AUTORIDADES DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE
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TRUJILLO QUE OTORGAN EL TÍTULO PROFESIONAL DE
BIÓLOGO-MICROBIÓLOGO
Dr. Orlando Velásquez Benites
RECTOR DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO
Dra. Vilma Julia Méndez Gil
VICE-RRECTOR ACADÉMICO DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE
TRUJILLO
Dra. Flor Marlene Luna Victoria Mori
VICERRECTORA ADMINISTRATIVA DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL
DE TRUJILLO
Dr. Regné Cortez Lara
SECRETARIO GENERAL DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO
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AUTORIDADES DE LA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO QUE
OTORGAN EL TÍTULO PROFESIONAL DE BIÓLOGO-
MICROBIÓLOGO
Dr. Hermes Mario Escalante Añorga
DECANO DE LA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
Dr. César Jara Campos
SECRETARIO DE LA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
MsC. Pedro Arnaldo Alvarado Salinas
DIRECTOR DE LA ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE
MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA
MsC. Iván Wilfredo Ángulo Castro
JEFE DEL DEPARTAMENTO DE LA ESCUELA ACADÉMICO
PROFESIONAL DE MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA
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DEL ASESOR
El que suscribe: Ms.C. Juan Héctor Wilson Krugg asesor de la presente tesis
titulada: Efecto “in vitro” de especies nativas de Trichoderma sobre la germinación y
crecimiento de Colletotrichum sp. aislado del distrito de Jaén – Cajamarca.
CERTIFICA:
Que la investigación ha sido desarrollada de conformidad con
su correspondiente proyecto y con las orientaciones pertinentes brindadas a la
tesista.
Que el presente informe ha sido redactado bajo mi asesoramiento, y acoge las
sugerencias y observaciones pertinentes. Por ello, autorizó a la Bachiller Sussy
Yolanda Torres García para continuar con los procedimientos según sus fines.
MSC Juan Hector Wilson Krugg
ASESOR
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PRESENTACIÓN
Cumpliendo con las disposiciones establecidas por el Reglamento de Grados y Títulos
de la Universidad Nacional de Trujillo, presento a su consideración y elevado criterio la
presente Tesis titulada: Efecto “in vitro” de especies nativas de Trichoderma sobre la
germinación y crecimiento de Colletotrichum sp. aislado del distrito de Jaén –
Cajamarca, con el objetivo de obtener el título profesional de Biólogo-Microbiólogo.
Esperando que vuestro criterio sea de comprensión por errores u omisiones
cometidos en la elaboración del presente trabajo, me someto a vuestro dictamen.
Trujillo, Mayo del 2012
Br. Sussy Yolanda Torres García
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MIEMBROS DEL JURADO
Blgo. Mlgo. Gerardo Alayo Espinoza
PRESIDENTE
Ms.C. Juan Héctor Wilson Krugg
SECRETARIO
Ms.C. Eduardo Muñoz Ganoza
VOCAL
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APROBACIÓN
Los profesores que suscriben, miembros del Jurado dictaminador, declaran que el
presente Informe de Tesis titulado: Efecto “in vitro” de especies nativas de Trichoderma
sobre la germinación y crecimiento de Colletotrichum sp. aislado del distrito de Jaén –
Cajamarca, ha cumplido con los requisitos formales y fundamentales, siendo
APROBADO por UNANIMIDAD.
Blgo. Mlgo. Gerardo Alayo Espinoza
PRESIDENTE
Ms.C. Juan Héctor Wilson Krugg
SECRETARIO
Ms.C. Eduardo Muñoz Ganoza
VOCAL
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DEDICATORIA
A Dios por darme la vida, salud, fortaleza, bienestar, ser mi guia y por las muchas
bendiciones en cada momento de mi vida
A mis queridos abuelitos, Juan José y Susana, y a mi madre Norma quienes
con su ejemplo, amor y confianza infinita; trabajo, esfuerzo y sacrificio
diario, lograron darme todo lo que necesito e hicieron posible la
culminación exitosa de mis estudios.
A mi hermana y mejor amiga Grecia que gracias a su ejemplo he podido aprender
muchas cosas importantes y a mi hermano Víctor quien me ayudó con su silencio para
cumplir mis objetivos.
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AGRADECIMIENTOS
Al Mblgo. Juan Wilson Krugg, profesor de la cátedra de Micología y
Fitopatología, por brindarme su amistad, confianza, sugerencias, apoyo constante y
asesoramiento para la realización y culminación este trabajo.
A mi familia, por su apoyo emocional y moral, en especial a esos
maravillosos abuelitos: Susana Pablo y Juan José García, que sin su ayuda,
tolerancia y comprensión no estuviera culminado el presente trabajo.
A mi Madre Norma Ruth García Pablo por su amor maternal, apoyo familiar
y económico, ya que sin su ayuda no se hubiera llevado a cabo la ejecución del
presente trabajo.
A un hombre maravilloso, José Miguel Nuntón León, por su amor
incondicional, apoyo y confianza depositada en mí.
