ESTUDIO DE LA COMPOSICIÓN QUÍMICA Y ACTIVIDAD
ANTIBACTERIANA DEL ACEITE ESENCIAL DE LA ESPECIE Chromolaena
meridensis(B.L. Rob.) R.M. King&H. Rob., sinonimia: Eupatorium
meridenseRobinson.
(ASTERACEAE).
ESTUDIO DE LA COMPOSICIÓN QUÍMICA Y ACTIVIDAD
ANTIBACTERIANA DEL ACEITE ESENCIAL DE LA ESPECIE
Chromolaena meridensis (B.L. Rob.) R.M. King & H. Rob., sinonimia:
Eupatorium meridense Robinson.
(ASTERACEAE).
BACHILLERES:NOVOA P. YOMAIRA.GUÉDEZ C. MARY A.
TUTORA: DIOLIMAR BUITRAGO.
MÉRIDA, JULIO DEL 2012.
UNIVERSIDAD DE LOS ANDESFACULTAD DE FARMACIA Y BIOANÁLISIS
ESCUELA DE BIOANÁLISISINSTITUTO DE INVESTIGACIONES
Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la EspecieChromolaena meridensis.
i
AGRADECIMIENTOS.
En primer lugar el agradecimiento más grande a Dios poracompañarnos todos los días durante este largo trayecto de nuestrasvidas, por haber consolado nuestros corazones cuando tuvimos que
pasar situaciones difíciles, ahora gracias a él culminamos un escalónmás en nuestras vidas para empezar uno nuevo.
A nuestros padres trabajadores incansables, gracias por el apoyo tangrande que desde niñas nos brindaron, hoy logramos cumplir conéxito uno de nuestros propósitos más grandes, por sus consejos tan
valiosos que definitivamente nos han conducido por el caminocorrecto, por habernos animado constantemente a seguir adelante. A
ustedes dedicamos estas palabras y todos los éxitos que podamosalcanzar. Los amamos.
A la profesora Diolimar Buitrago en calidad de Directora de tesis ya la profesora María Eugenia Lucena por compartirnos sus
experiencias y conocimientos, y sobre todo por haber confiado ennosotras para llevar a cabo la realización de este proyecto. MIL
GRACIAS. A todo el personal del Instituto de Investigaciones de laFacultad de Farmacia y Bioanálisis por habernos dado la
oportunidad y brindaros todos los medios para realizar nuestroproyecto de Grado.
A la Ilustre Universidad de los Andes, por abrirnos sus puertas ypermitirnos formar parte de esta gran casa de estudio.
Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la EspecieChromolaena meridensis.
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DEDICATORIA.
Nuestro Proyecto de Grado la dedicamos con todonuestro amor a Dios por estar a nuestro lado siempre,por darnos valor y brindarnos la fortaleza que tanto
necesitamos y por habernos regalado una familia tanmaravillosa.
A nuestros padres que nos dieron la oportunidad deformarnos como profesionales, por el inmenso apoyo que
nos dieron, por haber confiado en nosotras porquesiempre me dieron aliento para seguir luchando.
Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la EspecieChromolaena meridensis.
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RESUMEN
En el presente trabajo se determinó los componentes químicos del aceite esencial
de Chromolaena meridensis (B.L. Rob.) R.M. King & H. Rob. y se evaluó la
actividad antibacteriana del aceite esencial extraído de las partes aéreas frescas
contra cepas de referencia grampositivas: Staphylococcus aureus ATCC 25923 y
Enterococcus faecalis ATCC29212; y gramnegativas: Escherichia coli ATCC
25922, Pseudomona aeruginosa ATCC27853 y Klebsiella pneumoniae ATCC
23357. El aceite se obtuvo por el método de hidrodestilación empleando la trampa
de Clevenger con un rendimiento de 0,063 %. Su composición química se
determinó por Cromatografía de Gases Acoplada a Espectrometría de Masas,
identificándose 11 compuestos que corresponden en su mayoría a sesquiterpenos
monociclicos que constituyen el 97,75% del total de compuestos, seguido de
monoterpenos con un 0,28%, aldehído 0,54% y alqueno 0,87%. Los componentes
mayoritarios resultaron ser los sesquiterpenos: α – zingibereno (65,26%), α –
curcumeno (13,74%), α - humuleno (8,20), β – sesquifelandreno (4,06%) y β -
cariofileno (2,93%). La actividad antibacteriana se realizó por el Método de
Difusión en Agar con Discos y se determinó la Concentración Inhibitoria Mínima
(CIM), el aceite esencial fue activo contra las cepas de Staphylococcus
aureusATCC 25923, Streptococcus faecalisATCC 29212 y Klebsiella
pneumoniaeATCC 23357, con halos que oscilan entre 6 a 11 mm de diámetro y
una Concentración Inhibitoria Mínima de 10 μg/mL.
Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la EspecieChromolaena meridensis.
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ÍNDICE DE CONTENIDO Pág
I. INTRODUCCIÓN……………………………………………………….………. 1
II. ANTECEDENTES……………………………………………………….…….. 5
A. Antecedentes del género……………………………………………….……. 5
A.1. Descripción del género Chromolaena……………………………….…….. 10
A.1.1. Descripción de la especie Chromolaena meridensis (B. L. Rob.)R.M. King & H. Rob., sinonimia: Eupatorium meridense Robinson………… 11
A.1.2. Distribución de la especie Chromolaena meridensis (B. L. Rob.)R.M. King & H. Rob., en Venezuela…………………………………………… 12
A.2. Química del género Chromolaena……………………………………….... 12
A.3. Usos del género Chromolaena…………………………………………..… 20
A.4. Actividad biológica………………………………………………...………… 21
A.4.1. Actividad antibacteriana de especies del género Chromolaena…….. 21
A.4.2. Otras actividades biológicas…………………………………………….. 22
III. MARCO TEÓRICO................................................................................... 23
A. Aceites esenciales…………………………………………………………...… 23
A.1. Definición…………………………………………………………………..… 23
A.2. Distribución y localización………………………………………………….. 23
A.3. Propiedades físicas................................................................................ 24
A.4. Composición........................................................................................... 24
A.4.1. Terpenoides......................................................................................... 25
A.4.1.1. Monoterpenos................................................................................... 25
A.4.1.2. Sesquiterpenos................................................................................. 26
A.4.1.3. Biosíntesis de terpenos.................................................................... 26
Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la EspecieChromolaena meridensis.
v
A.5. Propiedades farmacológicas de los aceites esenciales......................... 28
Poder antiséptico...................................................................................... 28
Propiedades espasmolíticas y sedantes.................................................. 28
Propiedades irritantes............................................................................... 28
A.6. Algunos usos de los Aceites esenciales................................................. 29
A.7. Procedimientos de obtención de los aceites esenciales........................ 30
A.7.1. Por arrastre en vapor de agua............................................................. 30
A.7.2. Por expresión...................................................................................... 31
A.7.3. Por extracción con solventes orgánicos.............................................. 31
A.8. Métodos de análisis de los aceites esenciales....................................... 32
A.8.1. Cromatografía de Gases Acoplada a Espectrometría de Masas(CG/EM)......................................................................................................... 32
B. Determinación de la actividad antibacteriana de los aceites esenciales... 35
B.1. Bacteria.................................................................................................. 35
B.1.1. Bacterias grampositivas...................................................................... 37
a. Staphylococcus aureus.............................................................................. 37
b. Streptococcus faecalis (Enterococos)....................................................... 37
B.1.2. Bacterias gramnegativas..................................................................... 38
a. Escherichia coli.......................................................................................... 38
b. Pseudomona aeruginosa........................................................................... 39
c. Klebsiella pneumoniae............................................................................... 39
B.2. Antibiótico............................................................................................... 40
B.3. Métodos para evaluar la actividad antimicrobiana de aceitesesenciales...................................................................................................... 43
Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la EspecieChromolaena meridensis.
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B.3.1. Método de Difusión en Agar................................................................ 44
B.3.1.1. Método de Kirby-Bauer..................................................................... 45
B.3.2. Método de dilución.............................................................................. 46
B.3.2.1. Concentración inhibitoria mínima (CIM)........................................... 47
IV. PROBLEMA.............................................................................................. 48
V. HIPÓTESIS............................................................................................... 49
VI. OBJETIVOS............................................................................................. 50
A. Objetivo general........................................................................................ 50
A.1. Objetivos específicos.............................................................................. 50
VII. MATERIALES Y MÉTODOS................................................................... 51
A. Material vegetal......................................................................................... 51
A.1. Recolección e identificación del material vegetal……………………….. 51
A.2. Clasificación taxonómica........................................................................ 52
B. Obtención y análisis del aceite esencial de Chromolaena meridensis (B.L. Rob.) R.M. King & H. Rob.......................................................................... 52
B.1. Obtención del aceite por el Método de Hidrodestilación........................ 52
B.2. Cromatografía de Gases (CG)............................................................... 53
B.2.1. Cromatografía de Gases acoplada a Espectrometría de Masas (CG-EM)................................................................................................................ 55
C. Evaluación de la actividad antibacteriana................................................. 56
C.1. Preparación de los inoculos bacterianos................................................ 56
C.2. Preparación de las placas de Petri Agar Müeller-Hinton....................... 56
C.3. Impregnación de los discos.................................................................... 58
C.4. Incubación.............................................................................................. 61
Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la EspecieChromolaena meridensis.
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C.5. Lectura de la prueba.............................................................................. 61
C.6. Concentración inhibitoria mínima (CIM)................................................. 61
D. Diseño Experimental................................................................................. 63
VIII. RESULTADOS Y DISCUSIÓN............................................................... 65
IX. CONCLUSIONES..................................................................................... 75
ANEXOS........................................................................................................ 76
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS.............................................................. 83
Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la EspecieChromolaena meridensis.
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ÍNDICE DE FIGURAS Pág
FIGURA 1: UNIDAD DE ISOPRENO......................................................... 26
FIGURA 2: BIOSÍNTESIS DE MONOTERPENOS YSESQUITERPENOS................................................................ 27
FIGURA 3: DIAGRAMA DE UN CROMATÓGRAFO DE GASES.............. 34FIGURA 4: TIPOS DE ANTIÓBIÓTICOS Y SUS BLANCOS DE ACCIÓN 42
FIGURA 5: LOCALIZACIÓN GEOGRÁFICA DEL LUGAR DERECOLECCIÓN DE LA ESPECIE Chromolaena meridensis.. 51
FIGURA 6: Chromolaena meridensis......................................................... 52
FIGURA 7:DESARROLLO DEL PROCESO DE OBTENCIÓNDELACEITE ESENCIAL DE LA ESPECIEChromolaenameridensis................................................................................ 54
FIGURA 8:CROMATÓGRAFO DE GASES ACOPLADO A UNESPECTROMETRO DE MASAS MARCA HEWLETTPACKARD 5973....................................................................... 55
FIGURA 9: PREPARACIÓN Y ESTERILIZACIÓN DEL MEDIOMÜELLER - HINTON............................................................... 57
FIGURA 10: ESTERILIZACIÓN DE LOS DISCOS DE PAPEL DEFILTRO 59FIGURA 11: IMPREGNACIÓN DE LOS DISCO DE PAPEL DE FILTRO.... 59
FIGURA 12:REPRESENTACIÓN GRÁFICA DE LA UBICACIÓN DELOSDISCOSIMPREGNADOS.......................................................
