FACULTAD CIENCIAS DE LA SALUD
ESCUELA PROFESIONAL DE FARMACIA Y BIOQUIMICA
EXTRACCIÓN DE ADN, ARN Y PROTEÍNAS: EL PASADO Y EL
PRESENTE CURSO: BIOQUÍMICA II
DOCENTE: Q.F. Minaya Galarreta, Angélica.
INTEGRANTES: Apaza Gonzales, Pamela
Fernández Lugo, Ana Cecilia
Huamán Benites, angie
Miguel Buendía, Rosaura
Pozo Cuya, Mireya
Uribe Pinta, Elizabeth
Vargas Inga, Damel
INTRODUCCIÓN
La extracción de ADN, ARN y proteínas, es el método más fundamental utilizado en la biología molecular.
En el pasado el proceso de extracción y purificación consume tiempo, mano de obra y su rendimiento es limitado.
Pueden ser aislados de cualquier material biológico, tales como tejidos vivos o conservados, células, partículas de virus u otras muestras.
Actualmente existen muchos métodos especializados que pueden ser utilizados para extraer biomoléculas puras.
Estos métodos permiten un alto rendimiento de la muestra y la velocidad, exactitud y fiabilidad de la prueba es máxima; y reduce la contaminación cruzada.
ÁCIDOS NUCLEICOS
Los ácidos nucleicos almacenan la información genética de los organismos vivos y son los responsables de la transmisión hereditaria. Gran parte del desarrollo físico de un organismo a lo largo de su vida esta programado en estas moléculas.Las proteínas que elaboraran sus células y las funciones que realizaran están todas registradas en esta cinta molecular. Existen dos tipos: el ADN y el ARN.
EL ADN
Hay 2 cadenas helicoidales de polinucleótidos enrolladas a lo largo de un eje común.
Estas cadenas permanecen unidas por puentes de hidrogeno entre los pares de bases.
Es una macromolécula muy larga , filamentosa y formada por desoxirribonucleótidos, cada uno de ellos compuesto por una base nitrogenada, un azúcar desoxirribosa y un grupo fosfato.
EL ARN
El ARN tiene una sola hebra.
La pentosa de los nucleótidos constituyentes es ribosa.
Sus cuatro bases son: A, G, C, U.
Es la molécula que dirige las etapas intermedias de la síntesis proteica.
TIPOS DE ARNARNm: Actúa como molde y transporta la información para la síntesis proteína.
ARNr: Recibe la información genética. Traduce las proteínas. Se ubica en el ribosoma, organela donde se sintetiza las proteínas.
ARNt: transporta los aminoácidos hacia los ribosomas para la síntesis proteica.
EXTRACCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS
HISTORIA
1869
• Dr Friedrich Miescher realizó la primera extracción de ADN.
• Esperaba solucionar los principios fundamentales de la vida, para determinar la composición química de las células.
• Utilizó los leucocitos obtenidos de la pus recogidos en vendajes quirúrgicos y obtuvo mediante sus pruebas precipitado crudo de ADN.
MÉTODOS DE EXTRACCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS
MÉTODOSCONVENCIONALES
Tiocianato de guanidinio-fenol-cloroformo
Extracción alcalina
Método de Extracción CTAB
Centrifugación en gradiente de bromuro de etidio-cloruro de cesio.
Purificación de ARN Poli (A) por cromatografía de celulosa de oligo
(dT).
PROTEÍNAS
Las proteínas desempeñan un papel fundamental para la vida y son las biomoléculas más versátiles y más diversas. Son imprescindibles para el crecimiento del organismo. Realizan una enorme cantidad de funciones diferentes.
EXTRACCIÓN DE PROTEÍNAS
HISTORIA
Siglo
XVIII
• Antonio Fourcroy estableció propiedades comunes para todas las sustancias Albuminoides.
1893
• El químico holandés Gerhardus Johannes Mulder realizó la primera descripción de PROTEÍNA.
• Sus estudios en la composición mostró presencia de C, H, O, N. El azufre y fósforo estaban presentes en algunas sustancias animales.
1940
• Edwin Cohn realizó técnicas de purificación de proteínas durante la Segunda Guerra Mundial.
• Fue responsable de purificación de la sangre y desarrolla un método para fraccionar el plasma obteniendo albúmina para uso clínico y está fue utilizada por primera vez para tratar el schock en las víctimas del ataque a Pearl Harbor.
MÉTODOS DE EXTRACCIÓN DE PROTEÍNAS
Cromatografía de
intercambio iónico.Cromatografí
a de filtración en gel.
