitol + + Xilosa + + Sacarosa - - Maltosa - NR Oxidasa + + Catalasa + +
67
3.5.5.2. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
La confirmación de los aislados para el género Acidovorax se realizó con los iniciadores
específicos reportados por Schaad et al (2001), que amplificaron un fragmento de
aproximadamente 210 pb. No hubo amplificación con la cepa de Erwinia spp usada
como testigo negativo (Figura 26). Para los oligonucleotidos RST63 y RST64 utilizados
en este estudio, se creó un protocolo de amplificación.
3.5.5.3. Secuenciación y alineamiento
Las cepas secuenciadas de ACITLALIX, ACICOSO y ACIPASO se compararon en el
GenBank e indicaron una homología del 92%, 93% y 95% respectivamente, lo cual
confirmó su identidad filética con el género Acidovorax (NCBI, 2008).
3.5.6. Incidencia, severidad y distribución del rayado foliar del maíz
3.5.6.1. Incidencia
La incidencia del rayado foliar en Tlalixcoyan fue del 14.88%, en Paso de Ovejas 3.84%
y en Cosoleacaque 3.04% en 2006 (Figura 27). La incidencia se incremento en el 2007
a 45.92%en Tlalixcoyan, 8.64% en Paso de Ovejas y 4.48% en Cosoleacaque. La
mayor incidencia del rayado foliar del maíz ocurrió en Tlalixcoyan en los dos años.
3.5.6.2. Distribución y severidad del rayado foliar del maíz
La distribución espacial de la severidad del daño inducido en la parcela estudiada
sugiere el lento desarrollo de focos de infección. El porcentaje mayor de severidad
(50%) correspondió al foco inicial de infección que se originó en una orilla. Se
observaron posteriormente agregados de mayor tamaño, y la infestación dentro del
68
surco se extendió a entre surcos. Además se observó un gradiente de infección desde
las orillas de la plantación, lo cual fue atribuido a plantaciones vecinas enfermas.
La exploración gráfica, muestra un efecto de orilla; la diseminación de la enfermedad
ocurre a lo largo de los surcos y no entre surcos. Esto sugiere que la diseminación de
la enfermedad se da por efecto de orilla y de manejo (riego, fertilización, labores del
cultivo) (Figura 28). El grado 1 de severidad (8 %) fue el más frecuente.
3.6. DISCUSIÓN
El rayado foliar del maíz se caracterizó por manchas acuosas, inicialmente amorfas,
que coalescieron en rayas de dos mm de ancho, color blanco pajizo a lo largo de la
hoja. Esto es diferente al bandeado foliar causado por Burkholderia gladioli, que es de
color rojizo, de 8 mm de ancho y también a lo largo de la hoja.
Las bacterias aisladas de las muestras de maíz provenientes de Tlalixcoyan,
Cosoleacaque y Paso de Ovejas, Veracruz, fueron Gram negativa, catalasa y oxidasa
positiva. Se caracterizaron por presentar colonias color blanco-cremoso, redonda,
convexa y fueron identificadas como Acidovorax avenae subsp avenae (Sin.
Pseudomonas avenae) (Schaad et al., 2001). La enfermedad se descubrió por primera
vez en la caña de azúcar en Hawai, EE.UU., y en Queensland, Australia, en la década
de 1920 (Martin y Wismer, 1961).
La patogenicidad de Acidovorax avenae subsp avenae quedó demostrada con las
pruebas de patogenicidad en plantas maíz cv AS7573. Las hojas de todas las plantas
69
inoculadas presentaron manchas acuosas color verde olivo a los 15 DDI. A los 30 DDI
Ias manchas coalecieron y se extendieron a lo largo de la hoja formando un rayado
translúcido. A los 40 DDI el rayado bacteriano se torno de color blanco-pajizo
(CIMMYT, 2004., De León, 1984., White, G.D. 2004., McGee, 1988). Las temperaturas
de 28-30C en el invernadero aceleraron la reproducción de los síntomas ocasionados
por Acidovorax avenae. Hu et al. (1997) mencionó que las condiciones que favorecen
la expresión de los síntomas de las subespecies de Acidovorax avenae son los tejidos
jóvenes y temperaturas entre 27 y 30°C. Las condiciones antes mencionadas, heridas,
aberturas naturales como estomas e idatodos y la humedad relativa, son los factores
cruciales para el desarrollo y reproducción de la bacteria (Bradbury, 1973).
