Electroforesis Electroforesis Bidimensional Bidimensional
de proteínasde proteínas
Lucía Monteoliva Díaz
Separación de proteínas
• ELECTROFORESIS: 1D, 2D
• ALTERNATIVAS A LA 2D: CROMATOGRAFÍAMULTIDIMENSIONAL Y ELECTROFORESIS CAPILAR
Análisis proteico
Electroforesis (transporte bajo la acción de un campo eléctrico)
-Herramienta analítica indispensable, útil para:
separar y comparar mezclas proteicas evaluar pureza de una proteínaestimar cantidad de una proteínadetectar proteolisisdetectar modificaciones proteicasestimar características físicas de una proteína
- Geles de muy diversos tamaños y naturaleza
ELECTROFORESIS MONODIMENSIONAL EN CONDICIONES DESNATURALIZANTES
(SDS-PAGE)
• Fácil de realizar
• Reproducible
• Resuelve proteínas de 10-300 kDa de masa molecular
• CARACTERIZACIÓN DE PROTEÍNAS DESPUÉS DE UNA PURIFICACIÓN. COMPLEJOS PROTEICOS
Electroforesis bidimensional en la separación de proteínas
• Klose, 1975. Protein mapping by combined isoelectric focusing and electrophoresis of mouse tissues. A novel approach to testing for induced point mutations in mammals. Humangenetik 26(3), 231-243.
• O´Farrell, 1975. High Resolution Two-dimensional Electrophoresis of proteins. The Journal of Biological Chemistry 250, 4007-4021
• Anderson and Anderson, 1982. The human protein index. Clinical Chemistry, 28, 739–748.
Fundamentos bioquímicosde la primera dimensión
LAS PROTEÍNAS SON MOLÉCULAS ANFOTÉRICAS:
carga neta suma de las cargas de los AA de las cadenas
laterales y de los extremos –NH2 y –COOH
La carga de los aa de las cadenas laterales cambia dependiendo del pH del medio
PH ÁCIDO PH BÁSICO
GRUPOS CARBOXILOGRUPOS AMINO (+)
GRUPOS CARBOXILO (-)GRUPOS AMINO
• En un gradiente de pH y bajo la influencia de un campo eléctrico las proteínas se mueven hasta la zona donde la carga neta es 0
pI
Fundamentos bioquímicosde la primera dimensión
Gradiente de pH
La capacidad de resolución depende de: -formación de un gradiente de pH adecuado-fuerza del campo eléctrico
Gradientes de pH inmovilizados:
Inmovilinas “Tiras de IPG”
Campo eléctrico:
Voltajes muy elevados (8000)
Voltios-hora (Vh)
2.5 4 5 6 7 11109 128
Immobilized pH Gradients (IPGs)
3
wide gradients
‚standard‘ gradients
basic extremeacidic extreme
zoom-in gradients
3-10L, NL
AGENTES REDUCTORES: DTT, TBPAGENTES CAOTRÓPICOS: UREA,TIOUREADETERGENTES: no iónicos o zwiteriónicos: CHAPS, NP-40ANFOLITOS: aumentan conductividad de la muestra
Solubilización de la muestra
Las muestras son desnaturalizadas y completamente solubilizadas para una óptima separación.
IPGTMphor IEF unit
1. Step 300 V 3 h
3. Gradient 1 000 V 3 h
4. Gradient 8 000 V 3 h
5. Step 8 000 V 4 h
6. Step 500 V
Voltios hora
EQUILIBRADO DE LA TIRA
Tris, pH adecuado para electroforesis
urea: desnaturaliza
SDS: desnaturaliza y carga negativamente
1 REDUCCIÓN DE PUENTES DISULFURO
DTT
2. ALQILACIÓN
Iodoacetamida: (alquila los –SH para evitar reoxidaciones)
Fundamentos bioquímicos de la segunda dimensión:
SDS-PAGEProteínas + SDS+ Ag. REDUCTOR
SEPARACIÓN EN FUNCIÓN DE SU PM
Aplicación de un campo eléctrico
TODAS LAS PROTEÍNAS IGUAL
CARGA
1 Muestra2 Separación y detección 3 Análisis de imagen4 Escisión y digestión 5 Identificación
4
2
5
3
1
1000 1500 2000
Mass (m/z)
Proteómica Clásica: Diseño Experimental
1 Muestra2 Separación y detección 3 Análisis de imagen4 Escisión y digestión 5 Identificación
4
2
5
3
1
1000 1500 2000
Mass (m/z)
Proteómica Clásica: Diseño Experimental
Preparación de la muestra
ELECCIÓN
Tipo de muestra
Extracto totalFracción o compartimiento celular
Condiciones a estudiar
Condiciones “estándar”:Mapa de referencia
Distintasvariaciones
Complejosproteicos
Elección de muestra adecuada
Condiciones de crecimiento
Genotipo Tipo de célula
FármacosEnfermedadMedio de cultivo
Edad
Interacciones
FENOTIPO PROTEÓMICO: • fenotipo que puede ser observado con métodos proteómicos• Determinado por: GENOTIPO+AMBIENTE
1 ORGANISMO= INFINITOS PROTEOMAS
Preparación de la muestra
• Rotura celular• Precipitación de proteínas• Solubilización• Protección frente a proteasas• Eliminación de :
–Ácidos nucleicos–Lípidos–Sales–Material insoluble
• Fraccionamiento. Proteomas y subproteomas
AGENTES REDUCTORES: DTT, TBPAGENTES CAOTRÓPICOS: UREA,TIOUREADETERGENTES: no iónicos o zwiteriónicos: CHAPS, NP-40ANFOLITOS: aumentan conductividad de la muestra
Solubilización de la muestra
Las muestras son desnaturalizadas y completamente solubilizadas para una óptima separación.
