MANUAL DE PROCEDIMIENTOS HEMATOLOGIacuteA Y COAGULACIOacuteN
CONTENIDO
Presentacioacuten7
Introduccioacuten9
SECCIOacuteN 1 GENERALIDADES11
11 Objetivo 11
12 Campo de aplicacioacuten 11
13 Responsabilidades11
14 Documentos de referencia12
SECCIOacuteN 2 MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD13
SECCIOacuteN 3 OBTENCIOacuteN DE MUESTRAS SANGUIacuteNEAS14
31 Objetivo14
32 Obtencioacuten de sangre venosa con jeringahellip14
33 Obtencioacuten de sangre venosa en tubos al vaciacuteo 16
34 Obtencioacuten de sangre de la vena yugular externa 18
35 Obtencioacuten de sangre capilar 19
SECCIOacuteN 4 ANTICOAGULANTES 22
41 Caracteriacutesticas baacutesicas de los anticoagulantes maacutes usados en hematologiacutea22
42 Anticoagulantes soacutelidoshellip22
43 Anticoagulantes liacutequidos 24
SECCIOacuteN 5 REALIZACIOacuteN Y TINCIOacuteN DEL FROTIS SANGUIacuteNEO 25
51 Meacutetodo de los dos portaobjetos 25
52 Coloraciones usadas 26
53 Tincioacuten con colorante de Wright27
SECCIOacuteN 6 HEMOGRAMA- HEMOGLOBINA- HEMATOCRITO 29
61 Recuento leucocitario 29
62 Recuento de gloacutebulos rojos 33
63 Determinacioacuten del volumen globular (Hto) 35
64 Dosaje de hemoglobina 38
65 Frotis de sangre perifeacuterica 40
66 Foacutermula leucocitaria 41
SECCIOacuteN 7 VELOCIDAD DE SEDIMENTACIOacuteN43
71 Meacutetodo de Westergren 43
72 Meacutetodo de Wintrobe 44
SECCIOacuteN 8 PERFIL DE HEMOSTASIA45
81 Principios generales 45
82 Mecanismo de coagulacioacuten 45
83 Exploracioacuten de la coagulacioacuten 46
84 Obtencioacuten del plasma 46
85 Tiempo de sangriacutea47
851 Meacutetodo de Ivy48
852 Meacutetodo de Duke49
86 Tiempo de coagulacioacuten de sangre total (TCST) 51
87 Tiempo de tromboplastina parcial activada (PTTK) 54
88 Tiempo de trombina 55
89 Tiempo de protrombina (Prueba de Quick) 56
SECCIOacuteN 9 RECUENTO DE RETICULOCITOS Y PLAQUETAS58
91 Recuento de reticulocitos 58
92 Recuento de plaquetas 60
SECCIOacuteN 10 LEUCOGRAMA63
101 Granulocitos63
102 Agranulocitos 65
103 Criterios para el desarrollo de un leucograma 67
SECCIOacuteN 11 ALTERACIONES ERITROCITARIAS79
Alteraciones en el tamantildeo 70
Alteraciones en la forma 71
Alteraciones de color72
Inclusiones anormales73
BIBLIOGRAFIacuteA79
ANEXO A Preparacioacuten de colorantes y soluciones maacutes
Usados en hematologiacutea81
ANEXO B Preparacioacuten de anticoagulantes 85
PRESENTACIOacuteN
Con el propoacutesito de uniformizar los procedimientos hematoloacutegicos que serealizan en los diversos laboratorios cliacutenicos el Instituto Nacional de Saludpone a disposicioacuten de la comunidad teacutecnico-cientiacutefica nacional el Manual deProcedimientos de Laboratorio en Teacutecnicas Baacutesicas de Hematologiacutea en elcual se incluyen todos los meacutetodos empleados en el campo hematoloacutegicobaacutesico De este modo se contribuye a mejorar la calidad de diagnoacutestico en loslaboratorios de los servicios de saludEl laboratorio de hematologiacutea cuenta con dos aacutereas baacutesicas Aacuterea deHematimetriacutea (hemograma VSE recuento de plaquetas etc) y Aacuterea deHemostasia Partiendo de esta estructura en este manual nos referiremos alas teacutecnicas baacutesicas empleadas en estas aacutereas partiendo de la toma de muestrahasta la realizacioacuten de las pruebas respectivasEs necesario enfatizar que para obtener resultados maacutes confiables es importantepero no imprescindible automatizar el laboratorio debido a que elloevitaraacute el posible error humano sobre todo en lo referente a recuentos celularesvalores de hemoglobina y constantes corpusculares ya que en estasvariables se trabaja con cantidades exactas de sangre hecho que es muydifiacutecil de lograr cuando se usan los meacutetodos manuales lo mismo sucede altratarse de las pruebas de hemostasiaEsperamos que este manual constituya una herramienta de consulta en laRed Nacional de Laboratorios de Salud ademaacutes de una guiacutea para el personalde laboratorio en general
INTRODUCCIOacuteN
El presente manual ha sido elaborado en forma simple didaacutectica y eminentementepraacutectica para que su contenido sea faacutecil de entender por el personalque labora en el laboratorio de hematologiacuteaSe divide en tres partes
1 En la primera parte se presentan los aspectos maacutes importantes de labioseguridad en el laboratorio
2 En la segunda parte se exponen las principales teacutecnicas baacutesicas del laboratoriode hematologiacutea
3 En la tercera parte se detallan las alteraciones maacutes frecuentes de la serieroja y de la serie blanca de un hemograma
El objetivo principal es protocolizar y estandarizar los procedimientoshematoloacutegicos que empiezan con la toma de muestra (siguiendo las pautasde control de calidad preanaliacutetica) hasta el procesamiento de eacutesta (fase analiacutetica)en la determinacioacuten correspondiente y por uacuteltimo en la emisioacuten de losresultados (fase postanaliacutetica) Debemos recalcar que cuando se realizanpruebas de hemostasia debe tenerse en consideracioacuten los cuidados comunesa toda prueba de laboratorio es decir las muestras deben obtenerse encondiciones apropiadas y rotularse debidamente Esperamos que el presentemanual sirva de guiacutea efectiva y que pueda ser enriquecido con nuevosaportes con la finalidad de alcanzar un trabajo de calidad
SECCIOacuteN 1
GENERALIDADES
11 OBJETIVO
Establecer y estandarizar los procedimientos baacutesicos de un examen dehemograma hemoglobina hematocrito recuento de plaquetas velocidad desedimentacioacuten y recuento de reticulocitos que sirvan de ayuda diagnoacutestica alcliacutenico
12 CAMPO DE APLICACIOacuteN
La aplicacioacuten de las teacutecnicas hematoloacutegicas nos sirve para estandarizar losprocedimientos a nivel nacional y para que sea de utilidad al personal teacutecnicoy profesional de los laboratorios cliacutenicos
13 RESPONSABILIDADES
131 El Centro Nacional de Laboratorios en Salud Puacuteblica a traveacutes de su
Direccioacuten Ejecutiva de Laboratorios de Referencia es responsable deautorizar la elaboracioacuten la revisioacuten y la actualizacioacuten del presente manualde acuerdo con los procedimientos aprobados por el Instituto Nacionalde Salud
132 Los directores de los establecimientos de salud son responsables deautorizar proporcionar los recursos necesarios y designar al personalresponsable para la aplicacioacuten de las disposiciones contenidas en elpresente manual
133 El personal de los establecimientos de salud es responsable de planificarlas acciones organizar controlar y capacitar al personal para cumplirlas disposiciones contenidas en el presente manual
134 Los jefes o responsables de los laboratorios deben asegurar el controlinterno de la calidad la idoneidad del personal equipos materialesreactivos e instalaciones
135 El personal meacutedico profesional y teacutecnico es responsable de seguir lasespecificaciones contenidas en el presente manual y aplicar los procedimientosespeciacuteficos indicados
14 DOCUMENTOS DE REFERENCIA
141 Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OrganizacioacutenPanamericana de la Salud Publicacioacuten cientiacutefica Nordm 439 Nordm 2 1983
142 Manual de normas de bioseguridad Instituto Nacional de Salud Serie deNormas Teacutecnicas Nordm 18 2ordf ed 1997
SECCIOacuteN 2
MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD
21 Para la obtencioacuten de muestras el personal involucrado en los diferentesprocesos para los exaacutemenes hematoloacutegicos debe aplicar las medidas debioseguridad establecidas en el Manual de Bioseguridad Serie de NormasTeacutecnicas Nordm 18
22 Se debe controlar sobre todo
221 Al personal que trabaja en el laboratorio de hematologiacutea
222 El proceso de coloracioacuten en el que se debe aplicar las medidas debioseguridad correspondientes al uso y manipulacioacuten de sustanciastoacutexicas o canceriacutegenas
223 Ver lo referente a medidas de proteccioacuten en caso de accidentes porinoculacioacuten
SECCIOacuteN 3
OBTENCIOacuteN DE MUESTRAS SANGUIacuteNEAS
31 OBJETIVO
Establecer y uniformizar criterios en el procedimiento de obtencioacuten de muestrassanguiacuteneas con un adecuado control de calidad ya que de ello dependeque el resultado del anaacutelisis de la muestra sea el correcto Se efectuaraacute enayunas o no dependiendo de la prueba a usar
32 OBTENCIOacuteN DE SANGRE VENOSA CON JERINGA
321 Materiales y equipos requeridos
3211 Algodoacuten
3212 Alcohol al 70
3213 Ligadura o torniquete de 25 a 30 cm de largo
3214 Jeringas de 5 mL
3215 Viales con anticoagulante EDTA
322 Obtencioacuten de la muestra
3221 Verificar que los elementos por utilizar esteacuten listos y que el pacientese sienta coacutemodo
3222 Aplicar el torniquete aproximadamente cuatro dedos por encima de laflexioacuten del codo o a 10 cm del codo sujetar con un medio nudo (Fig 1)
3223 Limpiar la zona con alcohol al 70 o alcohol yodado en un aacuterea de 2pulgadas (Fig 2)
3224 El paciente deberaacute abrir y cerrar la mano durante unos segundos ydespueacutes la mantendraacute cerrada esto ayudaraacute a visualizar las venassuperficiales (Fig 3)
3225 Se retira el estuche protector de la aguja y se coge la jeringa de talmanera que el bisel se encuentre hacia arriba (Fig 4)
3226 Se coloca la aguja en direccioacuten paralela a la vena se perfora la pielhaciendo avanzar la aguja 05-1 cm en el tejido subcutaacuteneo luego seperfora la vena (Fig 5)
3227 Se aspira la jeringa hasta el volumen requerido
3228 Retirar el torniquete e indicar al paciente que deje de hacer puntildeo Secoloca el algodoacuten seco encima de la puncioacuten y se retira la aguja (Fig 6)
3229 Retirar la aguja de la jeringa Verter la muestra lentamente por lasparedes del vial con anticoagulante No olvidar colocar una gota en lalaacutemina portaobjeto para realizar el frotis
32210 Agitar el vial en ciacuterculos sobre la mesa para homogeneizar la muestracon el anticoagulante
PUNTOS PARA LA EXTRACCIOacuteN DE SANGRE
(Toma de muestra)
Se obtiene de las venas de la fosa cubital
PROCEDIMIENTO
Fig 1 Fig 2 Fig 3
Fig 4 Fig 5
Fig 6 Fig 7
33 OBTENCIOacuteN DE SANGRE VENOSA EN TUBOS AL VACIacuteO
331 Materiales requeridos
3311 Algodoacuten
3312 Alcohol al 70
3313 Ligadura o torniquete de 25 a 30 cm de largo
3314 Tubos al vaciacuteo con anticoagulante EDTA (K3) EDTA (Na2) u otroanticoagulante
3315 Agujas con dispositivo para extraccioacuten de sangre al vaciacuteo
- Nordm 21 para adultos
- Nordm 22 para nintildeos y neonatos
De preferencia ambas de bisel corto para evitar la coagulacioacuten
332 Obtencioacuten de la muestra
3321 Repetir los pasos de 3221 a 3224
3322 Se retira el estuche protector de la aguja y eacuteste se enrosca al dispositivopara extraccioacuten de sangre al vaciacuteo
3323 Colocar la ligadura cuatro dedos por encima de la flexioacuten del codo o10 cm por encima de eacuteste y pedir al paciente que abra y cierre la manovarias veces para favorecer la dilatacioacuten de las venas
3324 Una vez escogida la vena desinfectarla con una pieza de algodoacutenembebido en etanol al 70
3325 Se coloca la aguja en direccioacuten paralela a la vena se perfora la pielhaciendo avanzar la aguja entre 05 cm y 1 cm en el tejido subcutaacuteneose inserta el tubo al vaciacuteo por la parte posterior y no preocuparse porla cantidad de sangre extraiacuteda ya que el mismo sonido del vaciacuteo avisaraacuteque la extraccioacuten terminoacute (Fig 8)
3326 Retirar la ligadura tirando del extremo doblado
3327 Colocar un pedazo de algodoacuten seco sobre la parte donde se encuentraoculta la aguja Sacar la aguja con un movimiento raacutepido y depositarlaen el recipiente de metal con desinfectante (Fig 9)
3328 Pedir al paciente que presione firmemente el algodoacuten durante 3 minutoscon el brazo extendido No se recomienda que se flexione el brazoa causa del riesgo que se forme un hematoma
3329 Mezclar por inmersioacuten suave la sangre con el anticoagulante contenidoen el tubo No agitar el contenido
Fig 8 Fig 9
333 Ventajas de una extraccioacuten de sangre venosa
3331 Pueden hacerse repetidos exaacutemenes con la misma muestra
3332 Parte de la muestra (plasma o suero) puede congelarse para referenciafutura
334 Desventajas de una extraccioacuten de sangre venosa
3341 La puncioacuten venosa por su largo procedimiento requiere mayor preparacioacuten que el meacutetodo capilar
3342 El meacutetodo es teacutecnicamente difiacutecil en nintildeos individuos obesos y pacientes en shock
3343 La hemoacutelisis debe ser evitada pues se puede obtener una disminucioacuten en el recuento de eritrocitos
3344 Debe evitarse prolongada estasis venosa producida por el torniquete pues produce hemoacutelisis y otros cambios que ponen la sangre en un estado inadecuado para el anaacutelisis de gases recuentos celulares determinacioacuten de pH sanguiacuteneo y algunas pruebas de coagulacioacuten
3345 La sangre anticoagulada si no es de obtencioacuten reciente no debe ser utilizada en extensiones de sangre pues algunos anticoagulantes producen cambios en las plaquetas que pueden causar aglutinaciones agregacioacuten plaquetaria y dificultan la identificacioacuten de leucocitos
3346 Puesto que algunos de los componentes de la sangre no son estables los recuentos de leucocitos y plaquetas e iacutendice de sedimentacioacuten deben realizarse antes de que pasen dos horas desde que se obtuvo la muestra
34 OBTENCIOacuteN DE SANGRE DE LA VENA YUGULAR EXTERNA
341 Materiales requeridos
3411 Algodoacuten
3412 Alcohol al 70
3413 Jeringas de 5 mL
3414 Viales con anticoagulante EDTA
342 Obtencioacuten de la muestra
3421 El paciente es cubierto por una saacutebana de manera que los brazospermanezcan inmovilizados a lo largo del cuerpo
3422 Al paciente se le coloca de cuacutebito dorsal sobre la mesa de examen ouna
camilla de manera que la cabeza cuelgue sobre el final de lamesa y el cuerpo sea
sujetado por un asistente
3423 Cuando el paciente grita la vena yugular externa se marca claramente
3424 Limpiar la zona en un aacuterea de 2 pulgadas con alcohol al 70 o
alcoholyodado
3425 Se repiten los pasos de 3225 a 3227 de la extraccioacuten de sangrevenosa
con jeringa
3426 Retirar la aguja de la vena y presionar suavemente con un algodoacutenseco
aproximadamente de 3 a 5 minutos Pedir al paciente que permanezcaechado diez
minutos
3427 Se repiten los pasos de 3229
3428 Se repiten los pasos de 32210
343 Ventajas
Constituye un buen meacutetodo para la obtencioacuten de sangre en pacientes conshock
con venas colapsadas
344 Desventajas
Por lo delicado en su procedimiento no se recomienda como rutina soacutelo encasos
en que no se pueda obtener la muestra por meacutetodos convencionales
35 OBTENCIOacuteN DE SANGRE CAPILAR
Cuando la cantidad de sangre que se precisa es muy pequentildea o cuando
pordiferentes motivos no pueda practicarse una puncioacuten venosa debe recurrirse
a la puncioacuten capilar
351 Materiales requeridos
3512 Algodoacuten
3513 Alcohol al 70
3514 Lancetas desechables (Fig 10)
3515 Papel filtro Nordm 2
352 Procedimiento (Fig 11)
3521 La sangre capilar se obtiene de la cara lateral del dedo medio o anularen los adultos y del dedo gordo del pie o taloacuten en los nintildeos
3522 Desinfectar la zona con alcohol al 70 secar con algodoacuten esteacuteril
3523 Punzar la piel con una lanceta esteacuteril desechable (2 mm de profundidad)
3524 Usar gasa esteacuteril para desechar la primera gota y recoger las siguientesen tubos capilares Evitar comprimir la extremidad para obtenersangre porque se altera la composicioacuten sanguiacutenea
353 Ventajas
3531 Puede obtenerse con facilidad
3532 Es preferible cuando han de realizarse extensiones de sangre perifeacuterica
354 Desventajas
3541 Soacutelo se pueden obtener pequentildeas cantidades de sangre y los exaacutemenesde repeticioacuten requieren nuevas muestras
3542 La sangre en microtubos (capilares) frecuentemente se hemolizainterfiendo con la mayoriacutea de pruebas de laboratorio
3543 Los resultados obtenidos en pruebas con sangre capilar no puedenser comparados con los resultados de las pruebas con sangre venosa
3544 El dedo no soacutelo es delicado sino difiacutecil de desinfectar adecuadamenteen el tiempo disponible
3545 En pacientes con resistencia disminuida a la infeccioacuten (aquellos conleucemia agranulocitosis diabetes uremia y enfermedades con deficienciasinmunoloacutegicas) una muestra tomada del dedo es mucho maacutesprobable que conduzca a una infeccioacuten que otra tomada del brazo
3546 El recuento de eritrocitos y leucocitos asiacute como el recuento deplaquetas y reticulocitos no debe realizarse en sangre capilar debidoa la difiacutecil estandarizacioacuten del flujo sanguiacuteneo capilar
EXTRACCIOacuteN DE SANGRE CAPILAR
Fig 10
Fig 11
SECCIOacuteN 4
ANTICOAGULANTES
Una vez extraiacuteda la sangre eacutesta puede conservarse coagulada o
mantenidaincoagulable mediante la adicioacuten de un anticoagulante
41 CARACTERIacuteSTICAS BAacuteSICAS DE LOS ANTICOAGULANTES MAacuteS
USADOSEN HEMATOLOGIacuteA
bull No alterar el tamantildeo de los hematiacutees
bull No producir hemoacutelisis
bull Evitar al maacuteximo la agregacioacuten plaquetaria
bull No alterar la morfologiacutea de los leucocitos
La sangre tratada con anticoagulante debe procesarse lo antes posible
inclusomantenida bajo refrigeracioacuten (4 ordmC) si no pasan de las 2 horas El
tiempomaacuteximo entre la extraccioacuten de la sangre y su procesamiento depende
delcoagulante de eleccioacuten y no debe ser maacutes de 4 horas a excepcioacuten
delanticoagulante EDTA (etilendiaminotetraceacutetico) que puede ser hasta 24
horas(en refrigeracioacuten a 4 ordmC)
Los anticoagulantes pueden emplearse en forma soacutelida o liacutequida Los
primerosestaacuten indicados para la determinacioacuten de los paraacutemetros
hematoloacutegicosya que no producen como los anticoagulantes liacutequidos dilucioacuten de
la sangre
42 ANTICOAGULANTES SOacuteLIDOS
421 EDTA
Es la sal disoacutedica o tripotaacutesica del aacutecido etilendiaminotetraceacutetico La saldisoacutedica
(Na2EDTA) es menos soluble que la sal tripotaacutesica (K3EDTA) Estoscompuestos
realizan su accioacuten a traveacutes de un efecto quelante sobre el calcioal fijarlo impiden
su activacioacuten y por ende la coagulacioacuten sanguiacutenea
4211 Ventajas
bull Respeta la morfologiacutea eritrocitaria (especialmente la sal tripotaacutesica) yleucocitaria de manera que permite una demora de dos horas en la realizacioacutendel frotis sanguiacuteneo despueacutes de la extraccioacuten sanguiacutenea
bull Asegura la conservacioacuten de los elementos formes sanguiacuteneos durante 24horas si la sangre se mantiene a 4 ordmC
bull Al inhibir la aglutinacioacuten de las plaquetas facilita su recuento o su expresioacutensemicuantitativa a partir del frotis
bull La concentracioacuten recomendada de EDTA es de 15 mgmL de sangre Unamayor cantidad de anticoagulante puede producir retraccioacuten celular condisminucioacuten del hematocrito y un aumento de la concentracioacuten media de lahemoglobina Un exceso de sangre con relacioacuten al anticoagulante produceformacioacuten de microagregados que pueden alterar los resultados El empleode tubos al vaciacuteo con una gota (50mL) de EDTA tripotaacutesica comercialpara 5 mL de sangre es de intereacutes praacutectico dado que es cien veces maacutessoluble facilitando la mezcla de sangre con anticoagulante
4212 Desventajas
Usado en exceso afecta a los eritrocitos y a los leucocitos a los cuales les produce encogimiento y cambios en su forma por ello debe cuidarse de agregar la cantidad correcta de sangre al anticoagulante
422 Anticoagulante de Wintrobe
Es una mezcla de oxalato de amonio y potasio Actuacutea por precipitacioacuten del calcio es faacutecil de preparar Se emplea en forma de polvo en proporcioacuten de 2 de oxalato de amonio por 1 de oxalato de potasio La cantidad recomendada es de 2 mg x mL de sangre Este anticoagulante no afecta el volumen globular medio y puede usarse para determinaciones de hemoglobina hematocrito y recuento globular pero para los extendidos queda limitada a los primeros minutos tampoco es uacutetil para el recuento plaquetario porque produce formacioacuten de agregados plaquetarios
423 Heparina
El nombre de heparina proviene del griego hepar que significa hiacutegado ya que fue aislado por primera vez de las ceacutelulas de este tejido Es un mucopolisacaacuterido aacutecido Presenta el
inconveniente de que si no se agita raacutepidamente con la sangre despueacutes de extraiacuteda
pueden formarse microcoaacutegulos aunque no altera el volumeneritrocitario ni la morfologiacutea de los leucocitos No es recomendablepara el frotis sanguiacuteneo porque produce un fondo azul en la laacutemina
La heparina de sodio o litio puede usarse en forma soacutelida o liacutequida en
proporcioacutende 01 - 02 mg de heparina por 1 mL de sangre
43 ANTICOAGULANTES LIacuteQUIDOS
431 Citrato trisoacutedico
Es de eleccioacuten para las pruebas de hemostasia y la velocidad de sedimentacioacuten
Actuacutea a traveacutes de la precipitacioacuten del calcio La concentracioacuten depende de
la prueba por realizar
bull Para pruebas de hemostasia se emplea en proporcioacuten de 1 9 (05 mL
deanticoagulante para 45 mL de sangre total)
bull Para la determinacioacuten de la VSG (Velocidad de Sedimentacioacuten Globular) es14
(05 mL de anticoagulante para 2 mL de sangre)
432 Oxalato soacutedico
Recomendado tambieacuten para las pruebas de hemostasia Se emplea en
proporcioacutende un volumen de anticoagulante para 4 vol de sangre
SECCIOacuteN 5
REALIZACIOacuteN Y TINCIOacuteN DEL FROTIS SANGUIacuteNEO
La praacutectica del frotis sanguiacuteneo tambieacuten llamado extendido es de gran importanciaen hematologiacutea ya que el diagnoacutestico de muchas enfermedadeshematoloacutegicas puede realizarse con soacutelo observar las caracteriacutesticasmorfoloacutegicas de las ceacutelulas sanguiacuteneas de manera que eacuteste no debe serexcesivamente grueso ni excesivamente fino Todas las laacuteminas por usarsobre todo nuevas deben ser limpiadas con algodoacuten y alcohol al 70 paraeliminar la grasa que viene adherida
51 MEacuteTODO DE LOS DOS PORTAOBJETOS
511 Materiales
- Alcohol al 70
- Algodoacuten
- Lanceta descartable
- Portaobjetos de vidrios limpios y desgrasados (25 x 75 mm)
512 Fundamento
Consiste en la extensioacuten de una gota de sangre sobre un portaobjeto (25 x 75)empleando el canto biselado de otro portaobjeto de igual dimensioacuten (Fig 12)
513 Procedimiento
5131 Una vez extraiacuteda la sangre con cualquiera de las metodologiacuteas secoloca una pequentildea gota de sangre (5mL) (aprox 3 mm de diaacutemetro)sobre un portaobjeto a 2 cm aproximadamente de uno de los extremos
5132 Colocar el canto de otro portaobjeto esmerilado sobre la superficiedel primer portaobjeto (en la que se encuentra la gota de sangre)formando un aacutengulo de 45ordm
5134 Deslizar suavemente y a velocidad moderada el portaobjeto sobre elotro en sentido longitudinal hasta que la gota de sangre quede bienextendida sobre la
superficie del primer portaobjeto El grosor delfrotis sanguiacuteneo puede variar seguacuten sea el aacutengulo que formen entresiacute ambos portaobjetos Asiacute si es superior a 45ordm la extensioacuten obtenidaseraacute gruesa y corta si es inferior a 45ordm seraacute larga y fina El secado delfrotis es a temperatura ambiente y en posicioacuten horizontal
Fig 12
1048729 Zona excesivamente gruesa Se halla en la regioacuten inmediata al punto departida de la extensioacuten (cabeza) En ella se aprecia siempre un aumento delinfocitos
1048729 Zona excesivamente fina Corresponde al final de la extensioacuten y termina enun aacuterea donde las ceacutelulas adoptan una posicioacuten acartonada (barbas) Enesta regioacuten existe un exceso de granulocitos y monocitos
1048729 Zona ideal Corresponde a la regioacuten intermedia del frotis y en ella existe unreparto equilibrado de ceacutelulas
52 COLORACIONES USADAS
Una vez seco el frotis se procede a la tincioacuten hematoloacutegica con el colorante deRomanowsky constituido por la mezcla de eosina y azul de metileno Dentrode eacutestas tenemos
521 Colorante de Giemsa
522 Colorante de May-Grunwald
523 Colorante de Wright
524 Colorante de Leishman
Preparacioacuten de colorantes (Anexo A)
1048729 Para el estudio de las ceacutelulas sanguiacuteneas utilizar el colorante 523 y 524
1048729 Para el estudio de hemoparaacutesitos utilizar el colorante 521
1048729 Utilizar el colorante 522 para casos especiales en que se desee observar
con mayor claridad y especificidad los graacutenulos de los neutrofilos
53 TINCIOacuteN CON COLORANTE DE WRIGHT
531 Fundamento
El colorante de Wright va a permitir suministrar un medio para estudiar lasangre y determinar las variaciones y anormalidades de estructura forma ytamantildeo de los eritrocitos su contenido de hemoglobina y sus propiedades decoloracioacuten La informacioacuten obtenida de un frotis de sangre perifeacuterica dependeen gran parte de la calidad del extendido y la coloracioacuten
532 Materiales
5321 Colorante de Wright (Anexo A)
5322 Frasco gotero
5323 Solucioacuten amortiguada tamponada (Anexo A)
533 Procedimiento
5331 Una vez obtenido el frotis sanguiacuteneo se le dejaraacute secar entre 15 y 20minutos
5332 Luego se coloca la preparacioacuten en un soporte y se cubre con el colorantede Wright dejaacutendolo por espacio de 5 minutos
5333 Posteriormente se antildeade solucioacuten amortiguada tamponada en partesiguales hasta obtener un brillo metaacutelico dejando 6 minutos adicionales
5334 Finalmente se lava con agua corriente y se deja secar
5335 Se coloca en el microscopio y con pequentildeo aumento se revisa lacalidad de la coloracioacuten la cantidad aproximada de gloacutebulos blancosy se escoge el sitio para iniciar el recuento Se coloca una gota deaceite de inmersioacuten y se enfoca a un aumento de 100xLa forma de los gloacutebulos rojos se examinaraacute detenidamente observandoademaacutes del color (cantidad de hemoglobina) presencia deplaquetas su agrupacioacuten y distribucioacuten
5336 Posteriormente se hace el recuento diferencial de gloacutebulos blancosen 100
ceacutelulas para lo cual se deberaacute conocer las diferencias entreneutroacutefilos eosinoacutefilos
linfocitos y monocitosUna extensioacuten de sangre bien tentildeida debe caracterizarse
por unabuena diferenciacioacuten de las estructuras subcelulares en los leucocitosuna
coloracioacuten rosada de los hematiacutees y la ausencia de precipitados
Los defectos maacutes frecuentes observados en la tincioacuten del frotis sanguiacuteneoson
Coloracioacuten excesivamente azul debido a
1048729 Frotis excesivamente grueso
1048729 Lavado insuficiente
1048729 Tincioacuten muy prolongada
1048729 Empleo de colorante excesivamente alcalino
Coloracioacuten con una tonalidad rosada
1048729 El colorante el tampoacuten o el agua de lavado tienen un pH demasiadoaacutecido
Presencia de precipitados
1048729 Obedecen a una accioacuten excesiva del colorante Esto se puede evitarcon la
filtracioacuten
SECCIOacuteN 6
HEMOGRAMA-HEMOGLOBINA-HEMATOCRITO
El hemograma de Shilling constituye uno de los exaacutemenes de laboratorio
maacutesusados en el campo de la hematologiacutea Comprende las siguientes pruebas
61 RECUENTO LEUCOCITARIO
Principio
La sangre anticoagulada se deposita en un liacutequido que permite evidenciar
losleucocitos mantenieacutendolos visibles mientras que los eritrocitos
sonhemolizados El recuento del nuacutemero de leucocitos o gloacutebulos blancos se
expresapor mm3 (miliacutemetro cuacutebico)
611 Equipos
- Microscopio
- Hemocitoacutemetro (Caacutemara de Neubauer)
Consta de los siguientes elementos
diams Una laacutemina portaobjeto gruesa en el centro se hallan dos
superficiescuadriculadas iguales separadas del resto de la laacutemina por surcos y
dosbarras transversales algo maacutes elevadas
diams Una laminilla cubreobjetos oacutepticamente plana que al colocarse sobrelas barras
elevadas de la laacutemina forma una caacutemara entre el cubreobjetosy la superficie
cuadriculadaLa altura entre el cubreobjetos y la laacutemina portaobjetos es de 01
mmCada cuadriacutecula mide 3 mm de lado y se divide en 9 cuadrados grandesCada
uno de los cuales mide 1 mm2 de superficie que se subdivide a suvez en 16
cuadrados medianos El cuadrado grande central se divide en25 cuadrados
pequentildeos y cada uno de ellos en 16 cuadraditos Cadacuadrado pequentildeo mide
02 mm de lado (004 mm2 de superficie) y cadacuadradito mide 005 mm de lado
(00025 mm2 de superficie)
612 Materiales y reactivos requeridos
6121 Pipeta de gloacutebulos blancos (De Thoma) o pipeta automaacutetica (de 0 a 100 mL)Presenta cerca del extremo superior una marca de 11 inmediatamentecontinuacutea una dilatacioacuten (bulbo) que contiene una perla que funciona comomezcladora luego sigue el extremo maacutes largo de la pipeta (tallo) que estaacutedividida en 10 partes con 2 marcas 1 (parte final del bulbo) y 05 (a la mitaddel tallo) Se le acopla a su extremo superior 1 tubo de goma y una bombillapara aspirar
6122 Diluyente de gloacutebulos blancos Solucioacuten de Turk al 1
6123 Contador manual (Soacutelo si fuera necesario)
6124 Papel filtro
613 Procedimiento
6131 Una vez obtenida la sangre con anticoagulante o sangre capilar deldedo se procede a aspirar la sangre con la pipeta de gloacutebulos blancoshasta la marca de 05 y a limpiar la punta con papel absorbente
6132 Introducir la pipeta en el tubo que contenga solucioacuten de Turk y absorberhasta la marca de 11 (no debe haber burbujas)
6133 Tapar ambos extremos y proceder a mezclar manualmente o en unrotador automaacutetico por 2 oacute 3 minutos
6134 Monte la laminilla de vidrio en la caacutemara para recuento que debe estarlimpia y seca
6135 Agitar la pipeta y descartar las cuatro primeras gotas para luego colocaruna gota pequentildea de esta solucioacuten en la caacutemara
6136 Deje reposar por espacio de 3 minutos para que las ceacutelulas se sedimenten
6137 Enfocar con objetivo de 10x y contar en 4 cuadrados grandes angularesCuando se usa la pipeta automaacutetica se toma 20 mL (002 mL) desangre total con anticoagulante o sangre capilar con anticoagulante yse diluye en un tubo que contenga 380 mL de solucioacuten de Turk (aquiacutetenemos una dilucioacuten 120)
LECTURA
Fig 13
La lectura se realiza en los campos 1 3 7 y 9 como estaacute indicado en la figuraAdemaacutes de los leucocitos contados dentro de cada uno de los cuadrantes sedeben contar todos los leucocitos que se encuentren adheridos en la liacuteneahorizontal superior y vertical exterior o de lo contrario todos los leucocitosadheridos a la liacutenea horizontal inferior y vertical interior
614 Resultados
Nordm de leucocitos x mm3 = leucocitos contados en 4 camposdividealtura x dilucioacuten x aacuterea
Reemplazando = leucocitos contados en 4 camposdivide110 x 120 x 4=
Leucocitos contados en 4 camposdivide4200=
X1 divide4200= Nordm leucocitos contados x 50
615 Valores de referencia
5000 - 10 000 leucocitos mm3
616 Correccioacuten de valores para restar eritrocitos nucleados
Los normoblastos no se destruyen (lisis) en el liacutequido de dilucioacuten por lo tantopueden observarse al realizar el recuento leucocitario y confundirse con losleucocitos de tal manera que se debe emplear la siguiente foacutermula
Caacutelculo
La concentracioacuten del nuacutemero de normoblastos (por litro) esNuacutemero de normoblatos contados x concentracioacuten o nuacutemero de leucocitos100 + Nordm de normoblastos contados
Ejemplo
Si se cuentan 50 normoblastos y la concentracioacuten del nuacutemero de leucocitos es16 x 109l la concentracioacuten del nuacutemero de normoblastos seraacute
50 x16 = 53 x 109l
100 + 50
y la concentracioacuten de leucocitos corregida seraacute 16 - 53 = 107 x 109lEn unidades tradicionales las concentraciones de normoblastos y leucocitosse expresan por miliacutemetro cuacutebico En tales unidades el caacutelculo correspondienteal ejemplo que se ha dado seriacutea
50 x 16 000 = 5300 mm3
100 + 50
Recuento corregido de gloacutebulos blancos o leucocitos = 16 000 - 5300 = 10 700 mm3
Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2
62 RECUENTO DE GLOacuteBULOS ROJOS
Principio
La sangre se diluye en un liacutequido que nos permite observar claramente loshematiacutees luego esta dilucioacuten se coloca en una caacutemara de Neubauer con laayuda de una pipeta automaacutetica o pipeta Pasteur y se cuentan en el microscopioa un objetivo de 40x para calcular el nuacutemero de gloacutebulos rojos por mm3
621 Equipos
- Microscopio
- Hemocitoacutemetro (caacutemara de Neubauer)
622 Materiales y reactivos requeridos
6221 Pipeta de gloacutebulos rojos (De Thoma) o pipeta automaacutetica (de 0-100 mL)
Presenta cerca del extremo superior una marca de 101 inmediatamentecontinuacutea una dilatacioacuten (bulbo) que contiene una perla roja mezcladoraluego sigue el tallo (extremo maacutes largo) el cual estaacute dividido en 10 partescon 2 marcas 1 acabando el bulbo y 05 a la mitad del tallo Se requiereigual que el recuento de leucocitos una boquilla para aspirar
6222 Diluyente de gloacutebulos rojos Cloruro de Sodio al 09 (ver anexo)
Diluyente de Hayem (ver anexo)
6223 Contador manual (soacutelo si fuera necesario)
6224 Papel filtro
623 Procedimiento
6231 Mezclar la sangre obtenida con el anticoagulante o tomar sangre capilar
6232 Llenar la pipeta de gloacutebulos rojos con sangre hasta la marca de 05para realizar una dilucioacuten de 1200 y si se carga hasta 1 la dilucioacutenseraacute 1100 Limpiar la punta con gasa o papel absorbente
6233 Introducir la pipeta en el tubo o frasquito conteniendo diluyente (Hayem)y llenar de liacutequido de dilucioacuten hasta la marca de 101
6234 Se coloca en un rotador automaacutetico o se hace rotar manualmente de2 a 3 minutos
6235 Agitar bien la pipeta y descartar 3 a 4 gotas del tallo luego colocar unagota pequentildea cerca de un extremo de la caacutemara para que por capilaridadse llene exactamente
6236 Hacer el recuento con objetivo de 40xSe puede realizar con la pipeta automaacutetica se toma 20 mL (002mL)de sangre total con anticoagulante o sangre capilar y se deposita enun tubo de 12 x 75 que contenga 4 mL de solucioacuten de Hayem (aquiacute setiene una dilucioacuten de 1200) Se deja reposar aproximadamente 5minutos y se procede a cargar la caacutemara con la misma pipeta usandoun nuevo tip El inconveniente aquiacute es el gasto de reactivo (4 mL) perolas medidas son mas exactas
6237 Dejar en reposo por 3 minutos
6238 Enfocar la cuadriacutecula a 10x luego con el objetivo de 40x contar sobreel cuadrado grande central de la caacutemara soacutelo en 5 cuadrados pequentildeosuno central y cuatro angulares (80 cuadraditos en total)
6239 En el recuento se incluyen las ceacutelulas que cubren o tocan por dentroo por fuera las liacuteneas limitantes superior e izquierda en el cuadradopequentildeo de recuento y no se consideran los correspondientes a losliacutemites inferior y derechoSe hace el recuento en los puntos ABCD y Ey se sigue los mismos paraacutemetros del recuento de leucocitos
LECTURA
Fig 14
624 Resultados
Nordm de hematiacutees x mm3 = hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeosaltura x dilucioacuten X aacuterea
Reemplazando = hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeos110 x 1200 x 15
= hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeos divide 110 000
= hematiacutees contados x 10 000
625 Valores de referencia
(Unidades tradicionales millones de ceacutelulasmm3)
Hombres 4 500 000 - 5 500 000
Mujeres 4 000 000 - 5 000 000
Nintildeos (4 antildeos) 4 200 000 - 5 200 000
Lactantes (1 - 6 meses) 3 800 000 - 5 200 000
Recieacuten nacidos 5 000 000 - 6 000 000
Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2
63 DETERMINACIOacuteN DEL VOLUMEN GLOBULAR (Hematocrito)
Mide la fraccioacuten que comprende a los gloacutebulos rojos (masa globular) respectoal
volumen total de la muestra de sangre venosa o capilar Puede expresarseen
porcentaje o como valor decimal
Hto= altura de la columna de gloacutebulos rojosdivide altura de la columna de sangre
total(gloacutebulos rojos maacutes plasma)
631 Meacutetodo de Wintrobe
Materiales requeridos
- Tubo de Wintrobe graduado de 0 - 100 mm
- Pipetas Pasteur o pipetas de transferencia
- Tapoacuten de goma
Procedimiento
diams Llenar la sangre extraiacuteda con anticoagulante con una pipeta pasteur
comenzandodesde el fondo hasta la marca superior de 100 mm teniendocuidado
de no provocar espuma
diams Tapar el tubo con un tapoacuten de goma para evitar la evaporacioacuten
diams Centrifugar a 3000 rpm por 30 minutos
Resultados (lectura)
Del tubo graduado se mide directamente el nivel de la columna de gloacutebulosrojos
Valores de referencia
Hombres 40 - 54Mujeres 38 - 48
Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2
632 Meacutetodo de microhematocrito
Materiales requeridos
- Capilares rojos y azules (75 mm x 15 mm)
- Plastilina
Procedimiento
diams Tomar la muestra en capilares rojos heparinizados directamente del pulpejodel
dedo o utilizar capilares azules sin heparina para sangre venosacon
anticoagulante de Wintrobe o EDTA Debe llenarse aproximadamente70 - 80
del capilar
diams Ocluir (tapar) un extremo del capilar con plastilina
diams Colocar el capilar sobre la plataforma del cabezal de una centriacutefuga demicrohematocrito con el extremo ocluido adherido al reborde externo de laplataforma
diams Centrifugar por 5 minutos entre 10 000 - 12 000 rpm
Resultados (lectura)
La lectura se realiza con una escala estandarizada que expenden en el comercio
Uso de la escala
diams Sostenga el tubo frente a la escala de manera que el fondo de la columnade eritrocitos (no el extremo inferior del tubo) quede exactamente al mismonivel de la liacutenea horizontal correspondiente al cero
diams Desplace el tubo a traveacutes de la escala hasta que la liacutenea marcada con elnuacutemero 10 quede al nivel del tope de la columna de plasma Vigile que elfondo de la
columna de eritrocitos continuacutee sobre la liacutenea cero El tubodebe encontrarse completamente en posicioacuten vertical
diams La liacutenea que pase al nivel del tope de la columna de eritrocitos indicaraacute lafraccioacuten de volumen de eacutestos
Valores de referencia
Hombres 40 - 50
Mujeres 38 - 44
Nintildeos (5 antildeos) 38 - 44
Lactantes (3 meses) 37 - 42
Recieacuten nacidos 50 - 58
La disposicioacuten celular esParte superior una columna de plasmaEn la interfase estaacuten los leucocitos yplaquetasParte inferior estaacute la columna deeritrocitos (Fig 15)
64 DOSAJE DE HEMOGLOBINA
Principio
La sangre se diluye en liacutequido de Drabkin el cual hemoliza los hematiacutees yconvierte la hemoglobina en cianometahemoglobina (cianuro de hemiglobina)La solucioacuten que se produce se lee por medio de un espectrofotoacutemetro ofotocoloriacutemetro Su grado de absorbancia es proporcional a la cantidad dehemoglobina que contenga la sangre
641 Materiales y reactivos
6411 Un coloriacutemetro fotoeleacutectrico o un espectrofotoacutemetro
6412 Pipetas
diams Una pipeta para sangre (pipeta de Sahli) graduada hasta 002 mL contubo de goma y boquilla
diams Una pipeta de vidrio graduada de 5 mL
6413 Tubos de ensayo
6414 Reactivo de Drabkin para dilucioacuten
Este reactivo se puede adquirir en tabletas o polvos para disolver en 1litro de agua destilada Si se dispone de una balanza analiacutetica la preparacioacutense puede hacer en el laboratorio Esta solucioacuten se puedeconservar durante un mes en un frasco de vidrio oscuro Deseacutechese sise enturbia
CONTENIDO
Presentacioacuten7
Introduccioacuten9
SECCIOacuteN 1 GENERALIDADES11
11 Objetivo 11
12 Campo de aplicacioacuten 11
13 Responsabilidades11
14 Documentos de referencia12
SECCIOacuteN 2 MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD13
SECCIOacuteN 3 OBTENCIOacuteN DE MUESTRAS SANGUIacuteNEAS14
31 Objetivo14
32 Obtencioacuten de sangre venosa con jeringahellip14
33 Obtencioacuten de sangre venosa en tubos al vaciacuteo 16
34 Obtencioacuten de sangre de la vena yugular externa 18
35 Obtencioacuten de sangre capilar 19
SECCIOacuteN 4 ANTICOAGULANTES 22
41 Caracteriacutesticas baacutesicas de los anticoagulantes maacutes usados en hematologiacutea22
42 Anticoagulantes soacutelidoshellip22
43 Anticoagulantes liacutequidos 24
SECCIOacuteN 5 REALIZACIOacuteN Y TINCIOacuteN DEL FROTIS SANGUIacuteNEO 25
51 Meacutetodo de los dos portaobjetos 25
52 Coloraciones usadas 26
53 Tincioacuten con colorante de Wright27
SECCIOacuteN 6 HEMOGRAMA- HEMOGLOBINA- HEMATOCRITO 29
61 Recuento leucocitario 29
62 Recuento de gloacutebulos rojos 33
63 Determinacioacuten del volumen globular (Hto) 35
64 Dosaje de hemoglobina 38
65 Frotis de sangre perifeacuterica 40
66 Foacutermula leucocitaria 41
SECCIOacuteN 7 VELOCIDAD DE SEDIMENTACIOacuteN43
71 Meacutetodo de Westergren 43
72 Meacutetodo de Wintrobe 44
SECCIOacuteN 8 PERFIL DE HEMOSTASIA45
81 Principios generales 45
82 Mecanismo de coagulacioacuten 45
83 Exploracioacuten de la coagulacioacuten 46
84 Obtencioacuten del plasma 46
85 Tiempo de sangriacutea47
851 Meacutetodo de Ivy48
852 Meacutetodo de Duke49
86 Tiempo de coagulacioacuten de sangre total (TCST) 51
87 Tiempo de tromboplastina parcial activada (PTTK) 54
88 Tiempo de trombina 55
89 Tiempo de protrombina (Prueba de Quick) 56
SECCIOacuteN 9 RECUENTO DE RETICULOCITOS Y PLAQUETAS58
91 Recuento de reticulocitos 58
92 Recuento de plaquetas 60
SECCIOacuteN 10 LEUCOGRAMA63
101 Granulocitos63
102 Agranulocitos 65
103 Criterios para el desarrollo de un leucograma 67
SECCIOacuteN 11 ALTERACIONES ERITROCITARIAS79
Alteraciones en el tamantildeo 70
Alteraciones en la forma 71
Alteraciones de color72
Inclusiones anormales73
BIBLIOGRAFIacuteA79
ANEXO A Preparacioacuten de colorantes y soluciones maacutes
Usados en hematologiacutea81
ANEXO B Preparacioacuten de anticoagulantes 85
PRESENTACIOacuteN
Con el propoacutesito de uniformizar los procedimientos hematoloacutegicos que serealizan en los diversos laboratorios cliacutenicos el Instituto Nacional de Saludpone a disposicioacuten de la comunidad teacutecnico-cientiacutefica nacional el Manual deProcedimientos de Laboratorio en Teacutecnicas Baacutesicas de Hematologiacutea en elcual se incluyen todos los meacutetodos empleados en el campo hematoloacutegicobaacutesico De este modo se contribuye a mejorar la calidad de diagnoacutestico en loslaboratorios de los servicios de saludEl laboratorio de hematologiacutea cuenta con dos aacutereas baacutesicas Aacuterea deHematimetriacutea (hemograma VSE recuento de plaquetas etc) y Aacuterea deHemostasia Partiendo de esta estructura en este manual nos referiremos alas teacutecnicas baacutesicas empleadas en estas aacutereas partiendo de la toma de muestrahasta la realizacioacuten de las pruebas respectivasEs necesario enfatizar que para obtener resultados maacutes confiables es importantepero no imprescindible automatizar el laboratorio debido a que elloevitaraacute el posible error humano sobre todo en lo referente a recuentos celularesvalores de hemoglobina y constantes corpusculares ya que en estasvariables se trabaja con cantidades exactas de sangre hecho que es muydifiacutecil de lograr cuando se usan los meacutetodos manuales lo mismo sucede altratarse de las pruebas de hemostasiaEsperamos que este manual constituya una herramienta de consulta en laRed Nacional de Laboratorios de Salud ademaacutes de una guiacutea para el personalde laboratorio en general
INTRODUCCIOacuteN
El presente manual ha sido elaborado en forma simple didaacutectica y eminentementepraacutectica para que su contenido sea faacutecil de entender por el personalque labora en el laboratorio de hematologiacuteaSe divide en tres partes
1 En la primera parte se presentan los aspectos maacutes importantes de labioseguridad en el laboratorio
2 En la segunda parte se exponen las principales teacutecnicas baacutesicas del laboratoriode hematologiacutea
3 En la tercera parte se detallan las alteraciones maacutes frecuentes de la serieroja y de la serie blanca de un hemograma
El objetivo principal es protocolizar y estandarizar los procedimientoshematoloacutegicos que empiezan con la toma de muestra (siguiendo las pautasde control de calidad preanaliacutetica) hasta el procesamiento de eacutesta (fase analiacutetica)en la determinacioacuten correspondiente y por uacuteltimo en la emisioacuten de losresultados (fase postanaliacutetica) Debemos recalcar que cuando se realizanpruebas de hemostasia debe tenerse en consideracioacuten los cuidados comunesa toda prueba de laboratorio es decir las muestras deben obtenerse encondiciones apropiadas y rotularse debidamente Esperamos que el presentemanual sirva de guiacutea efectiva y que pueda ser enriquecido con nuevosaportes con la finalidad de alcanzar un trabajo de calidad
SECCIOacuteN 1
GENERALIDADES
11 OBJETIVO
Establecer y estandarizar los procedimientos baacutesicos de un examen dehemograma hemoglobina hematocrito recuento de plaquetas velocidad desedimentacioacuten y recuento de reticulocitos que sirvan de ayuda diagnoacutestica alcliacutenico
12 CAMPO DE APLICACIOacuteN
La aplicacioacuten de las teacutecnicas hematoloacutegicas nos sirve para estandarizar losprocedimientos a nivel nacional y para que sea de utilidad al personal teacutecnicoy profesional de los laboratorios cliacutenicos
13 RESPONSABILIDADES
131 El Centro Nacional de Laboratorios en Salud Puacuteblica a traveacutes de su
Direccioacuten Ejecutiva de Laboratorios de Referencia es responsable deautorizar la elaboracioacuten la revisioacuten y la actualizacioacuten del presente manualde acuerdo con los procedimientos aprobados por el Instituto Nacionalde Salud
132 Los directores de los establecimientos de salud son responsables deautorizar proporcionar los recursos necesarios y designar al personalresponsable para la aplicacioacuten de las disposiciones contenidas en elpresente manual
133 El personal de los establecimientos de salud es responsable de planificarlas acciones organizar controlar y capacitar al personal para cumplirlas disposiciones contenidas en el presente manual
134 Los jefes o responsables de los laboratorios deben asegurar el controlinterno de la calidad la idoneidad del personal equipos materialesreactivos e instalaciones
135 El personal meacutedico profesional y teacutecnico es responsable de seguir lasespecificaciones contenidas en el presente manual y aplicar los procedimientosespeciacuteficos indicados
14 DOCUMENTOS DE REFERENCIA
141 Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OrganizacioacutenPanamericana de la Salud Publicacioacuten cientiacutefica Nordm 439 Nordm 2 1983
142 Manual de normas de bioseguridad Instituto Nacional de Salud Serie deNormas Teacutecnicas Nordm 18 2ordf ed 1997
SECCIOacuteN 2
MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD
21 Para la obtencioacuten de muestras el personal involucrado en los diferentesprocesos para los exaacutemenes hematoloacutegicos debe aplicar las medidas debioseguridad establecidas en el Manual de Bioseguridad Serie de NormasTeacutecnicas Nordm 18
22 Se debe controlar sobre todo
221 Al personal que trabaja en el laboratorio de hematologiacutea
222 El proceso de coloracioacuten en el que se debe aplicar las medidas debioseguridad correspondientes al uso y manipulacioacuten de sustanciastoacutexicas o canceriacutegenas
223 Ver lo referente a medidas de proteccioacuten en caso de accidentes porinoculacioacuten
SECCIOacuteN 3
OBTENCIOacuteN DE MUESTRAS SANGUIacuteNEAS
31 OBJETIVO
Establecer y uniformizar criterios en el procedimiento de obtencioacuten de muestrassanguiacuteneas con un adecuado control de calidad ya que de ello dependeque el resultado del anaacutelisis de la muestra sea el correcto Se efectuaraacute enayunas o no dependiendo de la prueba a usar
32 OBTENCIOacuteN DE SANGRE VENOSA CON JERINGA
321 Materiales y equipos requeridos
3211 Algodoacuten
3212 Alcohol al 70
3213 Ligadura o torniquete de 25 a 30 cm de largo
3214 Jeringas de 5 mL
3215 Viales con anticoagulante EDTA
322 Obtencioacuten de la muestra
3221 Verificar que los elementos por utilizar esteacuten listos y que el pacientese sienta coacutemodo
3222 Aplicar el torniquete aproximadamente cuatro dedos por encima de laflexioacuten del codo o a 10 cm del codo sujetar con un medio nudo (Fig 1)
3223 Limpiar la zona con alcohol al 70 o alcohol yodado en un aacuterea de 2pulgadas (Fig 2)
3224 El paciente deberaacute abrir y cerrar la mano durante unos segundos ydespueacutes la mantendraacute cerrada esto ayudaraacute a visualizar las venassuperficiales (Fig 3)
3225 Se retira el estuche protector de la aguja y se coge la jeringa de talmanera que el bisel se encuentre hacia arriba (Fig 4)
3226 Se coloca la aguja en direccioacuten paralela a la vena se perfora la pielhaciendo avanzar la aguja 05-1 cm en el tejido subcutaacuteneo luego seperfora la vena (Fig 5)
3227 Se aspira la jeringa hasta el volumen requerido
3228 Retirar el torniquete e indicar al paciente que deje de hacer puntildeo Secoloca el algodoacuten seco encima de la puncioacuten y se retira la aguja (Fig 6)
3229 Retirar la aguja de la jeringa Verter la muestra lentamente por lasparedes del vial con anticoagulante No olvidar colocar una gota en lalaacutemina portaobjeto para realizar el frotis
32210 Agitar el vial en ciacuterculos sobre la mesa para homogeneizar la muestracon el anticoagulante
PUNTOS PARA LA EXTRACCIOacuteN DE SANGRE
(Toma de muestra)
Se obtiene de las venas de la fosa cubital
PROCEDIMIENTO
Fig 1 Fig 2 Fig 3
Fig 4 Fig 5
Fig 6 Fig 7
33 OBTENCIOacuteN DE SANGRE VENOSA EN TUBOS AL VACIacuteO
331 Materiales requeridos
3311 Algodoacuten
3312 Alcohol al 70
3313 Ligadura o torniquete de 25 a 30 cm de largo
3314 Tubos al vaciacuteo con anticoagulante EDTA (K3) EDTA (Na2) u otroanticoagulante
3315 Agujas con dispositivo para extraccioacuten de sangre al vaciacuteo
- Nordm 21 para adultos
- Nordm 22 para nintildeos y neonatos
De preferencia ambas de bisel corto para evitar la coagulacioacuten
332 Obtencioacuten de la muestra
3321 Repetir los pasos de 3221 a 3224
3322 Se retira el estuche protector de la aguja y eacuteste se enrosca al dispositivopara extraccioacuten de sangre al vaciacuteo
3323 Colocar la ligadura cuatro dedos por encima de la flexioacuten del codo o10 cm por encima de eacuteste y pedir al paciente que abra y cierre la manovarias veces para favorecer la dilatacioacuten de las venas
3324 Una vez escogida la vena desinfectarla con una pieza de algodoacutenembebido en etanol al 70
3325 Se coloca la aguja en direccioacuten paralela a la vena se perfora la pielhaciendo avanzar la aguja entre 05 cm y 1 cm en el tejido subcutaacuteneose inserta el tubo al vaciacuteo por la parte posterior y no preocuparse porla cantidad de sangre extraiacuteda ya que el mismo sonido del vaciacuteo avisaraacuteque la extraccioacuten terminoacute (Fig 8)
3326 Retirar la ligadura tirando del extremo doblado
3327 Colocar un pedazo de algodoacuten seco sobre la parte donde se encuentraoculta la aguja Sacar la aguja con un movimiento raacutepido y depositarlaen el recipiente de metal con desinfectante (Fig 9)
3328 Pedir al paciente que presione firmemente el algodoacuten durante 3 minutoscon el brazo extendido No se recomienda que se flexione el brazoa causa del riesgo que se forme un hematoma
3329 Mezclar por inmersioacuten suave la sangre con el anticoagulante contenidoen el tubo No agitar el contenido
Fig 8 Fig 9
333 Ventajas de una extraccioacuten de sangre venosa
3331 Pueden hacerse repetidos exaacutemenes con la misma muestra
3332 Parte de la muestra (plasma o suero) puede congelarse para referenciafutura
334 Desventajas de una extraccioacuten de sangre venosa
3341 La puncioacuten venosa por su largo procedimiento requiere mayor preparacioacuten que el meacutetodo capilar
3342 El meacutetodo es teacutecnicamente difiacutecil en nintildeos individuos obesos y pacientes en shock
3343 La hemoacutelisis debe ser evitada pues se puede obtener una disminucioacuten en el recuento de eritrocitos
3344 Debe evitarse prolongada estasis venosa producida por el torniquete pues produce hemoacutelisis y otros cambios que ponen la sangre en un estado inadecuado para el anaacutelisis de gases recuentos celulares determinacioacuten de pH sanguiacuteneo y algunas pruebas de coagulacioacuten
3345 La sangre anticoagulada si no es de obtencioacuten reciente no debe ser utilizada en extensiones de sangre pues algunos anticoagulantes producen cambios en las plaquetas que pueden causar aglutinaciones agregacioacuten plaquetaria y dificultan la identificacioacuten de leucocitos
3346 Puesto que algunos de los componentes de la sangre no son estables los recuentos de leucocitos y plaquetas e iacutendice de sedimentacioacuten deben realizarse antes de que pasen dos horas desde que se obtuvo la muestra
34 OBTENCIOacuteN DE SANGRE DE LA VENA YUGULAR EXTERNA
341 Materiales requeridos
3411 Algodoacuten
3412 Alcohol al 70
3413 Jeringas de 5 mL
3414 Viales con anticoagulante EDTA
342 Obtencioacuten de la muestra
3421 El paciente es cubierto por una saacutebana de manera que los brazospermanezcan inmovilizados a lo largo del cuerpo
3422 Al paciente se le coloca de cuacutebito dorsal sobre la mesa de examen ouna
camilla de manera que la cabeza cuelgue sobre el final de lamesa y el cuerpo sea
sujetado por un asistente
3423 Cuando el paciente grita la vena yugular externa se marca claramente
3424 Limpiar la zona en un aacuterea de 2 pulgadas con alcohol al 70 o
alcoholyodado
3425 Se repiten los pasos de 3225 a 3227 de la extraccioacuten de sangrevenosa
con jeringa
3426 Retirar la aguja de la vena y presionar suavemente con un algodoacutenseco
aproximadamente de 3 a 5 minutos Pedir al paciente que permanezcaechado diez
minutos
3427 Se repiten los pasos de 3229
3428 Se repiten los pasos de 32210
343 Ventajas
Constituye un buen meacutetodo para la obtencioacuten de sangre en pacientes conshock
con venas colapsadas
344 Desventajas
Por lo delicado en su procedimiento no se recomienda como rutina soacutelo encasos
en que no se pueda obtener la muestra por meacutetodos convencionales
35 OBTENCIOacuteN DE SANGRE CAPILAR
Cuando la cantidad de sangre que se precisa es muy pequentildea o cuando
pordiferentes motivos no pueda practicarse una puncioacuten venosa debe recurrirse
a la puncioacuten capilar
351 Materiales requeridos
3512 Algodoacuten
3513 Alcohol al 70
3514 Lancetas desechables (Fig 10)
3515 Papel filtro Nordm 2
352 Procedimiento (Fig 11)
3521 La sangre capilar se obtiene de la cara lateral del dedo medio o anularen los adultos y del dedo gordo del pie o taloacuten en los nintildeos
3522 Desinfectar la zona con alcohol al 70 secar con algodoacuten esteacuteril
3523 Punzar la piel con una lanceta esteacuteril desechable (2 mm de profundidad)
3524 Usar gasa esteacuteril para desechar la primera gota y recoger las siguientesen tubos capilares Evitar comprimir la extremidad para obtenersangre porque se altera la composicioacuten sanguiacutenea
353 Ventajas
3531 Puede obtenerse con facilidad
3532 Es preferible cuando han de realizarse extensiones de sangre perifeacuterica
354 Desventajas
3541 Soacutelo se pueden obtener pequentildeas cantidades de sangre y los exaacutemenesde repeticioacuten requieren nuevas muestras
3542 La sangre en microtubos (capilares) frecuentemente se hemolizainterfiendo con la mayoriacutea de pruebas de laboratorio
3543 Los resultados obtenidos en pruebas con sangre capilar no puedenser comparados con los resultados de las pruebas con sangre venosa
3544 El dedo no soacutelo es delicado sino difiacutecil de desinfectar adecuadamenteen el tiempo disponible
3545 En pacientes con resistencia disminuida a la infeccioacuten (aquellos conleucemia agranulocitosis diabetes uremia y enfermedades con deficienciasinmunoloacutegicas) una muestra tomada del dedo es mucho maacutesprobable que conduzca a una infeccioacuten que otra tomada del brazo
3546 El recuento de eritrocitos y leucocitos asiacute como el recuento deplaquetas y reticulocitos no debe realizarse en sangre capilar debidoa la difiacutecil estandarizacioacuten del flujo sanguiacuteneo capilar
EXTRACCIOacuteN DE SANGRE CAPILAR
Fig 10
Fig 11
SECCIOacuteN 4
ANTICOAGULANTES
Una vez extraiacuteda la sangre eacutesta puede conservarse coagulada o
mantenidaincoagulable mediante la adicioacuten de un anticoagulante
41 CARACTERIacuteSTICAS BAacuteSICAS DE LOS ANTICOAGULANTES MAacuteS
USADOSEN HEMATOLOGIacuteA
bull No alterar el tamantildeo de los hematiacutees
bull No producir hemoacutelisis
bull Evitar al maacuteximo la agregacioacuten plaquetaria
bull No alterar la morfologiacutea de los leucocitos
La sangre tratada con anticoagulante debe procesarse lo antes posible
inclusomantenida bajo refrigeracioacuten (4 ordmC) si no pasan de las 2 horas El
tiempomaacuteximo entre la extraccioacuten de la sangre y su procesamiento depende
delcoagulante de eleccioacuten y no debe ser maacutes de 4 horas a excepcioacuten
delanticoagulante EDTA (etilendiaminotetraceacutetico) que puede ser hasta 24
horas(en refrigeracioacuten a 4 ordmC)
Los anticoagulantes pueden emplearse en forma soacutelida o liacutequida Los
primerosestaacuten indicados para la determinacioacuten de los paraacutemetros
hematoloacutegicosya que no producen como los anticoagulantes liacutequidos dilucioacuten de
la sangre
42 ANTICOAGULANTES SOacuteLIDOS
421 EDTA
Es la sal disoacutedica o tripotaacutesica del aacutecido etilendiaminotetraceacutetico La saldisoacutedica
(Na2EDTA) es menos soluble que la sal tripotaacutesica (K3EDTA) Estoscompuestos
realizan su accioacuten a traveacutes de un efecto quelante sobre el calcioal fijarlo impiden
su activacioacuten y por ende la coagulacioacuten sanguiacutenea
4211 Ventajas
bull Respeta la morfologiacutea eritrocitaria (especialmente la sal tripotaacutesica) yleucocitaria de manera que permite una demora de dos horas en la realizacioacutendel frotis sanguiacuteneo despueacutes de la extraccioacuten sanguiacutenea
bull Asegura la conservacioacuten de los elementos formes sanguiacuteneos durante 24horas si la sangre se mantiene a 4 ordmC
bull Al inhibir la aglutinacioacuten de las plaquetas facilita su recuento o su expresioacutensemicuantitativa a partir del frotis
bull La concentracioacuten recomendada de EDTA es de 15 mgmL de sangre Unamayor cantidad de anticoagulante puede producir retraccioacuten celular condisminucioacuten del hematocrito y un aumento de la concentracioacuten media de lahemoglobina Un exceso de sangre con relacioacuten al anticoagulante produceformacioacuten de microagregados que pueden alterar los resultados El empleode tubos al vaciacuteo con una gota (50mL) de EDTA tripotaacutesica comercialpara 5 mL de sangre es de intereacutes praacutectico dado que es cien veces maacutessoluble facilitando la mezcla de sangre con anticoagulante
4212 Desventajas
Usado en exceso afecta a los eritrocitos y a los leucocitos a los cuales les produce encogimiento y cambios en su forma por ello debe cuidarse de agregar la cantidad correcta de sangre al anticoagulante
422 Anticoagulante de Wintrobe
Es una mezcla de oxalato de amonio y potasio Actuacutea por precipitacioacuten del calcio es faacutecil de preparar Se emplea en forma de polvo en proporcioacuten de 2 de oxalato de amonio por 1 de oxalato de potasio La cantidad recomendada es de 2 mg x mL de sangre Este anticoagulante no afecta el volumen globular medio y puede usarse para determinaciones de hemoglobina hematocrito y recuento globular pero para los extendidos queda limitada a los primeros minutos tampoco es uacutetil para el recuento plaquetario porque produce formacioacuten de agregados plaquetarios
423 Heparina
El nombre de heparina proviene del griego hepar que significa hiacutegado ya que fue aislado por primera vez de las ceacutelulas de este tejido Es un mucopolisacaacuterido aacutecido Presenta el
inconveniente de que si no se agita raacutepidamente con la sangre despueacutes de extraiacuteda
pueden formarse microcoaacutegulos aunque no altera el volumeneritrocitario ni la morfologiacutea de los leucocitos No es recomendablepara el frotis sanguiacuteneo porque produce un fondo azul en la laacutemina
La heparina de sodio o litio puede usarse en forma soacutelida o liacutequida en
proporcioacutende 01 - 02 mg de heparina por 1 mL de sangre
43 ANTICOAGULANTES LIacuteQUIDOS
431 Citrato trisoacutedico
Es de eleccioacuten para las pruebas de hemostasia y la velocidad de sedimentacioacuten
Actuacutea a traveacutes de la precipitacioacuten del calcio La concentracioacuten depende de
la prueba por realizar
bull Para pruebas de hemostasia se emplea en proporcioacuten de 1 9 (05 mL
deanticoagulante para 45 mL de sangre total)
bull Para la determinacioacuten de la VSG (Velocidad de Sedimentacioacuten Globular) es14
(05 mL de anticoagulante para 2 mL de sangre)
432 Oxalato soacutedico
Recomendado tambieacuten para las pruebas de hemostasia Se emplea en
proporcioacutende un volumen de anticoagulante para 4 vol de sangre
SECCIOacuteN 5
REALIZACIOacuteN Y TINCIOacuteN DEL FROTIS SANGUIacuteNEO
La praacutectica del frotis sanguiacuteneo tambieacuten llamado extendido es de gran importanciaen hematologiacutea ya que el diagnoacutestico de muchas enfermedadeshematoloacutegicas puede realizarse con soacutelo observar las caracteriacutesticasmorfoloacutegicas de las ceacutelulas sanguiacuteneas de manera que eacuteste no debe serexcesivamente grueso ni excesivamente fino Todas las laacuteminas por usarsobre todo nuevas deben ser limpiadas con algodoacuten y alcohol al 70 paraeliminar la grasa que viene adherida
51 MEacuteTODO DE LOS DOS PORTAOBJETOS
511 Materiales
- Alcohol al 70
- Algodoacuten
- Lanceta descartable
- Portaobjetos de vidrios limpios y desgrasados (25 x 75 mm)
512 Fundamento
Consiste en la extensioacuten de una gota de sangre sobre un portaobjeto (25 x 75)empleando el canto biselado de otro portaobjeto de igual dimensioacuten (Fig 12)
513 Procedimiento
5131 Una vez extraiacuteda la sangre con cualquiera de las metodologiacuteas secoloca una pequentildea gota de sangre (5mL) (aprox 3 mm de diaacutemetro)sobre un portaobjeto a 2 cm aproximadamente de uno de los extremos
5132 Colocar el canto de otro portaobjeto esmerilado sobre la superficiedel primer portaobjeto (en la que se encuentra la gota de sangre)formando un aacutengulo de 45ordm
5134 Deslizar suavemente y a velocidad moderada el portaobjeto sobre elotro en sentido longitudinal hasta que la gota de sangre quede bienextendida sobre la
superficie del primer portaobjeto El grosor delfrotis sanguiacuteneo puede variar seguacuten sea el aacutengulo que formen entresiacute ambos portaobjetos Asiacute si es superior a 45ordm la extensioacuten obtenidaseraacute gruesa y corta si es inferior a 45ordm seraacute larga y fina El secado delfrotis es a temperatura ambiente y en posicioacuten horizontal
Fig 12
1048729 Zona excesivamente gruesa Se halla en la regioacuten inmediata al punto departida de la extensioacuten (cabeza) En ella se aprecia siempre un aumento delinfocitos
1048729 Zona excesivamente fina Corresponde al final de la extensioacuten y termina enun aacuterea donde las ceacutelulas adoptan una posicioacuten acartonada (barbas) Enesta regioacuten existe un exceso de granulocitos y monocitos
1048729 Zona ideal Corresponde a la regioacuten intermedia del frotis y en ella existe unreparto equilibrado de ceacutelulas
52 COLORACIONES USADAS
Una vez seco el frotis se procede a la tincioacuten hematoloacutegica con el colorante deRomanowsky constituido por la mezcla de eosina y azul de metileno Dentrode eacutestas tenemos
521 Colorante de Giemsa
522 Colorante de May-Grunwald
523 Colorante de Wright
524 Colorante de Leishman
Preparacioacuten de colorantes (Anexo A)
1048729 Para el estudio de las ceacutelulas sanguiacuteneas utilizar el colorante 523 y 524
1048729 Para el estudio de hemoparaacutesitos utilizar el colorante 521
1048729 Utilizar el colorante 522 para casos especiales en que se desee observar
con mayor claridad y especificidad los graacutenulos de los neutrofilos
53 TINCIOacuteN CON COLORANTE DE WRIGHT
531 Fundamento
El colorante de Wright va a permitir suministrar un medio para estudiar lasangre y determinar las variaciones y anormalidades de estructura forma ytamantildeo de los eritrocitos su contenido de hemoglobina y sus propiedades decoloracioacuten La informacioacuten obtenida de un frotis de sangre perifeacuterica dependeen gran parte de la calidad del extendido y la coloracioacuten
532 Materiales
5321 Colorante de Wright (Anexo A)
5322 Frasco gotero
5323 Solucioacuten amortiguada tamponada (Anexo A)
533 Procedimiento
5331 Una vez obtenido el frotis sanguiacuteneo se le dejaraacute secar entre 15 y 20minutos
5332 Luego se coloca la preparacioacuten en un soporte y se cubre con el colorantede Wright dejaacutendolo por espacio de 5 minutos
5333 Posteriormente se antildeade solucioacuten amortiguada tamponada en partesiguales hasta obtener un brillo metaacutelico dejando 6 minutos adicionales
5334 Finalmente se lava con agua corriente y se deja secar
5335 Se coloca en el microscopio y con pequentildeo aumento se revisa lacalidad de la coloracioacuten la cantidad aproximada de gloacutebulos blancosy se escoge el sitio para iniciar el recuento Se coloca una gota deaceite de inmersioacuten y se enfoca a un aumento de 100xLa forma de los gloacutebulos rojos se examinaraacute detenidamente observandoademaacutes del color (cantidad de hemoglobina) presencia deplaquetas su agrupacioacuten y distribucioacuten
5336 Posteriormente se hace el recuento diferencial de gloacutebulos blancosen 100
ceacutelulas para lo cual se deberaacute conocer las diferencias entreneutroacutefilos eosinoacutefilos
linfocitos y monocitosUna extensioacuten de sangre bien tentildeida debe caracterizarse
por unabuena diferenciacioacuten de las estructuras subcelulares en los leucocitosuna
coloracioacuten rosada de los hematiacutees y la ausencia de precipitados
Los defectos maacutes frecuentes observados en la tincioacuten del frotis sanguiacuteneoson
Coloracioacuten excesivamente azul debido a
1048729 Frotis excesivamente grueso
1048729 Lavado insuficiente
1048729 Tincioacuten muy prolongada
1048729 Empleo de colorante excesivamente alcalino
Coloracioacuten con una tonalidad rosada
1048729 El colorante el tampoacuten o el agua de lavado tienen un pH demasiadoaacutecido
Presencia de precipitados
1048729 Obedecen a una accioacuten excesiva del colorante Esto se puede evitarcon la
filtracioacuten
SECCIOacuteN 6
HEMOGRAMA-HEMOGLOBINA-HEMATOCRITO
El hemograma de Shilling constituye uno de los exaacutemenes de laboratorio
maacutesusados en el campo de la hematologiacutea Comprende las siguientes pruebas
61 RECUENTO LEUCOCITARIO
Principio
La sangre anticoagulada se deposita en un liacutequido que permite evidenciar
losleucocitos mantenieacutendolos visibles mientras que los eritrocitos
sonhemolizados El recuento del nuacutemero de leucocitos o gloacutebulos blancos se
expresapor mm3 (miliacutemetro cuacutebico)
611 Equipos
- Microscopio
- Hemocitoacutemetro (Caacutemara de Neubauer)
Consta de los siguientes elementos
diams Una laacutemina portaobjeto gruesa en el centro se hallan dos
superficiescuadriculadas iguales separadas del resto de la laacutemina por surcos y
dosbarras transversales algo maacutes elevadas
diams Una laminilla cubreobjetos oacutepticamente plana que al colocarse sobrelas barras
elevadas de la laacutemina forma una caacutemara entre el cubreobjetosy la superficie
cuadriculadaLa altura entre el cubreobjetos y la laacutemina portaobjetos es de 01
mmCada cuadriacutecula mide 3 mm de lado y se divide en 9 cuadrados grandesCada
uno de los cuales mide 1 mm2 de superficie que se subdivide a suvez en 16
cuadrados medianos El cuadrado grande central se divide en25 cuadrados
pequentildeos y cada uno de ellos en 16 cuadraditos Cadacuadrado pequentildeo mide
02 mm de lado (004 mm2 de superficie) y cadacuadradito mide 005 mm de lado
(00025 mm2 de superficie)
612 Materiales y reactivos requeridos
6121 Pipeta de gloacutebulos blancos (De Thoma) o pipeta automaacutetica (de 0 a 100 mL)Presenta cerca del extremo superior una marca de 11 inmediatamentecontinuacutea una dilatacioacuten (bulbo) que contiene una perla que funciona comomezcladora luego sigue el extremo maacutes largo de la pipeta (tallo) que estaacutedividida en 10 partes con 2 marcas 1 (parte final del bulbo) y 05 (a la mitaddel tallo) Se le acopla a su extremo superior 1 tubo de goma y una bombillapara aspirar
6122 Diluyente de gloacutebulos blancos Solucioacuten de Turk al 1
6123 Contador manual (Soacutelo si fuera necesario)
6124 Papel filtro
613 Procedimiento
6131 Una vez obtenida la sangre con anticoagulante o sangre capilar deldedo se procede a aspirar la sangre con la pipeta de gloacutebulos blancoshasta la marca de 05 y a limpiar la punta con papel absorbente
6132 Introducir la pipeta en el tubo que contenga solucioacuten de Turk y absorberhasta la marca de 11 (no debe haber burbujas)
6133 Tapar ambos extremos y proceder a mezclar manualmente o en unrotador automaacutetico por 2 oacute 3 minutos
6134 Monte la laminilla de vidrio en la caacutemara para recuento que debe estarlimpia y seca
6135 Agitar la pipeta y descartar las cuatro primeras gotas para luego colocaruna gota pequentildea de esta solucioacuten en la caacutemara
6136 Deje reposar por espacio de 3 minutos para que las ceacutelulas se sedimenten
6137 Enfocar con objetivo de 10x y contar en 4 cuadrados grandes angularesCuando se usa la pipeta automaacutetica se toma 20 mL (002 mL) desangre total con anticoagulante o sangre capilar con anticoagulante yse diluye en un tubo que contenga 380 mL de solucioacuten de Turk (aquiacutetenemos una dilucioacuten 120)
LECTURA
Fig 13
La lectura se realiza en los campos 1 3 7 y 9 como estaacute indicado en la figuraAdemaacutes de los leucocitos contados dentro de cada uno de los cuadrantes sedeben contar todos los leucocitos que se encuentren adheridos en la liacuteneahorizontal superior y vertical exterior o de lo contrario todos los leucocitosadheridos a la liacutenea horizontal inferior y vertical interior
614 Resultados
Nordm de leucocitos x mm3 = leucocitos contados en 4 camposdividealtura x dilucioacuten x aacuterea
Reemplazando = leucocitos contados en 4 camposdivide110 x 120 x 4=
Leucocitos contados en 4 camposdivide4200=
X1 divide4200= Nordm leucocitos contados x 50
615 Valores de referencia
5000 - 10 000 leucocitos mm3
616 Correccioacuten de valores para restar eritrocitos nucleados
