UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO
FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE CIENCIAS
BIOLÓGICAS
Optimización en la Producción de Etanol por Saccharomyces cerevisiae var. ellipsoideus
MIT L-51 a partir de mosto de Annona squamosa “anuna” y mosto de melaza
AUTOR: Br. RUBEN MARTINEZ HARO PIZANGO
ASESOR: Dr. HEBER ROBLES CASTILLO
TRUJILLO – PERÚ
2015
TESIS
PARA OPTAR EL TÍTULO DE:
BIÓLOGO
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AUTORIDADES DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE
TRUJILLO
Dr. Orlando Gónzales Nieves
RECTOR DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO
Dr. Rubén Vera Veliz
VICERECTOR ACADÉMICO
Dr. Weyder Portocarrero Cárdenas
VICERRECTOR DE INVESTIGACIÓN
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AUTORIDADES DE LA FACULTAD DE CIENCIAS
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Dr. José Mostacero León
DECANO DE LA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
Dr. William Zelada Estraver
SECRETARIO DE LA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
Dr. Freddy Peláez Peláez
DIRECTOR DE LA ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE CIENCIAS
BIOLÓGICAS
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PRESENTACIÓN
Señores Miembros del Jurado:
En cumplimiento con las disposiciones establecidas en el Reglamento de
Grados y Títulos de la Escuela Académico Profesional de Ciencias
Biológicas de la Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad
Nacional de Trujillo, pongo a vuestra consideración y criterio el presente
trabajo de tesis titulado:
“Optimización en la Producción de Etanol por Saccharomyces
cerevisiae var. ellipsoideus MIT L-51 a partir de mosto de Annona
squamosa “anuna” y mosto de melaza”, con el cual pretendo obtener
el Título Profesional de Biólogo.
Trujillo, octubre de 2015
Br. Ruben Martinez Haro Pizango
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MIEMBROS DEL JURADO
Los suscritos, miembros del jurado, declaran que la presente tesis ha sido
ejecutada en concordancia con las normas de la Escuela Académico
Profesional de Ciencias Biológicas de la Universidad Nacional de Trujillo.
Dr. Segundo Eloy López Medina PRESIDENTE
Dra. Gina Zavaleta Espejo SECRETARIA
Dr. Heber Robles Castillo VOCAL
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APROBACIÓN
Los profesores que suscriben, miembros del jurado examinador, declaran que
el presente Informe de Tesis titulado: “Optimización en la Producción de
Etanol por Saccharomyces cerevisiae var. ellipsoideus MIT L-51 a partir
de mosto de Annona squamosa “anuna” y mosto de melaza”, ha cumplido
con los requisitos formales y fundamentales, siendo APROBADO por
UNANIMIDAD.
Dr. Segundo Eloy López Medina PRESIDENTE
Dra. Gina Zavaleta Espejo SECRETARIA
Dr. Heber Robles Castillo VOCAL
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DEL ASESOR
El que suscribe, profesor asesor de la tesis titulada: “Optimización en
la Producción de Etanol por Saccharomyces cerevisiae var. Ellipsoideus
MIT L-51 a partir de mosto de Annona squamosa “anuna” y mosto de
melaza”
CERTIFICA:
Que ha sido desarrollada, de acuerdo al reglamento establecido por la
Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad Nacional de Trujillo, estando
en conformidad con su correspondiente proyecto, y que el informe ha sido
redactado acogiendo las observaciones y sugerencias alcanzadas.
Por lo tanto, autorizo al Sr. Ruben Martinez Haro Pizango, continuar con el
trámite del reglamento correspondiente.
Trujillo, octubre de 2015
Dr. Heber Robles Castillo ASESOR
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DEDICATORIA
A Dios, que es la palanca de empuje
en esos tiempos grises.
A mi Madre, Padre y Hermanos por su apoyo
desinteresado y por el aliento del día a día.
A Katherine C. P., por ser mí complemento
en esta y en las futuras etapas de mi vida.
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AGRADECIMIENTO
Agradezco sinceramente al Dr. Heber Robles Castillo, destacado y admirable
catedrático del Departamento de Microbiología y Parasitología de la Facultad
de Ciencias Biológicas, por el apoyo brindado y el tiempo invertido en la
asesoría de la presente tesis.
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ÍNDICE
AUTORIDADES DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO ii
AUTORIDADES DE LA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS iii
PRESENTACIÓN iv
MIEMBROS DEL JURADO v
APROBACIÓN vi
DEL ASESOR vii
DEDICATORIA viii
AGRADECIMIENTO ix
RESUMEN xiv
I. INTRODUCCIÓN 1
II. MATERIALES Y MÉTODOS 9 2.1 MATERIAL 9 2.1.1 material biológico 9 2.1.2 medios de cultivo 9
2.2 MÉTODOS 9 2.2.1 FASE PRE-FERMENTATIVA 9 2.2.1.1 Reactivación del cultivo y
verificación de la pureza 9 2.2.1.2 Propagación y estandarización del inóculo
de Saccharomyces cerevisiae MIT L-51 10 2.2.1.3 Preparación del mosto 11 2.2.1.4 Diseño, construcción, lavado y esterilización del
Biorreactor para la fermentación por Saccharomyces
cerevisiae MIT L-51 12 2.2.1.5 Corrección y suplementación de los mostos 12 2.2.1.6 Higienización del mosto 13 2.2.2 FASE FERMENTATIVA 13 2.2.2.1 Acondicionamiento de los Biorreactores
e inoculación 13 2.2.2.2 Inóculo 13 2.2.2.3 Monitoreo del Bioproceso 14
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2.2.3 FASE POSTFERMENTATIVA 14 2.2.3.1 Determinación de la productividad del etanol 14 2.2.3.2 Determinación de la producción de etanol 15 2.2.3.3 Análisis estadístico 15
III. RESULTADOS 16
IV. DISCUSIÓN 20 V. CONCLUSIONES 24 VI. RECOMENDACIONES 25 VII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 26 VIII. ANEXOS 30
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ANEXOS
8.1 Annona squamosa “anuna” fruto utilizado para la fermentación de Saccharomyces cerevisiae MIT L-51
8.2 Composición de Agar Papa Sacarosado (APS) utilizado para reactivar el cultivo de Saccharomyces cerevisiae var. ellipsoideus MIT L-51 para el proceso fermentativo con Annona squamosa “anuna”
8.3 Composición (g/L) de Oxitetraciclina Gentamicina Agar (OGA) utilizado
para la propagación y estandarización del cultivo de Saccharomyces cerevisiae var. ellipsoideus MIT L-51 para el proceso fermentativo con Annona squamosa “anuna”.
8.4 Valor nutricional en 100 gramos de pulpa (según morton, 1987)
8.5 Reactivación de cultivo, observación macroscópica de Saccharomyces
cerevisiae var. ellipsoideus MIT L-51 en medio Agar Papa Sacarosado (APS) inclinado, utilizando la técnica de siembra en estría después de ser incubado a temperatura ambiente (23 ±4oC) durante 72 horas.
8.6 Verificación de la pureza, Saccharomyces cerevisiae var. ellipsoideus
MIT L-51, observación microscópica al fresco 100x.
8.7 Propagación del cultivo. Observación macroscópica de Saccharomyces cerevisiae var. ellipsoideus MIT L-51 en medio Oxitetraciclina Gentamicina Agar (OGA), utilizando la técnica de siembra en estría después de ser incubado a temperatura ambiente (23 ±4oC) durante 72 horas.
