1. Instituto Nacional de Tecnologa Agropecuaria Ediciones
Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal II Consejo Argentino para la
Informacin y el Desarrollo de la Biotecnologa Editores: , Viviana
Echenique, Clara Rubinstein, Esteban Hopp y Luis Mroginski Gabriela
Levitus Auspicios ArgenBio es el Consejo Argentino para la
Informacin y Desarrollo de la Biotecnologa. Es una organizacin sin
fines de lucro que tiene como misin divulgar informacin sobre la
biotecnologa, contribuyendo a su comprensin a travs de la educacin
y estimulando su desarrollo. Consideramos prioritario el apoyo a
iniciativas relacionadas con la biotecnologa y dirigidas a la
comunidad educativa de todos los niveles. En este sentido, este
libro cubre una necesidad importante ya que aporta informacin
completa y actualizada sobre las tecnologas de laboratorio que se
aplican al mejoramiento vegetal, escrita por especialistas y en
idioma espaol. Confiamos en que tanto estudiantes con profesionales
encontrarn en este libro una excelente fuente de informacin. Para
conocer ms sobre ArgenBio, visitar www.argenbio.org INSTITUTO
NACIONAL DE TECNOLOGA AGROPECUARIA ARGENBIO - Consejo Argentino
para la Informacin y el Desarrollo de la Biotecnologa
2. 1Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal II Biotecnologa y
Mejoramiento Vegetal II Editores: Dra. Gabriela Levitus, Dra.
Viviana Echenique, Dra. Clara Rubinstein, Dr. Esteban Hopp Ing.
Agr. Luis Mroginski.
3. 2 Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal II
4. 3Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal II ndice Prefacio
...............................................................................................................................
Agradecimientos
................................................................................................................
Lista de Autores
..................................................................................................................
Prlogo a la Primera Edicin. Dr. Francisco Garca Olmedo
............................................. Prlogo a la Segunda
Edicin. Dr. Francisco Garca Olmedo
........................................... Parte I: Herramientas
Bsicas
...........................................................................................
Captulo 1: Establecimiento de cultivos de tejidos vegetales. Luis
Mroginski, Pedro Sansberro y Eduardo Flaschland .
Captulo2:Morfognesis.SilviaRadice ... Captulo 3: La citogentica
molecular e inmunocitogentica en el estudio de los genomas ve-
getales. Guillermo Seijo, Graciela I. Lavia, Germn Robledo,
Aveliano Fernndez y Viviana G. Sols Neffa.
..................................................................................................................................................
Captulo 4: Herramientas bsicas de ingeniera gentica. Ingrid Garbus,
Marisa Gmez y Vi- viana Echenique.
................................................................................................................................
Captulo 5: Marcadores moleculares. Mara Carolina Martnez, Marcelo
Helguera y Alicia Carrera. Captulo 6: Construccin de mapas de
ligamiento gentico, localizacin de genes y regiones cromosmicas
asociadas a caracteres de inters en plantas. Gerardo D. L.
Cervigni, Juan Pa- blo A. Ortiz y Sergio E. Feingold.
.........................................................................................................
Captulo 7: Genmica. Viviana Echenique, Juan P. Selva, Mauro Meier,
Pablo Roncallo y Gustavo Schrauf.
..............................................................................................................................................
Captulo 8: Transcriptmica. Silvina Pessino y Silvina Felitti.
.......................................................... Captulo
9: Protemica. Paula Casati y Mara F. Drincovich
.............................................................
Captulo 10: Metabolmica. Fernando Carrari, Telma E. Scarpeci,
Luciano A. Abriata, Alejandro J. Vila y Estela M. Valle.
.........................................................................................................................
Captulo 11: Metagenmica. O. Mario Aguilar y Daniel H. Grasso.
................................................... Captulo 12:
Bioinformtica aplicada a la biotecnologa vegetal. Norma Paniego,
Ruth Heinz, Paula Fernndez, Vernica Lia, Corina Fusari.
...................................................................................
Parte II: Mtodos para generar y analizar diversidad Captulo 1:
Polinizacin y fertilizacin in vitro. Susana Cardone, Gladys Prez
Camargo y Aurora Picca.
..................................................................................................................................................
Captulo 2: Hibridacin somtica. Pablo Polci y Pablo Friedrich.
.................................................... 6 7 7 11 11 15
17 26 34 47 70 86 100 121 136 146 157 170 183 185 197
5. 4 Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal II 211 217 229 243 259
271 283 295 297 311 325 339 351 353 363 369 377 379 389 403 421
Captulo 3: Epigentica y evolucin. Ricardo W. Masuelli y Carlos F.
Marfil .................................. Captulo 4. Mutagnesis,
TILLING y EcoTILLING. Alberto Prina, Alejandra Landau, Mara
Gabriela Pacheco y Esteban Hopp
...................................................................................................................
Captulo 5: Variacin somaclonal. Susana Cardone, Sofa Olmos y
Viviana Echenique. ............... Captulo 6: Aplicacin de la
transformacin gentica al mejoramiento vegetal. Marina L. Daz, Diego
C. Zappacosta, Pascual M. Franzone y Ral D. Ros
...............................................................
Captulo 7: Usos del silenciamiento gnico para el anlisis funcional
de genes candidatos. Cecilia Vzquez Rovere, Ariel Bazzini, Cecilia
Rodrguez, Natalia Almasia y Sebastin Asurmendi .. Captulo 8:
Anlisis de experimentos biolgicos. Sofa Olmos, Miguel DiRenzo,
Mercedes Ib- ez, Nlida Winzer
..............................................................................................................................
Captulo 9: Mtodos multivariados para estimar variabilidad gentica.
Nlida Winzer, Miguel DiRenzo, Sofa Olmos y Mercedes Ibez.
.........................................................................................
Parte III: Mtodos para acelerar programas de mejoramiento e
identificacin varietal Captulo 1: Obtencin de plantas
doblehaploides. Pablo Polci, Vernica Conti y Rubn Miranda y Nicols
Gear.
....................................................................................................................................
Captulo 2: Aplicaciones de los marcadores moleculares. Alicia
Carrera, Gabriela Tranquilli, An- tonio Garayalde y Marcelo
Helguera.
..................................................................................................
Captulo 3: Marcadores moleculares y mejoramiento gentico de
cultivos. Carlos Sala, Maria- no Bulos, Anala Fresco y Emiliano
Altieri.
..........................................................................................
Captulo 4: Identificacin y registro de variedades. Ana Laura
Vicario, Marcelo Labarta y Mara Alicia Loray
.........................................................................................................................................
Parte IV: Mtodos de propagacin y conservacin de germoplasma Captulo
1: Micropropagacin. Sofa Olmos, Gabriela Luciani y Ernestina
Galdeano .................... Captulo 2: Semilla sinttica. Hebe Rey
y Luis Mroginski
.................................................................
Captulo 3: Conservacin de germoplasma in vitro. Adriana Scocchi y
Hebe Rey. ....................... Parte V: Ejemplos de aplicaciones
de la biotecnologa vegetal Captulo 1: Aportes de la citogentica al
estudio de genomas vegetales. Lidia Poggio, Gra- ciela Gonzlez,
Mara Rosa Ferrari, Ana Mara Garca, Arturo Wulff, Eduardo
Greizerstein, Pablo Tomas y Gustavo Schrauf.
..................................................................................................................
Captulo 2: Mejoramiento de plantas forrajeras en la era genmica.
Germn Spangenberg, Mauro Meier y Viviana Echenique
.......................................................................................................
Captulo 3: Caracterizacin molecular de la apomixis y su aplicacin
en la agricultura. Silvi- na C. Pessino y Juan Pablo A. Ortiz
....................................................................................................
Captulo 4: Avances de la biotecnologa en cultivos ornamentales.
Alejandro S. Escandn, Pa- blo A. Marinangeli y Mariana Prez de la
Torre.
..................................................................................
6. 5Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal II 435 447 457 467 481
495 507 519 529 539 545 559 569 571 583 595 603 613 621 631 633
Captulo 5: Aplicacin de la biotecnologa en la mejora y conservacin
de especies forestales. Susana Marcucci Poltri, Leonardo Gallo,
Noga Zelener, Susana Torales, Sandra Sharry ....................
Captulo 6: Tcnicas de ingeniera gentica para conferir resistencia a
virus en plantas. Maria- na del Vas, Ana Julia Distfano, Cecilia
Vzquez-Rovere, Esteban H. Hopp.
..................................... Captulo 7: Obtencin de
plantas resistentes a enfermedades bacterianas. Adrin Vojnov, Mer-
cedes Rivero y Diego Zappacosta
.......................................................................................................
Captulo 8: Aproximaciones biotecnolgicas para un manejo sustentable
del estrs fngico en la agricultura. Juan Carlos Daz Ricci; Ursula
Tonello; Gustavo Martnez-Zamora; Sergio Sala- zar; Nadia Chalfoun;
Gabriel Vellicce; Carlos Grellet; Paula Filippone; Alicia Mamani;
Marta Ontivero y Atilio Pedro Castagnaro.
...................................................................................................................
Captulo 9: Utilizacin de cultivos de tejidos para la obtencin y
conservacin de plantas li- bres de enfermedades. Vilma Conci.
................................................................................................
Captulo 10: Obtencin de plantas resistentes a insectos. Dalia Lewi
y Clara Rubinstein ............... Captulo 11: Aplicaciones
biotecnolgicas al manejo de malezas. Germn Ferrari y Julio E. De-
lucchi.
..................................................................................................................................................
Captulo 12: Obtencin de plantas tolerantes a distintos tipos de
estreses abiticos. Florencia del Viso, Andrea F. Puebla, Nstor
Carrillo y Raquel L. Chan
.............................................................
Captulo 13: Manipulacin gentica del metabolismo secundario en
plantas. Alicia Zelada, Ma- ra Binaghi
...........................................................................................................................................
Captulo14:Mejorasdecalidadenalimentos.ClaraRubinstein,GabrielaLevitus
............................. Captulo 15: Fitorremediacin. Mara
Eugenia Segretn, Paula Bey yAlejandro Mentaberry .............
Captulo 16: Plantas como biorreactores. Fernando Bravo Almonacid,
Sonia Wirth, Mara Eugenia Segretin, Mauro Morgenfeld, Ezequiel
Matas Lentz.
.........................................................................
Parte VI: Manejo responsable de la tecnologa Captulo 1: Criterios
cientficos para la evaluacin de la bioseguridad de Organismos
Genti- camente Modificados. Clara Rubinstein
...........................................................................................
Captulo 2: Bioseguridad de Organismos Genticamente Modificados -
Marcos Regulatorios. Moiss Burachik
..................................................................................................................................
Captulo 3: Flujo gnico y su posible impacto ambiental. Mnica
Poverene, Soledad Ureta y Agustina Gutirrez.
.............................................................................................................................
Captulo 4: Deteccin de OGM en la cadena agroalimentaria. Florencia
Longo y Ana Vicario. ....... Captulo 5: Manejo integrado de plagas
Programa de Refugios. Viviana Confalonieri y Cecilia Roca.
...................................................................................................................................................
