“INOCULACIÓN COMBINADA DE HONGOS MICORRÍCICO-ARBUSCULARES Y Azospirillum spp. EN PLÁNTULAS DE BANANO (Musa paradisiaca)
MICROPROPAGADAS: EFECTOS SOBRE EL DESARROLLO Y CRECIMIENTO DURANTE LA FASE DE ACLIMATACIÓN”
ESCUELA POLITÉCNICA DEL EJÉRCITODEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA
INGENIERÍA EN BIOTECNOLOGÍA
ESPE-HOLDINGDINE
Tania Carina Villarreal Villarreal
Previo a la obtención del título de:INGENIERA EN BIOTECNOLOGÍA
100 millones ha 100 millones ton
(FAO,2004)
230.000 has32%
producción mundial
(AEBE, 2010)
INTRODUCCIÓN
INTRODUCCIÓN
Mejorar manejo agrícola
Agricultura sostenible
Incremento de la producción
.
Pérdida de fertilidad =
baja producción
Monocultivo
40% del Costo de producción
es para INSUMOS QUÍMICOS
(WRM, 2004)(AEBE ,2010)
Plantas micropropagadas
Hongos micorrícicos arbusculares
(HMA)
Bacterias promotoras
del crecimiento
vegetal
BIOTECNOLOGÍA
Objetivo GeneralAnalizar el efecto de la inoculación combinada de Hongos micorrícicos arbusculares (HMA) y Azospirillum sp, sobre el desarrollo y crecimiento de plántulas de banano (Musa paradisiaca) micropropagadas durante la fase de aclimatación.
Objetivos Específicos
OB
JETI
VO
S
- Aislar y propagar Azospirillum sp. y esporas de HMA nativas del cultivo de banano.
- Inocular y determinar el efecto de diferentes dosis de HMA y Azospirillum sp. así como su interacción, sobre las variables de crecimiento de la planta y el contenido de macro y micronutrientes en el tejido foliar y suelo
- Evaluar el % colonización y la población final de esporas en plántulas de banano micropropagadas durante la fase de aclimatación.
- Determinar la población final de Azospirillum sp. presente en el sustrato y en raíces de las plantas de banano.
- Determinar la dosis de HMA y de Azospirillum sp. que permitan obtener los mejores resultados respecto a las variables evaluadas.
HIPÓTESIS
La co-inoculación de HMA y Azospirillum sp. mejoran el crecimiento (altura, perímetro del pseudotallo, área foliar, biomasa aérea, biomasa radical y contenido de nutrientes) de las plántulas de banano micropropagadas durante la fase de aclimatación
MARCO TEÓRICO
Musa paradisiaca
CULTIVO DE BANANO
Condiciones ambientales
Requerimientos nutricionales
T= 25°CRiego=160-180
mm/mes
MacronutrientesN, P, K
MicronutrientesCa, Mg, S Fe, Mn,
Zn, B, Cu
HONGOS MICORRÍCICOS ARBUSCULARES (HMA)
HONGOS MICORRÍCICOS ARBUSCULARES
Coadyuvante microbiano
Asociación mutualista HONGO-PLANTA
85-95% especies
vegetales
(Bonfante & Anca, 2009)
Fase asimbiótica
Fase presimbiótica
Fase simbiótica
CICLO DE VIDA DE LOS HMA (DESARROLLO DE LA SIMBIOSIS)
Fase asimbiótica
Fase presimbiótica
Fase simbiótica
• Absorción de nutrientes y agua
• Resistencia a patógenos• Agregación del suelo
BENEFICIOS
BACTERIAS PROMOTORAS DEL CRECIMIENTO VEGETAL Azospirillum
Azospirillum
Bacilos Gram (-) Diazótrofa
pH 6 a 7T°= 30°C
Familia Rhodospirillaceae
Colonización interna• Ingreso por tejido
destruido• Acción de pectinasas
Colonización externa• Adsorción• Anclaje
INTERACCIÓN Azospirillum -PLANTA
MECANISMOS DE PROMOCIÓN DEL
CRECIMIENTO VEGETAL Producción de
fitohormonasFijación de Nitrógeno
Interacción con microorganismos rizosféricos
MAT
ER
IAL
ES
Y
MÉ
TOD
OS
Muestreo de suelo de 7 haciendas bananeras de HDineAgros S.A
• Conteo de esporas de HMA (Gendermann y Nicholson, 1963 modificado por Herrera, 2004)
• Selección de Hacienda Central
Figura 1. Conteo poblacional de esporas de HMA nativas del cultivo de banano en 7 hdas. Bananeras de HDineAgros S.A
Desarrollo del inóculo micorrícico mediante cultivo
trampa
Elaboración de cultivo trampa a) Desinfección y lavado de semillas, b) Llenado de macetas con sustrato, c) Siembra de semillas de avena, d) Riego con agua destilada,
d) Mantenimiento de cultivos trampa.
