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UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO
FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA
ESCUELA ACADEMICO PROFESIONAL DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA
“VALIDACIÓN DEL MÉTODO ANALÍTICO POR
CROMATOGRAFÍA DE GASES PARA CUANTIFICAR
MENTOL EN UNGÜENTO”
TESIS II
PARA OPTAR EL GRADO ACADÉMICO
DE
BACHILLER EN FARMACIA Y BIOQUÍMICA
AUTORES: VARGAS MARQUINA, PABLO ROBERTO
VÁSQUEZ PÉREZ, GÉNESIS CYNTIA DEL PILAR
ASESOR: Mg. Q. F. ROGER A. RENGIFO PENADILLOS
CO-ASESORA: Q.F. MARIELENA BERMÚDEZ CHAGARAY
TRUJILLO – PERÚ
2012
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Agradecimientos:
A Dios:
Gracias por guiar nuestros caminos
y permitir que nuestras metas sean logradas.
Gracias por el inmenso amor que nos tienes,
por tus bendiciones y
por el regalo de la vida.
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A nuestros padres:
Desde lo más profundo de nuestro corazón
mil gracias por su compresión,
por sus sabios consejos y
por su ayuda incondicional para
hacer realidad uno de nuestros mas hermosos sueños,
El ser profesional.
A nuestros hermanos:
Por su constante apoyo,
comprensión y entusiasmo,
y por ser nuestros mejores amigos.
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Un sincero agradecimiento al
Mg.Q.F. Roger Rengifo Penadillos
por su generosa dirección, asesoramiento y dedicación en la
realización del presente trabajo.
Un especial agradecimiento a la
Q.F. Marielena Bermúdez Chagaray
por la confianza, el apoyo y la oportunidad
brindada, para que este trabajo haya
podido ser realizado.
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Al Laboratorio Farmacéutico MARKOS S.A.,
por las facilidades brindadas para
la realización del
presente trabajo.
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JURADO EVALUADOR
----------------------------------------
Dr. Juan Arbayza Fructuoso
PRESIDENTE
-----------------------------------
Dr. Pedro Alva Plasencia
MIEMBRO
-----------------------------------
Mg. Roger Rengifo Penadillos
MIEMBRO
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PRESENTACIÓN
Señores miembros del jurado:
Dando cumplimiento a las disposiciones establecidas en el Reglamento
para la obtención de GRADOS Y TÍTULOS DE LA FACULTAD DE
FARMACÍA Y BIOQUÍMICA DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE
TRUJILLO, presento a vuestra consideración y elevado criterio el Informe de
Tesis II, intitulado: “VALIDACIÓN DEL METODO ANALÍTICO POR
CROMATOGRAFÍA DE GASES PARA CUANTIFICAR MENTOL EN
UNGÜENTO”, con el que pretendemos obtener el GRADO DE BACHILLER.
Dejo a vuestra consideración, señores miembros del jurado la calificación del
presente Informe de Tesis II.
Trujillo, Abril de 2012
Pablo R. Vargas Marquina Génesis C. Vásquez Pérez
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INDICE
RESUMEN…………………………………………………....i
ABSTRACT………………………………………..…………ii
I. INTRODUCCIÓN ................................................................... 1
II. MATERIAL Y MÉTODO .................................................... 6
III. RESULTADOS ........................................................ ….…. 30
IV. DISCUSIÓN ........................................................................ 35
V. CONCLUSIONES ................................................................ 41
VI. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS .............................. 42
ANEXOS ..................................................................................... 46
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RESUMEN
El objetivo del presente estudio fue demostrar que el método analítico por
cromatografía de gases para cuantificar mentol en ungüento, cumple con los
parámetros de validación establecidos por la Farmacopea de los Estados
Unidos de América (USP 34), para el uso específico previsto. Para lo cual se
utilizó como fase móvil el gas Helio y fase estacionaria una columna G16
(Polietilenglicol 60m x 0,250mm x 0,50um). Se realizó la identificación del
pico de mentol por comparación del tiempo de retención del estándar con la
muestra, se evaluó la presencia de interferencias en las soluciones blanco,
placebo y placebo + principio activo (Salicilato de metilo) y se realizó el
análisis del placebo y la muestra sometidos a condiciones de estrés,
obteniendo resultados conformes. El % de recuperación promedio obtenido
fue 100,07%; Gexp=0,6803 y texp=0,4175. En la linealidad del estándar, la
pendiente (m) fue 0,0077 y el intercepto (b) de -0,0070; el coeficiente de
correlación (r) fue 0,9999 y el coeficiente de determinación (r2) de 0,9998;
los límites de confianza de “m” fueron 0,0077 y 0,0076; y texp=285,6489; los
límites de confianza de “b” fueron 0,0195 y 0,0055; y texp=1,2142;
tr=285,6489 y la desviación estándar relativa (RSD) de 0,52%. En la
linealidad de la muestra se obtuvó m=0,0078 y b=-0,0171; r=0,9987;
r2=0,9973; los límites de confianza de “m” fueron de 0,0075 y 0,0080; y
texp=69,3531; los límites de confianza de “b” fueron de 0,0735 y 0,0393; y
texp=0,6544; tr=69,3531 y el RSD=1,94%. En la aptitud del sistema se halló
un RSD=0,16%. Para la repetibilidad se obtuvó un RSD=0,41% y en la
precisión intermedia dada entre analistas en diferentes días fue 0,33%. Por
tanto los valores de los estimadores determinados permiten dar como
validado el método analítico propuesto para cuantificar mentol en ungüento,
al cumplir con los parámetros de validación según USP34.
Palabras claves: Cromatografía de gases, mentol, validación, USP34
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ABSTRACT
The purpose of this study was to demonstrate that the analytical method by gas
chromatography to measure menthol ointment, fulfills the validation parameters set
by the Pharmacopoeia of the United States of America (USP 34), for the specific
intended use. To which was used as the mobile phase and stationary phase helium
gas G16 column (Polyethylene glycol 60m x 0,250mm x 0,50um). Identification was
performed by comparing menthol peak retention time of standard sample, we
assessed the presence of interference in the solutions, placebo and placebo + active
ingredient (methyl salicylate) and performed the analysis of the placebo and the
sample subjected to stress conditions, obtaining results in line. The % average
recovery obtained was 100,07%; Gexp=0,6803 and texp=0,4175. The linearity of the
standard, the slope (m) was 0,0077 and the intercept (b) of -0,0070, the correlation
coefficient (r) was 0,9999 and the coefficient of determination (r2) of 0,9998; the
confidence limits of "m" were 0,0077 and 0,0076; and texp=285,6489; the confidence
limits of "b" were 0,0195 and 0,0055; and texp=1,2142; tr=285,6489 and the relative
standard deviation (RSD) of 0,52%. The linearity of the sample was obtained
m=0,0078 and b=-0,0171; r=0,9987; r2=0,9973; the confidence limits of "m" were of
0,0075 and 0,0080; and texp=69,3531; confidence limits of "b" were 0,0735 and
0,0393; and texp=0,6544; tr=69,3531 and RSD=1,94%. The ability of the system
found a RSD=0,16%. For repeatability was obtained RSD=0,41% and intermediate
precision given among analysts on different days was 0,33%. Thus the values of
certain estimators lead to allow validated analytical method proposed to quantify
menthol ointment, to meet the validation parameters according to USP34.
Keywords: Gas chromatography, menthol, validation, USP34
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1
I. INTRODUCCIÓN
En la fabricación de productos farmacéuticos, es indispensable realizar una
inspección completa al proceso de producción aplicando normas establecidas a fin de
garantizar la producción de productos farmacéuticos de buena calidad. Para ello debe
sujetarse a las normas aceptadas internacionalmente, comúnmente conocidas como
“Buenas Prácticas de Manufacturas”, (BPM) 1.
Las BPM constituyen un conjunto de normas mínimas para la correcta fabricación de
productos farmacéuticos, y establecen los estándares que deben ser observados por la
industria farmacéutica para la fabricación de sus productos, de manera que puedan
satisfacer los criterios de calidad requeridos, a fin de cautelar la salud de la población
usuaria 1.
En la actualidad los laboratorios de control de calidad de la Industria Farmacéutica
buscan validar sus métodos analíticos, la cual establecen por medio de estudios y
programas documentados asegurando que el método posee todos los requisitos para
el uso propuesto. La validación es parte integral de las BPM y del desarrollo de un
método de análisis puesto que sin fiabilidad de los resultados analíticos es imposible
asegurar que un medicamento cumple con las especificaciones exigidas, además,
contribuye a garantizar la calidad y asegurar las propiedades de calidad de un
producto determinado 2,5,12,16.
La calidad de los resultados analíticos debe ser acaparada mediante la fiabilidad y
reproducibilidad del método analítico utilizado en su obtención y esta demostración
debe estar debidamente documentada con el detalle de la preparación de las muestras
efectuadas y los datos obtenidos. Existen varios productos farmacéuticos, cuyos
métodos de análisis no se encuentran publicados en las obras oficiales de consulta
como la Farmacopea americana, británica, europea y japonesa. Esto hace necesario el
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desarrollo de la validación de métodos analíticos con el fin de cuantificar los
principios activos de dichos productos farmacéuticos 2,5,12,16.
