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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
INFORME TÉCNICO PARCIAL
PROYECTO MULTIDISCIPLINARIO
Clave del programa: 1539
“DESARROLLO DE BIOINSECTICIDAS MICRO Y
NANOENCAPSULADOS PARA EL CONTROL DE PLAGAS
DEL TOMATE”
COORDINADOR: Dr. Cipriano García Gutiérrez
Módulo I. “Caracterización molecular de hongos y bacterias entomopatógenos, e
identificación de genes implicados en su patogenicidad y virulencia”. Registro
asignado por la SIP: 20130246, Director: Dr. Cesar Marcial Escobedo Bonilla.
(CIIDIR Sinaloa).
Módulo II. “Escalamiento de procesos de producción de hongos y bacterias
entomopatógenas”. Registro asignado por la SIP: 20130173, Director: Dr. Sergio
García Salas. (UPIBI).
Módulo III. “Diseño y evaluación de bioinsecticidas micro y nanoencapsuladas
para el control de plagas del tomate en Sinaloa”. Registro asignado por la SIP:
20130074, Director: Dr. Cipriano García Gutiérrez. (CIIDIR Sinaloa).
Módulo IV. “Validación de la efectividad de bioinsecticidas micro y
nanoencapsulados para el control de plagas del tomate”. Registro asignado por la
SIP: 20130144, Director: Dr. Adolfo Dagoberto Armenta Bojórquez. (CIIDIR
Sinaloa).
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RESUMEN
Se presentan resultados de producción de la bacteria Bacillus thuringiensis y de
los hongos entomopatógenos Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae e Isaria
fumosorosea a nivel de laboratorio, en matraces y en biorreactores de 0.5 L y 5 L.,
generando información básica de ingeniería para desarrollar estos procesos a
nivel industrial. En los experimentos con la bacteria se obtuvieron los siguientes
resultados: velocidad específica de crecimiento máxima de 0.38 h-1 y productividad
de 7.3 x 108 esporas/L h; el uso de quitina al 1% en el medio de cultivo aumentó
un 10 % la productividad, comprobando un efecto inductor. También se encontró
que la productividad depende del coeficiente volumétrico de transferencia de
oxígeno (kLa), el cual se considera como el criterio más importante de
escalamiento de este proceso, pues la productividad aumentó 6 veces al aumentar
el kLa de 23 h-1 a 240 h-1.En los trabajos con hongos entomopatógenos destacan
los resultados con B. bassiana siendo los siguientes: velocidad específica de
crecimiento máxima de 0.040 h-1 y productividad de 1.79 x 109 esporas/L h; el uso
de quitina al 1% en el medio de cultivo no tuvo efecto para aumentar la
productividad, pero si aumento el complejo enzimático patogénico. En este
proceso la zona de escalamiento es muy amplia, pues la productividad se
mantiene en un intervalo de 1 x 109 esporas/L h a 3.6 x 109 esporas/L h en
amplios intervalos de kLa (23 h-1 a 240 h-1) y de consumo de potencia (0.21 a 1.56
W/L).Con respecto a la reología de los caldos de cultivo, en ambos procesos el
medio de cultivo tuvo un comportamiento Newtoniano, permitiendo mantener
condiciones de homogeneidad en el reactor, sobre todo en los biorreactores de
mayor tamaño (5L). En este trabajó se seleccionaron las cepas B16 de Beauveria
bassiana, la cepa HM13 de Metarhizium anisopliae y la cepa If19 de Isaria
fumosorosea, así como 3 aislamientos de Bacillus thuringiensis, para evaluar su
efectividad contra plagas de tomate; respecto a la identificación molecular de los
hongos hasta el momento se ha caracterizado a B. bassiana con los siguientes
resultados: tres de los siete ISSR (Biss22, M11 y M10) amplificaron exitosamente
con el aislado B4 y para el B2 solamente amplificaron los marcadores Biss22 y
B11. Cepas de Bt se formularon con lignina, aceite de maíz, harina de maíz
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nixtamalizado y sales minerales, utilizando como ingrediente activo esporas y
micelio, sometiéndose a un proceso de secado por aspersión para obtener un
insecticida microencapsulado. A estos formulados se les determinaron diversos
parámetros como rendimiento de esporas, humedad, estabilidad a temperatura
ambiente y en refrigeración, porcentaje de germinación y patogenicidad causada a
larvas de gusano del fruto, soldado, paratrioza y mosquita blanca. Todos los
formulados presentaron pérdida en el número y viabilidad de las esporas, de 98%
inical-86% final. La humedad de los microencapsulados fue del 10% -40%. El
formulado a base de B. bassiana tuvo mejor viabilidad de esporas (90% ). En los
bioensayos con dieta natural se utilizó una temperatura de 26°C y una humedad
relativa del 80%. La mortalidad máxima en larvas neonatas de gusano soldado y
del fruto fue del 80%-90% y en mosquita blanca del 60% utilizando
microencapsulados elaborados con los tres hongos, hubo diferencia significativa
de la mortalidad (p,0.5) en los formulados elaborados con esporas y blastosporas-
micelio de los bioinsecticidas. Los resultados en campo indican que el mejor
microencapsulado a base de B. bassiana tuvo mejores resultados que el control,
aunque fue ligeramente menor al uso del hongo en fresco, esto respecto al
porcentaje de frutos dañados (5%). Sin embargo se observó una mortalidad de
larvas del gusano del fruto mayor al 70%.
INTRODUCCIÓN
En los procesos industriales donde intervienen microorganismos es necesario
previamente hacer investigaciones a nivel de laboratorio y de planta piloto (García
y Medrano 2006). En estos se obtiene información sobre los requerimientos de
transferencia de momento, masa y calor, para que los microorganismos produzcan
los metabolitos de interés a máxima velocidad, reflejándose en alta productividad y
por lo tanto en menores costos de inversión y operación del biorreactor y en
consecuencia de todo el proceso.
Cuando se pasa de laboratorio a una escala mayor ocurre la disminución de la
productividad y/o rendimientos. Esta situación no es deseable, por lo que se tiene
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que investigar cuales son las constantes cinéticas y coeficientes de rendimiento de
los microorganismos en determinadas condiciones de cultivo, y en particular las
condiciones de mezclado, transferencia de oxígeno y calor; para tratar de
reproducirlas en escala mayor; y así garantizar que al menos en escala mayor se
obtenga productividad aceptable y coeficientes de rendimiento semejantes a las
obtenidas en menor escala.
Las estrategias de escalamiento se basan en determinar cuál es el factor más
importante que influye sobre la productividad. A este factor se le denomina criterio
de escalamiento. Los criterios más usuales son la potencia consumida por unidad
de volumen y el coeficiente volumétrico de transferencia de oxígeno (Rocha-
Valadez y col., 2006). Entonces habrá que encontrar los valores del criterio de
escalamiento para los que ya no hay un cambio importante en el valor de la
productividad. Al intervalo donde ya no hay un efecto sobre la productividad se le
llama zona de escalamiento (Yuh-Lih y Wen-Teng, 2002).
Las plagas agrícolas han sido controladas durante años mediante el empleo de
plaguicidas químicos que tienen un fuerte impacto negativo sobre los organismos
benéficos presentes en el ambiente y diversos problemas de salud en humanos.
La finalidad de diseñar y evaluar bioinsecticidas micro y nanoencapsulados a base
de hongos y bacterias entomopatógenas para el control de plagas en el cultivo de
tomate, permite tener formulaciones eficaces y estables para su aplicación en
campo en programas de control biológico, las esporas son las unidades infectivas
y la dormancia es la clave para prolongar su sobrevivencia o detener la
germinación reduciendo su metabolismo tanto como sea posible, una posibilidad
para lograr esto es la deshidratación de las mismas, utilizando un proceso de
secado por aspersión, y aprovechar esta tecnología para su formulación
(Horaczek and Viernstein, 2004).
Al respecto, Castrejón-Ayala (2013) elaboraron un bioinsecticida
microencapsulado a partir del hongo entomopatógeno Beauveria bassiana Mulsant
para el control del picudo del nopal Metamasius spinolae, obteniendo una
mortalidad del 31.1%, a una concentración de 1.58x1012 esporas viables.
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En relación a la microencapsulación de Bacillus thuringiensis Berlinier se han
utilizado diferentes materiales encapsulantes, como la maltodextrina (5%), con
altos niveles de toxicidad; sin embargo después del proceso de secado por
aspersión se degrada rápidamente debido a la calidad del producto, por lo que es
recomendable utilizar materiales que permitan mantener la viabilidad de las
esporas y su persistencia a la lluvia y a la luz solar, una vez que son aplicadas
(Nafari, 2012).
Namasivayam et al. (2013) diseñaron diferentes nano bioinsecticidas a base del
hongo entomopatógeno Nomurea rileyi (Farlow) Samson, aislado en la India,
utilizando quitosano cubierto con cobre y plata, como materiales encapsulantes,
para evaluar su toxicidad y el desarrollo del hongo, logrando tamaños de partícula
de 3-5 nm.
Por esta razón, el desarrollo de bioinsecticidas microencapsulados a base de
bacterias y hongos utilizando esta tecnología (microencapsulación) permite
obtener productos para el control de plagas de diferentes cultivos, donde también
se requiere realizar pruebas de validación de estos productos a nivel de
laboratorio y campo para demostrar su eficacia en el control de las diferentes
plagas.
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Módulo I. “Caracterización molecular de hongos y bacterias
entomopatógenos, e identificación de genes implicados en su patogenicidad
y virulencia”.
1. Objetivo y metas cumplidas
Caracterización molecular de cepas de hongos y bacterias entomopatógenos, e
identificación de genes involucrados en su patogenicidad y virulencia. En esta
primera etapa se han adquirido los reactivos y servicios necesarios para cumplir
con el objetivo propuesto. Para el estudio del hongo entomopatógeno Beauveria
bassiana se están siguiendo dos estrategias:
(1) evaluación de la diversidad genética de aislados de B. bassiana y (2) estudio
de su patogenicidad por medio de la determinación de una serie de genes
relacionados con virulencia y/o patogenicidad del hongo.
