La Espectrometria de Masas
en la
Identificacin de ProteinasDra. Irene FernndezServicio de Espectrometria de Masas. UB.
Gel 1. Spot 2. Rentat Extracci 3. Digesti 4. ExtracciProtenaBarreja dePptids trpticsEspectrometria de Masses ElectrosprayMALDIPROTEMICABase de Dades
- Colorantes ( sales de plata, Coomassie Blue, . . . )
- Urea (desnaturalitzacin prot., detergentes )
- Agentes reductores ( DTT, DTE )
- Glicerol, agentes alquilantes, SDSELIMINACIN
RKRKKKRKKProteasas y posiciones de corte especficasEnzimaPosicin de corteTrypsin/K-, /R-, \PChymotrypsin/W-, /Y-, /F-, \PGlu C (V8)/E-, /D, \PLys C/K-, \PAsp N/d-ProtenaTrypsinMezcla de Pptidos trpticos
COOHNH2Digesti Enzimtica ( Trypsina, V8)Qumica (CNBr, BNPS)NH2COOHm/z15.200 DaProtenaPptids trpticsSeqnciaMS/MSNH2COOHMSm/zm/zInformaci massesPunts de digestiModificaciBASE DE DADESMS102587410251025%2155181448
Deteccin en el Masas
A) Muestra pura
EM
t
%
Cromatograma de iones TIC
%
m/z
Espectro
m/zm/z%%12C+14N+16O13C+14N+16O12C+15N+16O2x13C+14N+16O13C+15N+16O
Distribucin isotpicade las seales
12C 10013C 1.112
14N 10015N 0.367
16O 10018O 0.200
32S 10034S 4.43
Monoisotopic MassMonoisotopic MassMonoisotopic MassAverage Mass
ANALISIS DE UNA MEZCLA
1234
HPLC
EM
TIC
%
m/z
%
m/z
%
m/z
%
m/z
%
1
3
2
4
FONTS DIONITZACI ELECTROSPRAY MALDI
ELECTROSPRAY
HPLCFONT ELECTROSPRAYIons : (M+nH)n+, (M-nH)n- analitzadorIntroducci directaLC/MS
Caracterstiques del procs d'ionitzaci (I)
a) Tcnica d'ionitzaci suau
- T. Ambient
- P. Atmosfrica
- Molt poca fragmentaci
b)Pot produir MULTIPLICITAT DE CRREGA en aquelles molcules amb posicions susceptibles d'ionitzar-se, com els grups -NH2 lliures de les protenes.
(
No es necessari disposar d'analitzadors de gran rang de lectura, es a dir amb quadrupols ( < 4000uma ) es poden detectar molcules de 100.000uma.
PAGE
1
H2N-CH-CO-NH-CHR2-CO-NH-CHR3-COOHCH-(CH2)3-NH2Tripptid Lys-Met-Asp ( KMD) MW monoisotopic= 459.3 DaH3N-CH-CO-NH-CHR2-CO-NH-CHR3-COOHCH-(CH2)3-NH2H3N-CH-CO-NH-CHR2-CO-NH-CHR3-COOHCH-(CH2)3-NH3+++A1 (M+H)+= 460.3A2 (M+2H)2+= 461.3/2 = 230.6m/z%AA1A2230.6A2460.3
Espectre real ESIDeconvoluci a lescala real de massesES Myoglobin 20 femtomoles MWaverage=16.951.1m/zmA20A19A18A21Am1-Hm2- m1n =
Barreja: human haemoglobin
n = 1/Dm
Dm
Dm
n= 1Dm= 1
n= 2Dm= 0,5
n= 3Dm= 0,33
- Micro Electrospray : L/min LC/MS amb split
- Nano Electrospray : nL/min. Biomolcules. No LC/MS. Si MS/MS. Lmits de detecci femtomols
Tampons voltils
Molcules solubles en dissolvents polars (H2O, CH3CN, MeOH).
Mostres netes ( no : sals, detergents, SDS, ...), processos previs de purificaci.
Tcnica depenent de la Concentraci
Lectura ions positius i negatius.