Captulo 6: Resistencia de malezas a herbicidas: evolucin y
estrategias de manejo. Daniel Tuesca, Luisa Nisensohn, Mario R.
Sabbatini, Guillermo Chantre.
..................................................... Parte VII:
Biotecnologa y sociedad
Captulo1:Latransformacintecnolgicaylosnuevosdesafos.CarmenVicin.
..........................
7. 6 Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal II Captulo 2: Adopcin
de los cultivos genticamente modificados en Argentina y en el mun-
do. Gabriela Levitus
.........................................................................................................................
Captulo 3: Biotecnologa en la mira: el problema de la percepcin.
Valeria Durand ............... 639 643
8. 7Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal II PREFACIO En
oportunidad de la Primera Edicin de Biotecnologa y Mejoramiento
Vegetal, nos habamos propuesto responder a la necesidad de un texto
en idioma espaol, dirigido a docentes y estudian- tes de los cursos
de Agronoma y de otras formaciones relacionadas con las tecnologas
aplicadas al mejoramiento vegetal, as como brindar un recurso de
informacin general y consulta para no especialistas. Esta Segunda
Edicin, intenta actualizar, profundizar y extender estas temticas,
atendiendo a la rpida evolucin en este campo del conocimiento. En
el contexto de los principios bsicos del mejoramiento, es decir,
generar variabilidad genti- ca y seleccionar caractersticas
deseables, las tecnologas evolucionan rpidamente y, del mismo modo,
se acelera la transferencia del conocimiento bsico a las
aplicaciones. Esta edicin intenta reflejar este proceso dinmico y
aportar informacin actualizada con ejemplos de aplicaciones al
mejoramiento de diferentes especies vegetales. En este trabajo se
han reunido las contribuciones de investigadores y especialistas en
diferentes campos relacionados con el mejoramiento. En las
secciones dedicadas a las herramientas bsicas, se ha hecho foco en
las tcnicas de cultivo de tejidos y micropropagacin que se utilizan
en s mis- mas para generar variabilidad, conservar germoplasma,
producir clones libres de enfermedades o como paso obligado en la
construccin de plantas transgnicas. En la seccin que se ocupa de
las aplicaciones de estas tcnicas a casos especficos, se brindan
ejemplos de mejoramiento logrado en diferentes especies. La
tecnologas omicas (genmica, transcriptmica, metabolmica)
constituyen una de las herra- mientas ms importantes en el
mejoramiento, por la potencialidad que presentan, tanto en el campo
de la investigacin bsica, en el mapeo de genes y la identificacin
de marcadores moleculares, como en la identificacin de funciones y
redes regulatorias que influyen en las caractersticas que se desean
mejorar: resistencia a enfermedades y plagas, rendimiento, calidad
nutricional y respuestas a diferentes tipos de estrs ambiental,
entre otras. Es claro que dentro de las tecnologas de mejoramiento,
la transgnesis o transformacin ge- ntica es una de las herramientas
ms verstiles y poderosas, ya que permite resolver problemas que por
va del mejoramiento convencional no sera posible enfrentar. En esta
edicin se presentan numerosos ejemplos de transgnesis para la
obtencin de cultivos tolerantes a estrs bitico y abitico, a plagas
y enfermedades o con mejoras en su calidad nutricional. Desde 1996,
cuando se cultivaron por primera vez, la superficie mundial de
cultivos transgnicos aument 80 veces, alcanzando las 134 millones
de hectreas en 2009. Segn el ltimo informe del ISAAA (Servicio
Internacional para las Adquisiciones Agrobiotecnolgicas) estas
hectreas fueron cultivadas por 14 millones de agricultores de 25
pases, siendo Argentina uno de los lderes en adopcin, con el 16%
del rea global. Por otro lado, es importante notar que se han
establecido sistemas de control a nivel internacional para regular
el desarrollo y la aplicacin de la ingeniera gentica al
mejoramiento de organismos vivos (conocidos como organismos
genticamente modificados u OGMs). Si bien stos no se limitan a
plantas, en este trabajo se presentan slo los aspectos regulatorios
y de bioseguridad relaciona- dos con los cultivos transgnicos.
Esperamos que esta nueva edicin constituya una herramienta til y
accesible para docentes, estudiantes y profesionales que se dedican
y se dedicarn a la noble tarea de mejorar la agricultura. Los
Editores
9. 8 Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal II AGRADECIMIENTOS A
todos y cada uno de los 141 autores, en su mayora investigadores y
profesionales de institu- ciones argentinas, que han contribuido
con sus aportes. Al Dr. Francisco Garca Olmedo, reconocido
investigador y catedrtico espaol, por regalarnos tambin el prlogo
de esta segunda edicin. Al Consejo Argentino para la Informacin y
el Desarrollo de la Biotecnologa (ArgenBio), por aus- piciar la
publicacin del libro. A los revisores, colegas y personal de apoyo,
por sus valiosas contribuciones para concretar este proyecto. Los
Editores El uso de fuentes y nombres comerciales en este documento
es slo para fines de identificacin y no implica ningn aval ni
recomendacin. Adems, los contenidos u opiniones expresadas en esta
publicacin son de exclusiva responsabilidad de los autores. LISTAS
DE AUTORES (por orden alfabtico) Abriata Luciano A. Instituto de
Biotecnologa, INTA Castelar Aguilar O. Mario IBBM, Facultad de
Ciencias Exactas, UNLP Almasia Natalia Instituto de Biotecnologa,
INTA Castelar Altieri Emiliano Nidera Semillas Asurmendi Sebastin
Instituto de Biotecnologa, INTA Castelar Bazzini Ariel Instituto de
Biotecnologa, INTA Castelar Bey Paula INGEBI, CONICET Binaghi Mara
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, UBA Bravo Almonacid
Fernando INGEBI, CONICET Bulos Mariano Nidera Semillas Burachik
Moiss Dir. de Biotecnologa, Min. de Agricultura, Ganadera y Pesca
Cardone Susana Facultad de Agronoma, UBA Carrari Fernando Instituto
de Biotecnologa, INTA Castelar Carrera Alicia Departamento de
Agronoma, Universidad Nacional del Sur Carrillo Nstor IBR -
Facultad de Cs Bioquimicas y Farmaceuticas, UNR Casati Paula
CEFOBI, Universidad Nacional de Rosario Castagnaro Atilio Pedro
EEAOC, Tucumn Cervigni Gerardo D. CEFOBI, Universidad Nacional de
Rosario Chalfoun Nadia INSIBIO, CONICET, Universidad Nacional de
Tucumn Chan Raquel L. Universidad Nacional del Litoral Chantre
Guillermo CERZOS, CONICET, Universidad del Sur Conci Vilma INTA
IFFIVE Confalonieri Viviana Facultad de Ciencias Exactas y
Naturales (UBA) Conti Vernica INTA-EEA Bordenave del Vas Mariana
Instituto de Biotecnologa, INTA Castelar del Viso Florencia
Instituto de Biotecnologa, INTA Castelar Delucchi Julio E. Monsanto
Argentina
10. 9Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal II Daz Marina L.
CERZOS, CONICET, Universidad del Sur Daz Ricci Juan Carlos INSIBIO,
CONICET, Universidad Nacional de Tucumn DiRienzo Miguel Facultad de
Agronoma, Universidad Nacional de Crdoba Distfano Ana Julia
Instituto de Biotecnologa, INTA Castelar Drincovich Mara F. CEFOBI,
Universidad Nacional de Rosario Durand Valeria Ketchum Argentina -
ArgenBio Echenique Viviana Departamento de Agronoma, Universidad
Nacional del Sur Escandn Alejandro S. Instituto de Floricultura,
INTA Castelar Feingold Sergio E. INTA - EEA Balcarce Felitti
Silvina Universidad Nacional de Rosario Fernndez Aveliano Fac. Cs
Exactas y Naturales y Agrimensura UNNE IBONE Fernndez Paula
Instituto de Biotecnologa, INTA Castelar Ferrari Germn Monsanto
Argentina Ferrari Mara Rosa Universidad Nacional de Buenos Aires
Filippone Paula EEAOC, Tucumn Flaschland Eduardo Facultad de
Ciencias Agrarias (UNNE) IBONE Franzone Pascual M. IGEAF INTA
Castelar Fresco Anala Nidera Semillas Friedrich Pablo Universidad
Nacional del Sur Fusari Corina Instituto de Biotecnologa, INTA
Castelar Galdeano Ernestina Facultad de Ciencias Agrarias (UNNE)
IBONE Gallo Leonardo INTA - EEA Bariloche Garayalde Antonio CERZOS,
CONICET, Universidad Nacional del Sur Garbus Ingrid CERZOS,
CONICET, Universidad Nacional del Sur Garca Ana Mara Facultad de
Agronoma, UBA Garca Olmedo Francisco Universidad Politcnica de
Madrid Gear Nicols Syngenta Gmez Marisa CERZOS, CONICET,
Universidad Nacional del Sur Gonzlez Graciela Facultad de Ciencias
Exactas y Naturales, UBA Grasso Daniel H. Instituto de Suelos, INTA
Castelar Greizerstein Eduardo Facultad de Ciencias Exactas y
Naturales UBA Grellet Carlos INSIBIO, CONICET, Universidad Nacional
de Tucumn Gutirrez Agustina Universidad Nacional del Sur Heinz Ruth
Instituto de Biotecnologa, INTA Castelar Helguera Marcelo INTA EEA
Marcos Jurez Hopp Esteban Instituto de Biotecnologa, INTA Castelar
Ibez Mercedes Universidad Nacional de Ro Cuarto Labarta Marcelo
Instituto Nacional de Semillas INASE Landau Alejandra Instituto de