Entre los ensayos moleculares usados para evaluar la diversidad genética, los
marcadores basados en PCR, como los marcadores ISSR (inter-simple sequence
repeat) son muy efectivos; en particular porque amplifican múltiples alelos a lo
largo de todo el genoma usando oligonucleótidos compuestos de una secuencia
repetida con un ancla de 2 a 4 nucleótidos al azar al inicio., determinando los
genes que pueden estar involucrados en la patogenicidad de los aislados de
Beauveria bassiana.
2. Materiales y métodos
Para extraer DNA, 100 mg de micelio fresco de los aislados fue homogeneizado
en fresco en presencia del amortiguador DNAzol (Invitrogen) de acuerdo al
protocolo reportado por el fabricante. La calidad del DNA fue confirmada por
medio de electroforesis en gel de agarosa al 1% y las concentraciones fueron
determinadas por espectrometría empleando el equipo Nanodrop. La
concentración del DNA resultante fue ajustado a 50 ng/ul para la amplificación por
PCR.
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Siete oligonucleótidos ISSR fueron seleccionados como panel para análisis de
diversidad genética. Estos oligonucleótidos (Tabla 1), han sido empleados
previamente y resultado muy informativos en estudios de diversidad de B.
bassiana y han encontrado entre 3 a 12 bandas polimórficas en estudios genéticos
de aislados de esta especie del mismo hospedero (Wang et al., 2013).
TABLA 1. Oligonucleótidos empleados para amplificar los ISSR en los aislados
entomopatogénicos de B. bassiana. Se muestran la secuencia y el número de bandas
polimorficas reportadas en estudios de diversidad previos con colecciones de aislados de
esta misma especie.
IDENTIFICADOR
SECUENCIA BANDAS POLIMORFICA
S REPORTADAS
REFERENCIA
M1 TGTGTGTGTGTGTGTGGT 3 Wang etal 2013
M2 AGAGAGAGAGAGAGAGCT
7 Wang etal 2013
M8 ACACACACACACACACT 7 Wang etal 2013
M10 GTCGTCGTCGTCGTCGTC 7 Wang etal 2013
M11 GAGGAGGAGGAGGC 4 Wang etal 2013
M17 TAGACAACAACAACAACA 5 Wang etal 2013
BIS22 GTGGTGGTGGTGGTGGTG
12 Wang etal 2005
La amplificación por PCR fue llevada a cabo en un volumen de 25 ul conteniendo
2.5 ul de amortiguador 10X, 2 ul de MgSO4 25mM, 1 ul de dNTPs 2.5mM, 1.25
unidades de Taq DNA polimerasa (Invitrogen), 1 ul de cada primer (20uM) y 100
ng de DNA como templado. El programa de amplificación fue de la siguiente
forma: Desnaturalización inicial por 2 min a 94C, seguido por 35 ciclos de
amplificación compuesto de 30 segundos de desnaturalización a 94C, alineación
de cada oligonucleótido por un minuto con temperatura de acuerdo a su Tm (47-
55C), extensión a 68C por 1.5 minuto y una amplificación final a 68C por 10
minutos. Los productos de PCR fueron revelados por electroforesis en agarosa al
2% y visualizados en fotodocumentador con luz UV.
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En cuanto al estudio de la patogenicidad y virulencia, se determinó que al menos
13 genes que codifican para quitinasas pueden estar relacionados con la
patogenicidad y/o virulencia del hongo. Estas secuencias incluyen:
class V chitinase, putative
chitinase A1
chitinase 18-11
chitinase 18-3
chitinase 18-4
symbiotic chitinase
acidic chitinase
class V chitinase Chi100
chitinase-like protein
Chitinase II
class III chitinase
bacteriodes thetaiotaomicron symbiotic chitinase
putative endochitinase
chitinase-like protein
protein=endo-N-acetyl-beta-D-glucosaminidase precursor
Los oligonucleótidos que amplifican estos genes ya han sido sintetizados y se está
trabajando en su determinación en el genoma del hongo.
3. Resultados
Al momento se realizó extracción de DNA genómico a partir de micelio fresco, sin
embargo la extracción de DNA no tuvo el rendimiento esperado sin embargo fue
posible obtener DNA de dos de los cinco aislados para pruebas posteriores de
PCR. De acuerdo a otros reportes de extracción de DNA de Beauveria, la
extracción a partir de micelio liofilizado a resultado muy eficiente por lo que el
siguiente paso será aislar DNA a partir de tejido con este tratamiento.
Del DNA de los aislados B4 y B2, que se obtuvo DNA, se llevó a cabo una
amplificación de DNA con los siete ISSR para evaluar si son informativos y
presentan bandas polimórficas. La Figura 1 muestra los resultados de esta
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amplificación y se revela que tres de los siete ISSR (Biss22, M11 y M10)
amplificaron exitosamente con el aislado B4 y para el B2 solamente amplificaron
los marcadores Biss22 y B11.
FIGURA 1. Visualización de productos de PCR amplificados con 5 marcadores ISSR
(Biss22, M17, M11, M10 y M8) utilizando DNA genómico de los aislados B2 y B4
de Beauveria bassiana) para identificar marcadores que puedan ser informativos
para los aislados en estudio. Electroforesis en gel de agarosa al 2% con
amortiguador TBE 0.5X por 1h a 90 Volts.
Los oligonucleótidos que amplifican los genes de quitinasas ya han sido
sintetizados y se está trabajando en su determinación en el genoma del hongo.
4. Conclusiones e impacto de la investigación
Los resultados preliminares implican que los ISSR Biss22, M11 y M10 son
potencialmente útiles para caracterizar molecularmente los aislados y aún no se
descarta que el resto de los ISSR sean útiles e informativos también. Se
procederá a extraer DNA a partir de micelio liofilizado o bien con alguna técnica
alternativa que permita hacer más eficiente la extracción. En este mismo sentido
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se procederá a optimizar los PCRs con cada ISSR informativo para diferenciar
cada banda polimórfica.
Los oligonucleótidos que amplifican secuencias de quitinasas están siendo
evaluados y se espera que algunos de ellos arrojen información relevante sobre su
función en la patogenicidad y virulencia del hongo.
5. Bibliografía.
Aquino de Muro M, Sarah Elliott, David Moore, Bruce L. Parker, Margaret
Skinner, William Reid y Mustapha El Bouhssini (2005). Molecular
characterisation of Beauveria bassiana isolates obtained from
overwintering sites of Sunn Pests (Eurygaster and Aelia species). Mycol.
Res. 109 (3): 294-306.
Emma L. Ormond, Alison P.M. Thomas, Philip J.A. Pugh, Judith K. Pell y
Helen E. Roy (2010). A fungal pathogen in time and space: the population
dynamics of Beauveria bassiana in a conifer forest. FEMS Microbiol Ecol
74: 146–154.
Estrada M. Elena, Manuel V. Camacho y C. Benito (2007). The molecular
diversity of different isolates of Beauveria bassiana (BALS.) VUILL. As
assessed using intermicrosatellites (ISSRS). Cellular & Molecular Biology
Letters 12: 240-252.
Wang S, Xuexia Miao, Weiguo Zhao, Bo Huang, Meizhen Fan, Zengzhi Li y
Yongping Huang (2005). Genetic diversity and population structure
among strains of the entomopathogenic fungus, Beauveria bassiana, as
revealed by inter-simple sequence repeats (ISSR). Mycol. Res. 109 (12):
1364–1372.
Wang Jing-jie, Li Yang, Xin Qiu, Yong-gui Liu, Wei Zhou, Yong-Ji Wan (2013).
Diversity analysis of Beauveria bassiana isolated from infected silkworm in
southwest China based on molecular data and morphological features of
colony. World J. Microbiol. Biotechnol. 29:1263-1269.
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Módulo II. “Escalamiento de procesos de producción de hongos y bacterias
entomopatógenas”.
1. Objetivo y metas cumplidas
Escalar los procesos de producción de los hongos Beauveria bassiana,
Metarhizium anisopliae, Isaria fumosorosea y de la bacteria Bacillus thuringiensis.
Obtener metabolitos y toxinas con actividad insecticida sobre insectos plaga del
tomate.
Las metas cumplidas son las propuestas en el protocolo 2013 de este proyecto,
las cuales corresponden al primer año de realización del mismo. Estas metas se
describen en la sección de resultados y discusión, correspondiendo principalmente
a B. thuringiensis y B. bassiana.
2. Materiales y métodos
Cepas del hongo entomopatógeno B. bassiana BbPM y de la bacteria B.
thuringiensis, proporcionadas por el CIIDIR Sinaloa.
Formulación del medio de cultivo para el hongo B. bassiana: 14.5 mL/L de melaza,
6 g/L de (NH4)2SO4, 3.5 g/L de KH2PO4, 0.5 g/L de MgSO4, 0.1 g/L de NaCl y 0.1
g/L de CaCl2.
Las condiciones de cultivo fueron pH de 5.4 y temperatura de 28oC.
Formulación del medio de cultivo para la bacteria B. thuringiensis: 10 g/L de
glucosa, 0.86 g/L extracto de levadura, 1.82 g/L de (NH4)2SO4, 0.8 g/L de KH2PO4,
0.5 g/L de NaCl.
Las condiciones de cultivo fueron pH de 7 y temperatura de 30oC.
Equipo utilizado:
Biorreactores y condiciones de operación:
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Biorreactor de tanque agitado de 0.5 L. 400 y 700 rpm; 0.5 y 1 vvm.
Biorreactor de tanque agitado de 5 L. 400 y 700 rpm; 0.5 y 1 vvm.
Métodos analíticos
Determinación de viscosidad con el viscosímetro Haake modelo RV20 con control
de temperatura (Nuñez y col., 2001).
Determinación de velocidad de corte en matraz de acuerdo a Fujita y col. (1994) y
en biorreactor de tanque agitado de acuerdo a Sánchez y col. (2006).
Determinación de consumo de potencia, de acuerdo a Aiba y col. (1973).
Determinación del número de esporas, empleando cámara de Neubauer.
Determinación de azúcares reductores, por el método del DNS.
Determinación de biomasa, por peso seco.
3. Resultados y discusión.
Meta 1. Constantes cinéticas de los hongos y bacterias entomopatógenas.
Actividades:
Obtención de información sobre los antecedentes relacionados con el cultivo de la
bacteria y los hongos entomopatógenos.
