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ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
POSGRADO EN CIENCIAS DE LOS ALIMENTOS
EFECTO DE LA FUENTE DE CARBONO Y LA
ADICIÓN DE SALES DE CALCIO Y/O MAGNESIO
EN LA PRODUCCIÒN DE NARINGINASA POR MEDIO DE
Aspergillus niger
TESIS
Que para obtener el grado de
Maestra en Ciencias de los Alimentos
P R E S E N T A
Q. A. RAQUEL GONZÁLEZ VÁZQUEZ
MÉXICO, D.F. 2009
Instituto Politécnico Nacional
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El trabajo experimental se realizó en el laboratorio de Tecnología de
alimentos y en el laboratorio de enzimología del departamento de
Graduados en alimentos de la Escuela. Nacional de Ciencias
Biológicas del Instituto Politécnico Nacional.
Fue dirigido por la Dra. Yadira Rivera Espinoza y por la M. en C.
Teresa Cruz y Victoria, con el financiamiento de los proyectos SIP
20070396 y 20080285 ambos titulados: “Producción de naringinasa
mediante la fermentación de diferentes fuentes de carbono por medio
de hongos filamentosos”.
Agradezco a CONACyT, institución que me apoyó económicamente.
Siendo becaria de enero 2006 a diciembre 2008, con número de
registro 217266/206844.
Agradezco al programa de formación de investigadores PIFI del IPN
ya que me apoyó económicamente. Siendo becaria en los periodos
correspondientes a partir de enero 2006 y hasta diciembre 2008.
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INDICE GENERAL
Resumen………………………………………………………………………… 1
Abstrac…………………………………………………………………………... 2
Introducción…………………………………………………………………….. 3-5
II Antecedentes……………………………………………………………….... 6 –27
II. 1. Enzimas alimentarias producidas por hongos filamentosos................ 6
II.1.1. Enzimas constitutivas e inducidas de los microorganismos.............. 6-7
II. 1.2. Enzimas extracelulares de los microorganismos.............................. 8
II. 2.Métodos fisicoquímicos del sabor amargo en los jugos de frutas
cítricas.......................................................................................................... 8-9
II. 3. Método enzimático para la eliminación del amargor............................ 10-11
II. 4. Producción de naringinasa.................................................................. 12
II. 4.1. Características del género Aspergillus............................................. 12-13
II. 5. Factores que influyen en la producción de naringinasa...................... 13-14
II. 6. Otras aplicaciones de la naringinasa................................................... 14-15
II. 7. Actividad enzimática y constantes de Km y Vmáx reportadas para la
naringinasa.................................................................................................. 15-16
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II. 8. Métodos para determinar la actividad enzimática de la naringinasa... 17-18
II. 8.1 Modelos gráficos para la determinación de la actividad enzimática.. 18-19
II. 8.1.1 Modelo de Michaelis-Menten.......................................................... 19-20
II 8.1.1.1 Determinación de las contantes de Michaelis –Menten................ 20-22
II 8.1.2. Modelo de Lineweaber-Burk........................................................... 23
II 8.1.2.1Determinación de las contantes de Lineweaber-Burk................... 23-24
II 8.1.3. Modelo de Eadie-Hofsteen............................................................. 24-25
II 8.1.3.1. Determinación de contantes de Eadie-Hofsteen......................... 25-26
II 8.1.4. Modelo de Agustinson.................................................................... 26-27
II 8.1.5 Modelo de Wilkinson........................................................................ 27-28
Justificación............................................................................................... 29
Objetivos..................................................................................................... 30
III. Materiales y métodos........................................................................... 31-45
III.1 Desarrollo experimental........................................................................ 31
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III.2 Materias primas.................................................................................... 32
III.3 Material de laboratorio y reactivos........................................................ 32
III.4 Equipo................................................................................................. 32
III.5 Métodos................................................................................................ 33-39
III.5.1 Evaluación preliminar de la capacidad productora de naringinasa
de la cepa Aspergillus niger ATCC 1015 por medio de cromatografía en
capa fina...................................................................................................... 33-34
III.5.1.1 Determinación del mejor disolvente que permite la ascendencia
por capilaridad de la naringina pura y la naringina presente en el jugo de
naranja en cromatografía en capa fina........................................................ 34-36
III.5.2 Recuperación de la cepa de A. niger a partir de un cultivo en tubo
inclinado....................................................................................................... 36
III.5.3 Preparación del inóculo de A. niger por medio de turbidimetria........ 36-37
III.5.4 Fermentaciones para la producción de naringinasa por medio de
A. niger utilizando como base un caldo nutritivo......................................... 37-39
III.5.6 Crecimiento del microorganismo utilizando diferentes fuentes de
carbono........................................................................................................ 39
III.6 Métodos analíticos................................................................................ 40-45
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III.6.1 Determinación de proteína en el medio de cultivo............................. 40
III.6.1.1 Preparación del reactivo de Bradford............................................ 40
III.6.1.2 Patrón de albúmina sérica bobina (ASB)........................................ 40-41
III.6.2 Determinación de la actividad enzimática de la naringinasa
comercial de Penicillium decumbens........................................................... 41
III.6.2.1 Estudio del efecto de la concentración de naringinasa de
Penicillium decumbens en la hidrólisis de naringina................................... 42
III.6.2.2 Estudio del efecto del tiempo en la velocidad de hidrólisis de la
naringina por la naringinasa de Penicillium decumbens.............................. 42-43
III.6.2.3 Curva tipo de naringina................................................................... 43
III.6.2.4 Determinación de las constantes de Vmáx y Km para la
naringinasa de P. decumbens por los métodos gráficos de Michaelis-
Menten, Lineweaber-Burk, Eadie-Hofsteen, Agustinson y Wilkinson.......... 43-44
III.6.3 Estudio de la actividad enzimática de la naringinasa producida por
A. niger en muestras de la fermentación de cada formulación.................... 44
III.6.4 Estudio de la actividad enzimática de la naringinasa producida por
A. niger del caldo nutritivo que presentó mayor actividad enzimática en el
estudio anterior............................................................................................ 44-45
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III.6.5 Análisis estadístico para determinar la confiabilidad de los
resultados obtenidos por medio del programa estadístico MINITAB13....... 45
IV. Resultados y discusión....................................................................... 46-84
IV.1 Evaluación de la capacidad productora de naringinasa de la cepa
Aspergillus niger ATCC 1015 por medio de cromatografía en capa fina..... 46-57
IV.1.1 Disolventes para la ascendencia por capilaridad de una muestra
de naringina pura en cromatografía en capa fina........................................ 46-49
IV.1.2 Disolventes utilizados para la ascendencia por capilaridad de la
naringina presente en el jugo de naranja en cromatografía en capa fina.... 49-51
IV.1.3 Disolventes para la ascendencia por capilaridad de la naringina
pura y la naringina presente en las naranjas en cromatografía en capa
fina............................................................................................................... 51-52
IV.1.4 Evaluación de la degradación de la naringina por la naringinasa
producida por Aspergillus niger ATCC 1015 una vez inoculado en
naranjas....................................................................................................... 52-57
IV.2 Recuperación de la cepa de A. niger a partir de un cultivo en tubo
inclinado....................................................................................................... 58
IV.3 Fermentaciones.................................................................................... 60-61
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IV.3.1 Crecimiento del microorganismo utilizando diferentes fuentes de
carbono........................................................................................................ 60
IV.4 Determinación de proteína en el medio de cultivo por el método de
Bradford....................................................................................................... 62-68
IV.5 Estudio de la actividad enzimática de la naringinasa de A. niger en
muestras de cada fermentación................................................................... 69
IV.6 Estudio de la actividad enzimática del caldo nutritivo seleccionado.... 76-84
V. Conclusiones......................................................................................... 85-86
VI. Bibliografía............................................................................................ 87-97
Anexos........................................................................................................ 98-111
Anexo 1. Curva tipo de proteína obtenida por el método de Bradford........ 98
Anexo 2. Estudio y determinación de la actividad enzimática de la
naringinasa comercial de Penicillium decumbens....................................... 99-102
Anexo 3. Curva tipo de naringina................................................................ 103-104
Anexo 4. Curva tipo de glucosa.................................................................. 105
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Anexo 5. Determinación de las constantes de Vmáx y Km para la
naringinasa de P. decumbens por los métodos gráficos de Michaelis-
Menten, Lineweaber-Burk, Eadie-Hofsteen, Agustinson y Wilkinson.......... 106-111
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INDICE DE CUADROS
Cuadro 1. Disolventes utilizados para determinar el factor de elución de
una muestra de naringina pura en cromatografía en capa fina................... 35
Cuadro 2. Disolventes y proporción utilizados para determinar el factor
de elución de la naringina presente en el jugo de naranja.......................... 35
Cuadro 3. Disolventes y proporción utilizados para determinar el factor
de elución de la naringina pura y de la naringina presente en el jugo de
naranja en una misma placa cromatográfica............................................... 36
Cuadro 4. Escala Macfarland empleada para calcular el inoculo
empleado en cada fermentación.................................................................. 37
Cuadro 5. Composición del caldo nutritivo empleado en cada
fermentación y al cual se le adicionó la fuente de carbono y/o las sales
de calcio y magnesio................................................................................... 38
Cuadro 6. Caldos nutritivos evaluados en el crecimiento delmicroorganismo y producción de naringinasa por A. niger .......................... 39
Cuadro 7. Curva tipo de albumina sérica bovina, para la determinación
de proteína en el medio de cultivo por el método de Bradford.................... 41
Cuadro 8. Disolventes para eluir la naringina pura (50 mg/1000ml) en
cromatografía en capa fina.......................................................................... 46
Cuadro 9. Máximos de producción de proteína en la producción de
naringinasa por medio de A. niger............................................................... 65
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Cuadro 10. Comparativo de los máximos de producción de proteína
significativos (p≤0.05) en la producción de naringinasa mediante
diferentes fuentes de carbono por medio de A. niger .................................. 67
Cuadro 11. Máximos encontrados de actividad enzimática en la
producción de naringinasa por medio de A. niger (No diferencia
significativa)................................................................................................. 73
Cuadro 12. Comparativo de los máximos de actividad enzimática
significativos (p≤0.05) de la naringinasa producida utilizando diferentes
fuentes de carbono por medio de A. niger ................................................... 74
Cuadro 13. Actividad enzimática de la naringinasa producida por
diferentes microorganismos y determinada mediantes diferentes
sustratos...................................................................................................... 78
Cuadro 14. Parámetros calculados para las curvas de Michaelis-
Menten, lineweaberburk, Eadi-Hoffsten y Agustinson para la naringinasa
de A.niger ATCC1015.................................................................................. 81
Cuadro 15. Parámetros de Vmax y Km para las curvas de Michaelis-
Menten, Lineweaber-Burk, Eadi-Hoffsten, Agustinson y Wilkinson para la
naringinasa de A. niger ATCC1015............................................................. 81
Cuadro 16. Constantes de Vmáx y Km para la naringinasa producida por
diferentes microorganismos......................................................................... 82
Cuadro 1A. Efecto de la concentración en la velocidad de hidrólisis de la
naringinasa de P. decumbens..................................................................... 99
Cuadro 2A. Efecto del tiempo en la velocidad de hidrólisis de la naringina
por la naringinasa e P. decumbens..............................................................101
Cuadro 3A. Curva tipo de naringina............................................................ 103
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Cuadro 4A. Parámetros Michaelis-Menten, Lineweaber-Burk, Eadie-
Hofsteen y Agustinson para la naringinasa de P. decumbens.................... 106
Cuadro 5A. Parámetros de Vmax y Km para las curvas de Michaelis-
Menten, Lineweaber-Burk, Eadie-Hofsteen, Agustinson y Wilkinson para
la naringinasa de P. decumbens.................................................................. 107
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INDICE DE FIGURAS
Figura 1. Hidrólisis de la naringina en prunina, ramnosa y naringenina
por la enzima naringinasa conteniendo actividad de α .-L-ramnosidasa y
β-D-glucosidasa........................................................................................... 11
Figura 2. Aspergillus niger. Conidióforo...................................................... 13
Figura 3. Aspergillus terreus. Conidióforo................................................... 13
Figura 4. Reducción del ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS), (color amarillo)
por la glucosa u otro azúcar reductor al ácido 3-amino-5-nitrosalicílico
(color rojo ladrillo)........................................................................................ 18
Figura 5. Representación gráfica de la velocidad de reacción y
constantes de Vmáx y Km de Michaelis-Menten............................................ 21
Figura 6. Representación gráfica de la doble recíproca de la velocidad
de reacción y constantes de Vmáx y Km para Lineweaberburk.................. 24
Figura 7. Representación gráfica de la velocidad de reacción yconstantes de Vmáx y Km de Eadie-Hofsteen............................................ 25
Figura 8. Representación gráfica de la velocidad de reacción y
constantes de Vmáx y Km de Agustinson....................................................... 27
Figura 9. Diagrama de proceso para la producción de naringinasa,
proteína y determinación de la actividad enzimática de naringinasa
producida por A. niger ATCC1015 utilizando diferentes fuentes de
carbono........................................................................................................ 31
Figura 10. Naringina pura ascendida por capilaridad en cromatografia en
capa fina utilizando como disolvente acetona 100%.(Rf=0)........................ 47
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Figura 11. Naringina pura ascendida por capilaridad en cromatografia en
capa fina utilizando como disolvente metanol 100% (Rf=0.62)................... 47
Figura 12. Naringina pura ascendida por capilaridad en cromatografia en
capa fina utilizando como disolvente metanol: acetona 95:5 (Rf= 0.54)..... 47
Figura 13. Naringina pura ascendida por capilaridad en cromatografia en
capa fina utilizando como disolvente metanol:acetona 90:10 (Rf=0.66)..... 48
Figura 14. Naringina pura ascendida por capilaridad en cromatografia en
capa fina utilizando como disolvente metanol: acetona 80:20 (Rf=0.65).... 49
Figura15. Naringina presente en el jugo de naranja ascendida por
capilaridad en cromatografía en capa fina utilizando como disolvente
metanol 100% (Rf=0.645)............................................................................ 50
Figura 16. Naringina presente en el jugo de naranja ascendida por
capilaridad en cromatografía en capa fina utilizando como disolvente
metanol: acetona 95:5 (Rf=1.67)................................................................. 50
Figura17. Naringina presente en el jugo de naranja ascendida porcapilaridad en cromatografía en capa fina utilizando como disolvente
metanol: acetona 90:10 (Rf=0).................................................................... 50
Figura 18. Naringina presente en el jugo de naranja ascendida por
capilaridad en cromatografía en capa fina utilizando como disolvente
metanol: acetona 80:20 (Rf=0.8)................................................................. 51
Figura 19. Naringina (N) y naringina de naranja (n) metanol: acetona
80:20 (Rf=1)................................................................................................. 52
Figura 20. Naringina (N) y naringina de naranja (n) metanol 100%
(Rf=0.86)...................................................................................................... 52
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Figura 21. Cromatoplacas de naranjas sin inocular, metanol: acetona
80:20 (triplicado).......................................................................................... 53
Figura 22. Cromatoplacas de naranjas inoculadas con A. niger , metanol:
acetona 80:20 (triplicado)............................................................................ 53
Figura 23. Cromatoplacas de naranjas sin inocular, metanol: acetona
80:20 (triplicado).......................................................................................... 54
Figura 24. Cromatoplacas de naranjas inoculadas con A. niger , metanol:
acetona 80:20 (triplicado)............................................................................ 54
Figura 25. Cromatoplacas de naranjas sin inocular, metanol: acetona
80:20 (triplicado).......................................................................................... 55
Figura 26. Cromatoplacas de naranjas inoculadas con A. niger , metanol:
acetona 80:20 (triplicado)............................................................................ 55
Figura 27. Cromatoplacas de naranjas sin inocular, metanol: acetona
80:20 (triplicado).......................................................................................... 56
Figura 28. Cromatoplacas de naranjas inoculadas con A. niger , metanol:
acetona 80:20 (triplicado)............................................................................ 56
Figura 29. Cromatoplacas de naranjas sin inocular, metanol: acetona
80:20 (triplicado).......................................................................................... 57
Figura 30. Cromatoplacas de naranjas inoculadas con A. niger , metanol:
acetona 80:20 (triplicado)............................................................................ 57
Figura 31. Cepa Aspergillus niger ATCC 1015 obtenida del cepario del
CINVESTAV................................................................................................. 58
Figura 32. Agar Saboraud........................................................................... 59
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Figura 33. Resiembra del microorganismo Aspergillus niger ATCC 1015.. 59
Figura 34. Crecimiento optimo de la cepa de Aspergillus niger ATCC1015............................................................................................................. 59
Figura 35. Crecimiento del micelio de A. niger ATCC1015 en melaza con
adición de CacO3 (▲) y melaza con adición de MgCO3 (■)......................... 61
Figura 36. Curvas de comportamiento de la proteína en relación a la
fuente de carbono (A) y sales de Ca2+
y/o Mg2+ (B), por Aspergillus niger
ATCC1015. Tiempo de la fermentación en días(C)..................................... 63
Figura 37. Curvas de producción de proteína mostrando las relaciones:
fuente de carbono-sales (A) y fuente de carbono-días (B), para
naringina, melaza y ramnosa y (C) la relación sales-días para
naringina...................................................................................................... 64
Figura 38. Curvas de Actividad enzimática expresada en microgramos
de glucosa producida después de 24hrs de hidrolisis, en relación a las
diferentes fuentes de carbono 0.5%, sales de Ca
2+
y/o Mg
2+
0.01mM ydías.............................................................................................................. 69
Figura 39. Curvas de actividad enzimática mostrando las relaciones
fuente de carbono-sales, fuente de carbono-días y sales-
días.............................................................................................................. 72
Figura 40. (A)Curva de Michaelis –Menten para Naringinasa donde Y=
6.683x+0.068; R2=0.908; (B) Curva de Lineweaber-Burk para
Naringinasa; (C) Curva de Agustinson para Naringinasa; (D) Curva de
Eadie-Hofsteen para la naringinasa de A. niger ATCC1015....................... 80
Figura 1A. Curva tipo de proteína............................................................... 98
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Figura 2A. Efecto de la concentración de la naringinasa de P.
decumbens en la hidrólisis de la naringina.................................................. 100
Figura 3A. Efecto del tiempo en la velocidad de hidrólisis de la naringina
por la naringinasa de P. decumbens........................................................... 102
Figura 4A. Curva tipo de naringina, Y= 129.22+ 80.535, R2= 0.921.......... 104
Figura 5A. Curva tipo de Azúcares reductores obtenida por el método
del ácido 3,5-dinitro salicílico (DNS)............................................................ 105
Figura 6A. Curva de Michaelis –Menten para naringinasa de Penicillium
decumbens.................................................................................................. 108
Figura 7A. Curva de Lineweaber-Burk para naringinasa de Penicillium
decumbens.................................................................................................. 109
Figura 8A. Curva de Eadie-Hofsteen para naringinasa de Penicillium
decumbens.................................................................................................. 110
Figura 9A. Curva de Agustinson para naringinasa de Penicillium
decumbens.................................................................................................. 111
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________________________________________________________ RESUMEN
1
RESUMEN
El presente trabajo aporta información del efecto de la naringina, melaza o
ramnosa, como fuentes de carbono, y las sales de Ca 2+ y/o Mg2+ en la producción
de naringinasa por medio de Aspegillus niger ATCC1015, el cual es un
microorganismo productor de ácido cítrico y no produce toxinas.