Al círculo de tesistas de Fitopatología y grandes amigos como lo son
Daniela, Alexander, Cristofer, Nilda y el Profesor Miguel Muñoz; por su
desinteresado apoyo, pero sobre todo por su amistad y confianza depositada.
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RESUMEN
Se evaluó el efecto “in vitro” de tres especies nativas de Trichoderma sobre la
germinación y crecimiento de Colletotrichum acutatum. Para esto se recolectaron frutos
y hojas de café con síntomas de antracnosis y muestra de suelo de cultivo de café; de
los cuales se obtuvieron aislamientos nativos de Colletotrichum acutatum y
Trichoderma sp, respectivamente.
Para la evaluación de la germinación de C. acutatum, se obtuvieron mediante recuento
directo de conidias; el porcentaje promedio de la germinación conidial de C.
acutatum frente a Trichoderma viride, Trichoderma aureoviride y Trichoderma
harzianum nativas se encontró estadísticamente una diferencia significativa en dos de
las especies. Para la evaluación de la actividad antagónica de las tres especies
nativas de Trichoderma sobre C. acutatum se empleó la técnica de cultivo dual en
placa, donde los Trichoderma nativos obtuvieron un grado antagónico I según la
escala de Bell et al., los que fueron capaces de crecer sobre el fitopatógeno en condiciones
de laboratorio y Finalmente se realizó la técnica microcultivo con el método del bloque,
evidenciándose mediante observaciones microscópicas, los diferentes mecanismos de
micoparasitismo tales como; fragmentación, formación de clamidosporas,
enrollamiento, penetración y adherencia de las hifas del antagonista; además de la
deformación de las hifas del patógeno por efecto del antagonista.
Concluyendo, que Trichoderma viride, Trichoderma aureoviride y Trichoderma
harzianum nativas disminuyen la germinación conidial y el crecimiento de
Colletotrichum acutatum, siendo Trichoderma harzianum y Trichoderma viride las que
presentan mayor efecto sobre C. acutatum.
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INDICE
Pag.
AUTORIDADES DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO i
AUTORIDADES DE LA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS DE LA
UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO QUE OTORGAN EL TÍTULO
PROFESIONAL DE BIÓLOGO-MICROBIÓLOGO ii
ASESOR iii
PRESENTACIÓN iv
MIEMBROS DEL JURADO v
APROBACIÓN vi
DEDICATORIA vii
AGRADECIMIENTOS viii
RESUMEN ix
ÍNDICE x
INTRODUCCION 1
MATERIAL Y METODOS 6
1. Material biológico 6
2. Procedimiento 6
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2.1. Aislamiento y determinación de C. acutatum 6
2.1.1. Recolección de muestra 6
2.1.2. Aislamiento de C. acutatum 7
2.1.3. Determinación de C. acutatum 7
2.2. Aislamiento y determinacion de Trichoderma nativas 8
2.2.1. Recolección de muestra 8
2.2.2. Aislamiento de Trichoderma nat ivas 8
2.2.3. Determinación de Trichoderma nativas 9
2.3. Selección de Trichoderma “nativo” según su Crecimeinto 9
2.4. Evaluación del efecto invitro de Trichodermas nativas sobre C. acutatum. 9
2.4.1. Evaluación sobre la germinación 9
2.4.2 Evaluación sobre el crecimiento 10
RESULTADOS 13
DISCUSION 19
CONCLUSIONES 24
RECOMENDACIONES 25
REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS 26
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ANEXOS 39
Anexo 1: Hoja de Coffea arabica “café” con síntomas de antracnosis
Anexo 2: Observación macroscópica de Colletotrichum acutatum
Anexo 3: Observación microscópica de Colletotrichum acutatum
Anexo 4: Observación macroscópica de Trichoderma sp. “nativas”
Anexo 5: Acción de Trichoderma "nativas" sobre la germinación de C. acutatum
Anexo 6: Número de conidias germinadas de C. acutatum frente a la presencia de
Trichoderma nativas
Anexo 7: Anava de las esporas germinadas de C. acutatum
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INTRODUCCION
La antracnosis es una enfermedad de zonas altas y húmedas pero está en todas las
zonas cafetaleras1, donde afecta principalmente las plantas que tienen mala
fertilización5, que les falta agua
6y que tiene demasiados herbicidas en su sistema
7. Los
principales síntomas son: Las hojas con manchas negras y halo clorótico de bordes
regulares, esto generalmente comienza desde el borde de la hoja y causa su caída
incluso hasta de las ramas, de la misma manera en los frutos comienza con la aparición
de manchas negras para luego producir pudrición2,3,4
, por lo que causa grandes
pérdidas economicas1 La enfermedad suele aparecer cuando hay mucha lluvia, mucho
sol y poca fertilidad.8,9,10,11,12
Colletotrichum sp., causante de la antracnosis, es un hongo que en la naturaleza vive
de la materia orgánica y en ocasiones especiales tiene la capacidad de volverse
patógeno, prefiriendo atacar tejidos muy jóvenes o tejidos muy viejos y físicamente
débiles. Los ataques más severos a los frutos ocurren cuando coinciden el estado más
susceptible del cultivo (floración, fructificación) con un tiempo lluvioso y días de
permanente humedad relativa, mayor del 90%.13
Al menos tres especies de
Colletotrichum se han asociado comúnmente con las plantas de café: C. gloesporoides,
C. acutatum y C. coffeanum, causando enfermedades como la antracnosis de las hojas,
muerte regresiva, quemazón de los frutos maduros y la enfermedad de las cerezas
verdes del café o CBD14
. La alta diversidad encontrada en el amplio grupo de especies
del genero Colletotrichum han sido muy problemática, ya que el diagnostico
fitopatológico requiere identificar con precisión patógenos específicos a fin de realizar
un mejor control de enfermedades. 15,16,17,18,7
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La incidencia de esta enfermedad se incrementa debido a factores como la selección
inadecuada de zonas agroecológicas, distancias de siembra, drenaje, podas,
fertilización, deficiente recolección de frutos afectados e inadecuado uso de
fungicidas.19,8.