La bacteria B. thuringiensis se produce principalmente a nivel industrial por
compañías transnacionales y existen muchos reportes de su cultivo sobre estudios
realizados para optimizar su producción. Sin embargo, esos estudios se realizan
usando materias primas de producción regional, como suero de leche, melazas e
incluso aguas residuales de la industria cervecera, así como cepas de B.
thuringiensis nativas de esas regiones.
En la literatura se ha reportado una velocidad específica de crecimiento de 0.65 h-1
(González y col., 2011), sin mencionar las condiciones en las que lo lograron.
También se ha reportado una concentración de 5 x 109 esporas /mL en
biorreactores de 1100 L (Razo y col., 1997), que es de los mayores volúmenes
que se han empleado. Sin embargo, a nivel industrial es posible que la producción
se realice en biorreactores de mayor tamaño.
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Con respecto al hongo B. bassiana se han reportado concentraciones hasta de 1.2
x 109 esporas/mL, en un biorreactor de tanque agitado de 7 L, equipado con una
turbina Rushton y una propela Maxflo (Aquiles y col., 2006).
Meta 2. Estrategia de preparación de inóculos.
Actividades:
Establecimiento de los programa de preparación de inoculo de la bacteria y de los
hongos entomopatógenos.
Para la bacteria Baciluus thuringuiensis
La preparación de inoculo se realizó a partir de cepas crecidas en medio de agar
nutritivo en tubo inclinado. 5 mL de medio de cultivo estéril se agregaron al tubo y
se agitó en vortex para formar una suspensión celular, la cual se usó para inocular
un matraz Erlenmeyer de 250 mL, conteniendo 45 mL de medio de cultivo estéril a
pH de 7.0. El cultivo se incubó a 30 °C durante 24 h a 200 rpm. Los 50 mL de
cultivo se utilizaron para inocular el biorreactor de 0.5 L y el cultivo se realizó a pH
7, 30 °C, variando las condiciones de agitación y aireación. Al final, éste cultivo
sirvió para inocular el biorreactor de 5 L, operándolo a pH 7, 30 °C y variando las
condiciones de agitación y aireación.
Para el hongo Beauveria bassiana.
La preparación de inoculo se realizó a partir de cepas crecidas durante 20 días en
medio PDA en tubo inclinado. 5 mL de una solución isotónica con Tween 80 al 1%
se agregaron al tubo y se agitó en vortex para formar una suspensión celular, la
cual se usó para inocular un matraz Erlenmeyer de 250 mL, conteniendo 45 mL de
medio de cultivo estéril a pH de 5.4. El cultivo se incubó a 28 °C durante 4 días a
130 rpm. Los 50 mL de cultivo se utilizaron para inocular el biorreactor de 0.5 L y
el cultivo se realizó a pH 5.4, 28 °C, variando las condiciones de agitación y
aireación. Al final, éste cultivo sirvió para inocular el biorreactor de 5 L, operándolo
a pH 5.4, 28 °C y variando las condiciones de agitación y aireación.
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Meta 3. Constantes cinéticas de los microorganismos a nivel de matraz.
Actividades:
Determinación de cinéticas de crecimiento y producción en el cultivo de la bacteria
y de los hongos en matraz, empleando reactivos grado técnico.
Para la bacteria B. thuringiensis se presenta la figura 1, que muestra la cinética de
crecimiento y producción de esporas creciendo en glucosa a nivel de matraz. Las
constantes cinéticas fueron: velocidad específica máxima de crecimiento de 0.38
h-1 y productividad global de 7.3 x 108 esporas/L h.
Figura 1. Cinética de crecimiento de Bacillus thuringiensis en matraz. Peso seco
(□), glucosa (∆) y esporas/mL (●).
Para el hongo B. bassiana se presenta la figura 2, que muestra la cinética de
crecimiento y producción de esporas creciendo en melaza a nivel de matraz. Las
constantes cinéticas fueron: velocidad específica máxima de crecimiento de 0.040
h-1 y productividad global de 1.79 x 109 esporas/L h.
0.00E+00
5.00E+06
1.00E+07
1.50E+07
2.00E+07
2.50E+07
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
0 10 20 30 40E
spo
ras/
mL
Pes
o s
eco
(g
/L),
Glu
cosa
(g
/L)
Tiempo (h)
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Figura 2. Cinética de crecimiento de Beauveria bassiana en matraz. Peso seco
(□), azúcares reductores (∆) y esporas/mL (●).
Meta 4. Constantes cinéticas de los microorganismos usando inductores a
nivel de matraz.
Actividades:
Estudiar el efecto de inductores sobre la productividad del cultivo de los hongos en
matraz.
Para la bacteria B. thuringiensis se presenta la figura 3, que muestra la cinética de
crecimiento y producción de esporas creciendo en melaza y usando quitina como
inductor a nivel de matraz. Las constantes cinéticas fueron: velocidad específica
máxima de crecimiento de 0.248 h-1 y productividad global de 8.3 x 108 esporas/L
h
El uso de quitina en el medio de cultivo, provocó la disminución (30%) de la
velocidad de crecimiento máxima y aumentó (10%) la productividad de esporas,
comprobando el efecto inductor de la quitina en la producción de esporas.
0.00E+00
5.00E+07
1.00E+08
1.50E+08
2.00E+08
0.000
1.000
2.000
3.000
4.000
5.000
6.000
7.000
0 50 100 150
Esp
ora
s/m
L
Bio
ma
sa (
g/L
), A
zúca
res
red
uct
ore
s (g
/L)
Tiempo (h)
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Figura 3. Cinética de crecimiento de Bacillus thuringiensis utilizando quitina al 1%
en matraz. Peso seco (□), glucosa (∆) y esporas/mL (●).
Para el hongo B. bassiana se presenta la figura 4, que muestra la cinética de
crecimiento y producción de esporas creciendo en melaza y usando quitina como
inductor a nivel de matraz. Las constantes cinéticas fueron: velocidad específica
máxima de crecimiento de 0.036 h-1 y productividad global de 1.85 x 109 esporas/L
h.
Figura 4. Cinética de crecimiento de Beauveria bassiana utilizando un inductor
(quitina al 1%) en matraz. Peso seco (□), glucosa (∆) y esporas/mL (●).
0.00E+00
5.00E+06
1.00E+07
1.50E+07
2.00E+07
2.50E+07
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
0 5 10 15 20 25 30
Esp
ora
s/m
L
Pes
o s
eco
(g
/L),
Glu
cosa
(g
/L)
Tiempo (h)
0.00E+00
5.00E+07
1.00E+08
1.50E+08
2.00E+08
0
1
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5
6
7
0 20 40 60 80 100
Esp
ora
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L
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ma
sa (
g/L
), A
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res
red
uct
ore
s (g
/L)
Tiempo (h)
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El empleo de quitina como un ingrediente del medio de cultivo, ocasionó una
disminución (10%) de la velocidad de crecimiento máxima y un aumento (3%) en
la productividad de esporas. En efecto, son valores mínimos que no muestran
claramente un efecto inductor de la quitina sobre la producción de esporas.
Meta 5. Parámetros de hidrodinámica y de transferencia de oxígeno en
biorreactor de 0.5 L.
Actividades:
Estudio de reología, parámetros hidrodinámicos, de transferencia de oxígeno y
consumo de potencia en el cultivo de la bacteria y de los hongos en biorreactor de
0.5 L. Determinar productividades y rendimientos.
El comportamiento reológico del cultivo de B. thuringiensis obtenido al final de la
fermentación, se presenta en la figura 5. En efecto, el caldo de cultivo conteniendo
células, cristal y esporas, se comporta como un líquido Newtoniano.
Figura 5. Comportamiento reológico del cultivo de Bacillus thuringiensis (o) y del
cultivo de Beauveria bassiana obtenidos en biorreactor de 0.5 L (□).
y = 0.0012x - 0.0797R² = 0.9976
y = 0.0014x - 0.2779R² = 0.992
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
0 500 1000 1500 2000
Esf
uer
zo d
e co
rte
(Pa)
Velocidad de corte (1/s)
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El comportamiento reológico del cultivo de B. bassiana obtenido al final de la
fermentación, se presenta en la figura 5. En efecto, el caldo de cultivo conteniendo
células se comporta como un líquido Newtoniano.
Debido a que el comportamiento reológico de ambos caldos de cultivo al final de la
fermentación son Newtonianos, se puede considerar que los parámetros
hidrodinámicos, de transferencia de oxígeno y consumo de potencia, son
semejantes a los que se obtuvieron en el biorreactor empleando agua y que se
presentan en las tablas 1 y 2, junto con las productividades de los cultivos de B.
thuringiensis y B. bassiana, respectivamente.
Tabla 1. Parámetros hidrodinámicos, de transferencia de oxígeno y consumo de
potencia en el cultivo de Bacillus thuringiensis en biorreactor de 0.5 L.
Velocidad
de
agitación
(rpn)
Velocidad
de
aireación
(vvm)
Velocidad
de corte
(s-1)
Coeficiente
volumétrico
de
transferencia
de oxígeno
(h-1)
Consumo
de
potencia
(W/L)
Productividad
(Esporas/Lh)
400
0.5 270 23 0,23 1.5 x 108
400 1.0 260 30 0,21 2.3 x 108
700 0.5 635 158 1,32 6.9 x 108
700 1.0 603 170 1,21 7.3 x 108
Tabla 2. Parámetros hidrodinámicos, de transferencia de oxígeno y consumo de
potencia en el cultivo de Beauveria bassiana en biorreactor de 0.5 L.
Velocidad
de
agitación
(rpm)
Velocidad
de
aireación
(vvm)
Velocidad
de corte
(s-1)
Coeficiente
volumétrico
de
transferencia
de oxígeno
(h-1)
Consumo
de
potencia
(W/L)
Productividad
(Esporas/Lh)
400 0.5 270 23 0,23 2.3 x 109
400 1.0 260 30 0,21 1.2 x 109
700 0.5 635 158 1,32 2.7 x 109
700 1.0 603 170 1,21 3.3 x 109
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Meta 6. Criterio y zona de escalamiento para biorreactor de 5 L.
Actividades:
Desarrollo de la estrategia de escalamiento de biorreactor de 0.5 L a biorreactor
de 5 L. Diseño de experimentos.