Primero se evaluó por cromatografía en capa fina la capacidad productora de
naringinasa por la cepa empleada, lo cual permitió conocer que el microorganismo
empleado tuviera presuntivamente la capacidad de producir naringinasa. Para
conocer el efecto de las diferentes fuentes de carbono de interés, se empleó un
caldo nutritivo base, adicionado con naringina, ramnosa o melaza, y/o sales de
calcio y magnesio. Las fermentaciones se llevaron a cabo bajo las mismas
condiciones de temperatura y agitación. Cada 24 horas durante los siete días de la
fermentación se cuantificó el peso del micelio, la producción de proteína y la
actividad enzimática de la naringinasa producida, además se determinó mediante
diferentes modelos gráficos las contantes de Vmáx y Km para la naringinasa que
mostró mayor actividad enzimática. Las constates de Vmáx y Km de la naringinasa
obtenida fueron comparadas contra las de la naringinasa comercial de Penicillium
decumbens, la cual también se determinó en este trabajo. A partir de las
investigaciones realizadas en la presente investigación se encontró que la melaza
y la adición de carbonato de calcio favorecieron significativamente el crecimiento
del microorganismo, pero no la producción de proteína y la actividad enzimática.
También se encontró que para favorecer la producción proteica se debe emplear
como fuente de carbono a la naringina y se debe adicionar la mezcla de las sales
de calcio y magnesio. Por otra parte, la fuente de carbono que permitió obtener
una mayor actividad enzimática fue la ramnosa sin adición de sales. Finalmente,
se encontró que la naringinasa producida bajo las condiciones de este trabajo
presenta la misma actividad específica que la naringinasa comercial, lo cual la
convierte en una enzima que puede competir con la enzima que se encuentra en
el mercado.
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________________________________________________________________ ABSTRAC
2
ABSTRAC
The current document provides information to the effect of Naringin, Melase or
Rhamnose, as carbon sources, and salts as Ca2+ and Mg2+ in the production of
Naringinase through Aspegillus niger ATCC1015, which is a microorganism
producer of citric acid and produces no toxins.
First was assessed by thin layer chromatography, production capacity of
Naringinase by the strain used, this allowed knowing that the microorganism used
was allegedly capable of producing Naringinase. To study the effect of different
carbon sources of interest, was used a nutrient broth base, added whit
Naringinase, Rhamnose or Melase and/or calcium and magenisium salts.
Fermentations were carried out under the same conditions of temperature and
agitation. Every 24 hours during the seven days of fermentation the mycelium
weight was quantified, protein production and enzyme activity of produced
Naringinase, also was determined by different graphic models the constants of
Vmax and Km for Naringinase that showed higher enzyme activity. Constants
Vmax and Km from Naringinase obtained were compared against the commercial
Naringinase of Penicillium decumbens, wich is also found in this document. Based
on research conducted in this document found that Melase and the addition of
calcium carbonate, significantly favored the growth of microorganism, but not the
production of protein and enzyme activity. Was also found that to promote the
production of protein must be used as a carbon source the Naringin and addition of
Calcium and Magnesium salts mixture. Furthermore, the carbon source that
yielded a higher enzyme activity was the Rhamnose no added salts. Finally we
found that the Naringinase produced under the terms of this study, shows the
same specific activity that commercial Naringinase, which makes an enzyme that
can compete whit the commercial enzyme.
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___________________________________________________________ INTRODUCCIÓN
3
I. INTRODUCCIÓN
La implementación de enzimas, con aplicación en la industria de los alimentos, ha
aumentado en años recientes. Un ejemplo de esto son las glucanasas, utilizadas
en la panificación, la extracción y clarificación de jugos (Villena y Gutiérrez, 2003)
o las enzimas quimosina y pepsina, que forman el cuajo para la fabricación de
quesos, solo por mencionar algunas (Montes y Magaña, 2002; Manzanares y col,
1997).
La aplicación de enzimas en los alimentos presenta una serie de ventajas de
índole económica o tecnológica. La gran especificidad de acción que tienen lasenzimas hace que no se produzcan reacciones laterales imprevistas. Además, las
enzimas pueden inactivarse fácilmente cuando se considere que ya han realizado
su misión, quedando entonces asimiladas el resto de las proteínas presentes en el
alimento (Montes y Magaña, 2002).
La naringinasa es una enzima que está siendo utilizada en la industria de los
alimentos con una aplicación importante en el proceso de desamargor en los jugos
de uva y otras frutas cítricas. La naringinasa es un complejo enzimático que
presenta actividad α-L-ramnosidasa (EC.3.2.1.40) y β-D- glucosidasa
(EC.3.2.1.21) capaz de hidrolizar a la naringina, el cual es el mayor y principal
componente del amargor en jugos de uva y varias frutas cítricas (Thomas y col,
1958; Griffith, 1969; Dunlap y col, 1962; Ono y col, 1978). La naringina es
abundante en frutas inmaduras y su concentración decrece en frutas maduras. Su
presencia ha sido la mayor limitación en la aceptación comercial de los jugos de
frutas. La hidrólisis de la naringina produce naringenina la cual es insípida, lo cual
ayuda a la mejor aceptación de los jugos por la disminución de su amargor (Yusof
y col, 1990).
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___________________________________________________________ INTRODUCCIÓN
4
La información sobre la α-L-ramnosidasa de la naringinasa es limitada y su
producción ha sido asociada con plantas (Hall, 1938; Thomas y col, 1958, Ting,
1958; Kaji y Ichimi, 1973), gastrópodos marinos (Kurosawa y col, 1973), y
microorganismos (Manzanares y col, 199, Young y col, 1989; Shanmugam y
Yadav, 1995). Por razones de viabilidad, solo los procesos basados en
naringinasas microbianas son viables (Munish y Uttam, 2000). Tal es el caso de
Aspergillus niger quien es considerado como el mejor productor de naringinasa
extracelular (Kishi, 1955) y Aspergillus terreus quien es bien conocido como un
hongo productor eficiente de enzimas extracelulares de interés para la industria de
alimentos (Gallego y col, 1996).
Existe poca información disponible en cuanto a la producción de la naringinasa ymucha información está guardada como secreto industrial o está patentada (Ito y
Takiguchi, 1970; Fukumoto y Okada, 1973; Wulbrandt y col, 1995). Algunos
reportes científicos ofrecen una información muy ambigua acerca de las
condiciones de producción de la naringinasa. Se ha reportado que la producción
de naringinasa mediante hongos filamentosos esta favorecida por los iones
metálicos como Ca2+ y Mg2+. Sin embargo, se ha encontrado que dichos iones no
son indispensables (Munish y col, 2005; Gallego y col, 2001). También se ha
reportado que la enzima es reprimida por la presencia de glucosa (Bram y
Salomons, 1965) lactato, citrato, sacarosa, fructosa y almidón (Munish y Uttam,
2000). Por otra parte se ha encontrado que la producción de la enzima disminuye
abajo de pH 4 y es estimulada en presencia de los sustratos naringina, ramnosa,
melaza (Munish y col, 2005; Gallego y col, 2001) y licor de maíz (Munish y Uttam,
2000).
La naringinasa de origen microbiano que existen actualmente en el mercado
presenta una eficacia muy deficiente de la hidrólisis de la naringina, por lo que es
necesario llevar a cabo estudios para conocer las condiciones de producción y
encontrar una enzima naringinasa que presente una mejor capacidad de hidrólisis.
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___________________________________________________________ INTRODUCCIÓN
5
Por ello en este estudio se utilizarán diferentes fuentes de carbono y iones
metálicos para conocer su efecto en la producción de la enzima naringinasa y en
su capacidad de hidrólisis. Asimismo, se llevará a cabo una comparación de la
actividad de la naringinasa producida por Aspergillus niger (ATCC 1015), la cual
es una cepa principalmente productora de ácido cítrico, y la naringinasa comercial
pura (producida por Penicillum decumbens) para conocer si la enzima producida
por A. niger presenta mayor capacidad de hidrólisis que la enzima comercial.
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_________________________________________________________ ANTECEDENTES
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II. ANTECEDENTES
II. 1. Enzimas alimentarias producidas por hongos filamentosos.
La aplicación de enzimas provenientes de especies de hongos filamentosos es
una constante en el desarrollo de alimentos. Muchos de ellos degradan polímeros
vegetales, que son los constituyentes de la pared celular (celulosa y hemicelulosa)
y tienen múltiples aplicaciones industriales como la mejora del filtrado de zumos, el
aumento de características organolépticas de ciertas bebidas alcohólicas o la
extracción de compuestos de interés nutricional desde residuos agroalimentarios
como es el caso de residuos de pescados para la obtención de proteasas,
coagulasas y peptonas de uso microbiológico (Fernandez, 2004). En condiciones
naturales la síntesis de estas enzimas se produce como respuesta a la presencia
de pequeñas cantidades de sustancias inductoras que generalmente son
monosacáridos producidos por la degradación de los polímeros asimilables. Estos
azúcares entran dentro de la célula fúngica a través de transportadores, pero si en
el medio hay otros azúcares monoméricos con alto valor nutricional (por ejemplo
glucosa) el microorganismo consume antes esta fuente de carbono que ejerce una
represión de la síntesis de las enzimas extracelulares (Lehninger, 1990).
II.1.1. Enzimas constitutivas e inducidas de los microorganismos.
Algunas enzimas pueden necesitarse en la misma cantidad durante todas las
condiciones de crecimiento y se denominan constitutivas. Las enzimas
constitutivas son generalmente enzimas celulares clave requeridas para el
crecimiento bajo todas las condiciones nutricionales y, por tanto, se sintetizan
continuamente en la célula en crecimiento. Por otra parte, las enzimas inducibles
son aquellas que se sintetizan solo cuando el sustrato que requiere se encuentra
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_________________________________________________________ ANTECEDENTES
7
presente en el medio de cultivo como única fuente de carbono y dicha sustancia
se conoce como inductor (Madigan y col, 2004).
Para movilizar los recursos de las fuentes complejas y que los microorganismos
puedan tener acceso a energía y nutrientes, estos producen enzimas que son
inducidas de acuerdo con los sustratos que estén presentes. Por ejemplo, la
adición de celulosa estimula la actividad de celulasa en suelos húmedos. (Shackle
y col, 2000) Lo que significa que la producción enzimática puede ser una
respuesta inducible a la presencia de sustratos complejos. Las enzimas
producidas bajo estas condiciones actúan catalizando la descomposición de los
sustratos complejos en compuestos asimilables. Sin embargo, los
microorganismos solo pueden producir estas enzimas a expensas del crecimiento
y metabolismo si la disponibilidad de nutrientes fácilmente asimilables es escasa
(Asmar y col., 1994; Sinsabaugh y Moorhead, 1994; Chróst, 1991; Pelletier y
Sygush, 1990; Koch, 1985; Harder y Dijkhuizen, 1983).
Sin embargo, aunque existen teorías razonables para explicar la producción
enzimática, la relación entre la producción enzimática y la adquisición de
nutrientes no han sido resueltas (Steven y Vitousek, 2005). Basada en la teoría
económica de los microorganismos (Koch, 1985), la producción enzimática puede
ser inducida sólo cuando esta permita aumentar el grado de adquisición de
recursos disponibles en el medio de crecimiento. Pero este efecto puede ser débil,
si: los sustratos nos están disponibles, los microorganismos no regularan
fuertemente la producción enzimática, o los costos enzimáticos son muy bajos
para permitir una continua producción. Es importante remarcar que la relación
entre la concentración enzimática y la degradación del sustrato es pobremente
comprendida para muchos compuestos de carbono. (Steven y Vitousek, 2005).
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_________________________________________________________ ANTECEDENTES
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II. 1.2. Enzimas extracelulares de los microorganismos.
Cada organismo produce una gran variedad de enzimas, muchas de las cuales
sólo se sintetizan en pequeñas cantidades y están implicadas en procesos
celulares. No obstante, algunas enzimas se producen en cantidades mucho más
grandes por algunos organismos y, en vez de quedarse en el interior de la célula,
se excretan al medio de cultivo. Las enzimas extracelulares son capaces de digerir
polímeros insolubles como la celulosa, las proteínas y el almidón; posteriormente,
los productos de digestión son transportados al interior de las células donde se
utilizan como nutrientes para el crecimiento (Madigan y col, 2004). De acuerdo con
Steven y Vitousek, (2005), las enzimas extracelulares son el principal medio por el
cual microorganismos como los del suelo pueden tener acceso a energía y
nutrientes, a través de degradar compuestos orgánicos complejos en moléculas
pequeñas que pueden ser asimilables (Asmar y col, 1994; Sinsabaugh y
Moorhead, 1994).
II. 2.Métodos fisicoquímicos del sabor amargo en los jugos de frutas cítricas.
La naringina (4’,5,7’-trihidroxi-flavonona 7-ramnoglucosido), flavonoide de los
cítricos, es el mayor y principal componente del amargor en jugos de uva y varias
frutas cítricas (Thomas y col, 1958; Griffith, 1969; Dunlap y col, 1962; Ono y col,
1978). Es abundante en frutas inmaduras y su concentración decrece en frutas
maduras. Su presencia ha sido la mayor limitación en la aceptación comercial de
los jugos de frutas. La concentración de naringina puede ser reducido por el
proceso tecnológico conocido como adsorción del amargor (Griffith, 1969; Jonson
y Chandler, 1988) ya sea por tratamientos químicos o físicos (Kimball, 1987;
Pritchet, 1957; Kimball, 1991; Puri, 1984; Shaw y Wilson, 1983; Wagner y col,
1991). Sin embargo, estas tecnologías tienen las siguientes limitaciones (Munish y
Uttam, 2000):
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_________________________________________________________ ANTECEDENTES
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(1) EL jugo debe ser previamente desgrasado, desencerado, despulpado y luego
remezclado con el jugo al que se le eliminó el amargor y clarificado.
(2) Las columnas de adsorción empleadas son regeneradas usualmente con
solución alcalina diluida y esto puede afectar las propiedades organolépticas y
finalmente la calidad del jugo.
(3) Los tratamientos empleados pueden alterar la composición del jugo a través de
reacciones químicas o remoción de nutrientes, sabor, color, etc.
(4) Los tratamientos no son específicos, son intrínsecamente ineficientes, y ellos
introducen en cada etapa variaciones por no monitorizar los cambios.
(5) Los métodos de extracción y terminado afectan el rendimiento, calidad, y
características de los jugos de cítricos producidos.
Otro método aplicado en la eliminación del sabor amargo en los jugos es la
hidrólisis acida de la naringina. Sin embargo, este método produce no solo
ramnosa, glucosa y naringenina sino también aglicones (terpenol, terpeno-diol, 2-
fenil etanol o bencilalcohol) los cuales también confieren un sabor amargo (Gunata
y col, 1985), por lo tanto, no es un proceso comercialmente viable. Similarmente
bajo condiciones selectas de pH y temperatura, el carbón activado puede remover
completamente la naringina de una solución; sin embargo, de manera simultánea
se remueven algunos de los componentes deseables del sabor (Munish y Uttam,
2000).
Coghlan, en el 1997, describió un proceso cromatográfico de flujo radial para la
eliminación del amargor de los jugos de frutas. En comparación con la
cromatografía convencional, el sistema de flujo radial es más rápido y operable a
baja presión (Chisti, 1999). No obstante, el uso de una resina cromatográfica es un
proceso patentado (Coghlan, 1997).
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_________________________________________________________ ANTECEDENTES
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II. 3. Método enzimático para la eliminación del amargor.
La reducción del amargor como resultado de un proceso enzimático, controla la
calidad y mejora el valor comercial del jugo de uva y el de toronja como resultado
del mantenimiento de las propiedades saludables e incrementa la aceptación por
el consumidor (Gallego y col, 2001) y precisamente el uso de enzimas para este
proceso está incrementándose rápidamente ya que disminuye la contaminación
durante el proceso (Magindag, 1989).
El componente amargo en los jugos puede ser eliminado por la naringinasa
[obteniendo ambas actividades α-L-ramnosidasa (EC.3.2.1.40) y β-D-glucosidasa
(EC.3.2.1.21)] que hidroliza a la naringina (Yusof y col, 1990) en la insípida
naringenina (C15H12O5), (4’,5,7'-trihidrxiflavonona) (Vila Real y col, 2006).
La naringinasa puede hidrolizar a la naringina por su actividad de α-L-ramnosidasa
y β-glucosidasa en dos pasos. En primer lugar, el sustrato naringina es hidrolizado
por la ramnosidasa para producir prunina. En segundo lugar la prunina es
convertida al flavonoide naringenina por medio de la β-glucosidasa (Figura 1)
(Chandler y Nicol, 1975; Habelt y Pittner, 1983).
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_________________________________________________________ ANTECEDENTES
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Figura 1. Hidrólisis de la naringina en prunina, ramnosa y naringenina por la
enzima naringinasa conteniendo actividad de α-L-ramnosidasa y β-D-glucosidasa.