La validación de un método analítico es el proceso que establece, mediante estudios
en laboratorio, que las características de validación del método cumplen los
requisitos para las aplicaciones analíticas previstas 3,7.
Entre las características analíticas típicas utilizadas para la validación de métodos se
encuentra la Exactitud, Precisión, Especificidad, Límite de detección, Límite de
cuantificación, Linealidad, Intervalo y Robustez 3,11.
La especificidad es la habilidad para evaluar inequívocamente el analito en busca de
la presencia de componentes esperados. Típicamente estos pueden incluir impurezas,
degradantes, matriz, etc. La falta de especificidad de un método analítico individual
puede ser compensada por otros métodos analíticos de apoyo 3,4.
La exactitud de un método analítico expresa el grado de concordancia entre el valor,
el cual es aceptado ya sea como un valor verdadero convencional o un valor de
referencia aceptado, y el valor encontrado 2. La exactitud se calcula como el
porcentaje de recuperación de la cantidad valorada con respecto a la cantidad
conocida de analito añadida a la muestra, o como la diferencia entre la media de la
valoración y el valor verdadero aceptado, considerando los intervalos de confianza 3.
La linealidad de un método analítico es su capacidad para obtener resultados de
prueba que sean proporcionales ya sea directamente, o por medio de una
transformación matemática bien definida, a la concentración de analito en muestras
dentro de un intervalo dado 3,4.
La precisión de un método analítico es el grado de concordancia entre los resultados
de las pruebas individuales cuando se aplica el método repetidamente a múltiples
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muestreos de una muestra homogénea 4. La precisión de un método analítico
habitualmente se expresa como la desviación estándar o la desviación estándar
relativa de una serie de mediciones 3. La precisión puede ser una medida del grado de
reproducibilidad o de repetibilidad del método analítico en condiciones normales de
operación 3,4.
La reproducibilidad expresa la precisión entre diferentes laboratorios. La precisión
intermedia expresa la variación dentro de un laboratorio, por ejemplo en diferentes
días, con diferentes analistas o con equipos diferentes dentro del mismo laboratorio.
La repetibilidad se refiere a la utilización del procedimiento analítico en un
laboratorio durante un periodo corto por el mismo analista con el mismo equipo 3.
Para desarrollar el método de la presente validación, se utilizó la técnica de
separación, Cromatografía de gases.
La cromatografía de gases (CG) es una técnica que permite separar los componentes
volátiles de una muestra, que se distribuyen entre una fase gaseosa móvil y una fase
estacionaria líquida o sólida contenida en una columna. La muestra a analizar se
volatiliza y se inyecta en la cabeza de una columna cromatográfica. La elución se
produce por el flujo de una fase móvil de un gas inerte; la cual no interactúa con la
fase estacionaria ni con las moléculas del analito, su única función es transportar el
analito a través de la columna. Existen dos tipos de cromatografía de gases:
cromatografía gas-sólido (GSC) y la cromatografía gas-líquido (GLC) 6,13,18.
La GLC utiliza una fase estacionaria líquida; disponible en columnas rellenas o
capilares, en columnas rellenas la fase estacionaria líquida se deposita sobre un
soporte sólido inerte finamente dividido como polímeros porosos o carbón grafito, en
columnas capilares la fase estacionaria se deposita sobre la superficie de la columna.
La GSC está disponible únicamente en columnas rellenas, el cual generalmente es un
absorbente activo 3,18.
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Un Cromatógrafo de gases consta de una fuente de gas transportador, un inyector,
una columna, un detector y un dispositivo registrador 3.
Los gases más utilizados son el nitrógeno, helio, aire, hidrógeno u oxigeno. El uso de
alguno de ellos dependerá de la columna, el detector en uso, el costo y la seguridad
3,6.
La inyección de la muestra se realiza generalmente con una microjeringa
hipodérmica a un alineador de vidrio (glass insert) contenido en un bloque metálico,
donde se vaporiza y es barrida hacia la columna. El bloque se calienta a una
temperatura que se fija en un valor suficientemente alto para convertir prácticamente
en forma instantánea la muestra líquida en vapor. La cantidad de muestra inyectada
es del orden de µL para líquidos, el volumen inyectado no debe superar la capacidad
de la columna y entre más pequeño sea el volumen usado de la muestra mayor será la
eficiencia y la reproductibilidad del análisis 6,15,18.
Las columnas cromatográficas varían en longitud desde menos de 2 hasta 50 metros
o más, a fin de colocarse en el interior de un termostato, normalmente se configuran
como helicoides con diámetros de 10 a 30 cm. La temperatura de la columna es una
variable importante para un trabajo preciso, por ello la columna normalmente se
introduce dentro de un horno termostatizado. La temperatura óptima de la columna
depende del punto de ebullición de la muestra y del grado de separación requerido
6,18.
Las sustancias presentes en la muestra pasan a través de la columna, donde son
separados y llegan al sistema de detección 6,14. El tipo de detector que se usa depende
de la naturaleza de los componentes que se analizan y es específica según la
monografía individual, tiene las siguientes características: 1) Adecuada sensibilidad,
2) Buena estabilidad y reproductibilidad, 3) Una respuesta lineal para los analitos, 4)
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Un intervalo de temperaturas de trabajo comprendido desde la temperatura ambiente
hasta el menos 400 ºC, 5) Alta fiabilidad y manejo sencillo, 6) Respuesta semejante
para todos los analitos y 7) No destructivo de la muestras 3,14,15.
La señal de salida de los detectores se registra como la respuesta del instrumento en
función del tiempo y la medida del área o altura del pico, es una función de la
cantidad presente 15.
El producto farmacéutico considerado como muestra de análisis para la presente
validación, es un ungüento que asocia dos principios activos: Mentol y Salicilato de
metilo. Siendo motivo de estudio la validación del método analítico para la
cuantificación del principio activo Mentol por cromatografía de gases, dicho
producto farmacéutico es indicado para el alivio local del dolor y las limitaciones
funcionales de las afecciones musculares, traumáticas y reumáticas. El método de
análisis para la cuantificación de mentol en ungüento no se encuentra publicada en
las obras oficiales de consulta, lo que hace necesario desarrollar un método de
análisis en el laboratorio para cuantificar dicho principio activo.
Es por ello que el presente proyecto de tesis tiene por finalidad demostrar que el
método analítico por cromatografía de gases para cuantificar mentol en ungüento
cumple con los parámetros de validación establecidos por la Farmacopea de los
Estados Unidos de América (USP 34), además de probar la confiabilidad del método
analítico para asegurar la calidad y eficacia del producto farmacéutico.
El problema planteado fue ¿El método analítico por cromatografía de gases para
cuantificar mentol en ungüento cumple con los parámetros de validación establecidos
por la Farmacopea de los Estados Unidos de América (USP 34)?
Dentro de los objetivos específicos se consideró, determinar los parámetros de
validación (Selectividad, Exactitud, Linealidad y Precisión) para el método analítico
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por cromatografía de gases para cuantificar mentol en ungüento, así como también
evaluar los parámetros de validación mencionados para establecer si cumplen con los
criterios establecidos por la Farmacopea de los Estados Unidos de América (USP
34).
II. MATERIAL Y MÉTODO
1. MATERIALES, REACTIVOS Y EQUIPOS
1.1. Materiales
1.1.1. Material de análisis
- 100 g de placebo ungüento.
- Potes de ungüento conteniendo Mentol 8,18g/100g de Laboratorios
Farmacéuticos Markos S.A.
1.1.2. Estándares
- Estándar primario Menthol USP
USP Reference Standard MENTHOL 250 mg
Lote: JOI189
Potencia: 99,9%
- Estándar secundario Mentol
Lote: 1011260
Potencia: 99,03% Tal cual (T/C)
Protocolo: ST16/11
Reanálisis: 2012-09-15
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1.1.3. Material de vidrio
- El de uso común en laboratorio, debidamente verificado.
1.2. Reactivos y solventes
- 1- Butanol Merck 2,5; lote K40272690 007.
- Metanol grado HPLC Merck 4 L, lote I577107 106.
- Agua ultrapura.
1.3. Equipos
DESCRIPCIÓN MARCA MODELO SERIE
PROTOCOLO
DE
CALIFICACIÓN
Balanza analítica Ohaus PA214 8328320492 PCI-CC.016
PCO-CC.016
PCD-CC.016
Baño María Memmert WB14 1499-0288 PCI-CC.023
PCO-CC.023
PCD-CC.023
Cromatógrafo de
gases
Agilent
Technologies 7820A CN11172021
PCI-CC.038
PCO-CC.038
PCD-CC.038
Cabina de flujo
laminar (Luz
UV)
S/M S/M S/S PCI-CC.044
PCO-CC.044
PCD-CC.044
Microbalanza Sartorius MSE3.6P-
000-DM 27203340
PCI-CC.045
PCO-CC.045
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Purificador de
agua Millipore Reference F1NA21877C
PCI-CC.046
PCO-CC.046
PCD-CC.046
Ultrasonido Fisher Scientific
FS23 222043 PCI-CC.016
PCO-CC.016
PCD-CC.016
1.4. Otros
- Columna G16 (DB-WAX/Polietilenglicol 60 m Largo x 0,250
mm Ancho x 0,50 um Film). Límite de temperatura: 20 – 250 °C,
serie USB102436H.
