ACTUALIZACIÓN SOBRE EL DESARROLLO DE MEDIOS DE CULTIVO CROMOGÉNICOS Y
FLUOROGÉNICOS
CUBADr.C.T.Claudio Rodríguez MartínezDirector de InvestigacionesCentro Nacional de Biopreparados
DISEÑO DE MEDIOS CULTIVO
BIOQUÍMICA QUÍMICAMICROBIOLOGÍA QUÍMICA
TECNOLOGÍA
NECESIDAD DE OPTIMIZAR LOS NECESIDAD DE OPTIMIZAR LOS MMÉÉTODOS DE AISLAMIENTO E TODOS DE AISLAMIENTO E IDENTIFICACIIDENTIFICACIÓÓNN
EMPLEO DE MEDIOS DE EMPLEO DE MEDIOS DE CULTIVO QUE CUMPLAN CULTIVO QUE CUMPLAN
CON LAS NUEVAS CON LAS NUEVAS EXIGENCIAS DEL EXIGENCIAS DEL
DIAGNDIAGNÓÓSTICO MODERNOSTICO MODERNO
MAYORMAYORRAPIDEZRAPIDEZ
¿¿CUCUÁÁLES SON LAS EXIGENCIAS MODERNAS PARA LES SON LAS EXIGENCIAS MODERNAS PARA EL DIAGNEL DIAGNÓÓSTICO MICROBIOLSTICO MICROBIOLÓÓGICO?GICO?
ELEVADAELEVADAESPECIFICIDADESPECIFICIDAD
ALTAALTASENSIBILIDADSENSIBILIDAD
AUMENTO DE LA ESPECIFICIDAD Y SENSIBILIDAD DIAGNAUMENTO DE LA ESPECIFICIDAD Y SENSIBILIDAD DIAGNÓÓSTICA STICA MEDIANTE MODIFICACIONES A LAS FORMULACIONES EXISTENTES MEDIANTE MODIFICACIONES A LAS FORMULACIONES EXISTENTES
MINIATURIZACIMINIATURIZACIÓÓNN
EMPLEO DE NUEVOS AGENTES GELIFICANTES Y SOPORTES QUE EMPLEO DE NUEVOS AGENTES GELIFICANTES Y SOPORTES QUE SUSTITUYAN EL AGARSUSTITUYAN EL AGAR
MEDIOS CON SUSTRATOS CROMOGMEDIOS CON SUSTRATOS CROMOGÉÉNICOS, FLUOROGNICOS, FLUOROGÉÉNICOS NICOS U OTROS OBTENIDOS POR SU OTROS OBTENIDOS POR SÍÍNTESISNTESISAUMENTO DE LA PRODUCCIAUMENTO DE LA PRODUCCIÓÓN DE MEDIOS LISTOS PARA EL USON DE MEDIOS LISTOS PARA EL USO
NUEVOS CONTENEDORES PARA LOS MEDIOSNUEVOS CONTENEDORES PARA LOS MEDIOS
NUEVOS MEDIOS PARA MICROORGANISMOS MANIPULADOS NUEVOS MEDIOS PARA MICROORGANISMOS MANIPULADOS GENGENÉÉTICAMENTE, O PARA MICROORGANISMOS ANTES NO ESTUDIADOS O TICAMENTE, O PARA MICROORGANISMOS ANTES NO ESTUDIADOS O CULTIVADOS CULTIVADOS
NUEVOS MEDIOS PARA LA PRODUCCINUEVOS MEDIOS PARA LA PRODUCCIÓÓN DE METABOLITOS A NIVEL N DE METABOLITOS A NIVEL INDUSTRIALINDUSTRIAL
AUTOMATIZACIAUTOMATIZACIÓÓN DE LA INOCULACIN DE LA INOCULACIÓÓN, LECTURA DE RESULTADOS, Y N, LECTURA DE RESULTADOS, Y CCÁÁLCULOS DE LOS MEDIOSLCULOS DE LOS MEDIOS
TENDENCIAS ACTUALES EN EL DESARROLLO TENDENCIAS ACTUALES EN EL DESARROLLO DE LOS MEDIOS DE CULTIVO Y SU EMPLEODE LOS MEDIOS DE CULTIVO Y SU EMPLEO
Dr.C.T.Claudio Rodríguez Martínez. CNB
MEDIOS DE CULTIVOMEDIOS DE CULTIVO
CROMOGCROMOGÉÉNICOS Y FLUOROGNICOS Y FLUOROGÉÉNICOSNICOS
MedioMedio
Medio
ETIOLOGETIOLOGÍÍAA
Pueden ser considerados, Pueden ser considerados, como tales, aquellos medios como tales, aquellos medios que incluyen, en su que incluyen, en su formulaciformulacióón final, uno o mn final, uno o máás s sustratos cromogsustratos cromogéénicos y/o nicos y/o fluorogfluorogéénicosnicos
DEFINICIDEFINICIÓÓN No. 1N No. 1
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DEFINICIDEFINICIÓÓN No. 2N No. 2Pueden considerarse aquellos medios de cultivo que están destinados a identificar los microorganismos sobre la base de reacciones enzimáticas típicas, dando lugar a la rotura del enlace entre el sustrato de la reacción enzimática y un grupo cromóforo o fluoróforo unido a dicho sustrato y provocando con ello un cambio de color o emisión de luz.