Biotecnologa, INTA Castelar Lavia Graciela I. Fac. de Cs Exactas y
Naturales y Agrimensura UNNE, IBONE Lentz Ezequiel M. INGEBI,
CONICET Levitus Gabriela ArgenBio Lewi Dalia IGEAF INTA Castelar
Lia Vernica Instituto de Biotecnologa, INTA Castelar Longo
Florencia Instituto de Biotecnologa, INTA Castelar Loray Mara
Alicia Direccin de Calidad - INASE Luciani Gabriela CERZOS,
CONICET, Universidad Nacional del Sur Mamani Alicia INSIBIO,
CONICET, Universidad Nacional de Tucumn Marcucci Poltri Susana
Instituto de Biotecnologa, INTA Castelar Marfil Carlos F. INTA -
EEA Mendoza Marinangeli Pablo A. CERZOS, CONICET, Universidad
Nacional del Sur Martnez Ma. Carolina Instituto de Biotecnologa,
INTA Castelar
11. 10 Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal II Martnez-Zamora
Gustavo INSIBIO, CONICET, Universidad Nacional de Tucumn Masuelli
Ricardo W. INTA - EEA Mendoza Meier Mauro CERZOS, CONICET,
Universidad Nacional del Sur Mentaberry Alejandro Facultad de
Ciencias Exactas y Naturales, UBA Miranda Rubn Asociacin
Cooperativas Argentinas (ACA), Univ. del Sur Morgenfeld Mauro
INGEBI, CONICET Mroginski Luis Facultad de Ciencias Agrarias (UNNE)
IBONE Nisensohn Luisa Universidad Nacional de Rosario Olmos Sofa
Laboratorio de Biotecnologa, INTA Pergamino Ontivero Marta INSIBIO,
CONICET, Universidad Nacional de Tucumn Ortiz Juan Pablo Facultad
de Ciencias Agrarias, UNR Pacheco Ma. Gabriela IGEAF INTA Castelar
Paniego Norma Instituto de Biotecnologa, INTA Castelar Prez Camargo
Gladys Facultad de Agronoma, UBA Prez de la Torre Mariana Instituto
de Floricultura, INTA Castelar Pessino Silvina C. Facultad de
Ciencias Agrarias, UNR Picca Aurora Departamento de Agronoma,
Universidad Nacional del Sur Poggio Lidia Facultad de Ciencias
Exactas y Naturales, UBA Polci Pablo Departamento de Agronoma,
Universidad Nacional del Sur Poverene Mnica Departamento de
Agronoma, Universidad Nacional del Sur Prina Alberto IGEAF INTA
Castelar Puebla Andrea F. Instituto de Biotecnologa, INTA Castelar
Radice Silvia INTA Castelar Rey Hebe Facultad de Ciencias Agrarias
(UNNE) - IBONE Ros Ral D. IGEAF INTA Castelar Rivero Mercedes
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, UBA Robledo Germn Fac. de
Cs Exactas y Naturales y Agrimensura UNNE, IBONE Roca Cecilia Dow
Agrosciences Rodrguez Cecilia Instituto de Biotecnologa, INTA
Castelar Roncallo Pablo CERZOS, CONICET Rubinstein Clara Monsanto
Argentina ILSI Sabbatini Mario R. CERZOS, CONICET, Universidad
Nacional del Sur Sala Carlos Nidera Semillas Salazar Sergio
INSIBIO, CONICET, Universidad Nacional de Tucumn Sansberro Pedro
Facultad de Ciencias Agrarias (UNNE) - IBONE Scarpeci Telma E. IBR
- Facultad de Cs Bioquimicas y Farmaceuticas, UNR Schrauf Gustavo
Facultad de Agronoma, UBA Scocchi Adriana Facultad de Ciencias
Agrarias (UNNE) - IBONE Segretin Ma. Eugenia INGEBI, CONICET Seijo
Guillermo Fac. de Cs Exactas y Naturales y Agrimensura UNNE, IBONE
Selva Juan P. CERZOS, CONICET, Universidad Nacional del Sur Sharry
Sandra Facultad de Agronoma, Universidad Nacional de La Plata Sols
Neffa Viviana G. Facultad de Ciencias Agrarias (UNNE) IBONE
Spangenberg Germn Victorian Department of Primary Industries (DPI)
Tomas Pablo FCA, Universidad Nacional del Litoral Tonello Ursula
INSIBIO, CONICET, Universidad Nacional de Tucumn Torales Susana
IRB, INTA Castelar Tranquilli Gabriela IRB, INTA Castelar Tuesca
Daniel Facultad de Ciencias Agrarias, UNR Ureta Soledad CERZOS,
CONICET, Universidad Nacional del Sur Valle Estela M. IBR -
Facultad de Cs Bioqumicas y Farmaceuticas, UNR Vzquez Rovere
Cecilia Instituto de Biotecnologa, INTA Castelar
12. 11Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal II Vellicce Gabriel
EEAOC, Tucumn Vicario Ana Laura Direccin de Calidad INASE Vicin
Carmen Facultad de Agronoma, UBA Vila Alejandro J. IBR - Facultad
de Cs Bioqumicas y Farmaceuticas, UNR Vojnov Adrin Fundacin Pablo
Cassar Winzer Nlida Universidad Nacional del Sur Wirth Sonia
INGEBI, CONICET Wulff Arturo Facultad de Ciencias Exactas y
Naturales, UBA Zappacosta Diego C. Departamento de Agronoma,
Universidad Nacional del Sur Zelada Alicia Facultad de Ciencias
Exactas y Naturales, UBA Zelener Noga IRB, INTA Castelar PRLOGOS
Prlogo a la primera edicin Recientemente, un periodista, que
comparta una ensalada con un bilogo, exclam: Si yo slo aspiro a que
la lechuga que yo tenga que consumir no tenga genes! Cuando el
bilogo le explic que al comer sta no haba ms opcin que engullir
unos 25.000 genes del genoma de Lactuca sativa y varios miles de
genes adicionales correspondientes a los genomas de los mi-
croorganismos que habitual y cmodamente habitan en la superficie de
las turgentes hojas, el periodista qued atnito. Segn un
eurobarmetro de hace unos meses, ms de dos tercios de los europeos
estaban en contra de los alimentos transgnicos. Sin embargo, en la
misma encuesta se inclua una aseve- racin - los tomates normales no
tienen genes, los transgnicos s - frente a la que tambin ms de dos
tercios de los encuestados se mostraban de acuerdo o confesaban su
ignorancia. Es una lstima que dicho eurobarmetro no registrara la
proporcin correspondiente al encabezamiento no saben, pero s
contestan, aunque es fcil colegir que dicha fraccin era alta y en
extremo vergonzante. Los avances del conocimiento biolgico y de la
biotecnologa destacan en el panorama cien- tfico-tcnico de este fin
de siglo y han impregnado las ms diversas vertientes de nuestra
vida cotidiana sin que se haya aceptado que un mnimo de estos
conocimientos debera formar parte integral de la cultura general.
La ignorancia de los hechos bsicos relativos a nuestra herencia
gentica o a nuestra alimentacin se considera incluso de buen tono.
Esto se refleja de entrada en el caos semntico que se ha creado en
torno a la biotecnologa, del que hay que culpar no slo a la
ignorancia del ciudadano sino tambin a la torpeza de los cientficos
y a la dictadura de los medios de comunicacin. Es preciso despejar
este caos si queremos entendernos a partir de la ciencia, y no a
sus espaldas. Trminos tales como organismos genticamente
modificados (OGMs), alimentos transgni- cos, ingeniera gentica, ADN
recombinante, transferencia gnica, clonacin, alimentos natura- les,
mejora gentica e, incluso, biotecnologa, han invadido nuestro
lenguaje cotidiano sin orden ni concierto. A estas alturas empieza
a ser difcil normalizar la situacin, pero tratemos de con- tribuir
a ello. La definicin de biotecnologa abarca a todas las tecnologas
mediadas por un ser vivo o por partes de l, sean stas clulas o
enzimas aisladas. Bajo esta definicin se incluyen desde la propia
agricultura, inventada hace diez milenios, y la fabricacin de las
veinticuatro clases de cerveza mesopotmica, que tanto gustaban a
Nabucodonosor, hasta la ltima forma de producir
13. 12 Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal II insulina humana.
No es apropiado, por tanto, usar el trmino de forma restringida
para referirse exclusivamente a los ltimos avances basados en la
biologa molecular. Para esto ltimo resulta ms adecuado el uso de la
expresin biotecnologa molecular. Prcticamente la totalidad de lo
que ponemos en nuestra mesa ha sido genticamente modifi- cado. La
domesticacin de plantas y animales supuso una alteracin muy drstica
de sus geno- mas y la mejora gentica subsiguiente ha ido aadiendo
modificaciones extensas y sustanciales. Lo importante es la
naturaleza de los cambios introducidos y no los mtodos empleados
para ello. De hecho, la ingeniera gentica es slo uno de esos mtodos
- una modalidad ms de me- jora gentica - y slo sirve para modificar
uno o pocos genes de forma muy selectiva. No servira para obtener
razas de perro tan distintas - en su tamao, morfologa y
temperamento - como el Chihuahua y el Pit Bull Terrier, que en
cambio han surgido de la mano del hombre gracias a los mtodos
genticos ms tradicionales. En consecuencia, resulta absurdo
denominar OGMs slo a los productos de la ingeniera gentica para
contraponerlos a los supuestamente naturales. Casi nada de lo que
ponemos en nuestra mesa es natural, hasta el punto que la mayora de
los organismos de los que derivamos nuestro alimento han perdido su
capacidad de sobrevivir por s mismos en la naturaleza. Es ms, para
llegar a nuestra mesa han debido sufrir alteraciones genticas que
les priven de infinidad de sustancias naturales que son txicas o
inhibitorias para el ser humano. Una variedad moderna, modificada
por ingeniera gentica, est tan lejos de ser natural como las que la
precedieron. Por fortuna! Ya que es obvio que natural no es sinnimo
de inocuo. Se consideran organismos transgnicos aquellos cuyo
genoma ha sido alterado por ingeniera gentica o, si se prefiere,
por sastrera gentica, ya que las operaciones fundamentales de esta
va experimental consisten en cortar y coser (unir) piezas de ADN.
