De los orgenes a la actualidad
http://depa.fquim.unam.mx/amyd/docs.php?curso=206
Tcnica Instrumental
La herramienta analticade mayor importancia
Componentes bsicos
Controlde flujo
Fasemvil
Introduccinde muestra
Columna Deteccin
Registroy proceso
Horno
C
PROCESO CROMATOGRAFICO
La fase mvil fluye a lo largo del lecho cromatogrfico en contacto con la fase estacionaria.
COLUMNA
COLUMNA
FASE MVIL FASE MVIL FASE MVIL
PROCESO CROMATOGRAFICO
La fase mvil fluye, arrastrando consigo los solutos.
Los solutos se reparten entre ambas fases
MuestraFaseestacionariaFase
mvil
AL ALIMENTAR LA MUESTRA AL SISTEMA, LOS SOLUTOS SE REPARTEN ENTRE LAS DOS FASES.
PROCESO CROMATOGRAFICO
Fase mvil
Fase estacionaria
t0Fase mvil
Fase estacionaria
t0
PROCESO CROMATOGRAFICO
LAS MOLECULAS DE SOLUTO EN FASE ESTACIONARIA SE ESTANCAN
LAS MOLECULAS EN FASE MOVIL AVANZAN CON ELLA
Fase mvil
Fase estacionaria
t1Fase mvil
Fase estacionaria
t1
PROCESO CROMATOGRAFICO
LA VELOCIDAD DEL SOLUTO VARIA INVERSAMENTE CON LA AFINIDAD POR LA FASE ESTACIONARIA.
F. mvil
F. estacionaria
SEPARACION DE SOLUTOS
LOS COMPONENTES CON CONSTANTES DE REPARTO DIFERENTES SE SEPARARN.
Fase mvil
Fase estacionaria
t0
SEPARACION DE SOLUTOS
Fase mvil
Fase estacionaria
t1
Fase mvil
Fase estacionaria
t2
Fase mvil
Fase estacionaria
t3
Dimensiones de la Columna L = Largo de columna (cm, mm) dc = dimetro interno (mm, m) df = espesor de pelcula de fase (m) dp = dimetro de partcula (m) Vo = volumen muerto (ml)
Velocidad y flujo de fase Flujo = F = gasto en volumen del eluyente por
unidad de tiempo, medido a la salida de la columnay a temperatura ambiente (ml/min)
Velocidad de fase mvil = u = distancia mediarecorrida por la fase movil en una unidad de tiempo(cm/seg)
2F r u =
Tiempo Muerto (t0) El tiempo que tarda en eluir un soluto que no
interacciona con la fase estacionaria. El tiempo que se necesita para renovar totalmente
la fase mvil de la columna. to = Vo / Fo
TIEMPO DE RETENCIN tr = Tiempo transcurrido al momento de eluir el
mximo de concentracin del soluto. Vr = volumen de retencin = volumen de fase mvil
gastado al momento de eluir el mximo deconcentracin del soluto.
Vr = tr Fo
TIEMPO DE RETENCIN
tiempo
sea
l
tr
to
Constante de Reparto Equilibrio de reparto:Solutofm Solutofe
Cociente de las concentraciones del soluto. Solutoen la fase estacionaria entre soluto en fase mvil
KSoluto
Solutofe
fm
=
Ecuacin de la RetencinVr = Vo + KVe
El volumen de retencin de un soluto es la suma delas contribuciones del tiempo que estuvo en fasemvil (Vm) y en fase estacionaria (KVe).
K V VV
r o
e=
Tiempo de Retencin Corregido
tiempo
sea
l
trtr
to
Factor de Capacidad Cociente de la cantidad de soluto en fase
estacionaria entre la cantidad en fase mvil.
=kn
nsoluto
soluto
fe
fm
FACTOR DE CAPACIDAD
tiempo
sea
l
trtr
to
==
k tt
t tt
r
o
r o
o
Factor de Capacidad
Medida de la retencin del soluto. Indica que tan lejos del tiempo muerto eluye este.