AguaAguaSustratos cromogSustratos cromogéénicos y/o fluorognicos y/o fluorogéénicosnicosSustancias Sustancias opacantesopacantes o contrastanteso contrastantesIndicadoresIndicadoresBases nutritivasBases nutritivasFuentes de carbono (azFuentes de carbono (azúúcares, alcoholes, etc.)cares, alcoholes, etc.)AgarAgarSales mineralesSales mineralesInhibidores selectivos (sales, antibiInhibidores selectivos (sales, antibióóticos, etc.)ticos, etc.)Otras sustancias (proteOtras sustancias (proteíínas, aminonas, aminoáácidos, etc.)cidos, etc.)
COMPONENTESCOMPONENTES FUNDAMENTALESFUNDAMENTALES
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ENZIMAS CARACTERÍSTICAS
SUSTRATOS CROMOGÉNICOS Y/O FLUOROGÉNICOS
GRUPOS CROMÓFOROS Y/O FLUORÓFOROS
INDICADORES SUSTRATOS COLONIAS
degradan
liberando
provocan cambios en características cromáticas de:
PRINCIPIOSPRINCIPIOS
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1.1. Cambio de la intensidad de la fluorescencia Cambio de la intensidad de la fluorescencia o de las caractero de las caracteríísticas cromsticas cromááticas de las cticas de las céélulas, lulas, por la absorcipor la absorcióón de los compuestos derivados de n de los compuestos derivados de los sustratos por diferentes componentes los sustratos por diferentes componentes celulares.celulares.
2.2. Aumento de la fluorescencia y de la Aumento de la fluorescencia y de la absorciabsorcióón de luz de los sustratos.n de luz de los sustratos.
3.3. Cambio de los atributos cromCambio de los atributos cromááticos ticos (absorbancia y/o fluorescencia) de los (absorbancia y/o fluorescencia) de los indicadores.indicadores.
PRINCIPIOS DE LAS REACCIONES DE DETECCIPRINCIPIOS DE LAS REACCIONES DE DETECCIÓÓNN
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SUSTRATO SINTÉTICOENZIMAS BACTERIANAS HIDROLIZAN
CAUSAN
1. INCREMENTO EN LA FLUORESCENCIA DE LOS SUSTRATOS
2. INCREMENTO DE LA ABSORCIÓN DE LUZ DE LOS SUSTRATOS
PRINCIPIOS DE LAS REACCIONES DE DETECCIPRINCIPIOS DE LAS REACCIONES DE DETECCIÓÓNN
No. 1
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HIDROLIZAN
CAUSA
1. INCREMENTO EN LA FLUORESCENCIA DE UN INDICADOR
2. INCREMENTO DE LA ABSORCIÓN DE LUZ DE UN INDICADOR
PRINCIPIOS DE LAS REACCIONES DE DETECCIPRINCIPIOS DE LAS REACCIONES DE DETECCIÓÓNN
No. 2
ENZIMAS BACTERIANAS
SUSTRATO SINTÉTICO
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COLORANTE FLUORESCENTE
DENTRO DE ALGUNO DE SUS COMPONENTES
Célula bacteriana ABSORBE
CAUSA
INCREMENTO EN LA FLUORESCENCIA
PRINCIPIOS DE LAS REACCIONES DE DETECCIPRINCIPIOS DE LAS REACCIONES DE DETECCIÓÓNN
No. 3
EJ. COLORANTES
a) Naranja acridina (AO) – se une al DNA
b) Ácido sulfónico 8-anilinonaftaleno(ANS) se une a las proteínas
Microscopio de epifluorescencia
Técnica de filtro directo epifluorescente
Citometría de flujo
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Célula de bacteria Gram +
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sustrato
Difusión pasiva
Célula de bacteria Gram -
sustrato
permeasa u otros(ej. sales biliares)
Difusión activa
osmosis
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Célula de bacteria
PRINCIPIOS DE LAS REACCIONES DE DETECCIPRINCIPIOS DE LAS REACCIONES DE DETECCIÓÓNN
Gradiente de iones
•Inactivo en la fase estacionaria•Amplia especificidad•Baja sensibilidad•Requiere altas concentraciones•Se inactiva con el estrés celular
Sistema de transporte mediado por elfosfoenol piruvato (fosfo-transferasa)
•Activo en todas las fases•Menor especificidad•Mayor sensibilidad•No requiere de altas concentraciones•Más sensible a las estructuras de aplicones
DIFUSIÓN ACTIVA
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PRINCIPIOS DE LAS REACCIONES DE DETECCIPRINCIPIOS DE LAS REACCIONES DE DETECCIÓÓNN
CADENA DE REACCIONES
Enzima
+Permeasa + Inductor
Ejemplo: β-galactosidasa + lactosa (inhibición competitiva)ó IPTG (acelerador)
lac-operon
+ X-Gal + sales biliares
Precipitado azul
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∗Permiten una detección visual de los productos de la actividad enzimática, ya sea directamente, o con una fuente de luz ultravioleta o con un fluorómetro.