Informaci : Pes Molecular (
TIC
MALDI
Matrix Assisted Laser Desorption Ionization
hn LaserIonsAnalitzador( TOF, quadrupol)(M+H)+(M-H)-MALDICristal.litzaciConcentracions:Peptids,protenes : 0.1 a 10pmol/mLOligonucletids :10 a 100pmol/mLMatriu ( SA, CHCA, THAP, DHB)Mostra1 mL
- Tcnica senzilla i rpida. Fcil preparaci mostra.
- Informaci :. Pes Molecular. Fins 300KDa.Poca fragmentaci. Anlisi barreges sense separaci prvia ( digerits proteics ). Seqenciaci : PSD, ISD, Enzimtica(informaci estructural ). Protenes, pptids, oligonucletids, oligosacrids, . . . .
- Quantitat de mostra : mL, conc. :
20173.140394.3ADAPptids trpticsTRYPSINA
Daniel C. Liebler Introduction to Proteomics. Humana Press, 2002
Diapositiva 13 de 65
Daniel C. Liebler Introduction to Proteomics. Humana Press, 2002
(Time of flight)
DetectorDetector
INFORMACI ESTRUCTURAL
Lectura dels ions formats a la font
Possibilitat de fragmentaci (MSn). Informaci estructural Pptids i protenes
MS
Anlisi dels ions de la font. A+ , B+ , C+
MS2
Selecci d'un dels ions anteriors: Precursor A+
Excitaci del Precursor per a fragmentar-lo. A+ A+1 , A+2 , A+3
Lectura dels ions resultants
A+1 , A+2 , A+3
MS3
Selecci d'un dels ions anteriors: A+1
Excitaci per a fragmentar-lo: A+1
A+11 , A+12
. . . . .
. . . . . .
FONT
ANALITZADOR
DETECTOR
400 / 401 uma
- Resoluci
400,0000 / 400,0001
Caracterstiques
- Sensibilitat Lmits detecci
- Rang d'anlisi Valors de m/z
Resoluci
Sensibilitat
Rang
Sector Magntic
ALTA
BONA
10.000
Quadrupol
UNITAT
MITJANA
4.000
TOF
MOLT BONA
BONA
300 KDa
ION TRAP
BAIXA
MOLT BONA
1.000
ICR
MOLT ALTA
MOLT BONA
10.000
NH2COOHPptidos trpticosDigestinInformacin masasMSCOOHNH2ProtenaMS/MSNH2COOHm/zm/zBASES DE DATOS10258741025m/z = 10252155181448725A-L-R-S-C-D-K-Rp*Secuencia pptidos trpticosProtena
SEQNCIACI EN MS- Maldi-TOF : PSD, ISD- Electrospray i Maldi-TOF/TOF: MS/MS
- Comparaci MS vs Seq. EDMAN. MS mesura masses. AA nous o modificats espoden detectar b.. N-terminal no lliure no s problema. MS es pot fer directament sobre barreges senzilles. Adquisici rpida i no gasta reactius. Tamany de pptids fins a 25 residus aprox.. Linformaci a vegades no es complerta i alguns pptids presenten dificultats. Quantitat : pmol de substncia
MALDI-TOF INFORMACIO ESTRUCTURAL (ISD) ( In Source Decay )-La DM entre els diferents fragments ens informa de la seqnciaTant en protenes com en DNA
Roepstorff, P.; Fohlmann, J. Biomed.Mass Spectrom, 11, 601 (1984)H2N------aa1------aa2------aa3------COOHSECUENCIACIN DE PPTIDOS Fragmentos inicos
NH2- C- -C- -N- -C- -C- -N- -C- -C- -N--C
CO2H
H
H
H
H
H
H
H
R4
R3
O
O
R2
R1
O
z1
c3
b3
a3
c2
b2
a2
c1
b1
a1
y1
x1
z2
y2
x2
z3
y3
x3
N-Terminal
C-Terminal
- Immonium Ions ( Fragmentaciones caractersticasde cada aminocido H2N+=CHRn)
672.1434.8535.11107.1819.2719.0994.1848.11108.1407.0994.9271.7518.1536.0435.81109.11080.1849.2654.2983.2343.8581.9482.6259.9282.9618.5736.2176.4966.3389.01125.9943.4803.31011.9242.4315.71179.31213.6In precursor doblemente cargado: 627.3Mr = 1253.6 DaSecuencia: qCYFHQFLKEjemplo espectro MS/MS-Espectros complicados. Programas secuenciacin DE NOVO.Introduccin en las bases de datos.