A partir de la información obtenida en los experimentos realizados en biorreactores
de 0.5 L, con respecto a la productividad alcanzada en función del coeficiente
volumétrico de transferencia de oxígeno, se estableció la zona efectiva de
escalamiento.
Para la bacteria B. thuringiensis el factor más importante a considerar como factor
de escalamiento es el coeficiente volumétrico de transferencia de oxígeno, que
debe ser mayor a 150 h-1 para que la productividad de formación de esporas sea
mayor a 6 x 108 esporas/Lh, tal y como se muestra en la tabla 3.
Para el hongo B. bassiana, el factor más importante a considerar como factor de
escalamiento no es el coeficiente volumétrico de transferencia de oxígeno ni el
consumo de potencia, tal y como se muestra en la tabla 4. Al parecer, es posible
emplear un bajo coeficiente volumétrico de transferencia de oxígeno, del orden de
23 h-1; y potencias bajas, del orden de 0.21 W/L, para obtener la misma
productividad de esporas que la obtenida a mayores coeficientes volumétricos de
oxígeno y mayores potencias.
Meta 7. Parámetros de hidrodinámica y de transferencia de oxígeno en
biorreactor de 5 L.
Actividades:
Caracterización cinética, reológica, hidrodinámica, de transferencia de oxígeno y
consumo de potencia en los cultivos de la bacteria y de los hongos en biorreactor
de 5 L. Evaluación de productividades y rendimientos.
La cinética de crecimiento de B. thuringiensis realizada en biorreactor de 5 L,
produjo una velocidad específica máxima de crecimiento de 0.40 h-1 y una
PROYECTO MULTIDISCIPLINARIO: 1539 Página 20
productividad global de 8.9 x 108 esporas/L h. Estos dos parámetros son mayores
que los encontrados en el biorreactor de 0.5 L; la razón de este hecho es
principalmente que en el biorreactor de 5 L el coeficiente volumétrico de
transferencia de oxígeno y la potencia por unidad de volumen son mayores que
los que hubo en el biorreactor de 0.5 L.
En la cinética de crecimiento de B. bassiana en biorreactor de 5 L resultaron con
una velocidad específica máxima de crecimiento de 0.039 h-1 y una productividad
de 1.85 x 109 esporas/L h. Estos dos parámetros son semejantes a los
encontrados en el biorreactor de 0.5 L. En efecto, al parecer no hay un efecto
significativo del coeficiente volumétrico de transferencia de oxígeno, ni de la
potencia consumida por unidad de volumen, sobre la productividad de formación
de esporas.
Con respecto al comportamiento reológico del cultivo de B. thuringiensis obtenido
al final de la fermentación en biorreactor de 5 L, se tuvo que el caldo de cultivo
conteniendo células, cristal y esporas, se comporta como un líquido Newtoniano.
De la misma manera, el comportamiento reológico del cultivo de B. bassiana
obtenido al final de la fermentación, fue el de un líquido Newtoniano.
Los parámetros hidrodinámicos, de transferencia de masa y de consumo de
potencia se presentan en las tablas 3 y 4. Debido a que el comportamiento
reológico de ambos caldos de cultivo al final de la fermentación son Newtonianos,
se puede considerar que los parámetros hidrodinámicos, de transferencia de
oxígeno y consumo de potencia, son semejantes a los que se obtuvieron en el
biorreactor empleando agua y que se presentan en las tablas 3 y 4, junto con las
productividades de los cultivos de B. thuringiensis y B. bassiana, respectivamente.
Tabla 3. Parámetros hidrodinámicos, de transferencia de oxígeno y consumo de
potencia en el cultivo de Bacillus thuringiensis en biorreactor de 5 L.
Velocidad Velocidad Velocidad Coeficiente Consumo Productividad
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de
agitación
de
aireación
de corte volumétrico
de
transferencia
de oxígeno
de
potencia
Esporas/Lh
400 0.5 503 39 0.22 5.5 x 108
400 1.0 477 50 0.21 6.0 x 108
700 0.5 1165 210 1.52 7.9 x 108
700 1.0 1105 240 1.36 8.9 x 108
Tabla 4. Parámetros hidrodinámicos, de transferencia de oxígeno y consumo de
potencia en el cultivo de Beauveria bassiana en biorreactor de 5 L.
Velocidad
de
agitación
Velocidad
de
aireación
Velocidad
de corte
Coeficiente
volumétrico
de
transferencia
de oxígeno
Consumo
de
potencia
Productividad
Esporas/Lh
400 0.5 503 39 0.22 2.9 x 109
400 1.0 477 50 0.21 1.0 x 109
700 0.5 1165 210 1.52 2.2 x 109
700 1.0 1105 240 1.36 3.6 x 109
Los resultados de la tabla 3 demuestran que en efecto, la productividad de
esporas de B thuringiensis aumenta al aumentar el coeficiente volumétrico de
transferencia de oxígeno. Este comportamiento ya se había observado en el
cultivo de B. thuringiensis en el biorreactor de 0.5 L; por lo cual, para alcanzar
productividades del orden de 8.9 x 108 esporas/L h, es necesario que el
biorreactor provea de un coeficiente volumétrico de transferencia de oxígeno del
orden de 240 h-1. Este hecho concuerda con la literatura, pues el cultivo de B.
thuringiensis es un proceso altamente demandante de oxígeno.
PROYECTO MULTIDISCIPLINARIO: 1539 Página 22
Los resultados de la tabla 4 confirman lo observado en el biorreactor de 0.5 L, que
la productividad de esporas de B. bassiana no depende del coeficiente volumétrico
de transferencia de oxígeno. Estos resultados denotan que la zona de
escalamiento para el proceso de producción de esporas de B. bassiana es muy
amplia, de manera que aún a bajos coeficientes volumétricos de transferencia de
oxígeno (39 h-1) y vahos valores de consumo de potencia (0.21 W/L), la
productividades obtenidas son semejantes a las obtenidas a mayores coeficiente
volumétricos de transferencia de oxígeno (ver tabla 6).
4. Conclusiones e impacto de la investigación
La mayor velocidad específica máxima de crecimiento y la mayor productividad de
esporas de B. thuringiensis se obtuvieron en el biorreactor de 5 L, donde hubo
mayores coeficientes volumétricos de transferencia de oxígeno y potencia por
unidad de volumen que en el biorreactor de 0.5 L. Para tener una productividad de
8.9 x 108 esporas/L h, el cultivo debe ser realizado en un biorreactor que
proporcione un coeficiente volumétrico de transferencia de oxígeno de 240 h-1 y
una potencia por unidad de volumen de 1.36 W/L
La velocidad específica máxima de crecimiento y la mayor productividad de
esporas de B. bassiana, al parecer no dependen del coeficiente volumétrico de
transferencia de oxígeno ni del consumo de potencia, pues en los intervalos de
dicho coeficiente de 23 h-1 a 240 h-1; y de 0.21 W/L a 1.21 W/L, la productividad
estuvo en el intervalo de 1 a 3.6 x 109 esporas/L h.
El comportamiento reológico de los cultivos de B thuringiensis y B bassiana fue de
tipo Newtoniano; situación que permite la aplicación de ecuaciones considerando
propiedades físicas del agua y favorece trasladar los resultados a varias escalas
de producción.
Impacto de la investigación
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Los resultados de este proyecto son la base para el desarrollo de procesos
industriales de producción de 2 bioinsecticidas, que al estar en un solo producto
confieren un espectro de acción sobre un mayor número y tipo de plagas de
cultivos de importancia económica, como por ejemplo el cultivo de tomate en el
Estado de Sinaloa.
En este proyecto se realizaron cultivos del hongo B. bassiana y de la bacteria B.
thuringiensis empleando materias primas baratas y se encontraron las condiciones
de operación de los biorreactores, con los que sus costos de operación son los
más bajos, en la obtención de los bioinsecticidas. Entonces, a menores costos de
producción, menores precios de venta y mayores las posibilidades para que los
productores los puedan emplear, minimizando el uso de insecticidas químicos y
los daños que esto ocasiona.
5. Bibliografía.
Aiba S, Humphrey AE, Millis NF (1973) Biochemical engineering. Academic
Press. New York and London
Aquiles S. S., C. García Gutiérrez, B. González Maldonado, H. Medrano
Roldán, L. G. Galán Wong. 2006. Toxicidad de blastosporas de Beauveria
bassiana contra palomilla del manzano. Folia Entomológica Mexicana.
Año/Vol 45, número 002, pp 195-200.
Fujita M, Iwahort K, Tatsuta S, Yamakawa K (1994). Analysis of pellet formation
of Aspergillus niger based on shear stress. J Ferment Bioeng 78: 368–373
García C, Medrano H. Biotecnología financiera aplicada a bioplaguicidas. IPN-
ITD. México, 2006.
González A., Restrepo A., Ordúz S. (2011) Esclamiento para la producción de un
biopesticida a partir de B. thuringiensis subsp. Israelensis en biorreactores
de 20 y 200 L. Iatreia 13: 2-8.
Núñez S. M. del C., Méndez M. M. G. del C., Solorza F. J. Introducción a la
Reología. Instituto Politécnico Nacional, 2001 ISN: 970-18-7223-1.
Razo E, Perez F, De La Torre M (1997) Scale-Up of Bacillus thuringiensis.
Fermentation Based on Oxygen Transfer. Journal of Fermentation and
Bioengineering 6: 561-564.
Rocha-Valadez JA, Estrada M, Galindo E, Serrano-Carreon L (2006) From
shake flasks to stirred fermentors: Scale-up of an extractive fermentation
process for 6-pentyl-a-pyrone production by Trichoderma harzianum using
volumetric power input. Process Biochemistry 41: 1347–1352.
PROYECTO MULTIDISCIPLINARIO: 1539 Página 24
Sánchez JA, Rodríguez-Porcel EM, Casas-López JL, Fernández-Sevilla JM,
Chisti Y (2006) Shear rate in stirred tank and bubble column bioreactors.
Chem Eng J 124: 1-5.
Yuh-Lih H, Wen-Teng W (2002). A novel approach for scaling-up a fermentation
system. Biochemical Engineering Journal 11: 123–130.
PROYECTO MULTIDISCIPLINARIO: 1539 Página 25
Módulo III. “Diseño y evaluación de bioinsecticidas micro y
nanoencapsuladas para el control de plagas del tomate en Sinaloa”.
