Universidad Nacional San Universidad Nacional San Antonio Abad del CuscoAntonio Abad del Cusco
Carrera Profesional de Farmacia y Carrera Profesional de Farmacia y BioquímicaBioquímica
cromatografíacromatografía Método usado principalmente para la Método usado principalmente para la
separación de los componentes de una separación de los componentes de una muestra, en el cual los componentes son muestra, en el cual los componentes son distribuidos entre dos fases, una de las distribuidos entre dos fases, una de las cuales es estacionaria, mientras que la otra cuales es estacionaria, mientras que la otra es móvil. La fase estacionaria puede ser un es móvil. La fase estacionaria puede ser un sólido o un líquido soportado en un sólido o sólido o un líquido soportado en un sólido o en un gel (matriz). La fase estacionaria en un gel (matriz). La fase estacionaria puede ser empaquetada en una columna, puede ser empaquetada en una columna, extendida en una capa, distribuida como extendida en una capa, distribuida como una película, etc...una película, etc...
La velocidad de desplazamiento es función del coeficiente de distribución de cada componente entre las dos fases.
][A][A
= DFM
FE
FE
sólido
líquido
gel
FM
gas
líquido
fluido sc
CROMATOGRAFÍA
DeterminaciónSeparación
la naturaleza de las fases móvil y estacionaria y la clase de equilibrios implicados en la transferencia de los solutos entre las fases, es decir, el mecanismo de interacción
dispositivo utilizado para conseguir el contacto entre la fase móvil y la estacionaria
Representación gráfica de la respuesta del detector en función del tiempo, volumen de eluyente o distancia en el lecho cromatográfico
funcionamiento del sistema cromatográfico
Información analítica relativa a la muestra
el tiempo que tarda el máximo de un pico en ser eluido después de la inyección
intervalo de tiempo que transcurre desde que el trazador es insertado al principio del lecho cromatográfico hasta que sale del mismo
t'R = tR - to
t0
tR
t´R
diferencia entre el tiempo de retención del analito y el volumen muerto de la columna, es decir, el tiempo que un analito es retenido en la columna comparado con un compuesto no retenido
k' = ( tR - to ) / to
Es la relación entre el tiempo que las moléculas del analito están en la fase estacionaria y el que están en la fase móvil.
tR = t0 (1 + K')
K'= ß KD
K'= ß Dmm
SS
V C
V C
FM laen pasa soluto el que tiempo
FE laen pasa soluto el que tiempo K´
Pes y Pm, probabilidades que tiene un analito de estar en la FE o FM, respectivamente, coinciden con las fracciones del mismo en cada una de estas fases:Pes = K'/ 1+K'
Pm = 1/ 1+K'
Pm es equivalente al denominado factor de retraso, R,
R = velocidad de desplazamiento del analito/velocidad de FM = 1 / 1+K'
V= tF
K' = V'R/V'0VR = V'R + V0
volumen que ocupa en la columna la FM
V0 = t0F
volumen de FM necesario para que se produzca la elución de un soluto
VR = tRF
V'R = t'RF
VR = V0 (1 + K')
CROMATOGRAFÍA EN SUPERFICIE PLANA
FLUJOpropiciado por CAPILARIDAD
FASE MÓVIL(apolar)
CÁMARACROMATOGRÁFICA
distancia avanzada por la moléculaRf= distancia avanzada por el frente
Rf es característico para cada soluto para una composición dada de fase móvil y un determinado tipo de superficie
F. MÓVIL (LÍQUIDA) Disolvente orgánico
F. ESTACIONARIA (LÍQUIDA) H2O absorbida en la celulosa.
SOPORTE celulosa de papel de filtro
CROMATOGRAFÍA EN PAPEL
CLASE: RepartoPROPIEDAD: SolubilidadNOMBRE: Fase Normal
Molec. Hidrofílica LENTARetenida por f.estacionaria
Molec. Hidrofóbica RÁPIDADisuelta en f. móvil
F. MÓVIL (LÍQUIDA) Disolvente orgánico
SOPORTE plancha de metal o vidrio
CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA (TLC)
F. ESTACIONARIA (SÓLIDA) sólido pulverizado sobre plancha de metal o vidrio. El más usado es el gel de sílica.
CLASE: InteracciónPROPIEDAD: HidrofóbicaNOMBRE: Interacción Hidrofóbica
Molec. Hidrofílica LENTARetenida por f.estacionaria
Molec. Hidrofóbica RÁPIDADisuelta en f. móvil
CLASE: RepartoPROPIEDAD: Tamaño (y forma)NOMBRE: Exclusión
CROMATOGRAFÍA DE GEL FILTRACIÓN
SOPORTE Resina de micropartículas esféricas formadas por polímeros hidrofílicos (dextrano, agarosa poliacrilamida o mezcla de ellos).