8.8 Técnica de cuenta directa en cámara de Neubauer
8.9 Biorreactores conteniendo los mostos y los sedimentos de Annona
squamosa “anuna” y melaza utilizado como testigo, después de finalizada la fermentación utilizando Saccharomyces cerevisiae var. ellipsoideus MIT L-51
8.10 Equipo de destilación para determinar el grado alcohólico
producido por Saccharomyces cerevisiae MIT L-51 en mosto de Annona squamosa “anuna”.
8.11 Calculo del volumen de CO2 (técnica de las densidades).
8.12 Calculo de la productividad mediante el método de Davies-
Griffieth (1982) modificado.
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8.13 Productividad de etanol de Saccharomyces cerevisiae var. ellipsoideus MIT L-51 en mosto de Annona squamosa “anuna” al 10%, 20%, 30% (p/v) y mosto de melaza al 20 % (p/v) utilizado como testigo, durante 168 horas de fermentación a temperatura ambiente (23 ±4oC).
8.14 Planteamiento de problema e hipótesis en la investigación de
fermentación con mosto de Annona squamosa “anuna”.
8.15 Análisis estadístico “t” de student de la optimización en la producción de etanol por Saccharomyces cerevisiae var. ellipsoideus MIT L-51 a partir de mosto de Annona squamosa “anuna” y mosto de melaza.
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RESUMEN
Se optimizó la producción de etanol utilizando un cultivo de Saccharomyces
cerevisiae var. ellipsoideus MIT L-51 en mosto de Annona squamosa “anuna”
cultivados en la región de Loreto-Perú. Para ello los frutos se lavaron,
desinfectaron y se procesaron para obtener el mosto, el cual se pasteurizó y
suplementó. Se utilizaron Biorreactores tipo tanque de 2 litros. Los
Biorreactores fueron cargados con mosto de Annona squamosa “anuna” a
diferentes concentraciones (10%, 20% y 30% (p/v)) y con mosto de melaza de
caña como control, todos en un volumen de 940 ml de mosto con 60 ml de
inóculo propagada y estandarizada. El proceso fermentativo se llevó a cabo
durante 168 horas monitoreando cada 24 horas, en el monitoreo se hizo el
recuento total de levaduras y densidad. Al finalizar el mosto fue destilado para
obtener el etanol, luego se calculo el grado alcohólico utilizando la técnica del
densímetro y corroborando con un alcoholímetro tipo DENSIMETRE METER
DMA 35 “Anton Paar”. Se concluye que: La máxima productividad de etanol se
dio a las 72 horas de iniciada el proceso fermentativo, siendo mayor en mosto
de Annona squamosa “anuna” al 30% (p/v) y durante 168 horas de
fermentación la levadura produce 0.05 (v/v) etanol, 0.18 (v/v) etanol y
0.271(v/v) etanol, en mosto de Annona squamosa “anuna” al 10%, 20%, 30%
(p/v) respectivamente.
Palabras clave: Etanol, Annona squamosa, Saccharomyces cerevisiae.
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I. INTRODUCCIÓN
La importancia de la producción de etanol ha surgido por la aparición de
nuevas necesidades del consumidor y por cambios económicos, esto hace que
hoy en día el etanol sea un combustible automotor, con gran potencial de
crecimiento en diversos países de América Latina. Este se puede obtener a
partir de la caña de azúcar, maíz, remolacha y de otros vegetales, pero la
tecnología más desarrollada para extraer este combustible está en base a la
caña de azúcar. En la mayoría de países latinoamericanos se produce etanol a
partir de azúcares y melazas (subproductos de la caña de azúcar), lo cual en
comparación con EE.UU. y en algunos países de Europa producen etanol a
partir de cereales como maíz (Ministerio de Agricultura Y Dirección General de
Competitividad Agraria, 2013).
En el Perú se ha fomentado la investigación de diversos sustratos para la
producción de etanol como es el caso de Ávila en el año 2012 en el cual
estudia la productividad de etanol en mostos de Passiflora edulis “maracuyá”,
Ananas comosus “piña” y Vitis vinífera var gross colman “uva” determinando
una productividad mayor en mosto de piña y menor en mosto de maracuyá; en
el cual afirma que el pico máximo de producción de etanol se da a las 24 horas
de fermentación, siendo mayor en el mosto de piña, y menor en el mosto de
uva y maracuyá; a lo que también afirma que durante las 96 horas de
fermentación, produce 6.24 x 10-2 g et/g lev/h en mosto de Vitis vinífera var.
gross colman “uva”, 5.04 x 10-2 g et/g lev/h en mosto de Passiflora edulis y 4.64
x 10-2 g et/g lev/h en mosto de Ananas comosus (Pedro, 2012).
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En el mismo año Mendocilla trabajó con los mismos mostos determinando la
velocidad de crecimiento de la levadura Saccharomyces cerevisiae obteniendo
de su estudio que en condiciones de fermentación alcohólica, crece a una
velocidad especifica de 0.0952 h-1 en mosto de Ananas comosus, 0.0825 h-1 en
mosto de Vitis vinífera var. gross colman y 0.0761 h-1 en mosto de Pasiflora
edulis (Mendocilla, 2012), coincidiendo con Ávila en que los mostos de piña y
uva contienen cantidades mayores de tiamina en relación al mosto de
maracuyá que se considera pobre en esta vitamina (Quispe, 2009); en
consecuencia las levaduras de Saccharomyces cerevisiae amplían y aceleran
su crecimiento.
Castro en el año 2009 investiga el efecto del pH y la temperatura sobre la
producción de etanol y dióxido de carbono utilizando como mosto malta de
Hordeum vulgare var. UNA La molina – 96 “cebada”, concluyendo que la
producción varía y no se ve afectada por efecto de las temperaturas de 5; 15 y
25oC y los valores de pH 4; 5 y 6, donde a 25oC la producción es mayor
(Castro, 2009). La cebada es un cereal con alto contenido en almidón, que es
la sustancia que da origen al extracto fermentescible; esto contiene la suficiente
cantidad de proteína para proporcionar aminoácidos necesarios para el
crecimiento de la levadura (Leal, 1990). Según Wiseman la velocidad de
fermentación se incrementa a temperaturas entre 15 y 22oC, siendo mayor
cuando mayor es la temperatura, debido que a temperaturas altas hace que se
incremente la actividad de la enzima, pero en detrimento de su estabilidad,
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hace que esto disminuya, teniendo en cuenta el periodo de tiempo en el que se
usa (Wiseman, 1991).
El mosto Annona squamosa no cuenta con trabajos anteriores realizados con el
tema fermentación debido a eso, es complicado determinar las propiedades
físico-quimicas de esta fruta, al igual del contenido de azucares naturales
fermentables, pero se puede asegurar la presencia de fuentes de nitrógeno,
esteroles, vitaminas, fosfolípidos, minerales, ácidos grasos insaturados
(Guerrero y Fischer, 2007), los cuales garantizan la producción del etanol.
El uso de la melaza como sustrato para la producción de etanol con
Saccharomyces cerevisiae presenta ventajas nutricionales frente a otros
medios de cultivos, pero una desventaja que recae es en el alto precio de esta
materia prima, que obliga a buscar nuevas alternativas para la obtención de
diferentes productos biotecnológicos por vías de fermentación (Apuntes
agroeconómicos, 2007).