∗Pueden ser acoplados a un amplio rango de sustratos para diferentes rutas metabólicas.
∗Estos sustratos no son carcinogénicos.
CARACTERÍSTICAS DE LOS SUSTRATOS FLUOROGÉNICOS
indicadores fluorescentes con diferentes pH óptimos
4-MU como indicador para la detección de un incremento en el pH
quinina para la detección de una disminución del pH
• Actividad de ureasa
• Formación de ácido de mono y disacáridos
• Descarboxilaciónde la lisina y ornitina
PRINCIPIOS DE LAS REACCIONES DE DETECCIPRINCIPIOS DE LAS REACCIONES DE DETECCIÓÓNN
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Naturaleza quNaturaleza quíímica de los grupos crommica de los grupos cromóóforosforos
SustratosSustratos Color de los Color de los precipitadosprecipitados
AbsorbciAbsorbcióónn, , λλmax max ((nm)nm)
X (5X (5--bromobromo--44--clorocloro--33--indolil)indolil) Azul turquesaAzul turquesa 615615
Y ( Y ( indoxilindoxil)) AzulAzul 680680
Magenta (5Magenta (5--bromobromo--66--clorocloro--33--indolil)indolil) MagentaMagenta 565565
SalmonSalmon (6(6--clorocloro--33--indolil)indolil) SalmSalmóónn 540540
Iodo (5Iodo (5--iodoiodo--33--indoxilindoxil)) PPúúrpurarpura 575575
GreenGreen (N(N--metilmetil--indolil)indolil) VerdeVerde 665665
o o óó pp--nitrofenolesnitrofenoles AmarilloAmarillopp--nitroanilinanitroanilina AmarilloAmarillo 390390CHE CHE ((cicloesculetinacicloesculetina + iones)+ iones) NegroNegro
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Naturaleza quNaturaleza quíímica de los grupos crommica de los grupos cromóóforosforos
SustratosSustratos Color de los Color de los precipitadosprecipitados
Alizarina 3Alizarina 3’’,4,4’’--dihidroxiflavonadihidroxiflavona--44’’-- (DH)(DH) NegroNegro
RojoRojo BrillanteBrillante 3B3B--AA + 1,4+ 1,4--butanodiol butanodiol diglicidildiglicidil etereter RojoRojo
CibacronCibacron AzulAzul 3GA3GA + 1,4+ 1,4--butanodiol butanodiol diglicidildiglicidil etereter AzulAzul
Reactive Orange 14Reactive Orange 14 + 1,4+ 1,4--butanodiol butanodiol diglicidildiglicidil etereter NaranjaNaranja
77--NN--((ββ--alanil)aminoalanil)amino--11--pentilfenoxazinapentilfenoxazina--33--unouno--trifluoroacetatotrifluoroacetato salsal
RojoRojo
HexacianoferratoHexacianoferrato III + FIII + Fee IIIIII AzulAzul
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Naturaleza quNaturaleza quíímica de los grupos crommica de los grupos cromóóforosforos
SustratosSustratos
44-- [2[2-- (4(4--octanoiloxioctanoiloxi--3, 53, 5--dimetoxifenildimetoxifenil))--vinilvinil]]--quinolinoquinolino--11--(propano(propano--33--ilil))-- sal del sal del áácido cido carboxilicocarboxilico88--hidroxiquinolinahidroxiquinolina
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HH
BrBrClCl
NN
OOOO
OHOH
OHOH
OHOH
CHCH22OHOH
XX--GalGal (5(5--BromoBromo--44--clorocloro--33--indoxilindoxil--ββ--DD--galactopirangalactopiranóósido sido óó XX--betabeta--DD--galactgalactóósido sido óó XX--ßß--DD--galgal))
•Grupos capturadores de electrones unidos al O2del nitrofenol•Poco sensible•Bajo costo de producción•Adecuado para medios líquidos•Difunde la reacción al medio
-o -p nitrofenoles
Unión del oxigeno a:ácidos inorgánicos o carboxílicos (estearasas, fosfatasas, sulfatasas)sacáridos (glucósidos)
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Difosfato de fenolftaleína
Difosfato de fenolftaleína
Fosfatasa
pH>7 Fenolftaleína 530 nm
4 Nitrofenil fosfatosal disódica
Fosfatasa alcalina
H3PO4
4-Nitrofenol
Mecanismo de la reacción
•Grupos capturadores de electrones unidos al O2 de la nitroanilina•Uniones con péptidos o aminoácidos (más común para detectar actividad L-alanina-aminopeptidasa)•Común para bacterias Gram –•Bajo coeficiente de extinción•Soluble en agua•Poco sensible•Adecuado para medios líquidos•Difunde la reacción al medio
Sustratos de nitroanilina
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Quelatos de metales