= =k K V
Vt t
te
o
r o
o
Area y Altura del Pico
tiempo
Alt
ura
Area
Ancho del Pico
tiempo
sea
l
Alt
ura
A
ltur
a
wb
w0.5
En mediciones manuales w0.5 es mucho mas precisoque wb
PLATO TEORICO
tiempo
Alt
ura
A
ltur
a
tr
wb
w0.5
sea
l
N tw
r
b=
2
16
Definicin ms conocida:
PLATO TEORICO
tiempo
Alt
ura
A
ltur
a
tr
wb
w0.5
sea
l Varias frmulas:
22 2
0.5
16 5.545 2r r r
b
t t tN
Areaw wAltura
= = =
Altura del Plato Terico H = Altura equivalente a un plato terico.
H LN
=L
H
Eficiencia Cromatogrfica H mide la eficiencia de la columna cromatogrfica. Entre mas pequeo sea H, el sistema es ms
eficiente. ( mayor nmero de platos tericos pormetro.
Para una misma longitud se logra mayor poder de separacin con una menor H.
Separacin de Solutos
tiempo
Sea
l
wb,2
=ttr
r
,
,
2
1
to
tr,2tr,1
wb,1
SELECTIVIDAD
La selectividad muestra las diferencias de afinidad por los solutos de las fases involucradas.
Indica el potencial de separacin de esos solutos en el sistema, pero no mide la separacin real.
= = =
KK
kk
t - t0t - tor
r
2
1
2
1
2
1 1,
,
tr,2tr,1
wb,2wb,1
( )( )
Rt t
w ws
r r
b b=
+, ,
, ,
2 1
1 21
2
RESOLUCINRs = 0.8
Rs = 1.0
Rs = 1.5
Rs = 2.0
RESOLUCIN Tres son los factores que influyen en la resolucin
cromatogrfica: retencin, selectividad yeficiencia:
R kk a
Ns
retencin selectividad eficiencia
=
+
1
14
RESOLUCINSolo controlando la retencin ...
... la selectividad ...
... y la eficiencia ...
... se logra una buena separacin.
RESOLUCIN Y RETENCIN
Rs
0 2 4 6 8 10k
75%
3
90%
RESOLUCIN Y SELECTIVIDAD
Rs
0 2 4 6 8 10
Zona de trabajo usual
RESOLUCIN Y EFICIENCIA
N0 20,000 40,000 60,000 80,000 10
Rs
x
1.4 x
N1 2N1 10 N1
3.2 x
RESOLUCIN Y EFICIENCIA A mayor nmero de platos tericos, mejor
separacin. La separacin mejora apreciablemente solo si el
aumento en N es de varios ordenes de magnitud. Los aumentos pequeos no son importantes, p. ej.
duplicar el largo de columna duplica el tiempo deanlisis y solo mejora en 40% la resolucin.
Las mejoras notables solo se logran mejorando lastcnicas cromatogrficas.
Tiempo total de anlisis y resolucin
( )( )
t Rk
kHu
t s=
+
161
122 3
2
ANLISIS MAS RPIDOS SI: Rs pequea, como se busca separar : 1.5 Rs 2. >> 1. k chica, para separar : 3 k 6. Se logran altas eficiencias (H pequeo) a
velocidades altas de fase mvil.
Eficiencia Cromatogrfica
H = f (ensanchamiento de la banda)
multicanales difusin
resistencia a la transferencia de masa
LH NBH A C uu
A B
C
=
= + +
= ==
Efecto Multicanales y/o Eddy
2 pA d=
Difusin axial
Transferencia de masa en la FMmovimiento
2 m
DB
u u
=
Ensanchamiento de la banda
Transferencia de masa en la FE
2
21
ae
e
t ukH
k D
= +
Transferencia de masa en fase mvil
2p
mm
d uC u
D
=
Transferencia de masa
Transferencia de masa en la FMestancada
( )( )( )
2 2
2
1
30 1 1
psm
M
k d uH
k yD
+=
+
Ecuacin de Van Deemter
( )( )( )
22 2 2
2
12 2 2
1 30 1 1
p pm ap
e m M
d u k d uD t ukH d
u k D D k yD
BH A C uu
+ = + + + + + +
= + +
Efecto del dimetro de partcula
Digestin de enolasa.Efecto del tamao de partculaen N y P
Columnas Tubo de acero inoxidable, vidrio o capilar de slice
fundida
Dimensiones
Longitud: 25 a 300 mm
Dimetro: 25 m a 100 mmTamao de partcula: 1.7 a 10 m
Tipos de CL
Cromatografa de intercambio inico
Adsorcin: lquido-slido
Particin: lquido-lquido