En la fermentación ocurre un conjunto de cadenas de reacciones, que
comprende la oxidación de un compuesto a esto se le llama “vía bioquímica”.
Las vías para la oxidación de los compuestos orgánicos y la conservación de la
energía en el ATP se puede dividir en dos procesos principales: 1)
Fermentación, en el cual el proceso de oxido-reducción se efectúa en ausencia
de cualquier aceptor terminal de electrones y 2) Respiración, en el cual el
oxigeno molecular o cualquier otro oxidante actúa como el aceptor oxidante de
electrones. “En ausencia de aceptor de electrones, muchos organismos
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efectúan reacciones redox balanceadas de algunos compuestos orgánicos, con
liberación de energía. Este proceso se llama fermentación (Brock, 1982).
El ejemplo más clásico de fermentación es el catabolismo de la glucosa por
levaduras en ausencia de oxigeno. En esta reacción parte de los átomos de
carbono terminan en CO2, una forma más oxidada que la de los átomos de
carbono de la molécula que partió, mientras que los otros átomos de carbono
terminan en etanol, que es más reducido que la glucosa (Hough, 1990). La
energía liberada en la reducción de la glucosa a etanol es -238.8 Kj/mol y se
conservan por fosforilaciones a nivel de sustrato en forma de enlaces fosfato de
alta energía en el ATP, con una producción neta de dos de estos enlaces
(Brock, 1982).
Anuna (Annona squamosa L.) pertenece a la familia de las anonáceas, la más
importante ya que cuenta con 150 especies; otras de interés comercial como la
guanábana (Annona muricata L.), la chirimoya (Annona cherimola Mill.) y más
recientemente el híbrido atemoya (A. squamosa x A. cherimola) proveniente del
cruce entre anuna y chirimoya (Guerrero y Fischer, 2007). El fruto es globoso-
oviforme, casi de forma acorazonada, de 5 a 12 cm de diámetro, color verde-
amarillento pero se conocen variedades de color púrpura. Externamente la
unión de los carpelos es laxa, con toda su superficie marcadamente
prominente, dándole al fruto apariencia tuberculada. La pulpa es blanca o
amarillenta entre la unión de los carpelos; los frutos son del tipo sincarpo
formados por numerosos pistilos de una flor; cada escama pertenece a un
carpelo fecundado, además de ser aromática, mantecosa, comestible, y de
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agradable sabor (Nakasone, 1998). Las semillas son oblongas, negro-lustrosas
o café-oscuras y constituyen entre el 31% y 41% del total del fruto y contienen
entre 14% y 49% de aceite (Leal, 1990; Morton, 1987).
El fruto de “anuna” tiene un alto contenido de proteína y azúcares. Es una
fuente importante de minerales como Fe, Ca y P y vitaminas como el ácido
ascórbico (Anexo 8.4)
Una fermentación alcohólica se debe a las actividades de ciertos
microorganismos, los cuales se encargan de procesar azúcares, como la
glucosa, la fructosa, etc., dando como resultado un alcohol a modo de etanol,
CO2 (gas) y ATP (adenosín trifosfato), moléculas que son utilizadas por los
propios microorganismos en sus metabolismos energéticos (Fermentación
alcohólica, 2000). En la presente investigación se reactivo adecuadamente el
cultivo puro de Saccharomyces cerevisiae var. ellipsoideus MIT L-51 y
estandarizando el volumen de inoculo adicionado al mosto de Annona
squamosa “anuna”; esto permite garantizar que la producción de etanol
obtenida en el mosto sea consecuencia de su variada composición en fuentes
de nitrógeno, esteroles, ácidos grasos insaturados, minerales, vitaminas,
fosfolípidos(Guerrero y Fischer, 2007).
Saccharomyces cerevisiae es la levadura más conocida y de importancia
industrial puesto que es la especie de levadura más utilizada para la obtención
de etanol a nivel industrial debido a su fácil manipulación y recuperación, no es
exigente en cuanto a su cultivo, presenta un bajo costo, tolera altas
concentraciones de etanol, produce bajas concentraciones de subproductos en
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la fermentación, es osmotolerante, capaz de utilizar altas concentraciones de
azucares, presenta alta viabilidad celular para el reciclaje y características de
floculación y sedimentación para el procesamiento posterior (Fajardo y
Sarmiento, 2007).
Las levaduras al ser células vivas necesitan los mismos elementos químicos
que otros seres vivos como es el carbono, hidrogeno, oxigeno, nitrógeno,
fosforo, potasio, azufre, magnesio, hierro, zinc, manganeso, cobre y molibdeno;
de estos los últimos cinco elementos se requieren en cantidades mínimas como
componentes o activadores de enzima (Carpenter, 1969). La concentración de
nutrientes puede afectar tanto a la velocidad como al rendimiento del
crecimiento del organismo. Si el nutriente se convierte en material celular,
cuanto más nutriente haya, mayor será la producción de células. La razón para
reducir la velocidad de crecimiento a concentraciones muy bajas de nutriente,
es porque no se puede transportar ese nutriente al interior de la célula con
suficiente rapidez para satisfacer las demandas metabólicas del nutriente y la
velocidad de crecimiento es proporcional a la concentración de dichos
nutrientes; sin embargo, a estas concentraciones bajas, el nutriente es utilizado
para la proliferación (Brock, 1982).
En el proceso de fermentación alcohólica es necesario brindar las condiciones
adecuadas de operación y optimización. Desde el punto de operación es
importante decidir las siguientes variables: temperatura, pH, °Brix, nutrientes y
productividad entre otras (Fajardo y Sarmiento, 2007).
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La temperatura ejerce un marcado efecto sobre la velocidad metabólica del
organismo. La temperatura tiene una influencia directa sobre la velocidad de
reacción y esta puede cambiar la configuración de los constituyentes celulares,
especialmente de las proteínas y de los componentes de la membrana
(Doran, 1998). La temperatura óptima de crecimiento de las levaduras
especialmente de Saccharomyces cerevisiae es de 30 a 35°C. La temperatura
afecta al organismo de manera notable ya que los organismos de una especie
dada solo pueden crecer en un rango de temperatura y esto afecta de manera
notable al organismo (Fajardo y Sarmiento, 2007).
La acidez o alcalinidad de una solución se expresa por su índice de pH en una
escala de 0 a 14. Es importante recordar que el pH es una función logarítmica,
un cambio en una unidad de pH representa un cambio de diez veces en la
concentración de iones hidrogeno (Brock, 1982). El pH tiene un marcado efecto
en la velocidad de crecimiento y en el rendimiento. El pH óptimo para algunos
organismos en especial para las levaduras se encuentra en un rango de 4.0 a
6.0. El pH tiene una gran influencia en los productos finales del metabolismo
anaerobio (Fajardo y Sarmiento, 2007).
El °Brix o grados Balling es otra escala del hidrómetro utilizada en la industria
azucarera. Normalmente las escalas °Brix se calibran de 15.6 °C a 20°C. Con
la escala a 20°C, cada °Brix indica 1 gramo de sacarosa por cada 100 gr de
líquido (Doran, 1998).
En la presente investigación se determinó la producción óptima de etanol por
Saccharomyces cerevisiae var. ellipsoideus MIT L-51 en mosto de Annona
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squamosa “anuna” en comparación con mosto de melaza de Saccharum
officinarum “caña de azúcar” cuyos resultados serán utilizados con la finalidad
de apoyar a generar nuevos sustratos a menor precio y brindar resultados
semejantes, pretendiendo utilizar los frutos de “anuna” como mosto para un
proceso óptimo de fermentación alcohólica y que estos resultados sean
aplicados en los siguientes trabajos experimentales.