Las 10 cepas patógenas seleccionadas, se caracterizaron como gram negativas,
aeróbicas, móviles, no produjeron pigmento fluorescente, positivo a la hipersensibilidad
en tabaco, no utilizaron como fuente de carbono a la arginina, pero si a L-arabinosa,
estas características fueron determinantes en este estudio para diferenciar al género
Acidovorax de otras bacterias fitopatógenas fenotípicamente similares como
Pseudomonas y Burkholderia (Schaad et al., 2001). EL crecimiento positivo de
Acidovorax avenae en D-xilosa, sorbitol, D-manitol, la reducción de nitratos, hidrólisis
de almidón y la patogenicidad en maíz, la ubicaron dentro de la subespecie avenae
(Schaad et al., 2001). La única subespecie que infecta al maíz es Acidovorax avenae
avenae.
El mejor método para la extracción de DNA partir de colonias bacterianas fue el AP, ya
que permitió obtener el DNA integro y de buena calidad, sin degradación o
70
fragmentación. La amplificación por PCR confirmó utilidad y reproducibilidad del
protocolo AP.
Los análisis de alineamiento de las secuencias nucleotídicas en el Genbank
confirmaron la identidad filética con el género Acidovorax, sin embargo, la especie con
la cual alineó fue citrulli, por la carencia de secuencias de la especie avenae en el
Genbank. Pero la patogenicidad en maíz y las pruebas bioquímicas específicas para
especie confirmaron su identidad como Acidovorax avenae avenae.
La incidencia del rayado foliar del maíz aumentó del 2006 al 2007; en Tlalixcoyan de
14.8 a 45.9 %, en Paso de Ovejas de 3.8 a 8.6% y en Cosoleacaque de 3 a 4.4%. Esto
contrasta con la incidencia en maíz de Burkholderia gladioli (Gijón et al. 2008) y
Pantoea ananatis que disminuyeron en el tiempo. Acidovorax avenae avenae es
transmitida por semilla en arroz (Shakya et al., 1985) pero no hay evidencia de su
transmisibilidad en maíz, que pudiera explicar el incremento de la incidencia de 2006 a
2007.
71
3.7. CONCLUSIONES
Las plantas de maíz cv AS7573 con síntomas de rayado foliar, colectadas en
Tlalixcoyan, Cosoleacaque y Paso de Ovejas, Veracruz fueron afectadas por
Acidovorax avenae subsp avenae. La identificación de la bacteria se confirmó utilizando
el análisis genotípico, fenotípico, pruebas bioquímicas y de patogenicidad. El
alineamiento de las secuencias nucleotídicas confirmaron su identidad filética con el
género Acidovorax. No se identificó a nivel de especie, por comparación de secuencias
nucleotídicas, por la carencia de secuencias de Acidovorax avenae en el Genbank. El
incremento de la enfermedad del 2006 al 2007 señala su importancia potencial y la
necesidad de considerarla en los programas de manejo del cultivo.
72
Figura 20. Ubicación de los sítios de muestreo del rayado foliar de maíz causado por acidovoax avenae subsp avenae, en tres municípios de Veracruz, México. 2006-2007. México
Figura 21. Escala arbitraria de severidad para la evaluación del rayado foliar de maíz causado por Acidovorax avenae subsp. avenae en Veracruz, México. 2006.2007
Clase 0= 0% Clase 1= 8% Clase 2= 15% Clase 3 = 25% Clase 4= 30% Clase 5= >50%
73
Figura 22. Síntomas en campo del rayado foliar del maíz cv AS7573 causado por acidovorax avenae subsp. avenae. A. Planta con amarillento general, B. Espiga con pudrición, C. Hoja con rayado translucido, D. Hoja con rayado blanco-pajizo, E. Hoja con tejido desgarrado, E. Hoja con
aspecto papeloso o atizonado.