Cromatografía de afinidad.Electroforesis
en gel.Southwestern Blotting o immunoblotti
ng.
OTROS MÉTODOS DE EXTRACCIÓN
EXTRACCIÓN DE BIOMOLÉCULAS
ALL IN ONE
SISTEMA DE EXTRACCIÓN AUTOMATIZADO
TERMINOLOGÍA
• Es un proceso por el cual átomos, iones o moléculas son atrapadas o retenidas en la superficie de un material.
ADSORCIÓN:
• Es una sustancia que desorganiza la estructura tridimensional en macromoléculas tales que proteínas, ADN o ARN y las desnaturaliza.
AGENTE CAOTRÓPICO:
• Es una sal de amonio cuaternario
CTAB (BROMURO DE HEXADECILTRIMETILAMONIO):
• Es la rotura de la membrana celular.
LISIS CELULAR:
TERMINOLOGÍA
MICROPISTILOS EPPI PARA TUBOS DE
ENSAYO:
• Para homogeneizar células y tejidos en una escala de medición Eppendorf® para tubos de ensayo de 1,5 ml / 2,0 ml (adaptación exacta).
PELLET O PELET
• Es una denominación utilizada para referirse a pequeñas porciones de material aglomerado o comprimido.
SDS O NADS (DODECILSULFATO
SÓDICO O LAURILSULFATO
SÓDICO)
• Es un compuesto tensoactivo iónico
TUBOS EPENDORF
• Es un tubo de microcentrífuga de forma de un pequeño contenedor cilíndrico de plástico, con un fondo cónico y una tapa unida al cuerpo del tubo para evitar su desprendimiento.
EXTRACCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOSPOR MÉTODOS CONVENCIONALES
LOS PASOS GENERALES PARA LA EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN DE ADN
• EXTRACCIÓN:
– Lisis de las células que contienen a los AN
– Inactivación de nucleasas –Clarificación: separación de los
AN de los restos celulares
• PURIFICACIÓN: – De otros AN no deseados – De Lípidos, carbohidratos – De sales y otros compuestos orgánicos
El procedimiento ideal de lisis celular debe tener la fuerza necesaria para romper el material de inicio (células o tejido) y la delicadez requerida para preservar las moléculas de interés (ADN o ARN).
LISIS CELULAR
MÉTODOS DE FRAGMENTACIÓN Y LISIS PARA LA EXTRACCIÓN DE ACIDOS NUCLÉICOS
MÉTODOS MECÁNICOS
- MOLIENDA MANUAL EN MORTERO
- CONGELACIÓN/DESCONGELACIÓN
- ULTRASONIDO
MÉTODOS NO MECÁNICOS
- AGENTES QUÍMICOSDetergentes: CTAB , SDS
ENZIMÁTICOS
- Proteasas: lisozimaGluconasas peptidasas- ARNasa
CARACTERÍSTICAS Y FUNCIONES DE LOS REACTIVOS EMPLEADOS EN LA EXTRACCIÓN DE ADN
MÉTODOS CONVENCIONALES
Fundamento del método: Extracción de ácidos nucleicos utilizando una solución del agente caotrópico de Tiocianato de Guanidino que genera lisis celular y degradación de proteínas con la liberación de los ácidos nucleicos.Posteriormente el uso de solventes orgánicos fenol- cloroformo que permiten su separación de restos de proteínas, lípidos y la posterior precipitación de los ácidos nucléicos usando etanol o isopropanol.
1.- EXTRACCIÓN CON TIOCIANATO DE GUANIDINO – FENOL –
CLOROFORMO (MÉTODO DE CHOMCZYNSKI):
EXTRACCIÓN DE ADN CON SOLUCIÓN DE CHONCZYNSKIMuest
ra vegeta
l PULVERIZAR EN EL
MORTERO
SOLUCIÓN DE TIOCIANATO DE GUANIDINO A pH
BÁSICO < 11
- LISIS DE MEM. CELULAR Y NUCLEAR
- DEGRADACIÓN DE PROTEÍNAS E INACTIVACIÓN DE ENDONUCLEASAS.