OBJETIVOS
Optimizar la Producción de Etanol por Saccharomyces cerevisiae var.
ellipsoideus MIT L-51 a partir de mosto de Annona squamosa “anuna”
y mosto de melaza.
Determinar la productividad de etanol de Saccharomyces cerevisiae
var. ellipsoideus MIT L-51 en mosto de Annona squamosa “anuna”.
Determinar la producción de etanol de Saccharomyces cerevisiae var.
ellipsoideus MIT L-51 en mosto de Annona squamosa “anuna”.
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II. MATERIALES Y MÉTODOS
2.1 MATERIAL
2.1.1 Material biológico
Cultivo de Saccharomyces cerevisiae var. ellipsoideus MIT L-51 del
Laboratorio de Biotecnología del Departamento Académico de
Microbiología y Parasitología de la Facultad de Ciencias Biológicas de
la Universidad Nacional de Trujillo.
Frutos maduros de Annona squamosa “anuna” cultivados en la
Región de Loreto-Perú.
2.1.2 Medios de cultivo
Oxitetraciclina Gentamicina Agar (OGA)
Agar Papa Sacarosado (APS)
2.2 MÉTODOS
2.2.1 FASE PRE-FERMENTATIVA
2.2.1.1 Reactivación del cultivo y verificación de la pureza
Del cultivo conservado de Saccharomyces cerevisiae var. ellipsoideus
MIT L-51 se realizó una suspensión al decimo en agua destilada estéril y se
observó al fresco en microscopio para corroborar la pureza.
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Una vez verificados su pureza se procedió a sembrar el cultivo axénico
tomando de 2 a 4 asadas en frasquitos conteniendo medio APS inclinado e
incubando a temperatura ambiente durante 72 horas para reactivar el cultivo.
Las levaduras reactivadas se conservaron en frio a 4 oC hasta el momento
de su uso.
2.2.1.2 Propagación y estandarización del inóculo de Saccharomyces
cerevisiae var. ellipsoideus MIT L-51
Se tomó asadas del cultivo de Saccharomyces cerevisiae var. ellipsoideus
MIT L-51 reactivadas y se sembró por estría en placas Petri y frasquitos
conteniendo medio OGA inclinado, y se incubaron a temperatura ambiente
durante 72 horas con el fin de propagar. Transcurrido el tiempo de
incubación, la biomasa desarrollada se “cosecho” utilizando de 20ml de agua
destilada estéril en total. La suspensión total de lo “cosechado” se recolectó
en un frasco de vidrio estéril. Se hizo una dilución al centésimo para luego
determinar la concentración celular por mililitro (cel./ml) mediante recuento
en cámara de Neubauer (Flores, 2009; Gómez, 2009; Mendocilla, 2012).
Con los datos obtenidos se realizaron los cálculos para determinar la
concentración de la levadura, obteniendo una concentración celular de 3.26x
106células/ml.
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2.2.1.3 Preparación del mosto
2.2.1.3.1 Annona squamosa “anuna”
Mediante la ayuda de un cepillo de dientes de primer uso se lavaron los
frutos con agua corriente y luego se desinfectaron con una solución de
hipoclorito de sodio al 0.5% durante 15 minutos; a continuación se
hicieron lavados sucesivos con abundante agua potable estéril hasta la
eliminación del olor característico del hipoclorito y luego se enjuagaron
con agua destilada estéril. Posteriormente los frutos se pelaron, se
separaron las pepas, y la pulpa fue estrujada y machacada; la fibra se
separo por filtración y el mosto medido y acondicionado para su posterior
higienización y suplementación. El mosto de Annona squamosa “anuna”
se utilizó para los Biorreactores problema.
2.2.1.3.2 Melaza de Saccharum officinarum
Se diluyo la melaza bruta con agua destilada estéril calentando y agitando
hasta diluirla totalmente. Posteriormente, se centrifugó tres veces con el
fin de retirar gran parte de las impurezas y contaminantes; se llevó al
autoclave por 20 minutos a 20 libras de presión y a 121oC. Por último, se
adicionó ampicilina a una concentración de 300 ml/L (Fajardo y
Sarmiento, 2007).
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2.2.1.4 Diseño, construcción, lavado y esterilización del Biorreactor
para la fermentación con Saccharomyces cerevisiae var. ellipsoideus
MIT L-51
Para la construcción del Biorreactor de fermentación, se utilizaron doce
botellas de vidrio de 2000 ml de capacidad, los cuales se hicieron dos
orificios en la tapa de teknoport uno para los muestreos respectivos y otro
para la liberación de gases, a este último se le conectó 60 cm de manguera
de acuario, el cual fue insertado en otra botella de plástico con una solución
de cloruro de sodio al 23% con la finalidad de recepcionar los gases emitidos
durante el proceso (Mendocilla, 2012).
Luego de ensamblar el Biorreactor, se procedió a lavar por separado cada
una de las partes utilizando detergente y cepillo de lavado, se enjuagó con
abundante agua, se desinfectó con solución de hipoclorito de sodio al 2.5%
durante una hora para luego enjuagar con agua de caño estéril y con agua
destilada estéril, finalizando con alcohol de 70o (Geldres, 2007).
2.2.1.5 Corrección y suplementación de los mostos
Para corregir la densidad se adicionó azúcar rubia domestica hasta llegar a
una densidad equivalente a 25o °Brix. La medición se hizo con un
Brixómetro.
Para corregir el pH se adicionó bicarbonato de sodio o acido cítrico según
sea el grado de acidez o alcalinidad de los mostos; se llevó a un valor de
3,5. Estos datos fueron medidos cualitativamente mediante tiras reactivas
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Para corregir la fuente nitrogenada se adicionó 200 mg de sulfato de amonio
por litro de mosto (Yeramian,et al. 2001).
2.2.1.6 Higienización del mosto
El mosto de Annona squamosa “anuna” al igual que el mosto de melaza
fueron acondicionados en un recipiente estéril y se higienizaron con 120 mg
de bisulfito de sodio por litro de mosto; luego el contenido se homogenizó
dejando actuar por 15 minutos para destruir todo organismo no deseable en
el mosto. Esto se comprobó sembrando 0.15 ml de mosto sulfitado, por
superficie, en una placa conteniendo Agar Papa Sacarosado e incubándola
a temperatura ambiente durante 72 horas (Mendocilla, 2012).
2.2.2 FASE FERMENTATIVA
2.2.2.1 Acondicionamiento de los Biorreactores e inoculación
Los mostos de “anuna” y melaza previamente suplementados, fueron
distribuidos en los Biorreactores estériles a razón 940ml de mosto en cada
uno y rotulados adecuadamente, “10%”, “20%” y “30%” para mosto de
Annona squamosa “anuna” y “20% MELAZA” para el mosto de melaza de
Saccharum officinarum como testigo. Se hicieron tres repeticiones del
experimento.
2.2.2.2 Inóculo
En condiciones de asepsia utilizando mecheros, se agregó un volumen de
60 ml de inóculo reactivado y estandarizado por litro de mosto.
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2.2.2.3 Monitoreo del Bioproceso
El proceso fermentativo se llevó a cabo durante 168 horas a temperatura
ambiente y se monitoreo a las 24, 48, 72, 96, 120, 144 y 168 horas. Durante
el monitoreo se hizo el recuento total de levaduras y se midió la densidad de
cada uno de los Biorreactores luego terminado el proceso fermentativo, se
procedió a calcular la productividad de etanol, producción de etanol y
densidad final.