(Vila Real y col, 2006)
El proceso de eliminación del amargor vía enzimática de los jugos de frutas es
limitado debido a los siguientes factores
(1) El uso de enzimas es caro para los procesos en que se emplea un alto
volumen de jugo.
(2) La limonina actúa sinergistamente con la naringina incrementando el amargor,
y el contenido de limonina no es eliminado por la naringinasa.
(3) La disponibilidad de la tecnología de resinas de intercambio iónico neutral para
el proceso de eliminación del amargor y desacidificación en jugos de uva; y
(4) La poca eficiencia de las preparaciones de naringinasa para llevar a cabo la
hidrólisis completa de la naringina (Munishy Uttam, 2000).
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_________________________________________________________ ANTECEDENTES
12
II. 4. Producción de naringinasa.
La información sobre la α-L-ramnosidasa de la naringinasa es limitada y está
relacionada con las semillas de Fagopyrum esculentum (Bourbouze y col, 1976),
las semillas de apio (Hall, 1938), las hojas de las uvas (Hall, 1938, Thomas y col,
1958, Ting, 1958), el hígado del gastrópodo marino Turbo cornutus (Kurosawa y
col, 1973), la planta patógena Corticium rolfssi (Kaji y Ichimi, 1973), el hongo
Aspergillus niger ( Manzanares y col, 1997) y Penicillium decubens ( Young y col,
1989), Cochiobolus miyabeanus (Ito y Takiguchi, 1970), Rhizotonia solana (Ito y
Takiguchi, 1970), Phanopsis citri (Ito y Takiguchi, 1970), Rhizopus nigricans
(Shanmugam y Yadav, 1995) y la preparación comercial de “Naringinasa” (Roitner
y col, 1984b). Por razones de viabilidad, solo los procesos basados en
naringinasas microbianas son viables (Munish y Uttam, 2000). Tal es el caso de
Aspergillus niger quien es considerado como el mejor productor de naringinasa
extracelular (Kishi, 1955) y Aspergillus terreus quien es bien conocido como un
hongo productor eficiente de enzimas extracelulares de interés para la industria de
alimentos (Gallego y col, 1996). Por lo que se ha propuesto que el proceso de
eliminación del amargor puede ser más rentable si la producción industrial de la
naringinasa es a través del uso de microorganismos (Munish y Uttam, 2000). De
tal manera que
II. 4.1. Características del género Aspergillus.
El género Aspergillus fue descrito por primera vez por P. A. Micheli (1729)
(Madigan y col, 2004), que lo denominó con este nombre por su parecido con un
"aspergillum" (instrumento religioso utilizado para dispersar el agua bendita).
Las especies del género Aspergillus se encuentran ampliamente distribuidas en la
naturaleza pudiéndose aislar de una gran variedad de substratos. Gracias a la
facilidad de dispersión de sus conidios y a su pequeño tamaño, éstos pueden
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_________________________________________________________ ANTECEDENTES
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permanecer en suspensión en el ambiente durante un largo periodo, por lo que el
hombre se encuentra expuesto constantemente a su inhalación.
El Aspergillus es un hongo filamentoso del grupo Deuteromycetes u Hongos
imperfectos, su aspecto microscópico es típico y se caracteriza por unas
estructuras esporíferas o reproductoras llamadas cabezas conidiales (Fig.2 y 3).
Estas cabezas están compuestas por una vesícula rodeada por una corona de
fiálides en forma de botella, en cuyo extremo se forman cadenetas de esporas.
Se conocen unas 900 especies del género Aspergillus. Rapper y Fennell los
clasifican en 18 grupos, basándose en su aspecto macroscópico y en las
características morfológicas de los conidióforos y fiálides.
Figura 2. Aspergillus niger. Figura 3. Aspergillus terreus.
Conidióforo. (Abarca, 2000) Conidióforo. (Abarca 2000)
II. 5. Factores que influyen en la producción de naringinasa.
En cuanto a la producción de la naringinasa tanto para A. niger , A. terreus y otras
especies de este género los iones metálicos como Ca2+
, Mg2+
favorecen la
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producción de dicha enzima, sin embargo, no son indispensables, (Munish y col,
2005; Gallego y col, 2001) también dicha enzima es reprimida por la presencia de
glucosa (Bram y Salomons, 1965), lactato, citrato, sacarosa , fructosa y almidón
(Munish y Uttam, 2000) así como también por Cd2+, Cu2+, Co2+, Fe2+,Hg2+, Mn2+,
Ni2+ tomando en cuenta que además Mn2+ y Fe2 inhiben el crecimiento del hongo.
Por otra parte la producción de la enzima disminuye abajo de pH 4 y es estimulada
en presencia de los sustratos naringina, ramnosa, melaza (Munish y col, 2005;
Gallego y col, 2001) y licor de maíz (Munish y Uttam, 2000). Es importante resaltar
que la producción de la naringinasa es dependiente del inductor. También se ha
reportado que la adición continua de pequeñas cantidades de naringina en un
cultivo por lote alimentado en un fermentador podría estimular una mayor
producción de la naringinasa que cuando se adiciona una alta cantidad de sustrato
al inicio de la fermentación (cultivo por lotes) (Bram y Salomons, 1965; Gallego y
col, 2001).
II. 6. Otras aplicaciones de la naringinasa.
La naringinasa ha sido empleada para la eliminación de cristales de hesperidín de
los jugos de naranja (Tereda y col, 1995), es utilizada en los procesos de jugo de
uva y naranja para el mejoramiento de lavado de la pulpa, incremento de la
recuperación y el rendimiento de aceites esenciales, para el proceso de
clarificación (Grassin y Fauquembergue, 1996), el mejoramiento del aroma del
vino (Caldini y col, 1994) y para preparaciones enzimáticas de productos
hidrolizados de glucósidos naturales (Roitnel y col, 1984b; Ellenrieder y col, 1998)
de importancia biotecnológica como: preparación de prunita (4’ -5,7’–
trihidroxiflavonona-7-glucosido) flavonoide utilizado como agente endulzante para
diabéticos (Roitner y col, 1984ª), y preparación de naringenina (Vila Real y col,
2006). Recientemente, el interés en la enzima α-L-ramnosidasa ha sido enfocado
principalmente en su acción dirigida hacia los terpenilglicosidos para el desarrollo
del aroma en los jugos de uva y bebidas derivadas (Williams y col, 1982).
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_________________________________________________________ ANTECEDENTES
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Por otra parte, la naringinasa también tiene aplicaciones en la industria
farmacéutica como son: la preparación del antibiótico Cloropolysporin C (Sankyo,
1988), aplicación en transformaciones esteroidales (Munish y Uttam, 2000), en el
estudio de la estructura de plantas y polisacáridos de bacterias (Michon, 1987),
preparación de ramnosa como intermediario en síntesis orgánicas, utilizado como
farmacéutico y agente protector de plantas (Daniela y col, 1990) y preparación de
prunina, flavonoide con actividad antiinflamatoria (Roitner y col, 1984b).
II. 7. Actividad enzimática y constantes de Km y Vmáx reportadas para la
naringinasa.
Es importante tomar en cuenta que el grado de actividad de α-L-ramnosidasa y β-
D-glucosidasa varia con la concentración de proteína y el pH (Munish y Uttam,
2000). Además, cada microorganismo puede producir diferentes formas activas de
una enzima y estas se producen en diferente cantidad dependiendo de la fuente
de carbono.
La actividad que presenta la α-ramnosidasa de la naringinasa de A. niger
producida utilizando naringina como fuente de carbono, encontrada por
Manzanares y col, (1997) es de 0.059 μmol de ramnosa/min y presenta una Vmáx=
20.6 U/mg y una Km= 2.9 mM. Esta actividad es dependiente del pH en el intervalo
de 3 a 5 y presenta su máximo de actividad a un pH=4.5 a 30°C en regulador
MacIIvaine, utilizando como sustrato p-nitrofenol. Mutter y col, (1994) determinaron
una Vmáx= 13.0 U/mg para la α-L-ramnosidasa de A. aculeatus; Por otro lado
cuando Munish y col en el 2005, utilizaron ramnosa como fuente de carbono y
reportaron una actividad de 0.399 μIU/ml (IU=cantidad de enzima necesaria para
liberar 1μmol naringina/min, utilizando regulador de acetato de sodio 0.1M, pH= 4,
T=30°C) para la naringinasa de A. niger MTCC 1344. Cuando se utilizó licor de
maíz y extracto de malta Bram y Solomons, (1965) encontraron una actividad de
94 U/ml y de 90U/ml para las naringinasas de de la cepa NRRL 72-4 (U=cantidad
de enzima necesaria para hidrolizar 1μmol naringina/min, utilizando regulador de
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_________________________________________________________ ANTECEDENTES
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citratos sin molaridad especifica, pH=4, T=45°C). Por su parte, Caldini y col,
(1994) determinaron una Km= 2.32 mM y Kurosawa y col, (1973) determinaron una
Km= 2.65 mM para la α-L- ramnosidasa de A. niger utilizando p-nitrofenol, el cual
es un sustrato inespecífico.
Elinbaum y col, (2002) reportaron una actividad de 1.7 U/ml de solución nutritiva
(U=cantidad de enzima necesaria para liberar 1μmol p-nitrofenol/min, en regulador
de ácido. succínico /succinato de sodio 50mM, pH=5.5, T= 30°C, para la α-L-
ramnosidasa de A. terreus, producida utilizando bagazo de caña de azúcar como
fuente de carbono. Por otro lado Gallego y col, (2001) encontraron una actividad
de 91U/mg proteína para la misma enzima producida por A. terreus (U= cantidad
de enzima necesaria para liberar 1μmol p-nitrofenol/min), determinada en
regulador de succinato 50 mM, pH= 5.5, T=50°C, utilizando ramnosa como fuente
de carbono y una Vmáx= 84 μmol/mg∙min y una Km= 0.17 mM (Michaelis)
En otras especies como Penicillium. decumbens se ha informado una actividad
para la naringinasa de 0.465U/g sólido determinada utilizando regulador de
acetato de amonio 0.1 M, pH= 4, T=40°C; dicha naringinasa fue obtenida por
fermentación solida y presenta una Km= 1.22 mM y Vmáx= 0.45 μmol/min
(Lineweaberburk) (Gülten y col, 2006). Por su parte, Romero y col, (1985)
determinaron una Km= 1.52 mM y una Vmáx= 10.7 U /mg para la α-L-ramnosidasa
de Penicillium sp. Ting (1979) informó que la naringina presente en jugo de toronja
puede ser hidrolizada a partir de una preparación comercial de pectinasas,
mediante la cual se hidroliza la naringina en naringenina in vitro, cuando esta se
emplea en una concentración del 0.02% en regulador de citratos 0.005 mM a pH 4
y se somete a un tiempo de hidrólisis de 2hrs a 50°C, utilizando como patrón una
solución de naringina (Eastman Kodak ) en concentración de 50 mg/ 100ml y
obteniendo un 68% de hidrólisis; la hidrólisis fue determinada por el método de
Davis (1947).
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_________________________________________________________ ANTECEDENTES
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II. 8. Métodos para determinar la actividad enzimática de la naringinasa.
Para la determinación de la actividad enzimática de la naringinasa hay pocos
procedimientos disponibles. Estos procedimientos están basados en la
determinación de flavonoides por medio de espectrofotometría de acuerdo al
método de Davis (1947) mediante el uso de dietilen glicol (Munish y Uttam, 2000).
La naringina reacciona con el reactivo para producir un color amarillo el cual es
medido a una longitud de onda de 420 nm. También se puede realizar esta
determinación mediante HPLC (Horuichi y col, 1985). El método de HPLC
determina la actividad de la enzima mediante la medida de los cambios en la
concentración de α-ramnosa. Romero y col, (1985) usaron p-nitrofenil-L-
ramnopiranosido para medir la actividad de la L-ramnosidasa de la naringinasa,
siguiendo colorimétricamente la aparición de p-nitrofenol (Munish y Uttam, 2000).
El ensayo de Davis es un método colorimétrico en el que se emplea dietilen glicol
alcalino para la determinación de ramnoglicosidos de naringina y otros
flavonoides que pueden estar presentes particularmente en la toronja y otras frutas
cítricas. A pesar de que el método de Davis no es especifico para la naringina, es
un método practico y rápido que es particularmente aplicado para la determinación
de naringina en jugo y en el flavedo de la toronja, para determinar la distribución
de falvononas en varios tejidos de frutas cítricas, para determinar la recuperación
de naringina pura adicionada a varias mezclas, para el seguimiento de la hidrólisis
de la naringina y para la determinación de la hesperidina en otras frutas cítricas.
La desventaja del método de Davis consiste en que si se encuentran compuestos
como el citral, furfural, geraniol y ácido ascórbico producen color cuando se
combinan con el dietilen glicol alcalino y muchas de las sustancias provenientes
de plantas dan colores amarillos cuando se mezclan con un álcali, lo cual ocasiona
interferencias (Davis, 1947).
Chaplin y Kennedy, (1968) informaron que, se puede utilizar un ensayo indirecto
para la determinación de la actividad de cualquier enzima que como producto de la
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_________________________________________________________ ANTECEDENTES
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hidrolisis de su sustrato genere algún azúcar reductor como por ejemplo la glucosa
o la fructosa. Dicho ensayo indirecto consiste en una determinación
espectrofotométrica, tras la conversión del azúcar reductor producido en un
derivado coloreado, mediante el método del ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS), el
cual se basa en la reducción del DNS (color amarillo) por la glucosa u otro azúcar
reductor al ácido 3-amino-5-nitrosalicílico (color rojo ladrillo) (Figura 4), cuya
presencia puede detectarse por lectura de la absorbancia en la zona de 540-570
nm. La velocidad de la reacción se determina analizando la cantidad de azúcares
reductores formados por unidad de tiempo y la actividad enzimática se expresa
como actividad específica.
OH
OH
NNO
O
O
OH
OH
NH2
NO
O
CHO
OH
OH
OH
OH
CH2OH
O
O
OOH
OH
OH
OH
CH2OH
COOH
+ +
ácido D-glucónicoácido 3-5-dinitrosalicílico
(amarillo)
D-glucosa ácido 3-amino-5-nitrosalicílico
(rojo)
Figura 4. Reducción del ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS), (color amarillo) por la
glucosa u otro azúcar reductor al ácido 3-amino-5-nitrosalicílico (color rojo ladrillo)
(Chaplin y Kennedy, 1968).
II. 8.1 Modelos gráficos para la determinación de la actividad enzimática.
Existen diferentes modelos gráficos para determinar la actividad enzimática como
son el modelo de Michael-Menten, el modelo de la doble reciproca de Lineweaber-
Burk, el modelo de Eadie-Hofsteen, el modelo de Agustinson y el modelo
estadístico de Wilkinson; estos modelos permiten seguir el curso de los
mecanismos catalíticos de las enzimas a través de determinaciones cinéticas de
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_________________________________________________________ ANTECEDENTES
19
las reacciones catalizadas enzimáticamente, que se expresan mediante dichos
modelos gráficos (Madigan y col, 2004).
II. 8.1.1 Modelo de Michaelis-Menten.
Leonor Michaelis y Maude Menten desarrollaron en 1913 una teoría general
acerca de la acción y cinética de las enzimas. Esta teoría, que es fundamental
para el análisis cuantitativo de todos los aspectos de la cinética de las enzimas y
de la inhibición, se ha desarrollado plenamente para el caso de una reacción en la
que sólo hay un sustrato. Dicha teoría es aplicable cuando la concentración del
sustrato es mayor que la concentración de la enzima, y cuando las condiciones
son de estado estacionario, o sea que la concentración del complejo enzima-
sustrato es constante (Voet y Voet, 2006; Madigan y col, 2004; Lehninger, 1990).
La teoría de Michaelis-Menten supone que la enzima E se combina en primer
lugar con el sustrato S para formar el complejo enzima-sustrato ES (Reacción 1); a
continuación este último se escinde en una segunda etapa para formar una
enzima libre y un producto P (Reacción 2) (Madigan y col, 2004):
K+1
E+S ES (1)
K-1
K+2
ES E+P (2)
K-2
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_________________________________________________________ ANTECEDENTES
20
Las Reacciones 1 y 2 son reversibles; las constantes de velocidad para las
reacciones directa e inversa poseen un subíndice positivo y otro negativo,
respectivamente (Lehninger, 1990).
II 8.1.1.1 Determinación de las contantes de Michaelis –Menten.
Michaelis-Menten dedujeron la ecuación de la velocidad para una reacción de un
solo sustrato catalizada enzimáticamente (Ecuación 1); esta ecuación expresa la
relación matemática entre la velocidad inicial de una reacción catalizada por una
enzima (V0), la concentración del sustrato [S] y ciertas características de la
enzima. A demás esta ecuación relaciona la velocidad inicial, la velocidad máxima
(Vmáx) y la concentración inicial del sustrato a través de la constante de Michaelis-
Menten (Km) que expresa la afinidad de la enzima por el sustrato. En el término
Vmáx se encuentra contenida la concentración de la enzima (Lehninger, 1990).
V0= Vmáx [S]
Km + [S]
Ecuación 1.Ecuación de Michaelis-Menten de la velocidad de reacción
(Lehninger, 1990).
De la ecuación de Michaelis-Menten se deriva una relación numérica importante
en el caso especial en que la velocidad inicial de la reacción sea exactamente la
mitad de la velocidad máxima y a partir de la cual se puede calcular la velocidad
máxima de la reacción (Ecuación 2) (Figura 5).
7/21/2019 EFECTO FUENTE CARBONO
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_________________________________________________________ ANTECEDENTES
21
V0 = ½ Vmáx
Ecuación 2. Relación numérica entre la velocidad de reacción y la velocidad
máxima, derivada de la ecuación de Michaelis-Menten (Lehninger, 1990).
Figura 5. Representación gráfica de la velocidad de reacción y constantes de V máx
y Km de Michaelis-Menten (Lehninger, 1990).
A concentraciones de sustrato muy bajas la velocidad inicial (V0) es casi
proporcional a la concentración del sustrato [S]. A concentraciones de sustrato
muy elevadas la velocidad de la reacción se aproxima asintóticamente a la Vmáx
(Lehninger, 1990).