1. Objetivo y metas cumplidas
Diseñar y evaluar la patogenicidad, persistencia y residualidad de nuevas
formulaciones nano y microencapsuladas a base dos hongos y bacterias
entomopatógenas contra las principales plagas del tomate.
1. Aislamiento y conservación de cepas de hongos entomopatógenos
2. Aislamiento y conservación de cepas de Bt
3. Cría de insectos
4. Establecimiento de las crías en laboratorio
5. Producción de hongos y bacterias
6. Diseño de formulaciones de HE
7. Diseño de formulaciones de Bt
8. Evaluación de formulados de HE
9. Evaluación de formulados de Bt
2. Materiales y métodos
META 1. AISLAMIENTO Y CONSERVACIÓN DE CEPAS DE HONGOS
ENTOMOPATÓGENOS
Aislamiento, propagación y conservación de cepas de Bb, Ma e If
Se colectaron muestras de suelo en 5 municipios de la zona Norte del Estado de
Sinaloa (5 puntos por cada municipio, 25 sitios en total): Choix, Ahome, El Fuerte,
Guasave y Sinaloa de Leyva (Cuadro 1). El aislamiento de los hongos
entomopatógenos se realizó utilizando un medio selectivo para Beauveria
bassiana, Metarhizium anisopliae e Isaria fumosorosea a base de cloruro de cobre,
cristal violeta y benzoato de sodio, a diferentes concentraciones (Ruelas y García,
2010).
La identificación se llevó a cabo de acuerdo a las características morfológicas de
los hongos, especialmente las estructuras de reproducción de acuerdo a las claves
PROYECTO MULTIDISCIPLINARIO: 1539 Página 26
taxonómicas de Humber (1997). Los aislamientos fueron conservados por
triplicado en crioviales con medio de cultivo LB y 15% de crioprotector
almacenándose en un ultracongelador a –70° C. Además, se realizó su
identificación molecular.
META 2. AISLAMIENTO Y CONSERVACIÓN DE CEPAS DE BT
Aislamiento y conservación de cepas nativas y cepas de colección de Bt
Colecta de muestras de suelo
Se recolectaron muestras de suelo en áreas cultivadas con tomate y de áreas no
cultivadas en los mismos sitios anteriormente indicados en Sinaloa, las colectas se
realizaron semanalmente.
Se tomó 1kg de muestra de suelo de cada uno de los sitios por triplicado a una
profundidad de alrededor de 10 a 15 cm, por medio de la técnica de 5 de oros, que
consiste en tomar una cantidad de suelo de cada una de las cuatro esquinas que
conforman el terreno donde se encuentra establecido el cultivo y una del centro,
se homogenizo hasta obtener 1 Kg, en el caso de las áreas no cultivadas cercanas
al cultivo, las muestras se tomaron de los surcos de tomate que no contenían
plántulas, las muestras se colocaron en bolsas de plástico y se trasladaron al
laboratorio de biotecnología agrícola del CIIDIR-IPN Unidad Sinaloa, debidamente
etiquetadas.
En el laboratorio las bolsas se dejaron una semana al aire libre para eliminar el
contenido de humedad. Después se tamizaron para retirar piedras, terrones,
plantas, insectos o basura.
Técnica de aislamiento
Se realizaron diluciones 1:10 a partir de las muestras de suelo. Se tomó 1g de
suelo de tamaño de partícula fina. Se adiciono en 9 mL de agua destilada estéril
en un tubo de ensaye de 18x150 mm. Esta dilución 1:10 fue pasteurizada a 80 °C
durante 15 min. La muestra se sometió a un shock térmico frío, colocando los
tubos en baño de hielo durante 5 min. Posteriormente el tubo se sometió a un
nuevo proceso de pasteurización a 80 °C durante 5 min.
PROYECTO MULTIDISCIPLINARIO: 1539 Página 27
A partir de esta se realizaron diluciones seriadas tomando 1 mL de la dilución 1:10
y colocándola en un tubo con 9 mL de agua destilada estéril para de esta manera
obtener la solución 1:100 o 1x10-2, a partir de esta se repitió el procedimiento
hasta generar una dilución del suelo de 1x10-5. De las tres últimas se tomó una
alícuota de 100 µl (0.1 ml) y se pasó a una placa con agar nutritivo. La muestra se
expandió mediante un proceso de estriado en 3 cuadrantes.
Identificación macroscópica
Las placas se incubaron a 30 °C durante 24 h, y se seleccionan colonias con
características típicas de Bt (colonias color crema, con bordes redondeados, ligera
elevación cóncava). Cada colonia fue trasferida a una nueva placa, las colonias
resembradas fueron incubadas a 30 °C por espacio de 96 h, cerciorándose de
llevar a cabo el monitoreo de la aparición de las esporas y de los respectivos
cristales proteicos.
Las colonias cristalíferas fueron conservadas en tubos con agar nutritivo inclinado
e incubadas por espacio de 24 h, las cuales posteriormente se conservaron a 4
°C.
Prueba de la Catalasa
Una vez seleccionadas las colonias a resembrar, se realizó la prueba de la
catalasa adicionando una pequeña gota de H2O2 sobre la colonia original con la
finalidad de observar la efervescencia de la solución (Catalasa positiva).
Identificación microscópica
Posteriormente se seleccionan las colonias para realizarles un frotis y la tinción de
Gram, la cual permite diferenciar bacterias Gram positivas de bacterias Gram
negativas.
Frotis y tinción de Gram
Se colocó una gota de solución salina estéril en un portaobjetos, con el asa
bacteriológica estéril, se tomó un inoculo de la colonia elegida y se colocó en la
PROYECTO MULTIDISCIPLINARIO: 1539 Página 28
gota de solución salina, con el asa bacteriológica se logró esparcir a lo largo del
portaobjetos, se dejó secar al aire libre, fijando el frotis a la flama del mechero y se
tiñe de la siguiente manera: Cubrir con cristal violeta 1 min, lavar con agua
corriente, sacudir levemente para quitar el exceso de agua, cubrir con lugol un
min, lavar nuevamente, poner un instante alcohol acetona para decolorar, lavar
nuevamente, cubrir con safranina por 30 s, lavar nuevamente, dejar secar y
observar al microscopio.
META 3. CRÍA DE INSECTOS
Selección de los insectos plaga para su cría en laboratorio
Se seleccionaron las principales plagas que están ejerciendo daños de
importancia económica en tomate en Sinaloa con base a los daños observados en
los cultivos en hojas y fruto, así como en los virus y enfermedades que transmiten,
para evaluar los micro y nano encapsulados elaborados.
META 4. ESTABLECIMIENTO DE LAS CRÍAS EN LABORATORIO
Establecimiento de la cría de los cuatro insectos plaga en laboratorio
Cría de gusano del fruto Helicoverpa zea (Boddie) y gusano soldado
Heliothis virescens (Fabricius)
Se colocaron individualmente larvas neonatas de gusano del fruto y gusano
soldado en recipientes de plástico con dieta artificial (cubos de 3 cmx3 cm). Se
mantuvieron a 25 ± 2 °C y una humedad relativa (HR) entre el 30 y 50%
(Humidificador Bio-Rad).
La dieta fue elaborada siguiendo la metodología de Greene et al., (1976) con
algunas modificaciones (Gaxiola, 2012). Consiste en una mezcla de proteínas,
vitaminas, bacteriostáticos y fungistáticos (Cuadro 2).
Elaboración de la dieta:
Se disuelve el agar en 400 mL de agua destilada, la mezcla se calienta en
agitación constante durante 20 min a 95 °C y se mezcla con 300 mL de agua
destilada, la harina de maíz nixtamalizado, el germen de trigo y la levadura de
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cerveza. La mezcla se enfrió a 60 °C y se incorporará el ácido ascórbico, el ácido
sórbico, las vitaminas y el metilparabeno sódico. Previamente el ácido ascórbico,
el ácido sórbico y las vitaminas se diluyeron en 10 mL de agua, el metilparabeno
sódico se disuelve en 10 mL de alcohol. La dieta artificial se colocó en recipientes
de plástico de forma rectangular a temperatura ambiente, finalmente una vez
solidificada se corta en cubos de 1 x3 cm y se almacena a 4°C.
Las larvas de gusano del fruto y soldado se colocaron en recipientes de plástico
con dieta artificial por separado y se guardaron a 25 ± 2 °C y una HR de 30 a 50%.
Las pupas fueron transferidas a una trampa para adultos, la cual está formada por
un cubo metálico cubierto por una malla, y en el fondo se coloca arena húmeda
para mantener la HR. Los adultos se colocaron en bolsas de papel en contacto
con una solución de glucosa al 1% para su alimentación y cópula. Las pupas y los
adultos se mantienen a 25 ± 2 °C y una HR del 50-70%.
Cuadro 2. Dieta artificial para cría de larvas de H. virescens (modificada por
Greene et al., 1976)
Reactivo Cantidad
Harina de maíz nixtamalizado 120 g
Germen de trigo 55 g
Levadura de cerveza 35 g
Ester metílico de ácido 4- hidroxibenzóico
(Metilparabeno sódico)
2.2 g
Vitaminas 15 mL
Ácido ascórbico 3.5 g
Ácido sórbico 1.1 g
Agar bacteriológico 15 g
Agua destilada 700 mL
Cría de mosquita blanca (Bemisia tabaci (Genn.)
Antes del inicio de la cría de mosquita blanca, se preparan macetas con plántulas
de tomate de 15-20 cm de altura. La cría inicial se estableció colectando
PROYECTO MULTIDISCIPLINARIO: 1539 Página 30
especímenes en plantas infestadas con la especie de interés. En el laboratorio se
purifico la especie a criar al seleccionar los adultos que sirvieron para infestar las
plántulas de tomate. Las plántulas se colocaron en una jaula entomológica,
elaborada con organdí o Tricot y mantenida bajo condiciones de invernadero.
Los adultos colectados de mosquita blanca se introducen en la jaula con las
plántulas de tomate. Los adultos ovipositan en el envés de las hojas y las ninfas
recién emergidas se desplazaron unos centímetros hasta quedar en un lugar de
manera permanente. Conforme las ninfas se alimentaron y completaron su
desarrollo, apareció la nueva generación de adultos. Para continuar con la cría se
introdujeron plántulas nuevas para ser infestadas por los nuevos adultos. Se
continúa con este proceso hasta contar con la población de adultos necesarios
para el objetivo del estudio.