2.2.3 FASE POSTFERMENTATIVA
2.2.3.1 Determinación de la productividad de etanol
La productividad de etanol se determinó por el método de Davies y Griffieth
modificado, para ello se calculo los mililitros de CO2 producido cada 12
horas mediante la técnica de las densidades (Anexo 8.11), se midió la
temperatura y con estos datos se realizaron los cálculos de productividad de
etanol (Anexo 8.12).
La productividad de etanol se expresa en gramos de etanol por levadura por
hora.
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2.2.3.2 Determinación de la producción de etanol
Culminada la fermentación, el volumen de etanol producido en cada
Biorreactor, se obtuvo mediante destilación.
El grado alcohólico se midió mediante la técnica de las densidades y
corroborando con un alcoholímetro tipo DENSIMETRE METER DMA 35
“Anton Paar”.
2.2.3.3 Análisis estadístico
Los datos fueron analizados estadísticamente mediante la prueba t de
Student para comparación de promedios (Geldres, 2007).
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III. RESULTADOS
Al determinar la Productividad de etanol por Saccharomyces cerevisiae var.
ellipsoideus MIT L-51 en mosto de Annona squamosa “anuna” al 10%, 20%,
30% (p/v) y mosto de melaza al 20 % (p/v) utilizado como testigo durante 168
horas de fermentación a temperatura ambiente; se observa en la figura 01 la
Productividad de etanol en los tres mostos de “anuna” en comparación con el
testigo (melaza al 20%), y la máxima productividad se da entre las 48 y 72
horas en las tres diferentes concentraciones de mostos de “anuna”, y entre los
72 y 96 horas para el mosto de melaza al 20%. Luego la productividad
disminuye entre las 96 y 120 horas y progresivamente hasta las 168 horas de
fermentación.
En la figura 02 se presenta la producción de etanol durante las 168 horas de
fermentación, observándose una mayor producción en mosto de “anuna” al
30% en comparación con las otras concentraciones.
El cuadro 01 muestra la productividad durante las primeras 72 horas de iniciada
la fermentación en mosto de “anuna” al 10%, 20% y 30% de concentración; así
como también la producción máxima de etanol durante las 168 horas del
proceso fermentación
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Fig. 01. Productividad de etanol de Saccharomyces cerevisiae var. ellipsoideus
MIT L-51 en mosto de Annona squamosa “anuna” al 10%, 20%, 30% (p/v) y
mosto de melaza al 20 % (p/v) utilizado como testigo, durante 168 horas de
fermentación a temperatura ambiente (23 ±4oC).
La productividad de etanol se expresa en gramos de etanol por levadura por
hora
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
24 48 72 96 120 144 168
pro
du
ctiv
idad
x1
0-1
horas
10%
20%
30%
20% MELAZA
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Fig. 02. Producción de Etanol (v/v) por Saccharomyces cerevisiae var.
ellipsoideus MIT L-51 en mosto de Annona squamosa “anuna” al 10%, 20%,
30% (p/v) y mosto de melaza al 20 % (p/v) utilizado como testigo durante 168
horas de fermentación a temperatura ambiente (23 ±4oC).
La producción de etanol se expresa en ml de etanol por volumen total.
0
0.5
1
1.5
2
2.5
Annonasquamosa 10%
Annonasquamosa 20%
Annonasquamosa 30%
solucion melaza20%
0.052 0.18 0.271
2.392 P
RO
DU
CC
ION
ETA
NO
L (V
/V)
Etanol (v/v)
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Cuadro 01. Productividad y Producción máxima de etanol a las 72 y 168 horas
de fermentación por Saccharomyces cerevisiae var. ellipsoideus MIT L-51 en
mosto de Annona squamosa “anuna” al 10%, 20%, 30% (p/v) y mosto de
melaza al 20 % (p/v) utilizado como testigo durante 168 horas de fermentación
Productividad x10-1
(g et/g lev/h)
Producción
(ml/L)
72 Horas 168 Horas
“anuna” 10% 3.18 0.05
20% 36.87 0.18
30% 72.25 0.27
Melaza 20%
MELAZA
380.82 2.39
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IV. DISCUSIÓN
Los datos obtenidos en el cuadro 01, figura 01 y figura 02 muestran la
capacidad del mosto de Annona squamosa “anuna” para ser fermentado por
Saccharomyces cerevisiae var. ellipsoideus MIT L-51 y en cantidad mayor en
mosto de melaza utilizada como testigo en esta investigación para la
producción de etanol.
Al determinar la productividad del etanol de Saccharomyces cerevisiae var.
ellipsoideus MIT L-51 en la Figura 01, se observa mayor productividad de
etanol en el mosto de melaza al 20% (p/v), seguido por el mosto de Annona
squamosa “anuna” al 30% (p/v) y luego por el de Annona squamosa “anuna”
20% (p/v). Esta gran ventaja se debe a que la melaza posee sacarosa (60%-
63% peso), glucosa (6%- 9% peso), fructosa (5%- 10% peso) y rafinosa, los
cuales son azucares fermentables (Fajardo y Sarmiento, 2007), en
comparación con mosto de Annona squamosa “anuna” que contiene
aproximadamente 21.5% de azucares totales (Roig, 1998).
Al ser analizada la productividad de etanol durante 168 horas de fermentación,
en el cuadro y figura 01, se observa que la máxima productividad se da a las 72
horas, luego disminuye bruscamente a las 96 horas y progresivamente hasta
las 120 y 144 horas de fermentación respectivamente. En mosto de Annona
squamosa “anuna” al 30% se observa un lento crecimiento a las 48 horas para
luego aumentar a un pico máximo bruscamente a las 72 horas, superando así
al mosto de Annona squamosa “anuna” al 20% que empezó un crecimiento
rápido en las primeras 48 horas y mantenerse durante las 96 horas siguientes
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hasta su eventual descenso, siendo estos resultados estadísticamente
significativos.
Suelen emplearse mezclas que incluyen biotina, tiamina, inositol y ácido
pantoténico, esenciales para el desarrollo metabólico de la célula y la
fermentación. La tiamina y el contenido de acido pantoténico en el mosto de un
fruto cumplen funciones muy importantes en el proceso de fermentación;
Annona squamosa “anuna” contiene 0,10 – 0,13 mg de tiamina por cada 100
gramos de pulpa (Guerrero y Fischer, 2007), lo cual, según hidalgo es
primordial por muchas descarboxilaciones y transformación de acido pirúvico a
etanol (metabolismo de los glúcidos); de igual modo el acido pantoténico al ser
constituyente de la coenzima A interviene en las reacciones de acetilación
(Hidalgo, 2003). A todo esto se resalta el aporte vitamínico de tiamina y de
acido pantoténico los cuales tienen un efecto estimulante sobre el crecimiento
de las levaduras asegurando una fermentación óptima (Pedro, 2012).
No siempre el nitrógeno asimilable incrementa el crecimiento celular, porque
puede ser acumulado intracelularmente en las vacuolas celulares, como
reserva en la fase estacionaria donde sería empleado en la síntesis de
proteínas (Henschke y Jiranek, 1993). Esto puede reprimir el consumo de
aminoácidos, con lo que se ve reducido la eficiencia de la fermentación. Por lo
cual Sablayrolles 2009, indica que cuando se tienen elevadas concentraciones
de nitrógeno y bajos niveles de tiamina se genera un detenimiento de la
fermentación (Sablayrolles, 2009). Del mismo modo Bartra et al. 2010 señala
que la ausencia de procesos de la vía metabólica de la tiamina se asocian al
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incremento de sulfuro de hidrogeno dentro de la fermentación (Bartra, et al.