Son diversos los métodos de control que se emplean para disminuir la
densidad de Colletotrichum sp., asi tenemos métodos preventivos y prácticas
culturales como un buen programa de fertilización y drenaje, control de maleza y poda
fitosanitaria anual, también el control del exceso de exposición solar favorece el
desarrollo de la enfermedad. Pero el método más usado y el cual tiene mayor
importancia actualmente es el uso de métodos químico incluyendo los productos a
base de cobre (oxicloruro de cobre 50%, Hidroxido de cobre 50%, sulfato de cobre
llamado caldo bordeles o caldo sulfocalcico)20,11
, también conocidos comercialmente
como el Benlate, Dithane M – 45, Daconil, los que representan del 40 al 60% del costo
total de producción21 y 22
. Sin embargo, su uso inadecuado e indiscriminado contamina
el ambiente, desencadenando resistencia del hongo a los fungicidas y toxicidad a
diferentes organismos23
, así como la aparición de organismos plagas secundarios
debido a la eliminación de sus enemigos naturales, acumulación de residuos químicos
en el medio ambiente, un progresivo deterioro del agroecosistema, e intoxicaciones y
enfermedades en el hombre. 24 y 25
Esto ha motivado la búsqueda de métodos alternos de control eficientes, estables,
económicas y compatibles con el medio ambiente26, 12
para el manejo integral de la
enfermedad en particular y el cultivo en general, proponiéndose así el uso de
organismos, entre ellos los hongos, como agentes de control, es decir, el control
biológico. 21,27, 28 29
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Entre los controladores biológicos tenemos a Trichoderma spp.30, 31
que es un hongo
antagonista de hongos fitopatógenos que afectan a cultivos hortícolas. 32, 33
Los
antagonistas contribuyen a la atenuación de los daños que causan las enfermedades, en
los agroecosistemas donde existan condiciones para su desarrollo y conservación. Para
lograr este objetivo los microorganismos beneficiosos presentan diferentes modos de
acción que les permitan ejercer su efecto bioregulador. Estos atributos, junto con la
capacidad que tienen de multiplicarse, se encuentran entre los de mayor importancia
para su selección como agentes de control biológico. 34,35
Se conocen numerosos hongos que se comportan como antagonistas de
Collectotrichum sp.; especies saprofitas del género Trichoderma, habitantes del suelo,
figuran entre los biocontroladores más prometedores e investigados. En el país se
ensayaron varias especies de Trichoderma, obtenidas de diferentes cultivos y
procedencias, para determinar su capacidad antagónica frente a aislamientos del
fitopatógeno. 36,37,10
El género Trichoderma presenta varias especies como T. viride, T.
harzianum, T. virens, T. aureoviride, T. hamatum, T. koningii, de las cuales la primera
ha sido la mas estudiada entre numerosos agentes de control biológico, por sus
características de antagonismo en condiciones naturales12,38,39
; además se comporta
como un hiperparásito frente a un amplio rango de hongos fitopatogenos entre los
cuales esta Rhizoctonia solani40
, Sclerotium cepivorum41,42
, Pythium spp43
,
Phytophthora capsici29
, Fusarium oxysporum
44,45 y Colletotrichum spp.
46
Trichoderma como antagonista tiene diferentes mecanismos de acción entre los que se
encuentran el micoparasitismo que se refiere al parasitismo de las hifas del
fitopatógeno por las hifas del Trichoderma, la competencia por el sustrato y nutrientes
y, la actividad antibiótica producida por metabolitos que inhiben la actividad parasítica
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de los fitopatogenos. 38,47,48,49,50,51,52,53
. En la búsqueda del desarrollo de una tecnología
para la producción de un agente de control biológico se debe dar énfasis a la obtención
de aislamientos nativos, considerados potenciales controladores biológicos ya que
reducen enfermedades en plantas al ser aplicados en campo debido a que presentan un
comportamiento que se adecua a las condiciones agroecológicas de una determinada
región 28,8
que estos a su vez son capaces de mantener su viabilidad, patogenicidad y
virulencia. En este sentido, Smith et al54
señalan que es mejor el aislamiento de un
antagonista que proviene de la misma zona de donde se encuentra el fitopatógeno,
debido a que cada zona geográfica presenta durante el año rangos propios de
temperatura, humedad relativa, pH, etc. 48,55, 56.