Al sustituir la ecuación 2 en la ecuación 1 y dividir por Vmáx se obtiene la Ecuación
3, mediante la cual se puede calcular la constante de Michaelis-Menten Km. Por
tanto, la contante de Michnaelis-Menten Km es igual a la concentración de sustrato
en la que la velocidad inicial de la reacción es la mitad de la velocidad máxima
(Figura 2).
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_________________________________________________________ ANTECEDENTES
22
Km= [S]
Ecuación 3.Ecuación de la constante de Michaelis-Menten (Lehninger, 1990).
Las dimensiones de Km para una reacción de un solo sustrato son moles por litro y
la constante es independiente de la concentración de la enzima. Puede obtenerse
con facilidad una aproximación al valor de Km a partir de una serie de
experimentos en los que la velocidad inicial de la reacción se mide a diferentes
concentraciones iniciales de sustrato con una concentración de enzima constante.
El valor aproximado de Km se obtiene gráficamente al representar la velocidad
inicial frente a la concentración inicial del sustrato (Figura 5); se obtiene una
hipérbola rectangular. La Km expresa la afinidad del complejo enzima-sustrato
(ES). Valores bajos indican que el complejo ES está unido muy fuertemente y
raramente se disocia. Por tanto se obtendrá una Km según el sustrato específico
en que actúe cada enzima y las condiciones de reacción en que se realice las
mediciones (Lehninger, 1990).
La gráfica de velocidad de Michaelis-Menten mostrada anteriormente (Figura 5) no
es lineal. Aunque a bajas concentraciones de sustrato se mantenga lineal, se va
curvando a medida que aumenta la concentración de sustrato. Antes de la llegada
de los métodos, que permiten ajustar regresiones no lineales de forma sencilla,
podía llegar a ser realmente difícil estimar los valores de la Km y la Vmáx en las
gráficas no lineales. Esto dio lugar a que varios investigadores concentraran sus
esfuerzos en desarrollar linearizaciones de la ecuación de Michaelis-Menten,
dando como resultado la gráfica de Lineweaver-Burke y el diagrama de Eadie-
Hofstee.
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_________________________________________________________ ANTECEDENTES
23
II 8.1.2. Modelo de Lineweaber-Burk.
La ecuación de Michaelis-Menten (Ecuación 1) puede transformarse
algebraicamente en otras formas que son más útiles para la expresión de los
datos experimentales. Una de las transformaciones se obtiene tomando los dobles
recíprocos de ambos miembros de la ecuación de Michaelis- Menten (Ecuación 4)
1 = Km + [S]
V0 Vmáx [S]
Ecuación 4.Ecuación de la doble reciproca de la ecuación de Michaelis-Menten
de la velocidad de reacción (Lehninger, 1990).
Redondeando y reduciendo la Ecuación 4 se obtiene la ecuación de Lineweaver-
Burk (Ecuación 5).
1 = Km 1_ + 1 _
V0 Vmáx [S] Vmáx
Ecuación 5.Ecuación de Lineweaver-Burk de la velocidad de reacción
(Lehninger, 1990).
II 8.1.2.1Determinación de las contantes de Lineweaber-Burk.
La representación gráfica de Lineweaver-Burk permite identificar la Km y Vmáx; el
punto de corte con el eje de ordenadas es el equivalente a la inversa de Vmáx, y el
de abscisas es el valor de -1/Km (Figura 6). Tal representación doble-recíproca
tiene la ventaja de que permite una determinación mucho más exacta del valor de
Vmáx ya que la representación sencilla de V0 frente a [S] en la curva de Michaelis-
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_________________________________________________________ ANTECEDENTES
24
Menten sólo se obtiene su valor aproximado puesto que es un valor límite a una
concentración del sustrato infinita.
Figura 6. Representación gráfica de la doble recíproca de la velocidad de reacción
y constantes de Vmáx y Km para Lineweaberburk (Lehninger, 1990).
El diagrama de Lineweaver-Burk (Figura 6) se emplea como herramienta gráfica
para calcular los parámetros cinéticos de una enzima, a demás puede
proporcionar también información valiosa acerca de la inhibición enzimática.
II 8.1.3. Modelo de Eadie-Hofsteen.
Otra transformación útil de la ecuación de Michaelis-Menten se obtiene
multiplicando ambos miembros de la ecuación de lineweaber-Burk (Ecuación 5)
por Vmáx y reordenándola se obtiene la ecuación de Eadie-Hofsteen.
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_________________________________________________________ ANTECEDENTES
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V0 = -Km V0 + Vmáx
[S]
Ecuación 6.Ecuación de Eadie-Hofsteen de la velocidad de reacción
(Lehninger, 1990).
II 8.1.3.1. Determinación de contantes de Eadie-Hofsteen.
La representación de V0 frente a V0/ [S] se conoce como la representación de
Eadie-Hofsteen (Figura 7). Donde V0 representa la velocidad de la reacción, Km es
la constante de Michaelis-Menten, [S] es la concentración del sustrato y Vmáx, es el
máximo de la velocidad de la reacción.
Figura 7. Representación gráfica de la velocidad de reacción y constantes de
Vmáx y Km de Eadie-Hofsteen (Lehninger, 1990).
El diagrama Eadie-Hofstee permite visualizar rápidamente los parámetros
cinéticos importantes como Km y Vmáx a la vez que está menos afectada por el
margen de error que el diagrama de Lineweaver-Burke, debido a que asigna el
mismo peso a todos los puntos para cualquier rango de concentración del sustrato
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_________________________________________________________ ANTECEDENTES
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o de la velocidad de reacción. Una de las consecuencias de la aproximación de
Eadie-Hofstee es que tanto la variable en la ordenada como en la abscisa no son
independientes, sino que dependen de la velocidad de la reacción. De éste modo,
cualquier error experimental se encuentra presente en ambos ejes (Lehninger,
1990).
II 8.1.4. Modelo de Agustinson.
La representación de [S]/V0 frente a [S] (Figura 8) se conoce como la
representación de Agustinson (Figura 6). Donde V0 representa la velocidad de la
reacción, Km es la constante de Michaelis-Menten, [S] es la concentración del
sustrato y Vmáx, es el máximo de la velocidad de la reacción. La ecuación 7
muestra la expresión matemática empleada en este modelo para la determinación
de las constantes cinéticas de Vmáx y Km.
[S] = 1 [S] + Km
V Vmáx Vmáx
Ecuación 7.Ecuación de Agustinson de la velocidad de reacción
(Lehninger, 1990).
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_________________________________________________________ ANTECEDENTES
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Figura 8. Representación gráfica de la velocidad de reacción y constantes de Vmáx
y Km de Agustinson (Lehninger, 1990).
II 8.1.5 Modelo de Wilkinson.
La estimación de los parámetros cinéticos Vmáx y Km por el método de Michaelis-
Menten y por otros métodos como el de la doble reciproca de Lineweaver-Burk no
emplean cálculos estadísticos. Los métodos gráficos frecuentemente no proveen
ninguna medida de precisión de la determinación, lo que es necesario para una
evaluación adecuada de los resultados en relación a consideraciones teórica o
para la comparación de los resultados obtenidos bajo diferentes condiciones
experimentales.
El modelo de Wilkinson, a diferencia de los otros modelos, emplea herramientas
estadísticas para la estimación de los parámetros cinéticos de Vmáx y Km. El
principal propósito de este modelo es suministrar estimaciones más exactas y
precisas de la Vmáx y la Km mediante cálculos matemáticos y haciendo uso de las
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_________________________________________________________ ANTECEDENTES
28
herramientas estadísticas como la desviación estándar y del error estándar
(Wilkinson, 1960).
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____________________________________________________________ JUSTIFICACIÓN
29
JUSTIFICACIÓN
El uso de naringinasa para la disminución del amargor de los jugos de frutas
cítricas es un proceso que ofrece numerosas ventajas, comparado con los
métodos fisicoquímicos que antiguamente se empleaban; y este proceso es más
rentable si se utiliza naringinasa de origen microbiano, especialmente de hongos
filamentosos del genero Aspergillus. Es un nicho que necesita ser explorado ya
que no existe suficiente información sobre los detalles en el proceso de obtención
de esta enzima. Mucha de la información está patentada o existe como secreto
industrial.
Además, es menester decir que las enzimas de origen microbiano que existenactualmente en el mercado presentan una eficacia muy deficiente de la hidrólisis
de la naringina, por lo que es necesario hacer más estudios con hongos del
género Aspergillus con la finalidad de evaluar la capacidad de producción de
naringinasa por la cepa empleada, comparar la producción de naringinasa
utilizando diferentes fuentes de carbono y factores que se ha informado que en
ciertas cepas favorecen su producción, comparar la actividad de la naringinasa
producida contra la actividad de una naringinasa comercial y contribuir en la
generación del conocimiento que conlleve al mejoramiento del desarrollo
tecnológico.
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________________________________________________________________ OJETIVOS
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OBJETIVOS
Objetivo general
Estudiar el efecto de diferentes fuentes de carbono y las sales de calcio y
magnesio en la producción de naringinasa por medio de Aspergillus niger ATCC
1015.
Objetivos particulares:
Evaluar mediante una prueba presuntiva si la cepa de Aspergillus niger
empleada tiene la capacidad de producir naringinasa.
Estudiar el efecto de la fuente de carbono (ramnosa, naringina y melaza en
la producción de naringinasa por Aspergillus niger
Determinar el efecto de sales de CaCO3 y MgCO3 en el crecimiento del
microorganismo, la producción de naringinasa y la producción de proteína
durante la fermentación.
Cuantificar la actividad enzimática de la naringinasa sobre la hidrólisis de la
narigina in vitro mediante la determinación de los productos de la hidrólisis
de esta por el método del DNS.
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___________________________________________________ MATERIALES Y MÉTODOS
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III. MATERIALES Y MÉTODOS
III.1 Desarrollo experimental.
Figura 9. Diagrama de proceso para la producción de naringinasa, proteína y
determinación de la actividad enzimática de naringinasa producida por A. niger
ATCC1015 utilizando diferentes fuentes de carbono.
Preparación del inóculo
FermentaciónCrecimiento del microorganismo en diferentes sustratos
RamnosaNaringina Melaza
Identificación dela enzima
Proteína
Método Bradford
Determinación de la
Vmáx, Km
Prueba preliminar de la capacidad productorade naringinasa por la cepa
CaCO3 y/oMgCO3
Actividad
enzimática
Aspergillus niger ATCC 1015
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___________________________________________________ MATERIALES Y MÉTODOS
32
III.2 Materias primas.
1. Naringinasa de Penicillium decumbens (Sigma)
2. Naringina (Sigma)
3. Ramnosa (BDDIFCO)4. Melaza (Ingenio San Miguelito, Córdoba, Ver.)
5. Glucosa (Sigma)
6. Medio de cultivo Agar Saboraud (BDDIFCO)
7. Extracto de malta (BDDIFCO)
Microorganismo
Aspergillus niger ATCC 1015 obtenido de Colección Nacional de Cepas
Microbianas y Cultivos Celulares del Centro de Investigación y de Estudios
Avanzados (CINVESTAV) y mantenidas a 5ºC en agar papa dextrosa. Este
microorganismo esta reportado como productor de ácido cítrico y antígenos
(CDBB: 177).
III.3 Material de laboratorio y reactivos.
Ácido ortofosfórico (Baker), acido 3,5-dns (Baker), agujas de jeringa (plastipack),agua destilada-desionizada, agar maltosa de sabouraud (BDDIFCO), albúmina
sérica bobina (bsa), azul de comassie-g (Baker), cajas petri, cloroformo.
III.4 Equipo.
Balanza analítica (Ohaus, Explorer® Po), baño metabólico (Shaker, G25), baño
maría (BM), centrifuga ALC4239R, espectrofotómetro visible-UV (TermoSpectronic, Genesys 20), fotocolorímetro (Klett- Summerson), horno (American),
autoclave, parrilla de calentamiento (Termolyne, HP-A1915B), vortex (Daigger,
Vortex Genie 2).
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___________________________________________________ MATERIALES Y MÉTODOS
33
III.5 Métodos.
III.5.1 Evaluación preliminar de la capacidad productora de naringinasa de la cepa
Aspergillus niger ATCC 1015 por medio de cromatografía en capa fina.
Para conocer si la cepa empleada tenía la capacidad de producir naringinasa, se
utilizaron muestras de jugo de dos lotes de naranjas verdes, un lote sin inocular y
otro inoculado por picadura con Aspergillus niger ATCC 1015, con la finalidad de
evaluar la presencia de naringina en el jugo y la hidrolisis de esta por medio de la
enzima producida por el microorganismo inoculado.
Las muestras de jugo de cada lote fueron tomadas cada 24h y en el caso del lote
de naranjas inoculadas las muestras fueron tomadas del punto de inoculación
debido a que el microorganismo no alcanza a colonizar toda la naranja en 24h. El
lote sin inocular sirvió como control para determinar que, la hidrólisis de la
naringina no fuera efecto de la maduración de la naranja.
Para dar seguimiento a la presencia o ausencia de naringina se utilizó la técnica
de cromatografía en capa fina, para lo cual se cortaron placas cromatográficas de
5 x 2 cm de largo y ancho respectivamente, a las que, se les aplicó una gota de la
muestra problema (naringina pura o jugo de naranja) a una distancia de 0.5 cm del
inicio de la placa cromatográfica (punto de aplicación). Cada placa cromatográfica
con la muestra previamente aplicada, se introdujo en una cámara de vidrio que
contenía 2 mL de disolvente aproximadamente. La muestra aplicada en la placa
ascendió por capilaridad utilizando diferentes disolventes.
Después de que la muestra ascendió por capilaridad y el disolvente recorrió una
distancia de hasta 0.5 cm antes del final de la placa cromatográfica, se sacó la
placa de la cámara de vidrio y se dejó evaporar al ambiente el disolvente que ésta
había absorbido.
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___________________________________________________ MATERIALES Y MÉTODOS
34
Para observar la distancia recorrida por las muestras a lo largo de la placa, se
utilizó una lámpara de luz ultravioleta de longitud corta (253 nm) y una de longitud
larga (350 nm), las manchas observadas fueron marcadas con lápiz.
Posteriormente se le aplicó con ayuda de un algodón y unas pinzas sulfato séricoamoniacal que sirvió como revelador cuando se sometió la placa con el sulfato
sérico amoniacal a calentamiento mediante de una parrilla por 1 min
aproximadamente. El experimento se realizó por triplicado.
III.5.1.1 Determinación del mejor disolvente que permite la ascendencia por
capilaridad de la naringina pura y la naringina presente en el jugo de naranja en
cromatografía en capa fina.
En primer lugar se empleó una muestra de naringina pura (N) que se empleó
como patrón de comparación en una concentración de 50 mg/1000ml, para poder
hacer los experimentos que permitieran conocer si la cepa empleada tenía
capacidad de producir naringinasa. Por ello se evaluaron las mezclas de
disolventes presentes el Cuadro 1.
La elección del disolvente que permitió la mejor elución de la naringina en
cromatografía en capa fina se realizó en base a los Rf (factor de elución de un
compuesto en una placa cromatográfica) calculados para cada placa
cromatográfica, es decir para cada muestra de naringina eluída utilizando
diferentes disolventes.
El Rf expresa la posición de un compuesto sobre la placa cromatográfica comouna fracción decimal; el máximo Rf es 1 y a mayor Rf mejor factor de elución. El Rf
fue calculado dividiendo la distancia que recorrió la muestra en la placa
cromatográfica entre la distancia que recorrió el disolvente.
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___________________________________________________ MATERIALES Y MÉTODOS
35
Cuadro 1. Disolventes utilizados para determinar el factor de elución de una
muestra de naringina pura en cromatografía en capa fina.
Disolvente / Concentración %
hexano / 100
acetato / 100
hexano: acetato de etilo / 80:20
acetato de etilo: hexano / 80:20
metanol: acetato de etilo / 80:20
metanol / 100.
acetona / 100
metanol: acetona / 95:5
metanol: acetona / 90:10
metanol: acetona / 80:20
Además se utilizaron diferentes disolvente o mezcla de disolventes para conocer
la elución de la naringina presente en el jugo de naranja (n) en una placa
cromatográfica las cuales se muestran en el Cuadro 2.
Cuadro 2. Disolventes y proporción utilizados para determinar el factor de elución
de la naringina presente en el jugo de naranja.
Disolvente / Concentración %
metanol / 100
acetona / 100metanol: acetona / 95:5
metanol: acetona / 90:10
metanol: acetona / 80:20
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___________________________________________________ MATERIALES Y MÉTODOS
36
Se buscó el mejor sistema de elución tanto para la naringina pura (N) como para la
naringina presente en el jugo de naranja (n). Para ello se evaluaron las mezclas de
disolventes presentes en el Cuadro 3.
Cuadro 3. Disolventes y proporción utilizados para determinar el factor de elución
de la naringina pura y de la naringina presente en el jugo de naranja en una misma
placa cromatográfica.
III.5.2 Recuperación de la cepa de A. niger a partir de un cultivo en tubo inclinado.
La cepa Aspergillus niger ATCC 1015 (obtenida del cepario del Cinvestav) se
adquirió en tubos de ensaye en agar papa dextrosa, por lo que fue resembrada
para obtener una cantidad suficiente para que pudiera emplearse en las
fermentaciones a realizar (Díaz y col, 1998).
III.5.3 Preparación del inóculo de A. niger por medio de turbidimetria.
Para la obtención del inóculo a emplear en cada fermentación se preparó para
cada ensayo y en el momento del inicio de la fermentación una solución que
contenía 900 x 106 esporas/ mL por medio de turbidimetria utilizando una escala
Disolvente / Concentración %
metanol / 100metanol: acetona / 80:20
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___________________________________________________ MATERIALES Y MÉTODOS
37
de MacFarland previamente preparada como se muestra en el Cuadro 4 (Díaz y
col, 1998).
Cuadro 4. Escala Macfarland empleada para calcular el inoculo empleado en cada
fermentación.
El renglón sombreado indica la cantidad de inóculo empleado.
III.5.4 Fermentaciones para la producción de naringinasa por medio de A. niger
utilizando como base un caldo nutritivo.