A B C
D E F
74
Figura 23. Plantas sintomáticas en un corte transversal mostrando necrosis vascular, en maíz cv AS7573 causado por acidovorax avenae subsp. avenae.
Figura 24. Síntomas desarrollados en pruebas de patogenicidad de acidovorax avenae subsp avenae en maíz cv AS7573. A. Manchas acuosas verde olivo en hojas, B. Rayado foliar C. Rayado
color blanco-pajizo.
C B C
75
Figura 25. Extracción de DNA mediante el método AP y PLANT-DNAZOL, de cepas de acidovoax avenae subsp avenae. Línea 1, DNA de buena calidad obtenido por el Protocolo AP. Línea 2, PLANT-DNAZOL que muestra DNA degradado. Línea 3, PLANT-DNAZOL con DNA de buena calidad pero con contaminación de RNA.
Figura 26. Amplificación del producto de aproximadamente 210pb, con los iniciadores RST63 y RST64 para el género Acidovorax. Línea 1 a la 5 son cepas de Acidovorax aisladas de maíz cv AS7573, procedentes de Veracruz, México. Línea 6, control negativo (Erwinia spp), M= Marcador molecular de 100pb (Invitrogen).
RNA
AP PLANT-DNAZOL PLANT-DNAZOL
DNA
M 1 2 3 4 5 6
1500 Pb
500Pb
210 Pb
M 1 2 3 4 5 6
M 1 2 3 4 5 6
76
Figura 27. Incremento de la incidencia de Acidovorax avenae subs avenae en plantaciones de maíz del cv AS7573, en tres municipio de Veracruz, México, del 2006-2007.
ACICOSO ACITLALIX ACITLALIX ACIPASO ACIPASO
77
Figura 28. A) mapa de campo de la distribución y B) mapa tridimensional de la severidad del rayado foliar del maíz cv AS 7573 causado por acidovorax avenae subsp avenae. en Tlalixcoyan, Ver. 2006-2007.
A
B
78
3.8. LITERATURA CITADA
Alcántara, M. S. 2009. Detección e incidencia del fitoplasma Maize Bushy Stunt y su relación con el rendimiento en el maíz en el estado de Veracruz, México.Tesis maestría en ciencias, Colegio de Postgraduados, Montecillo,Texcoco. 36p.
Barret, T. J. 1975. Preparation of bacterial vaccine. Proceedings of the first workshop of Phytobacteriology. Goodman R. N. (ed.) Columbia. Missouri University. p. 1-6.
Bradbury JF, 1973. Pseudomonas alboprecipitans. CMI Descriptions of Pathogenic Fungi and Bacteria. No. 371.
Chavero. J. J. 2004. Control Químico in vitro de la bacteriosis del maíz (Herbaspirillum rubrisubalbicans). Tesis de licenciatura, departamento de Fitotecnia. Universidad Autónoma Chapingo. pp. 75.
CIMMYT. 2004. Enfermedades del Maíz: Una guía para su identificación en el campo. 4ed. Pp. 119.
De León, C. 1984. Enfermedades del Maíz. Una guía para su identificación en el campo. Centro Internacional de Mejoramiento de Maíz y Trigo, CIMMYT. 3a Edición. pp. 114.
Gijón, H. A., Téliz, O. D., Cárdenas, S. E., De León, C., Mora, A. A., Mejía, S. D., De La Torre, A. R and Quiroga, M. R. 2008. Leaf stripe and stem rot Caused by Burkholderia gladioli, a new disease of maize in México. Plant Dis, Volume 92, Number 8. pp1249.
Hu, F. P., Young, J. M, Triggs, C. M, Wilkie, J. P, 1997. Pathogenic relationships of the subspecies of Acidovorax avenae. Australasian Plant Pathology 26:227-238. View Abstract
McGee, D. C1988. Maize diseases. A reference source for seed technologists. St. Paul, Minnesota, USA: APS Press. View Abstract Minnesota, USA: APS Press. View Abstract
NCBI. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/. Información verificada el 1 de junio 2008.