Un gen es un tramo de ADN (una secuencia construida con las bases
A, T, G, C) que, en general, determina una protena (una secuencia
de aminocidos), de acuerdo con las equivalencias plasmadas en la
clave gentica. Mediante la nueva tecnologa se puede alterar un
genoma por la adicin de uno o varios (pocos) genes que previamente
no formaban parte de l o por la inutilizacin de uno o varios genes
entre los ya existentes. Estas operaciones se hacen para conferir
caracteres deseables y para eliminar caracteres indeseables del
organismo, respectivamente, objetivos que no difieren de los de la
mejora gentica tradicional. En lo que difieren la vieja y la nueva
tecnologa es en el repertorio gnico que se puede mane- jar - genes
de la misma especie, en el caso de la vieja, y de cualquier
especie, en el de la nue- va - y en el modo de introducir y
transferir la modificacin gentica, por va sexual o por adicin
exgena (transformacin), respectivamente. Los organismos modificados
por transformacin se suelen denominar transgnicos. Llamar
transgnicos a los alimentos derivados de dichos orga- nismos
resulta menos apropiado porque, como dice el refrn, degradado es
todo gen que entra por boca de cristiano. Es absurdo llamar
transgnico al azcar procedente de una remolacha transgnica, ya que
es un producto qumico puro, esencialmente indistinguible del
aislado de la remolacha normal o de la caa de azcar. Con acertado
criterio, los editores de esta obra han adoptado un tratamiento
integral de todos los mtodos, objetivos y logros de la alteracin
gentica de las plantas con fines prcticos. Faltan en nuestro idioma
obras que acerquen con rigor a una parte tan importante de nuestra
cultura general. Las adaptaciones a los nuevos avances de textos
preexistentes, hechas a menudo por un nico autor, suelen adolecer
de falta de familiaridad con la nueva tecnologa. De aqu que la
aproximacin adoptada en esta obra, segn la cual cada captulo est a
cargo de verdaderos especialistas, sea la ms apropiada en la
actualidad. Dr. Francisco Garca Olmedo, 2004
14. 13Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal II Prlogo a la
segunda edicin La buena fortuna de un libro lleva aparejada la
esclavitud de su autor o autores, que quedan encadenados a la
necesidad de mantenerlo vivo en sucesivas ediciones. Estamos ante
la segunda edicin de Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal, un texto
que, hace seis aos, supuso una es- plndida y afortunada aportacin a
la recensin de un rea tecno-cientfica en vigorosa ebullicin y de
gran relevancia prctica. La necesidad de esta edicin surge de
mltiples circunstancias, entre las que cabe resaltar el enorme
avance del conocimiento que ha tenido lugar, la redefinicin de los
retos entonces planteados y la aparicin de otros nuevos que han
diversificado los objetivos prcticos de la disciplina. Adems, entre
la aparicin de la primera edicin y la de esta segunda, ha ocurrido
una crisis alimentaria significativa que no es separable de otras,
tales como la econmica, la climtica o la energtica. Segn todos los
indicios, la crisis alimentaria va a ser duradera y obedece a
factores mltiples: la subida del precio del petrleo, el bajo nivel
de reservas, la especulacin, el incremento de la pobla- cin y del
consumo per capita, el desvo de una parte sustancial de la
produccin agraria hacia la fabricacin de biocombustibles, la
disminucin de los rendimientos por el estrs debido al cambio
climtico y la falta de inversin en innovacin agropecuaria. Parece
como si el xito relativo de las ltimas dcadas hubiera hecho bajar
la guardia. En particular, la tasa de crecimiento de la produccin
de alimentos ha ido por detrs de la del crecimiento de la poblacin
durante la ltima dcada, justo el tipo de comportamiento relativo
que propuso Malthus hace ms de dos siglos. En el ltimo medio siglo,
ha sido la mejora gentica la que ha tenido el protagonismo tcnico
en la derrota de la amenaza maltusiana, ya que la superfi- cie de
suelo laborable apenas ha crecido. En la actualidad, se ha
adquirido de pronto conciencia de que no se sabe bien cmo se va a
conseguir el aumento de la produccin de alimentos en un 70-100 %
para el ao 2050, necesidad que se considera mnima para alimentar
una poblacin pro- yectada de unos 9.000 millones de seres humanos
que, adems, tendrn una demanda per cpita significativamente
superior a la actual. Si se quiere lograr dicho objetivo, habremos
de ser an ms eficaces en las prximas dcadas de lo que lo hemos sido
en las precedentes. Por supuesto, las respuestas a los retos
planteados ni han sido ni sern exclusivamente tcni- cas, pero todas
las estrategias posibles han tenido y tendrn un importante
componente tcnico y es sobre este componente sobre el que se centra
el libro que ahora se reedita. El cambio climtico est alterando los
estreses biticos y abiticos a que deben hacer frente las cosechas,
lo que hace prioritaria la investigacin bsica y aplicada tanto en
el esclarecimiento de los mecanismos involucrados como en la
adaptacin de las cosechas tradicionales a las nuevas condiciones,
as como el desarrollo de nuevas cosechas que sean ms apropiadas
para condicio- nes extremas. La crisis energtica ha impulsado un
nuevo inters por los biocombustibles, en los que se han centrado
algunas esperanzas infundadas que han dado lugar a la formulacin de
objetivos polticos que pueden tener consecuencias perjudiciales
para la alimentacin mundial. As por ejemplo, los objetivos
declarados para fechas prximas, tanto por lo EEUU como por la UE,
estn determinando una competencia por el suelo agrcola de la
generacin de biocombustibles con la produccin de alimentos que no
puede sino encarecer significativamente los alimentos y aumentar el
nmero de hambrientos en el mundo, as como contribuir a la
destruccin de bosque tropical. Por otra parte, La bsqueda de
especies y variedades aptas para la produccin de biocombustibles
plantea retos formidables a la investigacin de su agronoma y a su
mejora convencional y biotecnolgica. Es en el escenario que a
grandes rasgos acabamos de esbozar, donde la presente edicin de
Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal II manifiesta su pleno
potencial y debe alcanzar su mxi- ma funcionalidad. Dr. Francisco
Garca Olmedo, 2010
15. 14 Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal II
16. 15Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal II Parte I
Herramientas bsicas
17. 16 Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal II
18. 17Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal II I - CAPTULO 1
Establecimiento de cultivos de tejidos vegetales Luis Mroginski,
Pedro Sansberro y Eduardo Flaschland 1 Introduccin El cultivo de
tejidos en su acepcin amplia puede ser definido como un conjunto
muy hete- rogneo de tcnicas que presentan en comn el hecho de que
un explante (una parte sepa- rada del vegetal que pueden ser
protoplastos clulas desprovistas de pared celular clulas, tejidos u
rganos) se cultiva aspticamente en un medio artificial de
composicin qumica de- finida y se incuba en condiciones ambientales
controladas. La imprecisin de esta definicin puede generar muchas
polmicas, pero es ac- tualmente aceptada. Generalmente es comn
dividir las tcnicas del cultivo de tejidos en dos grandes grupos:
a) cultivos en medios semis- lidos y b) cultivos en medios lquidos,
los que a su vez pueden ser agitados (mediante el em- pleo de
agitadores de uso continuo) o estacio- narios. Tambin es frecuente
dividir al cultivo de tejidos atendiendo a los niveles de comple-
jidad en cultivo de rganos, cultivos celulares y cultivo de
protoplastos. Para el establecimien- to de los cultivos utilizando
cualquiera de los sistemas es necesario tener en cuenta algunos
aspectos generales comunes relacionados con el explante, la
asepsia, el medio de cultivo y las condiciones de incubacin. La
discusin de estos aspectos constituye el objetivo de este captulo.
Adicionalmente se incluye el tema de la aclimatacin de las plantas
regeneradas in vitro, que es de gran importancia en la mayora de
las aplicaciones del cultivo de tejidos en la agricultura. 2
Explante Varios factores deben ser tenidos en cuenta en la eleccin
del explante apropiado para el establecimiento de los cultivos in
vitro, entre ellos: 1. Objetivo del cultivo: si bien es difcil
tratar de clasificar las aplicaciones que se persiguen con el
cultivo de tejidos, se podra esquemati- zarlas en aplicaciones
para: Estudios bsicos. En este caso, los explan- tes cultivados
pueden ser diversos. Si lo nico que se quiere lograr es un sistema
de callos para estudiar algn proceso fisiolgico, se puede cultivar
cualquier rgano, tejido o clula viva. En este caso en que lo nico
que se bus- ca es la induccin de callos lo ideal es cultivar
explantes jvenes, derivados de semillas en germinacin, donde se
obtienen respuestas r- pidas y, en general, hay menores problemas
de contaminacin con microorganismos. A veces se hace uso del
cultivo de tejidos porque repre- senta un sistema experimental que
simplifica la complejidad generada por los fenmenos de correlacin
entre las distintas partes que normalmente estn presentes en una
planta entera. El explante que se usar estar condi- cionado por lo
que se quiere estudiar. Un buen ejemplo lo constituye el cultivo de
ovarios fe- cundados del tomate para estudiar los reque- rimientos
nutricionales durante el crecimiento de los frutos. Asimismo, el
cultivo de vulos ha sido muy til para estudiar aspectos relaciona-
dos con la formacin de las fibras en algodn. El cultivo de discos
de tallos brind una valiosa ayuda para estudiar la rizognesis in
vitro. Obtencin de plantas con sanidad contro- lada. Es muy comn la
utilizacin del cultivo de tejidos para la obtencin de plantas
libres de virus (ver VIII.-9). El explante ideal para ello es el
meristema (dependiendo de la especie, de 0,2-0,5mm de longitud)
consistente del domo y de un par de primordios foliares.
Micropropagacin. En este caso depende- r del sistema que se quiere
utilizar. Si lo que se quiere explotar es la brotacin de meris-
temas, los pices terminales y los segmentos uninodales de ramas
jvenes constituyen ex- celentes explantes. En este caso el cultiva-
dor de tejidos debe conocer perfectamente la biologa de la
reproduccin de la planta para aprovechar aquellos explantes que en
forma natural son propgulos. En cambio, si se pre- tende
micropropagar mediante el empleo de semillas sintticas (ver Parte
IV, captulo 2) el explante original deber posibilitar la
induccin
19. 18 Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal II de la
embriognesis somtica. En este caso, la utilizacin de embriones
zigticos inmaduros u hojas, suelen ser frecuentes como explantes.
Obtencin de hbridos interespecficos. Una de las primeras
aplicaciones del cultivo de tejidos en la agricultura lo constituy
su empleo como ayuda para la obtencin de hbridos deri- vados de
cruzamientos interespecficos, donde se produce el aborto temprano
de embriones. En estos casos, el explante cultivado es el embrin
cigtico en estadios tempranos de su desarrollo. Con la misma
finalidad tambin se utilizan ovarios u vulos fecundados. Obtencin
de plantas de semillas con em- briones rudimentarios. Para esta
finalidad los explantes pueden ser semillas (por ej. orqu- deas) o
bien, se aslan los embriones en un es- tado temprano de desarrollo
(corazn) como en el caso de yerba mate o de algunas varieda- des de
duraznero. Obtencin de plantas haploides (consi- derando como
haploide a un esporofito que contiene el complemento gamtico de
cromo- somas). En este caso, los explantes ms uti- lizados son las
anteras, aunque tambin pue- den emplearse microsporas aisladas,
vulos y ovarios no fertilizados. Induccin de variacin somaclonal.