Tamaños de poro intérvalo o rango de fraccionamiento.
P.e. Sephadex G25: 1000 – 5000 DaSephadex G200: 5000 – 250000 Da
MICROPARTÍCULAS
F. MÓVIL (LÍQUIDA) solvente acuoso que atraviesa la columna por los espacios intersticiales (entre las micropartículas).
FASE MÓVIL
F. ESTACIONARIA (LÍQUIDA) solvente acuoso (el mismo que el de la fase móvil) que se encuentra dentro de micropartículas.
F. ESTACIONARIA
1 2 4 5 6 7 8 93resp
uesta
del d
ete
cto
r
fracción
PERFIL DE ELUCIÓN
CROMATOGRAFÍA DE GEL FILTRACIÓN
Molec. GRANDES RÁPIDAS
* Avanzan con mayor velocidad a través de los espacios intersticiales (con F. móvil)
grande
Molec. PEQUEÑAS LENTAS
* Son retenidas por las fibras de las micropartículas y avanzan con menos velocidad (con F. estacionaria).
pequeñaAPLICACIÓN
MUESTRA
ELUCIÓN
CLASE: InteracciónPROPIEDAD: Electrostática
NOMBRE: Intercambio iónico (aniónico o catiónico)
CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO
SOPORTE Resina de micropartículas formadas por polímeros sintéticos (poliestireno entrecruzado con divinilbenceno o DowexR) o matrices de polímeros naturales (dextranos, celulosas, agarosa).
MICROPARTÍCULASF. MOVIL (LÍQUIDA) Solvente que anula la interacción electrostática.
2 posibilidades: Gradientes de pH cambio de carga de las moléculas de la muestra.
Gradientes iónicos competencia por grupos electrófilos.
FASE MÓVIL
F. ESTACIONARIA (SÓLIDA) Grupos con cargas iónicas unidos al soporte.
Carga positiva (+) intercambiadores de aniones (-).Carga negativa (-) intercambiadores de cationes (+).
F. ESTACIONARIA
CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO
Molec. MENOR CARGA (+) RÁPIDAS
* Son desplazadas más fácilmente por la f.móvil.
Molec. MAYOR CARGA (+) LENTAS
* Son retenidas por los grupos cargados iónicamente de la f. estacionaria.
•Gradiente de pH•Gradiente salino
1 2 4 5 6 7 8 93resp
uesta
del d
ete
cto
r
fracción
PERFIL DE ELUCIÓN
+
-
Na+
q+Q+APLICACIÓN
MUESTRA
ELUCIÓN
CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD
CLASE: InteracciónPROPIEDAD: Interacciones específicas entre dos moléculasP.e. hormona-receptor
proteína-metal o cofactores como ATPantígeno-anticuerpo
NOMBRE: Afinidad biológica
F. ESTACIONARIA (SÓLIDA) Ligando específico unido a la matriz.
-- Comerciales: Concavalina A une glicoproteínasProteína A une IgG (anticuerpos)
-- No comerciales: anclaje covalente ligando - matriz F. ESTACIONARIA
SOPORTE Matriz de micropartículas hidrofílicas sin carga, con rigidez, inerte y estable (agarosa, acrílica).
MICROPARTÍCULASF. MÓVIL (LÍQUIDA) Solución que anula o disminuye la
afinidad con el ligando de la fase estacionaria.
-- Solución con el propio ligando – Molécula + ligando libre -- Solución con algo que interacciona con el ligando - Molécula
FASE MÓVIL
fracción
Molec. NO INTERACCIÓN RÁPIDAS
* No se unen al ligando de la fase estacionaria.
Molec. INTERACCIÓN LENTAS
* Se unen al ligando de la f. estacionaria. Elución específica.
APLICACIÓN MUESTRA
LAVADOELUCIÓN
ESPECÍFICA1 2 4 5 6 7 8 93re
sp
uesta
del d
ete
cto
r
PERFIL DE ELUCIÓN
LAVADOELUCIÓN
ESPECÍFICA
molécula
CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD
CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD Sistema GST (Glutatión-S-Transferasa)
GST
Proteína X
Purificación de PROTEÍNAS RECOMBINANTES
Cualquier proteína con etiqueta GST
Glut
GSTGlut
GSTGlut
Glut
APLICACIÓN MUESTRA
ELUCIÓN
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