Eliminación de componentesno proteicos
Digestión con nucleasasSonicación
POLISACÁRIDOS, Ac. Nucleicos, Lípidos:VISCOSIDAD DE LA MUESTRA
Precipitación de la muestra
Lisado de E. coliExtracto de E. coli precipitado con
TCA/acetone y resuspendido
Anderson, N. L. (2003) Mol. Cell. Proteomics 2: 50
Reference intervals for 70 protein analytes in plasma
Complejidad de la célula eucariota
Rangos muy variables de concentraciones de las distintas proteínas en
una muestra compleja
Fraccionamiento:1. Subproteomas2. Distintos rangos de pH
2.5 4 5 6 7 11109 128
Immobilized pH Gradients (IPGs)
3
wide gradients
‚standard‘ gradients
basic extremeacidic extreme
zoom-in gradients
3-10L, NL
∑ 1491
∑ 1564
∑ 218 ∑ 1429
IPG 4 - 5
IPG 4 - 7
IPG 5 - 6 IPG 5,5 - 6,7
ResoluciónResoluciónYeast
Wildgruber et al., 2000. Electrophoresis
Visualización de las proteínas
• Tinción con Azul de Coomassie (100ng-1µg)
• Tinción con plata (1-10ng)
• Compuestos fluorescentes:
– SYPRO-RED,
– SYPRO-RUBY (1-10ng)
• Autorradiografía de proteínas marcadas
• Fluorocromos: DIGE
• Transferencia a membrana:
– Ab
– Tinciones
•Tinción de Plata amoniacal
•Sypro Ruby
Detección de ProteínasVENTAJAS DESVENTAJAS
NITRATO DE PLATA
Muy sensibleMétodo de elección
Proteínas no se tiñenImpurezas impiden tinciónPoco rango dinámico lineal (fácil saturación)
AZUL DE COOMASIE Fácil de realizar No es muy sensible
SYPRO-RUBY RápidoMuy sensible
Muy caro
ISÓTOPOS RADIACTIVOS Muy sensible Trabajar con
radiactivos
DIGE: aumenta rango dinámico
Densitómetroreflectancia y transmitancia
“Fluor-S / Fluor-S MaxMultiImager”
CCD Based UV / Visible, Fluorescence& Chemiluminescence
Sistemas de adquisición de imágenes
Melanie, PDQuest, ImageMaster Platinium software programs
ANÁLISIS DE IMAGEN
Proteómica de expresión: Cuantificación y comparación
Análisis de imagen
Adquisición
Gel: transmitanciaMembrana: reflectancia
SOFTWAREAnálisis de imagen
Etiquetado de las proteínas (mapas de referencia)
Detección y cuantificación de manchas
Comparaciones de geles (entre si, con bases de datos)
•Almacenamiento•Selección de proteínas:
identificación
pI 4.5
2
7 811
1314 15
16
171819 23
25 26 27293031 32
3344
4652
5354
5643
5067 69
80
81
88
87 9192
9382
83
62 63
667576
36 3734 40
2824
59
7164
22
41
21
5.5
MW
Resultados obtenidos
Ventajas de la 2D-PAGE
• REPRODUCIBILIDAD
Establecer mapas de referencia
Detección de cambios de proteoma
Bases de datos de mapas
• MAXIMA CAPACIDAD DE CARGA
Procesos de identificación
En electroforesis preparativa
• RESOLUCIÓN
Detección máximo número de manchas
Diferenciación y visualización de distintas
formas de una misma proteínas