2010).
La productividad de etanol a las 24 horas (fig. 01), en los mostos de “anuna” al
20% y al 30% presenta la misma tendencia debido al amonio presente en
forma natural y suplementado equivalentemente con sulfato de amonio. El
proceso de asimilación del nitrógeno inicia en la conversión del amoníaco a
glutamato, por la deshidrogenasa presente. Seguido de esto, parte del
glutamato es convertido en glutamina, que representa una fuente importante de
nitrógeno celular (Cooper, 1982).
Durante las 120 hasta las 168 horas la productividad de etanol (fig. 01) en los
tres mostos de “anuna” disminuye progresivamente; por el contrario el testigo
vuelve aumentar su productividad durante las 144 horas, en los mostos de
“anuna” podría deberse a factores fisiológicos por parte de la levadura como la
concentración alcohólica intracelular que afecta su funcionamiento, pues la
composición lípidica de la membrana celular de la levadura, se relaciona
directamente con la tolerancia al etanol, ya que mientras incrementa su
concentración, modifica esta composición, variando su polaridad, de modo que
la hidratación de la superficie de los grupos hidrófilos de la superficie de las
membranas, afecta el transporte de nutrientes y productos de dicha membrana
(Morris, et al. 1983). Por el contrario el incremento de la productividad en el
mosto de melaza a partir de las 144 horas posiblemente se deba a que
Saccharomyces cerevisiae se adapta muy bien en este medio, ya que presenta
un requerimiento energético en condiciones anaerobias de 0,036 gramos de
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célula por gramo de sustrato-hora, y en función de la cepa empleada se tiene
un contenido residual de azúcar de 10-56 g/L, lo que influencia el tiempo de
fermentación, el cual va de 119 a 170 horas (Sablayrolles, 2009).
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V. CONCLUSIONES
La mayor productividad de etanol por Saccharomyces cerevisiae var.
ellipsoideus MIT L-51 se alcanzó a las 72 horas y fue de 72.25 x10-1 g
et/g lev/h en mosto de Annona squamosa “anuna” a concentración de
30% (p/v).
La mayor producción de etanol por Saccharomyces cerevisiae var.
ellipsoideus MIT L-51, se alcanzó en mosto de Annona squamosa
“anuna” a concentración de 30% (p/v) y fue de 0.27 ml/L.
Se optimizó el proceso de producción de etanol por Saccharomyces
cerevisiae var. ellipsoideus MIT L-51 utilizando mosto de Annona
squamosa “anuna”, manteniendo la máxima concentración de mosto de
“anuna”, temperatura y pH de 3.5.
Saccharomyces cerevisiae var. ellipsoideus MIT L-51 durante 168 horas
de fermentación produce un grado alcohólico de 1.611%etanol, 8.380
%etanol y 12.504 %etanol, en mosto de Annona squamosa “anuna” al
10%, 20%, 30% (p/v) respectivamente.
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VI. RECOMENDACIONES
Esta investigación permitió determinar aspectos críticos en la cual se podrían
mejorar asegurando un mayor nivel de optimización si se investigan otros
aspectos, por lo cual se recomienda:
Evaluar pruebas experimentales utilizando mayores concentraciones del
fruto de “anuna”.
Controlar la temperatura de fermentación.
Determinar un patrón de grado de madurez del fruto de “anuna” así
mismo implementar un protocolo de características organolépticas para
mejores resultados.
Controlar el CO2 liberado para resultados más precisos.
Experimentar con equipos de alta precisión para la obtención de
mejores resultados.
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VII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Apuntes agroeconómicos. La industria del etanol. FAUBA. Disponible en: www.agro.uba.ar/apuntes/no_6/etanol.htm 1
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ANEXOS
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Anexo 8.1. Annona squamosa “anuna” fruto utilizado para la fermentación de
Saccharomyces cerevisiae var. ellipsoideus MIT L-51.
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Anexo 8.2. Composición de Agar Papa Sacarosado (APS) utilizado para
reactivar el cultivo de Saccharomyces cerevisiae var. ellipsoideus MIT L-51
para el proceso fermentativo con Annona squamosa “anuna”
Agar agar 4.5 gramos
Suero de papa 75 gramos
Azúcar 12 gramos
H2O destilada 300 ml
Disolver y llevar a ebullición, esterilizar en autoclave a 15 lb. de presión a 121
0C y durante 15 minutos.
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Anexo 8.3. Composición (g/L) de Oxitetraciclina Gentamicina Agar (OGA)
utilizado para la propagación y estandarización del cultivo de Saccharomyces
cerevisiae var. ellipsoideus MIT L-51 para el proceso fermentativo con Annona
squamosa “anuna”
Extracto de levadura 5.0 gramos
D(+) glucosa 10.0 gramos
Agar agar 15.0 gramos
Oxitetraciclina 0.1 gramos
Gentamicina 0.05 gramos
Disolver 30 g/litro, esterilizar en autoclave (15 min. A 121ºC), dejar enfriar hasta
unos 50ºC, incorporar 0.1 g/litro de Oxitetraciclina en forma de solución acuosa
y 0.05 g/litro de Gentamicina (1 mL/litro de Gentamicina en solución) y verter en
placas a pH: 6.5 ±0,2
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Anexo 8.4. Valor nutricional en 100 gramos de pulpa (según morton, 1987)
COMPONENTES CONCENTRACIÓN
Calorías 88,9 – 95,7
Humedad 69,8 – 75,18 g
Grasa 0,26 – 1,10 g
Carbohidratos 19,16 – 25,19 g
Azúcares totales 21.50 g Proteína 1,53 – 2,38 g
Fibra 1,14 – 2,50 g
Cenizas 0,55 – 1,34 mg
Fósforo 23,6 – 55,3 mg
Calcio 19,4 – 44,7 mg
Hierro 0,28 – 1,34 mg
Triptofano 9 – 10 mg
Metionina 7 – 8 mg
Lisina 54 – 69 mg
Caroteno 5 – 7 U.I.
Tiamina 0,10 – 0,13 mg
Riboflavina 0,113 – 0,167 mg
Niacina 0,654 – 0,931 mg
Ácido ascórbico 34,7 – 42,2 mg
FUENTE: Eugenio de Jesús Guerrero, Gerhard Fischer;
Manejo integrado en el cultivo de anuna.
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Anexo 8.5. Reactivación de cultivo, observación macroscópica de
Saccharomyces cerevisiae var. ellipsoideus MIT L-51 en medio Agar Papa
Sacarosado (APS) inclinado, utilizando la técnica de siembra en estría
después de ser incubado a temperatura ambiente (23 ±4oC) durante 72 horas.
Anexo 8.6. Verificación de la pureza, Saccharomyces cerevisiae var.
ellipsoideus MIT L-51, observación microscópica al fresco 100x.
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Anexo 8.7. Propagación del cultivo. Observación macroscópica de
Saccharomyces cerevisiae var. ellipsoideus MIT L-51 en medio Oxitetraciclina
Gentamicina Agar (OGA), utilizando la técnica de siembra en estría después de
ser incubado a temperatura ambiente (23 ±4oC) durante 72 horas.