Se utilizó Aspergillus niger ATCC 1015 en una concentración 900 x 106
esporas/mL. Se preparó un caldo nutritivo con la composición que se observa en
el Cuadro 5 (Munish y col, 2005; Bram y Solomons, 1965).
Clave del tubo BaCl 1%
mL
H2SO4 1%
mL
No. aproximado de
microorganismos x
106 /mL
1 0.1 9.9 300
2 0.2 9.8 600
3 0.3 9.7 900
4 0.4 9.6 1200
5 0.5 9.5 1500
6 0.6 9.4 1800
7 0.7 9.3 2100
8 0.8 9.2 2400
9 0.9 9.1 2700
10 1.0 9.0 3000
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___________________________________________________ MATERIALES Y MÉTODOS
38
Cuadro 5. Composición del caldo nutritivo empleado en cada fermentación y al
cual se le adicionó la fuente de carbono y/o las sales de calcio y magnesio.
Las muestras que se prepararon con caldo nutritivo para conocer el efecto de la
fuente de carbono y de las sales CaCO3 y MgCO3 se muestran en el Cuadro 6.
Cada fermentación se realizó por duplicado en matraces de 1L los cuales fueron
incubados por un periodo de 8 días a 30°C, con agitación de 54 ciclos por min.
Caldo nutritivo
sustancia proporción
NaNO3 2.0 g/l
KH2PO4 1.0 g/l
KCl 0.5 g/l
MgSO4·7H2O 0.5 g/l
FeCl3 0.1 g/l
Extracto de malta 1% p/v
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___________________________________________________ MATERIALES Y MÉTODOS
39
Cuadro 6. Caldos nutritivos evaluados en el crecimiento del microorganismo y
producción de naringinasa por A. niger .
III.5.6 Crecimiento del microorganismo utilizando diferentes fuentes de carbono.
Se tomó una alícuota de 20 mL cada día que duró la fermentación, esta fue filtrada
en papel filtro de poro de 1mm y se secó a 80ºC por 10 min aproximadamente, así
se cuantificó el peso del micelio por diferencia (Bucio Villalobos y col, 2007).
Fuente de
carbono
Proporción
fuente decarbono %
CaCO3
proporción 0.01 mM
MgCO3
proporción 0.01mM
naringina 0.5 --- ---
naringina 0.5 0.01 ---
naringina 0.5 --- 0.01
naringina 0.5 0.01 0.01
melaza 0.5 --- ---
melaza 0.5 0.01 ---
melaza 0.5 --- 0.01
melaza 0.5 0.01 0.01
ramnosa 0.5 --- ---
ramnosa 0.5 0.01 ---
ramnosa 0.5 --- 0.01
ramnosa 0.5 0.01 0.01
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III.6 MÉTODOS ANALÍTICOS.
III.6.1 Determinación de proteína en el medio de cultivo.
Para la determinación de la proteína en el medio de cultivo se utilizó el método deBradford, el cual es un método rápido y sensible para la cuantificación de micro
cantidades de proteína utilizando el principio de formación de color por unión a la
proteína (Bradford, 1976; Kirk y col, 2004).
El método de Bradford involucra la unión no covalente de la proteína al reactivo
Azul brillante de Coomasie G-250 ya que este interacciona con los grupos básicos
y aromáticos de las proteínas. Este colorante absorbe a una longitud de onda de
365 sin embargo la unión de la proteína al colorante causa un cambio en el
máximo de absorción del colorante de 365 a 595nm absorbancia a la que se
realiza la determinación (Bradford, 1976).
III.6.1.1 Preparación del reactivo de Bradford.
Se disuelven 100 mg de azul de Comassie en 50 mL de etanol al 96 %, despuésse añaden 100 mL de ácido fosfórico 85 %.Se diluye con 1000 mL de H2O
destilada y se deja reposar 24 h en oscuridad, se filtra dos veces con papel filtro y
se conserva en una botella oscura.
III.6.1.2 Patrón de albúmina sérica bobina (ASB).
Se realiza una curva de ASB de acuerdo con el Cuadro 7. Agitando perfectamente
y después de incubar por 10 minutos a temperatura ambiente. Cada ensayo se lee
a 595 nm usando como blanco el tubo 6 de la serie y se determinan por triplicado.
Esta curva solo es estable por 30 min y se deberá agitar perfectamente antes de
leer. Para determinar el contenido de la proteína en cuestión se realiza el mismo
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procedimiento sustituyendo la ASB por la proteína problema e interpolando los
resultados obtenidos para la proteína problema en la curva estándar. Durante la
determinación se desarrolla una coloración azulada que se incrementa conforme
se incrementa la concentración de proteínas.
Cuadro 7. Curva tipo de albumina sérica bovina, para la determinación de
proteína en el medio de cultivo por el método de Bradford.
Tubo Solución Proteína (ASB,250 μg/mL)
Agua destilada(mL)
Reactivo de Bradford(mL)
1 0.1 2.9 32 0.2 2.8 33 0.3 2.7 34 0.4 2.6 35 0.5 2.5 36 0.0 3 3
La curva tipo de albumina sérica bovina, para la determinación de proteína en el
medio de cultivo por el método de Bradford.se reporta en el Anexo número 1 del
presente trabajo y presentó una ecuación de la recta de Y=5.78x + 0.1408;
R2=0.9579.
III.6.2 Determinación de la actividad enzimática de la naringinasa comercial de
Penicillium decumbens.
Para llevar a cabo la determinación de la naringinasa producida por el
microorganismo empleado fue importante conocer el comportamiento de esta in
vitro por tanto se realizaron las siguientes determinaciones utilizando naringinasa
de Penicillium decumbens (Sigma).
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III.6.2.1 Estudio del efecto de la concentración de naringinasa de Penicillium
decumbens en la hidrólisis de naringina.
Se preparó una solución de naringina 0.005 mM en regulador de citratos 0.05 M
pH 4.5 de la cual siempre se adicionó 1.9 mL a cada tubo de ensayo, además de
diferentes soluciones de naringinasa de concentración final de 10, 30, 50, 75, 100,
125 y 150 μg/mL; las cuales fueron elaboradas a partir de una solución
concentrada de 1500 μg/ mL, siendo siempre la alícuota que se adicionó al
sustrato de 0.1 mL. Así el volumen total de cada tubo de ensayo fue de 2 mL.
Cada ensayo se incubo durante 15 minutos, tiempo en el cual se llevaría a cabo la
hidrólisis de naringina por la naringinasa y se obtendría glucosa como producto
final y esta es directamente proporcional a la cantidad de naringenina producidapor dicha hidrólisis. Terminado el tiempo de reacción, la reacción se detiene con la
adición de 4 mL de DNS y se calienta durante 5 minutos a ebullición para revelar
cada tubo, los cuales una vez fríos fueron leídos a 540nm con filtro verde. (Ting,
1958; Olson y col, 1979; Olson y Gray, 1981; Chaplin y Kennedy, 1986). Los
resultados de este estudio se reporta en el Anexo 2 apartado 2a.1 del presente
trabajo.
III.6.2.2 Estudio del efecto del tiempo en la velocidad de hidrólisis de la naringina
por la naringinasa de Penicillium decumbens.
Del estudio anterior se seleccionó una concentración de naringinasa a la cual se
observara claramente la hidrólisis de la naringina la cual fue 50 μg/ mL, dicha
concentración se mantuvo constante durante todo el experimento donde se
evaluaron diferentes tiempos de hidrolisis los cuales fueron 5,10, 20, 30, 40, 50, 60
minutos adicionando a cada tubo de ensayo 1.9 mL de naringina 0.005M y 0.1 mL
de naringinasa. Terminado el tiempo de reacción, la reacción se detuvo con la
adición de 4 mL de DNS y se calentó durante 5 minutos para revelar cada tubo,
los cuales una vez fríos fueron leídos en el fotocolorímetro con filtro verde. (Ting,
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1958; Olson y col, 1979; Olson y Gray, 1981; Chaplin y Kennedy, 1986). Los
resultados de este estudio se reporta en el Anexo 2, apartado 2a.2 del presente
trabajo.
III.6.2.3 Curva tipo de naringina.
Para el montaje de la curva tipo de naringina una vez conocidos tanto la
concentración de naringinasa a emplear (50 μg/ mL) y el tiempo de hidrólisis más
adecuado para observar tal efecto (10 min), se preparó una solución de
naringinasa en concentración de 50 μg/ mL en regulador de citratos 0.005 mM pH
4.5 de la cual se adición 0.5mL, la concentración de naringina empleada fue de0.005M y se emplearon los siguientes volúmenes: 0.05, 0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1,
1.2, 1.4, 1.6 y 1.8 mL para alcanzar un volumen final de cada ensayo de 2.5 mL. El
tiempo de incubación fue de 10 minutos, posteriormente la reacción fue detenida
agregando 4 mL de DNS y los tubos fueron puestos a ebullición durante 5
minutos, una vez fríos se llevo a cabo la lectura a 450nm con filtro verde. (Ting,
1958; Olson y col, 1979; Olson y Gray, 1981; Chaplin y Kennedy, 1986). Los
resultados de este estudio se reporta en el Anexo 3, Figura 4A del presente
trabajo.
III.6.2.4 Determinación de las constantes de Vmáx y Km para la naringinasa de
P. decumbens por los métodos gráficos de Michaelis-Menten, Lineweaber-Burk,
Eadie-Hofsteen, Agustinson y Wilkinson.
En base a los resultados de obtenidos de la curva de naringinasa y haciendo una
curva patrón de glucosa (Anexo 4, Figura 5A) se calcularon las concentraciones
reales en μg/ ml que representa cada volumen empleado en la curva tipo de
naringina 0.005M. Dichos resultados fueron empleados para trazar las curvas de
Michaelis- Mentes (Anexo 5, Figura 6A), Lineweaber-Burk (Anexo 5, Figura 7A),
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Eadie-Hofsteen (Anexo 5, Figura 8A) y Agustinson (Anexo 5, Figura 9A), y se
determino la Vmáx y Km para cada uno, a demás se determinaron dichas
constantes por el método estadístico de Wilkinson (1960) (Anexo 5, Cuadro 5A).
La Vmáx esta expresada en U/mg proteína donde una U = cantidad de enzima
para liberar 1μmol de glucosa/ min.
III.6.3 Estudio de la actividad enzimática de la naringinasa producida por A. niger
en muestras de la fermentación de cada formulación.
Para llevar a cabo la determinación de la actividad enzimática de la naringinasa
producida por el microorganismo empleado. Se tomó 0.5 mL de cada muestra dela fermentación de cada formulación, se le adicionó 1.5 mL de una solución de
naringina (Sigma) 5.26 mM en regulador de citratos 0.05M pH 6, como sustrato, y
se incubó a 35°C por 24 h, la reacción fue detenida adicionando 4 mL de ácido
3,5-dinitrosalicilico y con ebullición en baño María durante 5 minutos,
posteriormente se leyó a 450 nm en un fotocolorímetro con filtro verde. Todos los
ensayos se realizaron por triplicado. Como blanco se utilizó 1.5 mL de una
solución de naringina 5.26mM. Para el tratamiento de los resultados se utilizó una
curva tipo de glucosa con una ecuación de la curva de Y=0.6456x -2.2889;
R2=0.987, reportada en el Anexo 4, Figura 5A del presente trabajo.
III.6.4 Estudio de la actividad enzimática de la naringinasa producida por A. niger
del caldo nutritivo que presentó mayor actividad enzimática en el estudio anterior.
A partir de los resultados obtenidos en el estudio anterior se seleccionó el caldo
nutritivo seleccionado que presentó mayor actividad enzimática.
El caldo nutritivo elegido, fue tratado para concentrar la proteína y separarla del
medio de cultivo por lo que se le adicionó 65 g de sulfato de amonio por cada 100
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mL de medio de cultivo para precipitar la proteína en baño de hielo logrando una
saturación de 99% de acuerdo con Dawson (1968). La solución fue centrifugada a
17100 rpm (107442.46875277 radianes /min) 4°C por 30 min; el pellet fue re-
suspendido en 15 mL de regulador de citratos 0.05M pH 6 y se le determinó el
contenido proteico por medio del método de Bradford.
Para la determinación de la actividad enzimática del concentrado proteico obtenido
se emplearon 1.5 mL de una solución de naringina de diferente molaridad (0.02,
0.008, 0.00526, 0.0026, 0.0013, 0.001, 0.0006 M) en regulador de citratos 0.05 M
pH 6 a la que se le adicionaron 0.5 mL del concentrado proteico y se incubaron a
35°C por 24 h en baño María, una vez transcurrido el tiempo de incubación la
reacción fue detenida adicionando 4 mL de ácido 3,5-dinitrosalicilico y conebullición en baño María durante 5 minutos, posteriormente la lectura se realizó en
un fotocolorímetro con filtro verde. Todos los ensayos se realizaron por triplicado.
Para el tratamiento de los resultados se utilizó una curva tipo de glucosa con una
ecuación de la curva de Y=0.6456x -2.2889; R2=0.987, reportada en el Anexo 4,
Figura 5A del presente trabajo. Los resultados obtenidos permitieron calcular los
gráficos de Michaelis-Menten, Lineweaer-Burk, Eadie-Hoffsten y Agustinson. A
demás se determinó la Vmáx y Km para cada uno. El valor de Vmáx y Km para
Wilkinson se calculó de acuerdo al modelo estadístico de Wilkinson (1960).
III.6.5 Análisis estadístico para determinar la confiabilidad de los resultados
obtenidos por medio del programa estadístico MINITAB13.
Los resultados de peso del micelio, proteína y actividad enzimática fueron
analizados estadísticamente por medio del programa MINITAB13, a través de un
análisis de varianza (ANOVA) con un p ≤ 0.05 utilizando un diseño factorial
general completo de 3x4x5 (fuente de carbono, sales y días) con tres repeticiones.
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_________________________________________________ RESULTADOS Y DISCUCIÓN
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IV. RESULTADOS Y DISCUCIÓN
IV.1 Evaluación de la capacidad productora de naringinasa de la cepa Aspergillus
niger ATCC 1015 por medio de cromatografía en capa fina.
IV.1.1 Disolventes para la ascendencia por capilaridad de una muestra de
naringina pura en cromatografía en capa fina.
En la Figura 10 se observa que la acetona 100% no permitió la muestra de
naringina pura ascendiera por capilaridad en cromatografía en capa fina por lo que
este disolvente fue descartado para ser empleado en los siguientes experimentos.
El disolvente metanol 100% (Rf=0.62) (Figura 11) y las mezclas de disolventes
metanol: acetona 95:5 (Rf= 0.54) (Figura 9), metanol: acetona 90:10 (Rf=0.66)
(Figura 12) y metanol: acetona 80:20 (Rf=0.65) (Figura 13) permitieron que la
muestra de naringina pura ascendiera por capilaridad en cromatografía en capa
fina. La mezclas de disolventes hexano 100% (Rf=0), hexano: acetato de etilo
80:20 (Rf=0), acetato de etilo: hexano 80:20 (Rf=0), metanol: acetato de etilo
80:20 (Rf=0) y acetona 100% (Rf=0) no permitieron la ascendencia por capilaridad
de la muestra de naringina. Los resultados se muestran en la Cuadro 8.
Cuadro 8. Disolventes para eluir la naringina pura (50 mg/1000ml) encromatografía en capa fina.
Disolvente / proporción%
Ascendencia porcapilaridad
Rf
metanol 100 sí 0.62metanol: acetona / 95:5 sí 0.54
metanol: acetona / 90:10 sí 0.66metanol: acetona / 80:20 sí 0.65
hexano / 100 no 0hexano: acetato de etilo / 80:20 no 0acetato de etilo: hexano / 80:20 no 0metanol: acetato de etilo / 80:20 no 0
acetona / 100 no 0
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Figura 10. Naringina pura ascendida por capilaridad en cromatografia en capa fina
utilizando como disolvente acetona 100%.(Rf=0).
Figura 11. Naringina pura ascendida por capilaridad en cromatografia en capa fina
utilizando como disolvente metanol 100% (Rf=0.62).
Figura 12. Naringina pura ascendida por capilaridad en cromatografia en capa fina
utilizando como disolvente metanol: acetona 95:5 (Rf= 0.54).
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Figura 13. Naringina pura ascendida por capilaridad en cromatografia en capa fina
utilizando como disolvente metanol:acetona 90:10 (Rf=0.66).
Figura 14. Naringina pura ascendida por capilaridad en cromatografia en capa fina
utilizando como disolvente metanol: acetona 80:20 (Rf=0.65).
El valor de Rf nos permitió inferir que el mejor sistema que permitía que la muestra
de naringina pura ascendiera por capilaridad y se observará como una mancha
definida en una cromatoplaca podía ser la mezcla de metanol: acetona 90: 10
(Figura 13) por presentar el mayor Rf, seguido de metanol: acetona 80:20 (Figura14), metanol 100% (Figura 11) y en último caso el metanol: acetona 95:5 (Figura
12). La elección del disolvente o sistema de disolventes dependió del resultado
obtenido en la siguiente etapa experimental ya que se pretendió encontrar un
disolvente o mezcla de disolventes que permitiera la ascendencia por capilaridad
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tanto de la naringina pura como de la naringina presente en jugo de naranja ya
que esta última podía verse afectada en su polaridad debido a la acidez del medio
en el que se encontraba.
Debido a que no se observó ascendencia por capilaridad en cromatografía en
capa fina de la naringina pura con el disolvente hexano 100% ( disolvente no
polar; índice de polaridad Ip= 0) inferimos que la naringina es un flavonoide polar,
sin embargo, este flavonoide asciende por capilaridad en cromatografía en capa
fina muy poco con un disolvente de polaridad intermedia como la acetona 100%
(Ip= 5.4) (Figura 10), pero por otra parte con metanol 100% disolvente de alta
polaridad (Ip= 6.6) (Figura11) asciende por capilaridad de tal manera que permite
obtener un RF muy cercano a la unidad, por tanto podemos decir que la naringinaes un flavonoide de alta polaridad.
IV.1.2 Disolventes utilizados para la ascendencia por capilaridad de la naringina
presente en el jugo de naranja en cromatografía en capa fina.