60
FIGURA 13:CROMATÓGRAMA DEL ACEITE ESENCIAL DE LASPARTESAÉREAS DE LA ESPECIE Chromolaenameridensis................................................................................ 67
FIGURA 14:ESTRUCTURAS QUÍMICAS DE LOS COMPONENTESMAYORITARIOS DEL ACEITE ESENCIAL DE Chromolaenameridensis................................................................................ 69
Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la EspecieChromolaena meridensis.
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INDICE DE TABLAS Pág
TABLA I: TRIBUS DE LA FAMILIA ASTERACEAE............................... 7
TABLA II: LISTADO DE LOS GÉNEROS QUE INTEGRAN LA TRIBUEUPATORIEAE....................................................................... 8
TABLA III: ESPECIES DEL GÉNERO Chromolaena............................... 9
TABLA IV: COMPOSICIÓN QUÍMICA DE ALGUNAS ESPECIES DELGÉNERO Chromolaena.......................................................... 13
TABLA V: COMPONENTES VÓLATILES DEL GÉNERO Chromolaena 16
TABLA VI: USOS MEDICINALES DEL GÉNERO Chromolaena............. 20
TABLA VII: ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA DEL GÉNEROChromolaena.......................................................................... 21
TABLA VIII: CLASIFICACIÓN BACTERIANA SEGÚN SUCOLORACIÓN........................................................................ 36
TABLA IX: MICROORGANISMOS Y CONTROLES POSITIVOSUTILIZADOS........................................................................... 60
TABLA X: CARACTERÍSTICAS FÍSICAS Y ORGANOLÉPTICAS DELACEITE ESENCIAL DE LA ESPECIE Chromolaenameridensis............................................................................... 65
TABLA XI: COMPONENTES VOLÁTILES DEL ACEITE ESENCIAL DEChromolaena meridensis........................................................ 68
TABLA XII: ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA DEL ACEITE ESENCIALDE LA ESPECIE Chromolaena meridensis............................ 72
Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la EspecieChromolaena meridensis.
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ÍNDICE DE CUADROS Pág.
CUADRO 1: COMPONENTES QUÍMICOS DE Chromolaena meridensis.. 15
CUADRO 2: COMPONENTES MAYORITARIOS DEL ACEITEESENCIAL DE Chromolaena odorata..................................... 17
CUADRO 3: COMPONENTES MAYORITARIOS DEL ACEITEESENCIAL DE Chromolaena laevigata................................... 17
CUADRO 4: COMPONENTES MAYORITARIOS DEL ACEITEESENCIAL DE Chromolaena squalidum, Chromolaenaamygdalinum y Chromolaena conyzoides............................... 18
CUADRO 5: COMPONENTES MAYORITARIOS DEL ACEITEESENCIAL DE Chromolaena macrophyllum........................... 18
CUADRO 6: COMPONENTES MAYORITARIOS DEL ACEITEESENCIAL DE Chromolaena marginatum.............................. 18
Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la EspecieChromolaena meridensis.
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INDICE DE ANEXOS Pág
ANEXO 1: VOUCHER DE LA ESPECIE Chromolaena meridensisUBICADO EN EL HERBARIO MERF........................................ 77
ANEXO 2: EQUIPO DE HIDRODESTILACIÓN EMPLEANDO LATRAMPA DE CLEVENGER....................................................... 78
ANEXO 3: DISCOS DE PAPEL DE FILTRO DE 4 MILIMETRO DEDIÁMETRO.................................................................................. 79
ANEXO 4: COLOCACIÓN DE LOS DISCOS IMPREGNADOS CON ELACEITE ESENCIAL DE Chromolaena meridensis Y DMSO...... 79
ANEXO 5: ENSAYO DE LA CEPA DE E. coli ATCC 25922......................... 80
ANEXO 6: ENSAYO DE LA CEPA DE K. pneumoniae ATCC 23357.......... 80
ANEXO 7: ENSAYO DE LA CEPA DE P. aeruginosa ATCC 27853............ 81
ANEXO 8: ENSAYO DE LA CEPA DE S. aureus ATCC 25933................... 81
ANEXO 9: ENSAYO DE LA CEPA DE E. faecalis ATCC 29212.................. 82
Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la EspecieChromolaena meridensis.
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I. INTRODUCCIÓN
En el largo período de la evolución humana y durante mucho tiempo, la inclinación
del hombre hacia el concepto mágico-religioso de su cultura, le llevo a aplicar su
curiosidad y a buscar en la naturaleza remedios de gran valor terapéutico para
combatir diversas enfermedades (Albornoz, 1997).
La necesidad de procurarse alimentos y medicamentos, comenzó probablemente,
probando una y otra vez o también observando el hábito de los animales salvajes
cuando discriminaban las plantas, escogiendo las adecuadas para su nutrición y
evitando las venenosas. No cabe duda que los humanos han tenido que
experimentar situaciones desagradables para conocer las plantas beneficiosas.
Cuando una especie se comprobaba que tenía acción beneficiosa en un individuo,
se le daba a otro y si se notaba el mismo efecto sobre éste, entonces se aceptaba
y generalizaba su consumo (Albornoz, 1980).
El conocimiento de la interrelación hombre, animales y plantas, surgió en los
pueblos primitivos (Albornoz, 1980). Estos pueblos adquirieron información sobre
las propiedades medicinales de gran número de plantas propias de su medio
ambiente, dichos conocimientos generalmente los han acumulados determinados
individuos, sacerdotes, hechiceros, curanderos. etc., quienes los han transmitido
Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la EspecieChromolaena meridensis.
2
de generación en generación a determinados aprendices y a sus descendientes,
dejando útiles descripciones de plantas medicinales y de su utilidad (Domínguez,
1973).
En la actualidad se sigue intensificando la investigación científica de las plantas
medicinalescon el fin de extraer y separar sustancias con actividad biológica o
terapéutica(Albornoz, 1980), cubriendo aspectos adicionales, como la estructura
de los constituyentes químicos, datos espectroscópicos, síntesis y biosíntesis de
una gran variedad de compuestos propios de una especie o productos naturales
también denominados metabolitos secundarios (Marcano y Hasegawa, 1991).
Durante el año 1978, se publicaron en el mundo numerosos trabajos científicos
que informaron de unos 6500 productos aislados, de los cuales un 40% eran
desconocidos anteriormente y de este grupo un 10% mostró ser potenciales
agentes terapéuticos (Albornoz, 1980).
Los productos naturales son sustancias de origen orgánico e inorgánico que se
encuentran en la naturaleza y que pueden ser aislados y procesados por el
hombre. Su formación comienza con la fotosíntesis, luego de la cual los
fragmentos pequeños se recombinan para generar las grandes moléculas
(Albornoz, 1997). Hay muchas clases o categorías de sustancias naturales,
productos del metabolismo vegetal, que se han clasificado según origen, carácter
Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la EspecieChromolaena meridensis.
3
químico, similitud estructural molecular o su acción farmacológica (Albornoz,
1980).Dentro de las estructuras vegetales se encuentran los aceites esenciales,
estos pueden localizarse en sus flores, hojas, frutos y hasta raíces o en toda la
planta (Domínguez, 1973).
Los aceites esenciales son generalmente líquidos aromáticos, miscibles con
lípidos y solventes lipófilos; incoloros, particularmente cuando están frescos, ya
que al oxidarse se resinifican y toman color oscuro (lo cual se previene
depositándolos en recipientes de vidrio de color ámbar totalmente llenos y
cerrados perfectamente) (Albornoz, 1980). Son empleados en perfumería, en la
industria alimenticia o como fuente de materia prima (Domínguez, 1973). Las
familiasricas en aceites esenciales son:Lauráceas, Mirtáceas, Umbellíferas,
Pináceas, Rutáceas, Labiadas, Verbenáceas y Asteraceas (Marcano yHasegawa,
2002).Dentro de esta últimase encuentran numerosos géneros y especiesque han
sido objeto de estudios, en esta ocasiónse estudiará el aceite esencial
deChromolaena meridensis (B.L. Rob.) R.M. King & H. Rob., que hasta 1970 se
denominaba Eupatorium meridense Robinson(Aristeguieta, 1964). Los
componentes volátiles de esta especie no han sido estudiados, por lo que el
presente estudiose basó en la extracción e identificación de
Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la EspecieChromolaena meridensis.
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loscompuestosquímicos volátilesyanálisis antibacterianodel aceite esencial de
Chromolaena meridensis (B.L. Rob.) R.M. King & H. Rob.
Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la EspecieChromolaena meridensis.
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II. ANTECEDENTES
A. Antecedentes del género
La familia Asteraceae denominada también Compuesta estáabundantemente
representada en la flora de Venezuela y constituye junto con las Orquídeas,
Gramíneas, Leguminosas y Rubiáceas las familias dominantes en el país
(Aristeguieta, 1964). Es la segunda con mayor número de especies dentro de las
Angiospermas después de las Orchidaceae, agrupa entre 23.000 - 30.000
especies y 1.500 géneros y se encuentra ampliamente distribuida en el mundo
(Bremer, 1994).En Venezuela se encuentra distribuida desde el nivel de mar hasta
los sitios más elevados de los páramos andinos, casi en contacto con las nieves
perpetuas, donde escasamente es posible el desarrollo de plantas superiores
(Badillo, 2001). Al considerar la distribución de las Compuestas en Venezuela, el
país puede ser dividido en 3 regiones: a) Costa y Llano; b) Andes y Codillera
costera; c) región Guayanesa. De estas 3 regiones, la primera es pobre en
endemismo y números de especies de Compuestas. Las dos últimas, en cambio,
representan las áreas de mayor concentración de Compuestas con un alto grado
de endemismo (Badillo, 2001).
Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la EspecieChromolaena meridensis.
6
Las Compuestas son plantas heliófilas en casi su totalidad y se hacen dominantes
y muy diversificadas en sitios con temperaturas bajas, así se explica que en un
país tropical como Venezuela, la gran concentración de especies de Compuestas
esté localizada en las partes Andino - Cordillera Costera y alta Guayana; pues son
regiones montañosas de gran elevación con temperaturas baja, en cambio la
Costa y el Llano ofrecen una topografía plana o de poca elevación, con
temperaturas altas, y por ello el número de especies de Compuestas es muy
reducido en comparación con la gran variedad que se observa en las dos regiones
mencionadas (Badillo, 2001).
Esta familia distribuye sus géneros en 13 tribus (tabla I) (Badillo, 2001). En
Venezuela está representada por 204 géneros y 784 especies nativas o
naturalizadas, incluyendo 13 géneros y 189 especies endémicas (más 2
subespecies y 5 variedades) (Hokche et al, 2008). Dentro de esta familia se
encuentran desde árboles, pasando por arbustos y subarbustos, hasta plantas
herbáceas (Moreno et al, 2006).
La tribu Eupatoriaea está bien representada en el país, las especies de esta tribu
están contenidas en varios géneros (tabla II), los de mayor número de especies
Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la EspecieChromolaena meridensis.
7
corresponden a Eupatorium, Mikania y Chromolaena, este último con un total de
30 especies (tabla III) (Badillo, 2001).
(Badillo, 20 (Badillo, 2001).
(Badillo, 2001).
TABLA I: TRIBUS DE LA FAMILIA
ASTERACEAE
I. BARNADESIEAE
II. MUTISIEAE
III. CARDUEAE
IV. LACTUCEAE
V. VERNONIEAE
VI. LIABEAE
VII. PLUCHEEAE
VIII. GNAPHALIEAE
IX. ASTEREAE
X. ANTHEMIDEAE
XI. SENECIONEAE
XII. HELIANTHEAE
XIII. EUPATORIEAE
Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la EspecieChromolaena meridensis.