Los normoblastos no se destruyen (lisis) en el liacutequido de dilucioacuten por lo tantopueden observarse al realizar el recuento leucocitario y confundirse con losleucocitos de tal manera que se debe emplear la siguiente foacutermula
Caacutelculo
La concentracioacuten del nuacutemero de normoblastos (por litro) esNuacutemero de normoblatos contados x concentracioacuten o nuacutemero de leucocitos100 + Nordm de normoblastos contados
Ejemplo
Si se cuentan 50 normoblastos y la concentracioacuten del nuacutemero de leucocitos es16 x 109l la concentracioacuten del nuacutemero de normoblastos seraacute
50 x16 = 53 x 109l
100 + 50
y la concentracioacuten de leucocitos corregida seraacute 16 - 53 = 107 x 109lEn unidades tradicionales las concentraciones de normoblastos y leucocitosse expresan por miliacutemetro cuacutebico En tales unidades el caacutelculo correspondienteal ejemplo que se ha dado seriacutea
50 x 16 000 = 5300 mm3
100 + 50
Recuento corregido de gloacutebulos blancos o leucocitos = 16 000 - 5300 = 10 700 mm3
Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2
62 RECUENTO DE GLOacuteBULOS ROJOS
Principio
La sangre se diluye en un liacutequido que nos permite observar claramente loshematiacutees luego esta dilucioacuten se coloca en una caacutemara de Neubauer con laayuda de una pipeta automaacutetica o pipeta Pasteur y se cuentan en el microscopioa un objetivo de 40x para calcular el nuacutemero de gloacutebulos rojos por mm3
621 Equipos
- Microscopio
- Hemocitoacutemetro (caacutemara de Neubauer)
622 Materiales y reactivos requeridos
6221 Pipeta de gloacutebulos rojos (De Thoma) o pipeta automaacutetica (de 0-100 mL)
Presenta cerca del extremo superior una marca de 101 inmediatamentecontinuacutea una dilatacioacuten (bulbo) que contiene una perla roja mezcladoraluego sigue el tallo (extremo maacutes largo) el cual estaacute dividido en 10 partescon 2 marcas 1 acabando el bulbo y 05 a la mitad del tallo Se requiereigual que el recuento de leucocitos una boquilla para aspirar
6222 Diluyente de gloacutebulos rojos Cloruro de Sodio al 09 (ver anexo)
Diluyente de Hayem (ver anexo)
6223 Contador manual (soacutelo si fuera necesario)
6224 Papel filtro
623 Procedimiento
6231 Mezclar la sangre obtenida con el anticoagulante o tomar sangre capilar
6232 Llenar la pipeta de gloacutebulos rojos con sangre hasta la marca de 05para realizar una dilucioacuten de 1200 y si se carga hasta 1 la dilucioacutenseraacute 1100 Limpiar la punta con gasa o papel absorbente
6233 Introducir la pipeta en el tubo o frasquito conteniendo diluyente (Hayem)y llenar de liacutequido de dilucioacuten hasta la marca de 101
6234 Se coloca en un rotador automaacutetico o se hace rotar manualmente de2 a 3 minutos
6235 Agitar bien la pipeta y descartar 3 a 4 gotas del tallo luego colocar unagota pequentildea cerca de un extremo de la caacutemara para que por capilaridadse llene exactamente
6236 Hacer el recuento con objetivo de 40xSe puede realizar con la pipeta automaacutetica se toma 20 mL (002mL)de sangre total con anticoagulante o sangre capilar y se deposita enun tubo de 12 x 75 que contenga 4 mL de solucioacuten de Hayem (aquiacute setiene una dilucioacuten de 1200) Se deja reposar aproximadamente 5minutos y se procede a cargar la caacutemara con la misma pipeta usandoun nuevo tip El inconveniente aquiacute es el gasto de reactivo (4 mL) perolas medidas son mas exactas
6237 Dejar en reposo por 3 minutos
6238 Enfocar la cuadriacutecula a 10x luego con el objetivo de 40x contar sobreel cuadrado grande central de la caacutemara soacutelo en 5 cuadrados pequentildeosuno central y cuatro angulares (80 cuadraditos en total)
6239 En el recuento se incluyen las ceacutelulas que cubren o tocan por dentroo por fuera las liacuteneas limitantes superior e izquierda en el cuadradopequentildeo de recuento y no se consideran los correspondientes a losliacutemites inferior y derechoSe hace el recuento en los puntos ABCD y Ey se sigue los mismos paraacutemetros del recuento de leucocitos
LECTURA
Fig 14
624 Resultados
Nordm de hematiacutees x mm3 = hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeosaltura x dilucioacuten X aacuterea
Reemplazando = hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeos110 x 1200 x 15
= hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeos divide 110 000
= hematiacutees contados x 10 000
625 Valores de referencia
(Unidades tradicionales millones de ceacutelulasmm3)
Hombres 4 500 000 - 5 500 000
Mujeres 4 000 000 - 5 000 000
Nintildeos (4 antildeos) 4 200 000 - 5 200 000
Lactantes (1 - 6 meses) 3 800 000 - 5 200 000
Recieacuten nacidos 5 000 000 - 6 000 000
Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2
63 DETERMINACIOacuteN DEL VOLUMEN GLOBULAR (Hematocrito)
Mide la fraccioacuten que comprende a los gloacutebulos rojos (masa globular) respectoal
volumen total de la muestra de sangre venosa o capilar Puede expresarseen
porcentaje o como valor decimal
Hto= altura de la columna de gloacutebulos rojosdivide altura de la columna de sangre
total(gloacutebulos rojos maacutes plasma)
631 Meacutetodo de Wintrobe
Materiales requeridos
- Tubo de Wintrobe graduado de 0 - 100 mm
- Pipetas Pasteur o pipetas de transferencia
- Tapoacuten de goma
Procedimiento
diams Llenar la sangre extraiacuteda con anticoagulante con una pipeta pasteur
comenzandodesde el fondo hasta la marca superior de 100 mm teniendocuidado
de no provocar espuma
diams Tapar el tubo con un tapoacuten de goma para evitar la evaporacioacuten
diams Centrifugar a 3000 rpm por 30 minutos
Resultados (lectura)
Del tubo graduado se mide directamente el nivel de la columna de gloacutebulosrojos
Valores de referencia
Hombres 40 - 54Mujeres 38 - 48
Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2
632 Meacutetodo de microhematocrito
Materiales requeridos
- Capilares rojos y azules (75 mm x 15 mm)
- Plastilina
Procedimiento
diams Tomar la muestra en capilares rojos heparinizados directamente del pulpejodel
dedo o utilizar capilares azules sin heparina para sangre venosacon
anticoagulante de Wintrobe o EDTA Debe llenarse aproximadamente70 - 80
del capilar
diams Ocluir (tapar) un extremo del capilar con plastilina
diams Colocar el capilar sobre la plataforma del cabezal de una centriacutefuga demicrohematocrito con el extremo ocluido adherido al reborde externo de laplataforma
diams Centrifugar por 5 minutos entre 10 000 - 12 000 rpm
Resultados (lectura)
La lectura se realiza con una escala estandarizada que expenden en el comercio
Uso de la escala
diams Sostenga el tubo frente a la escala de manera que el fondo de la columnade eritrocitos (no el extremo inferior del tubo) quede exactamente al mismonivel de la liacutenea horizontal correspondiente al cero
diams Desplace el tubo a traveacutes de la escala hasta que la liacutenea marcada con elnuacutemero 10 quede al nivel del tope de la columna de plasma Vigile que elfondo de la
columna de eritrocitos continuacutee sobre la liacutenea cero El tubodebe encontrarse completamente en posicioacuten vertical
diams La liacutenea que pase al nivel del tope de la columna de eritrocitos indicaraacute lafraccioacuten de volumen de eacutestos
Valores de referencia
Hombres 40 - 50
Mujeres 38 - 44
Nintildeos (5 antildeos) 38 - 44
Lactantes (3 meses) 37 - 42
Recieacuten nacidos 50 - 58
La disposicioacuten celular esParte superior una columna de plasmaEn la interfase estaacuten los leucocitos yplaquetasParte inferior estaacute la columna deeritrocitos (Fig 15)
64 DOSAJE DE HEMOGLOBINA
Principio
La sangre se diluye en liacutequido de Drabkin el cual hemoliza los hematiacutees yconvierte la hemoglobina en cianometahemoglobina (cianuro de hemiglobina)La solucioacuten que se produce se lee por medio de un espectrofotoacutemetro ofotocoloriacutemetro Su grado de absorbancia es proporcional a la cantidad dehemoglobina que contenga la sangre
641 Materiales y reactivos
6411 Un coloriacutemetro fotoeleacutectrico o un espectrofotoacutemetro
6412 Pipetas
diams Una pipeta para sangre (pipeta de Sahli) graduada hasta 002 mL contubo de goma y boquilla
diams Una pipeta de vidrio graduada de 5 mL
6413 Tubos de ensayo
6414 Reactivo de Drabkin para dilucioacuten
Este reactivo se puede adquirir en tabletas o polvos para disolver en 1litro de agua destilada Si se dispone de una balanza analiacutetica la preparacioacutense puede hacer en el laboratorio Esta solucioacuten se puedeconservar durante un mes en un frasco de vidrio oscuro Deseacutechese sise enturbia
63 Determinacioacuten del volumen globular (Hto) 35
64 Dosaje de hemoglobina 38
65 Frotis de sangre perifeacuterica 40
66 Foacutermula leucocitaria 41
SECCIOacuteN 7 VELOCIDAD DE SEDIMENTACIOacuteN43
71 Meacutetodo de Westergren 43
72 Meacutetodo de Wintrobe 44
SECCIOacuteN 8 PERFIL DE HEMOSTASIA45
81 Principios generales 45
82 Mecanismo de coagulacioacuten 45
83 Exploracioacuten de la coagulacioacuten 46
84 Obtencioacuten del plasma 46
85 Tiempo de sangriacutea47
851 Meacutetodo de Ivy48
852 Meacutetodo de Duke49
86 Tiempo de coagulacioacuten de sangre total (TCST) 51
87 Tiempo de tromboplastina parcial activada (PTTK) 54
88 Tiempo de trombina 55
89 Tiempo de protrombina (Prueba de Quick) 56
SECCIOacuteN 9 RECUENTO DE RETICULOCITOS Y PLAQUETAS58
91 Recuento de reticulocitos 58
92 Recuento de plaquetas 60
SECCIOacuteN 10 LEUCOGRAMA63
101 Granulocitos63
102 Agranulocitos 65
103 Criterios para el desarrollo de un leucograma 67
SECCIOacuteN 11 ALTERACIONES ERITROCITARIAS79
Alteraciones en el tamantildeo 70
Alteraciones en la forma 71
Alteraciones de color72
Inclusiones anormales73
BIBLIOGRAFIacuteA79
ANEXO A Preparacioacuten de colorantes y soluciones maacutes
Usados en hematologiacutea81
ANEXO B Preparacioacuten de anticoagulantes 85
PRESENTACIOacuteN
Con el propoacutesito de uniformizar los procedimientos hematoloacutegicos que serealizan en los diversos laboratorios cliacutenicos el Instituto Nacional de Saludpone a disposicioacuten de la comunidad teacutecnico-cientiacutefica nacional el Manual deProcedimientos de Laboratorio en Teacutecnicas Baacutesicas de Hematologiacutea en elcual se incluyen todos los meacutetodos empleados en el campo hematoloacutegicobaacutesico De este modo se contribuye a mejorar la calidad de diagnoacutestico en loslaboratorios de los servicios de saludEl laboratorio de hematologiacutea cuenta con dos aacutereas baacutesicas Aacuterea deHematimetriacutea (hemograma VSE recuento de plaquetas etc) y Aacuterea deHemostasia Partiendo de esta estructura en este manual nos referiremos alas teacutecnicas baacutesicas empleadas en estas aacutereas partiendo de la toma de muestrahasta la realizacioacuten de las pruebas respectivasEs necesario enfatizar que para obtener resultados maacutes confiables es importantepero no imprescindible automatizar el laboratorio debido a que elloevitaraacute el posible error humano sobre todo en lo referente a recuentos celularesvalores de hemoglobina y constantes corpusculares ya que en estasvariables se trabaja con cantidades exactas de sangre hecho que es muydifiacutecil de lograr cuando se usan los meacutetodos manuales lo mismo sucede altratarse de las pruebas de hemostasiaEsperamos que este manual constituya una herramienta de consulta en laRed Nacional de Laboratorios de Salud ademaacutes de una guiacutea para el personalde laboratorio en general
INTRODUCCIOacuteN
El presente manual ha sido elaborado en forma simple didaacutectica y eminentementepraacutectica para que su contenido sea faacutecil de entender por el personalque labora en el laboratorio de hematologiacuteaSe divide en tres partes
1 En la primera parte se presentan los aspectos maacutes importantes de labioseguridad en el laboratorio
2 En la segunda parte se exponen las principales teacutecnicas baacutesicas del laboratoriode hematologiacutea
3 En la tercera parte se detallan las alteraciones maacutes frecuentes de la serieroja y de la serie blanca de un hemograma
El objetivo principal es protocolizar y estandarizar los procedimientoshematoloacutegicos que empiezan con la toma de muestra (siguiendo las pautasde control de calidad preanaliacutetica) hasta el procesamiento de eacutesta (fase analiacutetica)en la determinacioacuten correspondiente y por uacuteltimo en la emisioacuten de losresultados (fase postanaliacutetica) Debemos recalcar que cuando se realizanpruebas de hemostasia debe tenerse en consideracioacuten los cuidados comunesa toda prueba de laboratorio es decir las muestras deben obtenerse encondiciones apropiadas y rotularse debidamente Esperamos que el presentemanual sirva de guiacutea efectiva y que pueda ser enriquecido con nuevosaportes con la finalidad de alcanzar un trabajo de calidad
SECCIOacuteN 1
GENERALIDADES
11 OBJETIVO
Establecer y estandarizar los procedimientos baacutesicos de un examen dehemograma hemoglobina hematocrito recuento de plaquetas velocidad desedimentacioacuten y recuento de reticulocitos que sirvan de ayuda diagnoacutestica alcliacutenico
12 CAMPO DE APLICACIOacuteN
La aplicacioacuten de las teacutecnicas hematoloacutegicas nos sirve para estandarizar losprocedimientos a nivel nacional y para que sea de utilidad al personal teacutecnicoy profesional de los laboratorios cliacutenicos
13 RESPONSABILIDADES
131 El Centro Nacional de Laboratorios en Salud Puacuteblica a traveacutes de su
Direccioacuten Ejecutiva de Laboratorios de Referencia es responsable deautorizar la elaboracioacuten la revisioacuten y la actualizacioacuten del presente manualde acuerdo con los procedimientos aprobados por el Instituto Nacionalde Salud
132 Los directores de los establecimientos de salud son responsables deautorizar proporcionar los recursos necesarios y designar al personalresponsable para la aplicacioacuten de las disposiciones contenidas en elpresente manual
133 El personal de los establecimientos de salud es responsable de planificarlas acciones organizar controlar y capacitar al personal para cumplirlas disposiciones contenidas en el presente manual
134 Los jefes o responsables de los laboratorios deben asegurar el controlinterno de la calidad la idoneidad del personal equipos materialesreactivos e instalaciones
135 El personal meacutedico profesional y teacutecnico es responsable de seguir lasespecificaciones contenidas en el presente manual y aplicar los procedimientosespeciacuteficos indicados
14 DOCUMENTOS DE REFERENCIA
141 Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OrganizacioacutenPanamericana de la Salud Publicacioacuten cientiacutefica Nordm 439 Nordm 2 1983
142 Manual de normas de bioseguridad Instituto Nacional de Salud Serie deNormas Teacutecnicas Nordm 18 2ordf ed 1997
SECCIOacuteN 2
MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD
21 Para la obtencioacuten de muestras el personal involucrado en los diferentesprocesos para los exaacutemenes hematoloacutegicos debe aplicar las medidas debioseguridad establecidas en el Manual de Bioseguridad Serie de NormasTeacutecnicas Nordm 18
22 Se debe controlar sobre todo
221 Al personal que trabaja en el laboratorio de hematologiacutea
222 El proceso de coloracioacuten en el que se debe aplicar las medidas debioseguridad correspondientes al uso y manipulacioacuten de sustanciastoacutexicas o canceriacutegenas
223 Ver lo referente a medidas de proteccioacuten en caso de accidentes porinoculacioacuten
SECCIOacuteN 3
OBTENCIOacuteN DE MUESTRAS SANGUIacuteNEAS
31 OBJETIVO
Establecer y uniformizar criterios en el procedimiento de obtencioacuten de muestrassanguiacuteneas con un adecuado control de calidad ya que de ello dependeque el resultado del anaacutelisis de la muestra sea el correcto Se efectuaraacute enayunas o no dependiendo de la prueba a usar
32 OBTENCIOacuteN DE SANGRE VENOSA CON JERINGA
321 Materiales y equipos requeridos
3211 Algodoacuten
3212 Alcohol al 70
3213 Ligadura o torniquete de 25 a 30 cm de largo
3214 Jeringas de 5 mL
3215 Viales con anticoagulante EDTA
322 Obtencioacuten de la muestra
3221 Verificar que los elementos por utilizar esteacuten listos y que el pacientese sienta coacutemodo
3222 Aplicar el torniquete aproximadamente cuatro dedos por encima de laflexioacuten del codo o a 10 cm del codo sujetar con un medio nudo (Fig 1)
3223 Limpiar la zona con alcohol al 70 o alcohol yodado en un aacuterea de 2pulgadas (Fig 2)
3224 El paciente deberaacute abrir y cerrar la mano durante unos segundos ydespueacutes la mantendraacute cerrada esto ayudaraacute a visualizar las venassuperficiales (Fig 3)
3225 Se retira el estuche protector de la aguja y se coge la jeringa de talmanera que el bisel se encuentre hacia arriba (Fig 4)
3226 Se coloca la aguja en direccioacuten paralela a la vena se perfora la pielhaciendo avanzar la aguja 05-1 cm en el tejido subcutaacuteneo luego seperfora la vena (Fig 5)
3227 Se aspira la jeringa hasta el volumen requerido
3228 Retirar el torniquete e indicar al paciente que deje de hacer puntildeo Secoloca el algodoacuten seco encima de la puncioacuten y se retira la aguja (Fig 6)
3229 Retirar la aguja de la jeringa Verter la muestra lentamente por lasparedes del vial con anticoagulante No olvidar colocar una gota en lalaacutemina portaobjeto para realizar el frotis
32210 Agitar el vial en ciacuterculos sobre la mesa para homogeneizar la muestracon el anticoagulante
PUNTOS PARA LA EXTRACCIOacuteN DE SANGRE
(Toma de muestra)
Se obtiene de las venas de la fosa cubital
PROCEDIMIENTO
Fig 1 Fig 2 Fig 3
Fig 4 Fig 5
Fig 6 Fig 7
33 OBTENCIOacuteN DE SANGRE VENOSA EN TUBOS AL VACIacuteO
331 Materiales requeridos
3311 Algodoacuten
3312 Alcohol al 70
3313 Ligadura o torniquete de 25 a 30 cm de largo
3314 Tubos al vaciacuteo con anticoagulante EDTA (K3) EDTA (Na2) u otroanticoagulante
3315 Agujas con dispositivo para extraccioacuten de sangre al vaciacuteo
- Nordm 21 para adultos
- Nordm 22 para nintildeos y neonatos
De preferencia ambas de bisel corto para evitar la coagulacioacuten
332 Obtencioacuten de la muestra
3321 Repetir los pasos de 3221 a 3224
3322 Se retira el estuche protector de la aguja y eacuteste se enrosca al dispositivopara extraccioacuten de sangre al vaciacuteo
3323 Colocar la ligadura cuatro dedos por encima de la flexioacuten del codo o10 cm por encima de eacuteste y pedir al paciente que abra y cierre la manovarias veces para favorecer la dilatacioacuten de las venas
3324 Una vez escogida la vena desinfectarla con una pieza de algodoacutenembebido en etanol al 70
3325 Se coloca la aguja en direccioacuten paralela a la vena se perfora la pielhaciendo avanzar la aguja entre 05 cm y 1 cm en el tejido subcutaacuteneose inserta el tubo al vaciacuteo por la parte posterior y no preocuparse porla cantidad de sangre extraiacuteda ya que el mismo sonido del vaciacuteo avisaraacuteque la extraccioacuten terminoacute (Fig 8)
3326 Retirar la ligadura tirando del extremo doblado
3327 Colocar un pedazo de algodoacuten seco sobre la parte donde se encuentraoculta la aguja Sacar la aguja con un movimiento raacutepido y depositarlaen el recipiente de metal con desinfectante (Fig 9)
3328 Pedir al paciente que presione firmemente el algodoacuten durante 3 minutoscon el brazo extendido No se recomienda que se flexione el brazoa causa del riesgo que se forme un hematoma
3329 Mezclar por inmersioacuten suave la sangre con el anticoagulante contenidoen el tubo No agitar el contenido
Fig 8 Fig 9
333 Ventajas de una extraccioacuten de sangre venosa
3331 Pueden hacerse repetidos exaacutemenes con la misma muestra
3332 Parte de la muestra (plasma o suero) puede congelarse para referenciafutura
334 Desventajas de una extraccioacuten de sangre venosa
3341 La puncioacuten venosa por su largo procedimiento requiere mayor preparacioacuten que el meacutetodo capilar
3342 El meacutetodo es teacutecnicamente difiacutecil en nintildeos individuos obesos y pacientes en shock
3343 La hemoacutelisis debe ser evitada pues se puede obtener una disminucioacuten en el recuento de eritrocitos
3344 Debe evitarse prolongada estasis venosa producida por el torniquete pues produce hemoacutelisis y otros cambios que ponen la sangre en un estado inadecuado para el anaacutelisis de gases recuentos celulares determinacioacuten de pH sanguiacuteneo y algunas pruebas de coagulacioacuten
3345 La sangre anticoagulada si no es de obtencioacuten reciente no debe ser utilizada en extensiones de sangre pues algunos anticoagulantes producen cambios en las plaquetas que pueden causar aglutinaciones agregacioacuten plaquetaria y dificultan la identificacioacuten de leucocitos
3346 Puesto que algunos de los componentes de la sangre no son estables los recuentos de leucocitos y plaquetas e iacutendice de sedimentacioacuten deben realizarse antes de que pasen dos horas desde que se obtuvo la muestra
34 OBTENCIOacuteN DE SANGRE DE LA VENA YUGULAR EXTERNA
341 Materiales requeridos
3411 Algodoacuten
3412 Alcohol al 70
3413 Jeringas de 5 mL
3414 Viales con anticoagulante EDTA
342 Obtencioacuten de la muestra
3421 El paciente es cubierto por una saacutebana de manera que los brazospermanezcan inmovilizados a lo largo del cuerpo
3422 Al paciente se le coloca de cuacutebito dorsal sobre la mesa de examen ouna
camilla de manera que la cabeza cuelgue sobre el final de lamesa y el cuerpo sea
sujetado por un asistente
3423 Cuando el paciente grita la vena yugular externa se marca claramente
3424 Limpiar la zona en un aacuterea de 2 pulgadas con alcohol al 70 o
alcoholyodado
3425 Se repiten los pasos de 3225 a 3227 de la extraccioacuten de sangrevenosa
con jeringa
3426 Retirar la aguja de la vena y presionar suavemente con un algodoacutenseco
aproximadamente de 3 a 5 minutos Pedir al paciente que permanezcaechado diez
minutos
3427 Se repiten los pasos de 3229
3428 Se repiten los pasos de 32210
343 Ventajas
Constituye un buen meacutetodo para la obtencioacuten de sangre en pacientes conshock
con venas colapsadas
344 Desventajas
Por lo delicado en su procedimiento no se recomienda como rutina soacutelo encasos
en que no se pueda obtener la muestra por meacutetodos convencionales
35 OBTENCIOacuteN DE SANGRE CAPILAR
Cuando la cantidad de sangre que se precisa es muy pequentildea o cuando
pordiferentes motivos no pueda practicarse una puncioacuten venosa debe recurrirse
a la puncioacuten capilar
351 Materiales requeridos
3512 Algodoacuten
3513 Alcohol al 70
3514 Lancetas desechables (Fig 10)
3515 Papel filtro Nordm 2
352 Procedimiento (Fig 11)
3521 La sangre capilar se obtiene de la cara lateral del dedo medio o anularen los adultos y del dedo gordo del pie o taloacuten en los nintildeos
3522 Desinfectar la zona con alcohol al 70 secar con algodoacuten esteacuteril
3523 Punzar la piel con una lanceta esteacuteril desechable (2 mm de profundidad)
3524 Usar gasa esteacuteril para desechar la primera gota y recoger las siguientesen tubos capilares Evitar comprimir la extremidad para obtenersangre porque se altera la composicioacuten sanguiacutenea
353 Ventajas
3531 Puede obtenerse con facilidad
3532 Es preferible cuando han de realizarse extensiones de sangre perifeacuterica
354 Desventajas
3541 Soacutelo se pueden obtener pequentildeas cantidades de sangre y los exaacutemenesde repeticioacuten requieren nuevas muestras
3542 La sangre en microtubos (capilares) frecuentemente se hemolizainterfiendo con la mayoriacutea de pruebas de laboratorio
3543 Los resultados obtenidos en pruebas con sangre capilar no puedenser comparados con los resultados de las pruebas con sangre venosa
3544 El dedo no soacutelo es delicado sino difiacutecil de desinfectar adecuadamenteen el tiempo disponible
3545 En pacientes con resistencia disminuida a la infeccioacuten (aquellos conleucemia agranulocitosis diabetes uremia y enfermedades con deficienciasinmunoloacutegicas) una muestra tomada del dedo es mucho maacutesprobable que conduzca a una infeccioacuten que otra tomada del brazo
3546 El recuento de eritrocitos y leucocitos asiacute como el recuento deplaquetas y reticulocitos no debe realizarse en sangre capilar debidoa la difiacutecil estandarizacioacuten del flujo sanguiacuteneo capilar
EXTRACCIOacuteN DE SANGRE CAPILAR
Fig 10
Fig 11
SECCIOacuteN 4
ANTICOAGULANTES
Una vez extraiacuteda la sangre eacutesta puede conservarse coagulada o
mantenidaincoagulable mediante la adicioacuten de un anticoagulante
41 CARACTERIacuteSTICAS BAacuteSICAS DE LOS ANTICOAGULANTES MAacuteS
USADOSEN HEMATOLOGIacuteA
bull No alterar el tamantildeo de los hematiacutees
bull No producir hemoacutelisis
bull Evitar al maacuteximo la agregacioacuten plaquetaria
bull No alterar la morfologiacutea de los leucocitos
La sangre tratada con anticoagulante debe procesarse lo antes posible
inclusomantenida bajo refrigeracioacuten (4 ordmC) si no pasan de las 2 horas El
tiempomaacuteximo entre la extraccioacuten de la sangre y su procesamiento depende
delcoagulante de eleccioacuten y no debe ser maacutes de 4 horas a excepcioacuten
delanticoagulante EDTA (etilendiaminotetraceacutetico) que puede ser hasta 24
horas(en refrigeracioacuten a 4 ordmC)
Los anticoagulantes pueden emplearse en forma soacutelida o liacutequida Los
primerosestaacuten indicados para la determinacioacuten de los paraacutemetros
hematoloacutegicosya que no producen como los anticoagulantes liacutequidos dilucioacuten de
la sangre
42 ANTICOAGULANTES SOacuteLIDOS
421 EDTA
Es la sal disoacutedica o tripotaacutesica del aacutecido etilendiaminotetraceacutetico La saldisoacutedica
(Na2EDTA) es menos soluble que la sal tripotaacutesica (K3EDTA) Estoscompuestos
realizan su accioacuten a traveacutes de un efecto quelante sobre el calcioal fijarlo impiden
su activacioacuten y por ende la coagulacioacuten sanguiacutenea
4211 Ventajas
bull Respeta la morfologiacutea eritrocitaria (especialmente la sal tripotaacutesica) yleucocitaria de manera que permite una demora de dos horas en la realizacioacutendel frotis sanguiacuteneo despueacutes de la extraccioacuten sanguiacutenea
bull Asegura la conservacioacuten de los elementos formes sanguiacuteneos durante 24horas si la sangre se mantiene a 4 ordmC
bull Al inhibir la aglutinacioacuten de las plaquetas facilita su recuento o su expresioacutensemicuantitativa a partir del frotis
bull La concentracioacuten recomendada de EDTA es de 15 mgmL de sangre Unamayor cantidad de anticoagulante puede producir retraccioacuten celular condisminucioacuten del hematocrito y un aumento de la concentracioacuten media de lahemoglobina Un exceso de sangre con relacioacuten al anticoagulante produceformacioacuten de microagregados que pueden alterar los resultados El empleode tubos al vaciacuteo con una gota (50mL) de EDTA tripotaacutesica comercialpara 5 mL de sangre es de intereacutes praacutectico dado que es cien veces maacutessoluble facilitando la mezcla de sangre con anticoagulante
4212 Desventajas
Usado en exceso afecta a los eritrocitos y a los leucocitos a los cuales les produce encogimiento y cambios en su forma por ello debe cuidarse de agregar la cantidad correcta de sangre al anticoagulante
422 Anticoagulante de Wintrobe
Es una mezcla de oxalato de amonio y potasio Actuacutea por precipitacioacuten del calcio es faacutecil de preparar Se emplea en forma de polvo en proporcioacuten de 2 de oxalato de amonio por 1 de oxalato de potasio La cantidad recomendada es de 2 mg x mL de sangre Este anticoagulante no afecta el volumen globular medio y puede usarse para determinaciones de hemoglobina hematocrito y recuento globular pero para los extendidos queda limitada a los primeros minutos tampoco es uacutetil para el recuento plaquetario porque produce formacioacuten de agregados plaquetarios
423 Heparina
El nombre de heparina proviene del griego hepar que significa hiacutegado ya que fue aislado por primera vez de las ceacutelulas de este tejido Es un mucopolisacaacuterido aacutecido Presenta el
inconveniente de que si no se agita raacutepidamente con la sangre despueacutes de extraiacuteda
pueden formarse microcoaacutegulos aunque no altera el volumeneritrocitario ni la morfologiacutea de los leucocitos No es recomendablepara el frotis sanguiacuteneo porque produce un fondo azul en la laacutemina
La heparina de sodio o litio puede usarse en forma soacutelida o liacutequida en
proporcioacutende 01 - 02 mg de heparina por 1 mL de sangre
43 ANTICOAGULANTES LIacuteQUIDOS
431 Citrato trisoacutedico
Es de eleccioacuten para las pruebas de hemostasia y la velocidad de sedimentacioacuten
Actuacutea a traveacutes de la precipitacioacuten del calcio La concentracioacuten depende de
la prueba por realizar
bull Para pruebas de hemostasia se emplea en proporcioacuten de 1 9 (05 mL
deanticoagulante para 45 mL de sangre total)
bull Para la determinacioacuten de la VSG (Velocidad de Sedimentacioacuten Globular) es14
(05 mL de anticoagulante para 2 mL de sangre)
432 Oxalato soacutedico
Recomendado tambieacuten para las pruebas de hemostasia Se emplea en
proporcioacutende un volumen de anticoagulante para 4 vol de sangre
SECCIOacuteN 5
REALIZACIOacuteN Y TINCIOacuteN DEL FROTIS SANGUIacuteNEO
La praacutectica del frotis sanguiacuteneo tambieacuten llamado extendido es de gran importanciaen hematologiacutea ya que el diagnoacutestico de muchas enfermedadeshematoloacutegicas puede realizarse con soacutelo observar las caracteriacutesticasmorfoloacutegicas de las ceacutelulas sanguiacuteneas de manera que eacuteste no debe serexcesivamente grueso ni excesivamente fino Todas las laacuteminas por usarsobre todo nuevas deben ser limpiadas con algodoacuten y alcohol al 70 paraeliminar la grasa que viene adherida
51 MEacuteTODO DE LOS DOS PORTAOBJETOS
511 Materiales
- Alcohol al 70
- Algodoacuten
- Lanceta descartable
- Portaobjetos de vidrios limpios y desgrasados (25 x 75 mm)
512 Fundamento
Consiste en la extensioacuten de una gota de sangre sobre un portaobjeto (25 x 75)empleando el canto biselado de otro portaobjeto de igual dimensioacuten (Fig 12)
513 Procedimiento
5131 Una vez extraiacuteda la sangre con cualquiera de las metodologiacuteas secoloca una pequentildea gota de sangre (5mL) (aprox 3 mm de diaacutemetro)sobre un portaobjeto a 2 cm aproximadamente de uno de los extremos
5132 Colocar el canto de otro portaobjeto esmerilado sobre la superficiedel primer portaobjeto (en la que se encuentra la gota de sangre)formando un aacutengulo de 45ordm
5134 Deslizar suavemente y a velocidad moderada el portaobjeto sobre elotro en sentido longitudinal hasta que la gota de sangre quede bienextendida sobre la
superficie del primer portaobjeto El grosor delfrotis sanguiacuteneo puede variar seguacuten sea el aacutengulo que formen entresiacute ambos portaobjetos Asiacute si es superior a 45ordm la extensioacuten obtenidaseraacute gruesa y corta si es inferior a 45ordm seraacute larga y fina El secado delfrotis es a temperatura ambiente y en posicioacuten horizontal
Fig 12
1048729 Zona excesivamente gruesa Se halla en la regioacuten inmediata al punto departida de la extensioacuten (cabeza) En ella se aprecia siempre un aumento delinfocitos
1048729 Zona excesivamente fina Corresponde al final de la extensioacuten y termina enun aacuterea donde las ceacutelulas adoptan una posicioacuten acartonada (barbas) Enesta regioacuten existe un exceso de granulocitos y monocitos
1048729 Zona ideal Corresponde a la regioacuten intermedia del frotis y en ella existe unreparto equilibrado de ceacutelulas
52 COLORACIONES USADAS
Una vez seco el frotis se procede a la tincioacuten hematoloacutegica con el colorante deRomanowsky constituido por la mezcla de eosina y azul de metileno Dentrode eacutestas tenemos
521 Colorante de Giemsa
522 Colorante de May-Grunwald
523 Colorante de Wright
524 Colorante de Leishman
Preparacioacuten de colorantes (Anexo A)
1048729 Para el estudio de las ceacutelulas sanguiacuteneas utilizar el colorante 523 y 524
1048729 Para el estudio de hemoparaacutesitos utilizar el colorante 521
1048729 Utilizar el colorante 522 para casos especiales en que se desee observar
con mayor claridad y especificidad los graacutenulos de los neutrofilos
53 TINCIOacuteN CON COLORANTE DE WRIGHT
531 Fundamento
El colorante de Wright va a permitir suministrar un medio para estudiar lasangre y determinar las variaciones y anormalidades de estructura forma ytamantildeo de los eritrocitos su contenido de hemoglobina y sus propiedades decoloracioacuten La informacioacuten obtenida de un frotis de sangre perifeacuterica dependeen gran parte de la calidad del extendido y la coloracioacuten
532 Materiales
5321 Colorante de Wright (Anexo A)
5322 Frasco gotero
5323 Solucioacuten amortiguada tamponada (Anexo A)
533 Procedimiento
5331 Una vez obtenido el frotis sanguiacuteneo se le dejaraacute secar entre 15 y 20minutos
5332 Luego se coloca la preparacioacuten en un soporte y se cubre con el colorantede Wright dejaacutendolo por espacio de 5 minutos
5333 Posteriormente se antildeade solucioacuten amortiguada tamponada en partesiguales hasta obtener un brillo metaacutelico dejando 6 minutos adicionales
5334 Finalmente se lava con agua corriente y se deja secar
5335 Se coloca en el microscopio y con pequentildeo aumento se revisa lacalidad de la coloracioacuten la cantidad aproximada de gloacutebulos blancosy se escoge el sitio para iniciar el recuento Se coloca una gota deaceite de inmersioacuten y se enfoca a un aumento de 100xLa forma de los gloacutebulos rojos se examinaraacute detenidamente observandoademaacutes del color (cantidad de hemoglobina) presencia deplaquetas su agrupacioacuten y distribucioacuten
5336 Posteriormente se hace el recuento diferencial de gloacutebulos blancosen 100
ceacutelulas para lo cual se deberaacute conocer las diferencias entreneutroacutefilos eosinoacutefilos
linfocitos y monocitosUna extensioacuten de sangre bien tentildeida debe caracterizarse
por unabuena diferenciacioacuten de las estructuras subcelulares en los leucocitosuna
coloracioacuten rosada de los hematiacutees y la ausencia de precipitados
Los defectos maacutes frecuentes observados en la tincioacuten del frotis sanguiacuteneoson
Coloracioacuten excesivamente azul debido a
1048729 Frotis excesivamente grueso
1048729 Lavado insuficiente
1048729 Tincioacuten muy prolongada
1048729 Empleo de colorante excesivamente alcalino
Coloracioacuten con una tonalidad rosada
1048729 El colorante el tampoacuten o el agua de lavado tienen un pH demasiadoaacutecido
Presencia de precipitados
1048729 Obedecen a una accioacuten excesiva del colorante Esto se puede evitarcon la
filtracioacuten
SECCIOacuteN 6
HEMOGRAMA-HEMOGLOBINA-HEMATOCRITO
El hemograma de Shilling constituye uno de los exaacutemenes de laboratorio
maacutesusados en el campo de la hematologiacutea Comprende las siguientes pruebas
61 RECUENTO LEUCOCITARIO
Principio
La sangre anticoagulada se deposita en un liacutequido que permite evidenciar
losleucocitos mantenieacutendolos visibles mientras que los eritrocitos
sonhemolizados El recuento del nuacutemero de leucocitos o gloacutebulos blancos se
expresapor mm3 (miliacutemetro cuacutebico)
611 Equipos
- Microscopio
- Hemocitoacutemetro (Caacutemara de Neubauer)
Consta de los siguientes elementos
diams Una laacutemina portaobjeto gruesa en el centro se hallan dos
superficiescuadriculadas iguales separadas del resto de la laacutemina por surcos y
dosbarras transversales algo maacutes elevadas
diams Una laminilla cubreobjetos oacutepticamente plana que al colocarse sobrelas barras