Cromatografia en fase normal
Cromatografia en fase inversa
Cromatografia de exclusin por tamao
Empaques de UHPLC Images of current 1.9um particles
Cromatografa de fase inversa
FE
Slica qumicamente modificada con grupos no-polares: hidrocarburos saturados: C18 octadecil, C8 octil, C4 tetrametil, C2 dimetl
FM
Mezclas: agua/disolventes orgnicos H2O +(CH3OH, THF, CH3CN)
Cromatografa de fase inversa
Efecto solvofbico fuerte: Parte apolar de la molcula del soluto es mayor
% C en la FE es mayor
Polaridad de la FM es alta (mayor % de H2O)
Fase mvil Disolventes grado cromatogrfico
Agua de 18 m Baja viscosidad
No vlatil
Miscibilidad
Filtrada
Sin oxgeno disuelto (degasificada)
Fuerza del eluyente
Viscosidad del eluyente
Anlisis Isocrtico
Fase inversa, 10% CH3CN
Anlisis Isocrtico
Fase inversa, 80% CH3CN
Anlisis Isocrtico
Fase inversa, 50% CH3CN
Anlisis por gradienteGradiente exponencial de acetonitrilo
T t
Elucin por gradiente
Detectores Indice de refraccin
Ultravioleta-Visible
Fluorescencia
Electroqumico
Radioactividad
Infrarrojo
Espectrmetro de masas
Protenas por 2D nano UPLC
Cromatogramas de digestin de E. Coli
Fabricantes de Equipo HPLC Agilent Technologies Beckman Coulter Cecil Instruments Dionex Corp Hitachi PerkinElmer, Inc. Shimadzu Scientific Instruments Thermo Fisher Scientific Varian, Inc. Waters Corporation
Columnas para HPLC Agilent Technologies AkzoNobel Beckman Coulter Dionex Corp Merck KGaA Micro-Tech Phenomenex SGE Analytical Science Shimadzu Scientific Instruments Shodex Sigma-Aldrich Thermo Fisher Scientific Tosoh Corporation Varian, Inc. Waters Corporation W. R. Grace and Company (Vydac)
Cromatografa de Lquidos de Alto y Ultra Alto RendimientoSlide Number 2Componentes bsicosSeparacin CromatogrficaPROCESO CROMATOGRAFICOPROCESO CROMATOGRAFICOPROCESO CROMATOGRAFICOPROCESO CROMATOGRAFICOPROCESO CROMATOGRAFICOSEPARACION DE SOLUTOSSEPARACION DE SOLUTOSDefinicionesDimensiones de la ColumnaVelocidad y flujo de faseTiempo Muerto (t0)TIEMPO DE RETENCINTIEMPO DE RETENCINConstante de RepartoEcuacin de la RetencinTiempo de Retencin CorregidoFactor de CapacidadFACTOR DE CAPACIDADFactor de CapacidadArea y Altura del PicoAncho del PicoPLATO TEORICOPLATO TEORICOAltura del Plato TericoEficiencia CromatogrficaSeparacin de SolutosSELECTIVIDADSELECTIVIDADRESOLUCINRESOLUCINRESOLUCINRESOLUCINRESOLUCIN Y RETENCINRESOLUCIN Y SELECTIVIDADRESOLUCIN Y EFICIENCIARESOLUCIN Y EFICIENCIATiempo total de anlisis y resolucinVan DeemterSlide Number 43H = f (ensanchamiento de la banda)Efecto Multicanales y/o EddyDifusin axialEnsanchamiento de la bandaTransferencia de masa en fase mvilTransferencia de masaEcuacin de Van DeemterEfecto del dimetro de partculaDigestin de enolasa.Efecto del tamao de partculaen N y DPColumnas en HPLCSlide Number 54Slide Number 55ColumnasTipos de CLEmpaques de UHPLCSlide Number 59Slide Number 60Cromatografa de fase inversaCromatografa de fase inversaFase mvilFuerza del eluyenteViscosidad del eluyente Gradiente de ElucinAnlisis IsocrticoAnlisis IsocrticoAnlisis IsocrticoAnlisis por gradienteSlide Number 71Elucin por gradienteDetectoresSlide Number 74Protenas por 2D nano UPLC Cromatogramas de digestin de E. ColiFabricantes de Equipo HPLCColumnas para HPLC