Rodrigues, L. M., Silva, S., Gomes, J. E., Lopez., and Tsai, S. M. 2003. Detection and diversity assessment of Xylella fastidiosa in field-collected plant and insect samples by using 16S rRNA and gyrB secuence. Applied and Environmental Microbiology 69:4249-4255.
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79
Sambrook, J., Russell D. W. 2001. Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Third edition. 1:1.32-1.34. Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York.
Schaad, N. W., Jones, J. B, Chun W, 2001. Laboratory guide for identification of plant pathogenic bacteria. 3 . St. Paul, Minnesota, USA: APS Press.
Shakya, D. D., Chung, H. S, 1985. Pseudomonas avenae causing bacterial brown stripe disease of rice in Korea. Korean Journal of Plant Pathology 1:38-43.
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White, G. D. 2004. Plagas y Enfermedades del Maíz. The American Phytopathological Society. Ed. Mundi-prensa. 78p
80
CONCLUSIONES GENERALES
La epidemia del maíz que se presentó en el 2003-2004 en los municipios de
Tlalixcoyan, Cosoleacaque y Paso de Ovejas, Veracruz fue causada por un complejo
de patógenos. El fitoplasma Maize Bushy Stunt estuvo involucrado y fue motivo de una
tesis no incluida en la presente investigación. Tres bacterias fueron identificadas como
parte del complejo: BUrkholderia gladioli, Pantoea ananatis y Acidovorax avenae subsp
avenae.
La identificación de B. galdioli, se confirmó utilizando el análisis del rDNA 16s, rRNA
23s y con iniciadores para dominio, género y especie. El análisis filogenético y el uso
de enzimas de restricción indicaron que no existió variabilidad entre los aislamientos de
los tres municipios muestreados, lo que sugiere que el patógeno no se encontraba en
la región y fue introducido recientemente a México mediante semilla infectada. La alta
incidencia con que se presentó esta enfermedad en el 2003 disminuyó con el tiempo y
en 2007 la incidencia disminuyó aproximadamente a un 1%. Este es el primer reporte
de Burkholderia gladioli como patógeno del maíz (Zea mays) en México.
De acuerdo con las pruebas fisiológicas, bioquímicas, PCR y secuenciación, el agente
causal de la mancha foliar del maíz fue Pantoea ananatis. Este es el primer reporte de
esta enfermedad y del patógeno en México.
Las pruebas de patogenicidad demostraron que el cultivar comercial AS7573 se
presentó en 100% de plantas inoculadas mientras que en el cultivar Orca solamente
hubo una incidencia de 11.6 %. Temperaturas de 28-32C con una humedad relativa de
80% en invernadero fueron óptimas para el desarrollo de la enfermedad. El impacto en
81
el rendimiento y la calidad del grano de maíz ocasionada por Pantoea ananatis en
México no se ha determinado, por lo cual es necesario continuar la investigación para
entender la epidemiología de esta nueva enfermedad, y desarrollar estrategias de
manejo para reducir los riesgos y diseminación en zonas productoras de maíz.
Las plantas colectadas con síntomas de rayado foliar de maíz del cultivar comercial
AS7573, colectadas en Tlalixcoyan, Cosoleacaque y Paso de Ovejas, Veracruz fueron
afectadas por Acidovorax avenae subsp avenae, se confirmó utilizando el análisis
genotípico, fenotípico, pruebas bioquímicas y de patogenicidad. El alineamiento de las
secuencias nucleotidicas confirmaron su identidad filetica con el género Acidovorax. No
se estableció la identidad a nivel de especie, por comparación de secuencias
nucleotidicas, por la carencia de secuencias de Acidovorax. avenae en el Genbank.
Apesar que la incidencia de la enfermedad oscilo .entre 14.88% y 45.92 en el 2006 y
2007, a nivel nacional e internacional no hay muchos estudios sobre el comportamiento
de la bacteria.