En este caso se pueden utilizar varios explantes, pero si la
finalidad de su utilizacin es la aplicacin en planes de
mejoramiento gentico de plan- tas, los explantes utilizados deben
posibilitar la regeneracin de plantas enteras. Produccin y/o
conversin de sustancias tiles. Se puede utilizar una gran variedad
de explantes. Los de races suelen ser muy utilizados. Obtencin de
hbridos somticos. Para esta finalidad se recurre a la fusin de
protoplastos. En la mayora de los casos se aslan los proto- plastos
de mesfilos de hojas y de suspensio- nes celulares. Conservacin e
intercambio de germo- plasma. Los meristemas son los explantes
preferidos para el desarrollo de sistemas de conservacin a mediano
y largo plazo (cro- conservacin con nitrgeno lquido) y para el
intercambio de material gentico. Establecimiento de suspensiones
celula- res. En este caso se recomienda iniciar los cul- tivos a
partir de explantes extrados de semillas en germinacin (hipoctilo,
epictilo, cotiledo- nes, races). 2. Posibilidad de contaminacin con
mi- croorganismos. De ser posible, se deben cul- tivar explantes de
plantas donantes que crecen en condiciones de invernadero, con ello
se reduce sustancialmente las tasas de contami- nacin. Por otra
parte, es recomendable evitar el uso de explantes sucios (races,
rizomas) que provienen de plantas crecidas en macetas o en el
campo, dado que en la mayora de los casos no es posible conseguir
una buena des- infeccin de los mismos. 3. Edad fisiolgica. Este es
un aspecto de gran influencia en la morfognesis. Como regla general
se puede decir que cuando ms joven e indiferenciado se encuentre el
explante a cul- tivar, mejor ser su respuesta in vitro. Es por ello
que los meristemas apicales y axilares son ampliamente usados en
numerosas especies. En el caso de la micropropagacin de plan- tas
leosas, la edad del explante es un factor crtico. Si los tejidos
son jvenes, la micropro- pagacin tiene mayores posibilidades de ser
exitosa que con tejidos maduros. Este hecho genera la necesidad de
realizar tratamientos de rejuvenecimiento de las plantas donantes
de explantes. 4. Tamao. En general, cuanto ms grande sea el
explante mayores sern las posibilida- des de inducir la
proliferacin de callos o la re- generacin directa de rganos. Sin
embargo, a mayor tamao de explante tambin son ma- yores las
probabilidades de que los cultivos se contaminen con
microorganismos. Tambin es necesario tener en cuenta que existe un
ta- mao mnimo del explante, que depende de la especie y del
material vegetal, por debajo del cual no es fcil lograr el
establecimiento de los cultivos. Los explantes muy pequeos suelen
requerir del empleo de medios ms complejos o de los denominados
medios acondicionados. 5. Epoca del ao. Es un factor que suelen
tener mucha importancia en la micropropa gacin y que generalmente
est asociado al
20. 19Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal II grado de dormicin
que presentan ciertos ex- plantes (yemas, por ejemplo) y tambin con
la posibilidad de mayor o menor proliferacin de microorganismos. 3
Asepsia Uno de los principales problemas que se presentan cuando se
tratan de establecer los cultivos es el de la contaminacin de los
mis- mos con diversos tipos de microorganismos (hongos, levaduras,
bacterias, fitoplasmas, vi- rus). El ambiente generado por
explante-medio de cultivo-condiciones fsicas de incubacin es
altamente propicio para la proliferacin de muchos de estos
microorganismos que pue- den provocar la destruccin de los
cultivos. Es difcil cuantificar el impacto de estas prdidas, pero
en promedio, en laboratorios dedicados a la micropropagacin se lo
puede estimar en al- rededor del 10%. En el mejor de los casos, es-
tos microorganismos no destruyen los cultivos pero compiten con el
explante por los nutrien- tes del medio de cultivo o bien lo
modifican. Es muy difcil conseguir cultivos estrictamen- te
aspticos dado que en la mayora de los casos es altamente probable
que los mismos contengan virus y fitoplasmas, por lo que en la
prctica, cuando se refiere a cultivos asp- ticos, en general se
quiere significar que son cultivos donde no se produce la
proliferacin de hongos y bacterias. Dos son las fuentes de
contaminaciones: a) microorganismos presentes en el interior o en
la superficie de los explantes y b) fallas en los procedimientos de
cultivo en el laboratorio. La correcta deteccin de estas fuentes y
del tipo de microorganismo son aspectos importantes para el xito de
los cultivos, pues por un lado ayuda a determinar la fuente de
contaminacin y por otro lado, ayuda a la planificacin de los
procedimientos para controlarlos. Varios gne- ros de bacterias
(Pseudomonas, Xanthomonas, Erwinia, Enterobacter,Agrobacterium,
Bacillus, Micrococcus, Staphylococcus, Lactobacillus,
Mycobacterium, Corynebacterium) y de hon- gos filamentosos
(Aspergillus, Penicilium, Fusarium, Alternaria, Cladosporium y
Neurospora) estn frecuentemente en los cul- tivos. Es conveniente
inspeccionar visualmen- te con la ayuda de un microscopio estereos-
cpico los cultivos en forma peridica (por lo menos semanalmente).
Tambin se pueden realizar pruebas con medios de cultivo dife-
renciales y test bioqumicos especficos. Para evitar y/o minimizar
las contaminacio- nes de los cultivos con microorganismos es
necesario: 1) Conocer el material vegetal con que se tra- baja y
los posibles contaminantes especficos. 2) Realizar una adecuada
preparacin de la planta dadora de explantes, cultivndola pre-
ferentemente en invernaderos tratadas con productos qumicos que
eliminen patgenos y eventuales microorganismos endfitos. 3)
Proceder a la desinfeccin superficial de los explantes mediante el
uso de compuestos qumicos con el objeto de eliminar los micro-
organismos con el menor dao posible para el explante. Si bien no es
posible recomendar un procedimiento general, se puede sealar que el
procedimiento ms popularizado con- siste en una doble desinfeccin
mediante la inmersin de los explantes en etanol (70%v/v) durante
20-60 segundos seguido de hipoclo- rito de sodio 1 -3%, contenido
en el agua de lavandina comercial, durante 3 a 30 minutos,
dependiendo de la naturaleza del explante. Algunos procedimientos
se basan en el em- pleo de nicamente etanol o de hipoclorito de
sodio. Finalmente, es necesario eliminar los restos de estos
productos mediante varios la- vados con agua destilada estril. En
este ltimo punto hay que aconsejar que se utilice agua destilada
estril de reciente preparacin, dado que est demostrado que el
almacenaje prolongado del agua estril puede ser la causa de
contaminaciones con bacte- rias. Es aconsejable realizar estas
operacio- nes de desinfeccin superficial en una cmara de
transferencia con aire estril. En lugar del hipoclorito de sodio se
puede utilizar hipoclori- to de calcio (6 -12 %) o el cloruro de
mercurio (0,1%- 1,5%). Es preciso recomendar extrema cautela con el
empleo de este ltimo compues- to, dado que es altamente txico y
adems no es removido con facilidad del explante.
21. 20 Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal II En los casos en
que no se utilice etanol, la adicin de agentes tensoactivos junto
con el desinfectante es una prctica recomendada. Entre los ms
usados figuran Tween-20 (0,01 0.1%) o unas gotas de Triton. El
lavado pre- vio de los explantes con agua corriente y de-
tergentes, ayuda a una mejor desinfeccin. La inmersin de los
explantes en soluciones con- teniendo sustancias antibiticas y /o
antimic- ticas (gentamicina, sulfato de estreptomicina, ampicilina,
tetraciclina, carbenicilina, sulfato de gentamicina,
pentacloronitrobenceno, rifam- picina, anfotericina B, benomil,
carbendazim) puede ser de utilidad, pero deben ser utilizados en
casos excepcionales. Estos productos tienen el inconveniente de que
alteran la composicin de los medios de cultivo y adems pueden ser
metabolizados por los explantes. ltimamente han aparecido
soluciones bio- cidas que matan bacterias y hongos, previenen la
germinacin de esporas y a altas concen- traciones pueden eliminar
contaminaciones de microorganismos endfitos. Uno de estos
compuestos es el PPM (Plant Preaservative Mixture). Otro ejemplo es
el denominado G-1, un compuesto derivado de los furfurales de la
caa de azcar. Este compuesto, qumicamen- te: 1-(5-bromofur-2-il)-2-
bromo-2-nitroeteno fue desarrollado en la Universidad Central de
las Villas (Cuba) y tiene efecto bactericida y fungicida de amplio
espectro. En los casos en que se utilicen plntulas cre- cidas in
vitro como plantas donantes de explan- tes, es necesario
desinfectar las semillas para su cultivo y germinacin y luego es
aconsejable desinfectar tambin las plntulas resultantes. En algunos
materiales vegetales se utiliza la preincubacin de los explantes
mediante lo cual stos son desinfectados suavemente y precultivados
durante 24 horas en un medio conteniendo sacarosa, y finalmente son
desin- fectados nuevamente y cultivados. 4) Emplear medios e
instrumentos de cultivo esterilizados, es decir, liberados
completamen- te de cualquier microorganismo vivo o espo- ras. Para
la esterilizacin, en la mayora de los casos se hace uso del calor
en sus diversas formas: llama directa, calor hmedo (en forma de
vapor abierto o bajo presin), calor seco (aire caliente). Se pueden
usar hornos a mi- croondas. El agua caliente tambin puede ser
usada. En el caso de sustancias termolbiles, la esterilizacin se
puede hacer mediante fil- tracin a travs de filtros bacteriolgicos.
No es posible recomendar ningn sistema de esterilizacin dado que la
exitosa destruc- cin de los microorganismos depende de ml- tiples
factores entre los que interesan el tama- o del recipiente, el
tiempo de esterilizacin y la naturaleza de la sustancia a
esterilizar. Sin embargo, se pueden dar algunas sugerencias: La
esterilizacin en estufas mediante calor seco (aire caliente) es
recomendable para es- terilizar recipientes de vidrios secos
(pipetas, cpsulas de Petri, tubos). En estos casos, 2-4 horas en
estufas a 180-200 C brindan exce- lentes resultados. La
esterilizacin con calor hmedo con va- por bajo presin (en autoclave
o en una olla a presin). Es el procedimiento ms empleado para la
esterilizacin de los medios de cultivo (salvo, como se indic ms
arriba, para aque- llos que posean componentes termolbiles). En
este caso, lo ms comn es usar una pre- sin de 1.46 kg.cm-2 durante
20 minutos, con lo que prcticamente se destruyen todas las formas
de vida. Es importante que en todos los puntos del autoclave se
alcance dicha tem- peratura, para lo cual hay disponibles cintas
detectoras colorimtricas. 5) Cultivar los explantes en una cmara de
transferencia con aire estril (gabinete de flu- jo laminar),
localizada en un ambiente limpio y no expuesta a corrientes de
aire. De no dis- poner este equipamiento, se pueden sustituir con
cuartos esterilizados previamente con luz ultravioleta (nunca
exponerse a la luz UV en forma directa). La mesada de trabajo y las
pa- redes del gabinete deben ser desinfectadas previamente con
etanol al 70%. De la misma manera deben ser desinfectados
exteriormen- te todos los recipientes (conteniendo medios de
cultivo, agua, etc.) que ingresen en el rea del aire estril. Los
operarios constituyen frecuentemente una importante fuente primaria
de contamina- cin, porque es recomendable que, antes de comenzar a
trabajar laven sus manos y ante- brazos con abundante agua y jabn y
se des-
22. 21Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal II infecten con
etanol al 70 %. La utilizacin de guardapolvos, guantes y mscaras
protectoras de la boca y de la nariz, as como los gorros
protectores de los cabellos, ayudan a reducir sensiblemente los
niveles de contaminacin. Los instrumentos de trabajo (pinzas,
pipetas, tijeras, agujas, cpsulas de Petri) deben ser esterilizados
antes de su uso. Muchos de es- tos instrumentos pueden ser
colocados en eta- nol al 95% y, antes de ser usados, se deben
flamear cuidadosamente en la llama de un me- chero. Tambin es
necesario flamear la boca de los recipientes que contienen los
medios de cultivo antes y despus de cultivar el explante. 6)
Incubar los cultivos en cmaras o cuar- tos de cultivo, cerrados,
libres de corrientes de aire y bien higienizados. En lo posible se
debe restringir la circulacin de personas, y los recipientes con
cultivos contaminados deben ser rpidamente eliminados de este
sector. Es conveniente que antes del lavado, estos culti- vos sean
esterilizados. 4 Medios de cultivo Un medio de cultivo puede ser
definido como una formulacin de sales inorgnicas y compuestos
orgnicos requeridos para la nu- tricin y manipulacin de los
cultivos. Existen numerosas formulaciones, cada una de las cuales
comprende entre 6 y 40 compuestos. Para dar una idea de la cantidad
de formu- laciones disponibles, George y col., luego de revisar ms
de 3.000 trabajos cientficos des- criben en dos tomos (casi 1.000
pginas en to- tal) ms de 2.000 medios de cultivo. Tambin dos
empresas multinacionales ofrecen para la venta ms de 60 medios cada
una, listos para su utilizacin especialmente en la micropropa-
gacin comercial de plantas. En la Tabla 1 se presentan tres medios
que son muy usados en la actualidad. Bsicamente, los medios de
cultivo se com- ponen de compuestos que suministran: Una fuente de
carbono Nutrientes minerales Sustancias vitamnicas Sustancias
reguladoras del crecimiento Agente gelificante (en el caso de
medios semislidos) Otros compuestos. Fuente de carbono:
Prcticamente todos los cultivos son hetertrofos (comparativamente
unos pocos son auttrofos) y por ende necesi- tan del suministro de
una fuente de carbono. La sacarosa, en concentraciones de 2 al 5%,
es el azcar ms utilizado. En algunos medios se la reemplaza por
glucosa. En casos particu- lares se cita el empleo de maltosa o
galacto- sa. Tambin myo-inositol (100 mg/L) suele ser incorporado a
los medios resultando un mejor crecimiento de los cultivos.
