INTRODUCCION A LA CROMATOGRAFIA
DIANA PATRICIA CARDONA S.
UNIVERSIDAD DE ANTIOQUIA
Separación
• Analizar
• Identificar
• Purificar
• Cuantificar Componentes Mezcla
La cromatografía es, esencialmente, un método físico de separación,
en el cual los componentes a separar se distribuyen en dos fases, la
fase estacionaria, de gran área superficial y la fase móvil que se hace
pasar a lo largo de la fase estacionaria.
QUE ES CROMATOGRAFIA?
FASE CLASIFICACION
FASE
ESTACIONARIA
FASE
MOVIL
FASE MOVIL
FUERZAS DE
ATRACCION
L L
Cromatografía Liquida
Reparto
S
L
Adsorción
Reparto
Intercambio iónico
Exclusión Molecular
Afinidad
L G Cromatografía
Gaseosa
Adsorción
S G Exclusión molecular
Especies
orgánicas
enlazadas a una
superficie sólida
Fluido
supercrítico
Cromatografía Fluido
supercrítico
CLASIFICACION DE LOS METODOS CROMATOGRAFICOS
CROMATOGRAFIA LIQUIDA
CLASIFICACION DE LA
CROMATOGRAFIA LIQUIDA
http://www.separationsnow.com/FCKeditor/UserFiles/Image/sepNOW_
advertorials/0601_HPLC_Agilent/0601_hplcad_agilent_fig1.jpg
http://www.charltonsci.co.uk/charlton_
scientific011001.jpg
http://www.waters.com/watersdivision/Conten
tD.asp?watersit=JDRS-5LTGBH&WT.svl=1
Cada compuesto migra a una velocidad que
refleja el tamaño de sus moléculas y su
solubilidad en el solvente
CROMATOGRAFIA LIQUIDA
CROMATOGRAFIA PAPEL
http://images.bestwebbuys.com/muze/books/96/9781588904096.jpg
CROMATOGRAFIA LIQUIDA
CROMATOGRAFIA DE CAPA FINA
DETECCION: UV y Reveladores
Fase Normal – F. Estacionaria Polar (Silica gel) – F. Móvil No Polar
Fase Reversa – F. Estacionaria No Polar (silica
modificada) – F. Móvil Polar
F. E
STA
CIO
NA
RIA
F. M
ÓV
IL
ALTA A
MEDIA
BAJA A
MEDIA
BAJA POLARIDAD
BAJA POLARIDAD
POLARIDAD DE SUSTANCIAS
CROMATOGRAFIA CAPA FINA
TIPOS DE SEPARACION
FASE NORMAL
LA FASE ESTACIONARIA (SILICA) ES MAS POLAR QUE LA FASE MOVIL
LOS COMPONENTES QUE MIGRAN PRIMERO SON LOS MAS APOLARES
LOS COMPONENTES QUE MIGRAN AL FINAL SON LOS DE MAYOR POLARIDAD (MAS POLARES)
PUNTO DE
SIEMBRA
APOLAR
POLAR
SILICA GEL (FASE
ESTACIONARIA POLAR
CROMATOGRAFIA CAPA FINA
TIPOS DE SEPARACION
Glass TLC Plates, Silica gel 60 F254 20x20cm
Aluminium TLC Plates, Silica gel 60 F254 20x20cm
FASE REVERSA
SE BASA EN EL PRINCIPIO DE QUE LA
FASE ESTACIONARIA PRESENTA UNA
BAJA POLARIDAD; LOGRADO
MEDIANTE UN PROCESO DE
DERIVATIZACION
Sílice derivatizada superficialmente: C8 C18
CROMATOGRAFIA COLUMNA
TIPOS DE SEPARACION
Glass TLC Plates, Silica gel 60 RP-8 F254 20x20cm
Aluminium TLC Plates, Silica gel 60 RP-8 F254 20x20cm
Glass TLC Plates, Silica gel 60 RP-18 F254 20x20cm
Aluminium TLC Plates, Silica gel 60 RP-18 F254 20x20cm
CROMATOGRAFIA CAPA FINA
TIPOS DE SEPARACION
RESUMEN
CARACTERISTICAS FASE NORMAL FASE REVERSA
FASE ESTACIONARIA POL AR (SILICA GEL) APOLAR
FASE MOVIL APOLAR POLAR
PRIMEROS EN MIGRAR APOLARES POLARES
ULTIMOS EN MIGRAR POLARES APOLARES
El tipo de separación se
puede dar por:
Color
Afinidad
Polaridad
Peso molecular (GPC y
GFC)
Ingreso de muestra
Separación, Columna
Colección
de
fracciones
Detección de
Componentes
CROMATOGRAFIA LIQUIDA
CROMATOGRAFIA DE COLUMNA
http://www.separationsnow.com/FCKeditor/UserFiles/Image/sepNOW_advertorials/060
1_HPLC_Agilent/0601_hplcad_agilent_fig1.jpg
http://www.charltonsci.co.uk/charlton_scientific011001.jpg http://www.waters.com/watersdivision/ContentD.asp?watersit=JDRS
-5LTGBH&WT.svl=1
http://www.buchi.com/uploads/pics/flash-
chromatography.jpg
CROMATOGRAFIA LIQUIDA
CROMATOGRAFIA DE COLUMNA
CROMATOGRAFIA FLASH
EXTRACCION FASE SOLIDA
HPLC
Fase Normal – F. Estacionaria Polar – F. Móvil No Polar
Fase Reversa – F. Estacionaria No Polar – F. Móvil Polar
Par Iónico Cromatográfico P.I.C.