Cría de paratrioza (Bactericera cockerelli Sulc.)
Se prepararon plántulas de chile de 30 a 40 días de edad, las cuales se colocaron
en una jaula entomológica elaborada con tela tricot u organdí. La colecta de
adultos se realizó directamente con un aspirador sobre plantas de chile o papa
infestadas en campo. Los adultos colectados se colocaron en las jaulas con
plántulas de chile bajo condiciones de invernadero donde posteriormente
ovipositaron.
Los huevos eclosionaron a los 5 días y posteriormente las ninfas se establecieron
en el envés de las hojas y puntas de crecimiento. Los adultos emergieron a los 20-
25 días posterior a la oviposición. Con la aparición de la nueva generación de
adultos se colocan nuevas plántulas de chile para repetir el ciclo del insecto hasta
contar con los especímenes necesarios para los bioensayos.
Todos los insectos criados en laboratorio debieron completar por lo menos 2
generaciones para que se encontraran libres de los contaminantes del campo.
META 5. PRODUCCIÓN DE HONGOS Y BACTERIAS ENTOMOPATÓGENAS
Propagación masiva de hongos y bacterias en matraz y fermentador de 7L
PROYECTO MULTIDISCIPLINARIO: 1539 Página 31
En laboratorio se mantienen activas las cepas de hongos entomopatógenos en
medio de cultivo agar papa dextrosa (PDA), en cajas petri se les adiciono quitina y
extracto de levadura, a los tubos de ensayo solo se le adiciona extracto de
levadura como suplemento, en el caso de las muestras que se mantienen en
crioconservación para mantener su viabilidad se les adiciona quitina y extracto de
levadura; para llevar acabo la activación de las cepas utilizadas en la
crioconservación llevando un proceso de esterilización para evitar contaminación.
Aplicando la técnica de vaciado en cajas Petri.
Los aislamientos de hongos entomopatógenos fueron conservados en tubos de
ensayo como un resguardo para luego ser resembrados, en cajas de Petri con
medio de cultivo agar papa dextrosa (PDA) más quitina, con la técnica de estriado
que se realizó en una campana de flujo laminar específica para hongos. Los
aislamientos resembrados se incubaran en una cámara bioclimática hasta su
esporulación. Una vez esporulados se resguardaran para luego llevar acabó su
cosecha.
Los aislamientos esporulados en cajas Petri se cosechan en crioviales, a los
cuales se les agregó medio de cultivo líquido papa dextrosa con glicerol, por
triplicado. Una vez en el ultracongelación por varios días una repetición fue
descongelada a temperatura ambiente y resembrados por estriado en cajas Petri
con medio de cultivo PDA para verificar su viabilidad.
Propagación masiva de HE
Se propagaron los hongos entomopatogenos Beauveria bassiana (cepa B16),
Metarhizium anisopliae (Cepa HM13) e Isaria fumosorosea (Cepa If19) en medio
de cultivo sintético con melaza como fuente de carbono. El medio contenía una
concentración de 7g/L de azúcares reductores y sulfato de amonio como fuente de
carbono. La corrida se realizó en matraz de 500 mL con 200 mL de medio. Las
condiciones de la fermentación fueron: 25°C, pH =4.5, y 200 rpm el tiempo de
fermentación fue de 36 h. Estos microorganismos una vez propagados en matraz
fueron inoculados en un fermentador de 7L para contar con cantidades mayores
para su formulación micro y nanoencapsulada en el secador por aspersión.
PROYECTO MULTIDISCIPLINARIO: 1539 Página 32
Propagación masiva de BE
Obtención del complejo espora-cristal mediante la técnica de co-
precipitacion lactosa-acetona
Se trabajó con cepas de Bacillus thuringiensis proporcionadas por el Centro de
Biotecnología Genómica del IPN. Debido a que los aislamientos obtenidos en
Sinaloa aún requieren pruebas de identificación molecular para conocer los genes
Cry y Cyt que contienen y la morfología de los cristales.
Los extractos espora cristal fueron obtenidos mediante la técnica de co-
precipitación con lactosa- acetona descrita por Dulmage (1970). Las cepas fueron
activadas en tubos con agar nutritivo inclinado, e incubadas por 18 h, a 30 °C.
Posteriormente las cepas activadas fueron utilizadas para inocular matraces de
250 mL con 50 mL de caldo triptosa fosfato (CTP), los cuales fueron incubados por
18 h a 30 °C y 200 rpm de agitación. Finalmente fueron inoculados 10 matraces de
500 mL de capacidad con 100 mL de medio de cultivo a base de melaza, harina
de soya, líquido de remojo de maíz y carbonato de calcio. Los matraces se
incubaron a una atmosfera y 30 ºC, con una agitación de 200 rpm, y a la vez
fueron monitoreados en diferentes intervalos de tiempo hasta obtener cultivos con
un 80% de las células en la fase final de la esporulación. El pH del medio de
cultivo fue medido y ajustado en el rango de 7.0-7.2.
El complejo espora-cristal se obtuvo por el método de co-precipitación lactosa-
acetona (Dulmage, 1970), para ello el medio de cultivo fue centrifugado a 10,000
rpm por 30 min a 5 °C. El pellet es pesado para después preparar una solución de
lactosa al 5% en una proporción de 1.71 (factor) el volumen del peso del
precipitado. Este volumen fue adicionado al pellet y se sometió a agitación en una
base magnética a una velocidad media por espacio de 30 min. A continuación se
adicionó 3.34 volúmenes de acetona en relación al peso del precipitado y el
volumen de lactosa al 5% adicionado, continuando la agitación por 30 min más.
Posterior a este proceso, el complejo espora- cristal de cada cepa de B.
thuringiensis fue obtenido mediante filtración al vacío. Finalmente el extracto
obtenido fue lavado con 2 volúmenes de acetona, pulverizado y almacenado.
PROYECTO MULTIDISCIPLINARIO: 1539 Página 33
META 6. DISEÑO DE FORMULACIONES DE HE
Las diluciones de los diferentes hongos (Beauveria bassiana, cepa B16),
(Metarhizium anisopliae cepa HM13) y cepa If19 de Isaria fumosorosea,
blastosporas-micelio, ajustadas a una concentración de 1x106 blastosporas/mL, y
esporas a una concentración de 1.5x1011 esporas/g fueron formuladas para
obtener un polvo microencapsulado obtenido por aspersión en un secador a
escala laboratorio B-191 (Büchi, Flawil, Switzerland), en la planta piloto de la
UPIBI-IPN, el equipo cuenta con una boquilla de 0. 7 mm; el flujo de aire se ajustó
al 100%, la bomba al 5- 10%, el máximo valor del aspersor tuvo un valor máximo
de 100%.
El ingrediente activo: blastosporas, micelio y/o esporas fueron colocados en 10 mL
de agua en un vaso de precipitados y cubierto con papel parafilm por 30 min.
Después del periodo de hidratación, la suspensión fue agitada para formar una
pasta homogénea, hasta lograr una concentración del ingrediente activo de 0.11
g/mL. El aceite de canola y/o girasol (1-2-3) y la harina de maíz nixtamalizado
(Maseca ), fueron adicionados a la suspensión y mezclados , después la
solución de lignina y la de KH2PO4 y finalmente se adicionó la solución de NaCl.
Los ingredientes que se pusieron para formar la microcápsula aparecen en el
Cuadro 3.
Las muestras de los diferentes hongos entomopatógenos fueron procesadas a una
temperatura de entrada de 120°C y 62°C de salida. Con un flujo de alimentación
de 20 mL/min. Se pusieron 300 mL de la suspensión de cada hongo para la
alimentaron del secador por cada lote.
PROYECTO MULTIDISCIPLINARIO: 1539 Página 34
Cuadro 3. Ingredientes de las formulaciones de hongos entomopatógenos.
Ingredientes Componentes de la
formulación
Blastosporas-micelio-esporas 10 g
Agua 87 mL
Harina de maíz nixtamalizado 3.4 g
Aceite de maíz 2 g
Solución de lignina 100 g/L 67 mL
Solución de KH2PO4 100g/L 2 mL
Solución de NaCl, 41.6 g/L 26.6 mL
META 7. DISEÑO DE FORMULACIONES DE BT
Diseño y elaboración de formulaciones micro y nanoecapsuladas con la
bacteria Bt
Aún no se realizan las formulaciones con Bacillus thuringiensis, sin embargo, ya
se cuenta con los microorganismos y los protocolos para la realización de las
mismas.
META 8. EVALUACIÓN DE FORMULADOS DE HE
Bioensayos DL50 y TL50, de micro y nanoencapsulados contra insectos
plaga
Una vez ya obtenidos los formulados se hicieron las siguientes determinaciones:
Recuperación de los formulados después del secado por aspersión
Contenido de Humedad
Concentración de esporas totales
Viabilidad de las esporas
Porcentaje de germinación al inicio y después del almacenamiento a
temperatura ambiente y de refrigeración
Mortalidad en larvas de B. tabaci, Bactericera cockerelli, Heliothis virescens
y Helicoverpa zea en dieta natural o artificial a nivel de laboratorio
PROYECTO MULTIDISCIPLINARIO: 1539 Página 35
Recuperación de los formulados después del secado por aspersión
La determinación del peso del formulado se obtuvo, por una diferencia de pesos
del formulado recuperado y colocado en un frasco de la siguiente manera:
Primeramente se obtuvo el peso promedio de los frascos, después se determinó el
peso total (frasco + formulado) y después se obtuvo el peso del formulado,
restando el peso promedio del frasco al peso total. Posteriormente con los
resultados obtenidos de la determinación de sólidos totales, se hizo una relación a
1000 mL para obtener la cantidad de sólidos totales presentes en este volumen.
Después se obtuvo el porcentaje del formulado haciendo una relación de estos
sólidos totales y la cantidad de formulado obtenido.
Contenido de humedad
A cada formulado se le determinó la humedad contenida de la siguiente manera:
Se utilizaron vidrios de reloj previamente tarados, a los cuales se les agregó 0.1 g
del formulado. Los vidrios de reloj con la muestra se colocaron en una estufa a 95
°C por 24 h, para después obtener la diferencia del peso, correspondiente a la
humedad, la cual se determinó en porcentaje.