Sustrato (ej. esculina)
Enzima (ej. β-galactosidasa)
Grupo activo + (ej. esculetina, cicloesculetina,8-Hydroxyquinolina-β-D-glucosido8-Hydroxyquinolina-β-Dglucuronido,alizarina)
Iones en el medio(ej. hierro férrico)
Precipitado negro
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Quelatos de metales
Precipitado negro
SustratosSustratos Color de los Color de los precipitadosprecipitados
AbsorbciAbsorbcióónn, , λλmax max ((nm)nm)
X (5X (5--bromobromo--44--clorocloro--33--indolil)indolil)
Azul turquesaAzul turquesa 615615
Y (Y (indoxilindoxil--)) AzulAzul 68068055--BromoBromo--33--indolil indolil AzulAzulMagenta (5Magenta (5--bromobromo--66--clorocloro--33--indolil)indolil)
MagentaMagenta 565565
SalmonSalmon (6(6--clorocloro--33--indolil)indolil) SalmSalmóónn 540540Iodo (5Iodo (5--iodoiodo--33--indolilindolil PPúúrpurarpura 575575
GreenGreen (N(N--metilindolilmetilindolil)) VerdeVerde 665665
Sustratos Sustratos IndoxiloIndoxilo
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•Se oxidan con facilidad•Insolubles en forma de glucósidos o ésteres, aunque algunos pueden ser solubles (SLPA)•No apropiados para anaerobiosis
Sustratos de indoxilos
β-galactosidasa
X-Gal Precipitado azul
oxidación
Actividades enzimáticas a detectar
Alfa-L-arabinosidasa Alfa-glucosaminidasaBeta-D-celobiosidasa Beta-glucosaminidasaAlfa-L-fucosidasa Beta-glucosidasaBeta-D-fucosidasa Alfa-glucosidasaBeta-L-fucosidasa Beta-D-glucuronidasaAlfa-galactosaminidasa Beta-lactosidasaBeta-galactosaminidasa Alfa-maltosidasaAlfa-galactosidasa Beta-D-maltosidasa
Beta-galactosidasa Alfa-mannosidasaBeta-xylosidasa Beta-mannosidasaBeta-ribosidasa
GLICOSIDASAS
Actividades enzimáticas a detectar
Carboxil-esterasa (C2-C18) ColinesterasaButirasa PalmitasaCaprilasaFosfodiésteres (Inorgánicos) Fosfatasas, sulfatasas (Inorg.)
ESTERASAS
FOSFATASAS y SULFATASASFosfatasa alcalina Sulfatasas varias
Fosfatidilinositol fosfolipasa
Actividades enzimáticas a detectar
AMINOPEPTIDASASCatepsina Dipeptidil-aminopeptidasa II
G-glutamil-transpeptidasa Piroglutamil-peptidasa
Otras peptidasas
SustratoSustrato EnzimaEnzima Microorganismos a Microorganismos a diferenciardiferenciar
OrtoOrto--nitrofenilnitrofenil--ββ--DD--galactopirangalactopiranóósido sido (ONPG) (ONP(ONPG) (ONP-- ββ--DD--gal)gal)
55--bromobromo--44--clorocloro--33--indoxilindoxil-- ββ--DD--galactopirangalactopiranóósido sido
(X(X--gal) (Xgal) (X-- ββ--DD--gal)gal)
ββ--DD--galactosidasagalactosidasa DiferenciaciDiferenciacióón de n de coliformescoliformes
ParaPara--nitrofenilnitrofenil--ββ--DD--galactopirangalactopiranóósido sido (PNPGAL)(PNPGAL)(PNP(PNP-- ββ--DD--gal)gal)66--bromobromo--22--naftilnaftil-- ββ--DD--galactopirangalactopiranóósido sido (BNGAL)(BNGAL)
SUSTRATOS CROMOGSUSTRATOS CROMOGÉÉNICOSNICOS
SustratoSustrato EnzimaEnzima Microorganismos Microorganismos a diferenciara diferenciar
ColoresColores
ββ--DD--glucuronidasaglucuronidasa
AmarilloAmarillo
AzulAzul
55--bromobromo--66--clorocloro--33--indolilindolil-- ββ--DD--glucurglucuróónido (Magentanido (Magenta--GLR)GLR)
MagentaMagenta
E. coliE. coliParaPara--nitrofenilnitrofenil--ββ--DD--glucurglucuróónido (PNPGLR)nido (PNPGLR)55--BromoBromo--44--clorocloro--33--indoxilindoxil-- ββ--DD--glucurglucuróónido (Xnido (X--GLR)GLR)
SUSTRATOS CROMOGSUSTRATOS CROMOGÉÉNICOSNICOS
Dr.C.T.Claudio Rodríguez Martínez. CNB
SustratoSustrato EnzimaEnzima
33--indoxilindoxil-- ββ--DD--glucurglucuróónidonido
55--BromoBromo--33--indoxilindoxil-- ββ--DD--glucurglucuróónidonido
66--BromoBromo--33--indoxilindoxil-- ββ--DD--glucurglucuróónidonido
ββ--DD--glucuronidasaglucuronidasa
SUSTRATOS CROMOGSUSTRATOS CROMOGÉÉNICOSNICOS
SustratoSustrato EnzimaEnzima
55--BromoBromo--4 cloro4 cloro--33--indoxilindoxil--NN--acetilacetil--ββ--DD--galactosaminidina galactosaminidina ((XX--ββ--DD--galactosaminidinagalactosaminidina))