Nutrientes minerales: Los medios de cultivo deben suministrar los
mismos macro y micro- nutrientes que son esenciales para el creci-
miento de las plantas enteras. En general se destacan las
concentraciones relativamente Tabla 1: Composicin de tres medios
bsicos usados en el cultivo in vitro de tejidos. NH4NO3 1.650 -----
----- KNO3 1.900 2.830 2.500 KH2PO4 170 400 ----- CaCl2.2H2O 440
166 150 (NH4)2SO4 ----- 463 134 MgSO4.7H 2O 370 185 250
NaH2PO4.4H2O ----- ----- 150 KI 0,83 0,80 0,75 MnSO4.H2O -----
----- 10,00 H3BO3 6,20 1,60 3,00 MnSO4.4H2O 22,30 4,40 -----
ZnSO4.7H2O 8,60 1,50 2,00 Na2MoO4.2H2O 0,25 ----- 0,25 CuSO4.5H2O
0,025 ----- 0,025 FeSO4.7H2O 27,80 27,85 27,80 Na2EDTA 37,30 37,25
37,30 CoCl2.6H2O 0,025 ----- 0,025 Glicina 2,00 2,00 ----- Tiamina
-HCl 0,10 1,00 10,00 Piridoxina-HCl 0,50 0,50 1,00 cido Nicotnico
0,50 0,50 1,00 Mioinositol 100,00 ----- 100,00 Sacarosa 30.000,00
50.000,00 20.000,00 PH 5,7 5,8 5,5 1) Composicin en mgL -1- 1 . MS
= Medio de Murashige y Skoog (Physiol. Plant. 15: 473 - 97. 1962)
N6 = Medio de Chu,C.C., Wang,C:C., Sun,C.S., Hsu, C., Yin, K,C., y
Chu, C. (Sci. Sinica 18: 6 59- 668. 1975) B5 = Medio de Gamborg,
O.L., Miller,R.A. y Ojima, K. (Exp.Cell Res. 50: 151 - 158. 1968)
Medio bsico 1 Compuestos MS N6 B5
23. 22 Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal II altas de nitrgeno
y potasio. El nitrgeno es suministrado en forma de amonio y/o
nitrato. Tambin se pueden utilizar urea, glutamina y casena
hidrolizada. Es fundamental que el hie- rro sea incorporado
juntamente con un agente quelante (Na2EDTA), lo que lo hace
disponible es un amplio rango de pH. Sustancias vitamnicas: De
todas las que comnmente se incorporan a los medios, pa- reciera que
la tiamina es la nica realmente imprescindible para el buen
crecimiento de los cultivos. Sustancias reguladoras del
crecimiento: En la mayora de los casos los medios utilizados para
el establecimiento de los cultivos con- tienen auxinas (ANA, 2,4-D,
AIA, AIB, NOA, Dicamba, Picloram) y/o citocininas (BA, KIN, ZEA,
2iP, Thidiazurn). Las giberelinas (es- pecialmente GA3) son
requeridas en algunas ocasiones para el cultivo de meristemas o
para la elongacin de brotes. El ABA, es usado en algunos casos.
Agente gelificante (en el caso de medios se- mislidos): El agar
(entre 0,6 y 1%) es el com- puesto ms utilizado. Tambin pueden em-
plearse Agargel (0,40-0,60%), Transfergel (2,0-2,60%), Phytagel
(0,25- 0,40%), agaro- sa (0,80-0.90%) y Gelrite (0,10-0,20%). Otros
compuestos: Muchas sustancias, de variada composicin qumica, suelen
ser adi- cionadas a los medios bsicos. Adems de la glicina, otros
aminocidos se pueden agregar a los medios. Es el caso de
L-tirosina, aspara- gina y cistena, aunque hay que tener presente
que en dosis altas pueden inhibir el crecimien- to de los cultivos.
El carbn activado (0,1 a 5%) suele ser incorporado al medio, dado
que es probable que absorba metabolitos txicos para los cultivos.
En algunos medios se incorporan cidos orgnicos como el mlico, el
ctrico, el pirvi- co y el succnico y es frecuente el empleo de
L-glutamina y de casena hidrolizada. An hoy se siguen utilizando
ciertos componentes de composicin qumica no bien definida como el
agua de coco (5 a 15%), jugo de tomate y pur de banana. Tambin en
ocasiones es necesa- ria la incorporacin de agentes antioxidantes
(L-cistena, cido ascrbico, polivinilpirrolido- na) para prevenir el
ennegrecimiento tisular causado por la oxidacin de polifenoles pre-
sentes en los explantes. Este ennegrecimiento puede causar la
muerte de los mismos. La preparacin de los medios de cultivo pue-
de llevarse a cabo de diferentes maneras, en lecturas recomendadas
se citan manuales de laboratorio donde se describen detallada-
mente este punto. 5. Condiciones ambientales para la incubacin. La
incubacin de los cultivos se debe llevar a cabo en condiciones
controladas. Por lo me- nos en lo que se refiere a temperatura,
calidad e intensidad de luz, fotoperodo, humedad at- mosfrica e
higiene. Estas condiciones se lo- gran con el empleo de cmaras
climatizadas o cuartos especialmente preparados con aire
acondicionado (fro-calor) y una buena y uni- forme circulacin de
aire en el interior y dota- dos de un buen sistema de alarma para
cortar la iluminacin en caso de no funcionar el aire acondicionado.
En general, los cultivos son in- cubados a temperatura constante de
25-28 C, con ciclo de luz/oscuridad de 16/8horas. La luz es
generalmente provista por lmparas fluo- rescentes del tipo luz da
con una irradiancia de entre 50 y 200mol m-2s-1. La humedad at-
mosfrica debe ser elevada (80- 90%). 6 Aclimatacin de las plantas
regenera- das in vitro. Durante el perodo de incubacin, los
cultivos son expuestos a condiciones ambientales dis- miles al
ambiente externo. La atmsfera interna se caracteriza por presentar
una considerable variacin diurna en la concentracin de CO2, humedad
relativa elevada, temperatura cons- tante e intensidad lumnica
baja. A su vez, el medio de cultivo compuesto por concentracio- nes
elevadas de azcares (en aquellos siste- mas hetertrofos y
semiauttrofos de micropro- pagacin), sales y reguladores del
crecimiento,
24. 23Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal II sumado a la
ausencia de microorganismos, generan anormalidades morfolgicas,
anat- micas y fisiolgicas que las plantas debern corregir cuando
son transferidas al ambiente externo. Este perodo de adaptacin al
nuevo hbitat es llamado fase o etapa de aclimata- cin. La
estrategia a implementarse durante el mencionado ciclo deber
contemplar el control minucioso de los parmetros ambientales (hu-
medad, temperatura y luz) de tal manera que permita disminuir la
deshidratacin y, al mismo tiempo, estimular la fotosntesis con el
objeto de generar un rpido crecimiento de los plantines. El retraso
en el desarrollo de la cutcula y la escasa funcionalidad del
aparato estomtico que presentan las hojas de la mayora de las
especies cultivadas in vitro, determinan una alta tasa de
transpiracin que puede ocasionar la muerte por deshidratacin. El
control de este proceso fisiolgico es de vital importancia du-
rante la aclimatacin, teniendo en cuenta que la disminucin de la
transpiracin ser gradual y depender de la rehabilitacin de los
estomas, as como tambin del desarrollo de la cutcu- la. El
equipamiento necesario estar sujeto a la especie, pudiendo
utilizarse desde tneles de polietileno para plantas que posean un
elevado control de la transpiracin (por ej. Malus pumila o Agave
tequilana) o bien, a travs del empleo de cmaras climatizadas
(Fig.1) equipadas con sensores que permiten un descenso paulatino
de la humedad relativa. En algunos casos pue- de resultar necesaria
la aplicacin exgena de ABA (hormona involucrada en el control del
cie- rre de los estomas) o bien, el empleo de sus- tancias
antitranspirantes que forman una capa semipermeable en la
superficie de la hoja. En este ltimo caso debern tomarse algunas
pre- cauciones debido a que pueden observarse re- acciones de
fitotoxicidad. Resulta imprescindible evitar la exposicin a
temperaturas extremas tanto en la fase area como en el substrato.
Mediante el empleo de extractores y/o acondicionadores de aire com-
binados con un sistema de niebla, es posible establecer la
temperatura de la fase gaseosa entre los 25 y 30 C durante la
estacin estival, mientras que en la poca invernal es necesa- rio, a
veces, el empleo de mantas trmicas o serpentinas, sea de agua o
aire caliente a nivel del substrato, para mantener la temperatura
por encima de los 18-20 C. Sin lugar a dudas, la opcin ms econmica
es el empleo de la luz natural, disminuyendo su irradiancia
(20-50%) mediante el agregado de mallas de sombreado (saram). No
obstante, en aquellas latitudes donde el nivel medio de luz natural
es bajo y los das son cortos du- rante una parte considerable del
ao, la luz ar- tificial puede ser aplicada como complemento de la
luz natural. Las lmparas tubulares fluo- rescentes del tipo luz da
son empleadas en horticultura para prolongar el fotoperodo.
Asimismo, las lmparas tubulares de sodio alta presin presentan una
distribucin espectral de la energa adecuada para estimular fotosn-
tesis y se emplean para tal fin en una amplia variedad de cultivos.
Otro aspecto importante a tener en cuenta lo constituye la eleccin
del substrato, siendo el adecuado aquel que permita el normal
creci- miento y desarrollo de las races. Se puede em- plear: arena,
perlita, turba, vermiculita, o mez- clas de ellos, teniendo la
precaucin de rea- lizar una esterilizacin previa. Es conveniente el
agregado de fertilizantes, sea a travs del substrato (fertilizantes
de liberacin controla- da) o bien mediante el sistema de riego
(fer- tilizantes solubles); emplendose proporcio- nes ricas en
fsforo (N-P-K: 9-45-15) y potasio (N-P-K: 4-25-35) que favorecern
el desarrollo radicular y la rustificacin de las plantas. En todo
momento deber realizarse un rigu- roso control fitosanitario
emplendose antibiti- cos, fungicidas e insecticidas de uso
universal. En la Figura 1, se detalla un modelo de c- mara de
aclimatacin diseada por los autores y empleada por el Laboratorio
de Cultivo de Tejidos del Instituto de Botnica del Nordeste.
