Enzimas en Suero I y II
1) Dr. Jos G. Castao
Objetivos
Describir y manejar los parmetros fundamentales que definen la actividadenzimtica.
Mtodos de medicin de enzimas como catalizadores y como protenas.
Principales enzimas y utilidad clnica: Transaminasas, Fosfatasas, Creatina kinasa, troponinas, amilasa, GGT y PSA
Enzimas- Catalizadores biolgicos Catalizadores
aumentan velocidad de reacciones qumicas
un catalizador no se consume y convierte varias molculas de sustrato
La concentracin final de sustratos y productos se rige por la ley de equilibrio qumico
Enzimas Mayor parte protenas,
algunas RNAs Aumenta velocidad de
106 a 1012
Condiciones de reaccin suaves
Especificidad Regulacin
Propiedades de los Enzimas Reacciones qumicas - rotura, formacin y
reordenamiento de enlaces qumicos Especificidad
Dictada por el sitio activo del enzima Algunos sitios activos permiten la entrada de varios
sustratos Cofactores
Las cadenas laterales de los aminocidos de lasprotenas tienen un pequeo repertorio de gruposactivos Necesidad de cofactores.
Cofactores: Derivados de vitaminas, metales (Fe, Ca, Mg, Mn) pueden unirse como co-substratos o estar unidos al enzima de forma covalente (grupo prosttico) y permanecer unidos al enzima en multiples ciclos catalticos
Nomenclatura de Enzimas
Oxidoreductasas (EC Clase 1) Transferencia electrones (RedOx)
Transferasas (EC Class 2) Transferencia grupos funcionales entre moleculas
Hidrolasas (EC Class 3) Rompen enlaces por entrada de H2O
Liasas (EC Class 4) Reacciones de eliminacin para formar dobles enlaces
Isomerasas (EC Class 5) Reordenamiento de enlaces intramolecularmente
Ligasas (EC Class 6) Unen dos molculas con nuevos enlaces
Base de datos de enzimashttp://www.expasy.ch/enzyme
Ejemplo ID 2.3.1.43 DE Phosphatidylcholine--sterol O-acyltransferase. AN Lecithin--cholesterol acyltransferase. AN LCAT. AN Phospholipid--cholesterol acyltransferase. CA Phosphatidylcholine + sterol = sterol ester + CA 1-acylglycerophosphocholine. CC -!- Palmitoyl, oleoyl, and linoleoyl can be transferred; a number of CC sterols, including cholesterol, can act as acceptor. CC -!- The bacterial enzyme also catalyses the reactions of EC 3.1.1.4 and CC EC 3.1.1.5. DI Norum disease; MIM:245900. DI Fish-eye disease; MIM:136120. PR PROSITE; PDOC00110; DR BRENDA; 2.3.1.43. DR EMP/PUMA; 2.3.1.43. DR WIT; 2.3.1.43. DR KYOTO UNIVERSITY LIGAND CHEMICAL DATABASE; 2.3.1.43. DR P10480, GCAT_AERHY; P53760, LCAT_CHICK; P04180, LCAT_HUMAN; DR P16301, LCAT_MOUSE; Q08758, LCAT_PAPAN; P30930, LCAT_PIG ; DR P53761, LCAT_RABIT; P18424, LCAT_RAT ; //
http://www3.ncbi.nlm.nih.gov/htbin-post/Omim/dispmim?245900http://www3.ncbi.nlm.nih.gov/htbin-post/Omim/dispmim?136120http://srs.ebi.ac.uk/srs5bin/cgi-bin/wgetz?-e+[BRENDA-ECNumber:'2.3.1.43']http://www.genome.ad.jp/dbget-bin/www_bget?ec:2.3.1.43
Concepto de IsozimasIsozimas son dos o ms formas de un enzima
que catalizan la misma reaccin qumicapero tienen distinta secuencia primaria.
Por tanto codificada por distintos genes
FormacinFormacin de unde un complejo enzimacomplejo enzima--sustrato sustrato eses el primer el primer paso paso de la de la catlisiscatlisis
Sustrato Sustrato se se une une al al enzima enzima en elen el sitio activositio activo..
A A cantidadcantidad de de enzimaenzima fijafija, la , la velocidadvelocidad de de la la reacinreacin aumentaaumenta con la con la concentracinconcentracin de de sustratosustrato hastahasta queque se se alcanzaalcanza la la velocidadvelocidadmximamxima de la de la reaccinreaccin..