8
(Badillo, 2001).
TABLA II: LISTADO DE LOS GÉNEROS QUE INTEGRAN LA TRIBU EUPATORIEAE
AdenostemmaForster FleishmanniaSchultz-Bip
AgeratinaSpach Guayania R. King et H. Rob.
Ageratum L Hebeclinium D C.
Asplundianthus R. King et H. Rob. Heterocondylus R. King et H. Rob.
Austroeupatorium R. King et H. Rob. Idiothamnus R. King et H. Rob.
Ayapana R. King et H. Rob. Imeria R. King et H. Rob.
Badilloa R. King et H. Rob. Isocarpha R. Br.
Barrosoa R. King et H. Rob. KoanophyllonArruda da Camara
Bartlettina R. King et H. Rob. LepidesmianKlatt
Brickellia Elliot Lourteigia R. King et H. Rob.
Campuloclinium D C. MikaniaWilld
Chromolaena D C. Oxylobu(Mociño ex D C.) A. Gray
Conocliniopsis R. King et H. Rob. Siapaea Cav.
Critonia P. Browne Stevia Cav.
Critoniella R. King et H. Rob. Steyemarkina R. King et H. Rob.
Eupatorium L. TrichogoniaGardn
Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la EspecieChromolaena meridensis.
9
(Badillo, 2001).
TABLA III: ESPECIES DEL GÉNEROChromolaena
Chromolaena aridicola Badillo Chromolaena persericea R. King et H. Rob.
Chromolaena bathyphlebia (B. Rob.) R. King et H.Rob.
Chromolaena pharcidodes (B. Rob.) R. King et H.Rob.
Chromolaena columbiana (Heering) R. King et H.Rob.
Chromolaena ponsae Badillo
Chromolaena farinosa (B. Rob.) R. King et H. Rob. Chromolaena santanensis (Aristeg.) R. King etH. Rob.
Chromolaena ivifolia (L) R. King et H. Rob. Chromolaena squalid (DC.) R. King et H. Rob.
Chromolaena laevigata (Lam) R. King et H. Rob. Chromolaena steyermarkiana (Badillo) R. King etH. Rob.
Chromolaena larensis (Badillo) R. King et H. Rob. Chromolaena subscandens (Hieron.) R. King etH. Rob.
Chromolaena leptocephala (DC.) R. King et H.Rob.
Chromolaena ternicapitulata Pruski
Chromolaena maximiliani (Schroeder ex DC.) A.King et H. Rob.
Chromolaena thurnii (B. Rob.) R. King et H. Rob.
Chromolaena meridensis (B. Robinson) R. King etH. Rob.
Chromolaena trujillensis (B. Rob.) R. King et H.Rob.
Chromolaena molina (B. Rob.) R. King et H. Rob. Chromolaena tyleri (B. Rob.) R. King et H. Rob.
Chromolaena moritensis (Aristeg.) R. King et H.Rob.
Chromolaena urticoides (Schultz-Bip. ex Hieron.)R. King et H. Rob.
Chromolaena moritziana (Schultz-Bip. ex Hieron.)R. King et H. Rob.
Chromolaena voglii (B. Rob.) H. Huber, Mitt.
Chromolaena odorata (L) R. King et H. Rob. Chromolaena xestolepidoides (Wurdack) R. Kinget H. Rob.
Chromolaena pellia (Klatt) R. King et H. Rob. Chromolaena xestolepis (B. Rob.) R. King et H.Rob.
Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la EspecieChromolaena meridensis.
10
Esta familia ha sido motivo de muchos estudios químicos que han llevado al
descubrimiento de interesantes estructuras químicas, resultando varias de ellas
promisorias de ser utilizadas,como insecticidas, en la industria de los alimentos,
como aromatizantes, edulcorantes, Además, los estudios químicos sistematizados
han servido de soporte a estudios taxonómicos (De Pérez, 1994). En Venezuela
sus múltiples propiedades medicinales han sido ampliamente estudiadas (Gil et al,
2003), sus numerosas especies vegetales poseen aproximadamente 26% de
acción contra afecciones gastrointestinales, 16% contra enfermedades esqueleto
muscular y un 13% en enfermedades dermatológicas (Arrázola et al, 2002).
A.1. Descripción del géneroChromolaena
Las especies del género Chromolaena se presentan en cabezuelas homogéneas y
organizadas, por lo general de muchas flores, hermafroditas. Hierbas, frútices,
arbustos hasta pequeños árboles. Hojas casi siempre opuestas, por lo general con
inflorescencias corimbosas (Aristeguieta, 1964).
A.1.1.Descripción de la especieChromolaena meridensis (B.L. Rob.)
R.M. King & H. Rob., sinonimia: Eupatorium meridenseRobinson
Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la EspecieChromolaena meridensis.
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Planta fruticosa, erecta; tallos redondeados, cortamente pubescentes. Hojas
opuestas, brevemente pecioladas, lanceoladas atenuado-acuminada en ambos
extremos, 4-8 cm de largo, 1-2 cm de ancho, brillantes, puberulentas y
marcadamente rugosas, densamente piloso-glandulosas y prominentemente
reticuladovenosas por debajo, erenuladas o subenteras, cartáceas, 3-nervadas
desde cerca de la base, pecíolos alrededor de 0.5 cm de largo. Inflorescencias
corimbos terminales, redondeados, compuestos. Cabezuelas numerosas,
cortamente pediceladas o subsésiles, conteniendo unas diez flores. Involucro
delgado, cilíndrico, de 7-8 mm de largo, 5-6 seriado; brácteas oblonglas,
redondeadas o subtruncadas arriba, cilioladas en los márgenes y subglabras o
puberulentas y glándulas en el dorso. Receptáculo convexo, glabro. Corolas
puberulento-glandulosas en el ápice, 4,5-5 mm de largo. Aquenios de 3-3,5 mm de
largo, glandulosos en las costillas. Papus amarillento y un poco más corto que las
corolas, de 3,5-4 mm de largo (Aristeguieta, 1964).
A.1.2. Distribución de la especieChromolaena meridensis(B.L. Rob.)
R.M. King & H. Rob., en Venezuela
Esta especie es endémica de Venezuela y se encuentra ampliamente distribuida
en la región andina: estado Mérida (Chachopito, cerca de San Rafael, Mucurubá,
Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la EspecieChromolaena meridensis.
12
alrededores de Mérida y La Azulita), estado Trujillo (entre Trujillo y
Boconó)(Aristeguieta, 1964).
A.2. Química del géneroChromolaena
Del género Chromolaena se han estudiado diversas especies como: C. leivensis,
C. opadoclinia, C. odorata, C. arnottiana,C. morii, C. collina, C. connivens, C.
glaberrima, C. pseudoinsignis, C. chasleae, y se han determinadocompuestos de
tipo: sesquiterpenos, triterpenos, flavonoides, ácidos grasos
cíclicos,sesquiterpenlactonas, alcaloides pirrolizidínicos, germacranólidos,
diterpenos(ent-clerodanosy derivados del labdano) yprostaglandinas
provenientesde ácidos grasos libres(Rodríguez y Torrenegra, 2007).En la tabla IV
y Vse presentan los componentes químicos y volátiles hallados en algunas
especies del géneroChromolaena respectivamente, incluyendo los componentes
químicos encontrados enChromolaena meridensis (B.L. Rob.) R.M. King & H. Rob.
(Cuadro 1).
TABLA IV: COMPOSICIÓN QUÍMICA DE ALGUNAS ESPECIES DEL GÉNEROChromolaena
Especie Componentes Lugar Fuente
Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la EspecieChromolaena meridensis.
13
bibliográfica
Chromolaena laevigata
Saponinas, flavonoides,
Esteroides libres,
triterpenoides, Aza-
esteroideles, Taninos,
Alcaloides
Perú (Fuertes et al,
2010)
Chromolaena odorata
Alcaloides
pirrolizidínicos,
(Monoésteres de
retronecina y supininas)
México (Gómezet al,
2011)
Chromolaena pulchella
Alcaloides pirrolizidínicos
con núcleo de necina
España (Gómez et al,
2011)
Acetilivalina, Epazoyina
Acido-hardwikiico, 7,8-
seco-7,8-oxacassan-17-
aleufol,
Deoxipodofilotoxina
Geraniina
México (Torres,
2011)
Chromolaenaperglabra Esteroides, Flavonoides Boyacá –
Colombia
(Rodríguez y
Torrenegra,
2007)
Chromolaenatequendamensis
Cetoácidos (estructuralmenterelacionados conprostaglandinas)
CundinamarcaColombia
(Sanabria etal, 1989)
Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la EspecieChromolaena meridensis.
14
Chromolaenasubscandens
5,4-dihidroxi-7-metoxiflavonol,Β-estigmasterol, Hidroquinona,Eicosanol
CundinamarcaColombia
(Torrenegraet al, 2007)
Chromolaenabullata Flavonoides Colombia (Santander etal, 2007)
Chromolaenatacotana
Flavonoides Colombia (Castañedaet al, 2007)
Flavonoides (cianidina),Taninos (gelatinasal),Esteroides y/o triterpenoides,Flavononol 7-metoxi-aromadendrina
Colombia (Sanabria yCarrero,
1995)
Chromolaenamoritziana Flavonoides (Kanferol,Kanferol-3-O-rutinósido,Rutina e Isoquercetina)
Mérida-Venezuela
(Hidalgo etal, 1998)
Chromolaenameridensis
Ácido 12-oxo-9βH, 13αH-10,15(Z)-fitodienóico [1]flavonoides: eupatolitina[2]
velutina[3],rhamnetina [4]
Mérida-Venezuela
(Delgado,1989)
CUADRO 1: COMPONENTES QUÍMICOSDE Chromolaena meridensis
CONTINUACIÓN DE LA TABLA IV
Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la EspecieChromolaena meridensis.
15
O
O
OOH
OH
OH
OH
MeO
MeO
COOH
[1] [2]
O
OOH
OH
OMeO
OOH
OH
OH
OH
MeOMeO
[3][4]
Especie Componentes % Lugar Fuente Bibliográfica
Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la EspecieChromolaena meridensis.
16
%: Porcentaje de los componentes en el aceite esencial
α pineno[5] 42,2β pineno[6] 10,6pregeijereno [7] 2,8
Chromolaena odorata geijereno [8] 4,7 Nigeria (Owolabi et al, 2010)germacreno D [9] 9,7β-cariofileno[10] 5,4
Chromolaena laevigata globulol[11] 16,2germacreno D[9] 8,6globulol[11] 25,1oxido de cariofileno[12] 17,4
Chromolaena squalidum β-cariofileno[13] 7,1germacreno D[9] 10,4espatulenol[14] 14,2globulol[11] 25,1 Brasil (Maia et al, 2002)oxido de cariofileno[12] 17,4
Chromolaena conyzoides β-cariofileno[13] 7,1germacreno D[9] 10,4espatulenol [14] 14,2globulol[11] 25,1oxido de cariofileno[12] 17,4
Chromolaena amygdalinum β-cariofileno[13] 7,1germacreno D[9] 10,4espatulenol[14] 14,2
Chromolaena macrophyllum limoneno[15] 23,3sabineno[16] 46,7germacreno D[9] 14,8α-zingibereno[17] 57,5
Chromolaena marginatum α-gurjuneno[18] 19,5α-bisaboleno[19] 9,7α-selineno[20] 9
TABLA V: COMPONENTES VOLÁTILES DEL GÉNERO Chromolaena
Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la EspecieChromolaena meridensis.