ββ--DD--GalactosaminidasaGalactosaminidasa
ββ--DD--FucopiranosidasaFucopiranosidasa
ββ--DD--CelobiasaCelobiasa
55--BromoBromo--4 cloro4 cloro--33--indoxilindoxil--NN--acetilacetil--ββ--DD--fucopiranosidofucopiranosido(X(X-- ββ--DD--fucosidofucosido))55--BromoBromo--4 cloro4 cloro--33--indoxilindoxil--NN--acetilacetil--ββ--DD--celobiosidocelobiosido
Sustratos cromogénicos (para glicosidasas)
Sustratos cromogSustratos cromogéénicos (para nicos (para esterasasesterasas))55--BromoBromo--4 cloro4 cloro--33--indoxilindoxil butirato (Xbutirato (X--butirato)butirato)55--BromoBromo--4 cloro4 cloro--33--indoxilindoxil caprilatocaprilato (X(X--caprilatocaprilato))55--BromoBromo--4 cloro4 cloro--33--indoxilindoxil palmitatopalmitato (X(X--palmitatopalmitato))33--IndoxilIndoxil butirato (Ybutirato (Y--butirato)butirato)
55--BromoBromo--6 cloro6 cloro--33--indoxilindoxil butirato (Magentabutirato (Magenta--butirato)butirato)55--BromoBromo--6 cloro6 cloro--33--indoxilindoxil caprilatocaprilato (Magenta(Magenta--caprilatocaprilato))55--BromoBromo--6 cloro6 cloro--33--indoxilindoxil--palmitatopalmitato (Magenta(Magenta--palmitatopalmitato))
66--CloroCloro--33--indoxilindoxil butirato (Salmbutirato (Salmóónn--butirato)butirato)66--CloroCloro--33--indoxilindoxil caprilatocaprilato (Salm(Salmóónn--caprilatocaprilato))66--CloroCloro--33--indoxilindoxil palmitatopalmitato (Salm(Salmóónn--palmitatopalmitato))
4- [2- (4-octanoiloxi-3, 5-dimetoxifenil)-vinil]-quinolino-1-(propano-3-il)- sal del ácido carboxilico
Dr.C.T.Claudio Rodríguez Martínez. CNB
SustratoSustrato55--BromoBromo--4 cloro4 cloro--33--indoxilindoxil fosfato, sal fosfato, sal disdisóódicadica (X(X--phosphos··diNadiNa) ) 55--BromoBromo--4 cloro4 cloro--33--indoxilindoxil fosfato, sal pfosfato, sal p--toluidina (Xtoluidina (X--phosphos··pp--toltol))
33--IndoxilIndoxil fosfato, sal fosfato, sal disdisóódicadica (Y(Y--phosphos··diNadiNa) ) 33--IndoxilIndoxil fosfato, sal pfosfato, sal p--toluidina (Ytoluidina (Y--phosphos··pp--toltol))
55--BromoBromo--66--clorocloro--33--indoxilindoxil fosfato, sal pfosfato, sal p--toluidina (Magentatoluidina (Magenta--phosphos··pp--toltol))
66--CloroCloro--33--indoxilindoxil fosfato, sal pfosfato, sal p--toluidina (Salmtoluidina (Salmóónn--phosphos··pp--toltol))
Sustratos cromogSustratos cromogéénicos (para nicos (para fosfatasasfosfatasas))
Sustratos cromogSustratos cromogéénicos (para nicos (para sulfatasassulfatasas))
SustratoSustrato
55--BromoBromo--4 cloro4 cloro--33--indoxilindoxil sulfato, sal potsulfato, sal potáásica (Xsica (X--sulfatosulfato··K) K) 33--IndoxilIndoxil sulfato, sal potsulfato, sal potáásica (Ysica (Y--sulfatosulfato··K)K)
55--BromoBromo--66--clorocloro--33--indoxilindoxil sulfato, sal potsulfato, sal potáásica (sica (MagentaMagenta--sulfatosulfato··K)K)
Sustratos cromogSustratos cromogéénicos (para nicos (para sialidasassialidasas))
SustratosSustratos
MetilMetil NN--acetilacetil--.beta..beta.--DD--neuraminatoneuraminato, , MetilMetil NN--acetilacetil--4,7,8,94,7,8,9--tetratetra--OO--acetilacetil--22--clorocloro--22--deoxideoxi--DD--neuraminatoneuraminato, , MetilMetil NN--acetilacetil--4,7,8,94,7,8,9--tetratetra--OO--acetilacetil--22--OO--(4(4--formilfenilformilfenil))--alfaalfa--DD--neuraminatoneuraminato y Ny N--acetilacetil--22--OO--(4(4--formilfenilformilfenil))--alfaalfa--DD--ÁÁcido cido neuraminneuraminíícoco
((neuraminidasasneuraminidasas, , acilneuraminilacilneuraminil hidrolasashidrolasas)
Sustratos cromogSustratos cromogéénicos (para degradacinicos (para degradacióónnde polisacde polisacááridos)ridos)
SustratoSustrato
Brilliant Red 3BBrilliant Red 3B--AA + 1,4+ 1,4--butanodiol butanodiol diglicidildiglicidil etereterCibacronCibacron Blue 3GABlue 3GA + 1,4+ 1,4--butanodiol butanodiol diglicidildiglicidil etereter