30% arena10% turba negra60% suelo negro
Figura 2. Incremento de la densidad poblacional de esporas de HMA en cultivo trampa de avena.
DISEÑO EXPERIMENTAL
Diseño completamente al azarRepeticiones: 9UE: 1 plantaTotal: 144 plantas
Transplante e inoculación de plántulas de banano con HMA
• Adecuación de cámara de crecimiento• Inoculación con HMA
a) Fraccionamiento de inóculo por tratamiento, b) Llenado de macetas con sustrato, c) Aplicación de tratamientos, d) Trasplante de plántulas de banano, e) Riego con solución nutritiva, f) Ubicación de macetas en cámara de crecimiento
Incubación 30°C /
14 d
Aislamiento de bacterias diazótrofas
Inoculación de Azospirillum• Aislamiento e identificación • Selección de la cepa inóculo• Inoculación
Selección de cepas Azospirillum “sospechosas”
Aislamiento y selección de Azospirillum
• Pruebas fenotípicas• Pruebas bioquímica
Pruebas de identificación
• Curva patrón AIA (Bric et al. 1991).
• Producción de AIA
Selección de la cepa inóculo
0 10 20 30 40 50 60 700
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8f(x) = 0.0126533120760261 x + 0.0302726562255798R² = 0.980749629416034
Concentración (μg/ml)
Abs
530
nm
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 500
1
2
3
4
5
6
7
Concentración de AIA producido por cepas de Azospirillum a di-ferentes tiempos de incubación
G1r G2r G3ra G3rb G4r G2 G4a G4b
Tiempo (h)
Con
cent
raci
ón (μ
g/m
l)
Figura 3. Curva patrón de ácido indól acético
Figura 4. Concentración de AIA producido por las cepas de Azospirillum
HMA •0, 50, 100 y 200 g•Transplante
AZO 1 •Volumen: 20 ml•70 días tras inoculación fúngica
AZO 2 •Volumen: 40 ml•98 días de inoculación con HMA
FIN•Evaluación a 150 días•Variables de crecimiento: H, P, AF, Biomasa, Nutrientes•Población final HMA y % colonización (Philips & Hayman, 1970)•Población final Azospirillum
RE
SULT
AD
OS
POBLACIÓN FINAL DE ESPORAS Y % COLONIZACIÓN MICORRÍCICA
Tabla 1. Efecto de la inoculación de HMA y Azospirillum sobre el incremento la población final
de esporas de HMA
Figura 5. Efecto de la inoculación de HMA y Azospirillum sobre el incremento la población final
de esporas de HMA
Tabla 2. Efecto de la inoculación de HMA y Azospirillum sobre el porcentaje de
colonización micorrícica
Girish, 2006: Azospirillum y Glomus fasciculatum en tomate
Población final de AzospirillumR
ESU
LTA
DO
S
+
Belimov et al, 1999: Azospirillum y HMA en cebada
Tabla 3. Población final de Azospirillum en suelo y raíces de banano
ALTURAR
ESU
LTA
DO
S
b = 0,05 d= 21,29
Figura 6. Modelo de Gompertz para la altura
Tabla 4. Efecto de la inoculación de HMA y Azospirillum sobre el incremento de altura
para el período 70-150 días
Figura 7. Efecto de la inoculación de HMA y Azospirillum sobre el incremento de altura para el
período 70-150 días
b = 0,05 d= 11,24
7H / Control
RE
SULT
AD
OS
PERÍMETRO
Figura 8. Modelo de Gompertz para el perímetro.