Sitio activo
Sustrato+
Enzima Complejo ES
Llave cerraduraLlave cerradura -- Emil Fischer (1890)Emil Fischer (1890)
Enzima
Sustrato
+
Complejo ES
Ajuste inducidoAjuste inducido -- Daniel E. Daniel E. Koshland JrKoshland Jr. (1958). (1958)
Velocidad de reaccin en funcin cantidad de sustrato
[[SustratoSustrato]]
Vel
ocid
ad re
acci
nV
eloc
idad
reac
cin
(V)
(V) V max
Velocidad: nmero de moles convertidos por unidad de tiempo
Concepto de VMAX y KM de una reaccin enzimtica
[[SustratoSustrato]]
Vel
ocid
ad
Vel
ocid
ad d
e de re
acci
nre
acci
n(V
)(V
)
KKMM
VVMAXMAX
VVMAXMAX22
Ensayo de actividad: Cuantaenzima est presente?
Usar: pH ptimo, temperatura ptima, etc Cantidades saturantes de sustrato y cofactores[Sustrato] = 10 x Km
[P]
Tiempo
[E] = 2x
[E] = 1x
Linearidad con el tiempo de reaccin
Vo
[E]
[S] >>>>> Km
Linearidad con la cantidad deenzima
Curvas de progreso de la reaccin enzimtica
Aparicin de producto Desaparicin de sustrato
LagV inicial
Parada
Parada
Lag
V inicial
[P] [S]
Tiempo Tiempo
Velocidad inicial se considera cuando se ha consumido < 10% del sustrato
Medicin de actividadenzimtica
LagV inicialP/t
V inicialP/t
Tiempo
[P]
Lag
ParadaMedicin mltiple y continua
Medicin 2 puntos
Parada
[P]
Tiempo
Medicin de actividadenzimtica: mtodos directos y acoplados
LDHPiruvato + NADH Lactato + NADDirecto Desaparicin de
absorbancia de NADHa 340 nm
E1 Creatina +ATP Creatina- P + ADPCKAcoplado
E2 ADP + PEP Piruvato + ATPPKDesaparicin deabsorbancia de NADHa 340 nm
E3 Piruvato + NADH Lactato + NADLDH
E2= 5X E1; E3= 10 X E1. Concentraciones saturantes de sustratos:Creatina, ATP, PEP, NADH
Medicin de enzimas como protenas Un defecto enzimtico es una disminucin en la
actividad de un enzima. Esto puede ser debido.
Tipo I: Cantidad reducida, pero la actividadespecfica* es normal
Tipo II: Cantidad es normal, pero la actividad especfica* est reducida debido a un defecto en elenzima.
*actividad especfica = actividad enzimtica (moles/min) pormg de protena
Enzimas como Protenas(Ensayo enzimtico vs. Ensayo inmunolgico)
Los enzimas se siguen ensayando por su actividad enzimtica: desaparicin de sustrato o aparicin de producto. ES UNA AMPLIFICACION BASADA EN LA REACCION ENZIMATICA.