- Termómetro de líquido en vidrio Silver Brand, lote 05J.
- Membrana de filtración Sartolon Polyamid, tamaño de poro 0,45
um x 47 mm; lote 0611 25006 1140323.
- Membrana de filtración Sartolon Polyamid, tamaño de poro 0,45
um x 25 mm; lote 1111 25006 1140783.
- Portafiltro descartable Agilent Technologies Econofilter 25 cm
de diámetro x 0,2 um de tamaño de poro PTFE.
- Tapas y septas Agilent Technologies, lote 091996-3-1.
- Viales 100/PK Agilent Technologies, lote 1112001095.
- Jeringas de plástico 5 mL 21G x 11/2”.
- Papel Parafilm “M”, Laboratorio Film.
- Guantes de látex, Rubbercare lote 110.
2. MÉTODO:3,4,8,9,10
2.1. Selección y tamaño de la muestra
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Se realizó el proceso de muestreo aleatorio de los potes de ungüento que
contienen Mentol, teniendo en cuenta el manejo de las Tablas Militar
Estándar 105E (Ver Anexo 01).
A partir del cual se determinó según el nivel de inspección general III y el
tamaño de lote fabricado (500 potes de ungüento), el código de inspección
“J”. Él cual a su vez teniendo en cuenta el plan de muestreo y considerando
un 2,5% de nivel de aceptabilidad de la calidad se determinó como tamaño
de muestra 5 potes de ungüento, los cuales fueron tomados al azar.
2.2. Condiciones cromatográficas
Columna : G16 (Polietilenglicol 60 m Largo x 0,250 mm
Ancho x 0,50 um Film). Límite de temperatura:
20 – 250 °C.
Gas Carrier : Helio
Flujo : 2,01 mL/min
Makeup flow (He) : 30,8 mL/min
Flujo Columna +Hidrógeno: 31,2 mL/min
Flujo Columna + Aire : 426 mL/min
Flujo de venteo : 29,8 mL/min
Purga : 2,58 mL/min
Tipo de inyección : Split
Detector : FID (Detector de ionización a la
llama) a 250 °C
Temperatura Inyector : 250 °C
Temperatura Horno Inicial: 70 °C, tiempo: 1 minuto
Rampa 1 : 7,5 °C/min
Temperatura Horno Final: 180 °C, tiempo: 9 minuto
Volumen de Inyección : 1 L
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2.3. Preparación de las soluciones de trabajo
- Preparación del estándar interno
En un matraz volumétrico de 100 mL, se adicionó 1 mL de 1-butanol,
enrasó con metanol, homogeneizó y filtró a través de membrana de 0,45
µm x 25 mm.
- Preparación de la solución estándar
Se pesó aproximadamente 100 mg de mentol estándar y añadió a un
matraz volumétrico de 50 mL, se enrasó con metanol y homogeneizó.
Luego se transfirió 5 mL de ésta solución en un matraz volumétrico de 50
mL y añadió 1 mL del estándar interno, disolvió y enrasó con metanol,
luego se homogeneizó y filtró a través de membrana de 0,45µm x25 mm.
- Preparación de la muestra
En un matraz volumétrico de 50 mL se pesó aproximadamente 1,32 g de
muestra (equivalente a 100 mg de mentol), añadió 30 mL de metanol, se
colocó a baño maría hasta obtener una solución homogénea, luego se
enfrió y enrasó con metanol, después se transfirió 5 mL de ésta solución
en un matraz volumétrico de 50 mL y añadió 1 mL del estándar interno,
disolvió, enrasó con metanol, homogeneizó y filtró a través de membrana
de 0,45 µm x 25 mm.
2.4. Parámetros de validación
2.4.1. Selectividad
a. Identificación del pico de mentol en la muestra
Se procedió a preparar la solución estándar y solución muestra según lo
descrito en el ítem 2.3. e inyectó separadamente por duplicado.
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Criterio de aceptación4
El tiempo de retención que presente el pico resultante de la muestra
coincide en el tiempo de retención de la solución estándar.
b. Interferencias
Se evaluó la presencia de interferencias a nivel de blanco, placebo sólo y
placebo + principio activo (Salicilato de metilo).
- Blanco
Se empleó la solución diluyente (Metanol), filtró a través de membrana
de 0,45 µm x 25 mm e inyectó por duplicado.
- Placebo sólo
Se pesó 1,32 g de placebo y transfirió a un matraz volumétrico de 50 mL,
añadió 30 mL de metanol y colocó en baño maría hasta obtener una
solución homogénea, enfrió y enrasó con metanol, luego se transfirió 5
mL de está solución en un matraz volumétrico de 50 mL y añadió 1 mL
de estándar interno, disolvió y enrasó con metanol, homogeneizó y filtró
a través de membrana de 0,45 µm x 25 mm e inyectó por duplicado.
- Placebo + principios activos
Se pesó 1,32 g de placebo + 383 mg de salicilato de metilo y transfirió a
un matraz volumétrico de 50 mL, añadió 30 mL de metanol y colocó en
baño maría hasta obtener una solución homogénea, enfrió y enrasó con
metanol, luego se transfirió 5 mL de está solución en un matraz
volumétrico de 50 mL y añadió 1 mL de estándar interno, disolvió y
enrasó con metanol, homogeneizó y filtró a través de membrana de 0,45
µm x 25 mm e inyectó por duplicado.
- Solución Estándar
Se preparó la solución estándar según lo descrito en el ítem 2.3., filtró a
través de membrana de 0,45 µm x 25 mm e inyectó por duplicado.
- Muestra
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Se preparó la muestra según lo descrito en el ítem 2.3., filtró a través de
membrana de 0,45 µm x 25 mm e inyectó por duplicado.
Criterio de aceptación4
Ausencia de pico en el tiempo de retención del mentol en la solución
blanco, placebo y placebo + principio activo (Salicilato de metilo).
c. Análisis de muestras sometidas a condiciones de estrés
Se procedió a realizar el estudio de la muestra y el placebo sometidos a
condiciones de estrés para generar compuestos potencialmente
interferentes.
- Termólisis
Se sometió aproximadamente 15 g de placebo y muestra a 105 ºC durante
5 horas.
Placebo tratado: Se pesó 1,32 g de placebo tratado y transfirió a un
matraz volumétrico de 50 mL, añadió 30 mL de metanol, colocó en baño
maría hasta obtener una solución homogénea, enfrió y enrasó con
metanol, luego se transfirió 5 mL de esta solución en un matraz
volumétrico de 50 mL, añadió 1 mL de estándar interno, disolvió y
enrasó con metanol.
Homogeneizó y filtró a través de membrana de 0,45 µm x 25 mm e
inyectó por duplicado.
Muestra tratada: Se pesó 1,32 g de muestra tratada y transfirió a un
matraz volumétrico de 50 mL, añadió 30 mL de metanol, colocó en baño
maría hasta obtener una solución homogénea, enfrió y enrasó con
metanol, luego se transfirió 5 mL de está solución en un matraz
volumétrico de 50 mL y añadió 1 mL de estándar interno, disolvió y
enrasó con metanol.
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Homogeneizó y filtró a través de membrana de 0,45 µm x 25 mm e
inyectó por duplicado.
- Fotólisis
Se sometió aproximadamente 15 g de placebo y muestra a la acción de la
luz UV (254 nm) durante 5 horas.
Placebo tratado: Se pesó 1,32 g de placebo tratado a la acción de la luz
UV y transfirió a un matraz volumétrico de 50 mL, añadió 30 mL de
metanol, colocó en baño maría hasta obtener una solución homogénea,
enfrió y enrasó con metanol, luego se transfirió 5 mL de está solución en
un matraz volumétrico de 50 mL y añadió 1 mL de estándar interno,
disolvió y enrasó con metanol.
Homogeneizó y filtró a través de membrana de 0,45 µm x 25 mm e
inyectó por duplicado.
Muestra tratada: Se pesó 1,32 g de muestra y transfirió a un matraz
volumétrico de 50 mL, añadió 30 mL de metanol, colocó en baño maría
hasta obtener una solución homogénea, enfrió y enrasó con metanol,
luego se transfirió 5 mL de está solución en un matraz volumétrico de 50
mL y añadió 1 mL de estándar interno, disolvió y enrasó con metanol.
Homogeneizó y filtró a través de membrana de 0,45 µm x 25 mm e
inyectó por duplicado.
- Hidrólisis alcalina
Placebo: Se pesó 1,32 g de placebo y transfirió a un matraz volumétrico
de 50 mL, añadió 5 mL de Hidróxido de sodio 1 N y se llevó a ebullición
con reflujo por 1 hora, se dejó enfriar y añadió 5 mL de Ácido
Clorhídrico 1 N para neutralización, se añadió 30 mL de metanol y
colocó en baño maría hasta obtener una solución homogénea, se dejó
enfriar y enrasó con metanol, luego se transfirió 5 mL de está solución en
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un matraz volumétrico de 50 mL y añadió 1 mL de estándar interno,
disolvió y enrasó con metanol.