Las mezclas evaluadas en esta etapa fueron: metanol 100% (Rf=0.645)
(Figura15), metanol: acetona 95:5 (Rf=1.67) (Figura 16), metanol: acetona 90:10
(Rf=0) (Figura 17) y metanol: acetona 80:20 (Rf= 0.8) (Figura 18), de acuerdo con
el Rf el mejor sistema apto para la ascendencia por capilaridad en cromatografía
en capa fina de la naringina presente en la naranja es metanol: acetona 90:10, sin
embargo, al observar la placa cromatográfica no se observa una mancha definida
por tanto este sistema de disolventes fue descartado, eligiendo como mejores
sistemas aptos para la ascendencia por capilaridad de la naringina presente en la
naranja al metanol: acetona 80:20 ( Figura 18) seguido del metanol 100% (Figura
15).
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Figura15. Naringina presente en el jugo de naranja ascendida por capilaridad en
cromatografía en capa fina utilizando como disolvente metanol 100% (Rf=0.645).
Figura 16. Naringina presente en el jugo de naranja ascendida por capilaridad en
cromatografía en capa fina utilizando como disolvente metanol: acetona 95:5(Rf=1.67).
Figura17. Naringina presente en el jugo de naranja ascendida por capilaridad en
cromatografía en capa fina utilizando como disolvente metanol: acetona 90:10
(Rf=0).
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Figura 18. Naringina presente en el jugo de naranja ascendida por capilaridad en
cromatografía en capa fina utilizando como disolvente metanol: acetona 80:20
(Rf=0.8).
Finalmente este experimento nos permitió saber que la polaridad de la naringinapresente en la naranja puede estar afectada por la presencia de otros
componentes o por las condiciones en las que se encuentra en la naranja.
IV.1.3 Disolventes para la ascendencia por capilaridad de la naringina pura y la
naringina presente en las naranjas en cromatografía en capa fina.
Se encontró que la naringina pura (N) y la naringina presente en la naranja (n),
ascendieron por capilaridad en metanol 100% (Figura 20) alcanzando un Rf= 0.86,
pero su ascendencia por capilaridad mejoró con metanol: acetona en 80:20
(Figura 19) presentando un Rf= 1 el cual fue calculado con respecto a la muestra
de referencia lo que nos sugiere que el mejor sistema para permitir la ascendencia
por capilaridad en cromatografía en capa fina de las muestras de naringina pura y
naringina de la naranja es el de metanol: acetona en 80:20. Por tanto para la
siguiente etapa experimental se trabajo con este sistema de disolventes.
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Figura 19. Naringina (N) y naringina de naranja (n) metanol: acetona 80:20 (Rf=1).
(N= naringina; n= naringina de naranja).
Figura 20. Naringina (N) y naringina de naranja (n) metanol 100% (Rf=0.86). (N=
naringina; n= naringina de naranja).
IV.1.4 Evaluación de la degradación de la naringina por la naringinasa producida
por Aspergillus niger ATCC 1015 una vez inoculado en naranjas.
Pequeñas muestras de jugo de las naranjas utilizadas en el experimento (n) se
compararon en una placa cromatográfica contra una muestra de naringina pura
(N) tanto de las naranjas inoculadas por picadura con Aspergillus niger ATCC
1015 como las no inoculadas (controles). Después de revelar las placas se
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confirmó la presencia de la naringina en el lote de naranjas sin inocular (Figura 21)
y de igual manera se confirmo la presencia de la naringina en el lote de naranjas
acabadas de inocular (Figura 22).
Figura 21. Cromatoplacas de naranjas sin inocular, metanol: acetona 80:20
(triplicado). (N= naringina; n= naringina de naranja).
Figura 22. Cromatoplacas de naranjas inoculadas con A. niger , metanol: acetona
80:20 (triplicado). (N= naringina; n= naringina de naranja).
A las 24 horas del experimento se observó que todavia estaba presente la
naringina en el lote de naranjas sin inocular (Figura 23). En el lote de naranjas
N NN nnn
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inoculadas se observó que una naranja no presentó naringina en el punto de
inoculación (Figura 24).
Figura 23. Cromatoplacas de naranjas sin inocular, metanol: acetona 80:20
(triplicado). (N= naringina; n= naringina de naranja).
Figura 24. Cromatoplacas de naranjas inoculadas con A. niger , metanol: acetona80:20 (triplicado). (N= naringina; n= naringina de naranja).
A las 48 y 72 horas se observó la presencia de naringina en las naranjas no
inoculadas(Figura 25) junto con la presencia de otros compuestos, lo que podría
nN
N n nN
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sugerir el inicio de la degradación de la naringina presente en la naranja
probablemente por efecto de la maduración. En las naranjas inoculadas (Figura
26) se observó el mismo comportamiento presentado a las 24 horas solo que
ahora había presencia de otros compuestos que solo se observaron en una
longitud de onda larga al UV.
Figura 25. Cromatoplacas de naranjas sin inocular, metanol: acetona 80:20
(triplicado). (N= naringina; n= naringina de naranja).
Figura 26. Cromatoplacas de naranjas inoculadas con A. niger , metanol: acetona
80:20 (triplicado). (N= naringina; n= naringina de naranja).
N nN
N
N N
n
n
n
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Después de 96 hrs de haber iniciado el experimento se observó la presencia de
naringina en las naranjas no inoculadas (Figura 27) junto con la presencia de otros
compuestos que absorven en longiutud de onda larga al UV y en el lote de
naranjas inoculadas (Figura 28) con A. niger no se observó la presencia de
naringina.
Figura 27. Cromatoplacas de naranjas sin inocular, metanol: acetona 80:20
(triplicado). (N= naringina; n= naringina de naranja).
Figura 28. Cromatoplacas de naranjas inoculadas con A. niger , metanol: acetona
80:20 (triplicado). (N= naringina; n= naringina de naranja).
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A 120 hrs los controles (Figura 29) mostraron la presencia de naringina junto con
la presencia de otros compuestos que solo absorven en longitud de onda larga en
el UV. En las muestras de las naranjas inyetadas (Figura 30) con el hongo no se
observa la presencia de naringina probablemente debido a una hidrólisis inducida
por el microorganismo inoculado.
Figura 29. Cromatoplacas de naranjas sin inocular, metanol: acetona 80:20
(triplicado). (N= naringina; n= naringina de naranja).
Figura 30. Cromatoplacas de naranjas inoculadas con A. niger , metanol: acetona
80:20 (triplicado). (N= naringina; n= naringina de naranja).
N
N N
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IV.2 Recuperación de la cepa de A. niger a partir de un cultivo en tubo inclinado.
La cepa Aspergillus niger ATCC 1015 (obtenida del cepario del CINVESTAV;
Figura 31) fue resembrada en agar Sabouraud (Figura 32) el cual fue preparado,esterilizado y vaciado previamente en cajas petri, las cuales fueron resembradas
por picadura lo cual se muestra en la Figura 33. Dichas cajas se mantuvieron a
temperatura ambiente y cubiertas con papel aluminio por una semana para
obtener un óptimo crecimiento del microorganismo el cual se muestra en la Figura
34. El hongo comenzó a crecer desde el primer día y alcanzo su óptimo a los 7
días de haberse sembrado. Este procedimiento se realizó mensualmente a
manera de conservar la cepa.
Figura 31. Cepa Aspergillus niger ATCC 1015 obtenida del cepario del
CINVESTAV.
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59
Figura 32. Agar Saboraud.
Figura 33. Resiembra del microorganismo Aspergillus niger ATCC 1015.
Figura 34. Crecimiento optimo de la cepa de Aspergillus niger ATCC 1015.
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IV.3 Fermentaciones.
El caldo nutritivo, como fue descrito en materiales y métodos, fue adicionado con
diferentes fuentes de carbono (0.5% p/v) y con sales de calcio y magnesio al 1 M y
0.1mM. Sin embargo, en estas muestras no se observó el crecimiento del hongo
(peso del micelio).
IV.3.1 Crecimiento del microorganismo utilizando diferentes fuentes de carbono.
Se observó crecimiento del microorganismo cuando se empleó como fuente de
carbono naringina, ramnosa o melaza (0.5% p/v) en el caldo nutritivo. Cuando seadición las sales de calcio y/o magnesio en concentración de 0.01mM se observó
crecimiento del microorganismo al contrario de cuando se utilizó una
concentración de 1 y 0.1mM. Por ello se empleó en todos los caldos nutritivos que
se trabajaron en este estudio una concentración de 0.01 mM para las sales.
Es importante resaltar que cuando no se adicionó sal alguna al medio de cultivo,
no se encontró diferencia significativa para las tres diferentes fuentes de carbono
empleadas. Lo cual concuerda con Bramn y Solomons (1965) que sugieren que no
es necesaria la adición de factores de crecimiento para Aspergillus niger NRRL
72-4 en la producción de naringinasa. Sin embargo, la presencia de CaCO3 y
MgCO3 individualmente favoreció significativamente (p≤0.05) el crecimiento de
A. niger solo cuando se utilizó melaza como fuente de carbono, siendo el máximo
de crecimiento 0.905 g/mL y 0.775 g/mL para CaCO3 y MgCO3 respectivamente
(Figura 35). Bramn y Solomons (1965) sugieren que el CaCO3 tiene un efecto
positivo en el crecimiento del hongo durante la producción de la naringinasadebido a que cuando se realiza dicha producción en matraces agitados, y no en
fermentadores, en donde se pueden controlan todos los factores, se forma una
atmosfera limitada en oxigeno que afecta el crecimiento del hongo y esta limitación
puede modificarse a través de la adición de CaCO3. Esto podría aplicarse también
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para el MgCO3, ya que lo que aporta el carbonato de calcio es oxigeno para
contrarrestar la deficiencia de este en el medio, sin embargo, para magnesio no
está comprobado. No obstante la adición de la mezcla de ambas sales no mostró
diferencia significativa para alguna fuente de carbono empleada.
Figura 35. Crecimiento del micelio de A. niger ATCC1015 en melaza con adición
de CacO3 (▲) y melaza con adición de MgCO3 (■).
0.905
0.775
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1
0 1 2 3 4 5 6 7 8
P e s o d e l m i c e l i o e n b a s e s e c a
g / m l
Días
M 0.5%, Ca 0.01mM
M 0.5%, Mg 0.01mM
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IV.4 Determinación de proteína en el medio de cultivo por el método de Bradford.
La determinación de la proteína durante el crecimiento del microorganismo (no
toda la proteína producida es enzima naringinasa) se realizó por triplicado para
todas las muestras tomadas cada 24 horas durante el transcurso de la
fermentación y se utilizó como blanco la fuente de proteína inicial (1% p/v).
Para la producción de proteína se encontró que existe diferencia significativa
(p≤0.05) dependiendo de la fuente de carbono que se utilice, siendo la naringina la
fuente de carbono que favorece más la producción proteica, lo cual se observa en
la Figura 36, Curva A.
También se encontró diferencia significativa en la producción de proteína
dependiendo de la presencia o ausencia de sales de Ca2+ y/o Mg2+. En la Figura
36, Curva B se observa que la adición de las sales favorece positivamente la
producción de proteína, teniendo un mayor efecto positivo el MgCO3 que el
CaCO3, sin embargo, se observa que el efecto positivo se incrementa cuando se
adiciona la mezcla de sales de Ca2+ y Mg2+ y cuando se utiliza naringina como
fuente de carbono (Figura 37, Curva A). Probablemente el efecto de la mezcla de
las sales es mayor porque al adicionarlas juntas suman su efecto actuando
sinergistamente sobre la producción proteica.
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Figura 36. Curvas de comportamiento de la proteína en relación a la fuente de
carbono (A) y sales de Ca2+ y/o Mg2+ (B), por Aspergillus niger ATCC1015.
Tiempo de la fermentación en días(C). N= naringina; R= ramnosa; M=melaza; 0=
sin sales; Ca= CaCO3; Mg=MgCO3; m= mezcla de sales. La línea punteada
representa la media de los datos.
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Figura 37. Curvas de producción de proteína mostrando las relaciones: fuente de
carbono-sales (A) y fuente de carbono-días (B), para naringina, melaza y ramnosa
y (C) la relación sales-días para naringina. N= naringina; R= ramnosa; M=melaza;
0= sin sales; Ca= CaCO3; Mg= MgCO3; m= mezcla de sales.
Al analizar individualmente las diferentes formulaciones en función de la fuente de
carbono utilizada se encontró para el caso de naringina que existe diferencia
significativa (p≤0.05) en ausencia y presencia de las sales de Ca2+ y/o Mg2+.
Siendo el máximo de producción de proteína (Cuadro 9) para naringina sin adiciónde sales de 6192 µg / mL; para naringina + Ca2+ de 11849 µg / mL; para naringina
+ Mg2+ de 15154 µg / mL y para naringina + Ca2+ y Mg2+ de 32553 µg / mL. A
partir de dichos máximos de producción de proteína se observa que la adición de
la mezcla de las sales incrementa significativamente la producción de proteína en
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comparación cuando no se adicionan sales o cuando se adicionan Ca2+ o Mg2+
individualmente.
Cuadro 9.Máximos de producción de proteína en la producción de naringinasa por
medio de A. niger.
Sin embargo, no existe diferencia significativa en la producción de proteína al
adicionar Ca2+ y Mg2+ de manera independiente. Es posible que la adición de la
mezcla de las sales tenga un efecto sinergista positivo en la producción de
proteína cuando se utiliza naringina como fuente de carbono.
Ensayo Producción de
proteína (µg / mL)
naringina sin sales
naringina +Ca2+ y Mg2+
naringina + Ca2+
naringina + Mg2+
6192
32553
1184915154
melaza sin sales
melaza +Ca2+ y Mg2+
melaza + Ca2+
melaza + Mg2+
2339
5033
4987
7368
ramnosa sin sales
ramnosa+Ca2+ y Mg2+
ramnosa + Ca2+
ramnosa + Mg2+
2006
3139
2845
19445
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Cuando se utilizó melaza como fuente de carbono se encontró diferencia
significativa en la producción de proteína en ausencia y presencia de las sales de
Ca2+ y/o Mg2+. Siendo el máximo de producción de proteína (Cuadro 9) para
melaza sin adición de sales de 2339 µg /mL; para melaza + Ca2+ de 4987 µg / mL;
para melaza + Mg2+ de 7368 µg / mL y para melaza + Ca2+ y Mg2+ de 5033 µg /
mL. Es importante mencionar que, a pesar de que la producción de proteína al
adicionar Mg2+ al caldo nutritivo es mayor, esta no es significativamente diferente
en relación a la proteína producida cuando no se hizo adición de sales o cuando
se adicionó solo Ca2+, sin embargo, sí es significativamente mayor en relación a la
producida cuando se adicionó la mezcla de sales.
Finalmente cuando se utilizó ramnosa como fuente de carbono también seencontró diferencia significativa en ausencia y presencia de las sales de Ca2+ y/o
Mg2+ en la producción de proteína (Cuadro 9). Siendo el máximo de producción de
proteína para ramnosa sin adición de sales de 2006 µg /mL; para ramnosa + Ca2+
de 3139 µg / mL; para ramnosa + Mg2+ de 2845 µg / mL y para ramnosa + Ca2+ y
Mg2+ de 19445 µg / mL. A partir de los máximos obtenidos se observa que la
adición de la mezcla de sales de Ca2+ y Mg2+ al caldo nutritivo permite una mayor
producción de proteína con respecto a cuando no se adicionaron dichas sales, es
decir, la adición de la mezcla de sales tiene un efecto positivo en la producción de
proteína. Por otra parte la adición de Ca2+ al caldo nutritivo favoreció de igual
manera la producción de proteína en relación a cuando no se adicionó, pero esta
producción no fue significativamente diferente a la obtenida cuando se adicionó
Mg2+ o cuando se adicionó la mezcla de Ca2+ y Mg2+. Cabe señalar que la adición
de Mg2+ no tuvo un efecto significativo en la producción de proteína en relación a
los otros caldos nutritivos.
Al hacer una comparación entre las tres fuentes de carbono (naringina, melaza y
ramnosa) bajo las mismas condiciones, se encontró que al no adicionar sales
existe diferencia significativa en la producción de proteína entre la proteína
(Cuadro 10) producida al adicionar naringina y al adicionar ramnosa (2006 µg/mL)
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como fuente de carbono, siendo mayor la producción de proteína cuando se utiliza
naringina (6192 µg/mL), sin embargo, no existe diferencia significativa entre las
dos fuentes de carbono mencionadas anteriormente con respecto a melaza
cuando se utiliza como fuente de carbono.
Los caldos adicionados con Ca2+ que mostraron ser significativamente diferentes
en la producción de proteína, fueron en los que se utilizó naringina y melaza como
fuente de carbono (Cuadro 10), siendo mayor la producción de proteína para el
caso de naringina (11849 µg/mL) en relación con la melaza (4987 µg/mL). El caldo
nutritivo en el que se empleo ramnosa como fuente de carbono no mostró ser
significativamente diferente a los anteriormente mencionados.
Cuadro 10. Comparativo de los máximos de producción de proteína significativos
(p≤0.05) en la producción de naringinasa mediante diferentes fuentes de carbono
por medio de A. niger .
Ensayo Producción de
proteína (µg / mL)
naringina sin sales
ramnosa sin sales
6192
2006naringina + Ca +
melaza + Ca2+
11849
4987
naringina + Mg2+
ramnosa + Mg2+
15154
2845
naringina + Mg +
melaza + Mg2+
15154
7368
naringina + Ca + y Mg +
melaza + Ca2+ y Mg2+
32553
5033
naringina + Ca + y Mg +
ramnosa + Ca2+ y Mg2+
32553
19445
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En el caso de los caldos a los que se les adiciono Mg2+ se encontró diferencia
significativa en la producción de proteína (Cuadro 10), entre el que se utilizo como
fuente de carbono la naringina (15154 µg/mL) y en el que se utilizo ramnosa (2845
µg/mL), también se encontró diferencia significativa en la producción de proteína
entre naringina y melaza (7368 µg/mL). Sin embargo, la producción de proteína
entre melaza y ramnosa no fue significativamente diferente.
En el caso de los caldos adicionados con la mezcla de las sales de Ca2+ y Mg2+,
también se encontró diferencia significativa en la producción de proteína (Cuadro
10), entre naringina (32553 µg/mL) y melaza (5033 µg/mL) utilizada como fuente
de carbono, de igual manera entre naringina y ramnosa (19445 µg/mL).