elevadas de la laacutemina forma una caacutemara entre el cubreobjetosy la superficie
cuadriculadaLa altura entre el cubreobjetos y la laacutemina portaobjetos es de 01
mmCada cuadriacutecula mide 3 mm de lado y se divide en 9 cuadrados grandesCada
uno de los cuales mide 1 mm2 de superficie que se subdivide a suvez en 16
cuadrados medianos El cuadrado grande central se divide en25 cuadrados
pequentildeos y cada uno de ellos en 16 cuadraditos Cadacuadrado pequentildeo mide
02 mm de lado (004 mm2 de superficie) y cadacuadradito mide 005 mm de lado
(00025 mm2 de superficie)
612 Materiales y reactivos requeridos
6121 Pipeta de gloacutebulos blancos (De Thoma) o pipeta automaacutetica (de 0 a 100 mL)Presenta cerca del extremo superior una marca de 11 inmediatamentecontinuacutea una dilatacioacuten (bulbo) que contiene una perla que funciona comomezcladora luego sigue el extremo maacutes largo de la pipeta (tallo) que estaacutedividida en 10 partes con 2 marcas 1 (parte final del bulbo) y 05 (a la mitaddel tallo) Se le acopla a su extremo superior 1 tubo de goma y una bombillapara aspirar
6122 Diluyente de gloacutebulos blancos Solucioacuten de Turk al 1
6123 Contador manual (Soacutelo si fuera necesario)
6124 Papel filtro
613 Procedimiento
6131 Una vez obtenida la sangre con anticoagulante o sangre capilar deldedo se procede a aspirar la sangre con la pipeta de gloacutebulos blancoshasta la marca de 05 y a limpiar la punta con papel absorbente
6132 Introducir la pipeta en el tubo que contenga solucioacuten de Turk y absorberhasta la marca de 11 (no debe haber burbujas)
6133 Tapar ambos extremos y proceder a mezclar manualmente o en unrotador automaacutetico por 2 oacute 3 minutos
6134 Monte la laminilla de vidrio en la caacutemara para recuento que debe estarlimpia y seca
6135 Agitar la pipeta y descartar las cuatro primeras gotas para luego colocaruna gota pequentildea de esta solucioacuten en la caacutemara
6136 Deje reposar por espacio de 3 minutos para que las ceacutelulas se sedimenten
6137 Enfocar con objetivo de 10x y contar en 4 cuadrados grandes angularesCuando se usa la pipeta automaacutetica se toma 20 mL (002 mL) desangre total con anticoagulante o sangre capilar con anticoagulante yse diluye en un tubo que contenga 380 mL de solucioacuten de Turk (aquiacutetenemos una dilucioacuten 120)
LECTURA
Fig 13
La lectura se realiza en los campos 1 3 7 y 9 como estaacute indicado en la figuraAdemaacutes de los leucocitos contados dentro de cada uno de los cuadrantes sedeben contar todos los leucocitos que se encuentren adheridos en la liacuteneahorizontal superior y vertical exterior o de lo contrario todos los leucocitosadheridos a la liacutenea horizontal inferior y vertical interior
614 Resultados
Nordm de leucocitos x mm3 = leucocitos contados en 4 camposdividealtura x dilucioacuten x aacuterea
Reemplazando = leucocitos contados en 4 camposdivide110 x 120 x 4=
Leucocitos contados en 4 camposdivide4200=
X1 divide4200= Nordm leucocitos contados x 50
615 Valores de referencia
5000 - 10 000 leucocitos mm3
616 Correccioacuten de valores para restar eritrocitos nucleados
Los normoblastos no se destruyen (lisis) en el liacutequido de dilucioacuten por lo tantopueden observarse al realizar el recuento leucocitario y confundirse con losleucocitos de tal manera que se debe emplear la siguiente foacutermula
Caacutelculo
La concentracioacuten del nuacutemero de normoblastos (por litro) esNuacutemero de normoblatos contados x concentracioacuten o nuacutemero de leucocitos100 + Nordm de normoblastos contados
Ejemplo
Si se cuentan 50 normoblastos y la concentracioacuten del nuacutemero de leucocitos es16 x 109l la concentracioacuten del nuacutemero de normoblastos seraacute
50 x16 = 53 x 109l
100 + 50
y la concentracioacuten de leucocitos corregida seraacute 16 - 53 = 107 x 109lEn unidades tradicionales las concentraciones de normoblastos y leucocitosse expresan por miliacutemetro cuacutebico En tales unidades el caacutelculo correspondienteal ejemplo que se ha dado seriacutea
50 x 16 000 = 5300 mm3
100 + 50
Recuento corregido de gloacutebulos blancos o leucocitos = 16 000 - 5300 = 10 700 mm3
Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2
62 RECUENTO DE GLOacuteBULOS ROJOS
Principio
La sangre se diluye en un liacutequido que nos permite observar claramente loshematiacutees luego esta dilucioacuten se coloca en una caacutemara de Neubauer con laayuda de una pipeta automaacutetica o pipeta Pasteur y se cuentan en el microscopioa un objetivo de 40x para calcular el nuacutemero de gloacutebulos rojos por mm3
621 Equipos
- Microscopio
- Hemocitoacutemetro (caacutemara de Neubauer)
622 Materiales y reactivos requeridos
6221 Pipeta de gloacutebulos rojos (De Thoma) o pipeta automaacutetica (de 0-100 mL)
Presenta cerca del extremo superior una marca de 101 inmediatamentecontinuacutea una dilatacioacuten (bulbo) que contiene una perla roja mezcladoraluego sigue el tallo (extremo maacutes largo) el cual estaacute dividido en 10 partescon 2 marcas 1 acabando el bulbo y 05 a la mitad del tallo Se requiereigual que el recuento de leucocitos una boquilla para aspirar
6222 Diluyente de gloacutebulos rojos Cloruro de Sodio al 09 (ver anexo)
Diluyente de Hayem (ver anexo)
6223 Contador manual (soacutelo si fuera necesario)
6224 Papel filtro
623 Procedimiento
6231 Mezclar la sangre obtenida con el anticoagulante o tomar sangre capilar
6232 Llenar la pipeta de gloacutebulos rojos con sangre hasta la marca de 05para realizar una dilucioacuten de 1200 y si se carga hasta 1 la dilucioacutenseraacute 1100 Limpiar la punta con gasa o papel absorbente
6233 Introducir la pipeta en el tubo o frasquito conteniendo diluyente (Hayem)y llenar de liacutequido de dilucioacuten hasta la marca de 101
6234 Se coloca en un rotador automaacutetico o se hace rotar manualmente de2 a 3 minutos
6235 Agitar bien la pipeta y descartar 3 a 4 gotas del tallo luego colocar unagota pequentildea cerca de un extremo de la caacutemara para que por capilaridadse llene exactamente
6236 Hacer el recuento con objetivo de 40xSe puede realizar con la pipeta automaacutetica se toma 20 mL (002mL)de sangre total con anticoagulante o sangre capilar y se deposita enun tubo de 12 x 75 que contenga 4 mL de solucioacuten de Hayem (aquiacute setiene una dilucioacuten de 1200) Se deja reposar aproximadamente 5minutos y se procede a cargar la caacutemara con la misma pipeta usandoun nuevo tip El inconveniente aquiacute es el gasto de reactivo (4 mL) perolas medidas son mas exactas
6237 Dejar en reposo por 3 minutos
6238 Enfocar la cuadriacutecula a 10x luego con el objetivo de 40x contar sobreel cuadrado grande central de la caacutemara soacutelo en 5 cuadrados pequentildeosuno central y cuatro angulares (80 cuadraditos en total)
6239 En el recuento se incluyen las ceacutelulas que cubren o tocan por dentroo por fuera las liacuteneas limitantes superior e izquierda en el cuadradopequentildeo de recuento y no se consideran los correspondientes a losliacutemites inferior y derechoSe hace el recuento en los puntos ABCD y Ey se sigue los mismos paraacutemetros del recuento de leucocitos
LECTURA
Fig 14
624 Resultados
Nordm de hematiacutees x mm3 = hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeosaltura x dilucioacuten X aacuterea
Reemplazando = hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeos110 x 1200 x 15
= hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeos divide 110 000
= hematiacutees contados x 10 000
625 Valores de referencia
(Unidades tradicionales millones de ceacutelulasmm3)
Hombres 4 500 000 - 5 500 000
Mujeres 4 000 000 - 5 000 000
Nintildeos (4 antildeos) 4 200 000 - 5 200 000
Lactantes (1 - 6 meses) 3 800 000 - 5 200 000
Recieacuten nacidos 5 000 000 - 6 000 000
Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2
63 DETERMINACIOacuteN DEL VOLUMEN GLOBULAR (Hematocrito)
Mide la fraccioacuten que comprende a los gloacutebulos rojos (masa globular) respectoal
volumen total de la muestra de sangre venosa o capilar Puede expresarseen
porcentaje o como valor decimal
Hto= altura de la columna de gloacutebulos rojosdivide altura de la columna de sangre
total(gloacutebulos rojos maacutes plasma)
631 Meacutetodo de Wintrobe
Materiales requeridos
- Tubo de Wintrobe graduado de 0 - 100 mm
- Pipetas Pasteur o pipetas de transferencia
- Tapoacuten de goma
Procedimiento
diams Llenar la sangre extraiacuteda con anticoagulante con una pipeta pasteur
comenzandodesde el fondo hasta la marca superior de 100 mm teniendocuidado
de no provocar espuma
diams Tapar el tubo con un tapoacuten de goma para evitar la evaporacioacuten
diams Centrifugar a 3000 rpm por 30 minutos
Resultados (lectura)
Del tubo graduado se mide directamente el nivel de la columna de gloacutebulosrojos
Valores de referencia
Hombres 40 - 54Mujeres 38 - 48
Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2
632 Meacutetodo de microhematocrito
Materiales requeridos
- Capilares rojos y azules (75 mm x 15 mm)
- Plastilina
Procedimiento
diams Tomar la muestra en capilares rojos heparinizados directamente del pulpejodel
dedo o utilizar capilares azules sin heparina para sangre venosacon
anticoagulante de Wintrobe o EDTA Debe llenarse aproximadamente70 - 80
del capilar
diams Ocluir (tapar) un extremo del capilar con plastilina
diams Colocar el capilar sobre la plataforma del cabezal de una centriacutefuga demicrohematocrito con el extremo ocluido adherido al reborde externo de laplataforma
diams Centrifugar por 5 minutos entre 10 000 - 12 000 rpm
Resultados (lectura)
La lectura se realiza con una escala estandarizada que expenden en el comercio
Uso de la escala
diams Sostenga el tubo frente a la escala de manera que el fondo de la columnade eritrocitos (no el extremo inferior del tubo) quede exactamente al mismonivel de la liacutenea horizontal correspondiente al cero
diams Desplace el tubo a traveacutes de la escala hasta que la liacutenea marcada con elnuacutemero 10 quede al nivel del tope de la columna de plasma Vigile que elfondo de la
columna de eritrocitos continuacutee sobre la liacutenea cero El tubodebe encontrarse completamente en posicioacuten vertical
diams La liacutenea que pase al nivel del tope de la columna de eritrocitos indicaraacute lafraccioacuten de volumen de eacutestos
Valores de referencia
Hombres 40 - 50
Mujeres 38 - 44
Nintildeos (5 antildeos) 38 - 44
Lactantes (3 meses) 37 - 42
Recieacuten nacidos 50 - 58
La disposicioacuten celular esParte superior una columna de plasmaEn la interfase estaacuten los leucocitos yplaquetasParte inferior estaacute la columna deeritrocitos (Fig 15)
64 DOSAJE DE HEMOGLOBINA
Principio
La sangre se diluye en liacutequido de Drabkin el cual hemoliza los hematiacutees yconvierte la hemoglobina en cianometahemoglobina (cianuro de hemiglobina)La solucioacuten que se produce se lee por medio de un espectrofotoacutemetro ofotocoloriacutemetro Su grado de absorbancia es proporcional a la cantidad dehemoglobina que contenga la sangre
641 Materiales y reactivos
6411 Un coloriacutemetro fotoeleacutectrico o un espectrofotoacutemetro
6412 Pipetas
diams Una pipeta para sangre (pipeta de Sahli) graduada hasta 002 mL contubo de goma y boquilla
diams Una pipeta de vidrio graduada de 5 mL
6413 Tubos de ensayo
6414 Reactivo de Drabkin para dilucioacuten
Este reactivo se puede adquirir en tabletas o polvos para disolver en 1litro de agua destilada Si se dispone de una balanza analiacutetica la preparacioacutense puede hacer en el laboratorio Esta solucioacuten se puedeconservar durante un mes en un frasco de vidrio oscuro Deseacutechese sise enturbia
Alteraciones en el tamantildeo 70
Alteraciones en la forma 71
Alteraciones de color72
Inclusiones anormales73
BIBLIOGRAFIacuteA79
ANEXO A Preparacioacuten de colorantes y soluciones maacutes
Usados en hematologiacutea81
ANEXO B Preparacioacuten de anticoagulantes 85
PRESENTACIOacuteN
Con el propoacutesito de uniformizar los procedimientos hematoloacutegicos que serealizan en los diversos laboratorios cliacutenicos el Instituto Nacional de Saludpone a disposicioacuten de la comunidad teacutecnico-cientiacutefica nacional el Manual deProcedimientos de Laboratorio en Teacutecnicas Baacutesicas de Hematologiacutea en elcual se incluyen todos los meacutetodos empleados en el campo hematoloacutegicobaacutesico De este modo se contribuye a mejorar la calidad de diagnoacutestico en loslaboratorios de los servicios de saludEl laboratorio de hematologiacutea cuenta con dos aacutereas baacutesicas Aacuterea deHematimetriacutea (hemograma VSE recuento de plaquetas etc) y Aacuterea deHemostasia Partiendo de esta estructura en este manual nos referiremos alas teacutecnicas baacutesicas empleadas en estas aacutereas partiendo de la toma de muestrahasta la realizacioacuten de las pruebas respectivasEs necesario enfatizar que para obtener resultados maacutes confiables es importantepero no imprescindible automatizar el laboratorio debido a que elloevitaraacute el posible error humano sobre todo en lo referente a recuentos celularesvalores de hemoglobina y constantes corpusculares ya que en estasvariables se trabaja con cantidades exactas de sangre hecho que es muydifiacutecil de lograr cuando se usan los meacutetodos manuales lo mismo sucede altratarse de las pruebas de hemostasiaEsperamos que este manual constituya una herramienta de consulta en laRed Nacional de Laboratorios de Salud ademaacutes de una guiacutea para el personalde laboratorio en general
INTRODUCCIOacuteN
El presente manual ha sido elaborado en forma simple didaacutectica y eminentementepraacutectica para que su contenido sea faacutecil de entender por el personalque labora en el laboratorio de hematologiacuteaSe divide en tres partes
1 En la primera parte se presentan los aspectos maacutes importantes de labioseguridad en el laboratorio
2 En la segunda parte se exponen las principales teacutecnicas baacutesicas del laboratoriode hematologiacutea
3 En la tercera parte se detallan las alteraciones maacutes frecuentes de la serieroja y de la serie blanca de un hemograma
El objetivo principal es protocolizar y estandarizar los procedimientoshematoloacutegicos que empiezan con la toma de muestra (siguiendo las pautasde control de calidad preanaliacutetica) hasta el procesamiento de eacutesta (fase analiacutetica)en la determinacioacuten correspondiente y por uacuteltimo en la emisioacuten de losresultados (fase postanaliacutetica) Debemos recalcar que cuando se realizanpruebas de hemostasia debe tenerse en consideracioacuten los cuidados comunesa toda prueba de laboratorio es decir las muestras deben obtenerse encondiciones apropiadas y rotularse debidamente Esperamos que el presentemanual sirva de guiacutea efectiva y que pueda ser enriquecido con nuevosaportes con la finalidad de alcanzar un trabajo de calidad
SECCIOacuteN 1
GENERALIDADES
11 OBJETIVO
Establecer y estandarizar los procedimientos baacutesicos de un examen dehemograma hemoglobina hematocrito recuento de plaquetas velocidad desedimentacioacuten y recuento de reticulocitos que sirvan de ayuda diagnoacutestica alcliacutenico
12 CAMPO DE APLICACIOacuteN
La aplicacioacuten de las teacutecnicas hematoloacutegicas nos sirve para estandarizar losprocedimientos a nivel nacional y para que sea de utilidad al personal teacutecnicoy profesional de los laboratorios cliacutenicos
13 RESPONSABILIDADES
131 El Centro Nacional de Laboratorios en Salud Puacuteblica a traveacutes de su
Direccioacuten Ejecutiva de Laboratorios de Referencia es responsable deautorizar la elaboracioacuten la revisioacuten y la actualizacioacuten del presente manualde acuerdo con los procedimientos aprobados por el Instituto Nacionalde Salud
132 Los directores de los establecimientos de salud son responsables deautorizar proporcionar los recursos necesarios y designar al personalresponsable para la aplicacioacuten de las disposiciones contenidas en elpresente manual
133 El personal de los establecimientos de salud es responsable de planificarlas acciones organizar controlar y capacitar al personal para cumplirlas disposiciones contenidas en el presente manual
134 Los jefes o responsables de los laboratorios deben asegurar el controlinterno de la calidad la idoneidad del personal equipos materialesreactivos e instalaciones
135 El personal meacutedico profesional y teacutecnico es responsable de seguir lasespecificaciones contenidas en el presente manual y aplicar los procedimientosespeciacuteficos indicados
14 DOCUMENTOS DE REFERENCIA
141 Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OrganizacioacutenPanamericana de la Salud Publicacioacuten cientiacutefica Nordm 439 Nordm 2 1983
142 Manual de normas de bioseguridad Instituto Nacional de Salud Serie deNormas Teacutecnicas Nordm 18 2ordf ed 1997
SECCIOacuteN 2
MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD
21 Para la obtencioacuten de muestras el personal involucrado en los diferentesprocesos para los exaacutemenes hematoloacutegicos debe aplicar las medidas debioseguridad establecidas en el Manual de Bioseguridad Serie de NormasTeacutecnicas Nordm 18
22 Se debe controlar sobre todo
221 Al personal que trabaja en el laboratorio de hematologiacutea
222 El proceso de coloracioacuten en el que se debe aplicar las medidas debioseguridad correspondientes al uso y manipulacioacuten de sustanciastoacutexicas o canceriacutegenas
223 Ver lo referente a medidas de proteccioacuten en caso de accidentes porinoculacioacuten
SECCIOacuteN 3
OBTENCIOacuteN DE MUESTRAS SANGUIacuteNEAS
31 OBJETIVO
Establecer y uniformizar criterios en el procedimiento de obtencioacuten de muestrassanguiacuteneas con un adecuado control de calidad ya que de ello dependeque el resultado del anaacutelisis de la muestra sea el correcto Se efectuaraacute enayunas o no dependiendo de la prueba a usar
32 OBTENCIOacuteN DE SANGRE VENOSA CON JERINGA
321 Materiales y equipos requeridos
3211 Algodoacuten
3212 Alcohol al 70
3213 Ligadura o torniquete de 25 a 30 cm de largo
3214 Jeringas de 5 mL
3215 Viales con anticoagulante EDTA
322 Obtencioacuten de la muestra
3221 Verificar que los elementos por utilizar esteacuten listos y que el pacientese sienta coacutemodo
3222 Aplicar el torniquete aproximadamente cuatro dedos por encima de laflexioacuten del codo o a 10 cm del codo sujetar con un medio nudo (Fig 1)
3223 Limpiar la zona con alcohol al 70 o alcohol yodado en un aacuterea de 2pulgadas (Fig 2)
3224 El paciente deberaacute abrir y cerrar la mano durante unos segundos ydespueacutes la mantendraacute cerrada esto ayudaraacute a visualizar las venassuperficiales (Fig 3)
3225 Se retira el estuche protector de la aguja y se coge la jeringa de talmanera que el bisel se encuentre hacia arriba (Fig 4)
3226 Se coloca la aguja en direccioacuten paralela a la vena se perfora la pielhaciendo avanzar la aguja 05-1 cm en el tejido subcutaacuteneo luego seperfora la vena (Fig 5)
3227 Se aspira la jeringa hasta el volumen requerido
3228 Retirar el torniquete e indicar al paciente que deje de hacer puntildeo Secoloca el algodoacuten seco encima de la puncioacuten y se retira la aguja (Fig 6)
3229 Retirar la aguja de la jeringa Verter la muestra lentamente por lasparedes del vial con anticoagulante No olvidar colocar una gota en lalaacutemina portaobjeto para realizar el frotis
32210 Agitar el vial en ciacuterculos sobre la mesa para homogeneizar la muestracon el anticoagulante
PUNTOS PARA LA EXTRACCIOacuteN DE SANGRE
(Toma de muestra)
Se obtiene de las venas de la fosa cubital
PROCEDIMIENTO
Fig 1 Fig 2 Fig 3
Fig 4 Fig 5
Fig 6 Fig 7
33 OBTENCIOacuteN DE SANGRE VENOSA EN TUBOS AL VACIacuteO
331 Materiales requeridos
3311 Algodoacuten
3312 Alcohol al 70
3313 Ligadura o torniquete de 25 a 30 cm de largo
3314 Tubos al vaciacuteo con anticoagulante EDTA (K3) EDTA (Na2) u otroanticoagulante
3315 Agujas con dispositivo para extraccioacuten de sangre al vaciacuteo
- Nordm 21 para adultos
- Nordm 22 para nintildeos y neonatos
De preferencia ambas de bisel corto para evitar la coagulacioacuten
332 Obtencioacuten de la muestra
3321 Repetir los pasos de 3221 a 3224
3322 Se retira el estuche protector de la aguja y eacuteste se enrosca al dispositivopara extraccioacuten de sangre al vaciacuteo
3323 Colocar la ligadura cuatro dedos por encima de la flexioacuten del codo o10 cm por encima de eacuteste y pedir al paciente que abra y cierre la manovarias veces para favorecer la dilatacioacuten de las venas
3324 Una vez escogida la vena desinfectarla con una pieza de algodoacutenembebido en etanol al 70
3325 Se coloca la aguja en direccioacuten paralela a la vena se perfora la pielhaciendo avanzar la aguja entre 05 cm y 1 cm en el tejido subcutaacuteneose inserta el tubo al vaciacuteo por la parte posterior y no preocuparse porla cantidad de sangre extraiacuteda ya que el mismo sonido del vaciacuteo avisaraacuteque la extraccioacuten terminoacute (Fig 8)
3326 Retirar la ligadura tirando del extremo doblado
3327 Colocar un pedazo de algodoacuten seco sobre la parte donde se encuentraoculta la aguja Sacar la aguja con un movimiento raacutepido y depositarlaen el recipiente de metal con desinfectante (Fig 9)
3328 Pedir al paciente que presione firmemente el algodoacuten durante 3 minutoscon el brazo extendido No se recomienda que se flexione el brazoa causa del riesgo que se forme un hematoma
3329 Mezclar por inmersioacuten suave la sangre con el anticoagulante contenidoen el tubo No agitar el contenido
Fig 8 Fig 9
333 Ventajas de una extraccioacuten de sangre venosa
3331 Pueden hacerse repetidos exaacutemenes con la misma muestra
3332 Parte de la muestra (plasma o suero) puede congelarse para referenciafutura
334 Desventajas de una extraccioacuten de sangre venosa
3341 La puncioacuten venosa por su largo procedimiento requiere mayor preparacioacuten que el meacutetodo capilar
3342 El meacutetodo es teacutecnicamente difiacutecil en nintildeos individuos obesos y pacientes en shock
3343 La hemoacutelisis debe ser evitada pues se puede obtener una disminucioacuten en el recuento de eritrocitos
3344 Debe evitarse prolongada estasis venosa producida por el torniquete pues produce hemoacutelisis y otros cambios que ponen la sangre en un estado inadecuado para el anaacutelisis de gases recuentos celulares determinacioacuten de pH sanguiacuteneo y algunas pruebas de coagulacioacuten
3345 La sangre anticoagulada si no es de obtencioacuten reciente no debe ser utilizada en extensiones de sangre pues algunos anticoagulantes producen cambios en las plaquetas que pueden causar aglutinaciones agregacioacuten plaquetaria y dificultan la identificacioacuten de leucocitos
3346 Puesto que algunos de los componentes de la sangre no son estables los recuentos de leucocitos y plaquetas e iacutendice de sedimentacioacuten deben realizarse antes de que pasen dos horas desde que se obtuvo la muestra
34 OBTENCIOacuteN DE SANGRE DE LA VENA YUGULAR EXTERNA
341 Materiales requeridos
3411 Algodoacuten
3412 Alcohol al 70
3413 Jeringas de 5 mL
3414 Viales con anticoagulante EDTA
342 Obtencioacuten de la muestra
3421 El paciente es cubierto por una saacutebana de manera que los brazospermanezcan inmovilizados a lo largo del cuerpo
3422 Al paciente se le coloca de cuacutebito dorsal sobre la mesa de examen ouna
camilla de manera que la cabeza cuelgue sobre el final de lamesa y el cuerpo sea
sujetado por un asistente
3423 Cuando el paciente grita la vena yugular externa se marca claramente
3424 Limpiar la zona en un aacuterea de 2 pulgadas con alcohol al 70 o
alcoholyodado
3425 Se repiten los pasos de 3225 a 3227 de la extraccioacuten de sangrevenosa
con jeringa
3426 Retirar la aguja de la vena y presionar suavemente con un algodoacutenseco
aproximadamente de 3 a 5 minutos Pedir al paciente que permanezcaechado diez
minutos
3427 Se repiten los pasos de 3229
3428 Se repiten los pasos de 32210
343 Ventajas
Constituye un buen meacutetodo para la obtencioacuten de sangre en pacientes conshock
con venas colapsadas
344 Desventajas
Por lo delicado en su procedimiento no se recomienda como rutina soacutelo encasos
en que no se pueda obtener la muestra por meacutetodos convencionales
35 OBTENCIOacuteN DE SANGRE CAPILAR
Cuando la cantidad de sangre que se precisa es muy pequentildea o cuando
pordiferentes motivos no pueda practicarse una puncioacuten venosa debe recurrirse
a la puncioacuten capilar
351 Materiales requeridos
3512 Algodoacuten
3513 Alcohol al 70
3514 Lancetas desechables (Fig 10)
3515 Papel filtro Nordm 2
352 Procedimiento (Fig 11)
3521 La sangre capilar se obtiene de la cara lateral del dedo medio o anularen los adultos y del dedo gordo del pie o taloacuten en los nintildeos
3522 Desinfectar la zona con alcohol al 70 secar con algodoacuten esteacuteril
3523 Punzar la piel con una lanceta esteacuteril desechable (2 mm de profundidad)
3524 Usar gasa esteacuteril para desechar la primera gota y recoger las siguientesen tubos capilares Evitar comprimir la extremidad para obtenersangre porque se altera la composicioacuten sanguiacutenea
353 Ventajas
3531 Puede obtenerse con facilidad
3532 Es preferible cuando han de realizarse extensiones de sangre perifeacuterica
354 Desventajas
3541 Soacutelo se pueden obtener pequentildeas cantidades de sangre y los exaacutemenesde repeticioacuten requieren nuevas muestras
3542 La sangre en microtubos (capilares) frecuentemente se hemolizainterfiendo con la mayoriacutea de pruebas de laboratorio
3543 Los resultados obtenidos en pruebas con sangre capilar no puedenser comparados con los resultados de las pruebas con sangre venosa
3544 El dedo no soacutelo es delicado sino difiacutecil de desinfectar adecuadamenteen el tiempo disponible
3545 En pacientes con resistencia disminuida a la infeccioacuten (aquellos conleucemia agranulocitosis diabetes uremia y enfermedades con deficienciasinmunoloacutegicas) una muestra tomada del dedo es mucho maacutesprobable que conduzca a una infeccioacuten que otra tomada del brazo
3546 El recuento de eritrocitos y leucocitos asiacute como el recuento deplaquetas y reticulocitos no debe realizarse en sangre capilar debidoa la difiacutecil estandarizacioacuten del flujo sanguiacuteneo capilar
EXTRACCIOacuteN DE SANGRE CAPILAR
Fig 10
Fig 11
SECCIOacuteN 4
ANTICOAGULANTES
Una vez extraiacuteda la sangre eacutesta puede conservarse coagulada o
mantenidaincoagulable mediante la adicioacuten de un anticoagulante
41 CARACTERIacuteSTICAS BAacuteSICAS DE LOS ANTICOAGULANTES MAacuteS
USADOSEN HEMATOLOGIacuteA
bull No alterar el tamantildeo de los hematiacutees
bull No producir hemoacutelisis
bull Evitar al maacuteximo la agregacioacuten plaquetaria
bull No alterar la morfologiacutea de los leucocitos
La sangre tratada con anticoagulante debe procesarse lo antes posible
inclusomantenida bajo refrigeracioacuten (4 ordmC) si no pasan de las 2 horas El
tiempomaacuteximo entre la extraccioacuten de la sangre y su procesamiento depende
delcoagulante de eleccioacuten y no debe ser maacutes de 4 horas a excepcioacuten
delanticoagulante EDTA (etilendiaminotetraceacutetico) que puede ser hasta 24
horas(en refrigeracioacuten a 4 ordmC)
Los anticoagulantes pueden emplearse en forma soacutelida o liacutequida Los
primerosestaacuten indicados para la determinacioacuten de los paraacutemetros
hematoloacutegicosya que no producen como los anticoagulantes liacutequidos dilucioacuten de
la sangre
42 ANTICOAGULANTES SOacuteLIDOS
421 EDTA
Es la sal disoacutedica o tripotaacutesica del aacutecido etilendiaminotetraceacutetico La saldisoacutedica
(Na2EDTA) es menos soluble que la sal tripotaacutesica (K3EDTA) Estoscompuestos
realizan su accioacuten a traveacutes de un efecto quelante sobre el calcioal fijarlo impiden
su activacioacuten y por ende la coagulacioacuten sanguiacutenea
4211 Ventajas
bull Respeta la morfologiacutea eritrocitaria (especialmente la sal tripotaacutesica) yleucocitaria de manera que permite una demora de dos horas en la realizacioacutendel frotis sanguiacuteneo despueacutes de la extraccioacuten sanguiacutenea
bull Asegura la conservacioacuten de los elementos formes sanguiacuteneos durante 24horas si la sangre se mantiene a 4 ordmC
bull Al inhibir la aglutinacioacuten de las plaquetas facilita su recuento o su expresioacutensemicuantitativa a partir del frotis
bull La concentracioacuten recomendada de EDTA es de 15 mgmL de sangre Unamayor cantidad de anticoagulante puede producir retraccioacuten celular condisminucioacuten del hematocrito y un aumento de la concentracioacuten media de lahemoglobina Un exceso de sangre con relacioacuten al anticoagulante produceformacioacuten de microagregados que pueden alterar los resultados El empleode tubos al vaciacuteo con una gota (50mL) de EDTA tripotaacutesica comercialpara 5 mL de sangre es de intereacutes praacutectico dado que es cien veces maacutessoluble facilitando la mezcla de sangre con anticoagulante
4212 Desventajas
Usado en exceso afecta a los eritrocitos y a los leucocitos a los cuales les produce encogimiento y cambios en su forma por ello debe cuidarse de agregar la cantidad correcta de sangre al anticoagulante
422 Anticoagulante de Wintrobe
Es una mezcla de oxalato de amonio y potasio Actuacutea por precipitacioacuten del calcio es faacutecil de preparar Se emplea en forma de polvo en proporcioacuten de 2 de oxalato de amonio por 1 de oxalato de potasio La cantidad recomendada es de 2 mg x mL de sangre Este anticoagulante no afecta el volumen globular medio y puede usarse para determinaciones de hemoglobina hematocrito y recuento globular pero para los extendidos queda limitada a los primeros minutos tampoco es uacutetil para el recuento plaquetario porque produce formacioacuten de agregados plaquetarios
423 Heparina
El nombre de heparina proviene del griego hepar que significa hiacutegado ya que fue aislado por primera vez de las ceacutelulas de este tejido Es un mucopolisacaacuterido aacutecido Presenta el
inconveniente de que si no se agita raacutepidamente con la sangre despueacutes de extraiacuteda
pueden formarse microcoaacutegulos aunque no altera el volumeneritrocitario ni la morfologiacutea de los leucocitos No es recomendablepara el frotis sanguiacuteneo porque produce un fondo azul en la laacutemina
La heparina de sodio o litio puede usarse en forma soacutelida o liacutequida en
proporcioacutende 01 - 02 mg de heparina por 1 mL de sangre
43 ANTICOAGULANTES LIacuteQUIDOS
431 Citrato trisoacutedico
Es de eleccioacuten para las pruebas de hemostasia y la velocidad de sedimentacioacuten
Actuacutea a traveacutes de la precipitacioacuten del calcio La concentracioacuten depende de
la prueba por realizar
bull Para pruebas de hemostasia se emplea en proporcioacuten de 1 9 (05 mL
deanticoagulante para 45 mL de sangre total)
bull Para la determinacioacuten de la VSG (Velocidad de Sedimentacioacuten Globular) es14
(05 mL de anticoagulante para 2 mL de sangre)
432 Oxalato soacutedico
Recomendado tambieacuten para las pruebas de hemostasia Se emplea en
proporcioacutende un volumen de anticoagulante para 4 vol de sangre
SECCIOacuteN 5
REALIZACIOacuteN Y TINCIOacuteN DEL FROTIS SANGUIacuteNEO
La praacutectica del frotis sanguiacuteneo tambieacuten llamado extendido es de gran importanciaen hematologiacutea ya que el diagnoacutestico de muchas enfermedadeshematoloacutegicas puede realizarse con soacutelo observar las caracteriacutesticasmorfoloacutegicas de las ceacutelulas sanguiacuteneas de manera que eacuteste no debe serexcesivamente grueso ni excesivamente fino Todas las laacuteminas por usarsobre todo nuevas deben ser limpiadas con algodoacuten y alcohol al 70 paraeliminar la grasa que viene adherida
51 MEacuteTODO DE LOS DOS PORTAOBJETOS
511 Materiales
- Alcohol al 70
- Algodoacuten
- Lanceta descartable
- Portaobjetos de vidrios limpios y desgrasados (25 x 75 mm)
512 Fundamento
Consiste en la extensioacuten de una gota de sangre sobre un portaobjeto (25 x 75)empleando el canto biselado de otro portaobjeto de igual dimensioacuten (Fig 12)
513 Procedimiento
5131 Una vez extraiacuteda la sangre con cualquiera de las metodologiacuteas secoloca una pequentildea gota de sangre (5mL) (aprox 3 mm de diaacutemetro)sobre un portaobjeto a 2 cm aproximadamente de uno de los extremos
5132 Colocar el canto de otro portaobjeto esmerilado sobre la superficiedel primer portaobjeto (en la que se encuentra la gota de sangre)formando un aacutengulo de 45ordm
5134 Deslizar suavemente y a velocidad moderada el portaobjeto sobre elotro en sentido longitudinal hasta que la gota de sangre quede bienextendida sobre la
superficie del primer portaobjeto El grosor delfrotis sanguiacuteneo puede variar seguacuten sea el aacutengulo que formen entresiacute ambos portaobjetos Asiacute si es superior a 45ordm la extensioacuten obtenidaseraacute gruesa y corta si es inferior a 45ordm seraacute larga y fina El secado delfrotis es a temperatura ambiente y en posicioacuten horizontal
Fig 12
1048729 Zona excesivamente gruesa Se halla en la regioacuten inmediata al punto departida de la extensioacuten (cabeza) En ella se aprecia siempre un aumento delinfocitos
1048729 Zona excesivamente fina Corresponde al final de la extensioacuten y termina enun aacuterea donde las ceacutelulas adoptan una posicioacuten acartonada (barbas) Enesta regioacuten existe un exceso de granulocitos y monocitos
1048729 Zona ideal Corresponde a la regioacuten intermedia del frotis y en ella existe unreparto equilibrado de ceacutelulas
52 COLORACIONES USADAS
Una vez seco el frotis se procede a la tincioacuten hematoloacutegica con el colorante deRomanowsky constituido por la mezcla de eosina y azul de metileno Dentrode eacutestas tenemos
521 Colorante de Giemsa
522 Colorante de May-Grunwald
523 Colorante de Wright
524 Colorante de Leishman
Preparacioacuten de colorantes (Anexo A)
1048729 Para el estudio de las ceacutelulas sanguiacuteneas utilizar el colorante 523 y 524
1048729 Para el estudio de hemoparaacutesitos utilizar el colorante 521
1048729 Utilizar el colorante 522 para casos especiales en que se desee observar
con mayor claridad y especificidad los graacutenulos de los neutrofilos
53 TINCIOacuteN CON COLORANTE DE WRIGHT
531 Fundamento
El colorante de Wright va a permitir suministrar un medio para estudiar lasangre y determinar las variaciones y anormalidades de estructura forma ytamantildeo de los eritrocitos su contenido de hemoglobina y sus propiedades decoloracioacuten La informacioacuten obtenida de un frotis de sangre perifeacuterica dependeen gran parte de la calidad del extendido y la coloracioacuten
532 Materiales
5321 Colorante de Wright (Anexo A)
5322 Frasco gotero
5323 Solucioacuten amortiguada tamponada (Anexo A)
533 Procedimiento
5331 Una vez obtenido el frotis sanguiacuteneo se le dejaraacute secar entre 15 y 20minutos
5332 Luego se coloca la preparacioacuten en un soporte y se cubre con el colorantede Wright dejaacutendolo por espacio de 5 minutos
5333 Posteriormente se antildeade solucioacuten amortiguada tamponada en partesiguales hasta obtener un brillo metaacutelico dejando 6 minutos adicionales
5334 Finalmente se lava con agua corriente y se deja secar