Homogeneizó y filtró a través de membrana de 0,45 µm x 25 mm e
inyectó por duplicado.
Muestra: Se pesó 1,32 g de muestra y transfirió a un matraz volumétrico
de 50 mL, añadió 5 mL de Hidróxido de sodio 1 N y se llevó a ebullición
con reflujo por 1 hora, se dejó enfriar y añadió 5 mL de Ácido
Clorhídrico 1 N para neutralización, luego se añadió 30 mL de metanol y
colocó en baño maría hasta obtener una solución homogénea, se dejó
enfriar y se enrasó con metanol, después se transfirió 5 mL de está
solución en un matraz volumétrico de 50 mL y añadió 1 mL de estándar
interno, disolvió y enrasó con metanol.
Se homogeneizó y filtró a través de membrana de 0,45 µm x 25 mm e
inyectó por duplicado.
- Hidrólisis Ácida
Placebo: Se pesó 1,32 g de placebo y transfirió a un matraz volumétrico
de 50 mL, se añadió 5 mL de Ácido Clorhídrico 1 N y llevó a ebullición
con reflujo por 1 hora, se dejó enfriar y añadió 5 mL de Hidróxido de
sodio 1 N para neutralización, luego se añadió 30 mL de metanol y
colocó en baño maría hasta obtener una solución homogénea, se enfrió y
enrasó con metanol, después se transfirió 5 mL de está solución en un
matraz volumétrico de 50 mL y añadió 1 mL de estándar interno, se
disolvió y enrasó con metanol.
Se homogeneizó y filtró a través de membrana de 0,45 µm x 25 mm e
inyectó por duplicado.
Muestra: Se pesó 1,32 g de muestra y transfirió a un matraz volumétrico
de 50 mL, añadió 5 mL de Ácido Clorhídrico 1 N y se llevó a ebullición
con reflujo por 1 hora, se dejó enfriar y añadió 5 mL de Hidróxido de
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sodio 1 N para neutralización, se añadió 30 mL de metanol y colocó en
baño maría hasta obtener una solución homogénea, se enfrió y enrasó con
metanol, después se transfirió 5 mL de está solución en un matraz
volumétrico de 50 mL y añadió 1 mL de estándar interno, se disolvió y
enrasó con metanol.
Homogeneizó y filtró a través de membrana de 0,45 µm x 25 mm e
inyectó por duplicado.
- Oxidación
Placebo: Se pesó 1,32 g de placebo y transfirió a un matraz volumétrico
de 50 mL, se añadió 5 gotas de peróxido de hidrógeno y se sometió a
baño maría a 60 ºC durante 2 horas, se dejó enfriar y añadió 30 mL de
metanol, se colocó en baño maría hasta obtener una solución homogénea,
se enfrió y enrasó con metanol, luego se transfirió 5 mL de está solución
en un matraz volumétrico de 50 mL y añadió 1 mL de estándar interno,
se disolvió y enrasó con metanol.
Se homogeneizó y filtró a través de membrana de 0,45 µm x 25 mm e
inyectó por duplicado.
Muestra: Se pesó 1,32 g de muestra y transfirió a un matraz volumétrico
de 50 mL, se añadió 5 gotas de peróxido de hidrógeno y se sometió a
baño maría a 60 ºC durante 2 horas, se dejó enfriar y añadió 30 mL de
metanol, luego se colocó en baño maría hasta obtener una solución
homogénea, se dejó enfriar y enrasó con metanol, después se transfirió 5
mL de está solución en un matraz volumétrico de 50 mL y añadió 1 mL
de estándar interno, se disolvió y enrasó con metanol.
Se homogeneizó y filtró a través de membrana de 0,45 µm x 25 mm e
inyectó por duplicado.
Se comparó el tiempo de retención del pico de Mentol de la solución
estándar con los resultantes de la inyección del placebo y las muestras
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sometidas a condiciones de estrés. En éste último se determinó la
resolución del interferente con respecto al pico del mentol. La resolución,
es calculada mediante la aplicación de la formula:
Criterio de aceptación3,4
- La muestra sometida a condiciones de estrés, no presenta productos de
degradación que interfieran con el tiempo de retención del Mentol;
asimismo, el interferente próximo al pico de Mentol debe tener una
resolución mayor o igual a 1,5.
- El placebo sometido a las condiciones de estrés, no presenta productos
de degradación que interfieran con el tiempo de retención del Mentol.
2.4.2. Exactitud
a. Solución estándar
Se preparó la solución estándar, estándar interno según lo descrito en el
ítem 2.3., luego se filtró a través de membrana de 0,45 µm x 25 mm e
inyectó por 5 veces.
b. Preparación de las muestras
- Muestra al 80%
En un matraz volumétrico de 200 mL se pesó aproximadamente 0,8 g de
placebo + 32 mg de estándar de mentol, se añadió 100 mL de metanol, 4
mL de estándar interno y colocó en baño maría hasta obtener una
21
122ww
ttR RR
s
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solución homogénea, se dejó enfriar y enrasó con metanol, se preparó por
triplicado. Se homogeneizó y filtró a través de membrana de 0,45 µm x
25 mm.
- Muestra al 100%
En un matraz volumétrico de 200 mL se pesó aproximadamente 1 g de
placebo + 40 mg de estándar de mentol, se añadió 100 mL de metanol, 4
mL de estándar interno y colocó en baño maría hasta obtener una
solución homogénea, se dejó enfriar y enrasó con metanol, se preparó por
triplicado. Se homogeneizó y filtró a través de membrana de 0,45 µm x
25 mm.
- Muestra al 120%
En un matraz volumétrico de 200 mL se pesó aproximadamente 1,2 g de
placebo + 48 mg de estándar de mentol, se añadió 100 mL de metanol, 4
mL de estándar interno y colocó en baño maría hasta obtener una
solución homogénea, se dejó enfriar y enrasó con metanol, se preparó por
triplicado. Se homogeneizó y filtró a través de membrana de 0,45 µm x
25 mm.
c. Cálculos y análisis estadístico: 20
- Se determinó la cantidad de mentol hallado en cada muestra, mediante la
aplicación de la siguiente fórmula:
Donde:
mg mentol : Cantidad de mentol hallada en la muestra (mg).
fxPstxRst
Rmpmentolmg
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Rmp : Ratio del pico de mentol y estándar interno de la
solución muestra.
Rst : Ratio del pico de mentol y estándar interno de la
solución estándar.
Pst : Peso del estándar de mentol (mg).
f : Factor de dilución del estándar y la muestra.
- La exactitud se expresó como el porcentaje de mentol recuperado:
Donde:
R : Porcentaje de recuperación promedio
mg (h) : Miligramos de mentol hallados
mg (a) : Miligramos de mentol añadidos
Criterio de aceptación
El porcentaje de recuperación promedio (R) deberá acercarse al 100%.
En este caso, por tratarse de análisis de un principio activo en producto
terminado se considera como indicativo de exactitud valores de 98-
102%.
- Se evaluó la influencia de la concentración en la variabilidad de los
resultados mediante la aplicación de la prueba estadística G de Cochran:
Donde:
s2 : Máxima desviación estándar relativa
100)(
)(x
amg
hmgR
2
3
2
2
2
1
2 maxexp
sss
sG
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: Sumatoria de las desviaciones estándar relativa de
cada cada grupo de concentraciones
Criterio de aceptación
Si el G experimental (Gexp) es menor al G de tabla (Gtabla) para un valor
de p=0,05; 3 grupos de concentraciones (k=3) y 3 número de
determinaciones por grupo (n=3), entonces el factor de concentración no
influye en la variabilidad de los resultados.
- La exactitud se determinó mediante la aplicación del test de Student:
Donde:
texp : Valor de t obtenido experimentalmente
R : Porcentaje de recuperación promedio
n : Número de determinaciones (9)
RSD : Desviación estándar relativa del total de determinaciones
Criterio de aceptación
Si el texp es menor al ttabla; para (n-1) grados de libertad y un nivel de
confianza del 95 % (α=0,05), entonces no existirá diferencia significativa
entre la recuperación promedio y la cantidad añadida de mentol.
3.2.4.3. Linealidad
3.2.4.3.1. Linealidad del estándar
RSD
nRt
100exp
2
3
2
2
2
1 sss
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Se determinó preparando soluciones del estándar en concentraciones del
40%, 80%, 100%, 120% y 160% por triplicado, considerándose como
100% a la concentración de trabajo (0,2 mg/mL).
a. Preparación de las muestras
- Muestra 40%
Se pesó un aproximado de 80 mg de mentol estándar y transfirió en un
matraz volumétrico de 100 mL, se disolvió utilizando un ultrasonido y
enrasó con metanol, de esta solución se transfirió 5 mL en un matraz
volumétrico de 50 mL y añadió 1 mL de estándar interno, se disolvió y
enrasó con metanol, luego se homogeneizó y filtró a través de membrana
de 0,45 µm x 25 mm (0,08 mg/mL).
