EquipoDr Salamone DanielDr Gibbons AlejandroDra Cueto MarcelaDr Rafael Fernández y MartínDr Pereyra Bonnet Federico
Laboratorio de Biotecnología Animal-Facultad de AgronomíaUniversidad de Buenos Aires, Argentina
Laboratorio de Rumiantes Menores-UE BarilocheInstituto Nacional de tecnología Agropecuaria
ANIMALES TRANSGENICOS
Como fabricar una Como fabricar una proteína humana?proteína humana?
Por ejemplo: la insulina se usa para tratar Por ejemplo: la insulina se usa para tratar la diabetes. la diabetes.
Como podemos producir toda la insulina Como podemos producir toda la insulina que se necesita para tratar a 400 millones que se necesita para tratar a 400 millones
de pacientes en el mundo?de pacientes en el mundo?
Con una BACTERIACon una BACTERIA
PRODUCCIÓN DE UNA PROTEÍNA
PlásmidoPlásmido(vector de ADN)(vector de ADN)
Plásmido Plásmido pCX-EGFPpCX-EGFP
Animales Transgénicos
Otros sistemas
• Plantas transgénicas
• Animales transgénicos
Animales Transgénicos
ADN humano
Gen de la Insulina
“Vacas que expresan insulina en la leche”
(25 vacas para demanda mundial)
Ovulo de vaca
Introducción
Como?Como?Promotor de las glándulas mamariasPromotor de las glándulas mamarias
Gen de la InsulinaGen de la Insulina
Direccionamos la expresión!!!
Animales Transgénicos
Recolección de los ovocitos
• Obtención de ovocitos a partir de animales sacrificados para consumo
- Progreso genético mínimo - Garantía sanitaria escasa - Uso en Investigación
Aspiración de los folículos antrales Complejos cúmulus-ovocito Lavado de ovarios
Cultivo in vitroCultivo in vitro
=
Animales Transgénicos
Microagujas
Equipo de laboratorioEquipo de laboratorio
Animales Transgénicos
Transgénicos por microinyección de pronúcleos
Gordon et al., 1980 (PNAS)
Transgénesis por microinyección de pronúcleos
Laboratorio de BiotecnologíaAnimal, FA-UBA
Gordon y col., 1980 (PNAS)
(-)-Mosaicismo-Baja eficiencia (0,003 % Bovino)-Inserción del transgén al azar
(+)-Ampliamente usada
Introducción
Wilmut et al., 1997 Nature 385,810–813.
Clonación oveja Dolly
75 Day Fetus
Tissue cultureFetal cells
FIBROBLAST
oocyte
EXTRACCION DE NUCLEOEnucleated oocyte
FUSIÓN CELULAROVULO ACTIVADO CONNUCLEO DE FIBROBLASTO
7 Days embryo
Recipient cow
Embryo transfer 278days
Cloned calf
PASOS DE LA CLONACIÓNPASOS DE LA CLONACIÓN
ENUCLEACIÓNENUCLEACIÓN
Fotos CyagraFotos Cyagra
PASOS DE LA CLONACIÓNPASOS DE LA CLONACIÓN
TRANSFERENCIA NUCLEARTRANSFERENCIA NUCLEAR
Fotos CyagraFotos Cyagra
Transgénesis por clonación (SCNT )
Laboratorio de BiotecnologíaAnimal, FA-UBA
Cibelli y col., 1998 (Science)
(+)-Ampliamente usada-Identificar integración del transgén in vitro
(-)-Impronta-Eficiencia 1-3%-Inserción del transgén al azar-Consumo de tiempo
TRANSGENESIS MEDIADA POR TRANSGENESIS MEDIADA POR ESPERMATOZOIDESESPERMATOZOIDES
Además del ADN paterno (función natural), el Además del ADN paterno (función natural), el espermatozoide lleva ADN exógenoespermatozoide lleva ADN exógeno
Ovocito Gen exógenoEspermatozoide
espermatozoide llevando el gen exógeno al interior
del ovocito
ESQUEMA DE LA TECNICAAnimales Transgénicos
Laboratorio de BiotecnologíaAnimal, FA-UBA
CoincubaciónCoincubación
PlásmidosPlásmidos
EspermatozoidesEspermatozoides
Incubación espermatozoides/plásmidos
ICSI
Pipeta de holding
1er. CP
Espermatozoide
Transgénesis por Espermatozoides
ICSI
Lugar de deposición
Transgénesis por Espermatozoides
ICSI
Sin espermatozoide
Transgénesis por Espermatozoides
Transgénesis mediada por espermatozoides
Laboratorio de BiotecnologíaAnimal, FA-UBA
(+)-Sencilla-Alta eficiencia
(-)-No ha sido usada en rumiantes-Inserción del transgén al azar-Mosaicismo en embriones
Brinster y col., 1981 (PNAS)
Microscopía confocalMicroscopía confocal
Plásmido marcado color verde (FITC)
Núcleo espermático
color rojo (IP)
Laboratorio de BiotecnologíaAnimal, FA-UBA
(1000x)
Microscopía confocal de ovocito inyectado
Espermatozoide con ADN exógeno
Núcleo ovocito
Ovocito
Laboratorio de BiotecnologíaAnimal, FA-UBA
(400x)
qPCR
Copias del plásmido
3x105 moléculas por espermatozoide.