5335 Se coloca en el microscopio y con pequentildeo aumento se revisa lacalidad de la coloracioacuten la cantidad aproximada de gloacutebulos blancosy se escoge el sitio para iniciar el recuento Se coloca una gota deaceite de inmersioacuten y se enfoca a un aumento de 100xLa forma de los gloacutebulos rojos se examinaraacute detenidamente observandoademaacutes del color (cantidad de hemoglobina) presencia deplaquetas su agrupacioacuten y distribucioacuten
5336 Posteriormente se hace el recuento diferencial de gloacutebulos blancosen 100
ceacutelulas para lo cual se deberaacute conocer las diferencias entreneutroacutefilos eosinoacutefilos
linfocitos y monocitosUna extensioacuten de sangre bien tentildeida debe caracterizarse
por unabuena diferenciacioacuten de las estructuras subcelulares en los leucocitosuna
coloracioacuten rosada de los hematiacutees y la ausencia de precipitados
Los defectos maacutes frecuentes observados en la tincioacuten del frotis sanguiacuteneoson
Coloracioacuten excesivamente azul debido a
1048729 Frotis excesivamente grueso
1048729 Lavado insuficiente
1048729 Tincioacuten muy prolongada
1048729 Empleo de colorante excesivamente alcalino
Coloracioacuten con una tonalidad rosada
1048729 El colorante el tampoacuten o el agua de lavado tienen un pH demasiadoaacutecido
Presencia de precipitados
1048729 Obedecen a una accioacuten excesiva del colorante Esto se puede evitarcon la
filtracioacuten
SECCIOacuteN 6
HEMOGRAMA-HEMOGLOBINA-HEMATOCRITO
El hemograma de Shilling constituye uno de los exaacutemenes de laboratorio
maacutesusados en el campo de la hematologiacutea Comprende las siguientes pruebas
61 RECUENTO LEUCOCITARIO
Principio
La sangre anticoagulada se deposita en un liacutequido que permite evidenciar
losleucocitos mantenieacutendolos visibles mientras que los eritrocitos
sonhemolizados El recuento del nuacutemero de leucocitos o gloacutebulos blancos se
expresapor mm3 (miliacutemetro cuacutebico)
611 Equipos
- Microscopio
- Hemocitoacutemetro (Caacutemara de Neubauer)
Consta de los siguientes elementos
diams Una laacutemina portaobjeto gruesa en el centro se hallan dos
superficiescuadriculadas iguales separadas del resto de la laacutemina por surcos y
dosbarras transversales algo maacutes elevadas
diams Una laminilla cubreobjetos oacutepticamente plana que al colocarse sobrelas barras
elevadas de la laacutemina forma una caacutemara entre el cubreobjetosy la superficie
cuadriculadaLa altura entre el cubreobjetos y la laacutemina portaobjetos es de 01
mmCada cuadriacutecula mide 3 mm de lado y se divide en 9 cuadrados grandesCada
uno de los cuales mide 1 mm2 de superficie que se subdivide a suvez en 16
cuadrados medianos El cuadrado grande central se divide en25 cuadrados
pequentildeos y cada uno de ellos en 16 cuadraditos Cadacuadrado pequentildeo mide
02 mm de lado (004 mm2 de superficie) y cadacuadradito mide 005 mm de lado
(00025 mm2 de superficie)
612 Materiales y reactivos requeridos
6121 Pipeta de gloacutebulos blancos (De Thoma) o pipeta automaacutetica (de 0 a 100 mL)Presenta cerca del extremo superior una marca de 11 inmediatamentecontinuacutea una dilatacioacuten (bulbo) que contiene una perla que funciona comomezcladora luego sigue el extremo maacutes largo de la pipeta (tallo) que estaacutedividida en 10 partes con 2 marcas 1 (parte final del bulbo) y 05 (a la mitaddel tallo) Se le acopla a su extremo superior 1 tubo de goma y una bombillapara aspirar
6122 Diluyente de gloacutebulos blancos Solucioacuten de Turk al 1
6123 Contador manual (Soacutelo si fuera necesario)
6124 Papel filtro
613 Procedimiento
6131 Una vez obtenida la sangre con anticoagulante o sangre capilar deldedo se procede a aspirar la sangre con la pipeta de gloacutebulos blancoshasta la marca de 05 y a limpiar la punta con papel absorbente
6132 Introducir la pipeta en el tubo que contenga solucioacuten de Turk y absorberhasta la marca de 11 (no debe haber burbujas)
6133 Tapar ambos extremos y proceder a mezclar manualmente o en unrotador automaacutetico por 2 oacute 3 minutos
6134 Monte la laminilla de vidrio en la caacutemara para recuento que debe estarlimpia y seca
6135 Agitar la pipeta y descartar las cuatro primeras gotas para luego colocaruna gota pequentildea de esta solucioacuten en la caacutemara
6136 Deje reposar por espacio de 3 minutos para que las ceacutelulas se sedimenten
6137 Enfocar con objetivo de 10x y contar en 4 cuadrados grandes angularesCuando se usa la pipeta automaacutetica se toma 20 mL (002 mL) desangre total con anticoagulante o sangre capilar con anticoagulante yse diluye en un tubo que contenga 380 mL de solucioacuten de Turk (aquiacutetenemos una dilucioacuten 120)
LECTURA
Fig 13
La lectura se realiza en los campos 1 3 7 y 9 como estaacute indicado en la figuraAdemaacutes de los leucocitos contados dentro de cada uno de los cuadrantes sedeben contar todos los leucocitos que se encuentren adheridos en la liacuteneahorizontal superior y vertical exterior o de lo contrario todos los leucocitosadheridos a la liacutenea horizontal inferior y vertical interior
614 Resultados
Nordm de leucocitos x mm3 = leucocitos contados en 4 camposdividealtura x dilucioacuten x aacuterea
Reemplazando = leucocitos contados en 4 camposdivide110 x 120 x 4=
Leucocitos contados en 4 camposdivide4200=
X1 divide4200= Nordm leucocitos contados x 50
615 Valores de referencia
5000 - 10 000 leucocitos mm3
616 Correccioacuten de valores para restar eritrocitos nucleados
Los normoblastos no se destruyen (lisis) en el liacutequido de dilucioacuten por lo tantopueden observarse al realizar el recuento leucocitario y confundirse con losleucocitos de tal manera que se debe emplear la siguiente foacutermula
Caacutelculo
La concentracioacuten del nuacutemero de normoblastos (por litro) esNuacutemero de normoblatos contados x concentracioacuten o nuacutemero de leucocitos100 + Nordm de normoblastos contados
Ejemplo
Si se cuentan 50 normoblastos y la concentracioacuten del nuacutemero de leucocitos es16 x 109l la concentracioacuten del nuacutemero de normoblastos seraacute
50 x16 = 53 x 109l
100 + 50
y la concentracioacuten de leucocitos corregida seraacute 16 - 53 = 107 x 109lEn unidades tradicionales las concentraciones de normoblastos y leucocitosse expresan por miliacutemetro cuacutebico En tales unidades el caacutelculo correspondienteal ejemplo que se ha dado seriacutea
50 x 16 000 = 5300 mm3
100 + 50
Recuento corregido de gloacutebulos blancos o leucocitos = 16 000 - 5300 = 10 700 mm3
Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2
62 RECUENTO DE GLOacuteBULOS ROJOS
Principio
La sangre se diluye en un liacutequido que nos permite observar claramente loshematiacutees luego esta dilucioacuten se coloca en una caacutemara de Neubauer con laayuda de una pipeta automaacutetica o pipeta Pasteur y se cuentan en el microscopioa un objetivo de 40x para calcular el nuacutemero de gloacutebulos rojos por mm3
621 Equipos
- Microscopio
- Hemocitoacutemetro (caacutemara de Neubauer)
622 Materiales y reactivos requeridos
6221 Pipeta de gloacutebulos rojos (De Thoma) o pipeta automaacutetica (de 0-100 mL)
Presenta cerca del extremo superior una marca de 101 inmediatamentecontinuacutea una dilatacioacuten (bulbo) que contiene una perla roja mezcladoraluego sigue el tallo (extremo maacutes largo) el cual estaacute dividido en 10 partescon 2 marcas 1 acabando el bulbo y 05 a la mitad del tallo Se requiereigual que el recuento de leucocitos una boquilla para aspirar
6222 Diluyente de gloacutebulos rojos Cloruro de Sodio al 09 (ver anexo)
Diluyente de Hayem (ver anexo)
6223 Contador manual (soacutelo si fuera necesario)
6224 Papel filtro
623 Procedimiento
6231 Mezclar la sangre obtenida con el anticoagulante o tomar sangre capilar
6232 Llenar la pipeta de gloacutebulos rojos con sangre hasta la marca de 05para realizar una dilucioacuten de 1200 y si se carga hasta 1 la dilucioacutenseraacute 1100 Limpiar la punta con gasa o papel absorbente
6233 Introducir la pipeta en el tubo o frasquito conteniendo diluyente (Hayem)y llenar de liacutequido de dilucioacuten hasta la marca de 101
6234 Se coloca en un rotador automaacutetico o se hace rotar manualmente de2 a 3 minutos
6235 Agitar bien la pipeta y descartar 3 a 4 gotas del tallo luego colocar unagota pequentildea cerca de un extremo de la caacutemara para que por capilaridadse llene exactamente
6236 Hacer el recuento con objetivo de 40xSe puede realizar con la pipeta automaacutetica se toma 20 mL (002mL)de sangre total con anticoagulante o sangre capilar y se deposita enun tubo de 12 x 75 que contenga 4 mL de solucioacuten de Hayem (aquiacute setiene una dilucioacuten de 1200) Se deja reposar aproximadamente 5minutos y se procede a cargar la caacutemara con la misma pipeta usandoun nuevo tip El inconveniente aquiacute es el gasto de reactivo (4 mL) perolas medidas son mas exactas
6237 Dejar en reposo por 3 minutos
6238 Enfocar la cuadriacutecula a 10x luego con el objetivo de 40x contar sobreel cuadrado grande central de la caacutemara soacutelo en 5 cuadrados pequentildeosuno central y cuatro angulares (80 cuadraditos en total)
6239 En el recuento se incluyen las ceacutelulas que cubren o tocan por dentroo por fuera las liacuteneas limitantes superior e izquierda en el cuadradopequentildeo de recuento y no se consideran los correspondientes a losliacutemites inferior y derechoSe hace el recuento en los puntos ABCD y Ey se sigue los mismos paraacutemetros del recuento de leucocitos
LECTURA
Fig 14
624 Resultados
Nordm de hematiacutees x mm3 = hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeosaltura x dilucioacuten X aacuterea
Reemplazando = hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeos110 x 1200 x 15
= hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeos divide 110 000
= hematiacutees contados x 10 000
625 Valores de referencia
(Unidades tradicionales millones de ceacutelulasmm3)
Hombres 4 500 000 - 5 500 000
Mujeres 4 000 000 - 5 000 000
Nintildeos (4 antildeos) 4 200 000 - 5 200 000
Lactantes (1 - 6 meses) 3 800 000 - 5 200 000
Recieacuten nacidos 5 000 000 - 6 000 000
Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2
63 DETERMINACIOacuteN DEL VOLUMEN GLOBULAR (Hematocrito)
Mide la fraccioacuten que comprende a los gloacutebulos rojos (masa globular) respectoal
volumen total de la muestra de sangre venosa o capilar Puede expresarseen
porcentaje o como valor decimal
Hto= altura de la columna de gloacutebulos rojosdivide altura de la columna de sangre
total(gloacutebulos rojos maacutes plasma)
631 Meacutetodo de Wintrobe
Materiales requeridos
- Tubo de Wintrobe graduado de 0 - 100 mm
- Pipetas Pasteur o pipetas de transferencia
- Tapoacuten de goma
Procedimiento
diams Llenar la sangre extraiacuteda con anticoagulante con una pipeta pasteur
comenzandodesde el fondo hasta la marca superior de 100 mm teniendocuidado
de no provocar espuma
diams Tapar el tubo con un tapoacuten de goma para evitar la evaporacioacuten
diams Centrifugar a 3000 rpm por 30 minutos
Resultados (lectura)
Del tubo graduado se mide directamente el nivel de la columna de gloacutebulosrojos
Valores de referencia
Hombres 40 - 54Mujeres 38 - 48
Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2
632 Meacutetodo de microhematocrito
Materiales requeridos
- Capilares rojos y azules (75 mm x 15 mm)
- Plastilina
Procedimiento
diams Tomar la muestra en capilares rojos heparinizados directamente del pulpejodel
dedo o utilizar capilares azules sin heparina para sangre venosacon
anticoagulante de Wintrobe o EDTA Debe llenarse aproximadamente70 - 80
del capilar
diams Ocluir (tapar) un extremo del capilar con plastilina
diams Colocar el capilar sobre la plataforma del cabezal de una centriacutefuga demicrohematocrito con el extremo ocluido adherido al reborde externo de laplataforma
diams Centrifugar por 5 minutos entre 10 000 - 12 000 rpm
Resultados (lectura)
La lectura se realiza con una escala estandarizada que expenden en el comercio
Uso de la escala
diams Sostenga el tubo frente a la escala de manera que el fondo de la columnade eritrocitos (no el extremo inferior del tubo) quede exactamente al mismonivel de la liacutenea horizontal correspondiente al cero
diams Desplace el tubo a traveacutes de la escala hasta que la liacutenea marcada con elnuacutemero 10 quede al nivel del tope de la columna de plasma Vigile que elfondo de la
columna de eritrocitos continuacutee sobre la liacutenea cero El tubodebe encontrarse completamente en posicioacuten vertical
diams La liacutenea que pase al nivel del tope de la columna de eritrocitos indicaraacute lafraccioacuten de volumen de eacutestos
Valores de referencia
Hombres 40 - 50
Mujeres 38 - 44
Nintildeos (5 antildeos) 38 - 44
Lactantes (3 meses) 37 - 42
Recieacuten nacidos 50 - 58
La disposicioacuten celular esParte superior una columna de plasmaEn la interfase estaacuten los leucocitos yplaquetasParte inferior estaacute la columna deeritrocitos (Fig 15)
64 DOSAJE DE HEMOGLOBINA
Principio
La sangre se diluye en liacutequido de Drabkin el cual hemoliza los hematiacutees yconvierte la hemoglobina en cianometahemoglobina (cianuro de hemiglobina)La solucioacuten que se produce se lee por medio de un espectrofotoacutemetro ofotocoloriacutemetro Su grado de absorbancia es proporcional a la cantidad dehemoglobina que contenga la sangre
641 Materiales y reactivos
6411 Un coloriacutemetro fotoeleacutectrico o un espectrofotoacutemetro
6412 Pipetas
diams Una pipeta para sangre (pipeta de Sahli) graduada hasta 002 mL contubo de goma y boquilla
diams Una pipeta de vidrio graduada de 5 mL
6413 Tubos de ensayo
6414 Reactivo de Drabkin para dilucioacuten
Este reactivo se puede adquirir en tabletas o polvos para disolver en 1litro de agua destilada Si se dispone de una balanza analiacutetica la preparacioacutense puede hacer en el laboratorio Esta solucioacuten se puedeconservar durante un mes en un frasco de vidrio oscuro Deseacutechese sise enturbia
Con el propoacutesito de uniformizar los procedimientos hematoloacutegicos que serealizan en los diversos laboratorios cliacutenicos el Instituto Nacional de Saludpone a disposicioacuten de la comunidad teacutecnico-cientiacutefica nacional el Manual deProcedimientos de Laboratorio en Teacutecnicas Baacutesicas de Hematologiacutea en elcual se incluyen todos los meacutetodos empleados en el campo hematoloacutegicobaacutesico De este modo se contribuye a mejorar la calidad de diagnoacutestico en loslaboratorios de los servicios de saludEl laboratorio de hematologiacutea cuenta con dos aacutereas baacutesicas Aacuterea deHematimetriacutea (hemograma VSE recuento de plaquetas etc) y Aacuterea deHemostasia Partiendo de esta estructura en este manual nos referiremos alas teacutecnicas baacutesicas empleadas en estas aacutereas partiendo de la toma de muestrahasta la realizacioacuten de las pruebas respectivasEs necesario enfatizar que para obtener resultados maacutes confiables es importantepero no imprescindible automatizar el laboratorio debido a que elloevitaraacute el posible error humano sobre todo en lo referente a recuentos celularesvalores de hemoglobina y constantes corpusculares ya que en estasvariables se trabaja con cantidades exactas de sangre hecho que es muydifiacutecil de lograr cuando se usan los meacutetodos manuales lo mismo sucede altratarse de las pruebas de hemostasiaEsperamos que este manual constituya una herramienta de consulta en laRed Nacional de Laboratorios de Salud ademaacutes de una guiacutea para el personalde laboratorio en general
INTRODUCCIOacuteN
El presente manual ha sido elaborado en forma simple didaacutectica y eminentementepraacutectica para que su contenido sea faacutecil de entender por el personalque labora en el laboratorio de hematologiacuteaSe divide en tres partes
1 En la primera parte se presentan los aspectos maacutes importantes de labioseguridad en el laboratorio
2 En la segunda parte se exponen las principales teacutecnicas baacutesicas del laboratoriode hematologiacutea
3 En la tercera parte se detallan las alteraciones maacutes frecuentes de la serieroja y de la serie blanca de un hemograma
El objetivo principal es protocolizar y estandarizar los procedimientoshematoloacutegicos que empiezan con la toma de muestra (siguiendo las pautasde control de calidad preanaliacutetica) hasta el procesamiento de eacutesta (fase analiacutetica)en la determinacioacuten correspondiente y por uacuteltimo en la emisioacuten de losresultados (fase postanaliacutetica) Debemos recalcar que cuando se realizanpruebas de hemostasia debe tenerse en consideracioacuten los cuidados comunesa toda prueba de laboratorio es decir las muestras deben obtenerse encondiciones apropiadas y rotularse debidamente Esperamos que el presentemanual sirva de guiacutea efectiva y que pueda ser enriquecido con nuevosaportes con la finalidad de alcanzar un trabajo de calidad
SECCIOacuteN 1
GENERALIDADES
11 OBJETIVO
Establecer y estandarizar los procedimientos baacutesicos de un examen dehemograma hemoglobina hematocrito recuento de plaquetas velocidad desedimentacioacuten y recuento de reticulocitos que sirvan de ayuda diagnoacutestica alcliacutenico
12 CAMPO DE APLICACIOacuteN
La aplicacioacuten de las teacutecnicas hematoloacutegicas nos sirve para estandarizar losprocedimientos a nivel nacional y para que sea de utilidad al personal teacutecnicoy profesional de los laboratorios cliacutenicos
13 RESPONSABILIDADES
131 El Centro Nacional de Laboratorios en Salud Puacuteblica a traveacutes de su
Direccioacuten Ejecutiva de Laboratorios de Referencia es responsable deautorizar la elaboracioacuten la revisioacuten y la actualizacioacuten del presente manualde acuerdo con los procedimientos aprobados por el Instituto Nacionalde Salud
132 Los directores de los establecimientos de salud son responsables deautorizar proporcionar los recursos necesarios y designar al personalresponsable para la aplicacioacuten de las disposiciones contenidas en elpresente manual
133 El personal de los establecimientos de salud es responsable de planificarlas acciones organizar controlar y capacitar al personal para cumplirlas disposiciones contenidas en el presente manual
134 Los jefes o responsables de los laboratorios deben asegurar el controlinterno de la calidad la idoneidad del personal equipos materialesreactivos e instalaciones
135 El personal meacutedico profesional y teacutecnico es responsable de seguir lasespecificaciones contenidas en el presente manual y aplicar los procedimientosespeciacuteficos indicados
14 DOCUMENTOS DE REFERENCIA
141 Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OrganizacioacutenPanamericana de la Salud Publicacioacuten cientiacutefica Nordm 439 Nordm 2 1983
142 Manual de normas de bioseguridad Instituto Nacional de Salud Serie deNormas Teacutecnicas Nordm 18 2ordf ed 1997
SECCIOacuteN 2
MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD
21 Para la obtencioacuten de muestras el personal involucrado en los diferentesprocesos para los exaacutemenes hematoloacutegicos debe aplicar las medidas debioseguridad establecidas en el Manual de Bioseguridad Serie de NormasTeacutecnicas Nordm 18
22 Se debe controlar sobre todo
221 Al personal que trabaja en el laboratorio de hematologiacutea
222 El proceso de coloracioacuten en el que se debe aplicar las medidas debioseguridad correspondientes al uso y manipulacioacuten de sustanciastoacutexicas o canceriacutegenas
223 Ver lo referente a medidas de proteccioacuten en caso de accidentes porinoculacioacuten
SECCIOacuteN 3
OBTENCIOacuteN DE MUESTRAS SANGUIacuteNEAS
31 OBJETIVO
Establecer y uniformizar criterios en el procedimiento de obtencioacuten de muestrassanguiacuteneas con un adecuado control de calidad ya que de ello dependeque el resultado del anaacutelisis de la muestra sea el correcto Se efectuaraacute enayunas o no dependiendo de la prueba a usar
32 OBTENCIOacuteN DE SANGRE VENOSA CON JERINGA
321 Materiales y equipos requeridos
3211 Algodoacuten
3212 Alcohol al 70
3213 Ligadura o torniquete de 25 a 30 cm de largo
3214 Jeringas de 5 mL
3215 Viales con anticoagulante EDTA
322 Obtencioacuten de la muestra
3221 Verificar que los elementos por utilizar esteacuten listos y que el pacientese sienta coacutemodo
3222 Aplicar el torniquete aproximadamente cuatro dedos por encima de laflexioacuten del codo o a 10 cm del codo sujetar con un medio nudo (Fig 1)
3223 Limpiar la zona con alcohol al 70 o alcohol yodado en un aacuterea de 2pulgadas (Fig 2)
3224 El paciente deberaacute abrir y cerrar la mano durante unos segundos ydespueacutes la mantendraacute cerrada esto ayudaraacute a visualizar las venassuperficiales (Fig 3)
3225 Se retira el estuche protector de la aguja y se coge la jeringa de talmanera que el bisel se encuentre hacia arriba (Fig 4)
3226 Se coloca la aguja en direccioacuten paralela a la vena se perfora la pielhaciendo avanzar la aguja 05-1 cm en el tejido subcutaacuteneo luego seperfora la vena (Fig 5)
3227 Se aspira la jeringa hasta el volumen requerido
3228 Retirar el torniquete e indicar al paciente que deje de hacer puntildeo Secoloca el algodoacuten seco encima de la puncioacuten y se retira la aguja (Fig 6)
3229 Retirar la aguja de la jeringa Verter la muestra lentamente por lasparedes del vial con anticoagulante No olvidar colocar una gota en lalaacutemina portaobjeto para realizar el frotis
32210 Agitar el vial en ciacuterculos sobre la mesa para homogeneizar la muestracon el anticoagulante
PUNTOS PARA LA EXTRACCIOacuteN DE SANGRE
(Toma de muestra)
Se obtiene de las venas de la fosa cubital
PROCEDIMIENTO
Fig 1 Fig 2 Fig 3
Fig 4 Fig 5
Fig 6 Fig 7
33 OBTENCIOacuteN DE SANGRE VENOSA EN TUBOS AL VACIacuteO
331 Materiales requeridos
3311 Algodoacuten
3312 Alcohol al 70
3313 Ligadura o torniquete de 25 a 30 cm de largo
3314 Tubos al vaciacuteo con anticoagulante EDTA (K3) EDTA (Na2) u otroanticoagulante
3315 Agujas con dispositivo para extraccioacuten de sangre al vaciacuteo
- Nordm 21 para adultos
- Nordm 22 para nintildeos y neonatos
De preferencia ambas de bisel corto para evitar la coagulacioacuten
332 Obtencioacuten de la muestra
3321 Repetir los pasos de 3221 a 3224
3322 Se retira el estuche protector de la aguja y eacuteste se enrosca al dispositivopara extraccioacuten de sangre al vaciacuteo
3323 Colocar la ligadura cuatro dedos por encima de la flexioacuten del codo o10 cm por encima de eacuteste y pedir al paciente que abra y cierre la manovarias veces para favorecer la dilatacioacuten de las venas
3324 Una vez escogida la vena desinfectarla con una pieza de algodoacutenembebido en etanol al 70
3325 Se coloca la aguja en direccioacuten paralela a la vena se perfora la pielhaciendo avanzar la aguja entre 05 cm y 1 cm en el tejido subcutaacuteneose inserta el tubo al vaciacuteo por la parte posterior y no preocuparse porla cantidad de sangre extraiacuteda ya que el mismo sonido del vaciacuteo avisaraacuteque la extraccioacuten terminoacute (Fig 8)
3326 Retirar la ligadura tirando del extremo doblado
3327 Colocar un pedazo de algodoacuten seco sobre la parte donde se encuentraoculta la aguja Sacar la aguja con un movimiento raacutepido y depositarlaen el recipiente de metal con desinfectante (Fig 9)
3328 Pedir al paciente que presione firmemente el algodoacuten durante 3 minutoscon el brazo extendido No se recomienda que se flexione el brazoa causa del riesgo que se forme un hematoma
3329 Mezclar por inmersioacuten suave la sangre con el anticoagulante contenidoen el tubo No agitar el contenido
Fig 8 Fig 9
333 Ventajas de una extraccioacuten de sangre venosa
3331 Pueden hacerse repetidos exaacutemenes con la misma muestra
3332 Parte de la muestra (plasma o suero) puede congelarse para referenciafutura
334 Desventajas de una extraccioacuten de sangre venosa
3341 La puncioacuten venosa por su largo procedimiento requiere mayor preparacioacuten que el meacutetodo capilar
3342 El meacutetodo es teacutecnicamente difiacutecil en nintildeos individuos obesos y pacientes en shock
3343 La hemoacutelisis debe ser evitada pues se puede obtener una disminucioacuten en el recuento de eritrocitos
3344 Debe evitarse prolongada estasis venosa producida por el torniquete pues produce hemoacutelisis y otros cambios que ponen la sangre en un estado inadecuado para el anaacutelisis de gases recuentos celulares determinacioacuten de pH sanguiacuteneo y algunas pruebas de coagulacioacuten
3345 La sangre anticoagulada si no es de obtencioacuten reciente no debe ser utilizada en extensiones de sangre pues algunos anticoagulantes producen cambios en las plaquetas que pueden causar aglutinaciones agregacioacuten plaquetaria y dificultan la identificacioacuten de leucocitos
3346 Puesto que algunos de los componentes de la sangre no son estables los recuentos de leucocitos y plaquetas e iacutendice de sedimentacioacuten deben realizarse antes de que pasen dos horas desde que se obtuvo la muestra
34 OBTENCIOacuteN DE SANGRE DE LA VENA YUGULAR EXTERNA
341 Materiales requeridos
3411 Algodoacuten
3412 Alcohol al 70
3413 Jeringas de 5 mL
3414 Viales con anticoagulante EDTA
342 Obtencioacuten de la muestra
3421 El paciente es cubierto por una saacutebana de manera que los brazospermanezcan inmovilizados a lo largo del cuerpo
3422 Al paciente se le coloca de cuacutebito dorsal sobre la mesa de examen ouna
camilla de manera que la cabeza cuelgue sobre el final de lamesa y el cuerpo sea
sujetado por un asistente
3423 Cuando el paciente grita la vena yugular externa se marca claramente
3424 Limpiar la zona en un aacuterea de 2 pulgadas con alcohol al 70 o
alcoholyodado
3425 Se repiten los pasos de 3225 a 3227 de la extraccioacuten de sangrevenosa
con jeringa
3426 Retirar la aguja de la vena y presionar suavemente con un algodoacutenseco
aproximadamente de 3 a 5 minutos Pedir al paciente que permanezcaechado diez
minutos
3427 Se repiten los pasos de 3229
3428 Se repiten los pasos de 32210
343 Ventajas
Constituye un buen meacutetodo para la obtencioacuten de sangre en pacientes conshock
con venas colapsadas
344 Desventajas
Por lo delicado en su procedimiento no se recomienda como rutina soacutelo encasos
en que no se pueda obtener la muestra por meacutetodos convencionales
35 OBTENCIOacuteN DE SANGRE CAPILAR
Cuando la cantidad de sangre que se precisa es muy pequentildea o cuando
pordiferentes motivos no pueda practicarse una puncioacuten venosa debe recurrirse
a la puncioacuten capilar
351 Materiales requeridos
3512 Algodoacuten
3513 Alcohol al 70
3514 Lancetas desechables (Fig 10)
3515 Papel filtro Nordm 2
352 Procedimiento (Fig 11)
3521 La sangre capilar se obtiene de la cara lateral del dedo medio o anularen los adultos y del dedo gordo del pie o taloacuten en los nintildeos
3522 Desinfectar la zona con alcohol al 70 secar con algodoacuten esteacuteril
3523 Punzar la piel con una lanceta esteacuteril desechable (2 mm de profundidad)
3524 Usar gasa esteacuteril para desechar la primera gota y recoger las siguientesen tubos capilares Evitar comprimir la extremidad para obtenersangre porque se altera la composicioacuten sanguiacutenea
353 Ventajas
3531 Puede obtenerse con facilidad
3532 Es preferible cuando han de realizarse extensiones de sangre perifeacuterica
354 Desventajas
3541 Soacutelo se pueden obtener pequentildeas cantidades de sangre y los exaacutemenesde repeticioacuten requieren nuevas muestras
3542 La sangre en microtubos (capilares) frecuentemente se hemolizainterfiendo con la mayoriacutea de pruebas de laboratorio
3543 Los resultados obtenidos en pruebas con sangre capilar no puedenser comparados con los resultados de las pruebas con sangre venosa
3544 El dedo no soacutelo es delicado sino difiacutecil de desinfectar adecuadamenteen el tiempo disponible
3545 En pacientes con resistencia disminuida a la infeccioacuten (aquellos conleucemia agranulocitosis diabetes uremia y enfermedades con deficienciasinmunoloacutegicas) una muestra tomada del dedo es mucho maacutesprobable que conduzca a una infeccioacuten que otra tomada del brazo
3546 El recuento de eritrocitos y leucocitos asiacute como el recuento deplaquetas y reticulocitos no debe realizarse en sangre capilar debidoa la difiacutecil estandarizacioacuten del flujo sanguiacuteneo capilar
EXTRACCIOacuteN DE SANGRE CAPILAR
Fig 10
Fig 11
SECCIOacuteN 4
ANTICOAGULANTES
Una vez extraiacuteda la sangre eacutesta puede conservarse coagulada o
mantenidaincoagulable mediante la adicioacuten de un anticoagulante
41 CARACTERIacuteSTICAS BAacuteSICAS DE LOS ANTICOAGULANTES MAacuteS
USADOSEN HEMATOLOGIacuteA
bull No alterar el tamantildeo de los hematiacutees
bull No producir hemoacutelisis
bull Evitar al maacuteximo la agregacioacuten plaquetaria
bull No alterar la morfologiacutea de los leucocitos
La sangre tratada con anticoagulante debe procesarse lo antes posible
inclusomantenida bajo refrigeracioacuten (4 ordmC) si no pasan de las 2 horas El
tiempomaacuteximo entre la extraccioacuten de la sangre y su procesamiento depende
delcoagulante de eleccioacuten y no debe ser maacutes de 4 horas a excepcioacuten
delanticoagulante EDTA (etilendiaminotetraceacutetico) que puede ser hasta 24
horas(en refrigeracioacuten a 4 ordmC)
Los anticoagulantes pueden emplearse en forma soacutelida o liacutequida Los
primerosestaacuten indicados para la determinacioacuten de los paraacutemetros
hematoloacutegicosya que no producen como los anticoagulantes liacutequidos dilucioacuten de
la sangre
42 ANTICOAGULANTES SOacuteLIDOS
421 EDTA
Es la sal disoacutedica o tripotaacutesica del aacutecido etilendiaminotetraceacutetico La saldisoacutedica
(Na2EDTA) es menos soluble que la sal tripotaacutesica (K3EDTA) Estoscompuestos
realizan su accioacuten a traveacutes de un efecto quelante sobre el calcioal fijarlo impiden
su activacioacuten y por ende la coagulacioacuten sanguiacutenea
4211 Ventajas
bull Respeta la morfologiacutea eritrocitaria (especialmente la sal tripotaacutesica) yleucocitaria de manera que permite una demora de dos horas en la realizacioacutendel frotis sanguiacuteneo despueacutes de la extraccioacuten sanguiacutenea
bull Asegura la conservacioacuten de los elementos formes sanguiacuteneos durante 24horas si la sangre se mantiene a 4 ordmC
bull Al inhibir la aglutinacioacuten de las plaquetas facilita su recuento o su expresioacutensemicuantitativa a partir del frotis
bull La concentracioacuten recomendada de EDTA es de 15 mgmL de sangre Unamayor cantidad de anticoagulante puede producir retraccioacuten celular condisminucioacuten del hematocrito y un aumento de la concentracioacuten media de lahemoglobina Un exceso de sangre con relacioacuten al anticoagulante produceformacioacuten de microagregados que pueden alterar los resultados El empleode tubos al vaciacuteo con una gota (50mL) de EDTA tripotaacutesica comercialpara 5 mL de sangre es de intereacutes praacutectico dado que es cien veces maacutessoluble facilitando la mezcla de sangre con anticoagulante
4212 Desventajas
Usado en exceso afecta a los eritrocitos y a los leucocitos a los cuales les produce encogimiento y cambios en su forma por ello debe cuidarse de agregar la cantidad correcta de sangre al anticoagulante
422 Anticoagulante de Wintrobe
Es una mezcla de oxalato de amonio y potasio Actuacutea por precipitacioacuten del calcio es faacutecil de preparar Se emplea en forma de polvo en proporcioacuten de 2 de oxalato de amonio por 1 de oxalato de potasio La cantidad recomendada es de 2 mg x mL de sangre Este anticoagulante no afecta el volumen globular medio y puede usarse para determinaciones de hemoglobina hematocrito y recuento globular pero para los extendidos queda limitada a los primeros minutos tampoco es uacutetil para el recuento plaquetario porque produce formacioacuten de agregados plaquetarios
423 Heparina
El nombre de heparina proviene del griego hepar que significa hiacutegado ya que fue aislado por primera vez de las ceacutelulas de este tejido Es un mucopolisacaacuterido aacutecido Presenta el
inconveniente de que si no se agita raacutepidamente con la sangre despueacutes de extraiacuteda
pueden formarse microcoaacutegulos aunque no altera el volumeneritrocitario ni la morfologiacutea de los leucocitos No es recomendablepara el frotis sanguiacuteneo porque produce un fondo azul en la laacutemina
La heparina de sodio o litio puede usarse en forma soacutelida o liacutequida en
proporcioacutende 01 - 02 mg de heparina por 1 mL de sangre
43 ANTICOAGULANTES LIacuteQUIDOS
431 Citrato trisoacutedico
Es de eleccioacuten para las pruebas de hemostasia y la velocidad de sedimentacioacuten
Actuacutea a traveacutes de la precipitacioacuten del calcio La concentracioacuten depende de
la prueba por realizar
bull Para pruebas de hemostasia se emplea en proporcioacuten de 1 9 (05 mL
deanticoagulante para 45 mL de sangre total)
bull Para la determinacioacuten de la VSG (Velocidad de Sedimentacioacuten Globular) es14
(05 mL de anticoagulante para 2 mL de sangre)
432 Oxalato soacutedico
Recomendado tambieacuten para las pruebas de hemostasia Se emplea en
proporcioacutende un volumen de anticoagulante para 4 vol de sangre
SECCIOacuteN 5
REALIZACIOacuteN Y TINCIOacuteN DEL FROTIS SANGUIacuteNEO
La praacutectica del frotis sanguiacuteneo tambieacuten llamado extendido es de gran importanciaen hematologiacutea ya que el diagnoacutestico de muchas enfermedadeshematoloacutegicas puede realizarse con soacutelo observar las caracteriacutesticasmorfoloacutegicas de las ceacutelulas sanguiacuteneas de manera que eacuteste no debe serexcesivamente grueso ni excesivamente fino Todas las laacuteminas por usarsobre todo nuevas deben ser limpiadas con algodoacuten y alcohol al 70 paraeliminar la grasa que viene adherida
51 MEacuteTODO DE LOS DOS PORTAOBJETOS
511 Materiales
- Alcohol al 70
- Algodoacuten
- Lanceta descartable
- Portaobjetos de vidrios limpios y desgrasados (25 x 75 mm)
512 Fundamento
Consiste en la extensioacuten de una gota de sangre sobre un portaobjeto (25 x 75)empleando el canto biselado de otro portaobjeto de igual dimensioacuten (Fig 12)
513 Procedimiento
5131 Una vez extraiacuteda la sangre con cualquiera de las metodologiacuteas secoloca una pequentildea gota de sangre (5mL) (aprox 3 mm de diaacutemetro)sobre un portaobjeto a 2 cm aproximadamente de uno de los extremos
5132 Colocar el canto de otro portaobjeto esmerilado sobre la superficiedel primer portaobjeto (en la que se encuentra la gota de sangre)formando un aacutengulo de 45ordm
5134 Deslizar suavemente y a velocidad moderada el portaobjeto sobre elotro en sentido longitudinal hasta que la gota de sangre quede bienextendida sobre la
superficie del primer portaobjeto El grosor delfrotis sanguiacuteneo puede variar seguacuten sea el aacutengulo que formen entresiacute ambos portaobjetos Asiacute si es superior a 45ordm la extensioacuten obtenidaseraacute gruesa y corta si es inferior a 45ordm seraacute larga y fina El secado delfrotis es a temperatura ambiente y en posicioacuten horizontal
Fig 12
1048729 Zona excesivamente gruesa Se halla en la regioacuten inmediata al punto departida de la extensioacuten (cabeza) En ella se aprecia siempre un aumento delinfocitos
1048729 Zona excesivamente fina Corresponde al final de la extensioacuten y termina enun aacuterea donde las ceacutelulas adoptan una posicioacuten acartonada (barbas) Enesta regioacuten existe un exceso de granulocitos y monocitos
1048729 Zona ideal Corresponde a la regioacuten intermedia del frotis y en ella existe unreparto equilibrado de ceacutelulas