- Muestra 80%
Se pesó un aproximado de 32 mg de mentol estándar y transfirió en un
matraz volumétrico de 200 mL, se añadió 4 mL de estándar interno, se
disolvió utilizando un ultrasonido y enrasó con metanol, se homogeneizó
y filtró a través de membrana de 0,45 µm x 25 mm (0,16 mg/mL).
- Muestra 100%
Se pesó un aproximado de 40 mg de mentol estándar y transfirió en un
matraz volumétrico de 200 mL, se añadió 4 mL de estándar interno, se
disolvió utilizando un ultrasonido y enrasó con metanol, se homogeneizó
y filtró a través de membrana de 0,45 µm x 25 mm (0,2 mg/mL).
- Muestra 120%
Se pesó un aproximado de 48 mg de mentol estándar y transfirió en un
matraz volumétrico de 200 mL, se añadió 4 mL de estándar interno, se
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disolvió utilizando un ultrasonido y enrasó con metanol, se homogeneizó
y filtró a través de membrana de 0,45 µm x 25 mm (0,24 mg/mL).
- Muestra 160%
Se pesó un aproximado de 64 mg de mentol estándar y transfirió en un
matraz volumétrico de 200 mL, se añadió 4 mL de estándar interno, se
disolvió utilizando un ultrasonido y enrasó con metanol, se homogeneizó
y filtró a través de membrana de 0,45 µm x 25 mm (0,32 mg/mL).
b. Cálculos y análisis estadístico: 3,4,20,22
- Cálculo de la recta de regresión:
Se determinó la curva de calibración relacionando la respuesta (ratio) con
la concentración del analito sobre los puntos sin promedio.
Ecuación de la recta:
Siendo:
X : Concentración de analito (mg/mL)
Y : Ratio del pico cromatográfico
b : Valor de la pendiente de la recta
a : Valor del intercepto o del término independiente de la recta
con el eje “Y”
Donde:
aXbY
n
X
i
n
YiXi
iX
YiXib 2
2
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- Coeficiente de correlación (r)
El coeficiente de correlación "r" refleja el grado de relación o ligazón
existente entre las variables X (concentración) e Y (respuesta). Si es
cercano a la unidad significa que existe correlación con una probabilidad
elevada.
Criterio de aceptación:
r no debe ser significativamente diferente de 1. Valores mayores a 0,999
se consideran como aceptables.
- Coeficiente de determinación r2
Es el cuadrado del coeficiente de correlación "r" e indica la proporción
de la varianza total de "Y".
Criterio de aceptación:
r2 no debe ser significativamente diferente de 1. Valores mayores a 0,990
se consideran como aceptables.
- Test de verificación de la pendiente “b” o de la Linealidad (Límites
de confianza de la pendiente y test de t para n-2 grados de libertad y
p=0,05)
n
XibYia
n
iY
in
Xi
i
n
YiXi
YX
YiXir
2
2
2
2
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Varianza del error experimental total o Residual (S2y,x):
Varianza de la pendiente (S2b):
Desviación estándar de la pendiente (Sb):
Desviación estándar relativa de la pendiente (Sb rel. (%)):
Límites de confianza de la pendiente:
b ± tSb
Test de t:
2
2
2
,
n
xybyays xy
n
xx
Ss
xy
b 2
2
2
,2
2
bb ss
100.(%) xb
SrelS b
b
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Criterios de aceptación
En los límites de confianza de la pendiente, estos no incluyen el cero.
Test de t, texp > ttabla para n-2 grados de libertad y un nivel de confianza
del 95% (p=0,05), para que “b” sea diferente de cero (Ha).
- Test de verificación de la variable independiente (Intercepto) o de
proporcionalidad “a” (Límites de confianza del término
independiente y test de t para n-2 grados de libertad y p=0,05)
Varianza del término independiente o intercepto (S2a):
Desviación estándar del término independiente o intercepto (Sa):
Desviación estándar relativa del término independiente o intercepto
(Sarel. (%)):):
Limites de confianza del término independiente o intercepto:
a ± tSa
bS
bt exp
n
xxSs ba
2
22
2
aa Ss
100.(%) xa
SrelS a
a
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Test de t:
Criterios de aceptación:
En los límites de confianza del término independiente o intercepto, estos
incluyen el cero.
Test de t, texp > ttabla para n-2 grados de libertad y un nivel de confianza
del 95% (p=0,05), para que “a” sea estadísticamente igual a cero (Ho).
- Test estadístico del coeficiente de correlación "r"
HO: No hay correlación entre X e Y
Ha: Hay correlación entre X e Y
Donde:
r : Coeficiente de correlación lineal
n : Número de determinaciones
Criterio de aceptación:
Si el valor de tr obtenido es mayor que el ttabla calculado para (n-2) grados
de libertad y un nivel de confianza del 95% (α=0,05), entonces existe
correlación lineal significativa.
- Test de linealidad
Se define obteniendo el factor de respuesta (f) por cada determinación:
X
Yf
aS
at exp
21
2
r
nrtr
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Donde:
X : Concentración de analito (mg/mL)
Y : Ratio del pico cromatográfico
Criterio de aceptación
DSR f ≤ 2 %
3.2.4.3.2. Linealidad de la muestra
Se determinó preparando soluciones de muestra en concentraciones del
40%, 80%, 100%, 120% y 160% por triplicado, considerándose como
100% la cantidad de 1,32 g de muestra.
a. Preparación de las muestras
- Muestra 40%
En un matraz volumétrico de 50 mL se pesó un aproximado de 0,53 g de
muestra, se añadió 30 mL de metanol, colocó a baño maría hasta obtener
una solución homogénea, se dejó enfriar y enrasó con metanol, luego se
transfirió 5 mL de está solución en un matraz volumétrico de 50 mL y
añadió 1 mL de estándar interno, se disolvió y enrasó con metanol,
homogeneizó y filtró a través de membrana de 0,45 µm x 25 mm.
- Muestra 80%
En un matraz volumétrico de 50 mL se pesó un aproximado de 1,06 g de
muestra, se añadió 30 mL de metanol, colocó a baño maría hasta obtener
una solución homogénea, se dejó enfriar y enrasó con metanol, luego se
transfirió 5 mL de está solución en un matraz volumétrico de 50 mL y
añadió 1 mL de estándar interno, se disolvió y enrasó con metanol,
homogeneizó y filtró a través de membrana de 0,45 µm x 25 mm.
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- Muestra 100%
En un matraz volumétrico de 50 mL se pesó un aproximado de 1,32 g de
muestra, se añadió 30 mL de metanol, colocó a baño maría hasta obtener
una solución homogénea, se dejó enfriar y enrasó con metanol, luego se
transfirió 5 mL de está solución en un matraz volumétrico de 50 mL y
añadió 1 mL de estándar interno, se disolvió y enrasó con metanol,
homogeneizó y filtró a través de membrana de 0,45 µm x 25 mm.
- Muestra 120%
En un matraz volumétrico de 50 mL se pesó un aproximado de 1,58 g de
muestra, se añadió 30 mL de metanol, colocó a baño maría hasta obtener
una solución homogénea, se dejó enfriar y enrasó con metanol, luego se
transfirió 5 mL de está solución en un matraz volumétrico de 50 mL y
añadió 1 mL de estándar interno, se disolvió y enrasó con metanol,
homogeneizó y filtró a través de membrana de 0,45 µm x 25 mm.
- Muestra 160%
En un matraz volumétrico de 50 mL se pesó un aproximado de 2,11 g de
muestra, se añadió 30 mL de metanol, colocó a baño maría hasta obtener
una solución homogénea, se dejó enfriar y enrasó con metanol, luego se
transfirió 5 mL de está solución en un matraz volumétrico de 50 mL y
añadió 1 mL de estándar interno, se disolvió y enrasó con metanol,
homogeneizó y filtró a través de membrana de 0,45 µm x 25 mm.
Se realizó el análisis de regresión lineal y el correspondiente análisis
estadístico como lo indicado en la linealidad del estándar.
3.2.4.4. Precisión
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3.2.4.4.1. Aptitud del sistema
Se preparó la solución estándar según lo descrito en el ítem 2.3. e inyectó
6 veces consecutivas, para evaluar la dispersión de las mismas.
a. Cálculos
- Se cálculo la desviación estándar relativa (RSD)
Criterio de aceptación3
La desviación estándar relativa de los ratios hallados debe ser ≤ 2%.
3.2.4.4.2. Precisión del método
a. Solución estándar
Se preparó la solución estándar según lo descrito en el ítem 2.3. e inyectó
5 veces.
b. Soluciones muestra:
- Muestra al 80%
En un matraz volumétrico de 50 mL se pesó un aproximado de 1,06 g de
muestra, se añadió 30 mL de metanol, colocó a baño maría hasta obtener
una solución homogénea, se dejó enfriar y enrasó con metanol, luego se
transfirió 5 mL de está solución en un matraz volumétrico de 50 mL y
PX
sRSD
100.
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añadió 1 mL de estándar interno, se disolvió y enrasó con metanol,
homogeneizó y filtró a través de membrana de 0,45 µm x 25 mm.
