CUANTIFICACIÓN EN
CITOMETRÍA DE FLUJO Dra. Mónica Saracco
Instituto de Investigaciones
Biomédicas en Retrovirus y SIDA (ex CNRS)
CONCEPTO DE
CUANTIFICACIÓN
• Medición de células presentes en el
organismo normalmente, cuyo valor
relativo y/o absoluto tendrá suma
importancia para la toma de decisiones
diagnósticas y/o terapéuticas
¿QUÉ SE CUANTIFICA ?
• Poblaciones y sub-poblaciones
linfocitarias
• Células CD 34
• GB para depletar UGR y/o plaquetas en
transfusión
CONSIDERACIONES PARA
CUANTIFICAR
• DOBLE PLATAFORMA
• PLATAFORMA SIMPLE
• CONTROLES INTERNOS DE CALIDAD
• CONTROLES EXTERNOS DE CALIDAD
• CRITERIOS PARA INFORMAR
METODOLOGÍA
• DOBLE PLATAFORMA
• MEDICIONES SIMULTÁNEAS
• MUESTRAS SIN LAVADO
• TODOS LOS EQUIPOS CONTROLADOS
• SIMPLE PLATAFORMA
• MUESTRAS SIN LAVADO
• EVALUACIÓN DE LAS BEADS
CONTROLES DE CALIDAD INTERNOS
• Estado de la
muestra
• Calibración de
pipetas
• Control del contador
hematológico
• Reproducibilidad en
los hemogramas
• Control del citómetro
(Limpieza, canales de
fluorescencia, óptica)
EXTERNOS
• Controles de calidad
con reconocimiento
nacional e
internacional
(QASI-Program,
CAP, ProgBA)
• Evaluar y modificar
los parámetros en
base a ellos
FUENTES DE HPC
• MO
• SP movilizada
• Sangre de cordón
• Movilización con factores de crecimiento GMCSF, GCSF
• Movilización con QT
• Recolección con leucoaféresis
PBSC MO Autóloga • Menor contaminación
tumoral
• Engraftment más corto
• Recolección fácil
• Menos efectos
adversos (vol.
menores)
• Procesos ex-vivo
(manipulación
genética, purga
tumoral, selección + de
CD34)
• Mayor
contaminación
• Mayores volúmenes
• Recolección más
compleja
IDENTIFICACIÓN DE HPC
• Propiedades funcionales
• CFU-GM 10-14 días para la lectura de
resultados
• CD34 proteína glicosilada tras-membrana PM:
105-120KD, rol protector contra daño
proteolítico (mediado por ENZ.), por su gran n°
de sitios glicosilados
• Marcador confiable para reconocer células
mononucleares de MO (1%) que incluyen a las
HPC
HPC
• HPC CD34+ es una población heterogénea
que incluye a las stem cell pluripotentes así
como a los precursores diferenciados a linaje
• Monitoreo de CD34+ en SP permite
establecer el momento óptimo de recolección
por leucoaféresis, el pico depende del
protocolo utilizado
• N° de células CD34+ infundidas es predictivo
de la sobrevida del paciente post-transplante
FUNDAMENTOS
MÉTODO ISHAGE
Control Isotipo
• Puede enmascarar
CD34+ auténticos
• No se recomienda
para establecer
región de
positividad
• Se recomienda
CD45 FITC/ Isotipo
PE
AC. Anti CD34
• Selección del clon
adecuado
• Selección de
Fluorocromos PE,
PECY5, APC
• Menor
autofluorescencia,
menor unión a FC
ASPECTOS TÉCNICOS • N° de eventos
analizados = 75.000
eventos CD45+
• (mínimo 100 células
CD34+)
• Asegura precisión
• WCB <10X109 l,
100 ul de SP/
Aféresis. Incubar
20 30 min. 4°C
• Incluir todas las
células nucleadas
y se pueden
eliminar las
muertas con
tinciones nucleares
• 24hs 98%
viabilidad
CD45
• Antígeno CD45
Pan Leucocitario
• Negativo en GR y
plaquetas
• Denominador de
leucocitos para el
recuento absoluto
de CD34
• Lisis de GR
• Mejor recuperación
celular
• Menor tiempo
• Lavados pérdida
de CD34+
RECUENTO ABSOLUTO
SIMPLE PLATAFORMA • Más sencillo
• Mayor
estandarización
inter-laboratorio
• Se evitan errores
inherentes al uso
de un 2° equipo
• Errores de 0.06% a
0.1%
• Calibración de
partículas
fluorescentes
utilizadas
• Exactitud y
reproducibilidad
del pipeteo
T.A.M.O
Reconstitución Hematopoyética
• Neutrófilos > 0.5 X 109 l
• Plaquetas > 20 X 109 l
• 2X106 a 8 X106 células CD34+/Kg de peso
• Rango varía según patología y QT realizada
• Reconstitución tardía
0.5 X 106 a 2.0 x 106 células CD34+/Kg de peso
• Células precursoras primitivas CD34+/ CD38 neg o débil, HLA-DR neg/ débil
• CD90, CD133, CD13
(precursoras primitivas)
• Progenitores con diferenciación a linaje
CD71, CD13 (H), TdT,
CD19, CD10, MOP
RECUENTO ABSOLUTO