17
[5] [6] [7] [8]
[9] [10]
OH
[11] [9]
CUADRO 3: COMPONENTES MAYORITARIOS DEL ACEITEESENCIAL DE Chromolaena laevigata
CUADRO 2: COMPONENTES MAYORITARIOS DEL ACEITEESENCIAL DE Chromolaena odorata
Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la EspecieChromolaena meridensis.
18
OH O
[11] [12] [13]
HO H
H
[9] [14]
CUADRO 4: COMPONENTES MAYORITARIOS DEL ACEITE ESENCIAL DEChromolaena squalidum, Chromolaena amydalinum, y Chromolaenaconyzoides
CUADRO 5: COMPONENTES MAYORITARIOS DEL ACEITEESENCIAL DE Chromolaena macrophyllum
[15] [16]
Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la EspecieChromolaena meridensis.
19
CUADRO 6: COMPONENTES MAYORITARIOS DEL ACEITE ESENCIAL DEChromolaena marginatum
H
H
[9] [17] [18]
[19] [20]
Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la EspecieChromolaena meridensis.
20
A.3. Usos del géneroChromolaena
TABLA VI: USOS MEDICINALES DEL GÉNERO Chromolaena
Especie Uso terapéutico Lugar derecolección
Fuente bibliográfica
Chromolaena perglabra Actividad significativa in vitro contraagentes causante de la enfermedad de
Chagas y Leishmaniasis
Tinjacá(Boyacá -Colombia)
(Rodríguez yTorrenegra, 2007)
Chromolaena odorata
Actividad antidiarreica Nigeria (Gutiérrez et al, 2007)
Para infecciones de tejidos blandos yquemaduras
Argentina (Grossi, 2009)
Chromolaena Hookeriana Para calmar la estupefacción Bolivia (Vaera et al, 2002)
Chromolaena bullata Actividad antitumoral oinmunorreguladora (sobre células
tumorales humanas)
Colombia (Santander et al, 2007)
Chromolaena laevigata
Para el dolor de cabeza, comoantiséptico y purgante
Argentina (Marzocca, 1997)
Analgésico catártico Argentina (Amat, 1983)
Promotor abortivo y para la menstruación Argentina (Martínez, 1981)
Chromolaena odorata Antidiarreica y antipirético Argentina (Freire y Urtubey,1999)
Chromolaena puchella
Antiinflamatoria España (Gómez et al, 2011)
Anticancerosa México (Torres, 2011)
Chromolaena tacotanaDisminuye la viabilidad celular de la línea
celular K562(línea celular tumoral)Colombia (Castañeda et al, 2007)
Chromolaena roseorum Las hojas son utilizadas para el dolor decabeza
Ecuador (Lajones, 2006)
Chromolaena moritziana Anticatarral, es usado en tratamiento dela piel y como depurativa
Mérida-Venezuela
(Hidalgo et al, 1998)
Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la EspecieChromolaena meridensis.
21
A.4. Actividad biológica
A.4.1. Actividad antibacteriana de especies del género
Chromolaena
TABLA VII. ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA DEL GÉNERO Chromolaena
Especie Bacterias sensibles Lugar Fuente bibliográfica
Chromolaenasubcandens Staphylococcus aureus Cundinamarca-Colombia
(Torrenegra et al,2007)
Chromolaena odorata Staphylococcus aureus
Bacillussubtilis
Cundinamarca-Colombia
(Sanabria et al, 1998)
Chromolaenatequendamensis
Mycobacterium fortuitum
Brucellasp
Streptococcus hemolyticus
Streptococcus pneumoniae
Streptococcus faecalis
Staphylococcus albus
Staphylococcus aureus
Staphylococcus epidermidis
Micrococcus flavus
Sarcinalutea
Cundinamarca-Colombia
(Sanabriaet al, 1989)
Chromolaenatacotana
Klebsiella pneumoniae
Staphylococcus aureus
Staphylococcus epidermidis
Bogotá-SilvaniaDepartamento de
Cundinamarca(Sanabriay Carrero,
1995)
Chromolaenamoritziana Staphylococcus aureus Mérida-Venezuela (Hidalgo et al, 1998)
Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la EspecieChromolaena meridensis.
22
A.4.2. Otras actividades biológicas
Se han realizado varios estudios de actividad biológica en Chromolaena odorata,
pocos en Chromolaena hirsute y Chromolaena moritziana. Reportándose actividad
pesticida, actividad repelente, efecto antiprotozoario, actividad insecticida,
actividad tripanocida, actividad antibacteriana, actividad antimicrobacterial,
citotoxicidad, efecto antioxidante, mutagenicidad, proliferación de queratocitos
humanos y proliferación de fibroblastos entre otros (Rodríguez y Torrenegra,
2007).
Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la EspecieChromolaena meridensis.
23
III. MARCO TEÓRICO
A. Aceites esenciales
A.1. Definición
Los aceites esenciales o aceites volátiles se encuentran localizados en células y
órganos particulares o se producen por reacciones químicas en un determinado
momento. Generalmente son líquidos y otros sólidos a temperatura ordinaria, casi
siempre incoloros pero que por reacción del aire y de la luz toman una coloración
amarilla más o menos intensa; con sabor acre y picante; aromáticos. Son solubles
en alcohol, éter y ácidos fijos; son insolubles en agua, pero sin embargo, agitadas
con agua le comunican parcialmente su olor (Albornoz, 1997).
A.2. Distribución y localización
Los aceites esenciales pueden encontrarse en animales y en plantas (Tyler et al,
1988). Existirían, según Lawrence, 17.500 especies aromáticas. Los géneros
capaces de elaborar los constituyentes que componen los aceites esenciales
están repartidos en un número limitado de familias, ejemplos: Myrtaceae,
Lauracae, Rutaceae, Lamiaceae, Asteraceae, Apiaceae, Cupressaceae, Poaceae,
Zingiberaceae,Piperaceae, etc (Bruneton, 2001).
Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la EspecieChromolaena meridensis.
24
Los aceites volátiles se localizan en determinados sitios de la estructura vegetal,
en células normales o modificadas o también en estructuras especializadas tales
como cavidades esquizógenas, vasos secretores, pelos glandulares y canales
lisígenos(Albornoz, 1980), pueden almacenarse en las flores, igualmente en hojas
y, aunque sea menos habitual, en corteza, leño, raíces, rizomas, frutos, semillas,
etc (Bruneton, 2001).
A.3. Propiedades físicas
Los aceites esenciales son líquidos a temperatura ambiente, volátiles, lo que los
diferencia de los aceites fijos, muy raramente son coloreados. En general, su
densidad es inferior a la del agua (los aceites esenciales de sasafrás, clavo o
canela, constituyen excepciones). Posee un índice de refracción elevado y la
mayoría desvían la luz polarizada, son liposolubles y solubles en los disolventes
orgánicos habituales, arrastrables al vapor de agua, son muy poco solubles en
ella; no obstante, son lo suficientemente solubles como para comunicarle un olor
neto. Esta agua es agua destilada floral (Bruneton, 2001).
A.4. Composición
Químicamente los aceites son mezclas complejas y muy variables de
constituyentes que pertenecen, de manera casi exclusiva, a dos grupos
Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la EspecieChromolaena meridensis.
25
caracterizados por orígenes biogenéticos distintos: el grupo de los terpenoides por
una parte y el grupo de los compuestos aromáticos derivados del fenilpropano,
mucho menos frecuente (Bruneton, 2001), dentro de este último los más
frecuentes son anetol, eugenol, magnolol y cinamaldehído. Entre los componentes
volátiles aislados de las plantas también se encuentran ácidos libres, cetonas y
compuestos azufrados como allicina e isotiocianato de alilo (Marcano y Hasegawa,
2002).
A.4.1. Terpenoides
En los aceites esenciales se encuentran únicamente los terpenos más volátiles, es
decir, aquellos cuya masa molecular no es demasiado elevada: mono-y
sesquiterpenos (Bruneton, 2001).
A.4.1.1. Monoterpenos
Casi siempre se encuentran hidrocarburos. Estos pueden ser acíclicos (mirceno y
ocimenos), monociclicos (α- y ү-terpineno, p-cinemo) o biciclicos (pinenos, Δ3 –
careno, canfeno, sabineno). A veces constituyen más del 90% del aceite esencial.
También la presencia de numerosas moléculas funcionalizadas: alcoholes,
aldehídos, cetonas, ésteres, éteres, peróxidos y fenoles (Bruneton, 2001).
Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la EspecieChromolaena meridensis.
26
A.4.1.2. Sesquiterpenos
Las variaciones estructurales en esta serie son de la misma naturaleza que en el
caso precedente: siendo los más frecuentes hidrocarburos alcoholes y cetonas.
Algunos ejemplos de sesquiterpenos característicos de aceites esenciales son:
hidrocarburos mono o policíclicos (β-bisaboleno, β- cariofileno y longifoleno),
alcoholes (farnesol, carotol, β-santalol, patchulol), cetonas (nootkatona, cis-
longipinano-2,7-diona, β-vetivona), aldehídos (sinensales), ésteres (acetato de
cedrilo) (Bruneton, 2001).
A.4.1.3. Biosíntesis de terpenos
Los terpenoides están formados por largas estructuras de diversas familias
derivadas de la unidad isopreno C5 (figura 1), los cuales tienen la modalidad de
unirse cabeza-cola. Son estructuras típicas que cuentan con esqueletos
carbonados representados por (C5)n y son clasificados como: hemiterpenos (C5),
monoterpenos (C10), sesquiterpenos (C15), diterpenos (C20), sesterterpenos
(C25), triterpenos (C30) y tetraterpernos (C40) (Dewick, 2002).
FIG. 1: UNIDAD DE ISOPRENO
Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la EspecieChromolaena meridensis.
27
OPPFarnesil PP
(FPP)
OPPIsopentenil PP(IPP) (C5)
Hermiterpenos (C5)
OPPDimetilalil PP(DMAPP) (C5)
IPP
Monoterpenos (C10)
Sesquiterpenos (C15)
OPPGeranil PP
(GPP)
Los monoterpenos resultan de la combinación del dimetilalil difosfato (DMAPP) y
el isopentenil difosfato (IPP) por medio de la enzima feniltransferasa para producir
geranil difosfato (GPP). Los sesquiterpenos se forman adicionándole una unidad
C5 de isopentenil disfofato al geranil difosfato por extensión de la
feniltransferasa originando el precursor fundamental de los sesquiterpenos el
farnesil difosfato (FPP) (figura 2) (Dewick, 2002).
FIG. 2: BIOSÍNTESIS DE MONOTERPENOS Y SESQUITERPENOS
Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la EspecieChromolaena meridensis.
28
A.5. Propiedades farmacológicas de los aceites esenciales
Entre algunas propiedades fundamentales se destacan:
Poder antiséptico.El poder antiséptico que manifiesta frente a diversas
bacterias patógenas, incluso cepas habitualmente resistentes a los antibióticos.
Algunos aceites esenciales también son activos sobre hongos responsables de
micosis y sobre levaduras (Candida) (Bruneton, 2001).
Propiedades espasmolíticas y sedantes. Eficaces para disminuir o
suprimir los espasmos gastrointestinales, estimulan la secreción gástrica,
mejora determinados insomnios y trastornos psicosomáticos diversos y
disminución del nerviosismo (Bruneton, 2001).