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Anexo 8.8. Técnica de cuenta directa en cámara de Neubauer
Se coloca 1 ml de la muestra en un tubo de ensayo. Cuando se trata de cuantificar muestras muy concentradas será necesario preparar diluciones de la misma con solución salina isotónica.
Lavar cuidadosamente la cámara de Neubauer sin frotar la zona brillante del centro y el portaobjetos. Secar con papel suave. Colocar el portaobjetos sobre la zona central limitada por dos excavaciones laterales, donde se aprecian una zona cuadriculada a simple vista.
Tomar inmediatamente una muestra con una pipeta Pasteur de punta fina y depositar una gota entre la cámara y el cubreobjetos por el borde de la cámara. Dejar que la muestra se distribuya por capilaridad, evitando el exceso que dificultara la evaluación precisa de la población microbiana.
Dejar reposar durante 5 minutos, colocar la cámara en la platina del microscopio y localizar con el objetivo seco débil (10x) la zona cuadriculada que se muestra en la figura 03.
Localizar el cuadro central grande (C1) que miden 1.0 mm por lado, que se muestra divido en 5x5 cuadros pequeños (C2) limitados por triple línea que miden 0.2mm por lado. Estos cuadros pequeños a su vez se encuentran divididos en 16 cuadros más pequeños (C3) de 0.05mm de lado.
Hacer la cuantificación de células con el objetivo seco fuerte (40x), contando el número de células que se localicen en el cuadro C1, los cuadros de menor tamaño C2 sirven de guía para el cómputo. Se empieza a contar desde la parte superior de los cuadros C2 y se continúa hasta la base. Si las células tocan los límites de los cuadros C2; deberán contarse solamente aquellas que toquen la parte superior y el lado derecho del cuadro. Si las células tocan la parte inferior o el lado derecho no se cuentan. Este método reduce las posibilidades de contar células dos veces.
Cuente hasta cerca de 200 a 250 células antes de determinar el número de células por ml. En el proceso de contar se pueden presentar tres situaciones diferentes que a continuación se explican:
Si hay de 200 a 250 células por cuadro grande (C1), multiplicar directamente x 104 para reportar el número de células por ml.
Con menos de 200 células por cuadro grande (C1), será necesario contar de los cuadros de las esquinas (1x1 mm de lado y divididos en 4x4). De esta manera se cuantificaran mas 200 células. Después dividir el número total de
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células entre el número de cuadros empleados y sacar el valor promedio por cuadro grande. Después multiplicar este valor por x 104 para reportar el número de células por ml.
En el caso de que se observen más de 200 células por grande (C1), se deberán contar las células de los cuadros de menor tamaño (C2) hasta contar cerca de 200 células. Dividir este valor entre el número de cuadros usados para la cuenta y para sacar el valor promedio por cuadro C2. Multiplicar este valor promedio por 25 para obtener el número de células aproximado en un cuadro grande (C1) y después multiplicar x 104 para reportar el número de células por ml.
El factor de 104 por el cual se debe multiplicar el número de células por cuadrado grande (C1) es porque este cuadrado contiene un volumen de 0.1 mm3 (mide 1mm por lado y la cámara tiene una profundidad de 0.1 mm)
# Células/cuadro C1 (25 cuadros C2) = # células/0.1 mm3 x104 = # células/mL
En el caso de que el # de células sea muy grande, la suspensión deberá diluirse y se hará la corrección como sigue:
# células/mL. En la muestra diluida x (factor de dilución) = # células/mL. En la suspensión original
Anexo 8.8.1. Cuenta en cámara de Neubauer. Extraído de: María de los
Ángeles Aquiahuati Ramos y Col. 2004. Manual de prácticas del laboratorio de
microbiología general. Universidad Autónoma Metropolitana- unidad iztapalapa.
Primera edición. México, D.F.
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Anexo 8.8.2. Observación microscópica, en fresco, de Saccharomyces
cerevisiae var. ellipsoideus MIT L-51 en cámara de Neubauer a 100x
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Anexo 8.9. Biorreactores conteniendo los mostos y los sedimentos de Annona
squamosa “anuna” y melaza utilizado como testigo, después de finalizada la
fermentación utilizando Saccharomyces cerevisiae var. ellipsoideus MIT L-51.
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Anexo 8.10. Equipo de destilación para determinar el grado alcohólico
producido por Saccharomyces cerevisiae MIT L-51 en mosto de Annona
squamosa “anuna”
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Anexo 8.11. Calculo del volumen de CO2 (técnica de las densidades)
Para esta técnica se utilizó un densímetro calibrado a 20 0C.
Sabiendo que:
La Densidad de un líquido es la relación entre su masa y su volumen.
Donde P es la densidad, m la masa, y V el volumen.
La densidad del agua pura es 1. Dado que 1 Kg de agua tiene un volumen de 1 Litro. Por lo que un líquido azucarado (como el mosto) tendrá una densidad siempre mayor a 1.
El peso molecular del Etanol o Alcohol Etílico es: 46.0688 y por otro lado el peso molecular del dióxido de carbono es: 44.0098 y la densidad del etanol es 0.79 Kg por Litro.
Por los pesos moleculares que mencionamos anteriormente, entonces, por cada 44.0098 gramos de CO2 que se escapan, 46.0688 gramos de Alcohol Etílico han sido formados. O bien, por cada gramo de CO2, 1.05 gramos de Alcohol Etílico han sido ganados.
Entonces:
%ABV= (OG-FG)*131 Vol. de CO2 en el fermentador= OG-FG
Donde:
%ABV: porcentaje de alcohol en volumen
OG: densidad inicial
OF: densidad final
Extraído de: García, J. 2013. BREWMASTERS. Insumos, equipo, cerveza y
amigos. Cómo Medir el Contenido de Alcohol en la Cerveza. Disponible en:
http://www.brewmasters.com.mx/como-medir-el-contenido-de-alcohol-en-la-
cerveza/
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Anexo 8.12. Calculo de la productividad mediante el método de Davies-
Griffieth (1982) modificado.
1. Medir el volumen de CO2 producido en un tiempo determinado, en
base a la técnica de las densidades.
2. Calcular los ml de CO2 producido por hora.
3. Calcular los ml de CO2 producido por gramo de levadura.
4. Calcular la productividad:
- Considerando que 1mol de CO2 ocupa 22.4 L a 1 atmosfera
de presión y a 298 0K, calcular el volumen en base a las
condiciones trabajadas.
Utilizar la siguiente equivalencia:
=
- Calcular el número de moles de CO2 producido, que es
equivalente al número de moles de etanol.
- Convertir el numero de moles de etanol a gramos de etanol,
considerando que: numero de moles = W (g)/PM del etanol.
- Los resultados se expresan en gramos de etanol por gramo
de levadura por hora.
Extraído de: Villanueva E., Robles H. y Otiniano M. 2007. Guía de Practicas de
Microbiología Industrial. Universidad Nacional de Trujillo. Trujillo. Perú.
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Anexo 8.13. Productividad de etanol de Saccharomyces cerevisiae var.
ellipsoideus MIT L-51 en mosto de Annona squamosa “anuna” al 10%, 20%,
30% (p/v) y mosto de melaza al 20 % (p/v) utilizado como testigo, durante 168
horas de fermentación a temperatura ambiente (23 ±4oC).