Concentración de esporas totales iniciales en los formulados
Se disolvió 0.01 g de cada formulado en 1 mL de agua destilada estéril (en un
volumen de 10 ml), se hicieron las diluciones necesarias y se procedió al conteo
de conidias en una Cámara de Neubauer.
Viabilidad de esporas después del secado por aspersión
En matraces Erlenmeyer de 250 mL conteniendo 50 mL de caldo dextrosa
saboraud CSD + 1% de extracto de levadura estéril y 0.025 mg de estreptomicina,
se agregó 0.05 g de cada uno de los formulados a base de esporas, y se
sometieron a una agitación de 200 rpm por 24 h, esto para determinar el
porcentaje de germinación de esporas. Una vez obtenido; se calculó el número de
esporas viables, haciendo una relación entre el porcentaje de germinación y el
PROYECTO MULTIDISCIPLINARIO: 1539 Página 36
número de esporas iniciales del formulado, el cual representa el 100% de
viabilidad. El resultado se expresó en forma exponencial.
Porcentaje de germinación
Se prepararon matraces Erlenmeyer de 250 mL conteniendo cada uno 50 mL de
CSD + extracto de levadura al 1% y se agregó 0.05 g de cada formulado a probar.
Se colocaron los matraces en un agitador a 250 rpm y las determinaciones se
realizaron cada 24 h. Se tomó una alicuota que se colocó en un portaobjetos con
un cubreobjetos y se observó al microscopio. Se contaron 100 esporas en total
diferenciando las germinadas y no germinadas, se consideran germinadas
aquellas conidias cuyo tubo germinativo sea de la mitad del diámetro de la espora.
Esta cuenta se hizo por triplicado para cada formulado hecho a base de esporas.
Aún es necesario observar la formación de los gránulos formados en un
microscopio electrónico de barrido.
Mortalidad de larvas y ninfas a nivel de laboratorio
La determinación de la mortalidad de cada insecto de prueba se hizo por medio de
bioensayos, los cuales se realizaron de la siguiente manera: Se utilizaron vasitos
de plástico del No. 0, las cuales contenían hojas de tomate de 1 cm de diámetro,
ésta se roció con 100 L de una suspensión del formulado re suspendido en agua,
según la cantidad de sólidos totales obtenida, para obtener una concentración de
1x106 esporas/mL, el control correspondiente se re suspendió en base a los
sólidos totales. Para cada formulado y su control se utilizaron 25 vasitos por
triplcado, para dar un total de 75. En cada una se colocó una larva neonata o
ninfas en el caso de B. cockerelli y B. tabaci. Cada vasito se tapó. A los 7 días se
determinó la mortalidad de insectos. Los resultados obtenidos de este bioensayo
se sometieron a un análisis de varianza y una prueba de LSD con una P<0.05.
Mortalidad de larvas a nivel de invernadero
Se utilizaron cajas de Petrí desechables de 45 mm, a cada una de las cuales se
les colocó un disco de hoja de tomate de 12.56 cm2 de área, previamente
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sumergido en la suspensión del formulado o del control, de la misma manera que
en el bioensayo con dieta natural y se dejó secar, también se colocó un disco de
papel filtro en la base de la caja para absorber el exceso de humedad. Para cada
formulado, se hicieron 8 repeticiones cada una con 10 larvas neonatas de los
diferentes insectos.
A las larvas y ninfas se les permitió alimentarse de la hoja por 24 h, para que
tuvieran suficiente contacto con las esporas o el micelio de los formulados,
posteriormente los individuos sobrevivientes se transfirieron a vasitos con dieta
natural, para determinar la mortalidad a los 7 días. Los resultados obtenidos de
este bioensayo se sometieron a un Análisis de Varianza y Prueba de Tukey para
comparación de medias con una P< 0.05.
3. Resultados
Se obtuvieron un total de 16 aislamientos de hongos entomopatógenos, de los
cuales 8 pertenecen a B. bassiana, 5 a M. anisopliae y 3 a I. fumosorosea, sus
claves están registrados en la colección del laboratorio de Bioinsecticidas del
CIIDIR Sinaloa. De los 5 municipios muestreados, en tres de ellos se encontró la
presencia de hongos entomopatógenos para éste estudio en particular (cuadro 4).
Cuadro 4. Aislamientos obtenidos en las localidades muestreadas.
Clave Aislamiento Localidad y municipio
B1 Beauveria bassiana El Vado, Choix
B5 Beauveria bassiana El Vado, Choix
B8 Beauveria bassiana El Vado, Choix
HM12 Metarhizium anisopliae El Vado, Choix
HM13 Metarhizium anisopliae El Vado, Choix
HM19 Metarhizium anisopliae El Vado, Choix
B16 Beauveria bassiana El Guayabito, Choix
B17 Beauveria bassiana Colexio, Choix
B22 Beauveria bassiana Colexio, Choix
B24 Beauveria bassiana Colexio, Choix
B27 Beauveria bassiana Colexio, Choix
HM29 Metarhizium anisopliae La Uva, Guasave
HM32 Metarhizium anisopliae Cubiri, Sinaloa de Leyva
If12 Metarhizium anisopliae Cubiri, Sinaloa de Leyva
If19 Beauveria bassiana Bacubirito, Sinaloa de Leyva
If22 Beauveria bassiana Porohuí, Sinaloa de Leyva
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En relación a la producción de B. thuringiensis en el tiempo cero existe una
concentración de esporas de 41000 esporas/mL de la cepa HD133, una fase de
adaptación de 10 horas, y una fase exponencial con un tiempo de 14h. La
concentración de esporas final fue de 1x108esporas/mL.
Cuadro 5. Porcentajes de mortalidad de gusano del fruto y soldado a los 7 días.
Larvas
neonatas
Gusano del
fruto
Gusano
soldado
Aislados R1 R2 R3 % de
mortalidad
R1 R2 R3 % de
mortalidad
HM13 90 70 60 73.33% 90 80 70 80%
If19 50 50 50 50% 50 50 60 53.33%
B16 90 90 80 86.66% 10 90 90 93.33%
CONTROL 20 0 20 13.33% 20 0 20 13.33%
Cuadro 6. Porcentajes de mortalidad de ninfas de mosquita blanca y paratrioza.
Ninfas Mosquita
blanca
Paratrioza
Aislados R1 R2 R3 % de
mortalidad
R1 R2 R3 % de
mortalidad
HM13 80 70 70 73.33% 90 70 90 83.33%
B16 70 60 50 60% 10 90 50 80%
If19 10 70 60 76.66% 10 70 70 80%
CONTROL 20 0 20 13.33% 20 0 20 13.33%
4. Conclusiones e impacto de la investigación
Después del proceso de secado, todos los formulados presentaron pérdida en el
número y viabilidad de las esporas (98% inical-86% final). La humedad de los
microencapsulados fue superior al 10% por lo que fue necesario reducirla a ˂4%
con ayuda de un deshumidificador. Los microencapsulados tuvieron solubilidad y
estabilidad a temperatura ambiente al término de un mes, y a temperaturas de
PROYECTO MULTIDISCIPLINARIO: 1539 Página 39
refrigeración conservaron su viabilidad por 60 días, el formulado a base de B.
bassiana mostró una adecuada conservación en las esporas, ya que su viabilidad
fue mayor de 90%. Las esporas de todos los formulados tardaron un mínimo de 12
horas en empezar a germinar, después del proceso de secado, lo cual indica que
sufrieron daño durante el proceso de secado.
Los porcentajes de mortalidad de insectos se indican en los Cuadros 5 y 6, con los
tres formulados elaborados a base de blastosporas-micelio presentando mayor
estabilidad y capacidad de rehidratación, que el elaborado a base de esporas. Se
puede observar también que con B. bassiana se obtuvieron altos porcentajes de
mortalidad (93.33%) para el gusano soldado y 86.66% para el del fruto, en relación
a los productos elaborados con M. anisopliae e I. fumosorosea menor a 80%-40%.
Con respecto a las ninfas, en el cuadro 6 se muestran los resultados de mortalidad
de ninfas de B. cockerelli y B. tabaci, siendo los productos microencapsulados
menos efectivos para el control de éstos insectos, debido probablemente a la
especificidad de los hongos entomopatógenos, y hábitos de alimentación logrando
mayor mortalidad con M. anisopliae en ambos insectos, en mayor porcentaje en
paratrioza respecto a mosquita blanca.
El desarrollo de formulaciones microencapsuladas de B. bassiana y M. anisopliae
han demostrado hasta el momento tener efectividad en las pruebas de laboratorio,
por lo que en este ciclo agrícola 2013-2014 se tendrán los resultados de validación
de la efectividad de estos formulados en campo.
Uno de los formulados elaborados destaca entre los otros por su toxicidad contra
larvas de gusano del fruto respecto a las otras plagas, esto abre la posibilidad de
obtener un bioinsecticida debidamente caracterizado que sea útil para el control
del gusano del fruto en mediano plazo.
5. BIBLIOGRAFÍA
Greene, G. L., Leppla, N. C., Dickerson, W. A., 1976. Velvetbean caterpillar: a
rearing procedure and artificial diet. Journal Economic Entomology Vol. 69,
Num 4, pp. 487 – 488.
PROYECTO MULTIDISCIPLINARIO: 1539 Página 40
Horaczek, A., Viernstein, H. 2004. Comparison of three commonly used drying
technologies with respect to activity of aerial conidia of Beauveria brogniartii
and Metarhizium anisopliae. Biological control. 31: 65-71.
Humber R. A. 1997. Fungi: preservation of cultures. In: (Ed). L. Lacery. Manual of
Techniques in insect pathology. Academic Press. New York USA.
Nafari, I. B. 2012. Study of microencapsulated bioinsecticide from Bacillus
thuringiensis. Bogor Agricultural University. Disponible en:
http://repository.ipb.ac.id/handle/123456789/60765
Namasivayam, K. R., Bharani R. S. A., Ansari M. R. 2013. Natural ocurrence of
potential fungal biopesticide Nomuraea rileyi (Farlow) Samson associated
with agriculture fields of Tamil Nadu, India and it´s compatibility with metallic
nanoparticles. Journal Biofertilizers and biopesticides. 4(1): 1-7.