Tabla 5. Efecto de la inoculación de HMA y Azospirillum sobre el incremento de
perímetro para el período 70-150 días
Figura 9. Efecto de la inoculación de HMA y Azospirillum sobre el incremento de perímetro para el período 70-150 días
b = 0,03 d= 6,60
b = 0,13 d= 4,45
4P/Control
RE
SULT
AD
OS
ÁREA FOLIAR
Figura 10. Modelo de Gompertz para el área foliar
Tabla 6. Efecto de la inoculación de HMA y Azospirillum sobre el
incremento de área foliar para el período 70-150 días
Figura 11. Efecto de la inoculación de HMA y Azospirillum sobre el incremento del área foliar
para el período 70-150 días
16AF/Control
RE
SULT
AD
OS
BIOMASA AÉREA
Figura 12. Modelo de Gompertz para la biomasa aérea
Tabla 7. Efecto de la inoculación de HMA y Azospirillum sobre la biomasa aérea
Figura 13. Efecto de la inoculación de HMA y Azospirillum sobre la biomasa aérea de plantas de
banano.
12BA/Control
RE
SULT
AD
OS
BIOMASA RADICAL
Figura 14. Modelo de Gompertz para la biomasa radical
Tabla 8. Efecto de la inoculación de HMA y Azospirillum sobre la biomasa radical
Figura 15. Efecto de la inoculación de HMA y Azospirillum sobre la biomasa radical de plantas de
banano.
Yano-Melo et al, 1999: Glomus y Acaulospora (banano)Baset et al, 2009: Azospirillum Sp7 bananoJaizme et al, 2004: Bacillus+Glomus (banano)
4BR/Control
RE
SULT
AD
OS
CONTENIDO DE NUTRIENTESa b
cNUTRIENTES EN TEJIDO FOLIAR
a. Contenido de Nitrógenob. Contenido de Fósforoc. Contenido de Potasio
NUTRIENTES EN SUELOa. Contenido de Nitrógenob. Contenido de Fósforo
a b
Jaizme & Rodríguez, 2002: Glomus (3P , 3N)Baset et al (2009): Azospirillum Sp7 (2N , 2P)Girish, 2006: Glomus+Azospirillum (2N, 2P)
CONCLUSIONES1. La Hacienda Central poseía la mayor densidad poblacional de propágulos de HMA entre las 7 hdas.
bananeras evaluadas.
2. Utilizando 30% de suelo de la Hacienda Central, un sustrato de suelo - arena (1:1) y plantas de avena como hospederas, se obtuvo (tras cinco meses de propagación) un inóculo micorrícico que contenía 10 esporas/g de suelo.
3. La cepa G4b de Azospirillum fue la que produjo mayor cantidad de AIA (6,33 μg/ml) en relación a las cepas restantes y fue seleccionada como cepa inóculo.
4. La co-inoculación de 200 g de HMA y 1,5E8 UFC/ml de Azospirillum favorece el crecimiento de las plántulas de banano, permitiendo incrementar 7 veces la altura, 4 veces el perímetro, 16 veces el área foliar, 12 veces la biomasa aérea y 8 veces la biomasa radical, en relación a las plantas control.
CONCLUSIONES
5. La co-inoculación de 200 g de HMA y 1,5E8 UFC/ml de Azospirillum promueve una mejor absorción de fósforo y nitrógeno.
6. La población final de esporas de HMA y el porcentaje de colonización, son favorecidos por la co-inoculación de Azospirillum, alcanzando los mayores valores (62,67 esporas/g y 96,67%) para la interacción de HMA- Azospirillum en sus mayores dosis
7. La población final de Azospirillum incrementa cuando se co-inoculan con HMA.
RECOMENDACIONES• Realizar un ensayo similar utilizando menor número de tratamientos y más repeticiones para lograr obtener
resultados que permitan determinar en forma concreta el efecto de cada uno de los microorganismos y de su interacción sobre el desarrollo y nutrición de banano.
• Evaluar el efecto de mayores concentraciones de Azospirillum sobre el desarrollo de plántulas de banano, a fin de determinar la concentración máxima que beneficia a la planta y la dosis a la que se registran perjuicios sobre su desarrollo.
• Incrementar el porcentaje de turba en el sustrato para el crecimiento de las plantas o aumentar el tiempo de aplicación de solución nutritiva, a fin de alcanza niveles óptimos de fósforo en el suelo que no perjudiquen a los HMA pero que permitan una adecuada nutrición de las plantas.
• Evaluar la productividad de las plantas de banano co-inoculadas con HMA y Azospirillum en campo.
GRACIAS