Tcnicas inmunolgicas permiten medir la cantidad de enzima como protena (independiente de su actividad): ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) - La deteccin de
cualquier enzima por medio de anticuerpos especficos contra esa protena
Western blot (Deteccin de enzimas por anticuerpos especficos) -Nos da el peso molecular y la carga (IEF) -> isozimas
RIA (radioinmunoensayo)
Western blot e Inmunoblot
Protenas se obtienen de suero ( o de clulas) , y se preparan en soluccin para cargar en los pocillos de un gel de protenas (en condiciones nativas; o desnaturalizadascon detergentes, i.e. SDS). Se corre el gel y tras la electroforesis las protenas separadas se transfieren a una membrana (nitrocelulosa, PVDF, etc). La membrana se bloquea los sitios inespecficos y se aade anticuerpos contra la protena que queramos detectar (anticuerpoprimario). Se lava el exceso de anticuerpo no unido. Se incuba la membrana con un anticuerpo anti- anticuerpo primario que lleve unido covalentemente una enzima quepermita detectar posteriormente donde se ha unido. Se revela el Iblot con los sustratos adecuados que darn lugar a la formacin de color o a la emisin de luz (quimioluminiscencia)
Western e Inmunoblot
Transferenciaa membranade NC, PVDF
Revelado conAnticuerpo secundario
Inmunoblot Revelado : quimio-luminiscencia y precipitado con color
Ag
10Ab
20AbEnzima:
LuminolLuz Placa deRayos X
Membrana
BCIP, NBT Color azul
peroxidasa
Fosfatasa alcalina
Resultados de un inmunoblot
Reaccin de Ag y anticuerpo
Enzimas en suero tiles en diagnstico clnico
carcinoma de prostataProstataProstate specific antigen(PSA)
Enfermedad hepatobiliarHgado y Rin-glutamiltranspeptidasa
Muy inespecficaVarios tejidosLDH
Infarto Miocardio, msculoCorazn, Msculo y cerebroCreatina Kinasa* (CK)
Enfermedades pancreticasGlandulas salivares, PANCREASAmilasa*Remodelacin huesoHgado, huesoFosfatasa alcalina*
Infarto Miocardio, hgado, msculo
Corazn, Hgado, msculo, rin
Aspartato transaminasa(AST)
Dao o enfermedad heptica
Hgado >> RinAlanina transaminasa(ALT)
Aplicacin clnicaFuente principalEnzima
* isozimas especficas de tejido
Transaminasas
L-Asp + -cetoglutarato Oxalacetato + L-glutamatoAST
(GOT)
Cofactor: Piridoxal fosfato
L-Ala + -cetoglutarato Piruvato + L-glutamatoALT
(GPT)
Especificidad de tejidos de AST y ALT
Heart
Liver
Sk.Mus
cleKid
ney
Pancrea
sSpl
een Lung
RBCs
0
2000
4000
6000
8000
10000Aspartato transaminasa (AST)Alanina transaminasa (ALT)* * *
**
*
*
*
Con
cent
raci
n re
lativ
a su
ero
Transaminasas
AST sube en suero: Infarto de miocardio10 a 100 X Hepatitis viral
Necrosis hepticaShock, hipoxia
AST sube en suero: Cirrosis hepticaModerado 2 X- 5X Ictericia colestsica
Metastsis hepticaEnf. Musculoesquelticas
ALT sube en sueroAfectacn hepticaen paralelo a AST
LDH: lactato deshidrogenasaLDHPiruvato + NADH Lactato + NAD
Elevacin en suero es muy inespecfica. Sube: Infarto miocardio. Insuficiencia cardaca. Anemia Megaloblastica. Hepatitis. Cncer metastasis. Traumatismos musculares. Distrofias musculares
Varias isozimas: H Heart, M Muscle. LDH X: testculo
LD-5 LD-4 LD-3 LD-2 LD-1- +M4 H4Punto de aplicacin
Gamma Beta Alfa II Alfa I Alb
Electroforesis de sueroIsozimas LDH
Creatina Kinasa: Creatina (FosFo)KinasaCreatina +ATP Creatina- P + ADPCK
Muy abundante en msculo esqueltico y cardaco, cerebro, estmagoPoco abundante en hgado
BB B
B
1
2
3
14q32
19q13
Cerebro
Corazn
Msculo
Isozimas: es un dmero de B y M. Combinaciones
CK isozimas actividades en diversas patologas
1.515971986Duchenne portador(hembra)
39673 10521725Distrofia muscular de Duchenne (varn)
111781338(11x)
1556Infarto miocardio hasta 24h
0.32345347Pacientes inyeccin intramuscular
2.35.9124131Pacientes hospital no cardacos
CK-2 (MB)
CK-3 (MM)
ActividadTotal
% CK-2Creatina Kinasa Actividad (Units/L)Condicin clnica
(7.8X-crnico)
(30x -temp)
(2.7x -temp)
Creatina kinasa isozimas en elInfarto de Miocardio
IM
MM
normal
MM
MB
MB
-Gamma Beta Alfa II Alfa I Alb
CKMM CKMB CKBB +
95 %
5 %
Cambios en suero: Infarto de Miocardio
Das despus del infarto
Mul
tiplo
s de
l lim
ite e
stab
leci
do
0 1 2 3 4 5 6 7 8
Mioglobina
Troponina cardiaca
Creatina kinasa-MB
Troponina Cardaca con angina inestable
0
1
2
5
10
20
50
Limite de decisin AMILimite superior de normalidad
Troponinas cardacas
Troponinas T e I son parte de la unidad motora del msculo y regulan la interaccin de actina con miosina.