FASE SÓLIDARESTOS DE ALTO PESO MOLECULAR
FASE ACUOSA ADN , RESTOS DE PROTEÍNAS Y LIPIDOS
FENOL CLOROFORMO
ADN SUSPENSIÓ
NPROTEÍNA
S Y LÍPIDOS DISUELTO
S
CENTRIFUGA
CENTRIFUGA
ALCOHOL ETÍLICO PURO
ADN EN FORMA DE
FILAMENTOS
CENTRIFUGA
PELLET DE ADN
EXTRACCIÓN DE ARN CON SOLUCIÓN DE CHONCZYNSKI
Homogenizado de muestra vegetal
pulveriza previamente y conservada en
nitrógeno líquido a
-196°C
SOLUCIÓN DE TIOCIANATO DE GUANIDINO A pH
REDUCIDO - ACETATO DE SODIO – FENOL - CLOROFORMO
FASE ACUOSA
ARN TOTAL
FASE ORGÁNICA
ADN, PROTEÍNAS Y LIPIDOS DISUELTOS
CENTRIFUGACIÓN A 4°C
ALCOHOL ISOPROPÍLICO
PELLET DE ARN TOTAL
FASE ACUOSA
ARN TOTAL
2.- EXTRACCIÓN DE ADN PLASMÍDICO POR LISIS ALCALINA
Fundamento del método: Se basa en las diferencias
en la desnaturalización y renaturalización del ADN plasmídico y el ADN cromosómico al aplicar NaOH en presencia de un detergente fuertemente aniónico como el Dodesilsulfato de Sodio (SDS) y Acetato de potasio.
Se usa principalmente para extracción de ADN plasmídico de E. coli.
Detergente SDS
+ NaOH
-Lisis celular -Desnaturaliza
Proteínas ADN cromosómico
ADN plasmídico
-ADN plasmídico se mantiene en solución
-Precipitación: ADN cromosómico. proteínas .
Acetato de
potasio
CENTRIFUGAMOS
EXTRACCIÓN DE ADN PLASMÍDICO POR LISIS ALCALINA
Crecimiento de Cultivo bacteriano de E. coli
Cosecha de cultivo
bacterianopH
FUERTEMENTE ALCALINO DEL
MEDIOpH NEUTRO DEL MEDIO
3.- MÉTODO DE EXTRACCIÓN CTAB
Fundamento del método:Las células vegetales pueden lisarse con el detergente iónico bromuro de cetiltrimetil amonio (CTAB), que forma un complejo insoluble con los ácidos nucleicos en medio hiposalino. De ese modo, los polisacáridos, los compuestos fenólicos y los demás contaminantes permanecen en el sobrenadante y pueden eliminarse por lavado.
- Elaborado por Murray y Thompson en 1980.
- Adecuado para extraer y purificar ADN de vegetales y especialmente indicado para eliminar los polisacáridos y los compuestos polifenólicos que dañarían al ADN.
PASOS:
1.- Se debe moler la muestra después de congelación con Nitrógeno líquido
2.- Suspender la muestra en solución tampón de extracción, que contiene EDTA, Tris-HCl y CTAB.
4.- Incrementando la concentración salina
3.-Centrifugo, elimino el sobrenadante y lavo.
5.-Añado etanol y ARNasa
ADN puro
EL CTAB CAPTURA LOS LÍPIDOS QUE INTEGRAN LA MEMBRANA CELULAR Y NUCLEAR
EL CTAB EN MEDIO HIPOSALINO FORMA UN COMPLEJO INSOLUBLE CON LOS ÁCIDOS NUCLEICOS.
DIAGRAMA DEL MÉTODO DE EXTRACCIÓN CTAB
4.- CENTRIFUGACIÓN EN GRADIENTE DE BrEt - CsCl
- Técnica usada para la Mini preparación de ADN plasmídico .
- Requiere de cultivo bacterial a gran escala.
- Separa ADN plasmídico superenrrollado del ADN plasmídico circular que está en estado relajado, concentrándolos por centrifugación en una gradiente de Bromuro de Etidio –Cloruro de Cesio (BrEt – CsCl.)
Superenrrolado: Covalentemente cerrado y muy empacado.
DNA circular. DNA que no se ha empacado.
• Fundamento del método: El BrEt ingresa y se
intercala en la cadena de ADN disminuyendo su densidad, pero lo hace en mayor cantidad en el ADN plasmídico en estado relajado que en el ADN plasmídico superenrrollado.
pudiéndose separar por centrifugación en el gradiente de densidad de CsCl.
CENTRIFUGACIÓN EN GRADIENTE DE BrEt - CsCl
GRADIENTES DE CLORURO DE CESIO+ BROMURO DE ETIDIO
EL ADN SE SEDIMENTA FORMANDO UNA CAPA EN LA POSICIÓN DEL TUBO EN LA CUAL LA DENSIDAD DE LA SOLUCIÓN DE CsCl ES IGUAL A LA DEL ADN.