Dado que la localidad de Jaén es una de las principales zonas que exporta café
orgánico en nuestra región3 y siendo la antracnosis una enfermedad importante hoy en
día que afecta la calidad del café y produce grandes pérdidas económicas para los
agricultores, los biocontroladores como Trichoderma sp. ofrecen buenas posibilidades
para controlar esta enfermedad y reducir el impacto negativo sobre el medio ambiente,
además que se esta estudiando el uso de hongos antagonistas del genero Trichoderma
“nativos” que tienen ventajas selectivas frente a Trichodermas exógenas, debido a la
gran tolerancia a las condiciones ambientales de su región (Temperatura, humedad
relativa, radiación solar), y fácil adaptación a los cultivos contaminados con
significativas cantidades de productos agroquímicos. Es necesario el conocimiento del
efecto que pueden ejercer las Trichoderma “nativas” al Colletotrichum sp. para
generar información básica para el control biológico de la antracnosis en café
ofreciendo una alternativa ecológica a nuestro agro ecosistema. Por lo que el presente
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trabajo tiene como objetivo conocer el efecto “in vitro” de tres especies nativas de
Trichoderma sp. sobre Colletotrichum sp aislado de Coffea arabica.
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MATERIAL Y METODOS
1. Material de estudio
Diez racimos de Coffea arabica “café arabica" con síntomas característicos de ataque
por Colletotrichum sp. recolectados de la provincia de Jaén del departamento de
Cajamarca.
Un Kg de suelo del cultivo de Café proveniente de la provincia de Jaén del
departamento de Cajamarca.
Cultivo puro de Trichoderma viride proveniente del SENASA
proporcionado por la Cátedra de Fitopatología del Departamento de
Microbiología y Parasitología. Universidad Nacional de Trujillo.
2. Procedimiento
2.1. Aislamiento y determinación de Colletotrichum sp.
2.1.1. Recolección de muestra57
Se recolectaron frutos y hojas de Café con síntomas de
antracnosis por Colletotrichum acutatum, los que se colocaron en
bolsas de papel de primer uso, previamente rotulados, para
posteriormente ser trasladados al Laboratorio de Fitopatología del
Departamento de Microbiología y Parasitología de la Facultad de
Ciencias Biológicas de la Universidad Nacional de Trujillo.; las
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muestras fueron procesadas con el fin de diagnosticar infección por
Colletotrichum acutatum.
2.1.2. Aislamiento de Colletotrichum spp.
De las muestras de hojas de Café recolectadas se separaron las
que presentaban estado de infección intermedia a partir de las cuales se
cortaron los bordes obteniendo parte sana y parte enferma de la hoja
teniendo un tamaño aproximado de 0.5cm2. Previa descontaminación se
continuó el proceso de aislamiento sembrándolo en placas Petri
conteniendo el medio de cultivo Agar Sabouraud más antibiotico, las
mismas que se incubaron en estufa a (25 ± 2ºC). Luego de 5 días se
observó el color, forma y textura de las colonias que se formaron.
2.1.3. Determinación de C. acutatum.
Las colonias que macroscopicamente correspondían a
Colletotrichum sp. se sembraron en tubos de ensayo conteniendo
Agar Sabouraud (ASb) y fueron incubadas a temperatura ambiental
(25 ± 2°C) por cinco días, a fin de obtener un cultivo puro, luego a partir
de éstos se realizaron los microcultivos correspondientes para que
finalmente según las características culturales macroscópicas y mediante
el uso de claves taxonómicas de Gilman58
y Barnett59
determinar que las
colonias obtenidas correspondían a C. acutatum.
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2.2. Aislamiento y determinación de Trichoderma nativas
2.2.1. Recolección de muestra
Se seleccionaron cinco puntos al azar del terreno de cultivo de
café y de cada punto, a una profundidad de 10cm. se recolectó 200g
de suelo, los que se depositaron en bolsas plásticas de primer uso
previamente rotuladas, las que posteriormente se trasladaron al
Laboratorio de Fitopatología de la Facultad de Ciencias
Biológicas Departamento de Microbiología y Parasitología de la
Universidad Nacional de Trujillo para su procesamiento.
2.2.2. Aislamiento de Trichoderma nativas60
Se pesó 10g de la muestra de suelo previo homogenizado, los
cuales se vertieron en 90mL de agua destilada estéril (dilución 10-1
),
posteriormente se tomó 1 mL de la dilución mencionada y se mezcló
en 9mL de agua destilada estéril (dilución 10-2
); repitiéndose
sucesivamente este procedimiento hasta la obtención de una dilución
de 10-4
. Terminado el protocolo anterior se sembró 0,1mL de cada una
de las tres últimas diluciones en placas de Petri conteniendo Agar
Sabouraud (ASb) más estreptomicina (antibiótico), luego se
homogenizó con ayuda de una asa de Drigalsky y finalmente se
incubaron a temperatura ambiental (25 ± 2°C) durante cinco días.