Hay isozimas de Troponina T e Iespecficas cardacas que pueden detectarse con tcnicas inmunolgicas muysensibles.
Curvas ROC para TnT y TnI en el diagnstico de Infarto de Miocardio
Fosfatasa alcalina ALP (FA)Es una glicoprotena de 74-92 kDa
H2O + R-O-P-O- R-OH +H2PO4
OH
O-
pH >9.0
ALP
Funcin ? Aumento absorcin y excrecin
Tejidos: Hgado: Hepatocitos y Canalculos biliaresHueso: Osteoblastos (calcificacinIntestino, rin: Membrana plasmticaPlacenta
Fosfatasa alcalina: Isozimas- Gamma Beta Alfa II Alfa I Alb +
Isozimas ALP1: Biliar o renal2: Heptica3: Osea4: Placentaria5: Intestinal
5 3 2
3 2
Normal
Normal
3 2Nios
3 24Embarazo
5 3 2 1Colestasis
La fosfatasa alcalina por ser una protena secretada est glicosilada
Asialoglicoproteinas son reconocidas por receptores deasialoglicoproteinas y eliminadas por la bilis heptica
Las protenas del suero y extracelulares estn glicosiladascon acido silico (cido N-acetilneuraminico) como unidadterminal. Las protenas intracelulares no estn glicosiladas
SueroTejidosFragmentos
BilisHgado
influye en la vida media: ALP intestinal minutosALP heptica 7 das
El tratamiento de suero con neuroaminidasa(elimina cido sialico) y permite diferenciar isozimas de ALP.
Neuraminidasa
+
-Ambas isozimas
ALPhgado
ALPsea
Fosfatasa alcalina en Clnica
Aumento de Actividad Total en suero: Enfermedades seas: Hiperparatiroidismo (con
deficit de Calcio), Enfermedad de Paget, Tumores seos, Osteomalacia y Raquitismo, Fracturas seas
Enfermedades hepticas: Ictericia obstructiva extraheptica. Cncer o tumor heptico. Colestasis intraheptica. Hepatitis infecciosa. Cirrosis alcoholica
Adolescentes y nios: est elevada 2 a 3 veces. Crecimiento seo
Fosfatasa alcalina en Clnica
Aumento de ALP por isozimas Isozima seo: Enfermedades seas antes mencionadas.
Infarto Pulmonar. Insuficencia renal crnica. Isozima placentario: Embarazo durante el tercer
trimestre Isozima intestinal: Alteraciones del Intestino delgado.
Individuos con grupo sanguneo B u O Isozima heptico: las antes mencionadas. Pancreatitis
aguda o crnica. Insuficiencia cardaca congestiva. Cirrosis
Isozimas no identificadas (Regan o Nagao): en diversos tumores: cancer pulmonar, mama, ovario y colon
Alfa-AmilasaHidroliza enlaces glicosdicos alfa 1-4 de almidn, glucgenoy otros polisacridos. No hidroliza celulosa (beta 1-4),ni ramificaciones alfa 1-6. Dando lugar a glucosa, maltosa etc
Ca 2+GlucosaMaltosa
NOAmilasa
Tejidos e isozimas: glndulas salivares: isozima S (S1, S2, S3).Est tambin presente en: pulmn, hueso, ovario y tiroides
pncreas: isozima P (P1, P2, P3 muy poco)cuello uterino y trompas, epitelio intestinal yeyuno
Alfa-Amilasa. Significado clnicoSe eleva en suero especialmente en la pancreatitis agudaOtras causas de elevacin en suero:
lcera perforadaoclusin intestinalapendicitis agudaRotura de Embarazo ectpicoAdenocarcinoma pulmonar, ovario o pncreas
Hay una hiperamilasemia no patolgica en el 1-2% de los individuos. Se debe a la unin de amilasa a IgG o IgA circulantes.Este complejo es demasiado grande para ser filtrado por elrin y por eso se da la hiperamilasemia. No tiene significadopatolgico
GGT: -Glutamiltransferasa(-Glutamiltranspeptidasa)
-glutamylcysteinylglycine (glu-cys-gly) Glutation-GGT transfiere el -glutamilo a otro aminocido. Es un enzimamicrosomal que se induce por consumo de alcohol, fenobarbital, etc
glu-cys-gly
glu-cys-gly
S
S
(GSSG)
glu-cys-gly
SH
(GSH)
R-O-OH R-OH
Glutationperoxidasa
A.A
glu- AA
Cys-Gly
-GGT
El enzima del sueroes de origen hepticofundamentalmente
GGT: -GlutamiltransferasaIsozimas- Gamma Beta Alfa II Alfa I Alb +
4 2
4 2
Normal
Normal 3
4 2Hepatitis alcohlica 3
Elevacin de -GGT en suero:Cancer heptico primario X 10-20Metstasis heptica X10-15Cirrosis biliar primaria X10-15Hepatitis crnica activa X 7Colestasis intraheptica X6Colestasis extraheptica X 5Hepatitis alcoholica X4Vigilancia del consumo de alcohol
4 25Colestasispor drogas
5 4 2 1Cncer heptico
Fosfatasa cida ACP
H2O + R-O-P-O- R-OH +H2PO4
OH
O-
pH < 5.0
ACP
Funcin ?