Bsicamente, est compuesta por una fase area construida en aluminio
y policarbonato alveolar (9) y un recipiente o batea (11) que
contiene grnulos de arcilla expandida a fin de facilitar el
drenaje. Mediante el agregado de arena u otro substrato adecuado,
esta cmara puede ser utilizada tanto para el enraizamiento ex vitro
de los brotes obtenidos en la etapa de multiplicacin, as como
tambin, para el en- raizamiento convencional (a raz desnuda) de
estacas de tallos u hojas.
25. 24 Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal II La humedad
relativa de la fase area es con- trolada por un sensor (6) ubicado
por encima de la tubera de riego (4). El sistema humidifi- cador
est compuesto por picos tipo fog y es alimentado por una bomba de
bajo caudal y alta presin (13). Con el propsito de evitar el goteo
que pudiese ocasionar el agua rema- nente en las caeras, el sistema
consta de una vlvula solenoide de descarga y desage (7). La fase
gaseosa es renovada en forma in- termitente mediante el empleo de
extractores ubicados en ambos extremos de la cmara (3) los que,
conjuntamente, introducen o extraen aire, generando un movimiento
masal. Debido a la latitud geogrfica en que se en- cuentra, la
cmara est equipada con un acon- dicionador de aire (3000 frigoras)
para evitar situaciones de estrs trmico en poca estival. A su vez,
y dado que la mayora de las espe- cies estudiadas son originarias
de climas tro- picales y subtropicales, el sistema cuenta con
mantas trmicas que son colocadas por deba- jo de los tubetes,
manteniendo la temperatura del substrato durante el invierno. En
este lti- mo caso se agrega un material aislante entre la leca (10)
y la malla de hierro (16) de tal manera de dirigir el calor hacia
la fase area.
26. 25Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal II 7.
Agradecimientos. Los autores agradecen al Ing. Pablo A. Luna por la
planificacin digital de la cmara de acli- matacin. A la Secretara
General de Ciencia y Tcnica (UNNE) y al Establecimiento La Ca-
chuera por el aporte financiero recibido para construir la misma.
8. Lecturas Recomendadas GEORGE, E.F.; D.J.M. PUTTOCK y H.J. GEOR-
GE. 1987. Plant Culture Media . Vol. 1 (Formu- lations and Uses).
Exegetics Limited. England. 567 pg. GEORGE, E.F.; D.J.M. PUTTOCK y
H.J. GEORGE. 1988. Plant Culture Media . Vol. 2 (Commentary and
analysis). Exegetics Limited. England. 420 pg. HURTADO, D.V. y
MERINO, M.E. 1991. Cultivo de Tejidos Vegetales. Ed.Trillas. Mxico.
232 pg. PREZ PONCE, J.N. 1998. Propagacin y Mejora Gentica de
Plantas por Biotecnologa. Instituto de Biologa de Plantas.Santa
Clara. Cuba. 390 pg. POSPOSILOVA, J.; I. TICHA, P. KADLECEK, D.
HAISEL, S. PLZAKOVA. 1999. Acclimatization of micropropagated
plants to ex vitro conditions. Biologia Plantarum 42: 481-497.
ROCA, W.M. y L.A. MROGINSKI. 1993 (segunda edicin). Cultivo de
tejidos en la Agricultura: Fundamentos y aplicaciones. CIAT. Cali,
Colom- bia, 970 pg. TORRES, A.C.; L.A. CALDAS y J.A. BUSO. 1998.
Cultura de Tecidos e Transformacao Gentica de Plantas. (Vol.1)
Embrapa. Brasil.509 pg. TORRES, A.C.; L.A. CALDAS, y J.A. BUSO.
1999 Cultura de Tecidos e Transformacao Gentica de Plantas. (Vol.2)
Embrapa. Brasil.355 pg.
27. 26 Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal II I - CAPTULO 2
Morfognesis Silvia Radice 1.- Introduccin La embriognesis somtica y
la organognesis son dos procesos morfognicos muy frecuen- tes en el
cultivo in vitro de especies vegetales. La embriognesis somtica es
el proceso por el cual se obtiene una estructura similar a un
embrin cigtico sin que medie la fertilizacin de las gametas,
mientras que por organog- nesis pueden obtenerse tallos, races o
flores. Estos rganos son inducidos a partir de una clula o de un
grupo de clulas que, segn las condiciones de cultivo, tienen la
propiedad de mantenerse en activa divisin. Esta totipotencialidad
celular fue enunciada por Haberlandt en 1902, quien propuso la teo-
ra de que todas las clulas vegetales tienen la capacidad de
regenerar plantas completas. Haberlandt no lleg a demostrar su
hiptesis debido a que no pudo lograr la divisin celu- lar. Los
medios de cultivo que empleaba no incluan reguladores del
crecimiento debido a que esos compuestos eran an desconocidos. Los
avances en el cultivo de tejidos vegetales fueron muy lentos en sus
inicios. En 1934, Whi- te pudo mantener, en forma ilimitada, el
creci- miento de races en medios lquidos a partir de pices de
tomate. Al mismo tiempo se identi- fic el cido indol actico (AIA),
que posibilit el mantenimiento indefinido de callos de za- nahoria
y tabaco in vitro. Posteriormente se descubri el efecto de la leche
de coco como estimulante de la formacin de callo sobre el cultivo
de embriones de Datura stramonium. En 1948 Skoog y Tsui, trabajando
con cultivos de callo de tabaco, demostraron la existencia de una
regulacin qumica en la parte area y en la raz. Trabajos posteriores
en callos de la misma especie, con el agregado de cinetina, la
primera citocinina descubierta, permitieron demostrar que la
diferenciacin de brotes, ra- ces o de ambos, era regulada por el
balance de auxinas/citocininas. 2.- Tipos de morfognesis.
Definiciones En condiciones de cultivo in vitro, las clulas
somticas pueden regenerar embriones (Fig 1) o brotes, races y/o
flores (Fig 2) como res- puesta a un determinado estmulo. La
regene- racin es un proceso que comprende diferen- tes fases que se
suceden de manera similar para los tres tipos de morfognesis
citadas. De Klerk y colaboradores, en 1997, denominaron a estas
diferentes fases como adquisicin de la competencia; fase de
induccin y fase de realizacin. En la primera fase, las clulas no
respon- den al estmulo organognico pero adquieren esa competencia
durante una fase de desdi- ferenciacin. En la segunda fase o fase
de in- duccin, las clulas son receptivas al estmulo morfognico y
hay una relacin directa con el tipo, concentracin y combinacin de
regula- dores del crecimiento agregados al medio de cultivo y el
rgano a desarrollar. En la fase de realizacin, la clula sufre las
sucesivas divi- siones para formar el rgano determinado. A partir
de la siembra in vitro de diferentes ex- plantes relativamente
grandes y en condicio- nes de cultivo adecuadas, puede inducirse la
formacin de nuevos rganos de manera direc- ta, sin la formacin de
callo. Si la formacin es de brotes, races o flores se denomina
organo- gnesis directa. Si en cambio se induce la for- macin de
embriones somticos, este proceso se denominar embriognesis directa
(Figs. 1 y 3). Si por el contrario, a partir de la siembra de un
explante in vitro se observa la proliferacin de clulas en forma
desordenada y sin ninguna funcin predeterminada, se iniciar la
produc- cin de callos o suspensiones celulares (Figs. 2 A y 3). La
diferenciacin de rganos a partir de callos, denominada morfognesis
indirecta, estar condicionada a la previa formacin de los
meristemoides. Morfognesis directa o in- directa fueron trminos
propuestos por Hicks en1980. 3.- Histologa de la morfognesis Despus
de 48 horas de realizada la siembra del explante en el medio de
cultivo adecuado,
28. 27Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal II a partir de una
clula epidrmica o del mesfilo foliar, como ocurre en las conferas,
se suce- den una serie de divisiones mitticas. As se pueden
observar, a travs del estudio histolgi- co, pequeas masas de clulas
que contienen citoplasma denso y grandes nucleolos. Este conjunto
de clulas, agrupadas a modo de es- feras, fueron denominadas
meristemoides por Torrey en 1966, y son responsables de la dife-
renciacin de los nuevos rganos. Este tipo de meristema puede
iniciarse en forma directa, a partir de clulas diferenciadas
pertenecientes a un explante cultivado in vitro, o indirectamente,
a partir de una clula o grupo de clulas dife- renciadas que
promueven la proliferacin celu- lar (Fig 4 A). Su evolucin
determinar el cre- cimiento de un rgano, por ejemplo una yema
adventicia (Fig 4 B). Figura 1: A-F embriognesis somtica obtenida
por cultivo in vitro. A-C-E, embriognesis somtica en di- ferentes
fases de crecimiento observada en Codiaeum variegatum (L) Blume
cultivado en MS + 1 mg l-1 de BAP. B-D-F, embriognesis somtica
obtenida en diversos cultivares de Prunus sp a partir de embriones
zigticos inmaduros cultivados en MS + 0,1 mg l-1 de ANA + 1 mg l-1
de Kin con una previa induccin en MS + 2 mg l-1 de 2,4-D. Las
reglillas representan 5 mm.
29. 28 Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal II Las clulas
embriognicas son similares a las clulas meristemticas debido a que
no son demasiado voluminosas, tienen gran cantidad de ribosomas,
citoplasma denso, un nucleolo agrandado y pequeos granos de almidn.
Es- tas clulas, que en general se agrupan, pueden variar en tamao y
nmero. Dentro de un gru- po de clulas embriognicas, el desarrollo
de las mismas no est sincronizado. Estas clulas son capaces de
dividirse o de transformarse en embriones segn las condiciones del
medio de cultivo. Aquellas clulas que no desarrollan proembriones
comienzan el proceso de dife- renciacin, es decir se vacuolizan,
disminuye Figura 2: A-E Organognesis somtica obtenida por cultivo
in vitro. A, callo organognico obtenido en Abelia sp. (Andr) Rehder
cultivada en MS + 1 mg l-1 de picloran. B, Inicio de brotes
(flechas) en hojas crecidas in vitro de Crimson Gold (Prunus
persica L.) cultivadas en MS + 0,1 mg l-1 de ANA + 1 mg l-1 de Kin.
C, Brotes de Gerbera jamesonii Bolus obtenidos a partir del cultivo
de captulos florales en MS 0,05 mg l-1 de IBA + 0.75 mg l-1 de BAP
+ 0,1 mg l-1 de GA3. D, brotes florecidos in vitro de Abelia sp.