CENTRIFUGACIÓN EN GRADIENTE DE BrEt - CsCl
CENTRIFUGACIÓN EN GRADIENTE DE BrEt - CsCl
GRADIENTE DE DENSIDAD DE CsCl sin BrEt
GRADIENTE DE DENSIDAD DE CsCl y BrEt
GRADIENTE DE CENTRIFUGACIÓN CON BrEt - CsCl
4. PURIFICACIÓN DEL ARN POLI(A) POR CROMATOGRAFIA DE CELULOSA DE OLIGO (DT)
En células eucarióticas, el mARN difiere de otras especies de ARN, en que contiene en su extremo 3', una extensión relativamente grande de 200 a 300 residuos de adenina, en una secuencia conocida como poli A+.Cromatografía de afinidad
Permite separar el conjunto de los mRNA celulares de otros ácidos nucleicos, puesto que los mRNAs quedarán retenidos en la columna, merced a la hibridación que va a producirse entre sus colas de poli A (en el extremo 3) y los oligómeros de poli-T que contiene la resina cromatográfica.
Mediante purificación de poli(A)-ARN: hay ARNm con una cola de poliadeninas, mas de 100, llamada poli(A), estos ARN se pueden aislar por cromatografía en columna de celulosa de oligo dT celulosa. La cola poli(A) hibridará con la cadena oligo dT, fijándose en la columna. Después de lavar los ARN no fijados el ARNpoli(A) se eluye y se precipita con alcohol etílico frío.
Existen 2 métodos utilizados para la purificación de ARN poli(A)
Cromatografía de lote
Cromatografía en columnas de
oligo (dT)
La cromatografía en columnas es usada normalmente para la purificación de grandes cantidades de ARN Poli (A) no radiactivo aislado de células mamíferas.
trabaja con ARN mamífero en pocas cantidades de muestras que pueden ser radiactivos o no
EXTRACCIÓN DE ÁCIDO NUCLEICO EN FASE SÓLIDA
Logra una purificación rápida y eficiente comparada con los métodos convencionales.
Los sistemas de Fase Sólida absorberán los ácidos nucleicos en el proceso de extracción dependiendo del pH y contenido de sales del buffer.
El proceso de absorción está basado en los
siguientes principios
y mecanismos de exclusión por
afinidad y tamaño.
La interacción de los puentes de hidrógeno con una matriz hidrofílica bajo condiciones caotrópicas
Intercambio iónico bajo condiciones acuosas por medio de un intercambio aniónico
La purificación en Fase Sólida es normalmente efectuada por el uso de una columna giratoria operada bajo fuerzas centrífugas.
Matrices de sílica
Partículas de vidrio
Tierra de diatomeas
Transportadores de intercambio aniónico
TIPOS soporte sólido (fase estacionaria).
PASOS DE FASE SÓLIDA
lisis celular, adsorción de ácidos nucleicos, lavado y
elución.
Tiras de 8 columnas
Placa de 96 columnas
Pasos en el proceso de extracción en fase
sólida
• Acondicionar la columna para la adsorción de la muestra
Puede ser hecho utilizando un buffer a un pH particular para convertir la superficie o grupos funcionales sobre el sólido dentro de una forma química particular• Luego la muestra la cual ha sido
degradada por el uso de buffer de lisis es aplicada sobre la columna
• El ácido nucleico deseado absorberá a la columna con la ayuda de pH elevado y concentración de sales de la solución enlazante
PASOS PARA LA EXTRACCIÓN EN FASE SÓLIDA
1. se acondiciona la columna para la absorción de la muestra. Esto puede ser hecho usando un tampón a un pH definido 2. Luego, convierte la superficie o grupos funcionales en el solido es decir en una forma particular de química3. El ácido nucleico deseado se absorberá a la columna con la ayuda de un alto pH y concentración de sal de la solución enlazadora.
4. La muestra que fue degradada mediante el uso de solución amortiguadora se aplica a la columna
5. Luego los ácidos nucleicos se eluyen con un tampón de máxima salinidad
6. se precipita con isopropanol para lavar y eliminar todos los restos de impurezas
7. finalmente, se reconstituye el ADN de elevada pureza en un tampón de baja salinidad para su posterior utilización o almacenamiento
La matriz de silica hidratada
la cual fue preparada por
reflujo de óxido de silicio en
hidróxido de sodio o
hidróxido de potasio en una
proporción molar de
aproximadamente 2: 1
respectivamente a 10: 1 por
al menos cerca de 48 horas
habían sido introducidas en
la purificación del ADN. El
ADN se enlaza a la matriz
inorgánica y es liberada en
agua caliente.