Reactive Orange 14Reactive Orange 14 + 1,4+ 1,4--butanodiol butanodiol diglicidildiglicidil etereter
AmilosaXilosaHidroximetil-celulosa
Sustratos cromogSustratos cromogéénicos (para degradacinicos (para degradacióónnde protede proteíínas)nas)
SustratoSustrato
Brilliant Red 3BBrilliant Red 3B--AA + 1,4+ 1,4--butanodiol butanodiol diglicidildiglicidil etereterCibacronCibacron Blue 3GABlue 3GA + 1,4+ 1,4--butanodiol butanodiol diglicidildiglicidil etereter
Reactive Orange 14Reactive Orange 14 + 1,4+ 1,4--butanodiol butanodiol diglicidildiglicidil etereter
Colágeno
Sustratos cromogSustratos cromogéénicos (para recuento nicos (para recuento de aerobios)de aerobios)
SustratoSustrato
Cloruro de 2,3,5-trifenil tetrazolio
Colonias negras al consumirse OColonias negras al consumirse O22 y producirse COy producirse CO22
Sustratos cromogSustratos cromogéénicos (para nicos (para alanilalanil--aminopeptidasaaminopeptidasa))
SustratoSustrato
77--NN--((ββ--alanil)aminoalanil)amino--11--pentilfenoxazinapentilfenoxazina--33--oneone trifluoroacetatotrifluoroacetato salsal
((FenoxazinonaFenoxazinona))
MetilumberiferilMetilumberiferil (4(4--MUMU--) sustratos) sustratos
SUSTRATOS FLUOROGÉNICOS
44--MetilumbeliferilMetilumbeliferil--ββ--DD--áácido cido glucurglucuróóniconico (MUG) (MUG) (4(4--MUMU--ββ--DD--glcUAglcUA))
ββ--DD--glucuronidasaglucuronidasa
66--clorocloro--44--metilumbeliferonametilumbeliferona (CMUG)(CMUG) ββ--DD--glucuronidasaglucuronidasa44--TrifluorometilumbeliferonaTrifluorometilumbeliferona (4(4--TMU)TMU) ββ--DD--glucuronidasaglucuronidasa44--MetilumbeliferilMetilumbeliferil--NN--acetilacetil--ββ--DD--galactosaminidina (4galactosaminidina (4--MUMU-- ββ--DD--galactosaminidina) galactosaminidina)
ββ--DD--GalactosaminidasaGalactosaminidasa
44--MetilumbeliferilMetilumbeliferil--NN--acetilacetil--ββ--DD--glucosaminidinaglucosaminidina(4(4--MUMU-- ββ--DD--glucosaminidina) glucosaminidina)
ββ--DD--glucosidasaglucosidasa
44--MetilumbeliferilMetilumbeliferil palmitatopalmitato(4(4--MUMU--palmitatopalmitato))
EsterasasEsterasas
44--MetilumbeliferilMetilumbeliferil fosfato, fosfato, áácido libre cido libre (4(4--MUMU--phosphos))
FosfatasasFosfatasas
44--MetilumbeliferilMetilumbeliferil--sulfato, sal de potasio (4sulfato, sal de potasio (4--MUMU--sulfatosulfato··K)K)
SulfatasasSulfatasas
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44--trifluorometilumbeliferonatrifluorometilumbeliferona Sustrato fluorogSustrato fluorogééniconico
88--anilinoanilino--11--naftalenonaftaleno--áácido cido sulfsulfóóniconico Colorantes fluorogColorantes fluorogéénicosnicos
AcridinaAcridina, 7, 7--hidroxicumarinahidroxicumarina Indicadores de pH Indicadores de pH fluorescentesfluorescentes
OTROS COMPUESTOS FLUOROGÉNICOS
VENTAJAS DE LOS COMPUESTOS FLUOROGÉNICOS
•ESTABLES AL CALOR (PUEDEN ESTERILIZARSE)
•SOLUBLES EN AGUA
•ALTAMENTE SENSIBLES
•BAJO COSTO
•NO TÓXICOS
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SustratoSustrato
DD--AlaninaAlanina 77--amidoamido--44--metilcumarinametilcumarina, sal de , sal de trifluoroacetatotrifluoroacetato(H(H--DD--AlaAla--AMCAMC··TFA). TFA). FluorescenciaFluorescencia azulazulLL--Histidina 7Histidina 7--amidoamido--44--metilcumarinametilcumarina(H(H--HisHis--AMC)AMC)
LL--Leucina 7Leucina 7--amidoamido--44--metilcumarinametilcumarina(H(H--LeuLeu--AMC). Fluorescencia verdeAMC). Fluorescencia verde
Producen seProducen seññales fluorescentesales fluorescentes
Sustratos AMC (7Sustratos AMC (7--amidoamido--44--metilcumarinametilcumarina))
Aminopeptidasa B
Lisina
7-amino-metilcumarinaLisina-7-amido-4-metilcumarina
Mecanismo de reacciMecanismo de reaccióónn
ATP ATP + Luciferina + O+ Luciferina + O2 2 (en presencia de (en presencia de LuciferasaLuciferasa y Mgy Mg2+2+)) –– emisiemisióón de luz en n de luz en forma de destello o incandescencia forma de destello o incandescencia amarilloamarillo--verdosa.verdosa.