52 COLORACIONES USADAS
Una vez seco el frotis se procede a la tincioacuten hematoloacutegica con el colorante deRomanowsky constituido por la mezcla de eosina y azul de metileno Dentrode eacutestas tenemos
521 Colorante de Giemsa
522 Colorante de May-Grunwald
523 Colorante de Wright
524 Colorante de Leishman
Preparacioacuten de colorantes (Anexo A)
1048729 Para el estudio de las ceacutelulas sanguiacuteneas utilizar el colorante 523 y 524
1048729 Para el estudio de hemoparaacutesitos utilizar el colorante 521
1048729 Utilizar el colorante 522 para casos especiales en que se desee observar
con mayor claridad y especificidad los graacutenulos de los neutrofilos
53 TINCIOacuteN CON COLORANTE DE WRIGHT
531 Fundamento
El colorante de Wright va a permitir suministrar un medio para estudiar lasangre y determinar las variaciones y anormalidades de estructura forma ytamantildeo de los eritrocitos su contenido de hemoglobina y sus propiedades decoloracioacuten La informacioacuten obtenida de un frotis de sangre perifeacuterica dependeen gran parte de la calidad del extendido y la coloracioacuten
532 Materiales
5321 Colorante de Wright (Anexo A)
5322 Frasco gotero
5323 Solucioacuten amortiguada tamponada (Anexo A)
533 Procedimiento
5331 Una vez obtenido el frotis sanguiacuteneo se le dejaraacute secar entre 15 y 20minutos
5332 Luego se coloca la preparacioacuten en un soporte y se cubre con el colorantede Wright dejaacutendolo por espacio de 5 minutos
5333 Posteriormente se antildeade solucioacuten amortiguada tamponada en partesiguales hasta obtener un brillo metaacutelico dejando 6 minutos adicionales
5334 Finalmente se lava con agua corriente y se deja secar
5335 Se coloca en el microscopio y con pequentildeo aumento se revisa lacalidad de la coloracioacuten la cantidad aproximada de gloacutebulos blancosy se escoge el sitio para iniciar el recuento Se coloca una gota deaceite de inmersioacuten y se enfoca a un aumento de 100xLa forma de los gloacutebulos rojos se examinaraacute detenidamente observandoademaacutes del color (cantidad de hemoglobina) presencia deplaquetas su agrupacioacuten y distribucioacuten
5336 Posteriormente se hace el recuento diferencial de gloacutebulos blancosen 100
ceacutelulas para lo cual se deberaacute conocer las diferencias entreneutroacutefilos eosinoacutefilos
linfocitos y monocitosUna extensioacuten de sangre bien tentildeida debe caracterizarse
por unabuena diferenciacioacuten de las estructuras subcelulares en los leucocitosuna
coloracioacuten rosada de los hematiacutees y la ausencia de precipitados
Los defectos maacutes frecuentes observados en la tincioacuten del frotis sanguiacuteneoson
Coloracioacuten excesivamente azul debido a
1048729 Frotis excesivamente grueso
1048729 Lavado insuficiente
1048729 Tincioacuten muy prolongada
1048729 Empleo de colorante excesivamente alcalino
Coloracioacuten con una tonalidad rosada
1048729 El colorante el tampoacuten o el agua de lavado tienen un pH demasiadoaacutecido
Presencia de precipitados
1048729 Obedecen a una accioacuten excesiva del colorante Esto se puede evitarcon la
filtracioacuten
SECCIOacuteN 6
HEMOGRAMA-HEMOGLOBINA-HEMATOCRITO
El hemograma de Shilling constituye uno de los exaacutemenes de laboratorio
maacutesusados en el campo de la hematologiacutea Comprende las siguientes pruebas
61 RECUENTO LEUCOCITARIO
Principio
La sangre anticoagulada se deposita en un liacutequido que permite evidenciar
losleucocitos mantenieacutendolos visibles mientras que los eritrocitos
sonhemolizados El recuento del nuacutemero de leucocitos o gloacutebulos blancos se
expresapor mm3 (miliacutemetro cuacutebico)
611 Equipos
- Microscopio
- Hemocitoacutemetro (Caacutemara de Neubauer)
Consta de los siguientes elementos
diams Una laacutemina portaobjeto gruesa en el centro se hallan dos
superficiescuadriculadas iguales separadas del resto de la laacutemina por surcos y
dosbarras transversales algo maacutes elevadas
diams Una laminilla cubreobjetos oacutepticamente plana que al colocarse sobrelas barras
elevadas de la laacutemina forma una caacutemara entre el cubreobjetosy la superficie
cuadriculadaLa altura entre el cubreobjetos y la laacutemina portaobjetos es de 01
mmCada cuadriacutecula mide 3 mm de lado y se divide en 9 cuadrados grandesCada
uno de los cuales mide 1 mm2 de superficie que se subdivide a suvez en 16
cuadrados medianos El cuadrado grande central se divide en25 cuadrados
pequentildeos y cada uno de ellos en 16 cuadraditos Cadacuadrado pequentildeo mide
02 mm de lado (004 mm2 de superficie) y cadacuadradito mide 005 mm de lado
(00025 mm2 de superficie)
612 Materiales y reactivos requeridos
6121 Pipeta de gloacutebulos blancos (De Thoma) o pipeta automaacutetica (de 0 a 100 mL)Presenta cerca del extremo superior una marca de 11 inmediatamentecontinuacutea una dilatacioacuten (bulbo) que contiene una perla que funciona comomezcladora luego sigue el extremo maacutes largo de la pipeta (tallo) que estaacutedividida en 10 partes con 2 marcas 1 (parte final del bulbo) y 05 (a la mitaddel tallo) Se le acopla a su extremo superior 1 tubo de goma y una bombillapara aspirar
6122 Diluyente de gloacutebulos blancos Solucioacuten de Turk al 1
6123 Contador manual (Soacutelo si fuera necesario)
6124 Papel filtro
613 Procedimiento
6131 Una vez obtenida la sangre con anticoagulante o sangre capilar deldedo se procede a aspirar la sangre con la pipeta de gloacutebulos blancoshasta la marca de 05 y a limpiar la punta con papel absorbente
6132 Introducir la pipeta en el tubo que contenga solucioacuten de Turk y absorberhasta la marca de 11 (no debe haber burbujas)
6133 Tapar ambos extremos y proceder a mezclar manualmente o en unrotador automaacutetico por 2 oacute 3 minutos
6134 Monte la laminilla de vidrio en la caacutemara para recuento que debe estarlimpia y seca
6135 Agitar la pipeta y descartar las cuatro primeras gotas para luego colocaruna gota pequentildea de esta solucioacuten en la caacutemara
6136 Deje reposar por espacio de 3 minutos para que las ceacutelulas se sedimenten
6137 Enfocar con objetivo de 10x y contar en 4 cuadrados grandes angularesCuando se usa la pipeta automaacutetica se toma 20 mL (002 mL) desangre total con anticoagulante o sangre capilar con anticoagulante yse diluye en un tubo que contenga 380 mL de solucioacuten de Turk (aquiacutetenemos una dilucioacuten 120)
LECTURA
Fig 13
La lectura se realiza en los campos 1 3 7 y 9 como estaacute indicado en la figuraAdemaacutes de los leucocitos contados dentro de cada uno de los cuadrantes sedeben contar todos los leucocitos que se encuentren adheridos en la liacuteneahorizontal superior y vertical exterior o de lo contrario todos los leucocitosadheridos a la liacutenea horizontal inferior y vertical interior
614 Resultados
Nordm de leucocitos x mm3 = leucocitos contados en 4 camposdividealtura x dilucioacuten x aacuterea
Reemplazando = leucocitos contados en 4 camposdivide110 x 120 x 4=
Leucocitos contados en 4 camposdivide4200=
X1 divide4200= Nordm leucocitos contados x 50
615 Valores de referencia
5000 - 10 000 leucocitos mm3
616 Correccioacuten de valores para restar eritrocitos nucleados
Los normoblastos no se destruyen (lisis) en el liacutequido de dilucioacuten por lo tantopueden observarse al realizar el recuento leucocitario y confundirse con losleucocitos de tal manera que se debe emplear la siguiente foacutermula
Caacutelculo
La concentracioacuten del nuacutemero de normoblastos (por litro) esNuacutemero de normoblatos contados x concentracioacuten o nuacutemero de leucocitos100 + Nordm de normoblastos contados
Ejemplo
Si se cuentan 50 normoblastos y la concentracioacuten del nuacutemero de leucocitos es16 x 109l la concentracioacuten del nuacutemero de normoblastos seraacute
50 x16 = 53 x 109l
100 + 50
y la concentracioacuten de leucocitos corregida seraacute 16 - 53 = 107 x 109lEn unidades tradicionales las concentraciones de normoblastos y leucocitosse expresan por miliacutemetro cuacutebico En tales unidades el caacutelculo correspondienteal ejemplo que se ha dado seriacutea
50 x 16 000 = 5300 mm3
100 + 50
Recuento corregido de gloacutebulos blancos o leucocitos = 16 000 - 5300 = 10 700 mm3
Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2
62 RECUENTO DE GLOacuteBULOS ROJOS
Principio
La sangre se diluye en un liacutequido que nos permite observar claramente loshematiacutees luego esta dilucioacuten se coloca en una caacutemara de Neubauer con laayuda de una pipeta automaacutetica o pipeta Pasteur y se cuentan en el microscopioa un objetivo de 40x para calcular el nuacutemero de gloacutebulos rojos por mm3
621 Equipos
- Microscopio
- Hemocitoacutemetro (caacutemara de Neubauer)
622 Materiales y reactivos requeridos
6221 Pipeta de gloacutebulos rojos (De Thoma) o pipeta automaacutetica (de 0-100 mL)
Presenta cerca del extremo superior una marca de 101 inmediatamentecontinuacutea una dilatacioacuten (bulbo) que contiene una perla roja mezcladoraluego sigue el tallo (extremo maacutes largo) el cual estaacute dividido en 10 partescon 2 marcas 1 acabando el bulbo y 05 a la mitad del tallo Se requiereigual que el recuento de leucocitos una boquilla para aspirar
6222 Diluyente de gloacutebulos rojos Cloruro de Sodio al 09 (ver anexo)
Diluyente de Hayem (ver anexo)
6223 Contador manual (soacutelo si fuera necesario)
6224 Papel filtro
623 Procedimiento
6231 Mezclar la sangre obtenida con el anticoagulante o tomar sangre capilar
6232 Llenar la pipeta de gloacutebulos rojos con sangre hasta la marca de 05para realizar una dilucioacuten de 1200 y si se carga hasta 1 la dilucioacutenseraacute 1100 Limpiar la punta con gasa o papel absorbente
6233 Introducir la pipeta en el tubo o frasquito conteniendo diluyente (Hayem)y llenar de liacutequido de dilucioacuten hasta la marca de 101
6234 Se coloca en un rotador automaacutetico o se hace rotar manualmente de2 a 3 minutos
6235 Agitar bien la pipeta y descartar 3 a 4 gotas del tallo luego colocar unagota pequentildea cerca de un extremo de la caacutemara para que por capilaridadse llene exactamente
6236 Hacer el recuento con objetivo de 40xSe puede realizar con la pipeta automaacutetica se toma 20 mL (002mL)de sangre total con anticoagulante o sangre capilar y se deposita enun tubo de 12 x 75 que contenga 4 mL de solucioacuten de Hayem (aquiacute setiene una dilucioacuten de 1200) Se deja reposar aproximadamente 5minutos y se procede a cargar la caacutemara con la misma pipeta usandoun nuevo tip El inconveniente aquiacute es el gasto de reactivo (4 mL) perolas medidas son mas exactas
6237 Dejar en reposo por 3 minutos
6238 Enfocar la cuadriacutecula a 10x luego con el objetivo de 40x contar sobreel cuadrado grande central de la caacutemara soacutelo en 5 cuadrados pequentildeosuno central y cuatro angulares (80 cuadraditos en total)
6239 En el recuento se incluyen las ceacutelulas que cubren o tocan por dentroo por fuera las liacuteneas limitantes superior e izquierda en el cuadradopequentildeo de recuento y no se consideran los correspondientes a losliacutemites inferior y derechoSe hace el recuento en los puntos ABCD y Ey se sigue los mismos paraacutemetros del recuento de leucocitos
LECTURA
Fig 14
624 Resultados
Nordm de hematiacutees x mm3 = hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeosaltura x dilucioacuten X aacuterea
Reemplazando = hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeos110 x 1200 x 15
= hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeos divide 110 000
= hematiacutees contados x 10 000
625 Valores de referencia
(Unidades tradicionales millones de ceacutelulasmm3)
Hombres 4 500 000 - 5 500 000
Mujeres 4 000 000 - 5 000 000
Nintildeos (4 antildeos) 4 200 000 - 5 200 000
Lactantes (1 - 6 meses) 3 800 000 - 5 200 000
Recieacuten nacidos 5 000 000 - 6 000 000
Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2
63 DETERMINACIOacuteN DEL VOLUMEN GLOBULAR (Hematocrito)
Mide la fraccioacuten que comprende a los gloacutebulos rojos (masa globular) respectoal
volumen total de la muestra de sangre venosa o capilar Puede expresarseen
porcentaje o como valor decimal
Hto= altura de la columna de gloacutebulos rojosdivide altura de la columna de sangre
total(gloacutebulos rojos maacutes plasma)
631 Meacutetodo de Wintrobe
Materiales requeridos
- Tubo de Wintrobe graduado de 0 - 100 mm
- Pipetas Pasteur o pipetas de transferencia
- Tapoacuten de goma
Procedimiento
diams Llenar la sangre extraiacuteda con anticoagulante con una pipeta pasteur
comenzandodesde el fondo hasta la marca superior de 100 mm teniendocuidado
de no provocar espuma
diams Tapar el tubo con un tapoacuten de goma para evitar la evaporacioacuten
diams Centrifugar a 3000 rpm por 30 minutos
Resultados (lectura)
Del tubo graduado se mide directamente el nivel de la columna de gloacutebulosrojos
Valores de referencia
Hombres 40 - 54Mujeres 38 - 48
Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2
632 Meacutetodo de microhematocrito
Materiales requeridos
- Capilares rojos y azules (75 mm x 15 mm)
- Plastilina
Procedimiento
diams Tomar la muestra en capilares rojos heparinizados directamente del pulpejodel
dedo o utilizar capilares azules sin heparina para sangre venosacon
anticoagulante de Wintrobe o EDTA Debe llenarse aproximadamente70 - 80
del capilar
diams Ocluir (tapar) un extremo del capilar con plastilina
diams Colocar el capilar sobre la plataforma del cabezal de una centriacutefuga demicrohematocrito con el extremo ocluido adherido al reborde externo de laplataforma
diams Centrifugar por 5 minutos entre 10 000 - 12 000 rpm
Resultados (lectura)
La lectura se realiza con una escala estandarizada que expenden en el comercio
Uso de la escala
diams Sostenga el tubo frente a la escala de manera que el fondo de la columnade eritrocitos (no el extremo inferior del tubo) quede exactamente al mismonivel de la liacutenea horizontal correspondiente al cero
diams Desplace el tubo a traveacutes de la escala hasta que la liacutenea marcada con elnuacutemero 10 quede al nivel del tope de la columna de plasma Vigile que elfondo de la
columna de eritrocitos continuacutee sobre la liacutenea cero El tubodebe encontrarse completamente en posicioacuten vertical
diams La liacutenea que pase al nivel del tope de la columna de eritrocitos indicaraacute lafraccioacuten de volumen de eacutestos
Valores de referencia
Hombres 40 - 50
Mujeres 38 - 44
Nintildeos (5 antildeos) 38 - 44
Lactantes (3 meses) 37 - 42
Recieacuten nacidos 50 - 58
La disposicioacuten celular esParte superior una columna de plasmaEn la interfase estaacuten los leucocitos yplaquetasParte inferior estaacute la columna deeritrocitos (Fig 15)
64 DOSAJE DE HEMOGLOBINA
Principio
La sangre se diluye en liacutequido de Drabkin el cual hemoliza los hematiacutees yconvierte la hemoglobina en cianometahemoglobina (cianuro de hemiglobina)La solucioacuten que se produce se lee por medio de un espectrofotoacutemetro ofotocoloriacutemetro Su grado de absorbancia es proporcional a la cantidad dehemoglobina que contenga la sangre
641 Materiales y reactivos
6411 Un coloriacutemetro fotoeleacutectrico o un espectrofotoacutemetro
6412 Pipetas
diams Una pipeta para sangre (pipeta de Sahli) graduada hasta 002 mL contubo de goma y boquilla
diams Una pipeta de vidrio graduada de 5 mL
6413 Tubos de ensayo
6414 Reactivo de Drabkin para dilucioacuten
Este reactivo se puede adquirir en tabletas o polvos para disolver en 1litro de agua destilada Si se dispone de una balanza analiacutetica la preparacioacutense puede hacer en el laboratorio Esta solucioacuten se puedeconservar durante un mes en un frasco de vidrio oscuro Deseacutechese sise enturbia
El presente manual ha sido elaborado en forma simple didaacutectica y eminentementepraacutectica para que su contenido sea faacutecil de entender por el personalque labora en el laboratorio de hematologiacuteaSe divide en tres partes
1 En la primera parte se presentan los aspectos maacutes importantes de labioseguridad en el laboratorio
2 En la segunda parte se exponen las principales teacutecnicas baacutesicas del laboratoriode hematologiacutea
3 En la tercera parte se detallan las alteraciones maacutes frecuentes de la serieroja y de la serie blanca de un hemograma
El objetivo principal es protocolizar y estandarizar los procedimientoshematoloacutegicos que empiezan con la toma de muestra (siguiendo las pautasde control de calidad preanaliacutetica) hasta el procesamiento de eacutesta (fase analiacutetica)en la determinacioacuten correspondiente y por uacuteltimo en la emisioacuten de losresultados (fase postanaliacutetica) Debemos recalcar que cuando se realizanpruebas de hemostasia debe tenerse en consideracioacuten los cuidados comunesa toda prueba de laboratorio es decir las muestras deben obtenerse encondiciones apropiadas y rotularse debidamente Esperamos que el presentemanual sirva de guiacutea efectiva y que pueda ser enriquecido con nuevosaportes con la finalidad de alcanzar un trabajo de calidad
SECCIOacuteN 1
GENERALIDADES
11 OBJETIVO
Establecer y estandarizar los procedimientos baacutesicos de un examen dehemograma hemoglobina hematocrito recuento de plaquetas velocidad desedimentacioacuten y recuento de reticulocitos que sirvan de ayuda diagnoacutestica alcliacutenico
12 CAMPO DE APLICACIOacuteN
La aplicacioacuten de las teacutecnicas hematoloacutegicas nos sirve para estandarizar losprocedimientos a nivel nacional y para que sea de utilidad al personal teacutecnicoy profesional de los laboratorios cliacutenicos
13 RESPONSABILIDADES
131 El Centro Nacional de Laboratorios en Salud Puacuteblica a traveacutes de su
Direccioacuten Ejecutiva de Laboratorios de Referencia es responsable deautorizar la elaboracioacuten la revisioacuten y la actualizacioacuten del presente manualde acuerdo con los procedimientos aprobados por el Instituto Nacionalde Salud
132 Los directores de los establecimientos de salud son responsables deautorizar proporcionar los recursos necesarios y designar al personalresponsable para la aplicacioacuten de las disposiciones contenidas en elpresente manual
133 El personal de los establecimientos de salud es responsable de planificarlas acciones organizar controlar y capacitar al personal para cumplirlas disposiciones contenidas en el presente manual
134 Los jefes o responsables de los laboratorios deben asegurar el controlinterno de la calidad la idoneidad del personal equipos materialesreactivos e instalaciones
135 El personal meacutedico profesional y teacutecnico es responsable de seguir lasespecificaciones contenidas en el presente manual y aplicar los procedimientosespeciacuteficos indicados
14 DOCUMENTOS DE REFERENCIA
141 Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OrganizacioacutenPanamericana de la Salud Publicacioacuten cientiacutefica Nordm 439 Nordm 2 1983
142 Manual de normas de bioseguridad Instituto Nacional de Salud Serie deNormas Teacutecnicas Nordm 18 2ordf ed 1997
SECCIOacuteN 2
MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD
21 Para la obtencioacuten de muestras el personal involucrado en los diferentesprocesos para los exaacutemenes hematoloacutegicos debe aplicar las medidas debioseguridad establecidas en el Manual de Bioseguridad Serie de NormasTeacutecnicas Nordm 18
22 Se debe controlar sobre todo
221 Al personal que trabaja en el laboratorio de hematologiacutea
222 El proceso de coloracioacuten en el que se debe aplicar las medidas debioseguridad correspondientes al uso y manipulacioacuten de sustanciastoacutexicas o canceriacutegenas
223 Ver lo referente a medidas de proteccioacuten en caso de accidentes porinoculacioacuten
SECCIOacuteN 3
OBTENCIOacuteN DE MUESTRAS SANGUIacuteNEAS
31 OBJETIVO
Establecer y uniformizar criterios en el procedimiento de obtencioacuten de muestrassanguiacuteneas con un adecuado control de calidad ya que de ello dependeque el resultado del anaacutelisis de la muestra sea el correcto Se efectuaraacute enayunas o no dependiendo de la prueba a usar
32 OBTENCIOacuteN DE SANGRE VENOSA CON JERINGA
321 Materiales y equipos requeridos
3211 Algodoacuten
3212 Alcohol al 70
3213 Ligadura o torniquete de 25 a 30 cm de largo
3214 Jeringas de 5 mL
3215 Viales con anticoagulante EDTA
322 Obtencioacuten de la muestra
3221 Verificar que los elementos por utilizar esteacuten listos y que el pacientese sienta coacutemodo
3222 Aplicar el torniquete aproximadamente cuatro dedos por encima de laflexioacuten del codo o a 10 cm del codo sujetar con un medio nudo (Fig 1)
3223 Limpiar la zona con alcohol al 70 o alcohol yodado en un aacuterea de 2pulgadas (Fig 2)
3224 El paciente deberaacute abrir y cerrar la mano durante unos segundos ydespueacutes la mantendraacute cerrada esto ayudaraacute a visualizar las venassuperficiales (Fig 3)
3225 Se retira el estuche protector de la aguja y se coge la jeringa de talmanera que el bisel se encuentre hacia arriba (Fig 4)
3226 Se coloca la aguja en direccioacuten paralela a la vena se perfora la pielhaciendo avanzar la aguja 05-1 cm en el tejido subcutaacuteneo luego seperfora la vena (Fig 5)
3227 Se aspira la jeringa hasta el volumen requerido
3228 Retirar el torniquete e indicar al paciente que deje de hacer puntildeo Secoloca el algodoacuten seco encima de la puncioacuten y se retira la aguja (Fig 6)
3229 Retirar la aguja de la jeringa Verter la muestra lentamente por lasparedes del vial con anticoagulante No olvidar colocar una gota en lalaacutemina portaobjeto para realizar el frotis
32210 Agitar el vial en ciacuterculos sobre la mesa para homogeneizar la muestracon el anticoagulante
PUNTOS PARA LA EXTRACCIOacuteN DE SANGRE
(Toma de muestra)
Se obtiene de las venas de la fosa cubital
PROCEDIMIENTO
Fig 1 Fig 2 Fig 3
Fig 4 Fig 5
Fig 6 Fig 7
33 OBTENCIOacuteN DE SANGRE VENOSA EN TUBOS AL VACIacuteO
331 Materiales requeridos
3311 Algodoacuten
3312 Alcohol al 70
3313 Ligadura o torniquete de 25 a 30 cm de largo
3314 Tubos al vaciacuteo con anticoagulante EDTA (K3) EDTA (Na2) u otroanticoagulante
3315 Agujas con dispositivo para extraccioacuten de sangre al vaciacuteo
- Nordm 21 para adultos
- Nordm 22 para nintildeos y neonatos
De preferencia ambas de bisel corto para evitar la coagulacioacuten
332 Obtencioacuten de la muestra
3321 Repetir los pasos de 3221 a 3224
3322 Se retira el estuche protector de la aguja y eacuteste se enrosca al dispositivopara extraccioacuten de sangre al vaciacuteo
3323 Colocar la ligadura cuatro dedos por encima de la flexioacuten del codo o10 cm por encima de eacuteste y pedir al paciente que abra y cierre la manovarias veces para favorecer la dilatacioacuten de las venas
3324 Una vez escogida la vena desinfectarla con una pieza de algodoacutenembebido en etanol al 70
3325 Se coloca la aguja en direccioacuten paralela a la vena se perfora la pielhaciendo avanzar la aguja entre 05 cm y 1 cm en el tejido subcutaacuteneose inserta el tubo al vaciacuteo por la parte posterior y no preocuparse porla cantidad de sangre extraiacuteda ya que el mismo sonido del vaciacuteo avisaraacuteque la extraccioacuten terminoacute (Fig 8)
3326 Retirar la ligadura tirando del extremo doblado
3327 Colocar un pedazo de algodoacuten seco sobre la parte donde se encuentraoculta la aguja Sacar la aguja con un movimiento raacutepido y depositarlaen el recipiente de metal con desinfectante (Fig 9)
3328 Pedir al paciente que presione firmemente el algodoacuten durante 3 minutoscon el brazo extendido No se recomienda que se flexione el brazoa causa del riesgo que se forme un hematoma
3329 Mezclar por inmersioacuten suave la sangre con el anticoagulante contenidoen el tubo No agitar el contenido
Fig 8 Fig 9
333 Ventajas de una extraccioacuten de sangre venosa
3331 Pueden hacerse repetidos exaacutemenes con la misma muestra
3332 Parte de la muestra (plasma o suero) puede congelarse para referenciafutura
334 Desventajas de una extraccioacuten de sangre venosa
3341 La puncioacuten venosa por su largo procedimiento requiere mayor preparacioacuten que el meacutetodo capilar
3342 El meacutetodo es teacutecnicamente difiacutecil en nintildeos individuos obesos y pacientes en shock
3343 La hemoacutelisis debe ser evitada pues se puede obtener una disminucioacuten en el recuento de eritrocitos
3344 Debe evitarse prolongada estasis venosa producida por el torniquete pues produce hemoacutelisis y otros cambios que ponen la sangre en un estado inadecuado para el anaacutelisis de gases recuentos celulares determinacioacuten de pH sanguiacuteneo y algunas pruebas de coagulacioacuten
3345 La sangre anticoagulada si no es de obtencioacuten reciente no debe ser utilizada en extensiones de sangre pues algunos anticoagulantes producen cambios en las plaquetas que pueden causar aglutinaciones agregacioacuten plaquetaria y dificultan la identificacioacuten de leucocitos
3346 Puesto que algunos de los componentes de la sangre no son estables los recuentos de leucocitos y plaquetas e iacutendice de sedimentacioacuten deben realizarse antes de que pasen dos horas desde que se obtuvo la muestra
34 OBTENCIOacuteN DE SANGRE DE LA VENA YUGULAR EXTERNA
341 Materiales requeridos
3411 Algodoacuten
3412 Alcohol al 70
3413 Jeringas de 5 mL
3414 Viales con anticoagulante EDTA
342 Obtencioacuten de la muestra
3421 El paciente es cubierto por una saacutebana de manera que los brazospermanezcan inmovilizados a lo largo del cuerpo
3422 Al paciente se le coloca de cuacutebito dorsal sobre la mesa de examen ouna
camilla de manera que la cabeza cuelgue sobre el final de lamesa y el cuerpo sea
sujetado por un asistente
3423 Cuando el paciente grita la vena yugular externa se marca claramente
3424 Limpiar la zona en un aacuterea de 2 pulgadas con alcohol al 70 o
alcoholyodado
3425 Se repiten los pasos de 3225 a 3227 de la extraccioacuten de sangrevenosa
con jeringa
3426 Retirar la aguja de la vena y presionar suavemente con un algodoacutenseco
aproximadamente de 3 a 5 minutos Pedir al paciente que permanezcaechado diez
minutos
3427 Se repiten los pasos de 3229
3428 Se repiten los pasos de 32210
343 Ventajas
Constituye un buen meacutetodo para la obtencioacuten de sangre en pacientes conshock
con venas colapsadas
344 Desventajas
Por lo delicado en su procedimiento no se recomienda como rutina soacutelo encasos
en que no se pueda obtener la muestra por meacutetodos convencionales
35 OBTENCIOacuteN DE SANGRE CAPILAR
Cuando la cantidad de sangre que se precisa es muy pequentildea o cuando
pordiferentes motivos no pueda practicarse una puncioacuten venosa debe recurrirse
a la puncioacuten capilar
351 Materiales requeridos
3512 Algodoacuten
3513 Alcohol al 70
3514 Lancetas desechables (Fig 10)
3515 Papel filtro Nordm 2
352 Procedimiento (Fig 11)
3521 La sangre capilar se obtiene de la cara lateral del dedo medio o anularen los adultos y del dedo gordo del pie o taloacuten en los nintildeos
3522 Desinfectar la zona con alcohol al 70 secar con algodoacuten esteacuteril
3523 Punzar la piel con una lanceta esteacuteril desechable (2 mm de profundidad)
3524 Usar gasa esteacuteril para desechar la primera gota y recoger las siguientesen tubos capilares Evitar comprimir la extremidad para obtenersangre porque se altera la composicioacuten sanguiacutenea
353 Ventajas
3531 Puede obtenerse con facilidad
3532 Es preferible cuando han de realizarse extensiones de sangre perifeacuterica
354 Desventajas
3541 Soacutelo se pueden obtener pequentildeas cantidades de sangre y los exaacutemenesde repeticioacuten requieren nuevas muestras
3542 La sangre en microtubos (capilares) frecuentemente se hemolizainterfiendo con la mayoriacutea de pruebas de laboratorio
3543 Los resultados obtenidos en pruebas con sangre capilar no puedenser comparados con los resultados de las pruebas con sangre venosa
3544 El dedo no soacutelo es delicado sino difiacutecil de desinfectar adecuadamenteen el tiempo disponible
3545 En pacientes con resistencia disminuida a la infeccioacuten (aquellos conleucemia agranulocitosis diabetes uremia y enfermedades con deficienciasinmunoloacutegicas) una muestra tomada del dedo es mucho maacutesprobable que conduzca a una infeccioacuten que otra tomada del brazo
3546 El recuento de eritrocitos y leucocitos asiacute como el recuento deplaquetas y reticulocitos no debe realizarse en sangre capilar debidoa la difiacutecil estandarizacioacuten del flujo sanguiacuteneo capilar
EXTRACCIOacuteN DE SANGRE CAPILAR
Fig 10
Fig 11
SECCIOacuteN 4
ANTICOAGULANTES
Una vez extraiacuteda la sangre eacutesta puede conservarse coagulada o
mantenidaincoagulable mediante la adicioacuten de un anticoagulante
41 CARACTERIacuteSTICAS BAacuteSICAS DE LOS ANTICOAGULANTES MAacuteS
USADOSEN HEMATOLOGIacuteA
bull No alterar el tamantildeo de los hematiacutees
bull No producir hemoacutelisis
bull Evitar al maacuteximo la agregacioacuten plaquetaria
bull No alterar la morfologiacutea de los leucocitos
La sangre tratada con anticoagulante debe procesarse lo antes posible
inclusomantenida bajo refrigeracioacuten (4 ordmC) si no pasan de las 2 horas El
tiempomaacuteximo entre la extraccioacuten de la sangre y su procesamiento depende
delcoagulante de eleccioacuten y no debe ser maacutes de 4 horas a excepcioacuten
delanticoagulante EDTA (etilendiaminotetraceacutetico) que puede ser hasta 24
horas(en refrigeracioacuten a 4 ordmC)
Los anticoagulantes pueden emplearse en forma soacutelida o liacutequida Los
primerosestaacuten indicados para la determinacioacuten de los paraacutemetros
hematoloacutegicosya que no producen como los anticoagulantes liacutequidos dilucioacuten de
la sangre
42 ANTICOAGULANTES SOacuteLIDOS
421 EDTA
Es la sal disoacutedica o tripotaacutesica del aacutecido etilendiaminotetraceacutetico La saldisoacutedica
(Na2EDTA) es menos soluble que la sal tripotaacutesica (K3EDTA) Estoscompuestos
realizan su accioacuten a traveacutes de un efecto quelante sobre el calcioal fijarlo impiden
su activacioacuten y por ende la coagulacioacuten sanguiacutenea
4211 Ventajas
bull Respeta la morfologiacutea eritrocitaria (especialmente la sal tripotaacutesica) yleucocitaria de manera que permite una demora de dos horas en la realizacioacutendel frotis sanguiacuteneo despueacutes de la extraccioacuten sanguiacutenea
bull Asegura la conservacioacuten de los elementos formes sanguiacuteneos durante 24horas si la sangre se mantiene a 4 ordmC
bull Al inhibir la aglutinacioacuten de las plaquetas facilita su recuento o su expresioacutensemicuantitativa a partir del frotis
bull La concentracioacuten recomendada de EDTA es de 15 mgmL de sangre Unamayor cantidad de anticoagulante puede producir retraccioacuten celular condisminucioacuten del hematocrito y un aumento de la concentracioacuten media de lahemoglobina Un exceso de sangre con relacioacuten al anticoagulante produceformacioacuten de microagregados que pueden alterar los resultados El empleode tubos al vaciacuteo con una gota (50mL) de EDTA tripotaacutesica comercialpara 5 mL de sangre es de intereacutes praacutectico dado que es cien veces maacutessoluble facilitando la mezcla de sangre con anticoagulante
4212 Desventajas
Usado en exceso afecta a los eritrocitos y a los leucocitos a los cuales les produce encogimiento y cambios en su forma por ello debe cuidarse de agregar la cantidad correcta de sangre al anticoagulante
422 Anticoagulante de Wintrobe
Es una mezcla de oxalato de amonio y potasio Actuacutea por precipitacioacuten del calcio es faacutecil de preparar Se emplea en forma de polvo en proporcioacuten de 2 de oxalato de amonio por 1 de oxalato de potasio La cantidad recomendada es de 2 mg x mL de sangre Este anticoagulante no afecta el volumen globular medio y puede usarse para determinaciones de hemoglobina hematocrito y recuento globular pero para los extendidos queda limitada a los primeros minutos tampoco es uacutetil para el recuento plaquetario porque produce formacioacuten de agregados plaquetarios
423 Heparina
El nombre de heparina proviene del griego hepar que significa hiacutegado ya que fue aislado por primera vez de las ceacutelulas de este tejido Es un mucopolisacaacuterido aacutecido Presenta el
inconveniente de que si no se agita raacutepidamente con la sangre despueacutes de extraiacuteda
pueden formarse microcoaacutegulos aunque no altera el volumeneritrocitario ni la morfologiacutea de los leucocitos No es recomendablepara el frotis sanguiacuteneo porque produce un fondo azul en la laacutemina
La heparina de sodio o litio puede usarse en forma soacutelida o liacutequida en
proporcioacutende 01 - 02 mg de heparina por 1 mL de sangre
43 ANTICOAGULANTES LIacuteQUIDOS
431 Citrato trisoacutedico
Es de eleccioacuten para las pruebas de hemostasia y la velocidad de sedimentacioacuten
Actuacutea a traveacutes de la precipitacioacuten del calcio La concentracioacuten depende de
la prueba por realizar
bull Para pruebas de hemostasia se emplea en proporcioacuten de 1 9 (05 mL
deanticoagulante para 45 mL de sangre total)
bull Para la determinacioacuten de la VSG (Velocidad de Sedimentacioacuten Globular) es14
(05 mL de anticoagulante para 2 mL de sangre)
432 Oxalato soacutedico
Recomendado tambieacuten para las pruebas de hemostasia Se emplea en
proporcioacutende un volumen de anticoagulante para 4 vol de sangre
SECCIOacuteN 5
REALIZACIOacuteN Y TINCIOacuteN DEL FROTIS SANGUIacuteNEO
La praacutectica del frotis sanguiacuteneo tambieacuten llamado extendido es de gran importanciaen hematologiacutea ya que el diagnoacutestico de muchas enfermedadeshematoloacutegicas puede realizarse con soacutelo observar las caracteriacutesticasmorfoloacutegicas de las ceacutelulas sanguiacuteneas de manera que eacuteste no debe serexcesivamente grueso ni excesivamente fino Todas las laacuteminas por usarsobre todo nuevas deben ser limpiadas con algodoacuten y alcohol al 70 paraeliminar la grasa que viene adherida
51 MEacuteTODO DE LOS DOS PORTAOBJETOS
511 Materiales
- Alcohol al 70
- Algodoacuten
- Lanceta descartable
- Portaobjetos de vidrios limpios y desgrasados (25 x 75 mm)
512 Fundamento
Consiste en la extensioacuten de una gota de sangre sobre un portaobjeto (25 x 75)empleando el canto biselado de otro portaobjeto de igual dimensioacuten (Fig 12)
513 Procedimiento
5131 Una vez extraiacuteda la sangre con cualquiera de las metodologiacuteas secoloca una pequentildea gota de sangre (5mL) (aprox 3 mm de diaacutemetro)sobre un portaobjeto a 2 cm aproximadamente de uno de los extremos
5132 Colocar el canto de otro portaobjeto esmerilado sobre la superficiedel primer portaobjeto (en la que se encuentra la gota de sangre)formando un aacutengulo de 45ordm
5134 Deslizar suavemente y a velocidad moderada el portaobjeto sobre elotro en sentido longitudinal hasta que la gota de sangre quede bienextendida sobre la
superficie del primer portaobjeto El grosor delfrotis sanguiacuteneo puede variar seguacuten sea el aacutengulo que formen entresiacute ambos portaobjetos Asiacute si es superior a 45ordm la extensioacuten obtenidaseraacute gruesa y corta si es inferior a 45ordm seraacute larga y fina El secado delfrotis es a temperatura ambiente y en posicioacuten horizontal
Fig 12
1048729 Zona excesivamente gruesa Se halla en la regioacuten inmediata al punto departida de la extensioacuten (cabeza) En ella se aprecia siempre un aumento delinfocitos