Propiedades irritantes.Empleados por vía tópica, provocan aumento de la
microcirculación, sensación de calor y, en ciertos casos, ligera acción
anestésica local. Administrados por vía interna, los aceites esenciales
desencadenan fenómenos de irritación a diferentes niveles (Bruneton, 2001).
Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la EspecieChromolaena meridensis.
29
A.6. Algunos usos de los Aceites esenciales
Los aceites esenciales tienen diversos usos como agentes para sazonar la comida
y bebidas, así como en la perfumería y cosméticos. En tales productos su
actividad antimicrobial se despliega dos veces. Primeramente, los aceites
esenciales protegen a los productos contra contaminación microbiana por el
retraso del ataque o la inhibición del crecimiento de patógenos. Secundariamente,
cuando actúan como aditivos de comida o aplicado como ingrediente del
cosmético (Kalemba y Kunicka, 2003).
Los aceites esenciales pueden actuar beneficiosamente en la salud humana. Son
una alternativa excelente para las preparaciones sintéticas y ésa es la razón para
una valoración extensa de su actividad antimicrobiana (Kalembay Kunicka, 2003).
También se le atribuyen propiedades antisépticas, desinfectantes y
antihelmínticas, éstas propiedades se han aprovechado desde hace tiempo y
especialmente en el caso de infecciones bronquiales, urinarias y las causadas por
cortadas y quemaduras, algunos son diuréticos, sedantes y repelentes (Marcano y
Hasegawa, 2002).
Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la EspecieChromolaena meridensis.
30
A.7. Procedimientos de obtención de los aceites esenciales
A.7.1. Por arrastre en vapor de agua
La hidrodestilación simple consiste en sumergir directamente el material
vegetal a tratar (intacto u ocasionalmente triturado) en un alambique lleno de
agua que a continuación se somete a ebullición. Los vapores heterogéneos se
condensan sobre una superficie fría y el aceite esencial se separará por
diferencia de densidad(Bruneton, 2001).
En la destilación con vapor saturado, el material no está en contacto con el
agua: el vapor de agua se inyecta a través de la masa vegetal dispuesta sobre
placas perforadas. para acortar el tiempo de tratamiento, limitar la alteración de
los constituyentes del aceite esencial y economizar energía, se puede trabajar
a sobre presión moderada. Como consecuencia de la sobrepresión existe un
aumento de la temperatura y puede sufrir la calidad del producto (Bruneton,
2001).
La hidrodifusión consiste en impulsar el vapor de agua a muy baja presión a
través de la masa vegetal, de arriba abajo. la composición de los productos
obtenidos es desde un punto de vista cualitativo, sensiblemente diferente de
Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la EspecieChromolaena meridensis.
31
los productos obtenidos por los métodos clásicos. el procedimiento permite
ganar tiempo y energía (Bruneton, 2001).
A.7.2. Por expresión
El principio del método es muy simple: las “cascaras” se trituran y el contenido de
las glándulas secretoras que se han roto se recuperan por un procedimiento físico.
El procedimiento clásico consiste en ejercer, bajo una corriente de agua, una
acción abrasiva sobre la superficie del fruto. Después de eliminar los desechos
sólidos, el aceite esencial se separa de la fase acuosa por centrifugación
(Bruneton, 2001).
A.7.3. Por extracción con solventes orgánicos
Se puede usar éter de petróleo, hexano o se exprime el material biológico, estos
métodos pueden usarse solos o combinados. La extracción con solventes en
condiciones supercríticas ha dado excelente rendimiento y tiene gran potencial
para la obtención industrial de los aceites esenciales (Marcano y Hasegawa,
2002).
Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la EspecieChromolaena meridensis.
32
A.8. Métodos de análisis de los aceites esenciales
El procedimiento más usado gracias a la volatilidad de los aceites esenciales, es la
Cromatografía de Gases Acoplada a Espectrometría de Masas (CG/EM) (Marcano
y Hasegawa, 2002)
A.8.1. Cromatografía de Gases Acoplada a Espectrometría de
Masas (CG/EM)
La cromatografía de gases es uno de los métodos físicos de separación más
eficaces que se conocen; cada componente de una muestra suministra 3 unidades
de información: posición, altura y anchura de los picos en el cromatograma. La
posición suministra la información cualitativa y los otros proporcionan la
información cuantitativa. Es posible identificar los componentes por la posición de
los picos, pero por lo general la ambigüedad es tan grande que el analista ha de
completar la información con la obtenida por otros métodos analíticos, siendo
preferibles las técnicas multiparamétricas, como la espectroscopia de infrarrojo ola
espectrometría de masas (Dabrio, 1973).El principio básico de todas las técnicas
cromatográficas es el siguiente: Un fluido (fase móvil) circula a través de una fase
estacionaria (sólida o líquida); cuando una mezcla de sustancias se introduce en el
sistema, se produce una serie de equilibrios de distribución entre las dos fases,
Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la EspecieChromolaena meridensis.
33
generalmente de distinta magnitud para cada componente de la mezcla, por lo que
cada uno de ellos se desplazará con diferente velocidad a lo largo del sistema
(Dabrio, 1971).
Los Cromatógrafos de Gases (figura 3) contienen esencialmente:
Una fuente de gas comprimido. Nos proporciona la fase móvil (gas portador).
Los gases más utilizados son hidrogeno, helio, nitrógeno y argón (Dabrio,
1971).
Un regulador de presión o flujo de gas portador (Dabrio, 1971).
Inyector. Dispositivo que permite la introducción de la muestra en la corriente
de gas portador(Dabrio, 1971).
Columna cromatográfica. Tubo de vidrio o metal (acero inoxidable, cobre,
aluminio, entre otros) de longitud que oscila entre 1 - 200 m, cuyo diámetro
inferior puede ser desde 0,1 a 50 mm, según el tipo de columna. Según como
se encuentre en ella distribuida la fase estacionaria y el valor que alcance la
relación de fase(volumen de fase móvil/ volumen de fase estacionaria) se
originan los diferentes tipos de columnas. La separación de la mezcla se
Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la EspecieChromolaena meridensis.
34
realiza en ella, siendo, por tanto, la parte más importante del instrumento
(Dabrio, 1971).
El horno, en cuyo interior se sitúa la columna, que debe poseer una buena
regulación de temperatura (Dabrio, 1971).
El detector. Dispositivo que permite medir de una manera continúa una
propiedad física del gas portador, que se modifica ampliamente con la
presencia de muy pequeñas concentraciones de la sustancia a analizar. Está
situada a la salida de la columna (Dabrio, 1971).
Sistema electrónico de amplificación y medida de la señal eléctrica enviada por
el detector y registrador de la misma (Dabrio, 1971).
Tomado dehttp://es.wikipedia.org/wiki/Cromatograf%C3%ADa_de_gases
FIG. 3: DIAGRAMA DE UN CROMATÓGRAFO DE GASES
Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la EspecieChromolaena meridensis.
35
Ahora bien, la espectrometría de masas es básicamente una técnica en la que los
iones obtenidos de una sustancia, en general orgánica, se separan según su
relación de masa o carga iónica dando lugar, una vez registrados en forma
adecuada al espectro de masas característico de la citada sustancia (Dabrio,
1973). A una molécula se le suministra suficiente energía para obtener fragmentos
más pequeños provenientes de la rotura de los diferentes enlaces originales en la
molécula y el estudio de estos fragmentos dará una idea de cómo estaban unidos
y por tanto, de la estructura molecular(Marcano y Cortés, 1998).
B. Determinación de la actividad antibacteriana de los aceites
esenciales
B.1. Bacteria
Células procariotas universalmente distribuidas, algunas de gran importancia
médica o industrial, cuyas características principales son:
Son unicelulares y pueden tener forma esférica, bacilar o espiral (Barrios,
1988).
Se reproducen asexualmente por fisión binaria (Barrios, 1988).
Pueden ser fotosintéticas o no (Barrios, 1988).
Pueden ser inmóviles o móviles mediante flagelos (Barrios, 1988).
Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la EspecieChromolaena meridensis.
36
Los métodos de tinción diferencial clasifican a las bacterias en grupos diferentes
según sus propiedades de tinción. La tinción de Gram desarrollada por el médico
danés Christian Gram en 1884, es el método de tinción más ampliamente utilizado
en bacteriología. Se trata de unmétodo de tinción diferencial porque divide a las
bacterias en dos clases gramnegativas y grampositivas (Tabla VIII) (Prescott et
al,1999).
CARACTERISTICAS Grampositivas gramnegativas
Reacción al colorante: cristalvioleta
Retiene el cristal violeta y seobservan de color violeta
profundo
No retienen el cristal violeta ypor contraste con la safraninase observan de color rosado
Composición de la paredcelular
Baja en lípidos. Peptidoglicanopresente formando una
monocapa y ácidos teicoicos
Alta en lípidos. Peptidoglicanopresente en una capa internarigida en poca cantidad, nopresenta acidos teicoicos
Susceptibilidad a lapenicilina
Más susceptible Menos susceptible
Requerimiento nutricional
Relativamente complejo enmuchas especies
Relativamente sencillo
Resistencia a la roturamecánica
Más resistente Menos resistente
Ejemplos Más resistente
Escherichia coli
Klebsiella pneumoniae
Pseudomona aeruginosa
(Pelczar y Chan, 1984).
TABLA VIII. CLASIFICACIÓN BACTERIANA SEGÚN SU COLORACIÓN
Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la EspecieChromolaena meridensis.
37
B.1.1. Bacterias grampositivas
a. Staphylococcus aureus
El género Staphylococcusfigura entre las bacterias patógenas más importantes
para el ser humano y son habitantes normales de las vías respiratorias superiores,
la piel, el intestino y la vagina. Pueden dividirse en cepas patógenas y
relativamente no patógenas, basándose en la síntesis de la enzima coagulasa.Las
cepascoagulasa positiva como Staphylococcus aureus son muy resistente al calor,
la desecación y la radiación, por encontrarse en fosas nasales y piel de seres
humanos pueden penetrar rápidamente en los alimentos y producir enterotoxinas
que lo hacen peligros ycausar graves infecciones crónicas como: la intoxicación
alimentaria estafilocócica, además de abscesos localizados, síndrome de shock
tóxico y síndrome de la piel escaldada (Prescott et al, 1999).
b. Streptococcus faecalis(Enterococos)
Los Streptococcus son cocos pequeños de 0,8 a 1 micra de diámetro, con
disposición variable desde cocos en cadenas, hasta aislados o en diplococos, la
mayoría son capsulados, no forman esporas y raramente producen pigmentos, no
tienen cilios, a excepción deStreptococcus faecalis. Se pueden clasificar
basándose en su poder de fermentación, forma de agruparse o su acción
Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la EspecieChromolaena meridensis.
38
hemolítica; así bien, Streptococcus faecalis se clasifica como no hemolítico. Esta
especie se encuentra en las heces humanas, productos lácteos y puede producir
endocarditis lenta y enfermedades gastrointestinales (Paraje y Paraje, 1976).
B.1.2. Bacterias gramnegativas
a. Escherichia coli
Uno de los principales agente causantes de diarreas es E. coli, esta bacteria
circula en la población residente, normalmente sin causar síntomas a causa de la
inmunidad proporcionada por la exposición previa a ésta (Prescott et al, 1999).
Debido a que normalmente se encuentran en el intestino (Pelczar y Chan, 1984),
los alimentos y el agua contaminada son el medio principal a través del cual se
diseminan estas bacterias. Puede causar enfermedad diarreica por varios
mecanismos, y en la actualidad se identifican 6 tipos o cepas deE. coli
diarreogénicas:E. coli enterotoxígena (ECET), enteroinvasiva (ECEI),
enterohemorrágica (ECEH), enteroagregante (ECEAg), difusamente adherente
(ECDA) (Prescott et al, 1999).
Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la EspecieChromolaena meridensis.
39
b. Pseudomona aeruginosa
Es un bacilo chico de 1 a 2 micras, generalmente recto, no forma espora ni
capsula, es móvil por poseer un flagelo terminal. Se caracterizan por producir uno
a más pigmentos como la piocianina y el pigmento eritrogénico. Las infecciones
por Pseudomonasadquieren cada vez más importancia, especialmente en
ambiente hospitalario. Pseudomona aeruginosa es de escasa virulencia en
personas sanas, pero en personas inmunosuprimidas las infecciones se producen
con facilidad; son capaces de agravar lesiones ulcerosas de piel y originar
septicemia con puerta de entrada en otras lesiones, otitis que pueden causar
meningitis, infecciones oculares, intestinales y del aparato respiratorio. El
problema de las infecciones por Pseudomonases cada vez más alarmante, en
especial si se tiene en cuenta su alta resistencia a los antibióticos (Paraje y
Paraje, 1976).
c. Klebsiella pneumoniae
Generalmente se presenta como cocobacilos, rodeados de una capsula grande,
son inmóviles y no esporulados. Están especialmente asociados a procesos
respiratorios, pudiendo ocasionar faringitis, sinusitis, pleuresías y ciertos tipos de
Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la EspecieChromolaena meridensis.
40
neumonías graves; también pueden originar infecciones genitourinarias,
meningitis, peritonitis, diarreas en niños y septicemias. Su importancia clínica
radica en su gran resistencia a los antibióticos (Paraje y Paraje, 1976).
B.2. Antibiótico
Los antibióticos (AB) son compuestos relativamente sencillos producidos por
bacterias u hongos que atacan específicamente a las bacterias. Interfieren en
algún paso del metabolismo donde encuentran un blanco adecuado (Sánchez,
2006).
Los antibióticos se pueden clasificar y agrupar basados en la estructura química y
mecanismo de acción propuesto (figura 4), y así se considera:
Compuesto que inhiben la síntesis de pared bacteriana; entre ellos están
penicilina y cefalosporina, que agrupan semejanza estructural, y también
medicamentos disímbolos como cicloserina, vancomicina y bacitracina
(Chambers, 2003).
Compuestos que actúan de modo directo en la membrana celular del
microorganismo y que afectan su permeabilidad y permiten la fuga de
Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la EspecieChromolaena meridensis.
41
compuestos intracelulares; entre ellos están los detergentes como polimixina
(Chambers, 2003).
Medicamentos que afectan la función de las subunidades ribosómicas 30S o
50S y causan inhibición reversible de la síntesis proteínica; estos productos
bacteriostáticos incluyen cloranfenicol, tetreciclina, eritromicina, clindamicina y
pristinanicinas (Chambers, 2003).
Compuestos que se unen a la subunidad ribosómica 30S y alteran la síntesis
de proteínas, todo lo cual culmina con la muerte del microorganismo; incluyen
los aminoglucósidos (Chambers, 2003).
Medicamentos que afectan el metabolismo de ácido nucleíco como las
rifamicinas (por ejemplo rifampicina) que bloquean la polimerasa de ARN y las
quinolonas, que inhiben a las topoisomerasa (Chambers, 2003).
Antimetabolitos como el trimetropim y las sulfonamidas, que bloquean enzimas
esenciales del metabolismo del fosfato (Chambers, 2003).
Antivirales de varias clases; entre ella:
Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la EspecieChromolaena meridensis.
42
Análogos de ácido nucleico como aciclovir o ganciclovir, que inhiben de
manera selectiva a la polimerasa de ADN viral, y zidovudina o la
lamivudina, que inhiben a la inversotranscriptasa (Chambers, 2003).
Inhibidores de inversotranscriptasa no nucleósidos, como nevoparina o
efavirenz (Chambers, 2003).
Inhibidores de otras enzimas virales esenciales, por ejemplo, inhibidores
de la proteasa de VIH o de la neuraminidasa del virus de la influenza
(Chambers, 2003).
FIG. 4: TIPOS DE ANTIBIÓTICOS Y SUS BLANCOS DE ACCIÓN
Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la EspecieChromolaena meridensis.
43
(Sánchez, 2006).
B.3. Métodos para evaluar la actividad antimicrobiana de aceites
esenciales
Para la evaluación antimicrobiana de aceites esenciales, se aplica generalmente
métodos convencionales probados con capacidades antibióticas. Hay dos técnicas
básicas usadas para la valoración de ambas actividades: antibacterial y
antimicótica de los aceites esenciales:
El método de difusión en agar (pozo o disco de papel) (Kalemba y Kunicka,
2003).
El método de dilución (agar o caldo líquido). Las pruebas y evaluación de la
actividad antimicrobiana de los aceites esenciales son difíciles debido a su
volatilidad, insolubilidad en agua y complejidad (Kalemba y Kunicka, 2003).
Los aceites esenciales son de naturaleza hidrofóbica y de gran viscosidad. Estas
características pueden reducir la capacidad de la dilución o pueden usar
distribución desigual del aceite a través del medio, aun si se usa un agente
correcto disgregante o solubilizante. Se tiene que comprobar si las
concentraciones aplicadas del emulsor o del solvente no afectan el crecimiento y
diferenciación de los microorganismos de pruebas(Kalemba y Kunicka, 2003).
Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la EspecieChromolaena meridensis.
44
Los cultivos de microorganismos se realizan en medios líquidos, bajo condiciones
físicas óptimas para las especies individuales. Los microorganismos tienen que
alcanzar una fase apropiada del crecimiento y un número especificado de células
tienen que ser utilizado para la prueba (Kalemba y Kunicka, 2003).
B.3.1. Método de Difusión en Agar
El principio en que se basa la técnica de ensayo es bastante simple. Cuando se
coloca un disco impregnado en el agar en el que previamente se ha inoculado la
bacteria objeto de la prueba, el disco capta humedad y la sustancia impregnada
difunde rápidamente hacia fuera a través del agar, produciendo un gradiente de
concentración. La sustancia impregnada está presente a una concentración alta
cerca del disco y afecta incluso a gérmenes mínimamente sensibles (los
microorganismos resistentes crecen hasta el disco). A medida que aumenta la
distancia desde el disco, disminuye la concentración de la sustancia y solo los
patógenos más sensibles resultan dañados. Si la sustancia inhibe el agente
bacteriano, en torno al disco se forma un halo claro. Cuanto más ancha es la zona
que rodea el disco, más sensible es el patógeno. El diámetro del anillo es también
función de la concentración inicial de la sustancia, de su solubilidad y de su tasa
de difusión a través del agar (Prescott et al, 2004).
Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la EspecieChromolaena meridensis.
45
El aceite esencial no se usa a menudo en forma pura, generalmente se utilizan
sus soluciones. Se preparan en capsulas de Petri, soluciones del aceite esencial
en diferentes concentraciones y los discos de papel son sometidosa impregnación.
Las placas se almacenan durante algún tiempo para permitir que todos los
componentes del aceite esencial se difundan dentro del agar, después se incuban.
La eficacia del aceite esencial es demostrada por tamaño de la zona de inhibición
del crecimiento del microorganismo alrededor del disco y se expresa generalmente
como el diámetro de esta zona (milímetros o centímetros) (Kalemba y Kunicka,
2003).
B.3.1.1. Método de Kirby-Bauer
En la actualidad, la prueba de difusión en agar mas empleada es el método de
Kirby-Bauer. Consiste en tocar con una asa o aguja de inoculación, 4 o 5 colonias
del patógeno que crece en el agar y se emplea para inocular un tubo con caldo de
cultivo. El cultivo se incuba durante unas pocas horas hasta que se enturbia
ligeramente, luego se toma con un hisopo la suspensión bacteriana y se emplea
para inocular el agar de Mϋeller-Hinton, se deja secar y se coloca sobre este los
discos impregnados, luego se incuba por 16 o 18 horas y posteriormente se miden
los diámetros de inhibición. Finalmente se interpreta empleando una tabla que
Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la EspecieChromolaena meridensis.
46
relaciona el diámetro de la zona de inhibición con el grado de resistencia
microbiana (Prescott et al, 2004).
B.3.2.Método de dilución
El método de dilución en serie en agar se utiliza para bacterias y hongos y su
modificación con caldo líquido se usa solo para hongos. Los cultivos de agar se
realizan en cápsulas de Petri o en tubos, mientras que los cultivos líquidos se
realizan en frascos cónicos con un volumen de 100 ml de medio. Para el caldo
líquido en frascos cónicos, el índice de crecimiento inhibitorio se calcula (% de los
cambios en la biomasa del hongo comparando con el cultivo control) (Kalemba
yKunicka, 2003).
Los resultados se pueden presentar en dos maneras:
El índice de inhibición de crecimiento (Kalemba y Kunicka, 2003).
La concentración inhibitoria mínima (CIM) o la máxima dilución inhibitoria
(MDI)(Kalemba yKunicka, 2003).
Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la EspecieChromolaena meridensis.
47
B.3.2.1. Concentración inhibitoria mínima (CIM)
Proporciona cierta idea de la eficacia de un agente quimioterápico. La CIM es la
concentración más baja de un fármaco que impide el crecimiento de un
determinado patógeno (Prescott et al, 2004).
Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la EspecieChromolaena meridensis.
48
IV. PROBLEMA
¿Cuál sería la composición química y la actividad antibacteriana del aceite
esencial de la especieChromolaena meridensis (B.L. Rob.) R.M. King & H. Rob.
(Asteraceae),recolectadaen San Rafael de Mucuchíes,Mérida- Venezuela, frente a
bacterias grampositivas ygramnegativas representativas, pertenecientes a la
Colección de Cultivo Tipo Americano (ATCC)?
Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la EspecieChromolaena meridensis.
49
V. HIPÓTESIS
Especies del género Chromolaena presentan compuestos químicos volátiles como
monoterpenos, sesquiterpenos y compuestos fenólicos, cabe esperar que en el
aceite esencial de la especie Chromolaena meridensis (B.L. Rob.) R.M. King & H.
Rob. (Asteraceae) estén presentes algunos de estos compuestos y manifiesten
actividad antibacteriana frente a bacterias grampositivas y gramnegativas
representativas, pertenecientes a la Colección de Cultivo Tipo Americano (ATCC).
Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la EspecieChromolaena meridensis.
50
VI. OBJETIVOS
A. Objetivo general
Determinar la composición química y actividad antibacteriana del aceite esencial
deChromolaena meridensis (B.L. Rob.) R.M. King & H. Rob.
(Asteraceae),recolectada en San Rafael de Mucuchíes, Mérida- Venezuela, frente
a bacterias grampositivas y gramnegativas representativas, pertenecientes a la
Colección de Cultivo Tipo Americano (ATCC).
A.1. Objetivos específicos
Recolectar e identificar la especie de estudio en San Rafael Mucuchíes,
Mérida-Venezuela.
Extraer el aceite esencial mediante la técnica de hidrodestilación utilizando una
trampa de Clevenger.
Separar e identificar los componentes del aceite a través de la técnica
Cromatografía de Gasesacoplada a Espectrometría de Masas.
Evaluar la actividad antibacteriana del aceite esencial de la especie
Chromolaena meridensis (B.L. Rob.) R.M. King & H. Rob. (Asteraceae),
utilizando el Método de Difusión en Agar con discos de papel.
Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la EspecieChromolaena meridensis.
51
VII. MATERIALES Y MÉTODOS
A. Material vegetal
A.1. Recolección e identificación del material vegetal
LaespecieChromolaena meridensis (B.L. Rob.) R.M. King & H. Rob.,
fuerecolectada en el Municipio Rangel. San Rafael de Mucuchíes a 3 km del
cementerio vía Las Cañadas. Mérida - Venezuela (figura 5). Luego se realizó la
identificación de la especie por elIngeniero Juan Carmona y se dejóuna muestra
testigo (voucher) bajo el Nº935 en el Herbario MERF de la Facultad de Farmacia y
Bioanálisis,Universidad de Los Andes.
Tomado de https://www.google.co.ve/imagenes.
FIG. 5: LOCALIZACIÓN GEOGRÁFICA DEL LUGAR DE RECOLECCIÓN DE LAESPECIEChromolaena meridensis.
Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la EspecieChromolaena meridensis.
52
A.2. Clasificación taxonómica
(Aristeguieta, 1964)
B.Obtención y análisis del aceite esencial de Chromolaena
meridensis(B.L. Rob.) R.M. King & H. Rob.
B.1. Obtención del aceite por el Método de Hidrodestilación
Para obtener el aceite esencial de la especie en estudio, se recolectaron 1600 gr
de las partes aéreas del material vegetal fresco yposteriormente se licuaron con
agua para lograr mayor rendimiento del aceite. Luego se procedió a la extracción
Reino: Plantae
División: Magnoliophyta
Clase: Magnoliopsida
Orden: Asterales
Familia: Asteraceae
Subfamilia: Asteroideae
Tribu: Eupatorieae
Género: Chromolaena
Especie: Chromolaenameridensis(B.L. Rob.) R.M. King & H.Rob.
FIG. 6:Chromolaena meridensis
Foto tomada por la Prof. DiolimarBuitrago.
.
Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la EspecieChromolaena meridensis.
53
delaceite esencial por medio de un equipo de hidrodestilación, empleando la
trampa de Clevenger (figura 7).
La temperatura en el balón de extracción empleado, se mantuvo a 80°C por un
tiempo de 4 horas aproximadamente para lograr extraer todo el aceite posible
contenido en el material vegetal. Al culminar el proceso de extracción se procedió
a guardar el aceite en un frasco hermético de color ámbar para resguardarlo de la
luz y el oxígeno, se le adicionó sulfato de sodio anhidro para eliminar el exceso de
agua y se almacenó entre 4-5 °C.
B.2. Cromatografía de Gases (CG)
El análisis por Cromatografía de Gases fue realizado en un cromatógrafo de
marca Hewlett-Packard 6890 con un detector de ionización de llama. Se empleó
una columna HP-5 de 30 metros de largo, 0,25 mm de diámetro y 0,25 m de film.
Se usó Helio como gas portador con un flujo de 1 mL/min. Se empleó una
temperatura inicial de 60 ºC (1 min) y luego se calentó a razón de 4 ºC/min hasta
260 ºC. El inyector se mantuvo a 200 ºC y el detector a 230 ºC. Se determinaron
los índices de Kováts que fueron calculados en relación con una serie de n-
alcanos de C8-C24 y comparados con valores reportados en la literatura (Adams,
1995).
Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la EspecieChromolaena meridensis.
54
B.2. Análisis del aceite esencial
FIG. 7:DESARRORRO DEL PROCESO DE OBTENCIÓN DEL ACEITE ESENCIAL DELA ESPECIE Chromolaena meridensis
Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la EspecieChromolaena meridensis.
55
B.2.1. Cromatografía de Gases acoplada a Espectrometría de
Masas (CG-EM)
Los análisis se realizaron en un cromatógrafo de gasesmarca Hewlett-Packard
6890 acoplado a un detector de masas HP5973 (figura 8). El cromatógrafo estaba
equipado con una columna capilar HP-5MS (30 m x 0,25 mm diámetro interno y
espesor de película 0,25 m). La temperatura del inyector y el programa fueron los
mismos usados para el análisis CG. Se inyectó una muestra de 1,0 µL de una
solución al 2% del aceite esencial en n-heptano con reparto 100:1. La
identificación de sus componentes seefectúo mediante comparación
computarizada con las bases de datos: Wiley MS Data y NIST 05.
FIG. 8: CROMATÓGRAFO DE GASES ACOPLADO A UN ESPECTROMETRO DEMASAS
Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la EspecieChromolaena meridensis.
56
C. Evaluación de la actividad antibacteriana
Para la evaluación de la actividad antibacteriana del aceite esencial de la
especieChromolaena meridensis, se seleccionó el Método de Difusión de Agar
usando disco de papel. Esta técnica es la más generalizada y reconocida por su
precisión y confiabilidad para la evaluación de la actividad antimicrobiana, lo que
hace posible una estimación del grado de inhibición del crecimiento del
microorganismo de una forma bastante simple. Los parámetros más importantes
de este método son, el diámetro del disco de papel, la cantidad del aceite esencial
y el tipo de solvente de dispersión (Kalemba y Kunicka, 2003).
C.1. Preparación de los inoculos bacterianos
Cada bacteria fue cultivada en caldo Müeller-Hinton e incubadas a 37ºC durante
18 horas. A partir de este cultivo, se tomó una parte y se diluyó con solución
salina fisiológica estéril (0,85%) hasta obtener una turbidez visualmente
comparable al patrón McFarland Nº 0,5, equivalente a 106-8 UFC/mL (Velasco et
al, 2007).
C.2. Preparación de las placas de Petri Agar Müeller-Hinton
Las cápsulas de Petri de 5-12 cm de diámetro (usualmente 9 cm) se llenaron con
20 ml de caldo de Agar Müeller-Hinton previamente esterilizado (figura 9) y luego
Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la EspecieChromolaena meridensis.
57
se dejaron solidificar a 4°C durante varias horas,una vez solidificado se inocularon
en forma homogénea cada microorganismo de ensayo en la superficie del agar
con un hisopo estéril.
FIG. 9: PREPARACIÓN Y ESTERILIZACIÓN DEL MEDIO AGAR MÜELLER-HINTON
Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la EspecieChromolaena meridensis.
58
C.3.Impregnación de los discos
Se utilizaron discos de papel de filtro de 4milímetros (mm) de diámetro
previamente esterilizados en cámara de flujo laminar bajo rayos UV durante 12
horas aproximadamente (figura 10). Se realizarondiluciones del aceite esencial
conel solvente dimetilsulfóxido (DMSO)y se impregnaron los discoscon 10µl del
aceite puroy diluciones del aceite con concentraciones de 30 μg/mL,15 μg/mL y 10
μg/mL. Tambiénse impregnaron los discos con el solventeDMSO el cual se utilizó
como control negativo para comprobar la posible actividad de este solvente frente
a las bacterias ensayadas (Velasco et al, 2007)(figura 11). Y los controles
positivos estuvieron representados por discos de antibióticos comercialeslos
cuales inhibieronel crecimiento bacteriano de las cepasensayadas grampositivas y
gramnegativas pertenecientes a la Colección de Cultivo Tipo Americano (ATCC)
(tabla IX). En seguida se colocaron en la superficie del agar inoculado, de forma
equidistante los discos de papel de filtro ya impregnados, el control negativo y
controles positivos respectivos para cada microorganismo(figura 12). Los ensayos
se realizaron por duplicado.
Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la EspecieChromolaena meridensis.
59
FIG. 10: ESTERILIZACIÓN DE LOS DISCOS DE PAPEL DE FILTRO
FIG. 11: IMPREGNACION DE LOS DISCOS DE PAPEL DE FILTRO
Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la EspecieChromolaena meridensis.
60
TABLA IX. MICROORGANISMOS Y CONTROLES POSITIVOSUTILIZADOS
MICROORGANISMOS CONTROLES POSITIVOS
GRAM POSITIVAS
Staphylococcus aureus ATCC 25923 Erytromicina® (15 μg)
Enterococcus faecalis ATCC29212 Ampicilina® (10μg)
GRAM NEGATIVAS
Escherichia coli ATCC 25922
Pseudomona aeruginosa ATCC27853 Amikacina® (30μg)
Klebsiella pneumoniae ATCC 23357
1. Aceite puro de Chromolaena meridensis.
2. Aceite diluido (30 μg/mL, 15μg/mL, 10μg/mL)deChromolaena meridensis.
3. Control positivo (antibióticos comerciales)
4. Control negativo (solvente DMSO)
1
FIG. 12: REPRESENTACIÓN GRÁFICA DE LA UBICACIÓN DE LOS DISCOSIMPREGNADOS
2
3 4
Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la EspecieChromolaena meridensis.
61
C.4. Incubación
Posteriormente el medio de cultivo inoculado se dejó en preincubación durante 6 -
7 horas a4 °C y luego se incubaron a37 °C durante 24 horas (De los Ríos et al,
1999).
C.5. Lectura de la prueba
Transcurrido el tiempo de incubación se precedió a realizar la lectura de los halos
de inhibición; el diámetro de la zona de inhibición producto de la actividad
antibacteriana del aceite se expresó en milímetros (mm) (Velasco et al, 2007).En
los casos donde no se observo halo de inhibición la prueba se interpreto como
negativa o resistente.
C.6. Concentración inhibitoria mínima (CIM)
Después de la lectura de los halos de inhibición se procedió a realizar la
concentración inhibitoria mínima (CIM), necesaria para inhibir la producción y
multiplicación del crecimiento visible de las cepas ensayadas que resultaron ser
sensibles (positivas) al aceite esencial de la especie Chromolaena meridensis.
Para esto se empleó el método de Difusión en Agar con Discos que se utilizo
inicialmente para la determinación de la actividad antibacteriana. Se tomó una
Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la EspecieChromolaena meridensis.
62
parte las cepas bacterianas puras con un asa estéril y se colocaron en SSF 0,85
%, que luego fueron comparados con el patrón de turbidez de Mac Farland N° 0.5
(106-8 UFC/mL). La impregnación de los discos de papel de filtro previamente
esterilizados en cámara de flujo laminar bajo rayos UV, se realizó condiluciones
del aceite en un intervalo de concentraciones entre 1,25 μg/mL y 10 μg/mL.
También se impregnaron los discos con el solvente DMSO y los controles
positivos estuvieron representados por los antibióticos comerciales. Los ensayos
se realizaron por duplicado. Transcurrido el tiempo de incubación se realizo la
lectura de los halos de inhibición.
Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la EspecieChromolaena meridensis.
63
D. Diseño Experimental
Recolección.
ecioapiculata
Identificación.
Partes aéreas frescas.
Equipo de Hidrodestilación empleando latrampa de Clevenger.
Separación e identificaciónpor Cromatografía de GasesAcoplada a Espectrometría
de Masas.
Adición de sulfatoanhidro.Frasco hermético color ámbar, 4–5 °C.
Material vegetalChromolaena meridensis.
Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la EspecieChromolaena meridensis.
64
Método de Difusión en Agar usando disco de papel.
Preparación de los inoculos bacterianos en SSF 0,85 % y comparación conel patrón de Turbidez Mac Farland N° 0,5 (106-8 UFC/mL)
Siembra en Agar Müeller - Hinton.
Impregnación de los discos de 4 mm de diámetro con 10 µl del aceite esencial puroydiluido a 30 μg/mL, 15μg/mL y 10 μg/mL de Chromolaena meridensis y con el
respectivo solvente (DMSO).