- Muestra al 100%
En un matraz volumétrico de 50 mL se pesó un aproximado de 1,32 g de
muestra, se añadió 30 mL de metanol, colocó a baño maría hasta obtener
una solución homogénea, se dejó enfriar y enrasó con metanol, luego se
transfirió 5 mL de está solución en un matraz volumétrico de 50 mL y
añadió 1 mL de estándar interno, se disolvió y enrasó con metanol,
homogeneizó y filtró a través de membrana de 0,45 µm x 25 mm.
- Muestra al 120%
En un matraz volumétrico de 50 mL se pesó un aproximado de 1,58 g de
muestra, se añadió 30 mL de metanol, colocó a baño maría hasta obtener
una solución homogénea, se dejó enfriar y enrasó con metanol, luego se
transfirió 5 mL de está solución en un matraz volumétrico de 50 mL y
añadió 1 mL de estándar interno, se disolvió y enrasó con metanol,
homogeneizó y filtró a través de membrana de 0,45 µm x 25 mm.
Se repitió el análisis de la misma muestra 2 veces adicionales, en 2 días
diferentes y por un analista diferente cada vez.
c. Cálculos y análisis estadístico:
La precisión se expresa matemáticamente como la desviación estándar
(S) o como la desviación estándar relativa (DSR). El estimador de la
desviación estándar se calculó como:
11
2
n
XX
n
i
pi
s
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Donde:
n : Número de determinaciones
Xi : Valor medido por el ensayo i
Xp : Estimador de la media proporcional
La desviación estándar relativa (RSD) se calculó como:
Se evaluó la precisión del método a nivel de repetibilidad y precisión
intermedia:
- Repetibilidad:
Se evaluó los resultados obtenidos por un mismo analista, el mismo día y
en la misma serie de análisis.
- Precisión intermedia:
Se evaluó los resultados obtenidos en el análisis de la misma muestra
por los tres analistas en los tres diferentes días.
Criterio de aceptación3
Repetibilidad : DSR ≤ 2%
Precisión intermedia : DSR ≤ 2%
n
X
p
n
i
i
X
1
PX
sRSD
100.
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III. RESULTADOS
Cuadro 1: Parámetro de Selectividad para la validación del método analítico
por cromatografía de gases para cuantificar mentol en ungüento
Prueba Criterio de aceptación Resultado Conformidad
Identificación
Estándar Presencia del pico en
el tR de mentol
tRpromedio=14,285
Conforme
Muestra tRpromedio=14,286
Interferencias
Estándar
Presencia de pico en
el tR de mentol
Presencia Conforme
Muestra Presencia Conforme
Blanco
Ausencia de pico en el
tR de mentol
Ausencia Conforme
Placebo Ausencia Conforme
Placebo + principio
activo Ausencia Conforme
Análisis de muestras sometidos a condiciones de estrés
Placebo tratado
(Termólisis) Ausencia de
Ausencia Conforme
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Tiempo de retención (tR)
Cuadro 2: Parámetro de Exactitud para la validación del método analítico
por cromatografía de gases para cuantificar mentol en ungüento
*Tabla G de Cochran (Gtabla: 0,8709) para: p=0,05; k=3 y n=3
**Tabla t de Student (ttabla: 2,306) para: α=0,05 y n-1 grados de libertad
Placebo tratado
(Fotolisis) interferentes en el tR
del pico de mentol
Ausencia Conforme
Placebo
(Hidrólisis acida) Ausencia Conforme
Placebo
(Hidrólisis alcalina) Ausencia Conforme
Placebo (Oxidación) Ausencia Conforme
Muestra tratada
(Termólisis) Ausencia de
interferentes en el tR
del pico de mentol y
Resolución (Rs)≥ 1,5
Ausencia/Rs=86,601 Conforme
Muestra tratada
(Fotolisis) Ausencia/Rs=14,776 Conforme
Muestra
(Hidrólisis acida) Ausencia/Rs=89,698 Conforme
Análisis de las muestras sometidos a condiciones de estrés
Muestra
(Hidrólisis alcalina)
Ausencia de
interferentes en el tR
del pico de mentol, Resolución (Rs)≥ 1,5
Ausencia/Rs=128,912 Conforme
Muestra (Oxidación) Ausencia/Rs=83,529 Conforme
Estimadores
estadísticos Criterio de aceptación Resultado Conformidad
Porcentaje de
recuperación
promedio
98– 102% 100,07% Conforme
G de Cochran* Gexp ˂ Gtabla 0,6803 Conforme
test de Student** texp ˂ ttabla 0,4175 Conforme
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Cuadro 3: Parámetro de Linealidad del estándar para la validación del
método analítico por cromatografía de gases para cuantificar mentol en
ungüento
Estimadores estadísticos Criterio de
aceptación
Resultado Conformidad
Coeficiente de correlación
(r) r > 0,995 0,9999 Conforme
Coeficiente de
determinación (r2) r2 > 0,990 0,9998 Conforme
Estimadores estadísticos Criterio de
aceptación
Resultado Conformidad
Test de verificación de la
pendiente
- Límite de
confianza
(LC)
- Test de t
LC no incluye el
cero
texp > ttabla
LS=0,0077
LI=0,0076
texp=285,6489
ttabla=2,160
Conforme
Test de verificación de la
variable independiente
- Límite de
confianza
(LC)
- Test de t
LC incluye el cero
texp ˂ ttabla
LS=-0,0195
LI=0,0055
texp=1,2142
ttabla=2,160
Conforme
Test estadístico del
coeficiente de correlación
"r"*
tr > ttabla 285,6489 Conforme
Test de linealidad DSR ≤ 2% 0,52% Conforme
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*ttabla: 2.160 para: α=0,05 y n-2 grados de libertad
Y = 0,0077 X – 0,0070
Límite inferior (LI), Límite superior (LS)
Cuadro 4: Parámetro de Linealidad de la muestra de la validación del
método analítico por cromatografía de gases para cuantificar mentol en
ungüento
Estimadores estadísticos Criterio de
aceptación
Resultado Conformidad
Coeficiente de correlación
(r) r > 0,995 0,9987 Conforme
Estimadores estadísticos Criterio de
aceptación
Resultado Conformidad
Coeficiente de
determinación (r2) r2 > 0,990 0,9973 Conforme
Test de verificación de la
pendiente
- Límite de
confianza
- Test de t
LC no incluye el
cero
texp > ttabla
LS=0,0075
LI=0,0080
texp=69,3531
ttabla=2,160
Conforme
Test de verificación de la
variable independiente
- Límite de
confianza
- Test de t
LC incluye el
cero
texp ˂ ttabla
LS=-0,0735
LI=0,0393
texp=0,6544
ttabla=2,160
Conforme
Test estadístico del
coeficiente de correlación tr > ttabla
69,3531 Conforme
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*ttabla: 2.160 para: α=0,05 y n-2 grados de libertad
y = 0,0078 x -0,0171
Cuadro 5: Parámetro de Aptitud del sistema para la validación del método
analítico por cromatografía de gases para cuantificar mentol en ungüento
Cuadro 6: Parámetro de Precisión del método para la validación del método
analítico por cromatografía de gases para cuantificar mentol en ungüento
"r"*
Test de linealidad DSR ≤ 2% 1,94% Conforme
Estimadores
estadísticos Criterio de aceptación Resultado Conformidad
DRS de ratios DSR ≤ 2% 0,16% Conforme
Estimadores
estadísticos Criterio de aceptación Resultado Conformidad
Repetibilidad DSR ≤ 2% 0,41% Conforme
Precisión
intermedia
DSR ≤ 2%
0,33% Conforme
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IV. DISCUSIÓN
En el presente trabajo se desarrolló un método analítico por cromatografía de gases
para la cuantificación de mentol en ungüento, el cual no figura en ninguna obra
oficial. Por tanto debe ser validado previamente a su uso en rutina, con el fin de
garantizar un alto grado de confiabilidad, seguridad y calidad de los resultados, lo
cual se traduce en disminución de errores y repeticiones del análisis.
La selectividad es un parámetro definido según la Conferencia internacional sobre la
armonización de requerimientos técnicos para el registro de productos farmacéuticos
para uso humano (ICH), como la habilidad para evaluar inequívocamente al analito
en busca de la presencia de componentes esperados como impurezas, productos de
degradación y componentes de la matriz. Realizada a través de las pruebas de
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identificación para asegurar la identidad del analito, aplicada también a las sustancias
relacionadas para asegurar de no obtener resultados positivos y la determinación de
la pureza en el que se evalúa la separación de los componentes a través de la
resolución de los mismos, que eluyen cerca el uno del otro 4.
En el Cuadro 1, encontramos los resultados obtenidos de la prueba de identificación,
así mediante el uso de cromatogramas se identificó que el mentol en la solución
estándar tiene un tiempo de retención (tR) promedio igual a 14,285 y al compararlo
con el tR promedio del pico generado de la muestra; el cual es igual a 14,286, se
puede afirmar que ésta contiene mentol, por lo tanto el resultado es conforme.