1048729 Zona excesivamente fina Corresponde al final de la extensioacuten y termina enun aacuterea donde las ceacutelulas adoptan una posicioacuten acartonada (barbas) Enesta regioacuten existe un exceso de granulocitos y monocitos
1048729 Zona ideal Corresponde a la regioacuten intermedia del frotis y en ella existe unreparto equilibrado de ceacutelulas
52 COLORACIONES USADAS
Una vez seco el frotis se procede a la tincioacuten hematoloacutegica con el colorante deRomanowsky constituido por la mezcla de eosina y azul de metileno Dentrode eacutestas tenemos
521 Colorante de Giemsa
522 Colorante de May-Grunwald
523 Colorante de Wright
524 Colorante de Leishman
Preparacioacuten de colorantes (Anexo A)
1048729 Para el estudio de las ceacutelulas sanguiacuteneas utilizar el colorante 523 y 524
1048729 Para el estudio de hemoparaacutesitos utilizar el colorante 521
1048729 Utilizar el colorante 522 para casos especiales en que se desee observar
con mayor claridad y especificidad los graacutenulos de los neutrofilos
53 TINCIOacuteN CON COLORANTE DE WRIGHT
531 Fundamento
El colorante de Wright va a permitir suministrar un medio para estudiar lasangre y determinar las variaciones y anormalidades de estructura forma ytamantildeo de los eritrocitos su contenido de hemoglobina y sus propiedades decoloracioacuten La informacioacuten obtenida de un frotis de sangre perifeacuterica dependeen gran parte de la calidad del extendido y la coloracioacuten
532 Materiales
5321 Colorante de Wright (Anexo A)
5322 Frasco gotero
5323 Solucioacuten amortiguada tamponada (Anexo A)
533 Procedimiento
5331 Una vez obtenido el frotis sanguiacuteneo se le dejaraacute secar entre 15 y 20minutos
5332 Luego se coloca la preparacioacuten en un soporte y se cubre con el colorantede Wright dejaacutendolo por espacio de 5 minutos
5333 Posteriormente se antildeade solucioacuten amortiguada tamponada en partesiguales hasta obtener un brillo metaacutelico dejando 6 minutos adicionales
5334 Finalmente se lava con agua corriente y se deja secar
5335 Se coloca en el microscopio y con pequentildeo aumento se revisa lacalidad de la coloracioacuten la cantidad aproximada de gloacutebulos blancosy se escoge el sitio para iniciar el recuento Se coloca una gota deaceite de inmersioacuten y se enfoca a un aumento de 100xLa forma de los gloacutebulos rojos se examinaraacute detenidamente observandoademaacutes del color (cantidad de hemoglobina) presencia deplaquetas su agrupacioacuten y distribucioacuten
5336 Posteriormente se hace el recuento diferencial de gloacutebulos blancosen 100
ceacutelulas para lo cual se deberaacute conocer las diferencias entreneutroacutefilos eosinoacutefilos
linfocitos y monocitosUna extensioacuten de sangre bien tentildeida debe caracterizarse
por unabuena diferenciacioacuten de las estructuras subcelulares en los leucocitosuna
coloracioacuten rosada de los hematiacutees y la ausencia de precipitados
Los defectos maacutes frecuentes observados en la tincioacuten del frotis sanguiacuteneoson
Coloracioacuten excesivamente azul debido a
1048729 Frotis excesivamente grueso
1048729 Lavado insuficiente
1048729 Tincioacuten muy prolongada
1048729 Empleo de colorante excesivamente alcalino
Coloracioacuten con una tonalidad rosada
1048729 El colorante el tampoacuten o el agua de lavado tienen un pH demasiadoaacutecido
Presencia de precipitados
1048729 Obedecen a una accioacuten excesiva del colorante Esto se puede evitarcon la
filtracioacuten
SECCIOacuteN 6
HEMOGRAMA-HEMOGLOBINA-HEMATOCRITO
El hemograma de Shilling constituye uno de los exaacutemenes de laboratorio
maacutesusados en el campo de la hematologiacutea Comprende las siguientes pruebas
61 RECUENTO LEUCOCITARIO
Principio
La sangre anticoagulada se deposita en un liacutequido que permite evidenciar
losleucocitos mantenieacutendolos visibles mientras que los eritrocitos
sonhemolizados El recuento del nuacutemero de leucocitos o gloacutebulos blancos se
expresapor mm3 (miliacutemetro cuacutebico)
611 Equipos
- Microscopio
- Hemocitoacutemetro (Caacutemara de Neubauer)
Consta de los siguientes elementos
diams Una laacutemina portaobjeto gruesa en el centro se hallan dos
superficiescuadriculadas iguales separadas del resto de la laacutemina por surcos y
dosbarras transversales algo maacutes elevadas
diams Una laminilla cubreobjetos oacutepticamente plana que al colocarse sobrelas barras
elevadas de la laacutemina forma una caacutemara entre el cubreobjetosy la superficie
cuadriculadaLa altura entre el cubreobjetos y la laacutemina portaobjetos es de 01
mmCada cuadriacutecula mide 3 mm de lado y se divide en 9 cuadrados grandesCada
uno de los cuales mide 1 mm2 de superficie que se subdivide a suvez en 16
cuadrados medianos El cuadrado grande central se divide en25 cuadrados
pequentildeos y cada uno de ellos en 16 cuadraditos Cadacuadrado pequentildeo mide
02 mm de lado (004 mm2 de superficie) y cadacuadradito mide 005 mm de lado
(00025 mm2 de superficie)
612 Materiales y reactivos requeridos
6121 Pipeta de gloacutebulos blancos (De Thoma) o pipeta automaacutetica (de 0 a 100 mL)Presenta cerca del extremo superior una marca de 11 inmediatamentecontinuacutea una dilatacioacuten (bulbo) que contiene una perla que funciona comomezcladora luego sigue el extremo maacutes largo de la pipeta (tallo) que estaacutedividida en 10 partes con 2 marcas 1 (parte final del bulbo) y 05 (a la mitaddel tallo) Se le acopla a su extremo superior 1 tubo de goma y una bombillapara aspirar
6122 Diluyente de gloacutebulos blancos Solucioacuten de Turk al 1
6123 Contador manual (Soacutelo si fuera necesario)
6124 Papel filtro
613 Procedimiento
6131 Una vez obtenida la sangre con anticoagulante o sangre capilar deldedo se procede a aspirar la sangre con la pipeta de gloacutebulos blancoshasta la marca de 05 y a limpiar la punta con papel absorbente
6132 Introducir la pipeta en el tubo que contenga solucioacuten de Turk y absorberhasta la marca de 11 (no debe haber burbujas)
6133 Tapar ambos extremos y proceder a mezclar manualmente o en unrotador automaacutetico por 2 oacute 3 minutos
6134 Monte la laminilla de vidrio en la caacutemara para recuento que debe estarlimpia y seca
6135 Agitar la pipeta y descartar las cuatro primeras gotas para luego colocaruna gota pequentildea de esta solucioacuten en la caacutemara
6136 Deje reposar por espacio de 3 minutos para que las ceacutelulas se sedimenten
6137 Enfocar con objetivo de 10x y contar en 4 cuadrados grandes angularesCuando se usa la pipeta automaacutetica se toma 20 mL (002 mL) desangre total con anticoagulante o sangre capilar con anticoagulante yse diluye en un tubo que contenga 380 mL de solucioacuten de Turk (aquiacutetenemos una dilucioacuten 120)
LECTURA
Fig 13
La lectura se realiza en los campos 1 3 7 y 9 como estaacute indicado en la figuraAdemaacutes de los leucocitos contados dentro de cada uno de los cuadrantes sedeben contar todos los leucocitos que se encuentren adheridos en la liacuteneahorizontal superior y vertical exterior o de lo contrario todos los leucocitosadheridos a la liacutenea horizontal inferior y vertical interior
614 Resultados
Nordm de leucocitos x mm3 = leucocitos contados en 4 camposdividealtura x dilucioacuten x aacuterea
Reemplazando = leucocitos contados en 4 camposdivide110 x 120 x 4=
Leucocitos contados en 4 camposdivide4200=
X1 divide4200= Nordm leucocitos contados x 50
615 Valores de referencia
5000 - 10 000 leucocitos mm3
616 Correccioacuten de valores para restar eritrocitos nucleados
Los normoblastos no se destruyen (lisis) en el liacutequido de dilucioacuten por lo tantopueden observarse al realizar el recuento leucocitario y confundirse con losleucocitos de tal manera que se debe emplear la siguiente foacutermula
Caacutelculo
La concentracioacuten del nuacutemero de normoblastos (por litro) esNuacutemero de normoblatos contados x concentracioacuten o nuacutemero de leucocitos100 + Nordm de normoblastos contados
Ejemplo
Si se cuentan 50 normoblastos y la concentracioacuten del nuacutemero de leucocitos es16 x 109l la concentracioacuten del nuacutemero de normoblastos seraacute
50 x16 = 53 x 109l
100 + 50
y la concentracioacuten de leucocitos corregida seraacute 16 - 53 = 107 x 109lEn unidades tradicionales las concentraciones de normoblastos y leucocitosse expresan por miliacutemetro cuacutebico En tales unidades el caacutelculo correspondienteal ejemplo que se ha dado seriacutea
50 x 16 000 = 5300 mm3
100 + 50
Recuento corregido de gloacutebulos blancos o leucocitos = 16 000 - 5300 = 10 700 mm3
Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2
62 RECUENTO DE GLOacuteBULOS ROJOS
Principio
La sangre se diluye en un liacutequido que nos permite observar claramente loshematiacutees luego esta dilucioacuten se coloca en una caacutemara de Neubauer con laayuda de una pipeta automaacutetica o pipeta Pasteur y se cuentan en el microscopioa un objetivo de 40x para calcular el nuacutemero de gloacutebulos rojos por mm3
621 Equipos
- Microscopio
- Hemocitoacutemetro (caacutemara de Neubauer)
622 Materiales y reactivos requeridos
6221 Pipeta de gloacutebulos rojos (De Thoma) o pipeta automaacutetica (de 0-100 mL)
Presenta cerca del extremo superior una marca de 101 inmediatamentecontinuacutea una dilatacioacuten (bulbo) que contiene una perla roja mezcladoraluego sigue el tallo (extremo maacutes largo) el cual estaacute dividido en 10 partescon 2 marcas 1 acabando el bulbo y 05 a la mitad del tallo Se requiereigual que el recuento de leucocitos una boquilla para aspirar
6222 Diluyente de gloacutebulos rojos Cloruro de Sodio al 09 (ver anexo)
Diluyente de Hayem (ver anexo)
6223 Contador manual (soacutelo si fuera necesario)
6224 Papel filtro
623 Procedimiento
6231 Mezclar la sangre obtenida con el anticoagulante o tomar sangre capilar
6232 Llenar la pipeta de gloacutebulos rojos con sangre hasta la marca de 05para realizar una dilucioacuten de 1200 y si se carga hasta 1 la dilucioacutenseraacute 1100 Limpiar la punta con gasa o papel absorbente
6233 Introducir la pipeta en el tubo o frasquito conteniendo diluyente (Hayem)y llenar de liacutequido de dilucioacuten hasta la marca de 101
6234 Se coloca en un rotador automaacutetico o se hace rotar manualmente de2 a 3 minutos
6235 Agitar bien la pipeta y descartar 3 a 4 gotas del tallo luego colocar unagota pequentildea cerca de un extremo de la caacutemara para que por capilaridadse llene exactamente
6236 Hacer el recuento con objetivo de 40xSe puede realizar con la pipeta automaacutetica se toma 20 mL (002mL)de sangre total con anticoagulante o sangre capilar y se deposita enun tubo de 12 x 75 que contenga 4 mL de solucioacuten de Hayem (aquiacute setiene una dilucioacuten de 1200) Se deja reposar aproximadamente 5minutos y se procede a cargar la caacutemara con la misma pipeta usandoun nuevo tip El inconveniente aquiacute es el gasto de reactivo (4 mL) perolas medidas son mas exactas
6237 Dejar en reposo por 3 minutos
6238 Enfocar la cuadriacutecula a 10x luego con el objetivo de 40x contar sobreel cuadrado grande central de la caacutemara soacutelo en 5 cuadrados pequentildeosuno central y cuatro angulares (80 cuadraditos en total)
6239 En el recuento se incluyen las ceacutelulas que cubren o tocan por dentroo por fuera las liacuteneas limitantes superior e izquierda en el cuadradopequentildeo de recuento y no se consideran los correspondientes a losliacutemites inferior y derechoSe hace el recuento en los puntos ABCD y Ey se sigue los mismos paraacutemetros del recuento de leucocitos
LECTURA
Fig 14
624 Resultados
Nordm de hematiacutees x mm3 = hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeosaltura x dilucioacuten X aacuterea
Reemplazando = hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeos110 x 1200 x 15
= hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeos divide 110 000
= hematiacutees contados x 10 000
625 Valores de referencia
(Unidades tradicionales millones de ceacutelulasmm3)
Hombres 4 500 000 - 5 500 000
Mujeres 4 000 000 - 5 000 000
Nintildeos (4 antildeos) 4 200 000 - 5 200 000
Lactantes (1 - 6 meses) 3 800 000 - 5 200 000
Recieacuten nacidos 5 000 000 - 6 000 000
Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2
63 DETERMINACIOacuteN DEL VOLUMEN GLOBULAR (Hematocrito)
Mide la fraccioacuten que comprende a los gloacutebulos rojos (masa globular) respectoal
volumen total de la muestra de sangre venosa o capilar Puede expresarseen
porcentaje o como valor decimal
Hto= altura de la columna de gloacutebulos rojosdivide altura de la columna de sangre
total(gloacutebulos rojos maacutes plasma)
631 Meacutetodo de Wintrobe
Materiales requeridos
- Tubo de Wintrobe graduado de 0 - 100 mm
- Pipetas Pasteur o pipetas de transferencia
- Tapoacuten de goma
Procedimiento
diams Llenar la sangre extraiacuteda con anticoagulante con una pipeta pasteur
comenzandodesde el fondo hasta la marca superior de 100 mm teniendocuidado
de no provocar espuma
diams Tapar el tubo con un tapoacuten de goma para evitar la evaporacioacuten
diams Centrifugar a 3000 rpm por 30 minutos
Resultados (lectura)
Del tubo graduado se mide directamente el nivel de la columna de gloacutebulosrojos
Valores de referencia
Hombres 40 - 54Mujeres 38 - 48
Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2
632 Meacutetodo de microhematocrito
Materiales requeridos
- Capilares rojos y azules (75 mm x 15 mm)
- Plastilina
Procedimiento
diams Tomar la muestra en capilares rojos heparinizados directamente del pulpejodel
dedo o utilizar capilares azules sin heparina para sangre venosacon
anticoagulante de Wintrobe o EDTA Debe llenarse aproximadamente70 - 80
del capilar
diams Ocluir (tapar) un extremo del capilar con plastilina
diams Colocar el capilar sobre la plataforma del cabezal de una centriacutefuga demicrohematocrito con el extremo ocluido adherido al reborde externo de laplataforma
diams Centrifugar por 5 minutos entre 10 000 - 12 000 rpm
Resultados (lectura)
La lectura se realiza con una escala estandarizada que expenden en el comercio
Uso de la escala
diams Sostenga el tubo frente a la escala de manera que el fondo de la columnade eritrocitos (no el extremo inferior del tubo) quede exactamente al mismonivel de la liacutenea horizontal correspondiente al cero
diams Desplace el tubo a traveacutes de la escala hasta que la liacutenea marcada con elnuacutemero 10 quede al nivel del tope de la columna de plasma Vigile que elfondo de la
columna de eritrocitos continuacutee sobre la liacutenea cero El tubodebe encontrarse completamente en posicioacuten vertical
diams La liacutenea que pase al nivel del tope de la columna de eritrocitos indicaraacute lafraccioacuten de volumen de eacutestos
Valores de referencia
Hombres 40 - 50
Mujeres 38 - 44
Nintildeos (5 antildeos) 38 - 44
Lactantes (3 meses) 37 - 42
Recieacuten nacidos 50 - 58
La disposicioacuten celular esParte superior una columna de plasmaEn la interfase estaacuten los leucocitos yplaquetasParte inferior estaacute la columna deeritrocitos (Fig 15)
64 DOSAJE DE HEMOGLOBINA
Principio
La sangre se diluye en liacutequido de Drabkin el cual hemoliza los hematiacutees yconvierte la hemoglobina en cianometahemoglobina (cianuro de hemiglobina)La solucioacuten que se produce se lee por medio de un espectrofotoacutemetro ofotocoloriacutemetro Su grado de absorbancia es proporcional a la cantidad dehemoglobina que contenga la sangre
641 Materiales y reactivos
6411 Un coloriacutemetro fotoeleacutectrico o un espectrofotoacutemetro
6412 Pipetas
diams Una pipeta para sangre (pipeta de Sahli) graduada hasta 002 mL contubo de goma y boquilla
diams Una pipeta de vidrio graduada de 5 mL
6413 Tubos de ensayo
6414 Reactivo de Drabkin para dilucioacuten
Este reactivo se puede adquirir en tabletas o polvos para disolver en 1litro de agua destilada Si se dispone de una balanza analiacutetica la preparacioacutense puede hacer en el laboratorio Esta solucioacuten se puedeconservar durante un mes en un frasco de vidrio oscuro Deseacutechese sise enturbia
GENERALIDADES
11 OBJETIVO
Establecer y estandarizar los procedimientos baacutesicos de un examen dehemograma hemoglobina hematocrito recuento de plaquetas velocidad desedimentacioacuten y recuento de reticulocitos que sirvan de ayuda diagnoacutestica alcliacutenico
12 CAMPO DE APLICACIOacuteN
La aplicacioacuten de las teacutecnicas hematoloacutegicas nos sirve para estandarizar losprocedimientos a nivel nacional y para que sea de utilidad al personal teacutecnicoy profesional de los laboratorios cliacutenicos
13 RESPONSABILIDADES
131 El Centro Nacional de Laboratorios en Salud Puacuteblica a traveacutes de su
Direccioacuten Ejecutiva de Laboratorios de Referencia es responsable deautorizar la elaboracioacuten la revisioacuten y la actualizacioacuten del presente manualde acuerdo con los procedimientos aprobados por el Instituto Nacionalde Salud
132 Los directores de los establecimientos de salud son responsables deautorizar proporcionar los recursos necesarios y designar al personalresponsable para la aplicacioacuten de las disposiciones contenidas en elpresente manual
133 El personal de los establecimientos de salud es responsable de planificarlas acciones organizar controlar y capacitar al personal para cumplirlas disposiciones contenidas en el presente manual
134 Los jefes o responsables de los laboratorios deben asegurar el controlinterno de la calidad la idoneidad del personal equipos materialesreactivos e instalaciones
135 El personal meacutedico profesional y teacutecnico es responsable de seguir lasespecificaciones contenidas en el presente manual y aplicar los procedimientosespeciacuteficos indicados
14 DOCUMENTOS DE REFERENCIA
141 Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OrganizacioacutenPanamericana de la Salud Publicacioacuten cientiacutefica Nordm 439 Nordm 2 1983
142 Manual de normas de bioseguridad Instituto Nacional de Salud Serie deNormas Teacutecnicas Nordm 18 2ordf ed 1997
SECCIOacuteN 2
MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD
21 Para la obtencioacuten de muestras el personal involucrado en los diferentesprocesos para los exaacutemenes hematoloacutegicos debe aplicar las medidas debioseguridad establecidas en el Manual de Bioseguridad Serie de NormasTeacutecnicas Nordm 18
22 Se debe controlar sobre todo
221 Al personal que trabaja en el laboratorio de hematologiacutea
222 El proceso de coloracioacuten en el que se debe aplicar las medidas debioseguridad correspondientes al uso y manipulacioacuten de sustanciastoacutexicas o canceriacutegenas
223 Ver lo referente a medidas de proteccioacuten en caso de accidentes porinoculacioacuten
SECCIOacuteN 3
OBTENCIOacuteN DE MUESTRAS SANGUIacuteNEAS
31 OBJETIVO
Establecer y uniformizar criterios en el procedimiento de obtencioacuten de muestrassanguiacuteneas con un adecuado control de calidad ya que de ello dependeque el resultado del anaacutelisis de la muestra sea el correcto Se efectuaraacute enayunas o no dependiendo de la prueba a usar
32 OBTENCIOacuteN DE SANGRE VENOSA CON JERINGA
321 Materiales y equipos requeridos
3211 Algodoacuten
3212 Alcohol al 70
3213 Ligadura o torniquete de 25 a 30 cm de largo
3214 Jeringas de 5 mL
3215 Viales con anticoagulante EDTA
322 Obtencioacuten de la muestra
3221 Verificar que los elementos por utilizar esteacuten listos y que el pacientese sienta coacutemodo
3222 Aplicar el torniquete aproximadamente cuatro dedos por encima de laflexioacuten del codo o a 10 cm del codo sujetar con un medio nudo (Fig 1)
3223 Limpiar la zona con alcohol al 70 o alcohol yodado en un aacuterea de 2pulgadas (Fig 2)
3224 El paciente deberaacute abrir y cerrar la mano durante unos segundos ydespueacutes la mantendraacute cerrada esto ayudaraacute a visualizar las venassuperficiales (Fig 3)
3225 Se retira el estuche protector de la aguja y se coge la jeringa de talmanera que el bisel se encuentre hacia arriba (Fig 4)
3226 Se coloca la aguja en direccioacuten paralela a la vena se perfora la pielhaciendo avanzar la aguja 05-1 cm en el tejido subcutaacuteneo luego seperfora la vena (Fig 5)
3227 Se aspira la jeringa hasta el volumen requerido
3228 Retirar el torniquete e indicar al paciente que deje de hacer puntildeo Secoloca el algodoacuten seco encima de la puncioacuten y se retira la aguja (Fig 6)
3229 Retirar la aguja de la jeringa Verter la muestra lentamente por lasparedes del vial con anticoagulante No olvidar colocar una gota en lalaacutemina portaobjeto para realizar el frotis
32210 Agitar el vial en ciacuterculos sobre la mesa para homogeneizar la muestracon el anticoagulante
PUNTOS PARA LA EXTRACCIOacuteN DE SANGRE
(Toma de muestra)
Se obtiene de las venas de la fosa cubital
PROCEDIMIENTO
Fig 1 Fig 2 Fig 3
Fig 4 Fig 5
Fig 6 Fig 7
33 OBTENCIOacuteN DE SANGRE VENOSA EN TUBOS AL VACIacuteO
331 Materiales requeridos
3311 Algodoacuten
3312 Alcohol al 70
3313 Ligadura o torniquete de 25 a 30 cm de largo
3314 Tubos al vaciacuteo con anticoagulante EDTA (K3) EDTA (Na2) u otroanticoagulante
3315 Agujas con dispositivo para extraccioacuten de sangre al vaciacuteo
- Nordm 21 para adultos
- Nordm 22 para nintildeos y neonatos
De preferencia ambas de bisel corto para evitar la coagulacioacuten
332 Obtencioacuten de la muestra
3321 Repetir los pasos de 3221 a 3224
3322 Se retira el estuche protector de la aguja y eacuteste se enrosca al dispositivopara extraccioacuten de sangre al vaciacuteo
3323 Colocar la ligadura cuatro dedos por encima de la flexioacuten del codo o10 cm por encima de eacuteste y pedir al paciente que abra y cierre la manovarias veces para favorecer la dilatacioacuten de las venas
3324 Una vez escogida la vena desinfectarla con una pieza de algodoacutenembebido en etanol al 70
3325 Se coloca la aguja en direccioacuten paralela a la vena se perfora la pielhaciendo avanzar la aguja entre 05 cm y 1 cm en el tejido subcutaacuteneose inserta el tubo al vaciacuteo por la parte posterior y no preocuparse porla cantidad de sangre extraiacuteda ya que el mismo sonido del vaciacuteo avisaraacuteque la extraccioacuten terminoacute (Fig 8)
3326 Retirar la ligadura tirando del extremo doblado
3327 Colocar un pedazo de algodoacuten seco sobre la parte donde se encuentraoculta la aguja Sacar la aguja con un movimiento raacutepido y depositarlaen el recipiente de metal con desinfectante (Fig 9)
3328 Pedir al paciente que presione firmemente el algodoacuten durante 3 minutoscon el brazo extendido No se recomienda que se flexione el brazoa causa del riesgo que se forme un hematoma
3329 Mezclar por inmersioacuten suave la sangre con el anticoagulante contenidoen el tubo No agitar el contenido
Fig 8 Fig 9
333 Ventajas de una extraccioacuten de sangre venosa
3331 Pueden hacerse repetidos exaacutemenes con la misma muestra
3332 Parte de la muestra (plasma o suero) puede congelarse para referenciafutura
334 Desventajas de una extraccioacuten de sangre venosa
3341 La puncioacuten venosa por su largo procedimiento requiere mayor preparacioacuten que el meacutetodo capilar
3342 El meacutetodo es teacutecnicamente difiacutecil en nintildeos individuos obesos y pacientes en shock
3343 La hemoacutelisis debe ser evitada pues se puede obtener una disminucioacuten en el recuento de eritrocitos
3344 Debe evitarse prolongada estasis venosa producida por el torniquete pues produce hemoacutelisis y otros cambios que ponen la sangre en un estado inadecuado para el anaacutelisis de gases recuentos celulares determinacioacuten de pH sanguiacuteneo y algunas pruebas de coagulacioacuten
3345 La sangre anticoagulada si no es de obtencioacuten reciente no debe ser utilizada en extensiones de sangre pues algunos anticoagulantes producen cambios en las plaquetas que pueden causar aglutinaciones agregacioacuten plaquetaria y dificultan la identificacioacuten de leucocitos
3346 Puesto que algunos de los componentes de la sangre no son estables los recuentos de leucocitos y plaquetas e iacutendice de sedimentacioacuten deben realizarse antes de que pasen dos horas desde que se obtuvo la muestra
34 OBTENCIOacuteN DE SANGRE DE LA VENA YUGULAR EXTERNA
341 Materiales requeridos
3411 Algodoacuten
3412 Alcohol al 70
3413 Jeringas de 5 mL
3414 Viales con anticoagulante EDTA
342 Obtencioacuten de la muestra
3421 El paciente es cubierto por una saacutebana de manera que los brazospermanezcan inmovilizados a lo largo del cuerpo
3422 Al paciente se le coloca de cuacutebito dorsal sobre la mesa de examen ouna
camilla de manera que la cabeza cuelgue sobre el final de lamesa y el cuerpo sea
sujetado por un asistente
3423 Cuando el paciente grita la vena yugular externa se marca claramente
3424 Limpiar la zona en un aacuterea de 2 pulgadas con alcohol al 70 o
alcoholyodado
3425 Se repiten los pasos de 3225 a 3227 de la extraccioacuten de sangrevenosa
con jeringa
3426 Retirar la aguja de la vena y presionar suavemente con un algodoacutenseco
aproximadamente de 3 a 5 minutos Pedir al paciente que permanezcaechado diez
minutos
3427 Se repiten los pasos de 3229
3428 Se repiten los pasos de 32210
343 Ventajas
Constituye un buen meacutetodo para la obtencioacuten de sangre en pacientes conshock
con venas colapsadas
344 Desventajas
Por lo delicado en su procedimiento no se recomienda como rutina soacutelo encasos
en que no se pueda obtener la muestra por meacutetodos convencionales
35 OBTENCIOacuteN DE SANGRE CAPILAR
Cuando la cantidad de sangre que se precisa es muy pequentildea o cuando
pordiferentes motivos no pueda practicarse una puncioacuten venosa debe recurrirse
a la puncioacuten capilar
351 Materiales requeridos
3512 Algodoacuten
3513 Alcohol al 70
3514 Lancetas desechables (Fig 10)
3515 Papel filtro Nordm 2
352 Procedimiento (Fig 11)
3521 La sangre capilar se obtiene de la cara lateral del dedo medio o anularen los adultos y del dedo gordo del pie o taloacuten en los nintildeos
3522 Desinfectar la zona con alcohol al 70 secar con algodoacuten esteacuteril
3523 Punzar la piel con una lanceta esteacuteril desechable (2 mm de profundidad)
3524 Usar gasa esteacuteril para desechar la primera gota y recoger las siguientesen tubos capilares Evitar comprimir la extremidad para obtenersangre porque se altera la composicioacuten sanguiacutenea
353 Ventajas
3531 Puede obtenerse con facilidad
3532 Es preferible cuando han de realizarse extensiones de sangre perifeacuterica
354 Desventajas
3541 Soacutelo se pueden obtener pequentildeas cantidades de sangre y los exaacutemenesde repeticioacuten requieren nuevas muestras
3542 La sangre en microtubos (capilares) frecuentemente se hemolizainterfiendo con la mayoriacutea de pruebas de laboratorio
3543 Los resultados obtenidos en pruebas con sangre capilar no puedenser comparados con los resultados de las pruebas con sangre venosa
3544 El dedo no soacutelo es delicado sino difiacutecil de desinfectar adecuadamenteen el tiempo disponible
3545 En pacientes con resistencia disminuida a la infeccioacuten (aquellos conleucemia agranulocitosis diabetes uremia y enfermedades con deficienciasinmunoloacutegicas) una muestra tomada del dedo es mucho maacutesprobable que conduzca a una infeccioacuten que otra tomada del brazo
3546 El recuento de eritrocitos y leucocitos asiacute como el recuento deplaquetas y reticulocitos no debe realizarse en sangre capilar debidoa la difiacutecil estandarizacioacuten del flujo sanguiacuteneo capilar
EXTRACCIOacuteN DE SANGRE CAPILAR
Fig 10
Fig 11
SECCIOacuteN 4
ANTICOAGULANTES
Una vez extraiacuteda la sangre eacutesta puede conservarse coagulada o
mantenidaincoagulable mediante la adicioacuten de un anticoagulante
41 CARACTERIacuteSTICAS BAacuteSICAS DE LOS ANTICOAGULANTES MAacuteS
USADOSEN HEMATOLOGIacuteA
bull No alterar el tamantildeo de los hematiacutees
bull No producir hemoacutelisis
bull Evitar al maacuteximo la agregacioacuten plaquetaria
bull No alterar la morfologiacutea de los leucocitos
La sangre tratada con anticoagulante debe procesarse lo antes posible
inclusomantenida bajo refrigeracioacuten (4 ordmC) si no pasan de las 2 horas El
tiempomaacuteximo entre la extraccioacuten de la sangre y su procesamiento depende
delcoagulante de eleccioacuten y no debe ser maacutes de 4 horas a excepcioacuten
delanticoagulante EDTA (etilendiaminotetraceacutetico) que puede ser hasta 24
horas(en refrigeracioacuten a 4 ordmC)
Los anticoagulantes pueden emplearse en forma soacutelida o liacutequida Los
primerosestaacuten indicados para la determinacioacuten de los paraacutemetros
hematoloacutegicosya que no producen como los anticoagulantes liacutequidos dilucioacuten de
la sangre
42 ANTICOAGULANTES SOacuteLIDOS
421 EDTA
Es la sal disoacutedica o tripotaacutesica del aacutecido etilendiaminotetraceacutetico La saldisoacutedica
(Na2EDTA) es menos soluble que la sal tripotaacutesica (K3EDTA) Estoscompuestos
realizan su accioacuten a traveacutes de un efecto quelante sobre el calcioal fijarlo impiden
su activacioacuten y por ende la coagulacioacuten sanguiacutenea
4211 Ventajas
bull Respeta la morfologiacutea eritrocitaria (especialmente la sal tripotaacutesica) yleucocitaria de manera que permite una demora de dos horas en la realizacioacutendel frotis sanguiacuteneo despueacutes de la extraccioacuten sanguiacutenea
bull Asegura la conservacioacuten de los elementos formes sanguiacuteneos durante 24horas si la sangre se mantiene a 4 ordmC
bull Al inhibir la aglutinacioacuten de las plaquetas facilita su recuento o su expresioacutensemicuantitativa a partir del frotis
bull La concentracioacuten recomendada de EDTA es de 15 mgmL de sangre Unamayor cantidad de anticoagulante puede producir retraccioacuten celular condisminucioacuten del hematocrito y un aumento de la concentracioacuten media de lahemoglobina Un exceso de sangre con relacioacuten al anticoagulante produceformacioacuten de microagregados que pueden alterar los resultados El empleode tubos al vaciacuteo con una gota (50mL) de EDTA tripotaacutesica comercialpara 5 mL de sangre es de intereacutes praacutectico dado que es cien veces maacutessoluble facilitando la mezcla de sangre con anticoagulante
4212 Desventajas
Usado en exceso afecta a los eritrocitos y a los leucocitos a los cuales les produce encogimiento y cambios en su forma por ello debe cuidarse de agregar la cantidad correcta de sangre al anticoagulante
422 Anticoagulante de Wintrobe
Es una mezcla de oxalato de amonio y potasio Actuacutea por precipitacioacuten del calcio es faacutecil de preparar Se emplea en forma de polvo en proporcioacuten de 2 de oxalato de amonio por 1 de oxalato de potasio La cantidad recomendada es de 2 mg x mL de sangre Este anticoagulante no afecta el volumen globular medio y puede usarse para determinaciones de hemoglobina hematocrito y recuento globular pero para los extendidos queda limitada a los primeros minutos tampoco es uacutetil para el recuento plaquetario porque produce formacioacuten de agregados plaquetarios
423 Heparina
El nombre de heparina proviene del griego hepar que significa hiacutegado ya que fue aislado por primera vez de las ceacutelulas de este tejido Es un mucopolisacaacuterido aacutecido Presenta el
inconveniente de que si no se agita raacutepidamente con la sangre despueacutes de extraiacuteda
pueden formarse microcoaacutegulos aunque no altera el volumeneritrocitario ni la morfologiacutea de los leucocitos No es recomendablepara el frotis sanguiacuteneo porque produce un fondo azul en la laacutemina
La heparina de sodio o litio puede usarse en forma soacutelida o liacutequida en
proporcioacutende 01 - 02 mg de heparina por 1 mL de sangre
43 ANTICOAGULANTES LIacuteQUIDOS
431 Citrato trisoacutedico
Es de eleccioacuten para las pruebas de hemostasia y la velocidad de sedimentacioacuten
Actuacutea a traveacutes de la precipitacioacuten del calcio La concentracioacuten depende de
la prueba por realizar
bull Para pruebas de hemostasia se emplea en proporcioacuten de 1 9 (05 mL
deanticoagulante para 45 mL de sangre total)
bull Para la determinacioacuten de la VSG (Velocidad de Sedimentacioacuten Globular) es14
(05 mL de anticoagulante para 2 mL de sangre)
432 Oxalato soacutedico
Recomendado tambieacuten para las pruebas de hemostasia Se emplea en
proporcioacutende un volumen de anticoagulante para 4 vol de sangre
SECCIOacuteN 5
REALIZACIOacuteN Y TINCIOacuteN DEL FROTIS SANGUIacuteNEO
La praacutectica del frotis sanguiacuteneo tambieacuten llamado extendido es de gran importanciaen hematologiacutea ya que el diagnoacutestico de muchas enfermedadeshematoloacutegicas puede realizarse con soacutelo observar las caracteriacutesticasmorfoloacutegicas de las ceacutelulas sanguiacuteneas de manera que eacuteste no debe serexcesivamente grueso ni excesivamente fino Todas las laacuteminas por usarsobre todo nuevas deben ser limpiadas con algodoacuten y alcohol al 70 paraeliminar la grasa que viene adherida
51 MEacuteTODO DE LOS DOS PORTAOBJETOS
511 Materiales
- Alcohol al 70
- Algodoacuten
- Lanceta descartable
- Portaobjetos de vidrios limpios y desgrasados (25 x 75 mm)
512 Fundamento
Consiste en la extensioacuten de una gota de sangre sobre un portaobjeto (25 x 75)empleando el canto biselado de otro portaobjeto de igual dimensioacuten (Fig 12)
513 Procedimiento
5131 Una vez extraiacuteda la sangre con cualquiera de las metodologiacuteas secoloca una pequentildea gota de sangre (5mL) (aprox 3 mm de diaacutemetro)sobre un portaobjeto a 2 cm aproximadamente de uno de los extremos
5132 Colocar el canto de otro portaobjeto esmerilado sobre la superficiedel primer portaobjeto (en la que se encuentra la gota de sangre)formando un aacutengulo de 45ordm
5134 Deslizar suavemente y a velocidad moderada el portaobjeto sobre elotro en sentido longitudinal hasta que la gota de sangre quede bienextendida sobre la
superficie del primer portaobjeto El grosor delfrotis sanguiacuteneo puede variar seguacuten sea el aacutengulo que formen entresiacute ambos portaobjetos Asiacute si es superior a 45ordm la extensioacuten obtenidaseraacute gruesa y corta si es inferior a 45ordm seraacute larga y fina El secado delfrotis es a temperatura ambiente y en posicioacuten horizontal
Fig 12
1048729 Zona excesivamente gruesa Se halla en la regioacuten inmediata al punto departida de la extensioacuten (cabeza) En ella se aprecia siempre un aumento delinfocitos
1048729 Zona excesivamente fina Corresponde al final de la extensioacuten y termina enun aacuterea donde las ceacutelulas adoptan una posicioacuten acartonada (barbas) Enesta regioacuten existe un exceso de granulocitos y monocitos
1048729 Zona ideal Corresponde a la regioacuten intermedia del frotis y en ella existe unreparto equilibrado de ceacutelulas
52 COLORACIONES USADAS
Una vez seco el frotis se procede a la tincioacuten hematoloacutegica con el colorante deRomanowsky constituido por la mezcla de eosina y azul de metileno Dentrode eacutestas tenemos
521 Colorante de Giemsa
522 Colorante de May-Grunwald
523 Colorante de Wright
524 Colorante de Leishman
Preparacioacuten de colorantes (Anexo A)
1048729 Para el estudio de las ceacutelulas sanguiacuteneas utilizar el colorante 523 y 524
1048729 Para el estudio de hemoparaacutesitos utilizar el colorante 521
1048729 Utilizar el colorante 522 para casos especiales en que se desee observar
con mayor claridad y especificidad los graacutenulos de los neutrofilos
53 TINCIOacuteN CON COLORANTE DE WRIGHT
531 Fundamento