(Andr) Rehder cultivados en MS + 1 mg l-1 de BAP. E, races
(flechas) crecidas de callo de Abelia sp. (Andr) Re- hder
cultivadas en inducidas en MS + 1 mg l-1 de 2iP, previamente
inducidas con 1 mg l-1 de picloran. Las reglillas representan 5
mm
30. 29Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal II el volumen de
ncleo y nucleolo y desaparecen los grnulos de almidn. Las
experiencias demuestran que las clulas embriognicas se desarrollan
slo cuando se modifican las condiciones de cultivo. En gene- ral,
cuando se reducen las cantidades de auxi- na y citocinina o se
elimina la auxina. Las clulas embriognicas desarrollan como
embriones cuando las condiciones experimen- tales permiten que
estas expresen su poten- cial. Pueden ocurrir dos condiciones
ontog- nicas diferentes, es decir que el origen de los embriones
sea unicelular o pluricelular. En el caso de iniciarse a partir de
una clula, la misma se asla de las dems por una importan- te
modificacin en su pared celular, en particu- lar por la gelificacin
de la laminilla media. Esta clula, rodeada por un polisacrido
mucilagi- noso, sufre divisiones polarizadas formando un embrin
globular. Previo a esta polarizacin se deposita almidn, luego se
forma la epidermis y adquiere simetra bilateral. Sucesivamente se
observa el crecimiento de uno o ms cotiledo- nes, el desarrollo de
los tejidos provasculares, la iniciacin de los pices radicales y de
tallo y una progresiva acumulacin de almidn, lpidos y protenas. En
el caso de un origen multicelular de los em- briones somticos
pueden observarse diversos patrones. Los embriones somticos se
forman a partir de grupos de clulas epidrmicas y subepidrmicas (Fig
4 C). Este tipo de ontoge- nia de origen multicelular se llama
comnmente budding o embriognesis adventicia. Estas c- lulas pequeas
tienen una alta relacin ncleo/ citoplasma, citoplasma denso y un
nucleolo vo- luminoso que se tie fuerte- mente. Se diferencian de
las clulas embriognicas por la falta de sustancias de reser- va,
por su delgada pared ce- lular y su frecuente divisin celular.
Estas estructuras se denominan proembriones globulares (Fig 1 A,
B). En una etapa posterior desarro- llan una epidermis, un tejido
provascular, acumulan mate- rial de reserva y se polarizan. Estas
estructuras globulares desarrollan cotiledones y se transforman en
embriones somticos que presentan pices caulinar y radicular. Para
una misma especie puede ocurrir uno u otro tipo de inicio segn las
condicio- nes de cultivo. El desarrollo de un embrin somtico de
origen unicelular es compa- rable a la de un embrin ci- gtico. En
dicotiledneas, la Fig. 3: Esquema de los diferentes procesos
morfognicos obtenidos a partir de la siembra in vitro de diferentes
explantes. Las lneas con- tinuas expresan organognesis o
embriognesis directa mientras que las lneas quebradas indican que
la morfognesis se obtiene por va indirecta. etapa globular es
seguida por una etapa corazn que se corresponde con la adqui- sicin
de la simetra bilateral: desarrollo de la epidermis,
31. 30 Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal II de los estratos
procambiales y de manera su- cesiva el desarrollo del pice radical.
El pice de tallo se desarrolla ms tarde, durante la eta- pa
cotiledonar. En los embriones somticos de algunas especies hay una
etapa intermedia en- tre la globular y corazn llamada oblonga, que
corresponde a la individualizacin del pice de la raz y al
procambium en respuesta a la elon- gacin axial del embrin somtico
debido al transporte de auxinas (Fig 1 C). Los embriones de origen
multicelular obtenidos por budding muestran la misma ontogenia que
los cigticos, como as tambin la produccin de sustancias de reserva.
Figura 4: A-E Cortes histolgicos de diferentes explantes cultivados
in vitro. A, meristemoides (flechas) observados en cultivo de
Silybum marianum L. en MS + 1 mg l-1 de AIA + 5 mg l-1 de BAP 10 x.
B, yemas adventicias (flechas) en pices de Fragaria x ananassa
Duch. cultivados en Boxus + 0,1 mg l-1 de IBA + 0.5 mg l-1 de BAP +
0,1 mg l-1 de GA3 4 x. C, grupo de clulas embriognicas (flechas) en
Codiaeum variegatum (L) Blume cultivados en 1 mg l-1 de tidiazurn.
20 x. D, embriones somticos en Codiaeum variegatum (L) Blume
cultivados en 1 mg l-1 de tidiazurn 10 x. E, embriognesis
secundaria en Codiaeum variegatum (L) Blume cultivados en 1 mg l-1
de tidiazurn 10 x.
32. 31Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal II Sin el seguimiento
histolgico detallado, la for- macin del embrin somtico slo puede
ser confirmada por la germinacin (Fig 1 F). Sin embargo, debido al
bajo porcentaje de embrio- nes que llegan a esta etapa, esta tarea
es casi imprescindible para una correcta evaluacin de las
respuestas encontradas con los diversos medios de cultivo
empleados. Comparados con los embriones cigticos de la misma
especie, los embriones somticos fre- cuentemente desarrollan de
manera anormal o son inmaduros. La anomala ms frecuente- mente
encontrada es la formacin doble o tri- ple del sistema vascular,
causada por la pobre polarizacin del transporte de auxinas. Tambin
se puede encontrar un contenido excesivamen- te alto, reducido o
ausente de las reservas de almidn y/o proteicas, que el meristema
apical o radical no estn desarrollados o que la embrio- gnesis sea
repetitiva o secundaria (Fig 4 E). La falta del meristema apical o
una escasa deposicin de sustancias lipoproteicas en los embriones
somticos de algunas especies no debe ser tomada como una anormala.
Esto puede ser un sntoma de inmadurez debido a la rpida formacin de
los mismos. En este caso una etapa intermedia que permita la ma-
duracin de las estructuras formadas permitir incrementar el
porcentaje de embriones som- ticos capaces de germinar. 4.-
Factores que afectan los procesos morfognicos Los cuatro
principales factores que condicio- nan la obtencin y el crecimiento
de nuevos rganos in vitro son: 4.1.- el genotipo 4.2.- las
condiciones qumicas seleccionadas para realizar el cultivo. 4.3.-
las condiciones fsicas seleccionadas para realizar el cultivo.
4.4.- el explante. 4.1.- El genotipo es un factor determinante en
todos los procesos morfognicos, desde la ca- pacidad del explante
para su establecimiento en condiciones in vitro a la proliferacin
de callo, o la diferenciacin y crecimiento de nuevos rga- nos. Por
esta causa, no es posible generalizar metodologas o protocolos de
trabajo debido a que los medios de cultivo, as como las condi-
ciones de cultivo seleccionados, deben ser es- pecficos para cada
situacin en particular. Un ejemplo de ello es el protocolo empleado
por Stamp and Meredith en diferentes cultivares de Vitis vinifera.
En cuatro de ellos fue posible la obtencin de embriones somticos a
partir de embriones cigticos, pero estos resultados no se
repitieron con el cultivar "Pinot Noir". 4.2.- Varios son los
compuestos qumicos que influyen en los patrones morfognicos in
vitro dentro de los cuales podemos considerar: 4.2.1.- la
composicin salina del medio de culti- vo. La composicin salina ms
empleada para inducir la formacin de callo, la organognesis directa
o indirecta en la mayora de las espe- cies vegetales, es la de
Murashige & Skoog (1962) (MS). Sin embargo, existen otras
formu- laciones diseadas para inducir determinados patrones
morfognicos. Existe adems una es- trecha relacin entre la
composicin hormonal del explante y la concentracin de reguladores
del crecimiento agregada al medio de cultivo. 4.2.2.- reguladores
del crecimiento. Estos compuestos pueden promover la morfognesis an
cuando la concentracin salina no sea la adecuada. En condiciones
ptimas de cultivo pueden aumentar significativamente la dife-
renciacin de rganos. Para la induccin de embriones somticos en
muchas especies ve- getales es necesario el agregado de auxinas,
como ocurre en Tilia spp. Sin embargo para otras, como es el caso
del crotn (Codiaeum variegatum), es suficiente con el agregado de
thidiazurn. El genotipo y el tipo y concentra- cin de reguladores
del crecimiento empleados estn estrechamente relacionados. 4.2.3.-
antibiticos. En procesos de transfor- macin con Agrobacterium
tumefaciens es muy comn el agregado de antibiticos del tipo
cefotaxime; kanamicina y carbenicilina para la eliminacin de la
bacteria. En explantes de hoja de diferentes cultivares de Malus
domes- tica se encontr que 250 mg L1 de cefotaxime aumentan
significativamente la regeneracin de brotes mientras que 500 mg L1
de carbe- nicilina promueven la formacin de callo y la
33. 32 Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal II kanamicina inhibe
los procesos morfognicos. 4.2.4.- carbn activado. En general se usa
para adsorber compuestos txicos de la micro atms- fera gaseosa o el
exceso de reguladores del cre- cimiento presentes en el medio de
cultivo pero E.K. Pettersson y su equipo de colaboradores de la
Swedish University of Agriculture, demostraron que puede promover
la embriognesis somtica debido a la incorporacin de ciertos
compuestos al medio de cultivo por difusin. 4.2.5.- agar. Otro
aspecto importante a tener en cuenta es la consistencia del medio
de cultivo. Puede emplearse como semi-slido o lquido. El agente
gelificante ms utilizado en el cultivo in vitro es el agar, extrado
de diversas algas ma- rinas. Las diferentes calidades existentes en
el mercado modifican la expresin morfognica debido a que pueden
contener sustancias inhi- bitorias o promotoras del crecimiento.
Tal es el caso del cultivo de hojas de Actinidia chilensis (en
medio de MS con el agregado de 0,1 mg/L de AIA + 1 mg/L de BAP)
cuya respuesta morfogni- ca vari segn el tipo de agar utilizado.
Cuando el gelificante empleado fue Chubut-agar, de pro- duccin
nacional, se observ una gran diferen- ciacin de yemas adventicias,
mientras que con el agregado de agar SIGMA R slo se indujo la
proliferacin de callo. En caso de seleccionar medios de cultivo
lqui- dos, la respuesta morfognica observada vara de manera
considerable. El cultivo lquido es im- prescindible cuando se busca
promover la mor- fognesis indirecta a travs de suspensiones ce-
lulares. Para ello es necesario cultivar los callos en medio lquido
con agitacin para permitir que las clulas se disgreguen y puedan
diferenciar races, brotes o embriones somticos en forma aislada. La
eleccin de un medio de cultivo lquido o slido depende, adems, de la
especie con la que se trabaja. En Cymbidium, por ejemplo, se ha
observado que el empleo de medio lquido promueve una mayor
diferenciacin de proto- cormos respecto del mismo gelificado. A su
vez, este proceso puede mantenerse durante varios subcultivos,
mientras que en medio de cultivo ge- lificado se observ que los
protocormos tienden a formar tallos. 4.2.6.- atmsfera gaseosa. Es
un factor determi- nante en los procesos morfognicos y esta con-
dicionada por el tipo y tamao del envase selec- cionado para el
cultivo, as como tambin por el sistema de cobertura del mismo. Las
tapas usa- das en cultivo in vitro varan desde el tapn de algodn;
papel de aluminio; pelcula de resinite transparente o tapas rgidas
de polipropileno. El intercambio gaseoso es diferente para cada
tipo de tapa, en consecuencia la atmsfera interna tambin sufrir
variaciones. En condiciones in vivo la atmsfera contiene 78 % de
nitrgeno;