PURIFICACIÓN EN LAS MATRICES DE SÍLICA
El principio de está
basada en la elevada
afinidad de las cadenas
de ADN cargadas
negativamente con
respecto a las
partículas de sílica
cargadas
positivamente.
PURIFICACIÓN EN LAS MATRICES DE SÍLICA
El sodio juega un rol como un catión enlazante o puente que atrae el oxígeno cargado negativamente en los fosfatos de las cadenas de ácidos nucleicos.
DNA eluye de la sílica en
agua
DNA se une a la sílica
en NaI
PARTÍCULAS DE VIDRIO
Gel de agarosa involucrado en el uso de sales caotrópicas facilitan el enlazamiento de ADN a vidrio común de sílice.
La absorción de ácido nucleico es el sustrato de vidrio ocurre debido al mecanismo y principio similar al de la absorción de cromatografía de adsorción.
Esta invención ha descubierto que una mezcla de gel sílice y partículas de vidrio puede ser usada para separar ácido nucleico de otras sustancias en la presencia de soluciones de sales caotrópicas.
TIERRA DE DIATOMEAS(DIATOMITA)
Es una roca sedimentaria silícea formada por micro-fósiles de diatomeas, algas marinas unicelulares que secretan un esqueleto silíceo llamado frústula.
• Baja densidad.• Alta porosidad.• Dureza .• Capacidad abrasiva
suave.• Conductividad
térmica muy baja.• Alta resistencia a
la temperatura.• Capacidad muy alta
para absorber líquidos.
PROPIEDADES
PRINCIPALES USOS
Porosidad y Poder Absorbente
Purificación de ADN
Filtro-ayuda
DIATOMITA
La diatomita puede ser utilizado para la retirada del DNA en presencia del agente caotrópico altamente concentrado tal como el ioduro de sodio, guanidinium hydrochloride y guanidinium thiocyanate.
DIATOMITA
Quitan el DNA trenzada doble pero no el ARN o
las proteínas.
La diatomita resultante enlazada con el ADN es luego lavado con un tampón que contiene alcohol.
Este es luego dejado de lado y el ADN es eluído en un tampón bajo en sal o en agua destilada.
La diatomita tiene contenido de sílice hasta en un 94%. Ha sido usado para filtración y en
cromatografías.
PURIFICACIÓN DE ÁCIDO NUCLEICO BASADO EN
PARTÍCULAS MAGNÉTICAS
La separación magnética es una manera simple y eficiente el cual es utilizado actualmente en la purificación de ácido nucleicos.
Se utilizan transportado
res magnéticos.
PreparadosA partir de biopolímero
s.
Polímeros sintético
Vidrio poroso
Basado en materiales magnéticos inorgánicos
Materiales con una
gran área superficial ,
son preferidos para ser
usados en la
adherencia de ácidos nucleicos.
ÓXIDO DE HIERRO
Óxido de hierro (II, III) u óxido ferroso
férrico (Fe3O4).
Magnetita
Los momentos magnéticos de los distintos cationes
de hierro del sistema se encuentran fuertemente acoplados.
Esta moléculas van actuar como un
imán.
Purificación de ácido nucleico basado en partículas magnéticas
Purificación de ácidos
nucleicos en base
a:microesferas
magnéticas .
Uso de perlas magnéticas implica
cuya superficie tiene una carga que se puede cambiar
basándose en el pH o tampón. A pH bajo,
están cargados positivamente, atrayendo a las
moléculas de ADN con carga negativa y permitiendo que las
proteínas y los contaminantes que se
elimina mediante lavado.
El ácido nucleico es luego eluído
de las partículas
magnéticas con un
tampón de elución.
MATERIAL DE INTERCAMBIO ANIONÍCO
El ejemplo mas popular que se utiliza en el principio del intercambio iónico es « Resina de intercambio iónico».
Se basa
En la interacción entre grupos cargados positivamente de la celulosa de dietilaminoetilo ( superficie de la resina) y fosfatos cargados negativamente del ADN .
Una resina de intercambio iónico puede considerarse como una estructura de cadenas hidrocarbonadas.
Estas cadenas se encuentran unidas transversalmente formando una matriz tridimensional que proporciona rigidez a la resina y entrecruzamiento que determina la estructura porosa interna de la misma.