%m/zLinearDetectorLaserReflector DetectorSeleccin m/z=MALDI-TOF con REFLECTORSecuenciacin - PSDTof-LinealFuenteReflectorLserEspectro
PSD del Pptido de MW=1404.6
Peso de los fragmentos Introduccin Protein Databases NCBI base de datos Swiss Prot OWLSecuencia AKLMRLQ Gene Databases dbEST
IonizacinLectura FragmentosSeleccinFragmentacinEspectro fragmentosm/z%Fragmentacin MS/MS- Analizadores en Tandem- Ion Trap
IonizacinLectura FragmentosSeleccinFragmentacinFragmentacin MS/MSAnalizadorAnalizadorC.C.FuenteTriple Quadrupolo QQQQuadrupolo-TOF QTOFSector Magntico Quadrupolo BQTOF-TOF
ESI/Q-TOFIonizacinQuadrupoloTOFCIDmuestra(M+H)+nMS/MSseparacin m/zFuenteseparacin m/z
m/z
%
908.5
A
1816.3
A2
A3
MS/MS
m/z
y3
y4
y5
y6
y7
y9
y10
MS/MS dun pptid trptic de la Myoglobina
V
N
L
V
W
%
GLSDGE-W-QQ-V-L-N-V-WGK
GLSDGEWQQVLNVWGKMW=1815.3
AGCA
AQCAG
AGCAAQCAG
INFORMACI ESTRUCTURAL
Lectura dels ions formats a la font
Possibilitat de fragmentaci (MSn). Informaci estructural Pptids i protenes
MS
Anlisi dels ions de la font. A+ , B+ , C+
MS2
Selecci d'un dels ions anteriors: Precursor A+
Excitaci del Precursor per a fragmentar-lo. A+ A+1 , A+2 , A+3
Lectura dels ions resultants
A+1 , A+2 , A+3
MS3
Selecci d'un dels ions anteriors: A+1
Excitaci per a fragmentar-lo: A+1
A+11 , A+12
. . . . .
. . . . . .
MODIFICACIONES POSTRADUCCIONALES
1) FOSFORILACIONES : Serina (S), Threonina (T) y Tyrosina (Y)Cambios Biolgicos
. Activacin/desactivacin enzimtica. Alteracin interacciones y asociaciones proteicas. Cambio estructura protenas, degradacin. . .
Cambios observables en el masas
. Adicin Grupo Fosfato : PO4H3 M-S-D-K M- p S-D-K
. DM de la Protena/Pptido + 80 uma por cada fosforilacin. MS/MS Prdida PO4H3 m/z=1 DM = - 98
Prdida PO3 m/z=1 DM = - 79
Fosforilacin de S , T y Y
***G-N-D-T-T-L-D-S-S-M-EG-N-D-T-T-L-D-S-S-M-E****Modificaciones Postraduccionales : Fosforilacin11.266
11.347
11.427
11.506808080*****
MODIFICACIONES POSTRADUCCIONALES
2) GLICOSILACIONES : Adicin de un Carbohidrato o un Polisacrido dando lugar a una glicoprotena. Molculas complejas debido a la heterogeneidad de los azcares.
. >60% Protenas en mamferos
. Marcadores interacciones clula/clula, clula/molcula :
Fertilizacin, respuesta immune, replicacin viral, infecciones parasitarias, crecimiento de la clula, inflamaciones, degradaciones . . .
Cambios observables en el masas
. Adicin azcares en posiciones N-Linked NH2 Asn
O-Linked Ser, Thr
. Incremento del peso de la protena en funcin de la modificacin.
N- y O-linked Protein Glicosylation
MODIFICACIONES POSTRADUCCIONALES
2) GLICOSILACIONES : Anlisis
. Identificacin de la Protena Glicosilada, tipo de Glicosilacin y posicin en la cadena peptdica, caracterizacin de la Glicosilacin : Secuencia de las cadenas
. Incremento del peso de la protena en funcin de la modificacin.