LTCD3/CD4+
• DOBLE
PLATAFORMA
• Hemograma
• S/lavado
• CMF 3 colores/ 4
colores
• Más económica
• Requiere mayor
control (2 equipos)
• PLATAFORMA
ÚNICA
• Tubos Tru-Count
• 4 Colores
• S/Lavado
• Encarece el método
• Utiliza solo 1 equipo
• Evaluar
reproducibilidad
CONTROLES DE CALIDAD
Control de calidad interno
• Trazabilidad y reproducibilidad de equipos utilizados
• Controles comerciales o Sangre periférica normal
Control de calidad
externo
• Sangre
estabilizada
CDC RECOMENDACIONES
• Repetición de 1 MoAb en la determinación de CD3/CD4 y CD3/CD8
• La suma de CD3/CD4 y CD3/CD8 deberá ser igual al valor del CD3 +/- 5 a 10%
• La suma de LT CD3+, LB CD19+, células NK deberá ser igual al 100% +/- 5-10% en poblaciones linfocitarias periféricas
• No realizar lavados
MATERIALES Y MÉTODOS
• 5ml de SP con EDTA en tubos Vacutainer
• Marcación con 50 ul de sangre entera
bien homogeneizada / 5 ul de MoAb
• Incubar 15 a 20 minutos, T° ambiente
• Lisado con distintos métodos
• Hacer la CMF
EVALUACIÓN PREVIA CMF
• 1) SP sin presencia de coágulos
• 2) Dentro de las 24 hs de extracción
• 3) Hemograma con reproducibilidad
• 4) Evaluar todos los parámetros del
mismo, GR, GB, Plaquetas
• 5) Repetir en caso de leucopenia o
leucocitosis
EVALUAR DURANTE LA CMF
• Método de lisis
• Presencia de GR nucleados
(Eritroblastos)
• Pureza de la región seleccionada (baja en
monocitos)
• Evaluar la presencia de células dobles
positivas
¿CUÁNDO SE DEBERÁ
REPETIR UNA MUESTRA?
• Mala lisis de GR (no se puede establecer
una clara diferencia entre linfocitos,
monocitos y granulocitos)
• La suma de valores CD3/CD4 y
CD3/CD8 supera ampliamente al CD3
(sin observar células dobles positivas)
• Valores de CD3 inferiores al 50% (sin
alteraciones de lisis presentes)
¿CUÁNDO DEBO MEDIR
TODAS LAS POBLACIONES Y
SUB-POBLACIONES
PERIFÉRICAS?
• Siempre sería lo correcto
• Indispensable, con valores bajos menores
al 50% de CD3 total
• Evaluar células B (CD19 positivas)
• Evaluar células NK (CD56-16 positivas)
PROTOCOLOS DE ANÁLISIS
• Región morfológica
FSC vs. SSC
• Región en base
a MoAb (CD45)
vs. SSC
• TRI-Test
CD8/CD4/CD3
• CD3/CD4/CD45
CD3/CD8/CD45
• Multi-Check
CD3/CD8/CD4/CD45
Density Dot Plot Contour Plot
Los colores informan la Identificación de las poblaciones
frecuencia de los eventos mediante líneas de contorno
COULTER EPICS XL
Tri-Test CD4/CD8/CD3
• Gate morfológico (FSC vs SSC)
Simul-Test CD3/CD4/CD45
CD3/CD8/CD45
• Gate en SSC vs. CD45
FACS CANTO 4 COLORES
CD3/CD8/CD45/CD4
CD3/CD56-16/CD45/CD19
Se utilizan con Doble Plataforma
(Hemograma+Citometría) Clinico
Simple Plataforma con tubos Tru-Count
DIVA
MULTI-TEST
PROTOCOLO
• Donantes de banco de sangre
• Serología negativa
• 105 muestras obtenidas post-donación
• Vacutainer con EDTA
• Procesadas en el día
COMPARACIÓN DE CMF Y
SOFTWARE
CMF
SOF
T
CD3 CD4 CD8 CD19 CD56
BDS
P
1361
(1038-1717)
898
(662-1042)
437
(298-670)
234
(176-323)
187
(149-299)
BDD
P
1375
(1057-1724)
883
(654-1122)
408
(315-601)
229
(157-341)
195
(143-302)
CL45 1367
(1080-1691)
894
(677-1076)
413
(307-623)
236
(160-330)
182
(154-280)
CLTT 1327
(1058-1658)
837
(650-1076)
420
(312-625)
LEUCODEPLECIÓN
• Remover los leucocitos de una UGRD o
de C. plaquetarios con el fin de prevenir
la aloinmunización a antígenos HLA
• Previene la repetición de reacciones
febriles no hemolíticas
• Utilizado en pacientes poli-transfundidos
METODOLOGÍAS DE
LEUCODEPLECIÓN
• En etapa pre-almacenamiento por filtros
integrados a equipos de recolección
• En etapa post-almacenamiento (bed-side)
por medio de filtros
LEUCO-COUNT
• Muestras de sangre Pre y Post filtración
• Recuento de GB automático o manual
con cámara de Nageotte
• Se marca para CMF con IP (tinción para
DNA/RNA) presente en células nucleadas
ausente en GR y plaquetas
• Tubos Tru-Count para recuento absoluto
de GB presente en las muestras.
• Controles 1.9 GB/ul +/- 1.5 (bajo) y 2.5
GB/ul +/- 1.5 (alto)