Se evaluó la ausencia de interferentes en las soluciones relacionadas en los ensayos
como el blanco, placebo y placebo más el principio activo de salicilato de metilo;
mediante el uso de cromatogramas, con la finalidad de discriminar la presencia de
componentes que puedan ser identificados en el mismo tR del mentol, de los
resultados se halló la ausencia de picos con similar tR que el mentol.
La determinación de la pureza se realizó mediante el análisis de la muestra y el
placebo sometido a condiciones de estrés como termólisis, fotolisis, hidrólisis acida,
hidrólisis alcalina y oxidación. Se determinó que la muestra y el placebo son
susceptibles a la formación de productos de degradación, por lo cual se evaluó la
ausencia de interferentes en el tR del mentol en los placebos y las muestras, además
se consideró para esta última que la separación del interferente próximo al pico de
mentol deberá tener una resolución mayor o igual a 1,5 para asegurar que los
componentes de la mezcla se separen adecuadamente. De los resultados se obtuvó la
ausencia de interferentes en el tR del mentol en los placebos y las muestras, en este
último también se determinó una resolución mayor a 1,5 de los interferentes
próximos con respecto al pico del mentol presente en la muestra, demostrando que el
resultado del ensayo no es afectado por la presencia de los excipientes y otros
interferentes.
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La exactitud; según la Guía de validación de métodos analíticos de la Asociación
Española de Farmacéuticos de la Industria (AEFI), puede evaluarse mediante la
recuperación del analito denominado porcentaje de recuperación. También mediante
la aplicación del test G de Cochran (Gexp < Gtabla), para determinar si el factor
concentración tiene alguna influencia en los resultados. El test de t student (texp <
ttabla) para evaluar la diferencia significativa entre la recuperación media y 100 20,21.
En el cuadro 2, el porcentaje de recuperación promedio obtenido fue de 100,07% del
principio activo de mentol siendo los límites de aceptación de 98 -102%. Mediante el
test G de Cochran se determinó el Gexp=0,6803 y Gtabla=0,8709; al comparar del valor
de Gexp con Gtabla, se observó que este último es mayor, por lo tanto las varianzas de
las tres concentraciones utilizadas son iguales; es decir, el factor concentración no
influye en la variabilidad de los resultados. Como tercer estimador analítico se
consideró el “t Student”, donde el valor de texp=0,4175 es menor que el ttabla= 2,306;
al ser texp menor al ttabla no existe diferencia significativa entre la recuperación media
y el 100% confirmándose que el método es exacto.
Para evaluar el parámetro de linealidad; la USP 34 y la Guía de validación de
métodos analíticos de la AEFI, establecen que los resultados deben hallarse mediante
métodos estadísticos adecuados como el cálculo de una línea de regresión por el
método de los mínimos cuadrados, la intersección con el eje de ordenadas (b), la
pendiente de la línea de regresión (m) y la suma de los cuadrados residuales. Así
también se debe presentar el coeficiente de correlación (r) el cual indica el grado de
relación entre la variable X (concentración) y la variable Y (respuesta), el valor
recomendable es ≥ 0,995. El coeficiente de determinación (r2), expresa la proporción
de la variación total de Y explicada por el método, el valor recomendable es ≥ 0,990
3,20,22.
El test de linealidad, verificado mediante el coeficiente de variación de los factores
de respuesta (f), éste expresa la relación entre respuesta y la concentración, siendo
recomendable considerar la desviación estándar relativa (RSD) ≤ 2%; o la
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significación estadística de la desviación estándar de la pendiente mediante la prueba
t de Student, empleada para comprobar que exista una pendiente significativamente
distinta de cero. El test de proporcionalidad, el cual permite evaluar si la recta pasa
por el origen de coordenadas determinando si la variable independiente es
significativamente distinta de cero. El test estadístico del coeficiente de correlación
"r" (tr > ttabla) permite determinar si el coeficiente correlación “r” es lo
suficientemente grande para afirmar que hay correlación entre los valores X y Y
3,20,22.
En el cuadro 3 y 4, la ecuación de la recta de las cinco concentraciones de la solución
estándar resultó Y=0,0077X - 0,0070 y de la muestra Y=0,0078X - 0,0171. Del
análisis estadístico se obtuvó un valor de r=0,9999 para el estándar y r=0,9987 para
la muestra; para n-2 grados de libertad (n=15), lo cual demuestra que existe una
correlación positiva con una probabilidad superior al 99,99% para el estándar y una
probabilidad del 99,87% para la muestra. El valor de r2 para la solución estándar fue
de 0,9998 y de la muestra 0,9973; lo que significa que la variable independiente o
intercepto explica un 99,98% y 99,73% de la varianza total de Y respectivamente en
el estándar y la muestra.
En la linealidad del estándar, los límites de confianza de la pendiente hallados fueron
0,0077 y 0,0076; este intervalo no incluye el cero, en la aplicación del test de t el
valor hallado de texp=285,6489 es mayor al ttabla=2,160; por lo tanto se rechaza la
hipótesis nula (b=0) y se acepta la hipótesis alternativa (b≠0); es decir, el valor
hallado indica que la probabilidad de ser b ≠ 0 es muy elevada (> 99,5%). Los límites
de confianza del término independiente o intercepto hallados fueron de -0,0195 y
0,0055; este intervalo incluye el cero, en el test de t el valor obtenido de texp=1,2142
es menor al ttabla=2,160; por lo tanto no se rechaza la hipótesis nula (a=0); es decir,
éste valor hallado indica que la probabilidad de ser a=0 es mayor (Superior al
99,5%), lo que significa que la ordenada en el origen es estadísticamente igual a cero.
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En la linealidad de la muestra, los límites de confianza de la pendiente hallados se
encuentran entre 0,0075 y 0,0080; este intervalo no incluye el cero, en la aplicación
del test de t el valor obtenido de texp=69,3531 es mayor al ttabla=2,160; por lo tanto se
rechaza la hipótesis nula (b=0) y se acepta la hipótesis alternativa (b≠0); es decir, el
valor hallado indica que la probabilidad de ser b ≠ 0 es muy elevada (> 99,5%). Los
límites de confianza del término independiente o intercepto obtenidos fueron de -
0,0735 y 0,0393; este intervalo incluye el cero, en el test de t el valor hallado de
texp=0,6544 es menor al ttabla=2,160; por lo tanto no se rechaza la hipótesis nula
(a=0); es decir, éste valor hallado indica que la probabilidad de ser a=0 es mayor
(Superior al 99,5%), lo que significa que la ordenada en el origen es estadísticamente
igual a cero.
En la aplicación del test estadístico del coeficiente de correlación "r", el valor
obtenido en la solución estándar fue tr=285,6489, para la muestra fue tr=69,3531 y el
ttabla=2,16; al hacer las comparaciones de los tr obtenidos con el ttabla se observó que
este último es menor que los dos primeros, con lo cual se rechaza la hipótesis nula
(HO: No hay correlación entre X e Y); es decir, hay una correlación significativa
entre los valores X y Y.
En la aplicación del test de linealidad, se determinó el valor promedio de f=0,0076
para la solución estándar y f=0,0077 para la muestra, los cuales indican que no existe
diferencia significativa entre el valor de la pendiente del estándar y de la muestra con
respecto a los valores de f hallados de cada determinación. Así también se halló el
valor de RSD=0,52% para la solución estándar y un RSD=1,94% para la muestra; los
cuales cumplen el test de linealidad.
La aptitud del sistema, es usado para verificar que las condiciones cromatográficas
sean adecuadas para el análisis; asimismo, según las recomendaciones dadas por la
USP 34 considera la expresión de la precisión del sistema como la RSD de
inyecciones repetidas de una solución estándar, siendo RSD ≤ 2% 3.
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En el cuadro 5, el RSD obtenido del análisis de las respuestas (ratios) halladas de la
solución estándar fue de 0,16%, por tanto las condiciones del sistema son adecuadas
para el análisis de cuantificación del mentol.
Tenemos como último parámetro de validación la precisión del método, según la
USP 34 la precisión de un procedimiento analítico habitualmente se expresa como el
RSD de una serie de medidas, considerándose el valor de RSD ≤ 2%. La precisión
puede considerarse en tres niveles repetibilidad, precisión intermedia y
reproducibilidad 3,24.
En el cuadro 6, dentro de las pruebas que se realizó incluyeron la repetibilidad y la
precisión intermedia. En la repetibilidad se obtuvó un RSD de 0,41% del ensayo
realizado por un analista. Para el caso de la precisión intermedia, se realizó
considerando el análisis en diferentes días y por un analista diferente cada día, se
analizó en las concentraciones del 80%, 100% y 120%, obteniendo un RSD de
0,33%. Con lo cual se comprobó el grado de concordancia (grado de dispersión)
entre una serie de medidas múltiples a partir de muestras homogéneas en las
condiciones establecidas en el método analítico aplicado.
De este modo, podemos constatar que el método fue suficientemente preciso, por lo
que no repercutieron apreciablemente los errores aleatorios en la determinación
considerando que la variabilidad del método puede deberse a errores aleatorios
inherentes a todo método de ensayo.
Los factores susceptibles a influir sobre los resultados de un ensayo no pueden ser
siempre controlados como: el analista, el equipo instrumental, los reactivos, el
tiempo, etc, es por ello la importancia de este parámetro de validación.