La cantidad de luz es directamente La cantidad de luz es directamente proporcional a la cantidad de ATP proporcional a la cantidad de ATP presente en la muestra, y esta cantidad presente en la muestra, y esta cantidad de ATP, a su vez, depende de la cantidad de ATP, a su vez, depende de la cantidad de cde céélulas. lulas.
Sustratos Sustratos BioluminiscentesBioluminiscentes
ATP + O2+Luciferina
Mg 2+
Oxiluciferina+AMP+PPi+CO2
Mecanismo de reacciMecanismo de reaccióónn
560 nm – centelleo
Microorganismos o grupos detectadosMicroorganismos o grupos detectados
Aeromonas Aeromonas sppspp..Bacillus cereusCampylobacter spp.Candida Candida albicansalbicansCandida Candida sppspp..Cellulomonas spp.CellulosimicrobiumClostridium difficileClostridium perfringensColiformesColiformesE. coliE. coliE. coli E. coli O157:H7O157:H7Enterobacter sakazakiiEnterobacterias β-lactamasa positivasEnterococusEnterococus sppspp..Enterococus Vancomicina resistentes
Klebsiella Klebsiella sppspp..Listeria monocytogenesMycobacteriaPseudomonas aeruginosaPseudomonas aeruginosaPseudomonas Pseudomonas sppspp..Salmonella Salmonella sppspp..Serratia Serratia marcecensmarcecensShigella sonneiShigella sonneiShigella spp.Staphylococcus aureusStaphylococcus aureus MRVibrio parahaemolyticus y V. cholerae
Dr.C.T.Claudio Rodríguez Martínez. CNB
EVOLUCIEVOLUCIÓÓN DE SU EMPLEO EN LA MICROBIOLOGN DE SU EMPLEO EN LA MICROBIOLOGÍÍA DIAGNA DIAGNÓÓSTICASTICA
EN 1962, LeMinor Y Hamida DEMOSTRARON QUE LA ENZIMA β-GALACTOSIDASA DE LOS MICROORGANISMOS DEGRADABAN UN SUSTRATO (α-nitrophenyl-β-D-galactopIranosido)
EN LOS AÑOS 70 – MARCADORES DE TRANSFORMACIONES GENÉTICAS
EN LOS AÑOS 80 – SUSTRATOS FLUOROGÉNICOS (MUG) PARA E. coli (MERCK)
EN LOS MEDIADOS DE LOS 80- SUSTRATOS CROMOGÉNICOS PARA E. coli (MANAFI M.)
EN LOS 90- PRIMEROS MEDIOS PARA OTROS m.o. (ALAIN RAMBACH- Salmonella)
FINALES 90-ACTUALIDAD- COMBINACIONES DE CROMOGÉNICOS-FLUOROGÉNICOS- “SUSTRATOS TRADICIONALES”
Dr.C.T.Claudio Rodríguez Martínez. CNB
EVOLUCIEVOLUCIÓÓN DE SU EMPLEO EN LA MICROBIOLOGN DE SU EMPLEO EN LA MICROBIOLOGÍÍA DIAGNA DIAGNÓÓSTICASTICA
SU EMPLEO HA CONLLEVADO A LA RE-CLASIFICACIÓN DE GRUPOS IMPORTANTES
M. Manafi: Rapid testing methods using fluorogenic and chromogenicMedia. Conference
COMO INGREDIENTES CONSTITUTIVOS DE LOS MEDIOSCOMO INGREDIENTES CONSTITUTIVOS DE LOS MEDIOSCOMO INGREDIENTES CONSTITUTIVOS DE LOS MEDIOS
CromoCen AGNCromoCen AGN®®: contiene : contiene una mezcla de sustancias una mezcla de sustancias
cromogcromogéénicas nicas
FORMAS DE PRESENTACIFORMAS DE PRESENTACIÓÓN O EMPLEON O EMPLEO
Agar Violeta Rojo Bilis con MUG
FORMANDO PARTE DE MEDIOS TRADICIONALES MODIFICADOSFORMANDO PARTE DE MEDIOS TRADICIONALES MODIFICADOS
CROMOCEN CCCROMOCEN CCCROMOCEN SCCROMOCEN SCCROMOCEN ECCSCROMOCEN ECCSCROMOCEN AGNCROMOCEN AGN
FORMANDO PARTE DE NUEVOS MEDIOSFORMANDO PARTE DE NUEVOS MEDIOS
CromoCen CND-C
MEDIOS PARA UNA ESPECIE O GMEDIOS PARA UNA ESPECIE O GÉÉNERO ESPECNERO ESPECÍÍFICOFICO
MEDIOS PARA MMEDIOS PARA MÁÁS DE UNA ESPECIE O GS DE UNA ESPECIE O GÉÉNERO NERO
CROMOCEN AGN
Como suplementos de los medios, adicionando en el laboratorioComo suplementos de los medios, adicionando en el laboratoriolos sustratos: los sustratos:
MacConkey con Sorbitol MacConkey con Sorbitol + 100 + 100 μμg/mL Xg/mL X--GluGlu
FORMAS DE PRESENTACIFORMAS DE PRESENTACIÓÓN O EMPLEON O EMPLEO
MEDIO PARA SISTEMA DE FILTRACIMEDIO PARA SISTEMA DE FILTRACIÓÓN POR MEMBRANA N POR MEMBRANA CON SUSTRATO FLUOROGCON SUSTRATO FLUOROGÉÉNICO QUE SE LIGA AL NICO QUE SE LIGA AL CITOPLASMA DE LA CCITOPLASMA DE LA CÉÉLULA O ESPORA SIN DESTRUIRLALULA O ESPORA SIN DESTRUIRLA
En forma de soluciones que se aEn forma de soluciones que se aññaden a los medios de aden a los medios de filtracifiltracióón por membranan por membrana
FORMAS DE PRESENTACIFORMAS DE PRESENTACIÓÓN O EMPLEON O EMPLEO
En la composiciEn la composicióón de los n de los medios para filtracimedios para filtracióón por n por membranamembrana
FORMAS DE PRESENTACIFORMAS DE PRESENTACIÓÓN O EMPLEON O EMPLEO
Formando parte de los medios o pruebas miniaturizadas Formando parte de los medios o pruebas miniaturizadas en los sistemas de identificacien los sistemas de identificacióónn
FORMAS DE PRESENTACIFORMAS DE PRESENTACIÓÓN O EMPLEON O EMPLEO
En forma de soluciones que se aEn forma de soluciones que se aññaden a las coloniasaden a las colonias
SOLUCISOLUCIÓÓN N FLUOROGFLUOROGÉÉNICA QUE SE NICA QUE SE
ADICIONA A LA CEPA ADICIONA A LA CEPA SOSPECHOSASOSPECHOSA
Y LA LECTURA SE REALIZA DIRECTAMENTE
POR LA APARICIÓN DE LA FLUORESCENCIA
FORMAS DE PRESENTACIFORMAS DE PRESENTACIÓÓN O EMPLEON O EMPLEO
•• Mayor especificidad y sensibilidad diagnMayor especificidad y sensibilidad diagnóósticassticas•• Generalmente mayor rapidez en las respuestasGeneralmente mayor rapidez en las respuestas•• Posibilidad de diferenciar un mayor nPosibilidad de diferenciar un mayor núúmero de especies en mero de especies en una misma placauna misma placa•• Sencillez en la identificaciSencillez en la identificacióónn•• Los resultados pueden ser analizados en algunos casos por Los resultados pueden ser analizados en algunos casos por personal no especializado (spersonal no especializado (síí entrenado)entrenado)•• No se necesita en la mayorNo se necesita en la mayoríía de los casos de medios para a de los casos de medios para aislamiento primarioaislamiento primario•• Por lo general, las coloraciones de las colonias se mantienen Por lo general, las coloraciones de las colonias se mantienen estables por mestables por máás de 48 horass de 48 horas•• Ahorro de recursos para la identificaciAhorro de recursos para la identificacióón posterior por n posterior por pruebas bioqupruebas bioquíímicasmicas•• Ahorro en medios y recursos en general al prescindir del Ahorro en medios y recursos en general al prescindir del empleo de otros medios diferenciales o selectivosempleo de otros medios diferenciales o selectivos
VENTAJAS DE LOS MEDIOS CROMOGVENTAJAS DE LOS MEDIOS CROMOGÉÉNICOS Y FLUOROGNICOS Y FLUOROGÉÉNICOSNICOS
Dr.C.T.Claudio Rodríguez Martínez. CNB
MMÁÁS PRECISOSS PRECISOS
MMÁÁS RS RÁÁPIDOSPIDOS MMÁÁS S ECONECONÓÓMICOSMICOS
MMÁÁS CONFIABLESS CONFIABLES
MMÁÁS S ESPECESPECÍÍFICOSFICOS
VENTAJASVENTAJAS
FINALMENTEFINALMENTE……………………………………
Dr.C.T.Claudio Rodríguez Martínez. CNB
PARA LOS LABORATORISTAS………...
MAYOR CONFIANZA
Muchas Gracias ...................Muchas Gracias ...................
Dr.C.T.Claudio Rodríguez Martínez. CNB