TIPOS DE EXTRACCIO
N DE PROTEINAS
Cromatografía de
intercambio iónico
Cromatografía de
filtración en gel
Cromatografía de
afinidad
Electroforesis en gel
1) Solubilizar a la proteína y
separarla
Proteínas extracelulares Seroalbúmina
Proteínas citoplasmáticas
Liberarse de la célula.(lisis
celular)
Lisis celularTécnica Principio Ejemplos
Digestión enzimática Daños en paredes celulares
Lisozimas/ bacterias
Método químico Detergentes o agentescaotrópicos
SDS, CTAB, tiocianatode guanidina
Método físico Choque osmótico solución tampón
Comparación de las envolturas celulares bacterianas. Arriba: Bacteria Gram-positiva. 1-membrana citoplasmática, 2-peptidoglicano, 3-fosfolípidos, 4-proteínas, 5-ácido liproteico.Abajo: Bacteria Gram-negativa. 1-membrana citoplasmática (membrana interna), 2-espacio periplasmático, 3-membrana externa, 4-fosfolípidos, 5-peptidoglicano, 6-lipoproteína, 7-proteínas, 8-lipopolisacáridos, 9-porinas
2°) Eliminar restos
celulares
Mediante centrifugación
CROMATOGRAFIA
2 fases
Móvil (Liquido o
gas)
Estacionaria(Papel o gel
Aspectos históricos de la cromatografía
La técnica de cromatografía aparece en 1850. -El químico F.F.Runge, que trabajaba con tintas, descubre que los cationes orgánicos se podían separar por migración cuando se colocaba una solución que los contenía sobre un material poroso, como papel.
En 1906 el botánico ruso Tswett utilizó la cromatografía de columna para separar extractos vegetales coloreados.
Por primera vez se utiliza el nombre de cromatografía.
En 1930 Lederer consigue separar los colorantes de la yema de huevo
Los químicos Khun, Kamer y Ruzucca desarrollan la cromatografía en el campo de la química orgánica e inorgánica.
Obtienen el premio Nóbel por sus trabajos en 1937, 1938, 1939 respectivamente.
Aspectos históricos de la cromatografía
A partir de 1940 los métodos cromatográficos adquieren extensión mundial.
En 1940 Tiselius divide los métodos cromatográficos en cromatografía por análisis frontal, desarrollo por elusión y desarrollo por desplazamiento, obtuvo el premio Nóbel por sus trabajos en 1948.
Para el mismo tiempo la cromatografía comienza a aplicarse en el campo de la bioquímica.
Martin consigue separar algunos aminoácidos acetilados
Cromatografía de
Filtración en Gel
Fase fija
Formada por polímeros biológicos
o sintéticos
Polímeros forma de pequeñas bolitas.Diámetro 10-250 µm.
Estos se hinchan con una disolución de tampón acuosa y se introducen en una
columna
Fase móvil
Tampón en el cual, la mezcla de proteínas se
encuentra disuelta
AgarosaDextrano
poliacrilamida
Cromatografía de Filtración en Gel o Cromatografía de exclusión
Cromatografía de intercambio iónico
• Sustancias ionizables:• DEAE
=DIETILAMINOETIL• CM = CARBOXIMETIL• Tienen carga (+)
fase estacion
aria
• Proteínas con carga (-) se unen al CM y quedan retenidas.
• Las proteínas neutras y las que tienen carga (+) eluyen libremente.
• Usar tampón con elevada concentración de NaCl
Fase móvil
Cromatografía de intercambio iónico
FASE ESTACIONARIA
Las proteínas cargadas negativamente se unen a la fase estacionaria
Las proteínas cargadas positivamente eluyen
Fase estacionaria
CROMATOGRAFIA POR AFINIDAD
Ofrece la mayor especificidad y selectividad para el aislamiento y
purificación de biomoléculas
En esta técnica la molécula que se une específicamente a la proteína se conoce con el nombre de ligando mientras que otras pasan por la columna
Las proteínas deseada se eluye de la columna mediante una solución que contiene una alta concentración de la forma soluble del Ligando.
La unión entre el ligando y moléculas diana de las proteínas debe ser reversible para permitir que las proteínas deban eliminarse en una forma activa
Después de eliminar los contaminantes, el ligando acoplado debe conservar su afinidad de unión específica para las proteínas diana
TIPOS DE LIGANDO
MOLÉCULAS DIANA
Enzima Análogo de sustrato, inhibidor, cofactor
Anticuerpo Antígeno, virus
Lectina Polisacárido, glicoproteína, receptor de superficie celular,célula
ácido nucleico
Secuencia de bases complementaria, histonas, nucleico polimerasa de ácido, la proteína de unión de ácido nucleico
hormonas y vitamina
Receptor, proteína portadora
El glutatión Glutatión-S-transferasa o proteínas de fusión GST
Los iones metálicos
Poli (su) proteínas de fusión, proteínas nativas con histidina, cisteína y residuos / triptófano en sus superficies
Existen numerosas variaciones de esta técnica en función del equipo utilizado, soporte y condiciones físico-químicas en las cuales se va a llevar a cabo la separación:
Electroforesis capilar
Electroforesis en gel de poliacrilamida
Isoelectroenfoque
Electroforesis en gel de agarosa.