Por otra parte el tiempo (días) mostró tener efecto en la producción de proteína
dependiendo de la fuente de carbono que se empleo, lo cual se observa en la
Figura 37B donde claramente se aprecia que los ensayos realizados con naringina
como fuente de carbono presentan mayor producción de proteína ya que a pesar
de que presenta variaciones a lo largo de la fermentación, siempre se mantiene
por arriba de la producción de proteína producida con melaza y con ramnosa. Por
otra parte la Figura 37C, muestra la producción de proteína a lo largo del tiempo
de fermentación utilizando naringina como fuente de carbono en relación a la
ausencia y/o presencia de las sales de Ca2+ y Mg2+ donde se observa que es con
la mezcla donde se ve favorecida significativamente la producción de proteína a
pesar de la variación de esta a lo largo de los días debido al metabolismo del
hongo.
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IV.5 Estudio de la actividad enzimática de la naringinasa de A. niger en muestras
de cada fermentación.
La determinación de la actividad enzimática se realizó durante el crecimiento del
hongo en el caldo nutritivo en diferentes condiciones por triplicado a lo largo de 7
días de fermentación. Se utilizó como blanco una solución de naringina 5.26M pH
6 en buffer de citratos.
En la Figura 38A se observa el efecto de las tres diferentes fuentes de carbono en
la actividad enzimática. A través del análisis estadístico se encontró que existe
diferencia significativa entre ellas (p≤0.05) siendo la ramnosa la fuente de carbono
que favorece más la producción de naringinasa. Por otra parte en la figura 38B seobserva que la adición de sales no influye significativamente en la actividad
enzimática de esta enzima.
Figura 38. Curvas de Actividad enzimática expresada en microgramos de glucosa
producida después de 24hrs de hidrolisis, en relación a las diferentes fuentes de
carbono 0.5%, sales de Ca2+ y/o Mg2+ 0.01mM y días. La línea punteada
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representa la media de los datos. N= naringina; R= ramnosa M=melaza; 0= sin
sales; m= mezcla de sales.
La producción enzimática obtenida en el presente trabajo puede explicarse a
través de la teoría económica de los microorganismos (Koch, 1985) que establece
que la producción de una enzima inducida, solo es favorecida cuando la
producción de esta permite al microorganismo obtener más nutrientes para su
crecimiento y multiplicación. Además este efecto puede incrementar si no existen
sustratos fácilmente asimilables, los microorganismos no regularan fuertemente la
producción enzimática de las enzimas constitutivas, o los costos enzimáticos son
suficientemente bajos para permitir una continua producción, y de acuerdo con
Stevens y col, (2005), las enzimas extracelulares como en este caso lanaringinasa son el principal medio por el cual los microorganismos degradan
compuestos orgánicos complejos en moléculas pequeñas que pueden ser
asimilables.
Por otra parte en la Figura 38C se observa que la producción de naringinasa varía
de acuerdo con el metabolismo del hongo durante los días que duró la
fermentación, siendo esta mayor el primer día después del inicio de la
fermentación y claramente se observa una disminución de esta los últimos días de
la fermentación, quizá debido a una represión por catabolito (glucosa) (Munish y
col 2005, Bram y Solomons, 1965).También el comportamiento ascendente y
descendente de la actividad enzimática a lo largo del tiempo de fermentación
puede explicarse a través de lo citado por Chróst (1991) que establece que una
vez que la concentración de productos incrementa lo suficiente, la síntesis
enzimática se ve reprimida y la producción regresa a un nivel basal.
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Comparando la actividad enzimática que se observa a través de los días (Figura
38C) con la variación de la proteína presente en el medio de cultivo con respecto
al tiempo (Figura 36C) se observa que la cantidad la actividad enzimática no es
proporcional a la producción de proteína ya que la actividad enzimática mayor se
observa en el primer día después del inicio de la fermentación (Figura 39B)
después de lo cual desciende y es hasta el sexto día cuando vuelve a subir pero
no alcanza el máximo alcanzado el primer día, lo que es contrario para la
producción de proteína donde se observa (Figura 36B) que esta aumenta y
disminuye repetitivamente, es decir no muestra la misma tendencia que en el caso
de la actividad enzimática . De acuerdo con Koch, 1985; Pelletier y Sygush, 1990;
Chróst, 1991; Sinsabaugh y Moorhead, 1994, debido a la producción de nitrógeno
y energía, los microorganismos solo deben producir enzimas a expensas delcrecimiento y metabolismo, es decir; cuando la disponibilidad de nutrientes es
escasa, la producción de enzimas aumenta, ya que de esta manera los
microorganismos pueden movilizar los nutrimentos de las fuentes complejas
(Harder y Dijkhuizen, 1983).
En este trabajo no se cuantificó la cantidad de enzima producida sino la actividad
enzimática de la enzima producida, en este sentido, la actividad enzimática de la
naringinasa producida no, fue proporcional a la producción de proteína.
Por otra parte también se encontró que las relaciones de Fuente de carbono-Sales
(Figura 39A), Fuente de Carbono- Días (Figura 39B), Sales-Días (Figura 39C),
tienen un efecto significativo en la actividad enzimática determinada.
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Figura 39. Curvas de actividad enzimática mostrando las relaciones fuente de
carbono-sales, fuente de carbono-días y sales-días. N= naringina; R= ramnosa
M=melaza; 0= sin sales; m= mezcla de sales. La línea punteada representa la
media de los datos.
Al analizar los diferentes caldos nutritivos en los que se empleó naringina como
fuente de carbono se encontró que no existe diferencia significativa entre ellos en
cuanto a la actividad enzimática determinada (Cuadro 11), sin embargo, el máximo
de actividad enzimática encontrado para naringina sin sales fue de 2605 μg de
glucosa/mL; para naringina + Ca2+ fue de 5536 μg de glucosa / mL; para naringina
+ Mg2+ fue de 3122 μg de glucosa/mL y para naringina + Ca2+ y Mg2+ fue de 3122
μg de glucosa/mL. Las unidades de actividad enzimática son expresadas en este
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trabajo en microgramos de glucosa debido a que a partir del método utilizado se
cuantifica la cantidad de glucosa producida por la hidrólisis de la naringinasa
presente en el medio de cultivo sobre una muestra de naringina pura de
concentración conocida.
Cuadro 11.Máximos encontrados de actividad enzimática en la producción de
naringinasa por medio de A. niger (No diferencia significativa).
En el caso de los diferentes caldos nutritivos en los que se empleo melaza como
fuente de carbono se encontró que no existe diferencia significativa entre ellos en
cuanto a la actividad enzimática determinada (Cuadro 11), sin embargo, el máximo
de actividad enzimática encontrado para melaza sin sales fue de 2605 μg de
glucosa / mL; para melaza + Ca2+ fue de 2743 μg de glucosa / mL; para melaza +
Ensayo Actividad
enzimática (U/µg)
Naringina sin salesNaringina +Ca2+ y Mg2+
Naringina + Ca2+
Naringina + Mg2+
26053122
5536
3122
Melaza sin sales
Melaza +Ca2+ y Mg2+
Melaza + Ca2+
Melaza + Mg2+
2605
2432
2743
3225
Ramnosa sin sales
Ramnosa+Ca2+ y Mg2+
Ramnosa + Ca2+
Ramnosa + Mg2+
6139
4932
1638
2777
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Mg2+ fue de 3225 μg de glucosa / mL y para melaza + Ca2+ y Mg2+ fue de 2432 μg
de glucosa/mL.
Finalmente, para el caso de los diferentes caldos nutritivos en los que se empleo
ramnosa como fuente de carbono tampoco se encontró diferencia significativa
entre ellos en cuanto a la actividad enzimática determinada (Cuadro 11), sin
embargo, el máximo de actividad enzimática encontrado para ramnosa sin sales
fue de 6139 μg de glucosa / mL; para ramnosa + Ca2+ fue de 1638 μg de glucosa /
mL; para ramnosa + Mg2+ fue de 2777 μg de glucosa / mL y para ramnosa + Ca2+
y Mg2+ fue de 4932 μg de glucosa / mL.
Por otra parte, al hacer una comparación entre las tres fuentes de carbono(naringina, melaza y ramnosa) bajo las mismas condiciones, se encontró que al no
adicionar sales sí existe diferencia significativa entre en la actividad enzimática
determinada en el caldo nutritivo adicionado con naringina y el adicionado con
ramnosa, encontrándose un máximo de actividad enzimática para naringina de
2605 µg de glucosa /mL y de 6139 µg de glucosa /mL para ramnosa (Cuadro 12).
Cuadro 12. Comparativo de los máximos de actividad enzimática significativos
(p≤0.05) de la naringinasa producida utilizando diferentes fuentes de carbono por
medio de A. niger .
Ensayo Actividad
enzimática (U/µg)
Naringina sin sales
Ramnosa sin sales
2605
6139
Melaza sin sales
Ramnosa sin sales
2605
6139
Naringina + Ca +
Melaza + Ca2+
5536
2743
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También se encontró diferencia significativa entre la actividad enzimática
determinada en el caldo nutritivo adicionado con melaza y el adicionado con
ramnosa, encontrándose un máximo de actividad enzimática para melaza de 2605
µg de glucosa /mL, lo que claramente significa que el caldo de cultivo en el que se
emplea ramnosa como fuente de carbono permite obtener una mayor actividad
enzimática comparada con la de las otras dos fuentes de carbono (Cuadro 12).
Cabe señalar que no se encontró diferencia significativa entre la actividad
enzimática de la naringinasa determinada en el caldo nutritivo adicionado con
Naringina y el adicionado con melaza.
Los caldos adicionados con Ca2+ que mostraron ser significativamente diferentes
en la actividad enzimática fueron en los que se utilizó naringina y melaza comofuente de carbono (Cuadro 12), siendo mayor la producción de proteína para el
caso de Naringina (5536 µg de glucosa /mL) en relación con la melaza para la que
se encontró una actividad enzimática de 2743 µg de glucosa /mL. El caldo de
nutritivo en el que se empleo Ramnosa como fuente de carbono no mostró ser
significativamente diferente a los anteriormente mencionados.
En el caso de los caldos a los que se les adiciono Mg2+ no se encontró diferencia
significativa en la actividad enzimática, entre el alguna de las fuentes de carbono
empeladas en este trabajo.
En el caso de los caldos adicionados con la mezcla de las sales de Ca2+ y Mg2+,
tampoco se encontró diferencia significativa en la actividad enzimática
determinada entre los caldos de cultivo adicionados con las diferentes fuentes de
carbono.
De acuerdo a los resultados anteriores se seleccionó el caldo nutritivo que
presentó mayor actividad enzimática. De tal manera que la elección se realizó ente
la actividad enzimática para los caldos nutritivos en los que no se adicionó sales y
cuando se adicionó Ca2+, para las fermentaciones llevadas a cabo sin adición de
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sales, el caldo nutritivo adicionado con ramnosa fue quién mostro mayor actividad
enzimática (6139 µg de glucosa /mL) y para las llevadas a cabo con adición de
Ca2+ la actividad enzimática mayor encontrada fue cuando se utilizó Naringina
(5536 µg de glucosa /mL) como fuente de carbono. Por lo que la fracción de
ramnosa sin sales fue la elegida para realizar la siguiente parte del experimento.
IV.6 Estudio de la actividad enzimática del caldo nutritivo seleccionado.
La fracción seleccionada para la concentración de la proteína y la determinación
de las constantes fue la de la ramnosa sin adición de sales del primer día después
del inicio de la fermentación. El uso de la ramnosa como fuente de carbonopermite obtener una naringinasa con mayor actividad comparada con la producida
utilizando como fuente de carbono naringina o melaza. Quizá este
comportamiento pude explicarse por lo sugerido por Munish y colaboradores en el
2005, quienes señalan que los medios utilizados para producir naringinasa por A.
niger , adicionados con ramnosa, producen elevadas cantidades de enzima quizá
ya que estos medios tienen un bajo contenido de carbohidratos. Sin embargo,
Elinbaum y col. 2002 sugieren que en el caso de una fermentación sólida la
naringina es mejor inductor que la ramnosa para la producción de la naringinasa
utilizando A. terreus, además también sugieren que una fermentación solida
provee mejores resultados para la producción de naringinasa que una
fermentación liquida.
Haciendo una comparación de la producción proteica a lo largo del tiempo de
fermentación en relación a la actividad enzimática se observa que no son
proporcionales y por tanto una mayor producción proteica no conlleva a una mayor
actividad enzimática aunque la naturaleza de la enzima sea proteica, ya que una
actividad enzimática elevada puede estar dada tanto por haber alto contenido de
proteína en el medio de cultivo o por que la enzima es altamente activa. También
es importante resaltar que la actividad enzimática puede ser reprimida debido a
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una inhibición por glucosa (producto de la hidrólisis de la naringina por la
naringinasa) ya que de acuerdo con lo reportado por Munish y colaboradores en el
2005; Gallego y col en el 2001; Bram y Solomons en 1965 y Clarke y Brammer en
1964, la glucosa reprime la producción de naringinasa.
Como se mencionó con anterioridad, el caldo nutritivo donde se encontró mayor
actividad enzimática fue el adicionado con ramnosa como fuentes de carbono y sin
adición de sales durante las primeras 24 horas de la fermentación. Sin embargo,
debido a que se contaba con una pequeña cantidad de muestra se decidió juntar
todas las muestras tomadas cada día durante el periodo de la fermentación y se
procedió a una concentración de proteína. El contenido de proteína determinado
después del proceso de concentración al que se sometió la muestra fue de 66851μg/mL de proteína.
La determinación de la actividad enzimática de las fracciones de ramnosa (del
conjunto de muestras obtenidas cada día) sin adición de sales se probó sobre la
hidrólisis de naringina y se obtuvo una actividad enzimática de 0.010U/mg
(U=1µmol de glucosa liberada / min) la cual se reporta en el Cuadro 13. Tal vez
este valor tan pequeño encontrado se debe a que al juntar todas las fracciones
disminuyó la actividad enzimática inicial la cual fue de 0.947 U / min.
La actividad encontrada para la naringinasa presente en el concentrado de
proteína es mayor comparada con la informada por Bram y Solomons 1965 para la
naringinasa de A. niger NRRL 72-4 (Cudadro 13, No5) y es menor comparada con
la informada por diferentes autores, los valores se presentes en el Cuadro 13, sin
embargo, es importante resaltar que la mayoría de ellos determinaron la actividad
enzimática utilizando sustratos inespecíficos como el p-nitrofenol o el dietilen glicolalcalino, que esta actividad fue determinada utilizando diferentes condicione, y que
la producción de la enzima se realizó utilizando diferentes condiciones de
fermentación como en el caso de Gülten y col, 2006 (Cuadro13, No.2).
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_________________________________________________ RESULTADOS Y DISCUCIÓN
78
Por otra parte tal vez la producción de naringinasa por el hongo en estudio podría
mejorarse si se hace una adición de la fuente de carbono en diferentes etapas de
la fermentación de acuerdo con lo que sugiere Bram y Solomons (1965), sin
embargo, como ellos mismos establecen la adición continua de la fuente de
carbono a lo largo de la fermentación es un método más difícil y que requiere de
mayor control y de un fermentador.
Cuadro 13. Actividad enzimática de la naringinasa producida por diferentes
microorganismos y determinada mediantes diferentes sustratos.
Sustrato Actividad
narignina (1) 0.010 U/mg
naringina (2) 469 U/mg
p-nitrofenol (3) 91 U/mg
p-nitrofenol (4) 1.7 U/mL
dietilen glicol alcalino (5) 90-94 U/mL
dietilen glicol alcalino (6) 3.99x 10-4
IU/mLp-nitrofenol (7) 0.059 U
(1) Naringinasa de A. niger ATCC1015 producida en el presente trabajo. Medio de
cultivo adicionado con ramnosa como fuente de carbono. Regulador de citratos
0.05M, pH=6, 35°C, [naringina]=0.00526mM. U=1µmol de glucosa liberada / min.
(2) Naringinasa de P. decumbens, Gülten y col, 2006. Fermentación solida.Regulador de acetato de amonio 0.1M, pH= 4, 40°C, U= 1 µmol de glucosa
liberado/ min.
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79
(3) α-L-ramnosidasa de A. terreus, Gallego y col, 2001. Medio de cultivo
adicionado con ramnosa. Rregulador de succinato 50 mM, pH= 5.5, 50°C. U=
cantidad de enzima necesaria para liberar 1μmol p-nitrofenol/min.
(4) α-L-ramnosidasa de A. terreus, Elinbaum y col, 2002. Medio de cultivo
adicionado con carbono de bagazo de caña de azúcar. Regulador de ácido.
succínico /succinato de sodio 50mM, pH=5.5, 30°C. U=cantidad de enzima
necesaria para liberar 1μmol p-nitrofenol/min.
(5) Naringinasas de A. niger NRRL 72-4, Bram y Solomons 1965. Regulador de
citratos sin molaridad especifica reportada, pH=4, 45°C. U=cantidad de enzima
necesaria para hidrolizar 1μmol naringina/min. Método de Davis 1947.
(6) Naringinasa de A. niger MTCC 1344, Munish y col en el 2005. Medio de cultivo
adicionado con ramnosa. Regulador de acetato de sodio 0.1M, pH= 4, 30°C.
IU=cantidad de enzima necesaria para liberar 1μmol naringina/min. Método de
Davis 1947.
(7) α-ramnosidasa de la naringinasa de A. niger. Manzanares y col, 1997. Medio
de cultivo adicionado con naringina. Regulador MacIIvaine, pH=4.5, 30°C.
U= μmol de ramnosa/min.
Para determinar la constante de velocidad (Vmáx) y la constante de Michaelis-
Menten (Km) se utilizaron los modelos gráficos de Michaelis-Menten, Lineweaber-
Burk, Eadie-Hofsteen y Agustinson y el método gráfico de Wilkinson 1960. La
Figura 40 muestra las curvas para los modelos gráfico.
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80
Figura 40. (A)Curva de Michaelis –Menten para Naringinasa donde Y=
6.683x+0.068; R2=0.908; (B) Curva de Lineweaber-Burk para Naringinasa; (C)
Curva de Agustinson para Naringinasa; (D) Curva de Eadie-Hofsteen para la
naringinasa de A. niger ATCC1015.