EstrategiaGlcNacDeteccin yaislamiento de la ProtenaProteolisisGlcNacLC-MS/MSMALDI-TOF/TOF. Identificacin Protena ( DataBase). Identificacin grupo GlcNac. Posicin en la cadena peptdica . Secuenciacin azcares
GlcNacm/z%Secuenciacin cadena glicosdica
. Enzimtica ( glicosidasas ). MS/MS
MODIFICACIONES POSTRADUCCIONALES
3) Acetilaciones: Adicin de un grupo Acilo ( -COCH3) en el grupo amino terminal o los grupos amino libres (Lisina K )DM = 42
Oxidaciones: Metioninas DM = 16
Aductos acrilamida: Cistenas DM = 71
Carbamidometilacin : Adicin grupo -CH2CONH2 en el grupo -SH de las cistenas DM = 57
Comprovacin Interaccin Especfica entre ProtenasDaMyo DDominio DaFusionado con GSTGST-DaMw= 36 KDaDominio Myo DFusionado con polyhistidinasMyo DMw= 15 KDa?
Secuencia His6 MYO-DMW aprox 15300Da
MRGSHHHHHHGMASMTGGQQMGRDLYDDDDKDPSSSSAMAPKKKRKVPGVPSSNCIDWIX
KRKTTNADRRKAATMRERRRLSKVNEAFETLKRCTSSNPNQRLPKVEILRNAIRYIEGLQALLR
DQGSPGTELNCGR
1)Extracto Proteico+GST-DaColumna afinidad GSTLavadoEluidoGST-DaProt. InteraccionanteLiberacin protenaMW1D-SDS-PAGE1D-SDS-PAGE2)Protenas no interaccionantes3)Interaccin proteica
ELUDO CROMATOGRAFA DE AFINIDADVoyager Spec #1=>NR(0.80)=>NR(1.00)[BP = 15457.7, 629]MyoD ?GST-Da degradationGST-DaGST-Da (2+)15407365041828827179GST-DaMyoD?Espectro MALDI-TOF
Voyager Spec #1[BP = 1175.7, 16833]1175.742073.002058.011177.751206.722075.001333.661404.701050.59842.552060.011406.711080.451208.722327.122014.021300.682665.341478.671180.662251.202384.181717.961052.60861.10957.472055.951613.861308.771838.85770.342649.341935.012146.982776.532515.281422.751513.432894.57Digerido trptico de la protena interaccionante con DaEspectro de MALDI-TOF-Recorte-Dig. Trypsina-Extraccin pptidos-Anlisis MS
Identificacin Protena Interaccionante con Da Myo DBases de DatosPeptide MassFingerprintingMS/MS SpectraMS-TAG
Resultado: Protena Myo D Pptidos trpticos identificados - VNEAFETLKR YIEGLQALL
Index Number: 127240Acc. #: P10085 INCLUIRIMAGEN \d "Image1.gif"
Species: MOUSE Name: Myoblast determination protein 1pI of Protein: 5.3Protein MW: 34219Amino Acid Composition: A36 C9 D25 E19 F8 G22 H8 I7 K9 L27 M4 N9 P36 Q9 R25 S32 T13 V10 W1 Y9
1
11
21
31
41
51
61
71
MELLSPPLRD
IDLTGPDGSL
CSFETADDFY
DDPCFDSPDL
RFFEDLDPRL
VHVGALLKPE
EHAHFSTAVH
PGPGAREDEH
81
91
101
111
121
131
141
151
VRAPSGHHQA
GRCLLWACKA
CKRKTTNADR
RKAATMRERR
RLSKVNEAFE
TLKRCTSSNP
NQRLPKVEIL
RNAIRYIEGL
161
171
181
191
201
211
221
231
QALLRDQDAA
PPGAAAFYAP
GPLPPGRGSE
HYSGDSDASS
PRSNCSDGMM
DYSGPPSGPR
RQNGYDTAYY
SEAVRESRPG
241
251
261
271
281
291
301
311
KSAAVSSLDC
LSSIVERIST
DSPAAPALLL
ADAPPESPPG
PPEGASLSDT
EQGTQTPSPD
AAPQCPAGSN
PNAIYQVL