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2.2.3. Determinación de Trichoderma nativas
Las colonias que correspondían a Trichoderma .spp se
sembraron en tubos de ensayo conteniendo Agar Sabouraud (ASb), e
incubaron a temperatura ambiental (25 ± 2°C) por cinco días a fin de
obtener cultivos puros. Transcurrido el tiempo de incubación, se
realizaron los microcultivos correspondientes posteriormente según las
características culturales macroscópicas, microscópicas observadas en el
microcultivo y mediante el uso de claves taxonómicas de Kubicek y
Harman52
se determino las especies de Trichoderma.
2.3. Selección de Trichoderma nativas según su crecimiento.
Se sembraron por puntura en placas de Petri conteniendo ASb, a cada
una de las Trichoderma spp. nativas aisladas del suelo, se incubaron a temperatura
ambiental (25 ± 2°C) y se midió el crecimiento cada 12 horas hasta que cubriera
la placa de Petri, seleccionándose las Trichoderma nativas que presentaron
el mayor crecimiento y esporulación en comparación con Trichoderma
viride utilizado como testigo.
2.4. Evaluación del efecto in vitro de especies nativas de Trichoderma spp.
sobre la germinación y el crecimiento de Colletotrichum acutatum
2.4.1. Evaluación sobre la germinación62
Se obtuvo un inóculo de esporas para cada especie nativa de
Trichoderma mediante una suspensión en agua destilada estéril y se
realizaron diluciones sucesivas hasta conseguir una concentración
de 3.4 x103 esporas/mL. Paralelamente se preparo un inóculo de
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esporas de C. accutatum también con una concentración de 3.4
x103 esporas/mL.
Se colocaron 0.01mL de la suspensión de esporas de C. acutatum en
un frasco de penicilina al cual se le agrego 0.01m1 de la suspensión de
esporas de Trichoderma nativa obtenida previamente. Se prepararon
controles que consistían en colocar 0.01 ml de la suspensiones
de esporas de C. acutatum en 0.01mL de agua destilada estéril. Todos
los frascos en evaluación se incubaron a temperatura ambiental (25 ± 2°C)
durante 24 horas, a cuyo termino se realizo el conteo microscópico de
conidias germinadas y no germinadas de C. acutatum cuyos resultados
se expresaron en porcentajes de la germinación conidial de C.
acutatum.
Finalmente el análisis estadístico se llevó a cabo en base a la prueba
de Análisis de Varianza mediante el Programa Estadístico SPSS, para la
comparación entre los resultados de el porcentaje de la germinación de
C. acutatum frente a cada especie de Trichoderma "nativas"
2.4.2. Evaluación sobre el crecimiento
a. Observación macroscópica del micoparasitismo
En placas de Petri conteniendo ASb se sembraron en
posiciones opuestas y equidistantes a C. acutatum y a cada una de las
especies nativas seleccionadas de Trichoderma, las que se incubaron
a temperatura ambiental (25 ± 2°C) durante siete días. Se
procedió de la misma manera para el caso de Trichoderma
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viride procedente de SENASA, que fue utilizado como control.
A los siete días de incubación se evaluó el grado de
antagonismo según la escala de Bell y col.23
, donde:
Grado Antagónico l: Trichoderma spp. crece completamente sobre la
colonia del patógeno y cubre la superficie del medio de cultivo.
Grado Antagonico 2: Trichoderma spp. crece al menos en las dos
terceras partes de la superficie del medio de cultivo.
Grado Antagonico 3: Trichoderma spp. y el patógeno cubren
aproximadamente la mitad de la superficie del medio de cultivo.
Grado Antagonico 4: El patógeno crece al menos en las dos terceras
partes del medio de cultivo limitando el crecimiento de Trichoderma .spp.
Grado Antagónico 5: El patógeno crece sobre la colonia de
Trichoderma .spp. ocupando toda la superficie del medio de cultivo.
b. Observación microscópica del micoparasitismo48, 61
En una cámara húmeda constituida por una placa de Petri estéril en
cuyo interior se encontraba una lámina portaobjeto ubicada sobre
soportes de vidrio, se colocó en forma aséptica sobre el portaobjeto en
posiciones opuestas y equidistantes dos bloques de ASb de 1 cm2, luego
en uno de los bloques de ASb se sembró C. acutatum y se incubaron
durante 24 horas. Una vez transcurrido este tiempo se procedió a sembrar
en el otro bloque a una de las especies nativas de Trichoderma, se
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procedió de la misma manera para enfrentar contra C. acutatum a las
otras especies nativas así como para Trichoderma viride procedente
de SENASA utilizada como control. A continuación se coloco una
lámina cubreobjeto estéril encima de los bloques de ASb y se agregó al
fondo de la placa, agua destilada estéril; finalmente se incubaron a
temperatura ambiental (25 ± 2°C). Después de cinco días se retiro en
forma cuidadosa el cubreobjeto al cual se habían adherido los hongos y se
coloco sobre una lámina portaobjeto con una gota azul de lactofenol, e
inmediatamente se sello por los bordes; para finalmente realizar
una observación microscópica a fin de observar el
micoparasitismo.