Electroforesis en papel.
Electroforesis bidimensional
Los soportes de elección para la electroforesis de proteínas son los geles de poliacrilamida (PAGE, polyacrilamide gel electrophoresis) debido a su buena resolución y gran versatilidad.
ELECTROFORESIS EN GELEs uno de los métodos más utilizados para la purificación, análisis y caracterización de proteínas según su relación tamaño a carga eléctrica en el que se utiliza una corriente eléctrica controlada.
usándose como base una matriz gelatinosa, ya sea de agarosa o poliacrilamida
Es químicamente inerte, de propiedades uniformes, capaz de ser preparado de forma rápida .
Es un gel transparentes con estabilidad , insolubles en agua, y que permiten buena visualización de las bandas durante tiempo prolongado
Tiene un amplio rango de pHs, temperatura y fuerza iónica.
POLIACRILAMIDA
se mezcla acrilamida en diferentes proporciones , con el agente entrecruzante N,N’ metilen bis acrilamida
Además tiene la ventaja de que variando la concentración de polímeros, se puede modificar de manera controlada el tamaño del poro
COMO OBTENGO LA POLIACRILAMIDA
La electroforesis de proteínas en geles de poliacrilamida puede llevarse a cabo en condiciones nativas (ND-PAGE) o desnaturalizantes (SDS-PAGE).
Las diferencias entre uno y otro son :
ND-PAGE las proteínas mantienen su estructura tridimensional y las diferentes cadenas polipeptídicas pueden permanecer unidas, separándose no sólo en función de su carga eléctrica, sino también según su tamaño y forma
SDS-PAGE cuando las proteínas se solubilizan en presencia del detergente aniónico SDS , éste se une a las proteínas, rompiendo interacciones hidrofóbicas y desnaturalizándolas. Las proteínas desnaturalizadas de la muestra adoptarán una estructura en forma de bastoncillo con una serie de moléculas de SDS cargadas negativamente a lo largo de la cadena polipeptídica. Las proteinas se separan en base a su masa molecular
Se siembra la muestra (ADN, ARN o proteínas) en un gel que es sometido a una corriente eléctrica. Las moléculas se mueven a través del gel impulsadas por dicha corriente. Esta técnica permite separar moléculas de acuerdo a su tamaño y carga ya que las más pequeñas (o aquellas con mayor carga) se mueven con mayor velocidad. El gráfico muestra bandas de distinto ancho, correspondientes a distinta cantidad y tamaño de la muestra de proteínas.
Marcadores de peso molecular:
Mezcla de diferentes proteínas preteñidasde las que conocemos el peso molecular.
Por comparación podemos averiguar el PM aparente de nuestra proteína
SOUTHWESTERN BLOT O IMMUNOBLOTTING
Es un método utilizado en BIOLOGÍA MOLECULAR;
El método lleva el nombre de su inventor, el británico biólogo Edward Southern .
Fue descrito por primera vez en 1981.
Muchas de las proteínas enlazadas por ADN en la célula deben ser Aisladas
individualmente y caracterizadas para definir la función del gen.
Northern blot
Es una técnica de
detección de
moléculas de ácido
ribonucleico (ARN)
de una secuencia
dada dentro de una
mezcla compleja.
Western blot o inmunoblotmétodo que se utiliza para aislar, identificar y caracterizar proteínas de unión a ADN
Southern blot
Es un proceso que se
utiliza para el análisis
del ADN.
2. Las proteinas separadas son transferidas en un filtro de membrana de nitrocelulosa difluoruro de polivinilideno
SOUTHWESTERN BLOT O IMMUNOBLOTING
1. Se separan las proteinas mediante electroforesisen gel de poliacrilamida sodio dodecilsulfato
3. Las proteinas unidas a la menbrana se incuban luego con sondas de oligonucleotidos de secuencia especifica de ADN para las proteínas absorbidas y analizarlas
ELECTROFORESISSe separan las proteínas o los ácidos nucleicos en un gel de electroforesis
TRANSFERENCIA (BLOTTING)Se transfieren las bandas de proteínas o de ácidos nucleicos desde el gel hacia una membrana de nitrocelulosa (flechas azules) para que puedan reaccionar con la sonda radioactiva.Se añaden Anticuerpos radiactivos contra una proteína o sondas radioactivas de ácidos nucleicos (con secuencia conocida). Se espera a que reaccionen (A). Se coloca la membrana de nitrocelulosa sobre una placa fotográfica y se revela (B).