Tejidos: Prostata 1000 veces superior a resto tejidosHgado: Hepatocitos y Canalculos biliaresHueso: Osteoclastos (descalcificacin)RinPlaquetas
ACP. Elevada en el cncer de prstata. Muy inespecfica.En la actualidad no se utiliza
PSA (Prostate Specific Antigen).PSA es una proteasa similar a la quimiotripsina (familia de la Kalikrena)producido por el epitelio prosttico, y muy abundante en el fludo seminal. PSA se detecta en la mayor parte de los pacientes con cncerde prstata. En el suero se encuentra formando un complejo con el inhibidor de proteasas alfa-1-antiquimiotripsina (ACT). En el cncerde prstata un alto porcentaje de PSA se encuentra unido a ACT, ms queen la hiperplasia prosttica. Se determina por tcnicas inmunolgicascon anticuerpos especficos. Sus niveles disminuyen con la desaparicin delcncer de prstata, se utiliza para el seguimiento del tratamiento.
Rango de PSA normales varan con la edad: ng/ml40 - 49 0.0 - 2.550 - 59 0.0 - 3.560 - 69 0.0 - 4.570 - 79 0.0 - 6.5
Enzimas en Suero I y IIObjetivosEnzimas- Catalizadores biolgicosPropiedades de los EnzimasNomenclatura de EnzimasBase de datos de enzimas http://www.expasy.ch/enzymeEjemploConcepto de IsozimasFormacin de un complejo enzima-sustrato es el primer paso de la catlisisSitio activoVelocidad de reaccin en funcin cantidad de sustratoConcepto de VMAX y KM de una reaccin enzimticaEnsayo de actividad: Cuanta enzima est presente?Curvas de progreso de la reaccin enzimticaMedicin de actividad enzimticaMedicin de actividad enzimtica: mtodos directos y acopladosMedicin de enzimas como protenasEnzimas como Protenas(Ensayo enzimtico vs. Ensayo inmunolgico)Western blot e InmunoblotWestern e InmunoblotInmunoblot Revelado : quimio-luminiscencia y precipitado con colorResultados de un inmunoblotEnzimas en suero tiles en diagnstico clnicoTransaminasasEspecificidad de tejidos de AST y ALTTransaminasasLDH: lactato deshidrogenasaCreatina Kinasa: Creatina (FosFo)KinasaCK isozimas actividades en diversas patologasCreatina kinasa isozimas en el Infarto de MiocardioCambios en suero: Infarto de MiocardioTroponinas cardacasCurvas ROC para TnT y TnI en el diagnstico de Infarto de MiocardioFosfatasa alcalina ALP (FA)Fosfatasa alcalina: IsozimasLa fosfatasa alcalina por ser una protena secretada est glicosiladaEl tratamiento de suero con neuroaminidasa (elimina cido sialico) y permite diferenciar isozimas de ALP.Fosfatasa alcalina en ClnicaFosfatasa alcalina en ClnicaAlfa-AmilasaAlfa-Amilasa. Significado clnicoGGT: g-Glutamiltransferasa (g-Glutamiltranspeptidasa)GGT: g-GlutamiltransferasaIsozimasFosfatasa cida ACPPSA (Prostate Specific Antigen)Theoretical enzyme values for healthy (H) and diseased (D) patientsTest Outcomes6a) Define the terms specificity and sensitivity.Receiver operator characteristic (ROC) curve for theoretical data.Clinical Correlate 1Clinical Correlate 2