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RESULTADOS
En la figura 1 se observa que los porcentajes de germinación conidial de C.
acutatum, disminuyen frente a las especies nativas de Trichoderma viride, Trichoderma
aureoviride y Trichoderma harzianum y de Trichoderma viride SENASA.
En la figura 2 se muestra que T. viride, T. aureoviride y T. harzianum nativas
presentan un antagonismo clase 1 sobre el crecimiento de C. acutatum , a diferencia de T.
viride SENASA que presento un grado antagónico 2.
En la evaluación microscópica se evidencio los niveles de micoparasitismo de T.
viride, T. aureoviride y T. harzianum nativas obre C. acutatum. tales como;
fragmentación, vocuolización y adherencia de las hifas del antagonista, así mismo la
deformación y formación de clamidosporas de las hifas del fitopatógeno por efecto del
antagonista (Figura 3, 4, 5).
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Fig. 1. Porcentaje de la germinación conidial de Colletotrichum acutatum frente a
Trichoderma viride SENASA y a Trichoderma viride, Trichoderma
aureoviride y Trichoderma harzianum nativas.
.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Control T.viride (SENASA)
T. viride T. harzianum T. aureoviride
100
53.8
24.3
29.9
48.2
% de la germinacion conidial de C. acutatum
a
b
c
c
b
a: p< 0.05 : Si existe diferencia significativa.
b: p> 0.05 : No existe diferencia significativa.
c: p> 0.05 : No existe diferencia significativa.
T.viride SENASA y especies nativas de Trichoderma
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Figura 2. Efecto antagónico de Trichoderma viride SENASA y de las especies nativas
de Trichoderma sobre el crecimiento de C. acutatum, evaluado mediante la técnica de
cultivo dual, observándose un antagonismo de clase 2; a) T. viride SENASA frente a C.
acutatum. y antagonismo de clase 1 b) T. viride frente a C. acutatum c) T. aureoviride
frente a C. acutatum.; d) T. harzianum frente C. acutatum
a) T. viride SENASA
vs C. acutatum
b) T. viride vs
C. acutatum
c) T. aureoviride vs
C. acutatum
d) T. harzianum vs
C. acutatum
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Figura 3. Vista microscópica del efecto micoparasitico de las hifas de Trichoderma viride
sobre las hifas de C. acutatum donde se observa: a) adherencia b) Formación de
clamidosporas c) fragmentanción d) Deformación.
a b
c d
Clamidospora
Adherencia
Deformación Fragmentación
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Figura 4. Vista microscópica del efecto micoparasitico de las hifas de Trichoderma
aureoviride sobre las hifas de C. acutatum donde se observa: a) Adherencia b)
Fragmentación c) Vacuolización d) Formación de clamidosporas.
a b
c d
Fragmentación
Vacuolizacion Clamidosporas
Adherencia
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Figura 5. Observación microscópica del efecto micoparasitico de las hifas de Trichoderma
harzianum sobre las hifas de C. acutatum: a) Adherencia b) Fragmentación c) Formación
de clamidosporas d) Deformación e) Penetración f) Enrollamiento.
c d
f e
a
b Adherencia
Fragmentación
Clamidospora Deformación
Penetración Enrollamiento
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DISCUSION
Los resultados de esta investigación demostraron que los aislamientos nativos
de Trichoderma viride, Trichoderma aureoviride y Trichoderma harzianum presentan
un claro efecto antagónico sobre la germinación y el crecimiento del aislamiento nativo
de Colletotrichum acutatum. En relación a la evaluación in vitro de la germinación
conidial de C. acutatum, esta disminuye significativamente en presencia de las
conidias de T. viride, T. aureoviride y T. harzianum nativas al compararse con el
control, teniendo un porcentaje de germinación entre un 24.3 a 48.2 % (Figura 1), Esta
disminución de la germinación se debe a que las especies Trichoderma tiene la
capacidad de generar enzimas hidroliticas y otras sustancias que disminuyen la
germinación, respecto a esto Carsolio et al.81
menciona al sistema quitinolitico
de un aislado de Trichoderma (aislado TM), el cual está compuesto de dos
enzimas β 1.4-Nacetilglucosaminidasa y cuatro endoquitinasas, donde la enzima
individual más interesante del complejo es la endoquitinasa (42-kDa), la cual puede
hidrolizar in vitro la pared celular de C. acutatum y reducir la germinación de las
esporas y del tubo de elongación de diversos hongos fitopatogenos. Por otra parte, Lorito
et al.33
agregan que la purificación de dos enzimas de Trichoderma harzianum,
degradadoras de la pared celular, la N-acetyl-13-glucosaminidase y 13-1,3-
glucanasa (glucan 1,3-0- glucosidasa) poseen un efecto inhibitorio sinérgico, sobre
la germinación y elongación del tubo germinativo del fitopatógeno, cuando estas
enzimas son aplicadas juntas. También se conoce que Trichoderma genera sustancias
hidrófobas las cuales recubren las esporas del hospedero evitando de esta manera la
afinidad por el agua y así mismo el ingreso de ésta, inhibiendo así la germinación de la
espora del fitopatógeno.