CC
Hora Annona squamosa “anuna” MELAZA
10% 20% 30% 20%
24 2.05 2.24 4.11 46.75
48 4.17 29.57 18.65 233.38
72 3.18 36.87 72.25 380.82
96 4.73 32.63 50.62 383.33
120 3.05 24.86 38.37 350.41
144 1.44 8.61 17.14 311.52
168 0.75 4.84 8.37 340.87
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Anexo 8.14. Planteamiento de problema e hipótesis en la investigación de
fermentación con mosto de Annona squamosa “anuna”.
PROBLEMA
¿Cuál será la producción óptima del etanol por Saccharomyces cerevisiae var.
Ellipsoideus MIT-L51 en mosto de Annona squamosa “anuna” en comparación
con mosto de Saccharum officinarum “caña de azúcar”?
HIPÓTESIS
La producción óptima de etanol obtenida a la concentración en mosto de
Annona squamosa al 10% no difiere a la producción optima de etanol obtenida
a la concentración de Annona squamosa al 20%
HO: µ1 - µ2 = 0
Hi : µ1 - µ2 ≠ 0
La producción óptima de etanol obtenida a la concentración en mosto de
Annona squamosa al 10% no difiere a la producción optima de etanol obtenida
a la concentración de Annona squamosa al 30%
HO: µ1- µ3 = 0
Hi : µ1 - µ3 ≠ 0
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La producción óptima de etanol obtenida a la concentración en mosto de
Annona squamosa al 20% no difiere a la producción optima de etanol obtenida
a la concentración de Annona squamosa al 30%
HO: µ2- µ3 = 0
Hi : µ2 - µ3 ≠ 0
La producción óptima de etanol obtenida a la concentración en mosto de
Annona squamosa al 10% no difiere a la producción de etanol obtenida a la
concentración de melaza al 20%
HO: µ1- µm = 0
Hi : µ1- µm ≠ 0
La producción óptima de etanol obtenida a la concentración en mosto de
Annona squamosa al 20% no difiere a la producción de etanol obtenida a la
concentración de melaza al 20%
HO: µ2- µm = 0
Hi : µ2- µm ≠ 0
La producción óptima de etanol obtenida a la concentración en mosto de
Annona squamosa al 30% no difiere a la producción de etanol obtenida a la
concentración de melaza al 20%
HO: µ3- µm = 0
Hi : µ3- µm ≠ 0
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ANEXO 8.15. ANÁLISIS ESTADÍSTICO “t” DE STUDENT DE LA OPTIMIZACIÓN EN LA PRODUCCIÓN DE ETANOL POR
Saccharomyces cerevisiae var. ellipsoideus MIT L-51 A PARTIR DE MOSTO DE Annona squamosa “anuna” Y MOSTO DE
MELAZA
ANÁLISIS DE VARIANZA:
Numero de tratamientos: t=4
Número de repeticiones por cada ensayo: rj=3
Numero de total de tratamientos: N=12
Desarrollo de datos para el análisis de varianza: cantidad de etanol producido en el proceso de optimización por
Saccharomyces cerevisiae var. ellipsoideus MIT L-51 a partir de mosto de Annona squamosa “anuna” y mosto de melaza
Biorreactor R1 R2 R3 Tj (Tj)2 (R1)2 (R2)2 (R3)2 Anuna 10% 0.065 0.026 0.039 0.130 0.0169 0.004225 0.000676 0.001521 Anuna 20% 0.129 0.193 0.219 0.541 0.2927 0.016641 0.037249 0.047961 Anuna 30% 0.258 0.233 0.297 0.788 0.6209 0.066564 0.054289 0.088209 Melaza 20% 2.299 2.098 2.768 7.165 51.337 5.285401 4.401604 7.661824 ∑ 2.751 2.550 3.323 8.624 52.2675 5.372831 4.493818 7.799515
∑Y2ij 17.666164
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A=∑Tj =8.624 B= A2/N = 6.198 ∑Y2ij = 17.666164
Base de datos del análisis de varianza: optimización del proceso a partir de mosto de Annona squamosa “anuna” por
Saccharomyces cerevisiae var. ellipsoideus MIT L-51.
FUENTE SUMA DE CUADRADOS GRADOS DE LIBERTAD EMC (Esperanza media de cuadrados)
TRATAMIENTO St =∑Tj2/rj –B= 11.225 t-1=3 Mt= St/(t-1)= 3.742 ERROR Se =∑Y2ij - ∑Tj2/rj= 0.244 N-t=8 Me= s2= Se/(N-t)=0.031 TOTAL St + Se=11.469 N-1=11
FO= Mt/Me= 120.71
HO: [ENSAYO]i =0
Hi : [ENSAYO]i ≠ 0
Según la tabla: F(t-1), (N-t), 5% = F3, 8, 5% = 4.07 FO > FTABLA = se rechaza HO
Los tratamientos tienen una diferencia significativa, las condiciones de los ensayos no son nulas y afectan la optimización del proceso de producción de etanol a partir de mosto de Annona squamosa “anuna” por Saccharomyces cerevisiae var. ellipsoideus MIT L-51
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DIFERENCIA MINIMA SIGNIFICATIVA (DLS):
I. HO: µX = µY : Las condiciones del ensayo surten el mismo efecto II. H1: µX ≠ µY : Las condiciones del ensayo surten diferente efecto III. DLS = t N-t, 1-α/2 x (2S2/r)1/2
. Cuando: α = 0.05
t N-t, 1-α/2 = t8, 0.975 = 2.306 (2S2/r)1/2 = (2 x 0.031/3)1/2 = 0.144
DLS: 2.306 x 0.144= 0.332
Concentración de etanol en la optimización del proceso a partir de mosto de Annona squamosa “anuna” por Saccharomyces
cerevisiae var. ellipsoideus MIT L-51.
Experimentos R1 R2 R3 Ppromedio Anuna 10% (E10) 0.065 0.026 0.039 0.043 Anuna 20% (E20) 0.129 0.193 0.219 0.180 Anuna 30% (E30) 0.258 0.233 0.297 0.263 Melaza 20%(M20) 2.299 2.098 2.768 2.388
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µ10=µ20, como I E10-E20 I = I - 0.137 I < 0.332, entonces se acepta HO » µ10=µ20,
No existe diferencia significativa entre la producción de etanol cuando las concentraciones están 10% anuna y 20% anuna
µ10=µ30, como I E10-E30 I = I - 0.220 I < 0.332, entonces se acepta HO » µ10=µ30
No existe diferencia significativa entre la producción de etanol cuando las concentraciones están 10% anuna y 30% anuna
µ10=µM20, como I E10-M20 I = I -2.345 I >0.332, entonces se rechaza HO » µ10≠µM20
Existe diferencia significativa entre la producción de etanol cuando las concentraciones están 10% anuna y 20% melaza
µ20=µ30, como I E20-E30 I = I -0.083 I < 0.332, entonces se acepta HO » µ20=µ30
No existe diferencia significativa entre la producción de etanol cuando las concentraciones están 20% anuna y 30% anuna
µ20=µM20, como I E20-M20 I = I -2.208 I >0.332, entonces se rechaza HO » µ20≠µM20
Existe diferencia significativa entre la producción de etanol cuando las concentraciones están 20% anuna y 20/% melaza
µ30=µM20, como I E30-M20 I = I -2.125 I >0.332, entonces se rechaza HO » µ30≠µM20
Existe diferencia significativa entre la producción de etanol cuando las concentraciones están 30% anuna y 20% melaza
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