Intercambio Iónico – pH – Fuerza Iónica
Permeación por Gel (polímeros) Filtración en gel
F. E
STA
CIO
NA
RIA
F. M
ÓV
IL
ALTA A
MEDIA
BAJA A
MEDIA
BAJA POLARIDAD
BAJA POLARIDAD
POLARIDAD DE SUSTANCIAS
CROMATOGRAFIA COLUMNA
TIPOS DE SEPARACION
Fase Normal – F. Estacionaria Polar – F. Móvil No Polar
Fase Reversa – F. Estacionaria No Polar – F. Móvil Polar
Par Iónico Cromatográfico P.I.C
Intercambio Iónico – pH – Fuerza Iónica
Exclusión por tamaño: - Permeación por Gel (polímeros)
- Filtración en gel
CROMATOGRAFIA COLUMNA
TIPOS DE SEPARACION
FASE NORMAL
LA FASE ESTACIONARIA(SILICA) ES MAS POLAR QUE LA FASE MOVIL
LOS COMPONENTES QUE ELUYEN PRIMERO SON LOS DE MENOR POLARIDAD
LOS COMPONENTES QUE ELUYEN AL FINAL SON LOS DE MAYOR POLARIDAD
PUNTO DE SIEMBRA
APOLAR
POLAR SILICA GEL (FASE
ESTACIONARIA
POLAR
CROMATOGRAFIA COLUMNA
TIPOS DE SEPARACION
Ingreso de muestra
Separación, Columna
Colección
de
fracciones
1
2
3
1
1 2 3
COMP. APOLAR
COMP. POLAR
FASE
ESTACIONARIA
POLAR
CCF (FASE NORMAL)
LA COLUMNA SE PUEDE CONTAMINAR EN FORMA IRREVERSIBLE CON
PRODUCTOS QUE CONTENGA LA MUESTRA QUE PRESENTEN ALTA
POLARIDAD TALES COMO AZUCARES.
ESTE MECANISMO SE UTILIZA CUANDO SE VA A ANALIZAR MUESTRAS
QUE CONTENGAN PRINCIPIOS DE BAJA POLARIDAD
FASE NORMAL
CROMATOGRAFIA COLUMNA
TIPOS DE SEPARACION
Fase Normal – F. Estacionaria Polar – F. Móvil No Polar
Fase Reversa – F. Estacionaria No Polar – F. Móvil Polar
Par Iónico Cromatográfico P.I.C
Intercambio Iónico – pH – Fuerza Iónica
Exclusión por tamaño: - Permeación por Gel (polímeros)
- Filtración en gel
CROMATOGRAFIA COLUMNA
TIPOS DE SEPARACION
FASE REVERSA
SE BASA EN EL PRINCIPIO DE QUE LA FASE
ESTACIONARIA PRESENTA UNA BAJA POLARIDAD;
LOGRADO MEDIANTE UN PROCESO DE DERIVATIZACION
Sílice derivatizada superficialmente: C18 C8 C4 FENIL AMINO CIANO
CROMATOGRAFIA COLUMNA
TIPOS DE SEPARACION
FASE REVERSA CROMATOGRAFIA COLUMNA
TIPOS DE SEPARACION
LA FASE ESTACIONARIA ES MENOS POLAR QUE LA FASE MOVIL
LOS COMPONENTES QUE ELUYEN PRIMERO SON LOS DE MAYOR POLARIDAD
LOS COMPONENTES QUE ELUYEN AL FINAL SON LOS DE MENOR POLARIDAD
APOLAR
POLAR SILICA GEL (FASE
ESTACIONARIA
POLAR
Ingreso de muestra
Separación, Columna
Colección de
fracciones
1
2
3
1
1 2 3
COMP. POLAR
COMP. APOLAR
FASE
ESTACIONARIA
APOLAR
CCF (FASE NORMAL)
PUNTO DE SIEMBRA
POLAR
APOLAR
SILICA GEL RP18 (FASE
ESTACIONARIA APOLAR
1 2 3
CCF (FASE REVERSA)
MUESTRAS CON COMPUESTOS
ACIDOS DEBILES
PRINCIPIO DE LECHATELIER
EFECTO DEL ION COMUN
– PRACTICAMENTE SE ADICIONA ACIDO
ACETICO AL 1% A LA FASE MOVIL
FASE REVERSA
CROMATOGRAFIA COLUMNA
TIPOS DE SEPARACION
Fase Normal – F. Estacionaria Polar – F. Móvil No Polar
Fase Reversa – F. Estacionaria No Polar – F. Móvil Polar
Par Iónico Cromatográfico P.I.C
Intercambio Iónico – pH – Fuerza Iónica
Exclusión por tamaño: - Permeación por Gel (polímeros)