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También podemos evidenciar mediante los resultados que existe una disminución
estadísticamente significativa de la germinación conidial de C. acutatum en presencia de
T. viride y T. harzianum nativos en relación a T. viride procedente de SENASA. Al
respecto Baker y Cook 90
mencionan que los controladores biológicos nativos presentan
una ventaja frente a los controladores biológicos foráneos, de que estos nativos ya
tienen caracteres fisiológicos adaptados a las condiciones ecológicas locales en pro del
control del fitopatógeno. 91
y además tienen como ventaja el reconocimiento inmediato
del fitopatógeno lo cual le brinda un ataque antagónico más agresivo y menor
resistencia del fitopatógeno por lo que puede hacer un control más efectivo.85,92
También se evidencia un porcentaje de germinación conidial menor de C. acutatum
frente a T. viride y T. harzianum nativos los cuales tienen diferencia significativa con
respecto al control y en cuanto a T. aureoviride, esto es debido a que T. harzianum y T.
viride son las especies que tienen la habilidad de generar mayor producción de
metabolítos y enzimas como lectinas las cuales están involucrados en el reconocimiento
y especificidad del ataque al hospedero por parte del agente antagónico79
y en la
interacción hospedero – micoparasito.89
En relación a la evaluación antagónica se puede observar que los T.viride T. harzianum
y T. aureoviride nativos presentan un grado antagonista clase 1 a diferencia del T.
viride procedente de SENASA el cual presenta un grado antagonista clase 2. Estos
resultados confirma lo reportado por varios autores quienes obtuvieron una eficiencia
entre 70% y un 100% de la actividad biocontroladora de cepas nativas de
Trichoderma, de grado antagonico 1, frente a patógenos como Phytophthora capsici29
,
Fusarium oxysporum44,45,64
, Pythium spp43
, Rhizoctonia solani40,65,66
, Botrytis cinerea y
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Oidium sp.67
, Sclerotium cepivorum41,42,68
,Sclerotinia sclerotiorum69
, Alternaria dauci70
y
Colletotrichum spp.46,71,72
Según Suton J. et al. nos menciona que Trichoderma se
caracteriza por un crecimiento rápido el cual ofrece una ventaja importante en la
competencia por espacio y nutrientes el cual ejerce biocontrol al reducir o detener
completamente el desarrollo del micelio del fitopatogeno63,73
y asi mismo crecer cubriendo
la colonia del fitopatogeno.75,40,94
Uno de los mecanismo que utiliza Trichoderma es la producción de
moléculas toxicas volátiles o enzimas hidrolíticas76,77
como son quitinasas, glucanasas,
lipasas y proteasas; las cuales se inducen durante la acción parasítica de las especies de
Trichoderma sobre algunos hongos patógenos80,81
donde las enzimas disuelven o dañan
polímeros estructurales, como quitina y glucanos de la pared celular de los hongos
fitopatógenos, produciendo un efecto adverso sobre su desarrollo82
. En cuanto a los
resultados, en la Figura 2 nos permite visualizar que los Trichoderma nativos tienen
un grado mayor de antagonismo in vitro logrando sobrecrecer en su totalidad en la
colonia de C. acutatum, esto se debe a que son hongos antagonistas adaptados a las
condiciones ambientales y generan un ataque in vitro mas agresivo por tener un previo
reconocimiento del fitopatógeno, atribuyendo a su actividad antagónica de
micoparásitos, la producción de ciertos metabolítos difusibles y altamente tóxicos de
naturaleza enzimática acompañados por otros compuestos antibióticos encargados de la
inhibición del crecimiento y la actividad parasítica del patógeno tales como;
viridin, trichodermin, gliotoxin, harzaniolide83
, trichotoxina, gliovirina entre otros84
generados en cantidades que causan la muerte o destrucción de su hospedero78,79
;.
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Estas observaciones coinciden con Malajczuk95
donde señala que cepas nativas de
Trichoderma sobrecrecen y parasitan mejor a Phytophthora que las Trichoderma
exógenas. De la misma manera Aranzazu et al.13
obtuvieron resultados semejantes,
donde especies nativas de Trichoderma viride y T. harzianum nativos, especies
ampliamente citadas como antagonistas para el control de Colletotrichum sp., fueron
capaces de inhibir el crecimiento de este fitopatógeno; además resultados comparados por
Freeman et al.88
quienes aislaron cepas nativas de Trichoderma, capaces de reducir el
crecimiento de C. acutatum en ensayos en condiciones controladas.