Preincubación.4 °C – 6 a 7 horas.
Incubación.37 °C – 24 horas.
Lecturas de los halos de inhibición.
CIM a las cepas sensibles frente al aceite esencial.
Resultados ydiscusión.
Conclusión.
Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la EspecieChromolaena meridensis.
65
VIII. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
El aceite esencial de la especie Chromolaena meridensis (B. L. Rob.) R.M. King &
H. Rob., recolectada en San Rafael de Mucuchíes. Mérida-Venezuela, se obtuvo a
partir de las partes aéreas del material vegetal fresco licuadas con agua para un
mayor rendimiento del aceite, las cuales se sometieron a un proceso de
Hidrodestilación empleando la trampa de Clevenger. El aceite obtenido presentó
las siguientes características físicas y organolépticas (tabla X).
TABLA X: CARACTERÍSTICAS FÍSICAS Y ORGANOLÉPTICAS DEL ACEITEESENCIAL DE LA ESPECIE Chromolaena meridensis
CARACTERÍSTICAS ACEITE ESENCIAL
Aspecto Transparente
Color Amarillo
Peso de hojas 1600gr
Volumen del aceite 1 mL
Rendimiento porcentual (%) 0,063
Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la EspecieChromolaena meridensis.
66
Luego de la obtención del aceite esencial, se realizóun análisis para conocer su
composición química empleando un equipo de Cromatografía de GasesAcoplada
a un Espectrómetro de Masas marcaHewlett Packard 5973.En la figura 13 se
presenta el cromatograma de las partes aéreas del aceite esencial
deChromolaena meridensis.
En la tabla XI se muestran los componentes volátiles presentes, tiempo de
retención y abundancia relativa de cada uno de ellos. En total se lograron
identificar 11 compuestos que representan más del 99% de los compuestos
presentes en el aceite esencial y corresponden en su mayoría a sesquiterpenos
monociclicos que constituyen el 97,75% del total de compuestos, seguido de
monoterpenos con un 0,28%, aldehído 0,54% y alqueno 0,87%. Los componentes
mayoritarios resultaron ser los sesquiterpenos: α – zingibereno (65,26%)[17], α –
curcumeno (13,74%)[21], α - humuleno (8,20)[22], β – sesquifelandreno
(4,06%)[23] yβ - cariofileno (2,93%)[24]; cuyas estructuras se representan en la
figura 14.
Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la EspecieChromolaena meridensis.
67
FIG. 13: CROMATOGRAMA DEL ACEITE ESENCIAL DE LAS PARTES AÉREAS DE LAESPECIEChromolaena meridensis
Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la EspecieChromolaena meridensis.
68
TR: Tiempo de retención obtenido en el equipo CG-EM
A: Área
IKcal: Índice de kováts calculado
IKlit: Índice de kováts de la literatura
COMPONENTES TR A % IK cal IK lit
Benzaldehído 5.705 0.54 965 961
Mirceno 6.367 0.13 991 991
α – terpineno 6.650 0.15 1002 1018
α – terpinoleno 9.086 0.87 1092 1088
β - cariofileno 19.592 2.93 1420 1418
α – bergamoteno 20.069 1.98 1438 1436
α - humuleno 20.664 8.20 1459 1454
α – curcumeno 21.500 13.74 1487 1483
α – zingibereno 22.095 65.26 1507 1495
β – bisaboleno 22.319 1.58 1514 1509
β – sesquifelandreno 22.758 4.06 1529 1524
TABLA XI: COMPONENTES VOLÁTILES DEL ACEITE ESENCIAL DEChromolaena meridensis
Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la EspecieChromolaena meridensis.
69
SESQUITERPENOS
[17] [21] [22]
[23][24]
H
H
HH
FIG. 14: ESTRUCTURAS QUÍMICAS DE LOS COMPONENTES MAYORITARIOSDEL ACEITE ESENCIAL DEChromolaena meridensis
Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la EspecieChromolaena meridensis.
70
Según la literatura consultada no existen estudios previos sobre la composición
química del aceite esencial de Chromolaena meridensis, sin embargo se han
estudiado otras especie pertenecientes al género.
En el año 2002 Maia et al, 2002reportó el sesquiterpeno α- zingibereno como
componente mayoritario del aceite esencial de Chromolaena marginatum en una
proporción de 57,5%, lo cual coincide con los resultados reportados
paraChromolaena meridensis, que presenta dicho compuesto en un 65,26%.
En este mismo estudio se reportó el compuestoβ- cariofileno en el aceite esencial
deChromolaena squalidum, Chromolaena amygdalinun y Chromolaena
conyzoides en proporción de 7,1% para las tres especies, mientras que para
Chromolaenameridensis, este compuesto se encontró en un 2,93%.
Por otra parteOwolabi et al, 2010reportó también en su estudioel compuestoβ-
cariofileno,presentecomo uno de los componentesmayoritarios del aceite esencial
de Chromolaena odorataen un 5,4%.
Para el estudio de la actividad antibacteriana del aceite esencial de Chromolaena
meridensis, se empleó el Método de Difusión en Agar con discos de papel
utilizandocepas de referencia grampositivas y gramnegativas, presentando
Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la EspecieChromolaena meridensis.
71
actividad inhibitoria frente a las cepas de Staphylococcus aureusATCC 25923,
Streptococcus faecalisATCC 29212 y Klebsiella pneumoniaeATCC 23357, con
halos que oscilan entre 6 a 11 mm de diámetro y una concentración inhibitoria
mínima de 10 μg/mL . En la tabla a continuación se representan las lecturas de las
zonas de inhibición expresadas en milímetro (mm) y CIM.
Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la EspecieChromolaena meridensis.
72
MicroorganismosAceitepuro
30 15 10 CIM
Staphylococcus aureusATCC 25923 11 8 7 5 10
Streptococcus faecalisATCC 29212 10 8 7 7 10
Escherichia coliATCC25922 R R R R _
Pseudomona aeruginosaATCC 27853 R R R R _
Klebsiella pneumoniae ATCC 23357 9 6 6 6 10
R: Resistente
CIM: Concentración Inhibitoria Mínima
ATCC: Colección de Cultivo Tipo Americano
-: No hubo actividad
Rango CIM: 1,25 μg/mL – 10 μg/mL
TABLA XII: ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA DEL ACEITE ESENCIAL DE LA ESPECIEChromolaena meridensis
Zonas de inhibición expresadas en mm
Concentraciones en μg/mL
Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la EspecieChromolaena meridensis.
73
La actividad antibacteriana que se manifestó se podría atribuir a la presencia de
los compuestosα-zingibereno, β-sesquifelandreno y β-cariofileno, que han sido los
responsables de la actividad antibacteriana en otros géneros.
En un estudio realizadoen Turquía porKahriman et al, 2011 se comprobó que el
componente mayoritario α- zingibereno presente en el aceite esencial de las hojas
deSenecio pandurifolius,demostró una actividad inhibitoria (por el Método de
Difusión en Agar) frente a las cepas de referencia Staphylococcus aureus y
Enterococcus faecalis con halos de inhibición de 15 mm y 12 mm de diámetro
respectivamente, resultando la concentración más baja capaz de inhibir las cepas
6,5 μg/mL. Parael caso de Chromolaena meridensisel compuesto α–
zingiberenotambién está presente en el aceite esencial de las hojas frescas en
mayor proporción y la actividad antibacteriana se manifestó contra las mismas
cepas con halos de inhibición para el caso de Staphylococcus aureusde 11 mm de
diámetro y Enterococcus faecalisde 10 mm de diámetro, con una Concentración
Inhibitoria Mínima de 10μg/.
Por otra parte en un estudio realizado por El-Baroty etal, 2010se caracterizó la
propiedad antibacterial de los compuestos β-sesquifelandreno y β – cariofileno
presentes en el aceite esencial extraído del rizoma de jengibre en gran
Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la EspecieChromolaena meridensis.
74
proporción, frente a las cepas de referencia: Staphylococcus aureus yKlebsiella
pneumoniae.Encontrándose similitud con los resultados reportadosen el presente
estudio, dondela actividad inhibitoria se mostró frente a las mismas cepas y los
componentes β-sesquifelandreno y β – cariofilenotambién están presentes en el
aceite esencial de Chromolaena meridensis.
Aun cuando existen estudios que confirman la actividad inhibitoria de algunos
extractos de diferentes especies del género Chromolaena sobre una variedad de
cepas bacterianas (Torrenegra et al, 2007; Sanabria et al, 1998; Sanabria et al,
1989; Sanabria y Carrero, 1995; y Hidalgo et al,1998), este es el primer estudio
que se realiza para evaluar la actividad inhibitoria del aceite esencial de la especie
Chromolaena meridensis contra cepasde referencia grampositivas
(Staphylococcus aureusATCC 25923 y Streptococcus faecalisATCC 29212) y
gramnegativas (Escherichia coliATCC 25922, Pseudomona aeruginosaATCC
27853y Klebsiella pneumoniae ATCC 23357).
Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la EspecieChromolaena meridensis.
75
IX. CONCLUSIONES
El aceite esencial extraído de las partes aéreas de la especie Chromolaena
meridensis por el método de Hidrodestilaciónempleando la trampa de
Clevenger mostró un rendimiento de 0,063%.
Los componentes identificados de acuerdo al análisis cromatográfico y
espectroscópicoresultaron ser 11 compuestos, en su mayoría sesquiterpenos
monociclicos que representan el 97,75% del total de compuestos, luego
monoterpenos con un 0,28 %, alqueno 0,87 % y aldehído 0,54 %.
Los componentes mayoritarios del aceite esencial, están representados en su
totalidad por los sesquiterpenos: α – zingibereno (65,26%), α – curcumeno
(13,74%), α - humuleno (8.20), β – sesquifelandreno (4,06%) y β - cariofileno
(2,93%).
El aceite esencial de Chromolaena meridensis, presentó actividad inhibitoria
frente a tres de las cepas ensayadas: grampositivas (Staphylococcus aureus
ATCC y Streptococcus faecalis ATCC 29212) y gramnegativas (Klebsiella
pneumoniae ATCC 23357); y una Concentración Inhibitoria Mínima de 10
μg/mL.
Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la EspecieChromolaena meridensis.
76
Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la EspecieChromolaena meridensis.
77
ANEXO 1: VOUCHER DE LA ESPECIEChromolaena meridensis UBICADO
EN EL HERBARIO MERF
Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la EspecieChromolaena meridensis.
78
ANEXO 2: EQUIPO DE HIDRODESTILACION EMPLEANDO LA TRAMPA DECLEVENGER
Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la EspecieChromolaena meridensis.
79
ANEXO 4:COLOCACIÓN DE LOS DISOS IMPREGNADOS CON ELACEITE ESENCIAL DE C. meridensisy CON DMSO
ANEXO 3:DISCOS DE PAPEL DE FILTRO DE 4 MILÍMETROS DEDIÁMETRO
Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la EspecieChromolaena meridensis.
80
ANEXO 5:ENSAYO DE LA CEPA DEE. coli ATCC 25922
ANEXO 6:ENSAYO DE LA CEPA DE K. pneumoniaeATCC 23357
Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la EspecieChromolaena meridensis.
81
ANEXO 7: ENSAYO DE LA CEPA DE P. aeruginosaATCC 27853
ANEXO 8: ENSAYO DE LA CEPA DE S. aureusATCC 25923
Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la EspecieChromolaena meridensis.
82
ANEXO 9: ENSAYO DE LA CEPA DE E. faecalisATCC 29212
Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la EspecieChromolaena meridensis.
83
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