91% GFP tratamiento corto y 91% GFP tratamiento corto y 66% GFP tratamiento largo.66% GFP tratamiento largo.
Caballos 29%
Gatos 26%(Med Vet J. Jarazo)
Vacas 23%
Laboratorio de BiotecnologíaAnimal, FA-UBA
Cerdos 60%(R. Olivera)
MosaicismoMosaicismo20-60%20-60%
Modificación
Modificación genética a Modificación genética a realizarrealizar
Cutícula (cutina)
Hongo fitopatógeno Fusarium solani
CUTINASA
Sintetizar el gen de la cutinasa con un promotor de glándulas salivales
Transferirlo a una Oveja para que exprese
cutinasa en saliva y aproveche mejor la
oferta forrajera
Laboratorio de BiotecnologíaAnimal, FA-UBA
Esperanza 1 (25/04/08)
Esperanza 2 (04/08/09)
Dinastía ESPERANZADinastía ESPERANZA
Negativos para el transgén por PCR y Southern blot.Negativos para el transgén por PCR y Southern blot.
Confirmación de paternidad por microsatélites.Confirmación de paternidad por microsatélites.
Laboratorio de BiotecnologíaAnimal, FA-UBA
Papers y Reconocimientos
Laboratorio de BiotecnologíaAnimal, FA-UBA
2009 Medalla de Oro OMPI
SBTE 2007 INNOVAR 2008
Leche humanizada de vacaLeche humanizada de vacaINTA Balcarce y Univ. de San MartínINTA Balcarce y Univ. de San Martín
RositaIsaRositaIsa
Laboratorio de BiotecnologíaAnimal, FA-UBA
GanaderíaGanadería
Bovinos resistentes a la Bovinos resistentes a la “vaca loca”“vaca loca”
Richt y col., 2006.Richt y col., 2006.
Nació Pampa, la primera ternera clonada en la Argentina El proyecto, que duró seis años y tuvo una inversión de 2 millones de dólares, busca obtener
medicación para humanos; el país se ubica entre los nueve países del mundo que fueron
capaces de clonar vacunos
Lunes 12 de agosto de 2002 |
Transgénicos por Clonación
Medicamento producido por animales Medicamento producido por animales transgénicos autorizado por la FDA.transgénicos autorizado por la FDA.
Laboratorio de BiotecnologíaAnimal, FA-UBA
ATryn® antitrombina humana
GTC Biotherapeutics, Massachusetts.GTC Biotherapeutics, Massachusetts.
Ratones: Modelos de Enfermedades Ratones: Modelos de Enfermedades o para Investigacioneso para Investigaciones
Laboratorio de BiotecnologíaAnimal, FA-UBA
Producción de órganos para xenotransplante:
- Producción cerdos que expresan proteínas humanas que bloquean la acción del complemento (ej. CD59).
- Transplantes de corazón o hígado en forma temporaria hasta la obtención de donante compatible.
1796 Edward Jenner, descubre de la “vacuna” antivariólica. Viruela: Causante en el Siglo XVIII de 60 millones de muertes
Siglo XX: En Mayo de 1980, la OMS declara oficialmente la erradicación mundial de la viruela humana
PasadoLas Vacunas: Primer ejemplo de la utilidad
de los animales de granja en la salud humana.
Animales Transgénicos
PresenteFermentador como bioreactor para producir
vacunas y proteínas recombinantespara la salud humana
Animales Transgénicos
•En el siglo XVIII y en oposición a la tecnología de Jenner, se dijo:
“Existen informes fidedignos de niños que habían empezado a mugir y andar en cuatro patas y de gente con cuernos” por haber sido vacunados.
La realidad demostró lo contrario, ¿hoy en el Siglo XXI, escuchamos comentarios similares?
Siempre se escuchan las voces de los detractores del desarrollo científico
Animales Transgénicos
Futuro