Extracción de biomoleculas
All-In-OnePara la extraccion de acidos nucleicos
se siguieron los pasos de Chomczynski
y Sacchi (1987).
Este método involucra la lisis celular
con isotiocianato de guanidinio y fenol
en una solución de una fase.
El homogeneización de la
muestra: Permite la
disgregación de la
estructura celular para
facilitar la salida de los
ácidos nucleicos. Esto con
la utilización de SDS.
Este método implica la lisis
de la célula en presencia de
agentes desnaturantes
fuertes de proteínas
(isotiocianato de guanidinio y
fenol) en una solución
monofásica.
FASE ACUOSA: ARN
FASE ORGANICA: ADN Y PROTEINAS
Extracción Fenol-Cloroformo: ADN y/o ARN
MUESTRA + Fenol equilibrado:Cloroformo (1:1)desproteiniza e inhibe nucleasas
El ADN y las proteinas pueden ser aislada de la fase orgánica por precipitación con etanol o isopropanol .ARN precipito a partir de la fase acuosa con isopropanol.
PH: reducido
Sistema de extracción automaticaEs un Sistema de instrumentación muy grande,
complejo y costoso, diseñado para un alto
volumen de procesamiento de muestras.
El hecho de automatizar el proceso de
extracción de ácidos nucleicos es beneficioso
para una serie de razones:
Reduce el tiempo de trabajo.
Disminuye los costos laborales.
Aumenta la seguridad de los trabajadores
Aumenta la reproducibilidad calidad de los
resultados.
Sobre todo minimiza el riesgo de
contaminación cruzada.
MagNA Pure LC 2.0
sistema de manipulación de partícula paramagnética para procesar la muestra y proporcionar un rendimiento constante y pureza ya que no hay detectable contaminación cruzada , entre las muestras
El proceso de extracción completo dura unos 20 minutos desde el comienzo hasta el final
SE DAN POR TRES PASOS SENCILLOS
Añadir la muestra líquida al cartucho del reactivo.
Oprimir el botón de Inicio. El ADN es eluído en un tampón de elución al final del proceso
Colocar el cartucho del reactivo dentro de la máquina.
1
3
2
Magna pure Pequeño tamaño basado en el uso de partículas magnéticas.El ácido nucleico obtenido es altamente puroAusencia de contaminación cruzada mediante filtros Hepa.Descontaminación por rayos uv Demora Máximo de 30 minutosEs posible trabajar con un amplio rango de muestras (sangre total, suero, plasma, tejidos, células en cultivo, etc.),
Roche Applied Science trabaja en el desarrollo de sistemas de alta tecnología para aplicación en Genómica y Proteómica
MagNA Pure LC 2.0
Permite hasta 32 aislamientos de ácidos nucleicos (DNA, RNA, , mrna y ácidos nucleicos totales)Muestras (tejidos, sangre, suero, células periféricas mononucleadas, células blancas, tejidos vegetalesRealiza labores de pre-pcr en distintos formatos
Unidad inicio
Unidad de elución y post-elución
Unidad procesamiento
1
3
2
Posibles Orientaciones Futuras
La automatización ha ayudado en el aumento
del rendimiento y mejora la fiabilidad del
proceso
Por lo tanto las estaciones de trabajo robótico para extracción
de ácidos nucleicos deben cumplir con una verdadera ¨Walk-away¨ , automatización, lo que significa
un proceso totalmente automatizado
un sistema portátil de extracción , ofrece varias ventajas , tales como la mano de obra reducida,
reducción de los residuos y aumento de la velocidad
conclusiones
• Las técnicas generales de purificación y extracción de
ácidos nucleicos; tanto los métodos convencionales como
los métodos modernizados gracias al desarrollo de la
tecnología; como es el sistema automatizado; permiten a
los investigadores y científicos a adquirir mejores
resultados y es esencial en una gran cantidad de
aplicaciones bioquímicas como son: relaciones de
parentesco, para detectar enfermedades hereditarias, para
conocer los genes de una persona, clonación, etc.Automatización de ácido nucleico , este proceso de extracción es potencialmente beneficioso para un número de razones entre ellas , para reducir el tiempo detrabajo , reducir la manos de obra , costos , aumento de seguridad de los trabajadores y al mismo tiempo proporciona oportunidad en la reproducibilidad y la calidad de aumentar los resultados