En el cuadro 14 se muestra los datos calculados para las curvas correspondientes.
Los valores correspondientes a Vmáx y Km para la naringinasa de A. niger a partir
de cada modelo gráfico y el calculado por el método estadístico de Wilkinson se
muestran en el cuadro 15.
y = 0.010x + 6.279
R² = 0.868
0
2
46
8
10
12
14
16
18
0 500 1000 1500
1 / V
1/S
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0 0.005 0.01 0.015 0.02 0.025
V
S
A B
y = 4.508x + 0.016
R² = 0.978
0
0.02
0.040.06
0.08
0.1
0.12
0 0.005 0.01 0.015 0.02 0.025
S / V
S
y = -0.002x + 0.176
R² = 0.725
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0 20 40 60 80
V
V/S
C D
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81
Cuadro 14. Parámetros calculados para las curvas de Michaelis- Menten,
lineweaberburk, Eadi-Hoffsten y Agustinson para la naringinasa de A.niger
ATCC1015.
Cuadro 15. Parámetros de Vmax y Km para las curvas de Michaelis-Menten,
Lineweaber-Burk, Eadi-Hoffsten, Agustinson y Wilkinson para la naringinasa de A.
niger ATCC1015.
Michaelis-Menten Lineweaber-Burk Agustinson Eadi-Hoffsten
[s] mM V μg/min 1/[S] 1/V [S]/V S V/[S] V
1 65.2 1 0.01535 0.0153 1 65.36 65.2
1.3 69.5 0.769 0.014.4 0.0187 1.3 53.47 69.5
2.6 78.1 0.385 0.0128 0.33 2.6 30.04 78.1
5.26 11.3 0.190 0.0089 0.465 5.26 2.148 11.3
8 14.9 0.125 0.0067 0.537 8 1.8625 14.920 19.1 0.05 0.0053 1.047 20 0.955 19.1
Curva Vmax ( U/mg min)
Km (mM)
Michaelis-Menten 0.0158 0.0954
Lineweaverburk 13.24 1.6
Eadie-Hoffsten 18.46 7.21
Agustinson 14.64 2.1
Wilkinson* 17.63 3.3
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82
En el Cuadro 16 se presentan los valores para la Vmáx y Km determinadas para
A. niger y P. decumbens, así como los valores reportados por diferentes autores
para la naringinasa.
Cuadro 16. Constantes de Vmáx y Km para la naringinasa producida por
diferentes microorganismos.
Sustrato Vmáx Km
narignina (1) 17.63U/mg∙min 3.3mM
naringina (2) 2.92 8.4
naringina (3) 0.45µmol/mg∙min 0.1.22mMp-nitrofenol (4) 20.6 U/mg 2.9 mM
p-nitrofenol (5) 10.7 U /mg 1.52 mM
p-nitrofenol (6) 84U/mg 0.17mM
(1) Naringinasa de A. niger. Medio de cultivo adicionado con ramnosa como fuente
de carbono. Regulador de citratos 0.05M, pH=6, 35°C, [naringina]=0.00526mM.
U=1µmol de glucosa liberada / min (Método de Wilkinson).
(2) Naringinasa de P. decumbens (Sigma). Regulador de citratos 0.05M, pH=4.5,
35°C, [naringina]=0.00526mM. U=1µmol de glucosa liberada / min (Método de
Wilkinson).
(3) Naringinasa de Penicillium. Decumbens. Gülten y col, 2006. Fermentación
solida. Regulador de acetato de amonio 0.1 M, pH= 4, 40°C. U= 1 µmol de glucosa
liberado/ min. (Lineweaberburk).
(4) α-ramnosidasa de la naringinasa de A. niger .Manzanares y col, 1997.
Regulador MacIIvaine pH=4.5, 30°C.U= μmol de ramnosa liberados / min
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_________________________________________________ RESULTADOS Y DISCUCIÓN
83
(5) α-L-ramnosidasa de Penicillium sp Romero y col, 1985. Regulador de ácido.
succínico /succinato de sodio 50mM, pH=5.5, 30°C. U=cantidad de enzima
necesaria para liberar 1μmol p-nitrofenol/min.
(6) α-L-ramnosidasa de A. terreus, Gallego y col, 2001. Medio de cultivo
adicionado con ramnosa. Rregulador de succinato 50 mM, pH= 5.5, 50°C. U=
cantidad de enzima necesaria para liberar 1μmol p-nitrofenol/min. (Michaelis)
En este trabajo se encontró que los valores de Vmáx y Km para la naringinasa de
A. niger ATCC1015 (Cuadro16, No.1) coinciden con los encontrados para la
naringinasa de P. decumbens (Cuadro16, No.2), lo que significa que a pesar de
haber una aparente producción proteica baja para la naringinasa producida por A.
niger, las constantes resultaron ser del mismo orden que las encontradas para la
naringinaa de P. decmbens por lo cual los resultados obtenidos son
comparativamente buenos.
El valor de Vmáx reportados por Gallego y colaboradores en el 2001 (Cuadro 16,
No 6) para la α-L-ramnosidasa de A. terreus es menor comparada con el obtenido
en el presente trabajo (Cuadro 16, No. 1) sin embargo, la enzima obtenida
presenta una menor afinidad por el sustrato naringina ya que obtuvo una Km
mayor (Cuadro 16, No.1) quizá porque esta enzima no solo presenta la actividad
de α-L-ramnosidasa sino también la de β-glucosidasa.
Por otra parte el valor informado para la α-L-ramnosidasa de A. niger por
Manzanares y colaboradores en 1997 y el informado por Romero y colaboradores
en 1985 es menores que el encontrado en el presente trabajo mediante el método
de Wilkinson ya que este engloba de manera estadística a todos los demás.
El valor de Vmáx para la α-L-ramnosidasa de A. niger informado por Manzanares y
col. 1997 (Cuadro 16, No.4) es mayor a lo encontrado en el presente trabajo lo
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_________________________________________________ RESULTADOS Y DISCUCIÓN
84
que significa que la actividad enzimática de la enzima encontrada es menor
teniendo ambas actividades (α-L-ramnosidasa y β-D-glucosidasa).
Gülten y col. en el 2006 determinaron las constantes de actividad enzimática de la
naringinasa de P. decumbens a través del método de Linewaver-Burk,
encontrando una Km menor a la encontrada, lo que significa que dicha naringinasa
tiene más afinidad por el sustrato que la que tiene la naringinasa producida
(Cuadro 64, No.3).
Sin embargo todos los autores anteriormente mencionados determinaron la las
constantes de Vmáx y Km utilizando un sustrtos inespecíficos como el p-nitrofenol,
obteniendo los valores presentes en el Cuadro 16.
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___________________________________________________________ CONCLUSIONES
85
V. CONCLUSIONES
El presente trabajo nos permitió encontrar una cepa capaz de producir una enzima
con las características encontrada en una enzima comercial, por lo que usando
fuentes de carbono económicas se puede encontrar un nicho que a nivel comercialpuede ser más rentable.
La prueba presuntiva en cromatografía en capa fina mostró presuntivamente que
la cepa de Aspergillus niger ATCC 1015 es capaza de producir naringinasa.
Las diferentes fuentes de carbono y la concentración en la que se emplearon
produjeron naringinasa a partir de A. niger ATCC 1015 como respuesta por parte
del microorganismo a la presencia de compuestos orgánicos que pueden ser
asimilables a través de estas enzimas.
Cuando se adicionaron las sales de calcio y magnesio se encontró que un factor
determinante para el crecimiento del microorganismo es la concentración en la
que éstas se adicionan.
La fuente de carbono que favorece más el crecimiento del microorganismo es la
melaza y este crecimiento incrementa cuando se adiciona carbonato de calcio.
La mayor producción proteica se obtuvo cuando se empleó naringina como fuente
de carbono y ésta fue favorecida positivamente al adicionar la mezcla de sales.
La mayor actividad enzimática encontrada fue la de la enzima producida utilizando
el caldo nutritivo adicionado con ramnosa como fuente de carbono sin adición de
sales.
Por lo tanto las condiciones que favorecieron el crecimiento del hongo y la
producción de la proteína no fueron las ideales para favorecer la mayor actividad
enzimática de la naringinasa producida. De acuerdo a lo encontrado las
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___________________________________________________________ CONCLUSIONES
86
condiciones más adversas utilizadas en este estudio para el crecimiento del hongo
favorecieron la producción de enzima con mayor capacidad de hidrólisis de la
naringina. Lo que significa que no existe relación alguna entre el crecimiento del
hongo y la actividad enzimática de la enzima producida. A demás tampoco existe
relación alguna entre la producción proteica con respecto una mayor actividad
enzimática ni entre el crecimiento del microorganismo con respecto a la
producción proteica. Sin embargo en este trabajo si existió una relación entre la
actividad enzimática y la adquisición de nutrientes por parte del microorganismo.
Debido a que la naturaleza de A. niger es producir acido cítrico, la tendencia
natural del medio de cultivo tiende a ser acida, quizás controlando estas
condiciones puede mejorarse la producción enzimática y la actividad de esta y
esto puede lograrse haciendo un escalamiento de dicha producción a
fermentadores controlados ya que con una aeración controlada y vigorosa puede
inhibirse la producción de acido cítrico por este hongo y favorezca la producción
de naringina. Además el proceso podría ser optimizado ya que existen
investigaciones que suguieren que la adición de fuentes de carbono en diferentes
etapas podría proveer mejores resultados en cuanto a la actividad enzimática de la
naringinasa que se produce utilizando A. niger .
Finalmente mediante este estudio no es posible esclarecer la relación entre la
concentración enzimática y la degradación del sustrato, enigma que también
permanece poco entendible en la literatura.
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_________________________________________________________________ ANEXOS
98
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0 200 400 600 800 1000 1200
A b s ( n
m )
microgramos de proteína /ml
ANEXOS
Anexo 1. Curva tipo de proteína obtenida por el método de Bradford.
Figura 1A. Curva tipo de proteína donde Y=5.78x + 0.1408; R2=0.9579.
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_________________________________________________________________ ANEXOS
99
Anexo 2. Estudio y determinación de la actividad enzimática de la naringinasa
comercial de Penicillium decumbens.
2a.1. Estudio del efecto de la concentración de la naringinasa de P. decumbens en
la velocidad de hidrólisis de la naringina.
El efecto de la concentración de la naringinasa de P. decumbens sobre la hidrólisis
de naringina (Figura 2A; Cuadro 1A) se observa como el aumento de la
concentración de enzima adicionada. Esta se refleja en un incremento en la
concentración de azucares reductores en un mismo tiempo, la concentración
elegida en base a este experimento para montar la curva tipo de naringina fue de50 μg/ml. A demás también se observó que el tiempo de incubación empleado (15
minutos) provee una medida excesiva del grado de hidrólisis.
Cuadro 1A. Efecto de la concentración en la velocidad de hidrólisis de la
naringinasa de P. decumbens.
Concentraciónμg/ml
UK
10 0
30 22.33
50 111.33
75 140
100 240
125 248.66
150 263.33
200 269
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_________________________________________________________________ ANEXOS
100
Figura 2A. Efecto de la concentración de la naringinasa de P. decumbens en la
hidrólisis de la naringina.
0
50
100
150
200
250
300
0 50 100 150 200 250
U K
microgramos glucosa /mililitro de hidrolizado
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_________________________________________________________________ ANEXOS
101
2a.2 Estudio del efecto del tiempo en la velocidad de hidrólisis de la naringina por
la naringinasa de Penicillium decumbens.
Del estudio anterior se seleccionó la concentración de naringinasa de 50 μg/ml a
la cual se observó claramente la hidrólisis de la naringina. Esta concentración fue
elegida para determinar el efecto del tiempo en la velocidad de hidrólisis de la
naringina por la naringinasa de P. decumbens. Dicha concentración se mantuvo
constante durante todo el experimento.
El objetivo de realizar el experimento de efecto del tiempo en la velocidad de
hidrolisis de la naringina fue encontrar un tiempo adecuado al cual se llevara a
cabo la hidrólisis de la naringina de manera que fuera suficiente pero no excesiva,
para evitar subestimar o sobrestimar los resultados. En la curva de efecto del
tiempo en la velocidad de hidrólisis (Figura 3A; Cuadro 2A) se observa que a
mayor tiempo de incubación es mayor el grado de hidrólisis, y que un tiempo
adecuado para montar la curva tipo de naringinasa es de 10 minutos.
Cuadro 2A. Efecto del tiempo en la velocidad de hidrólisis de la naringina por la
naringinasa de P. decumbens.
Tiempomin
UK
5 278.66
10 335.33
20 370.66
30 426.66
40 66050 926.66
60 1060
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_________________________________________________________________ ANEXOS
102
Figura 3A. Efecto del tiempo en la velocidad de hidrólisis de la naringina por la
naringinasa de P. decumbens.
0
200
400
600
800
1000
1200
0 10 20 30 40 50 60 70
U K
Tiempo en minutos
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_________________________________________________________________ ANEXOS
103
Anexo 3. Curva tipo de naringina.
Para el montaje de la curva tipo de naringina, una vez conocidos tanto la
concentración de naringinasa a emplear (50 μg/ml) y el tiempo de hidrólisis más
adecuado para observar tal efecto (10 min), se preparó una solución de
naringinasa en concentración de 50 μg/ml en regulador de citratos 0.005 mM pH
4.5. La concentración de la naringina empleada fue de 0.005 M y se utilizaron los
siguientes volúmenes: 0.05, 0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1, 1.2, 1.4, 1.6 y 1.8 ml.
Transcurrido el tiempo de incubación la reacción fue detenida agregando 4 ml de
DNS y los tubos fueron puestos a ebullición durante 5 minutos, una vez fríos se
llevo a cabo la lectura a 540 nm en un fotocolorímetro con filtro verde (Figura 4A).
Los resultados se muestran en el Cuadro 3A.
Cuadro 3A. Curva tipo de naringina.
Naringina
0.0005 M
(ml)
UK
promedio
μg de glucosa
producida/ml de
naringina hidrolizada
0.05 83 110.273
0.1 109 155.293
0.2 136 200.462
0.4 155 232.996
0.6 178 272.380
0.8 197 304.332
1 219 344.948
1.2 240 381.155
1.4 260 415.637
1.6 283 455.293
1.7 294 474.258
1.8 305 510.465
1.9 316 512.189
7/21/2019 EFECTO FUENTE CARBONO
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_________________________________________________________________ ANEXOS
104
Figura 4A. Curva tipo de naringina, Y= 129.22+ 80.535, R2= 0.921.
0
50
100
150
200
250
300
350
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8 2
U K
microgramos de glucosa producida/ml de naringina hidrolizada
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_________________________________________________________________ ANEXOS
105
Anexo 4. Curva tipo de glucosa.
Figura 5A. Curva tipo de Azúcares reductores obtenida por el método del ácido
3,5-dinitro salicílico (DNS) donde Y=0.6456x - 2.2889; R2=0.987.
0
100
200
300
400
500
600
700
0 200 400 600 800 1000 1200
U K d e g
l u c o s a
microgramos de glucosa /ml
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_________________________________________________________________ ANEXOS
106
Anexo 5. Determinación de las constantes de Vmáx y Km para la naringinasa de
P. decumbens por los métodos gráficos de Michaelis-Menten, Lineweaber-Burk,
Eadie-Hofsteen, Agustinson y Wilkinson.
Cuadro 4A. Parámetros Michaelis-Menten, Lineweaber-Burk, Eadie-Hofsteen y
Agustinson para la naringinasa de P. decumbens.
Michaelis-Menten Lineweaber-Burk Agustinson Eadie-Hofsteen
[s] mM V μg/min 1/[S] 1/V [S]/V S V V/[S]
1.51 132.2 0.66 0.00358 0.0054 1.5 309 154.5
2 154 0.5 0.00324 0.0065 2 357 142.8
0.5 214.4 0.4 0.0028 0.007 2.5 385 128.33
1 244 0.33 0.0026 0.0078 3 424 121.1
1.5 279.5 0.29 0.00236 0.0083 3.5 465 116.3
2 309 0.25 0.00215 0.0086 4 --
2.5 357 -- -- -- -- --
3 385 -- -- -- -- --
3.5 424 -- -- -- -- --
4 465 -- -- -- -- --
4.5 540 -- -- -- -- --
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_________________________________________________________________ ANEXOS
107
Cuadro 5A. Parámetros de Vmáx y Km para las curvas de Michaelis- Menten,
Lineweaber-Burk, Eadie-Hofsteen, Agustinson y Wilkinson para la naringinasa de
P. decumbens.
Curva Vmax Km
Lineweaver-Burk 3.968 2.5
Eadie-Hofsteen 4.379 4.8
Agustinson 4.88 3.7
Wilkinson 2.92 8.4
La Vmáx esta expresada en U/mg proteína donde una U = cantidad de enzima
para liberar 1μmol de glucosa/ min.
7/21/2019 EFECTO FUENTE CARBONO
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_________________________________________________________________ ANEXOS
108
Figura 6A. Curva de Michaelis –Menten para naringinasa de Penicillium
decumbens donde Y= 83.256x+145.42; R2
=0.9842.
0
100
200
300
400
500
600
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5
μ g / m
i n
mM
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_________________________________________________________________ ANEXOS
109
Figura 7A. Curva de Lineweaber-Burk para naringinasa de Penicillium decumbens
Y= 0.0035x+0.0014; R2=0.9722.
0
0.0005
0.001
0.0015
0.002
0.0025
0.003
0.0035
0.004
0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 0.45 0.5 0.55 0.6 0.65 0.7
m
i
n
mM
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_________________________________________________________________ ANEXOS
110
Figura 8A. Curva de Eadie-Hofsteen para naringinasa de Penicillium
decumbens.
y = -3.703x + 879.0R² = 0.949
250
300
350
400
450
500
110 115 120 125 130 135 140 145 150 155 160
μ g / m
i n
μg/min•mM
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_________________________________________________________________ ANEXOS
y = 0.001x + 0.004R² = 0.978
0.0055
0.006
0.0065
0.007
0.0075
0.008
0.0085
0.009
m M