- Filtración en gel
CROMATOGRAFIA COLUMNA
TIPOS DE SEPARACION
APLICACIÓN: MUESTRAS CON COMPUESTOS
ACIDOS Y BASES DEBILES
FASE REVERSA: MECANISMO DE PAR IONICO
CROMATOGRAFICO (PIC)
CROMATOGRAFIA COLUMNA
TIPOS DE SEPARACION
PIC A: PARA COMPUESTOS DE CARACTERISTICAS
ACIDAS: FOSFATO DE TETRABUTIL AMONIO
• PIC B: PARA COMPUESTOS DE CARACTERISTICAS
BASICAS PIC B5 (ACIDO PENTANO SULFONICO)
PIC B6 (ACIDO HEXANO SULFONICO)
PIC B7 (ACIDO HEPTANO SULFONICO)
PIC B8 (ACIDO OCTANO SULFONICO)
Fase Normal – F. Estacionaria Polar – F. Móvil No Polar
Fase Reversa – F. Estacionaria No Polar – F. Móvil Polar
Par Iónico Cromatográfico P.I.C
Intercambio Iónico – pH – Fuerza Iónica
Exclusión por tamaño: - Permeación por Gel (polímeros)
- Filtración en gel
CROMATOGRAFIA COLUMNA
TIPOS DE SEPARACION
INTERCAMBIO IONICO
CROMATOGRAFIA COLUMNA
TIPOS DE SEPARACION
ANIONICAS DEBILES
ANIONICAS FUERTES
CATIONICAS DEBILES
CATIONICAS FUERTES
Proceso de separación de moléculas basados en
la diferencia en la carga neta.
Se utiliza para analisis de compuestos que tengan
caracteristicas ionicas (aniones o cationes)
Proteinas con una carga neta positiva serán retenidos en las columnas con un
empaque cargado negativamente (ej. Carboximetilcelulosa), eluyendo los otros
componentes que tienen carga neta negativa.
Proteinas con una carga neta negativa serán retenidos en columnas con un
empaque cargado positivamente (ej: dietilaminoetil-celulosa)
http://www.dbs.umt.edu/courses/fall2006/bioc380/lectures/008/lecture.ht
ml
INTERCAMBIO IONICO
Polos
opuestos
se atraen
Amino Acidos con dos grupos ionizables
http://www.dbs.umt.edu/courses/fall2006/bioc380/lectures/008/lecture.html
http://www.ucl.ac.uk/~ucbcdab/enzpur/ionX.htm
Fase Normal – F. Estacionaria Polar – F. Móvil No Polar
Fase Reversa – F. Estacionaria No Polar – F. Móvil Polar
Par Iónico Cromatográfico P.I.C
Intercambio Iónico – pH – Fuerza Iónica
Exclusión por tamaño: - Permeación por Gel (polímeros)
- Filtración en gel
CROMATOGRAFIA COLUMNA
TIPOS DE SEPARACION
CROMATOGRAFIA COLUMNA
TIPOS DE SEPARACION
CROMATOGRAFIA DE EXCLUSION POR TAMAÑO (SEC)
Es una técnica que permite separar las
moleculas de acuerdo a su tamaño, gracias
al intercambio repetitivo entre las
moleculas del soluto, la fase móvil y la
cantidad remanente de solvente en los
poros del empaque de la columna. Las
moléculas de mayor peso molecular eluyen
primero y las de menor eluiran al final
http://www.ucl.ac.uk/~ucbcdab/enzpur/gelexcl.htm
Cromatografía de Permeación en
Gel (GPC): SEPARACION DE
POLIMEROS ORGANICOS
CLASIFICACION DE LA CROMATOGRAFIA DE
EXCLUSION POR TAMAÑO (SEC)
Cromatografía de Filtración en Gel
(GFC): SEPARACION DE POLIMEROS
SOLUBLES EN AGUA, PROTEINAS,
AZUCARES ENTRE OTROS, SE
DENOMINA CROMATOGRAFIA DE
FILTRACION EN GEL
SEPARACION DE LOS COMPONENTES DE UN POLIMERO