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V. CONCLUSIONES
1. El método analítico desarrollado para la cuantificación de mentol en
ungüento por cromatografía de gases cumple con los parámetros de
validación (Especificidad, Exactitud, Linealidad y Precisión) establecidos
por la USP 34 para el uso específico previsto.
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VI. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
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Productos Farmacéuticos. Informe de la Dirección General de Medicamentos,
Insumos y Drogas: DIGEMID; 1999;2: 19-20:26
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Validación de técnicas analíticas utilizadas en el control de la calidad. Rev
Cubana Farm [revista en internet] 1997 Noviembre-Enero. [acceso 05 de
marzo del 2012]; 32(2). Disponible en:
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en United Book Press; 2011.
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the Registration of Pharmaceuticals for Human Use. ICH [Sede Web] 2005.
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ANEXOS
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ANEXO 1: TABLAS MILITAR ESTÁNDAR 105E
CODIGO DE
INSPECCIÓN
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NIVEL DE
ACEPTACIÓN
Fuente:
- Military Standard: Sampling procedures and tablesfor inspection by attributes.
- ISO 2859.
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1
ANEXO 2: ESQUEMA DEL MÉTODO
- Preparación del estándar interno
- Preparación del estándar
1 mL 1-Butanol
Fiola 100 mL Enrasar con metanol
Homogeneizar
Filtrar
Pesar aproximadamente
100 mg de mentol
estándar
Enrasar con metanol
Homogeneizar Transferir 5
mL
Añadir 1 mL
estándar interno y
enrasar con metanol
Homogeneizar
Filtrar
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- Preparación de la muestra
Añadir 30 mL
metanol
Baño María
Enfriar
Enrasar con metanol
Homogeneizar Transferir 5
mL
Añadir 1 mL
estándar interno y
enrasar con metanol
Homogeneizar
Filtrar
Pesar aproximadamente
1,32 g de Muestra
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- Termólisis
ÁNALISIS DE MUESTRAS SOMETIDAS A CONDICIONES DE ESTRES
Pesar aproximadamente
1,32 g de Placebo tratado
Añadir 30 mL
metanol
Baño María Enrasar con metanol
Homogeneizar
Transferir 5
mL
Añadir 1 mL
estándar interno y
enrasar con metanol
Homogeneizar
Filtrar
105°C X 5 h
15 g Placebo
y Muestra
Pesar aproximadamente
1,32 g de Muestra tratada
Enfriar
Homogeneizar
Enrasar con metanol
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- Fotolisis
Pesar aproximadamente
1,32 g de Placebo tratado
Añadir 30 mL
metanol
Baño María Enrasar con metanol
Homogeneizar
Transferir 5
mL
Añadir 1 mL
estándar interno y
enrasar con metanol
Homogeneizar
Filtrar
105°C X 5 h
15 g Placebo
y Muestra
Pesar aproximadamente
1,32 g de Muestra tratada
Enfriar
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- Hidrólisis alcalina
Pesar aproximadamente
1,32 g de Placebo
5 mL
NaOH 1N Baño María
Homogeneizar
Transferir 5
mL Homogeneizar
105°C X 5 h
Pesar aproximadamente
1,32 g de Muestra
Enfriar Ebullición
x 1h
Enfriar
5 mL HCl
1N Añadir 30 mL
metanol
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- Hidrólisis acida
Enrasar con metanol Añadir 1 mL
estándar interno y
enrasar con metanol
Filtrar
Pesar aproximadamente
1,32 g de Placebo
5 mL
NaOH 1N
Baño María
Transferir 5
mL
105°C X 5 h
Pesar aproximadamente
1,32 g de Muestra
Enfriar Ebullición
x 1h
Enfriar
5 mL HCl
1N Añadir 30 mL
metanol
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- Oxidación
Enrasar con metanol
Homogeneizar
Añadir 1 mL
estándar interno y
enrasar con metanol
Homogeneizar
Filtrar
Pesar aproximadamente
1,32 g de Placebo
Baño maría
60m°C x 2h
Baño María
Transferir 5
mL
105°C X 5 h
Pesar aproximadamente
1,32 g de Muestra
Enfriar
5 gotas de Peróxido
de hidrogeno
Enfriar
Añadir 30 mL
metanol
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Enrasar con metanol
Homogeneizar
Añadir 1 mL
estándar interno y
enrasar con metanol
Homogeneizar
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- Muestra al 80%
EXACTITUD
Pesar 0.8 g Placebo
32 mg de estándar
mentol
Fiola 200 mL
100 mL metanol 4 mL estándar
interno
Baño maría
Hasta
homogeneizar
Enfriar
Enrasar con metanol
Homogeneizar
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10
- Muestra al 100%
- Muestra al 120%
Pesar 1 g Placebo
40 mg de estándar
mentol
Fiola 200 mL
100 mL metanol 4 mL estándar
interno
Baño maría
Hasta
homogeneizar
Enfriar
Enrasar con metanol
Homogeneizar
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Pesar 1,2 g Placebo
48 mg de estándar
mentol
Fiola 200 mL
100 mL metanol 4 mL estándar
interno
Baño maría
Hasta
homogeneizar
Enfriar
Enrasar con metanol
Homogeneizar
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P 80 mg de mentol
estándar
P 32 mg de mentol
estándar
P 40 mg de mentol
estándar
Fiola 100mL
enrasar con
Metanol
Transferir 5mL
Fiola 50mL
Añadir 4 mL estándar
interno y enrasar con
metanol
Estándar 40%
P 48 mg de mentol
estándar
Fiola 200mL
Añadir 1 mL estándar
interno y enrasar con
metanol
Estándar 80%
Estándar 100%
Estándar 120%
LINEALIDAD DEL ESTANDAR
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P 0.53g de Muestra
P 1.06g de Muestra
P 1.32g de Muestra
Muestra 40%
Muestra 80%
Añadir 30mL
metanol
Baño Maria Enfriar y
enrasar
metanol
Transferir 5mL
- Añadir 1mL
de estándar
interno
Muestra 100%
LINEALIDAD DE LA MUESTRA
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Muestra 160%
P 2.11g de Muestra
P 1.58g de Muestra Muestra 120%
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- Muestras
PRECISIÓN DEL MÉTODO
80% - Pesar 1,06 g Muestra
Fiola 50 mL
Añadir 30 mL
metanol
Enfriar
Enrasar con
metanol
Transferir 5
mL
Baño maría
100% - Pesar 1,06 g Muestra
120% - Pesar 1,06 g Muestra
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1 mL estándar
interno
Enrasar con metanol
Homogeneizar
Filtrar
Fiola 50 mL
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ANEXO 3: PARAMETRO DE VALIDACIÓN DE ESPECIFICIDAD
1. Identificación del pico de mentol en la muestra
Estándar secundario Mentol:
Lote: 1011260
Potencia: 99,03% Tal cual (T/C)
Protocolo: ST16/11
Reanálisis: 2012-09-15
Diluciones:
Resultados:
Solución Inyección tR Promedio
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Estándar
1 14,285 14,285
2 14,285
Muestra
1 14,287 14,286
2 14,286
Conclusión:
Se identificó que el mentol en la solución estándar tiene un tiempo de retención (tR) promedio igual a 14,285 y al compararlo con
el tR promedio del pico generado de la muestra; el cual es igual a 14,286, se puede afirmar que ésta contiene mentol, por lo tanto
el resultado es conforme.
2. Interferencias
Estándar secundario Mentol:
Lote: 1011260
Potencia: 99,03% Tal cual (T/C)
Protocolo: ST16/11
Reanálisis: 2012-09-15
Factores:
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Conclusión:
Ausencia de picos en el tiempo de retención del mentol en la solución blanco, placebo y placebo + principio activo (Salicilato de
metilo).
3. Análisis de muestras sometidas a condiciones de estrés
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Estándar secundario Mentol:
Lote: 1011260
Potencia: 99,03% Tal cual (T/C)
Protocolo: ST16/11
Reanálisis: 2012-09-15
Resultados:
Análisis de muestras sometidos a condiciones de estrés
Prueba Criterio de
aceptación Resultado Conformidad
Placebo tratado
(Termólisis)
Ausencia de
interferentes en el tR
del pico de mentol
Ausencia Conforme
Placebo tratado
(Fotolisis) Ausencia Conforme
Placebo
(Hidrólisis acida) Ausencia Conforme
Placebo Ausencia Conforme
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Tiempo de retención (tR)
Conclusión:
No existen compuestos potencialmente interferentes
(Hidrólisis alcalina)
Placebo (Oxidación) Ausencia Conforme
Muestra tratada
(Termólisis)
Ausencia de
interferentes en el tR
del pico de mentol y
Resolución (Rs)≥ 1,5
Ausencia/Rs=86,601 Conforme
Muestra tratada
(Fotolisis) Ausencia/Rs=14,776 Conforme
Muestra
(Hidrólisis acida) Ausencia/Rs=89,698 Conforme
Muestra
(Hidrólisis alcalina) Ausencia/Rs=128,912 Conforme
Muestra ( Oxidación) Ausencia/Rs=83,529 Conforme
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