En el micoparasitismo, cuando el micoparásito llega al hospedero, las hifas se enrollan
alrededor o son adheridas al hospedero y algunas veces penetran en él81
, siendo la
penetración del antagonista al micelio del fitopatógeno aparentemente debida a la parcial
degradación de la pared celula79
. Mediante observaciones microscópicas de los
puntos de interacción entre los micelios de las especies T. viride, T. harzianum,
T. aureoviride nativos y C. acutatum (Figura 3, 4, 5), se observa que el antagonista
establece un contacto estrecho con el patógeno mediante la adherencia (Figura 3.a , 4a
y 5a ) y el enrollamiento de las hifas y (Figura 5f ); resultados similares fueron
reportados por Elad et al79
, Benhamou y Chet85
y Benhamou et al.86
, quienes presentaron
evidencias del enrollamiento de Trichoderma spp. en hifas de varios fitopatógenos, entre
ellos R. solani, S. rolfsii . Después de cinco días, el antagonista se multiplico
abundantemente; observándose signos de deformación, como las aparentes arrugas
de las hifas del hospedero (Figura 3d y 5.d); hallazgos también reportados por
Benhamou et al.86
y Calistru et al.87
quienes sugieren que este fenómeno es debido a la
excreción de metabolítos extracelulares o compuestos volátiles una vez que el contacto
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entre ambas panes se establece, ocurriendo posteriormente la pérdida de turgencia del
micelio del fitopatógeno provocando su muerte.
Estos resultados junto con las pruebas de enfrentamiento demuestran la capacidad
antagónica que tienen los aislamientos nativos de Trichoderma en condiciones de
laboratorio; ya que además de inhibir el crecimiento vegetativo y la formación de
clamidosporas en el patógeno (Figura 3b, 4d, 5c) parasitan sus hifas, fragmentándolas
(Figura 3c, 4b, 5b) e impidiendo su desarrollo61
; asi los tres aislamientos nativos reúnen
las características para ser catalogados como controladores biológicos de C.
acutatum destacando la mayor efectividad en las especies T. viride y T.
harzianum las cuales tienen buenas perspectivas para ser utilizados en campo
por ser aislamientos nativos con comportamientos que se adecuan a las condiciones
agroecológicas como son temperatura, humedad relativa, radiación solar, además de
poseer tolerancia y adaptación a cantidades significativas de productos
agroquímicos.
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CONCLUSIONES
Trichoderma viride, Trichoderma aureoviride y Trichoderma harzianum
nativos disminuyen la germinación conidial de Colletotrichum acutatum.
Trichoderma harzianum y Trichoderma viride son las especies que presentan
mayor efecto sobre la germinación de C. acutatum, no existiendo diferencia
significativa entre estas últimas.
T. viride, T. aureoviride, T. harzianum nativas disminuyen el crecimiento de C.
acutatum.
T. viride, T. aureoviride, T. harzianum nativas presentan adherencia,
enrollamiento, fragmentación, vacuolización y penetración sobre las hifas de C.
acutatum.
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RECOMENDACIONES
Tener en cuenta los factores ambientales como la temperatura y la
humedad para el crecimiento de Trichoderma spp. Para poder identificar las
variaciones fisiológicas de Trichoderma frente a los distintos factores ambientales
locales en donde será aplicado como controlador biológico.
Realizar ensayos en condiciones semicontroladas (en invernadero) y en
condiciones de campo. Para identificar ciertos factores que influyen negativamente o
positivamente con la optima función controladora.
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ANEXOS
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Anexo 1: Hojas de café con síntomas de antracnosis producidas por Colletotrichum
acutatum recolectados de Jaen – Cajamarca.
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Anexo 2: A) Observación macroscópica de Colletotrichum acutatum aislado a partir de
hojas de café. B) Observación microscópica de Colletotrichum acutatum aislado a partir
de hojas de café
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Anexo 3: Observación macroscópica de las Trichodermas spp. “nativas” aisladas a
partir de suelo de cultivo de Café.
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Anexo 4. Número de conidias germinadas de C. acutatum frente a la presencia de las
conidias de T. viride T. harzianum y T aureoviride a las 24 horas de incubación.
Ensayo
A.D.E Conidias
de T. viride
SENASA
Conidias de
T. viride
Conidias
de T.
harzianum
Conidias de
T.
aureoviride
1 73 41 18 16 32
2 83 61 17 18 35
3 58 65 17 30 36
× 71.3 55.7 17.3 21.3 34.3
Nº de conidias germinadas de C. acutatum Vs.
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Anexo 5. Análisis de varianza del porcentaje de germinación ce C. acutatum frente a las
diferentes especies de Trichoderma
ANOVA de un factor
ANOVA
PG
Suma de
cuadrados gl
Media
cuadrática F Sig.
Inter-
grupos 10728.964 4 2682.241 95.095 .000
Intra-
grupos 282.060 10 28.206
Total 11011.024 14
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Anexo 6. Poblaciones estadísticas encontradas al comparar el porcentaje de C. acutatum
frente a las diferentes especies de Trichoderma
Subconjuntos homogéneos
PG
HSD de Tukey
TTO N Subconjunto para alfa = .05
1 2 3 1
C. acutatum
vs T. viride
3 24.2667
C. acutatum
vs T.
harzianum
3 29.9000
C. acutatum
vs T.
aureoviride
3 48.1667
C. acutatum
vs T. viride
SENASA
3 53.7667
C. acutatum 3
100.000
0
Sig. .698 .702 1.000
Se muestran las medias para los grupos en los subconjuntos homogéneos.
a Usa el tamaño muestral de la media armónica = 3.000.
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