Doi:10.4172/2155-6202.1000132.
Ruelas Ayala D. y C. Garcia Gutierrez. 2010. Optimization of a media with
antimicrobial effects on the germination of Beauveria bassiana.
International congress on invertebrate pathology µbial control OECD
symposium on disease in aquatic crustaceans 44th annual meeting of the
society for invertebrate pathology, Halifax, Canada.
PROYECTO MULTIDISCIPLINARIO: 1539 Página 41
Módulo IV. “Validación de la efectividad de bioinsecticidas micro y
nanoencapsulados para el control de plagas del tomate”.
1. Objetivo y metas cumplidas
Validación de la efectividad de bioinsecticidas micro y nanoencapsulados en el
control del gusano del fruto (H. virescens) del tomate.
2. Materiales y métodos
Producción de plántula de tomate en invernadero.
En la producción de plántula de tomate en invernadero, se utilizó charolas de
poliuretano de 200 cavidades de 40 cm3 de volumen. Se sembró el híbrido Tisey,
el manejo en invernadero consistió principalmente, en aplicación de riego,
fertilización y control de plagas. La plántula de tomate fue transportada a campo
en charolas a los 35 días después de sembrada.
Establecimiento de la parcela experimental de tomate
Para la evaluación en campo se estableció una parcela de cultivo de tomate
(fotografía 1). El experimento consistió en un diseño de bloques completamente al
azar, con tres repeticiones o bloques, se preparó el terreno de acuerdo a la
tecnología regional; barbecho rastreo cruzado y marca de camas a una distancia
de 1.6 metros por 10 metros de largo y una distancia entre planta de 25
centímetros, la parcela útil consistió en un tramo de tres metros centrales de la
cama para eliminar el efecto orillas, a los costados del experimento se plantaron 4
camas de tomate que sirvieron como barreras. La plantación se realizó el día 2 de
octubre 2013 en un suelo de aluvión.
PROYECTO MULTIDISCIPLINARIO: 1539 Página 42
Figura1. Experimento de tomate con 3 m sin plantar entre cada bloques.
Control de plagas y maleza
Durante el desarrollo del cultivo hasta inicio de floración no se presentaron
insectos-plagas que ameritara medida de control. Se presentaron lluvias al inicio
del desarrollo del cultivo que favoreció la crecimiento de malezas para su control
se realizó de manera manual con la ayuda de herramientas de trabajo (machetes,
palas y azadones) (Fotografía 2). Las malezas que se presentaron en el cultivo
fueron correhuela Convolvulus arvensis (L), Bledo Amarantus palmeri (S),
Chuales Chenopodium spp, Zacate Jhonson Shorgum halepensis (L).
Figura 2. Control de malezas en la parcela experimental.
PROYECTO MULTIDISCIPLINARIO: 1539 Página 43
Monitoreo de H. virescens.
Durante floración e inicio de formación de frutos se presentó de manera natural
huevecillos de H. virescens se procedió a monitorear, en la hoja inferior
inmediata donde la planta tiene más flores abiertas, que es donde se ha
encontrado con mayor frecuencia, se encontró de cinco a seis Huevecillos viables
por cada 30 hojas muestreadas (algunos Huevecillos estaban eclosionados se
contó por igual larvas recientes), lo cual está por arriba del umbral de acción que
es al encontrar cuatro o más huevecillos viables en 30 hojas, para facilitar el
conteo se realizó a las primeras horas del día ya que las temperaturas bajas
reducen la locomoción de larvas.
Aplicación de los tratamientos
Para la aplicación de los tratamientos se utilizó una bomba de mochila marca
Truper ® con capacidad de 3.8 litros, para cada tratamiento por separado para
evitar contaminación entre ellos.
Figura 3. Mochila marca Truper ®
PROYECTO MULTIDISCIPLINARIO: 1539 Página 44
Cuadro 1. Descripción de tratamientos
Núm. De tratamiento
Tratamiento Descripción
1 Bb + ACEITE MINERAL Beauveria bassiana más aceite mineral
2 MA + ACEITE MINERAL Metarhizium anisopliae más aceite mineral
3 Bb MICROCAPSULAS Beauveria bassiana microencapsulado
4 MA MICROENCAPSULADO Metarhizium anisopliae microencapsulado
5 Bb + GLICERINA Beauveria bassiana más glicerina
6 MA + GLICERINA Metarhizium anisopliae más glicerina
7 QUIMICO Fastac (alfacypermetrina)
8 CONTROL Sin aplicación
Figura 4. Aplicación de los tratamientos en la parcela experimental
Evaluación del rendimiento de frutos
La cosecha de tomate se realizó de forma manual, colectando frutos totales
únicamente de la parcela útil que consistió en 4 m (6 m2), para esto se utilizaron
cubetas de 20 litros de capacidad, se contaron y pesaron los frutos de cada
tratamiento en una báscula digital marca TORO REY® . Los resultados de
rendimiento se extrapolaron a ton ha-1 para tener datos más ilustrativos.
PROYECTO MULTIDISCIPLINARIO: 1539 Página 45
Evaluación de daño en frutos causados por H. virescens
Una vez que se pesó el rendimiento de tomate en la parcela útil se procedió a
sacar el número de frutos daños. Se contaron los frutos que presentaron el daño
característico causado por la larva, que son perforaciones irregulares en todo el
fruto. Para evaluar el daño se observaron los frutos identificando las perforaciones
o en el fruto.
Figura 5. Larvas de H. virescens
Figura 6. Frutos dañados por larvas de H. virescens
Análisis estadístico
Los datos obtenidos de campo fueron analizados a través de un análisis de
varianza y un análisis de comparación de medias por la prueba de Tukey con un
nivel de significancia del 95% (p≤0.05) empleando el programa estadístico SAS.
PROYECTO MULTIDISCIPLINARIO: 1539 Página 46
3. Resultados
Evaluación de frutos totales y frutos dañados por larvas de H. virescens en
la parcela útil de cada tratamiento.
En el siguiente cuadro se observan el total de frutos de tomate y frutos dañados
recolectados en la cosecha.
Cuadro 2. Comparación de medias de frutos totales y frutos dañados por larvas de H. virescens en experimento de tomate
Núm. de tratamiento
Tratamiento Frutos totales Frutos dañados
1 Bb + ACEITE MINERAL 420.67a 9.66bc
2 MA + ACEITE MINERAL 453.33a 8.33bc
3 Bb MICROCAPSULAS 400.33a 11.66abc
4 MA MICROENCAPSULADO 412.67a 19.33ab
5 Bb + GLICERINA 407.00a 11.00abc
6 MA + GLICERINA 393.67a 13.33abc
7 QUIMICO 466.33a 4.33c
8 CONTROL 403.67a 21.33a
Medias con letras iguales dentro de cada columna y de cada factor son iguales según, Tukey (p0.05).
En frutos totales no se presentaron diferencias significativas entre tratamientos
esto es debido a que todos los tratamientos presentaron la misma fertilización y
manejo del cultivo en frutos dañados el tratamiento control (sin aplicación de
biorracional), presentó el mayor número de frutos dañados, sin presentar
diferencias significativas con los tratamientos Bb MICROCAPSULAS, MA
MICROENCAPSULADO, Bb + GLICERINA y MA + GLICERINA.
El tratamiento con menor frutos dañados fue el tratamiento químico Fastac
(alfacypermetrina), que no presentó diferencias significativas con los tratamientos
de Bb + ACEITE MINERAL y MA + ACEITE MINERAL.
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Rendimiento en frutos del cultivo del tomate
El mayor rendimiento de tomate se obtuvo con el control químico y el menor
rendimiento con el tratamiento control sin aplicación de bioinsecticidas, como se
puede observar en el siguiente cuadro.
Cuadro 3. Comparación de medias de cosecha comercial y porciento de frutos dañados por larvas de H. virescens en experimento de tomate
Núm. de tratamiento
Tratamiento Rendimiento
tha-1
% Frutos dañados
1 Bb + ACEITE MINERAL 68.50 2.00
2 MA + ACEITE MINERAL 74.10 1.83
3 Bb MICROCAPSULAS 64.78 2.91
4 MA MICROENCAPSULADO 65.55 4.00
5 Bb + GLICERINA 66.00 2.7
6 MA + GLICERINA 63.41 3.33
7 QUIMICO 77.00 0.92
8 CONTROL 63.72 5
En porcentaje de frutos dañados la Universidad California (1999), establece el
umbral económico de (3.25 %) para tomate industrial, de acuerdo a esto los
mejores tratamientos serían 1,2,3,5 y el control químico y los tratamientos menos
efectivos serían 4, 6 y el control sin bioinsecticida.
Loa tratamientos de bioinsecticidas con menor porcentaje de fruto dañados fueron
Beauveria bassiana más aceite mineral y Metarhizium anisopliae más aceite
mineral, quizás el aceite mineral actué como protector solar, anti desecante,
abrillantadores que reflejen la luz solar y eviten que las esporas de los hongos se
inactiven por la acción de la luz.
PROYECTO MULTIDISCIPLINARIO: 1539 Página 48
4. Conclusiones e impacto de la investigación
El aceite mineral favorece a las cepas de hongos Beauveria y Metarhizium, a
presentar una mayor efectividad como bioinsecticidas, al aislarlos del medio
ambiente que puede afectar a las esporas de estos hongos.
El mecanismo lento de infección de los hongos para producir mortalidad en
insectos, es una desventaja frente a los productos químicos que causan una
muerte rápida; pero en comparación con los insecticidas, éstos no generan
poblaciones de insectos resistentes y no generan condiciones tan adversas al
medio ambiente como los insecticidas químicos.
5. Bibliografía.
Gastélum Luque R. 2006. El gusano del fruto en tomate y chile. Manejo de plagas
en tomate y chile (memorias). FPS, UAS, INIFAP, FIRA. 136-174 p
Tanada, Y. y Kaya, H. 1993. Insect Pathology, Academic Press. Fungal Infections
San Diego, California. USA. pp. 318-366.
UCLA (University of California). 1999. Integrate Pest Management for Tomatoes.
State Wide Integrated Pest Management Projet. Division of Agriculture and
Natural Resources. Publication 3274. 59 p.