El colorante de Wright va a permitir suministrar un medio para estudiar lasangre y determinar las variaciones y anormalidades de estructura forma ytamantildeo de los eritrocitos su contenido de hemoglobina y sus propiedades decoloracioacuten La informacioacuten obtenida de un frotis de sangre perifeacuterica dependeen gran parte de la calidad del extendido y la coloracioacuten
532 Materiales
5321 Colorante de Wright (Anexo A)
5322 Frasco gotero
5323 Solucioacuten amortiguada tamponada (Anexo A)
533 Procedimiento
5331 Una vez obtenido el frotis sanguiacuteneo se le dejaraacute secar entre 15 y 20minutos
5332 Luego se coloca la preparacioacuten en un soporte y se cubre con el colorantede Wright dejaacutendolo por espacio de 5 minutos
5333 Posteriormente se antildeade solucioacuten amortiguada tamponada en partesiguales hasta obtener un brillo metaacutelico dejando 6 minutos adicionales
5334 Finalmente se lava con agua corriente y se deja secar
5335 Se coloca en el microscopio y con pequentildeo aumento se revisa lacalidad de la coloracioacuten la cantidad aproximada de gloacutebulos blancosy se escoge el sitio para iniciar el recuento Se coloca una gota deaceite de inmersioacuten y se enfoca a un aumento de 100xLa forma de los gloacutebulos rojos se examinaraacute detenidamente observandoademaacutes del color (cantidad de hemoglobina) presencia deplaquetas su agrupacioacuten y distribucioacuten
5336 Posteriormente se hace el recuento diferencial de gloacutebulos blancosen 100
ceacutelulas para lo cual se deberaacute conocer las diferencias entreneutroacutefilos eosinoacutefilos
linfocitos y monocitosUna extensioacuten de sangre bien tentildeida debe caracterizarse
por unabuena diferenciacioacuten de las estructuras subcelulares en los leucocitosuna
coloracioacuten rosada de los hematiacutees y la ausencia de precipitados
Los defectos maacutes frecuentes observados en la tincioacuten del frotis sanguiacuteneoson
Coloracioacuten excesivamente azul debido a
1048729 Frotis excesivamente grueso
1048729 Lavado insuficiente
1048729 Tincioacuten muy prolongada
1048729 Empleo de colorante excesivamente alcalino
Coloracioacuten con una tonalidad rosada
1048729 El colorante el tampoacuten o el agua de lavado tienen un pH demasiadoaacutecido
Presencia de precipitados
1048729 Obedecen a una accioacuten excesiva del colorante Esto se puede evitarcon la
filtracioacuten
SECCIOacuteN 6
HEMOGRAMA-HEMOGLOBINA-HEMATOCRITO
El hemograma de Shilling constituye uno de los exaacutemenes de laboratorio
maacutesusados en el campo de la hematologiacutea Comprende las siguientes pruebas
61 RECUENTO LEUCOCITARIO
Principio
La sangre anticoagulada se deposita en un liacutequido que permite evidenciar
losleucocitos mantenieacutendolos visibles mientras que los eritrocitos
sonhemolizados El recuento del nuacutemero de leucocitos o gloacutebulos blancos se
expresapor mm3 (miliacutemetro cuacutebico)
611 Equipos
- Microscopio
- Hemocitoacutemetro (Caacutemara de Neubauer)
Consta de los siguientes elementos
diams Una laacutemina portaobjeto gruesa en el centro se hallan dos
superficiescuadriculadas iguales separadas del resto de la laacutemina por surcos y
dosbarras transversales algo maacutes elevadas
diams Una laminilla cubreobjetos oacutepticamente plana que al colocarse sobrelas barras
elevadas de la laacutemina forma una caacutemara entre el cubreobjetosy la superficie
cuadriculadaLa altura entre el cubreobjetos y la laacutemina portaobjetos es de 01
mmCada cuadriacutecula mide 3 mm de lado y se divide en 9 cuadrados grandesCada
uno de los cuales mide 1 mm2 de superficie que se subdivide a suvez en 16
cuadrados medianos El cuadrado grande central se divide en25 cuadrados
pequentildeos y cada uno de ellos en 16 cuadraditos Cadacuadrado pequentildeo mide
02 mm de lado (004 mm2 de superficie) y cadacuadradito mide 005 mm de lado
(00025 mm2 de superficie)
612 Materiales y reactivos requeridos
6121 Pipeta de gloacutebulos blancos (De Thoma) o pipeta automaacutetica (de 0 a 100 mL)Presenta cerca del extremo superior una marca de 11 inmediatamentecontinuacutea una dilatacioacuten (bulbo) que contiene una perla que funciona comomezcladora luego sigue el extremo maacutes largo de la pipeta (tallo) que estaacutedividida en 10 partes con 2 marcas 1 (parte final del bulbo) y 05 (a la mitaddel tallo) Se le acopla a su extremo superior 1 tubo de goma y una bombillapara aspirar
6122 Diluyente de gloacutebulos blancos Solucioacuten de Turk al 1
6123 Contador manual (Soacutelo si fuera necesario)
6124 Papel filtro
613 Procedimiento
6131 Una vez obtenida la sangre con anticoagulante o sangre capilar deldedo se procede a aspirar la sangre con la pipeta de gloacutebulos blancoshasta la marca de 05 y a limpiar la punta con papel absorbente
6132 Introducir la pipeta en el tubo que contenga solucioacuten de Turk y absorberhasta la marca de 11 (no debe haber burbujas)
6133 Tapar ambos extremos y proceder a mezclar manualmente o en unrotador automaacutetico por 2 oacute 3 minutos
6134 Monte la laminilla de vidrio en la caacutemara para recuento que debe estarlimpia y seca
6135 Agitar la pipeta y descartar las cuatro primeras gotas para luego colocaruna gota pequentildea de esta solucioacuten en la caacutemara
6136 Deje reposar por espacio de 3 minutos para que las ceacutelulas se sedimenten
6137 Enfocar con objetivo de 10x y contar en 4 cuadrados grandes angularesCuando se usa la pipeta automaacutetica se toma 20 mL (002 mL) desangre total con anticoagulante o sangre capilar con anticoagulante yse diluye en un tubo que contenga 380 mL de solucioacuten de Turk (aquiacutetenemos una dilucioacuten 120)
LECTURA
Fig 13
La lectura se realiza en los campos 1 3 7 y 9 como estaacute indicado en la figuraAdemaacutes de los leucocitos contados dentro de cada uno de los cuadrantes sedeben contar todos los leucocitos que se encuentren adheridos en la liacuteneahorizontal superior y vertical exterior o de lo contrario todos los leucocitosadheridos a la liacutenea horizontal inferior y vertical interior
614 Resultados
Nordm de leucocitos x mm3 = leucocitos contados en 4 camposdividealtura x dilucioacuten x aacuterea
Reemplazando = leucocitos contados en 4 camposdivide110 x 120 x 4=
Leucocitos contados en 4 camposdivide4200=
X1 divide4200= Nordm leucocitos contados x 50
615 Valores de referencia
5000 - 10 000 leucocitos mm3
616 Correccioacuten de valores para restar eritrocitos nucleados
Los normoblastos no se destruyen (lisis) en el liacutequido de dilucioacuten por lo tantopueden observarse al realizar el recuento leucocitario y confundirse con losleucocitos de tal manera que se debe emplear la siguiente foacutermula
Caacutelculo
La concentracioacuten del nuacutemero de normoblastos (por litro) esNuacutemero de normoblatos contados x concentracioacuten o nuacutemero de leucocitos100 + Nordm de normoblastos contados
Ejemplo
Si se cuentan 50 normoblastos y la concentracioacuten del nuacutemero de leucocitos es16 x 109l la concentracioacuten del nuacutemero de normoblastos seraacute
50 x16 = 53 x 109l
100 + 50
y la concentracioacuten de leucocitos corregida seraacute 16 - 53 = 107 x 109lEn unidades tradicionales las concentraciones de normoblastos y leucocitosse expresan por miliacutemetro cuacutebico En tales unidades el caacutelculo correspondienteal ejemplo que se ha dado seriacutea
50 x 16 000 = 5300 mm3
100 + 50
Recuento corregido de gloacutebulos blancos o leucocitos = 16 000 - 5300 = 10 700 mm3
Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2
62 RECUENTO DE GLOacuteBULOS ROJOS
Principio
La sangre se diluye en un liacutequido que nos permite observar claramente loshematiacutees luego esta dilucioacuten se coloca en una caacutemara de Neubauer con laayuda de una pipeta automaacutetica o pipeta Pasteur y se cuentan en el microscopioa un objetivo de 40x para calcular el nuacutemero de gloacutebulos rojos por mm3
621 Equipos
- Microscopio
- Hemocitoacutemetro (caacutemara de Neubauer)
622 Materiales y reactivos requeridos
6221 Pipeta de gloacutebulos rojos (De Thoma) o pipeta automaacutetica (de 0-100 mL)
Presenta cerca del extremo superior una marca de 101 inmediatamentecontinuacutea una dilatacioacuten (bulbo) que contiene una perla roja mezcladoraluego sigue el tallo (extremo maacutes largo) el cual estaacute dividido en 10 partescon 2 marcas 1 acabando el bulbo y 05 a la mitad del tallo Se requiereigual que el recuento de leucocitos una boquilla para aspirar
6222 Diluyente de gloacutebulos rojos Cloruro de Sodio al 09 (ver anexo)
Diluyente de Hayem (ver anexo)
6223 Contador manual (soacutelo si fuera necesario)
6224 Papel filtro
623 Procedimiento
6231 Mezclar la sangre obtenida con el anticoagulante o tomar sangre capilar
6232 Llenar la pipeta de gloacutebulos rojos con sangre hasta la marca de 05para realizar una dilucioacuten de 1200 y si se carga hasta 1 la dilucioacutenseraacute 1100 Limpiar la punta con gasa o papel absorbente
6233 Introducir la pipeta en el tubo o frasquito conteniendo diluyente (Hayem)y llenar de liacutequido de dilucioacuten hasta la marca de 101
6234 Se coloca en un rotador automaacutetico o se hace rotar manualmente de2 a 3 minutos
6235 Agitar bien la pipeta y descartar 3 a 4 gotas del tallo luego colocar unagota pequentildea cerca de un extremo de la caacutemara para que por capilaridadse llene exactamente
6236 Hacer el recuento con objetivo de 40xSe puede realizar con la pipeta automaacutetica se toma 20 mL (002mL)de sangre total con anticoagulante o sangre capilar y se deposita enun tubo de 12 x 75 que contenga 4 mL de solucioacuten de Hayem (aquiacute setiene una dilucioacuten de 1200) Se deja reposar aproximadamente 5minutos y se procede a cargar la caacutemara con la misma pipeta usandoun nuevo tip El inconveniente aquiacute es el gasto de reactivo (4 mL) perolas medidas son mas exactas
6237 Dejar en reposo por 3 minutos
6238 Enfocar la cuadriacutecula a 10x luego con el objetivo de 40x contar sobreel cuadrado grande central de la caacutemara soacutelo en 5 cuadrados pequentildeosuno central y cuatro angulares (80 cuadraditos en total)
6239 En el recuento se incluyen las ceacutelulas que cubren o tocan por dentroo por fuera las liacuteneas limitantes superior e izquierda en el cuadradopequentildeo de recuento y no se consideran los correspondientes a losliacutemites inferior y derechoSe hace el recuento en los puntos ABCD y Ey se sigue los mismos paraacutemetros del recuento de leucocitos
LECTURA
Fig 14
624 Resultados
Nordm de hematiacutees x mm3 = hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeosaltura x dilucioacuten X aacuterea
Reemplazando = hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeos110 x 1200 x 15
= hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeos divide 110 000
= hematiacutees contados x 10 000
625 Valores de referencia
(Unidades tradicionales millones de ceacutelulasmm3)
Hombres 4 500 000 - 5 500 000
Mujeres 4 000 000 - 5 000 000
Nintildeos (4 antildeos) 4 200 000 - 5 200 000
Lactantes (1 - 6 meses) 3 800 000 - 5 200 000
Recieacuten nacidos 5 000 000 - 6 000 000
Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2
63 DETERMINACIOacuteN DEL VOLUMEN GLOBULAR (Hematocrito)
Mide la fraccioacuten que comprende a los gloacutebulos rojos (masa globular) respectoal
volumen total de la muestra de sangre venosa o capilar Puede expresarseen
porcentaje o como valor decimal
Hto= altura de la columna de gloacutebulos rojosdivide altura de la columna de sangre
total(gloacutebulos rojos maacutes plasma)
631 Meacutetodo de Wintrobe
Materiales requeridos
- Tubo de Wintrobe graduado de 0 - 100 mm
- Pipetas Pasteur o pipetas de transferencia
- Tapoacuten de goma
Procedimiento
diams Llenar la sangre extraiacuteda con anticoagulante con una pipeta pasteur
comenzandodesde el fondo hasta la marca superior de 100 mm teniendocuidado
de no provocar espuma
diams Tapar el tubo con un tapoacuten de goma para evitar la evaporacioacuten
diams Centrifugar a 3000 rpm por 30 minutos
Resultados (lectura)
Del tubo graduado se mide directamente el nivel de la columna de gloacutebulosrojos
Valores de referencia
Hombres 40 - 54Mujeres 38 - 48
Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2
632 Meacutetodo de microhematocrito
Materiales requeridos
- Capilares rojos y azules (75 mm x 15 mm)
- Plastilina
Procedimiento
diams Tomar la muestra en capilares rojos heparinizados directamente del pulpejodel
dedo o utilizar capilares azules sin heparina para sangre venosacon
anticoagulante de Wintrobe o EDTA Debe llenarse aproximadamente70 - 80
del capilar
diams Ocluir (tapar) un extremo del capilar con plastilina
diams Colocar el capilar sobre la plataforma del cabezal de una centriacutefuga demicrohematocrito con el extremo ocluido adherido al reborde externo de laplataforma
diams Centrifugar por 5 minutos entre 10 000 - 12 000 rpm
Resultados (lectura)
La lectura se realiza con una escala estandarizada que expenden en el comercio
Uso de la escala
diams Sostenga el tubo frente a la escala de manera que el fondo de la columnade eritrocitos (no el extremo inferior del tubo) quede exactamente al mismonivel de la liacutenea horizontal correspondiente al cero
diams Desplace el tubo a traveacutes de la escala hasta que la liacutenea marcada con elnuacutemero 10 quede al nivel del tope de la columna de plasma Vigile que elfondo de la
columna de eritrocitos continuacutee sobre la liacutenea cero El tubodebe encontrarse completamente en posicioacuten vertical
diams La liacutenea que pase al nivel del tope de la columna de eritrocitos indicaraacute lafraccioacuten de volumen de eacutestos
Valores de referencia
Hombres 40 - 50
Mujeres 38 - 44
Nintildeos (5 antildeos) 38 - 44
Lactantes (3 meses) 37 - 42
Recieacuten nacidos 50 - 58
La disposicioacuten celular esParte superior una columna de plasmaEn la interfase estaacuten los leucocitos yplaquetasParte inferior estaacute la columna deeritrocitos (Fig 15)
64 DOSAJE DE HEMOGLOBINA
Principio
La sangre se diluye en liacutequido de Drabkin el cual hemoliza los hematiacutees yconvierte la hemoglobina en cianometahemoglobina (cianuro de hemiglobina)La solucioacuten que se produce se lee por medio de un espectrofotoacutemetro ofotocoloriacutemetro Su grado de absorbancia es proporcional a la cantidad dehemoglobina que contenga la sangre
641 Materiales y reactivos
6411 Un coloriacutemetro fotoeleacutectrico o un espectrofotoacutemetro
6412 Pipetas
diams Una pipeta para sangre (pipeta de Sahli) graduada hasta 002 mL contubo de goma y boquilla
diams Una pipeta de vidrio graduada de 5 mL
6413 Tubos de ensayo
6414 Reactivo de Drabkin para dilucioacuten
Este reactivo se puede adquirir en tabletas o polvos para disolver en 1litro de agua destilada Si se dispone de una balanza analiacutetica la preparacioacutense puede hacer en el laboratorio Esta solucioacuten se puedeconservar durante un mes en un frasco de vidrio oscuro Deseacutechese sise enturbia
141 Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OrganizacioacutenPanamericana de la Salud Publicacioacuten cientiacutefica Nordm 439 Nordm 2 1983
142 Manual de normas de bioseguridad Instituto Nacional de Salud Serie deNormas Teacutecnicas Nordm 18 2ordf ed 1997
SECCIOacuteN 2
MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD
21 Para la obtencioacuten de muestras el personal involucrado en los diferentesprocesos para los exaacutemenes hematoloacutegicos debe aplicar las medidas debioseguridad establecidas en el Manual de Bioseguridad Serie de NormasTeacutecnicas Nordm 18
22 Se debe controlar sobre todo
221 Al personal que trabaja en el laboratorio de hematologiacutea
222 El proceso de coloracioacuten en el que se debe aplicar las medidas debioseguridad correspondientes al uso y manipulacioacuten de sustanciastoacutexicas o canceriacutegenas
223 Ver lo referente a medidas de proteccioacuten en caso de accidentes porinoculacioacuten
SECCIOacuteN 3
OBTENCIOacuteN DE MUESTRAS SANGUIacuteNEAS
31 OBJETIVO
Establecer y uniformizar criterios en el procedimiento de obtencioacuten de muestrassanguiacuteneas con un adecuado control de calidad ya que de ello dependeque el resultado del anaacutelisis de la muestra sea el correcto Se efectuaraacute enayunas o no dependiendo de la prueba a usar
32 OBTENCIOacuteN DE SANGRE VENOSA CON JERINGA
321 Materiales y equipos requeridos
3211 Algodoacuten
3212 Alcohol al 70
3213 Ligadura o torniquete de 25 a 30 cm de largo
3214 Jeringas de 5 mL
3215 Viales con anticoagulante EDTA
322 Obtencioacuten de la muestra
3221 Verificar que los elementos por utilizar esteacuten listos y que el pacientese sienta coacutemodo
3222 Aplicar el torniquete aproximadamente cuatro dedos por encima de laflexioacuten del codo o a 10 cm del codo sujetar con un medio nudo (Fig 1)
3223 Limpiar la zona con alcohol al 70 o alcohol yodado en un aacuterea de 2pulgadas (Fig 2)
3224 El paciente deberaacute abrir y cerrar la mano durante unos segundos ydespueacutes la mantendraacute cerrada esto ayudaraacute a visualizar las venassuperficiales (Fig 3)
3225 Se retira el estuche protector de la aguja y se coge la jeringa de talmanera que el bisel se encuentre hacia arriba (Fig 4)
3226 Se coloca la aguja en direccioacuten paralela a la vena se perfora la pielhaciendo avanzar la aguja 05-1 cm en el tejido subcutaacuteneo luego seperfora la vena (Fig 5)
3227 Se aspira la jeringa hasta el volumen requerido
3228 Retirar el torniquete e indicar al paciente que deje de hacer puntildeo Secoloca el algodoacuten seco encima de la puncioacuten y se retira la aguja (Fig 6)
3229 Retirar la aguja de la jeringa Verter la muestra lentamente por lasparedes del vial con anticoagulante No olvidar colocar una gota en lalaacutemina portaobjeto para realizar el frotis
32210 Agitar el vial en ciacuterculos sobre la mesa para homogeneizar la muestracon el anticoagulante
PUNTOS PARA LA EXTRACCIOacuteN DE SANGRE
(Toma de muestra)
Se obtiene de las venas de la fosa cubital
PROCEDIMIENTO
Fig 1 Fig 2 Fig 3
Fig 4 Fig 5
Fig 6 Fig 7
33 OBTENCIOacuteN DE SANGRE VENOSA EN TUBOS AL VACIacuteO
331 Materiales requeridos
3311 Algodoacuten
3312 Alcohol al 70
3313 Ligadura o torniquete de 25 a 30 cm de largo
3314 Tubos al vaciacuteo con anticoagulante EDTA (K3) EDTA (Na2) u otroanticoagulante
3315 Agujas con dispositivo para extraccioacuten de sangre al vaciacuteo
- Nordm 21 para adultos
- Nordm 22 para nintildeos y neonatos
De preferencia ambas de bisel corto para evitar la coagulacioacuten
332 Obtencioacuten de la muestra
3321 Repetir los pasos de 3221 a 3224
3322 Se retira el estuche protector de la aguja y eacuteste se enrosca al dispositivopara extraccioacuten de sangre al vaciacuteo
3323 Colocar la ligadura cuatro dedos por encima de la flexioacuten del codo o10 cm por encima de eacuteste y pedir al paciente que abra y cierre la manovarias veces para favorecer la dilatacioacuten de las venas
3324 Una vez escogida la vena desinfectarla con una pieza de algodoacutenembebido en etanol al 70
3325 Se coloca la aguja en direccioacuten paralela a la vena se perfora la pielhaciendo avanzar la aguja entre 05 cm y 1 cm en el tejido subcutaacuteneose inserta el tubo al vaciacuteo por la parte posterior y no preocuparse porla cantidad de sangre extraiacuteda ya que el mismo sonido del vaciacuteo avisaraacuteque la extraccioacuten terminoacute (Fig 8)
3326 Retirar la ligadura tirando del extremo doblado
3327 Colocar un pedazo de algodoacuten seco sobre la parte donde se encuentraoculta la aguja Sacar la aguja con un movimiento raacutepido y depositarlaen el recipiente de metal con desinfectante (Fig 9)
3328 Pedir al paciente que presione firmemente el algodoacuten durante 3 minutoscon el brazo extendido No se recomienda que se flexione el brazoa causa del riesgo que se forme un hematoma
3329 Mezclar por inmersioacuten suave la sangre con el anticoagulante contenidoen el tubo No agitar el contenido
Fig 8 Fig 9
333 Ventajas de una extraccioacuten de sangre venosa
3331 Pueden hacerse repetidos exaacutemenes con la misma muestra
3332 Parte de la muestra (plasma o suero) puede congelarse para referenciafutura
334 Desventajas de una extraccioacuten de sangre venosa
3341 La puncioacuten venosa por su largo procedimiento requiere mayor preparacioacuten que el meacutetodo capilar
3342 El meacutetodo es teacutecnicamente difiacutecil en nintildeos individuos obesos y pacientes en shock
3343 La hemoacutelisis debe ser evitada pues se puede obtener una disminucioacuten en el recuento de eritrocitos
3344 Debe evitarse prolongada estasis venosa producida por el torniquete pues produce hemoacutelisis y otros cambios que ponen la sangre en un estado inadecuado para el anaacutelisis de gases recuentos celulares determinacioacuten de pH sanguiacuteneo y algunas pruebas de coagulacioacuten
3345 La sangre anticoagulada si no es de obtencioacuten reciente no debe ser utilizada en extensiones de sangre pues algunos anticoagulantes producen cambios en las plaquetas que pueden causar aglutinaciones agregacioacuten plaquetaria y dificultan la identificacioacuten de leucocitos
3346 Puesto que algunos de los componentes de la sangre no son estables los recuentos de leucocitos y plaquetas e iacutendice de sedimentacioacuten deben realizarse antes de que pasen dos horas desde que se obtuvo la muestra
34 OBTENCIOacuteN DE SANGRE DE LA VENA YUGULAR EXTERNA
341 Materiales requeridos
3411 Algodoacuten
3412 Alcohol al 70
3413 Jeringas de 5 mL
3414 Viales con anticoagulante EDTA
342 Obtencioacuten de la muestra
3421 El paciente es cubierto por una saacutebana de manera que los brazospermanezcan inmovilizados a lo largo del cuerpo
3422 Al paciente se le coloca de cuacutebito dorsal sobre la mesa de examen ouna
camilla de manera que la cabeza cuelgue sobre el final de lamesa y el cuerpo sea
sujetado por un asistente
3423 Cuando el paciente grita la vena yugular externa se marca claramente
3424 Limpiar la zona en un aacuterea de 2 pulgadas con alcohol al 70 o
alcoholyodado
3425 Se repiten los pasos de 3225 a 3227 de la extraccioacuten de sangrevenosa
con jeringa
3426 Retirar la aguja de la vena y presionar suavemente con un algodoacutenseco
aproximadamente de 3 a 5 minutos Pedir al paciente que permanezcaechado diez
minutos
3427 Se repiten los pasos de 3229
3428 Se repiten los pasos de 32210
343 Ventajas
Constituye un buen meacutetodo para la obtencioacuten de sangre en pacientes conshock
con venas colapsadas
344 Desventajas
Por lo delicado en su procedimiento no se recomienda como rutina soacutelo encasos
en que no se pueda obtener la muestra por meacutetodos convencionales
35 OBTENCIOacuteN DE SANGRE CAPILAR
Cuando la cantidad de sangre que se precisa es muy pequentildea o cuando
pordiferentes motivos no pueda practicarse una puncioacuten venosa debe recurrirse
a la puncioacuten capilar
351 Materiales requeridos
3512 Algodoacuten
3513 Alcohol al 70
3514 Lancetas desechables (Fig 10)
3515 Papel filtro Nordm 2
352 Procedimiento (Fig 11)
3521 La sangre capilar se obtiene de la cara lateral del dedo medio o anularen los adultos y del dedo gordo del pie o taloacuten en los nintildeos
3522 Desinfectar la zona con alcohol al 70 secar con algodoacuten esteacuteril
3523 Punzar la piel con una lanceta esteacuteril desechable (2 mm de profundidad)
3524 Usar gasa esteacuteril para desechar la primera gota y recoger las siguientesen tubos capilares Evitar comprimir la extremidad para obtenersangre porque se altera la composicioacuten sanguiacutenea
353 Ventajas
3531 Puede obtenerse con facilidad
3532 Es preferible cuando han de realizarse extensiones de sangre perifeacuterica
354 Desventajas
3541 Soacutelo se pueden obtener pequentildeas cantidades de sangre y los exaacutemenesde repeticioacuten requieren nuevas muestras
3542 La sangre en microtubos (capilares) frecuentemente se hemolizainterfiendo con la mayoriacutea de pruebas de laboratorio
3543 Los resultados obtenidos en pruebas con sangre capilar no puedenser comparados con los resultados de las pruebas con sangre venosa
3544 El dedo no soacutelo es delicado sino difiacutecil de desinfectar adecuadamenteen el tiempo disponible
3545 En pacientes con resistencia disminuida a la infeccioacuten (aquellos conleucemia agranulocitosis diabetes uremia y enfermedades con deficienciasinmunoloacutegicas) una muestra tomada del dedo es mucho maacutesprobable que conduzca a una infeccioacuten que otra tomada del brazo
3546 El recuento de eritrocitos y leucocitos asiacute como el recuento deplaquetas y reticulocitos no debe realizarse en sangre capilar debidoa la difiacutecil estandarizacioacuten del flujo sanguiacuteneo capilar
EXTRACCIOacuteN DE SANGRE CAPILAR
Fig 10
Fig 11
SECCIOacuteN 4
ANTICOAGULANTES
Una vez extraiacuteda la sangre eacutesta puede conservarse coagulada o
mantenidaincoagulable mediante la adicioacuten de un anticoagulante
41 CARACTERIacuteSTICAS BAacuteSICAS DE LOS ANTICOAGULANTES MAacuteS
USADOSEN HEMATOLOGIacuteA
bull No alterar el tamantildeo de los hematiacutees
bull No producir hemoacutelisis
bull Evitar al maacuteximo la agregacioacuten plaquetaria
bull No alterar la morfologiacutea de los leucocitos
La sangre tratada con anticoagulante debe procesarse lo antes posible
inclusomantenida bajo refrigeracioacuten (4 ordmC) si no pasan de las 2 horas El
tiempomaacuteximo entre la extraccioacuten de la sangre y su procesamiento depende
delcoagulante de eleccioacuten y no debe ser maacutes de 4 horas a excepcioacuten
delanticoagulante EDTA (etilendiaminotetraceacutetico) que puede ser hasta 24
horas(en refrigeracioacuten a 4 ordmC)
Los anticoagulantes pueden emplearse en forma soacutelida o liacutequida Los
primerosestaacuten indicados para la determinacioacuten de los paraacutemetros
hematoloacutegicosya que no producen como los anticoagulantes liacutequidos dilucioacuten de
la sangre
42 ANTICOAGULANTES SOacuteLIDOS
421 EDTA
Es la sal disoacutedica o tripotaacutesica del aacutecido etilendiaminotetraceacutetico La saldisoacutedica
(Na2EDTA) es menos soluble que la sal tripotaacutesica (K3EDTA) Estoscompuestos
realizan su accioacuten a traveacutes de un efecto quelante sobre el calcioal fijarlo impiden
su activacioacuten y por ende la coagulacioacuten sanguiacutenea
4211 Ventajas
bull Respeta la morfologiacutea eritrocitaria (especialmente la sal tripotaacutesica) yleucocitaria de manera que permite una demora de dos horas en la realizacioacutendel frotis sanguiacuteneo despueacutes de la extraccioacuten sanguiacutenea
bull Asegura la conservacioacuten de los elementos formes sanguiacuteneos durante 24horas si la sangre se mantiene a 4 ordmC
bull Al inhibir la aglutinacioacuten de las plaquetas facilita su recuento o su expresioacutensemicuantitativa a partir del frotis
bull La concentracioacuten recomendada de EDTA es de 15 mgmL de sangre Unamayor cantidad de anticoagulante puede producir retraccioacuten celular condisminucioacuten del hematocrito y un aumento de la concentracioacuten media de lahemoglobina Un exceso de sangre con relacioacuten al anticoagulante produceformacioacuten de microagregados que pueden alterar los resultados El empleode tubos al vaciacuteo con una gota (50mL) de EDTA tripotaacutesica comercialpara 5 mL de sangre es de intereacutes praacutectico dado que es cien veces maacutessoluble facilitando la mezcla de sangre con anticoagulante
4212 Desventajas
Usado en exceso afecta a los eritrocitos y a los leucocitos a los cuales les produce encogimiento y cambios en su forma por ello debe cuidarse de agregar la cantidad correcta de sangre al anticoagulante
422 Anticoagulante de Wintrobe
Es una mezcla de oxalato de amonio y potasio Actuacutea por precipitacioacuten del calcio es faacutecil de preparar Se emplea en forma de polvo en proporcioacuten de 2 de oxalato de amonio por 1 de oxalato de potasio La cantidad recomendada es de 2 mg x mL de sangre Este anticoagulante no afecta el volumen globular medio y puede usarse para determinaciones de hemoglobina hematocrito y recuento globular pero para los extendidos queda limitada a los primeros minutos tampoco es uacutetil para el recuento plaquetario porque produce formacioacuten de agregados plaquetarios
423 Heparina
El nombre de heparina proviene del griego hepar que significa hiacutegado ya que fue aislado por primera vez de las ceacutelulas de este tejido Es un mucopolisacaacuterido aacutecido Presenta el
inconveniente de que si no se agita raacutepidamente con la sangre despueacutes de extraiacuteda
pueden formarse microcoaacutegulos aunque no altera el volumeneritrocitario ni la morfologiacutea de los leucocitos No es recomendablepara el frotis sanguiacuteneo porque produce un fondo azul en la laacutemina
La heparina de sodio o litio puede usarse en forma soacutelida o liacutequida en
proporcioacutende 01 - 02 mg de heparina por 1 mL de sangre
43 ANTICOAGULANTES LIacuteQUIDOS
431 Citrato trisoacutedico
Es de eleccioacuten para las pruebas de hemostasia y la velocidad de sedimentacioacuten
Actuacutea a traveacutes de la precipitacioacuten del calcio La concentracioacuten depende de
la prueba por realizar
bull Para pruebas de hemostasia se emplea en proporcioacuten de 1 9 (05 mL
deanticoagulante para 45 mL de sangre total)
bull Para la determinacioacuten de la VSG (Velocidad de Sedimentacioacuten Globular) es14
(05 mL de anticoagulante para 2 mL de sangre)
432 Oxalato soacutedico
Recomendado tambieacuten para las pruebas de hemostasia Se emplea en
proporcioacutende un volumen de anticoagulante para 4 vol de sangre
SECCIOacuteN 5
REALIZACIOacuteN Y TINCIOacuteN DEL FROTIS SANGUIacuteNEO
La praacutectica del frotis sanguiacuteneo tambieacuten llamado extendido es de gran importanciaen hematologiacutea ya que el diagnoacutestico de muchas enfermedadeshematoloacutegicas puede realizarse con soacutelo observar las caracteriacutesticasmorfoloacutegicas de las ceacutelulas sanguiacuteneas de manera que eacuteste no debe serexcesivamente grueso ni excesivamente fino Todas las laacuteminas por usarsobre todo nuevas deben ser limpiadas con algodoacuten y alcohol al 70 paraeliminar la grasa que viene adherida
51 MEacuteTODO DE LOS DOS PORTAOBJETOS
511 Materiales
- Alcohol al 70
- Algodoacuten
- Lanceta descartable
- Portaobjetos de vidrios limpios y desgrasados (25 x 75 mm)
512 Fundamento
Consiste en la extensioacuten de una gota de sangre sobre un portaobjeto (25 x 75)empleando el canto biselado de otro portaobjeto de igual dimensioacuten (Fig 12)
513 Procedimiento
5131 Una vez extraiacuteda la sangre con cualquiera de las metodologiacuteas secoloca una pequentildea gota de sangre (5mL) (aprox 3 mm de diaacutemetro)sobre un portaobjeto a 2 cm aproximadamente de uno de los extremos
5132 Colocar el canto de otro portaobjeto esmerilado sobre la superficiedel primer portaobjeto (en la que se encuentra la gota de sangre)formando un aacutengulo de 45ordm
5134 Deslizar suavemente y a velocidad moderada el portaobjeto sobre elotro en sentido longitudinal hasta que la gota de sangre quede bienextendida sobre la
superficie del primer portaobjeto El grosor delfrotis sanguiacuteneo puede variar seguacuten sea el aacutengulo que formen entresiacute ambos portaobjetos Asiacute si es superior a 45ordm la extensioacuten obtenidaseraacute gruesa y corta si es inferior a 45ordm seraacute larga y fina El secado delfrotis es a temperatura ambiente y en posicioacuten horizontal
Fig 12
1048729 Zona excesivamente gruesa Se halla en la regioacuten inmediata al punto departida de la extensioacuten (cabeza) En ella se aprecia siempre un aumento delinfocitos
1048729 Zona excesivamente fina Corresponde al final de la extensioacuten y termina enun aacuterea donde las ceacutelulas adoptan una posicioacuten acartonada (barbas) Enesta regioacuten existe un exceso de granulocitos y monocitos
1048729 Zona ideal Corresponde a la regioacuten intermedia del frotis y en ella existe unreparto equilibrado de ceacutelulas
52 COLORACIONES USADAS
Una vez seco el frotis se procede a la tincioacuten hematoloacutegica con el colorante deRomanowsky constituido por la mezcla de eosina y azul de metileno Dentrode eacutestas tenemos
521 Colorante de Giemsa
522 Colorante de May-Grunwald
523 Colorante de Wright
524 Colorante de Leishman
Preparacioacuten de colorantes (Anexo A)
1048729 Para el estudio de las ceacutelulas sanguiacuteneas utilizar el colorante 523 y 524
1048729 Para el estudio de hemoparaacutesitos utilizar el colorante 521
1048729 Utilizar el colorante 522 para casos especiales en que se desee observar
con mayor claridad y especificidad los graacutenulos de los neutrofilos
53 TINCIOacuteN CON COLORANTE DE WRIGHT
531 Fundamento
El colorante de Wright va a permitir suministrar un medio para estudiar lasangre y determinar las variaciones y anormalidades de estructura forma ytamantildeo de los eritrocitos su contenido de hemoglobina y sus propiedades decoloracioacuten La informacioacuten obtenida de un frotis de sangre perifeacuterica dependeen gran parte de la calidad del extendido y la coloracioacuten
532 Materiales
5321 Colorante de Wright (Anexo A)
5322 Frasco gotero
5323 Solucioacuten amortiguada tamponada (Anexo A)
533 Procedimiento
5331 Una vez obtenido el frotis sanguiacuteneo se le dejaraacute secar entre 15 y 20minutos
5332 Luego se coloca la preparacioacuten en un soporte y se cubre con el colorantede Wright dejaacutendolo por espacio de 5 minutos
5333 Posteriormente se antildeade solucioacuten amortiguada tamponada en partesiguales hasta obtener un brillo metaacutelico dejando 6 minutos adicionales
5334 Finalmente se lava con agua corriente y se deja secar
5335 Se coloca en el microscopio y con pequentildeo aumento se revisa lacalidad de la coloracioacuten la cantidad aproximada de gloacutebulos blancosy se escoge el sitio para iniciar el recuento Se coloca una gota deaceite de inmersioacuten y se enfoca a un aumento de 100xLa forma de los gloacutebulos rojos se examinaraacute detenidamente observandoademaacutes del color (cantidad de hemoglobina) presencia deplaquetas su agrupacioacuten y distribucioacuten
5336 Posteriormente se hace el recuento diferencial de gloacutebulos blancosen 100
ceacutelulas para lo cual se deberaacute conocer las diferencias entreneutroacutefilos eosinoacutefilos
linfocitos y monocitosUna extensioacuten de sangre bien tentildeida debe caracterizarse
por unabuena diferenciacioacuten de las estructuras subcelulares en los leucocitosuna
coloracioacuten rosada de los hematiacutees y la ausencia de precipitados
Los defectos maacutes frecuentes observados en la tincioacuten del frotis sanguiacuteneoson
Coloracioacuten excesivamente azul debido a
1048729 Frotis excesivamente grueso
1048729 Lavado insuficiente
1048729 Tincioacuten muy prolongada
1048729 Empleo de colorante excesivamente alcalino
Coloracioacuten con una tonalidad rosada
1048729 El colorante el tampoacuten o el agua de lavado tienen un pH demasiadoaacutecido
Presencia de precipitados
1048729 Obedecen a una accioacuten excesiva del colorante Esto se puede evitarcon la
filtracioacuten
SECCIOacuteN 6
HEMOGRAMA-HEMOGLOBINA-HEMATOCRITO
El hemograma de Shilling constituye uno de los exaacutemenes de laboratorio
maacutesusados en el campo de la hematologiacutea Comprende las siguientes pruebas
61 RECUENTO LEUCOCITARIO
Principio
La sangre anticoagulada se deposita en un liacutequido que permite evidenciar
losleucocitos mantenieacutendolos visibles mientras que los eritrocitos
sonhemolizados El recuento del nuacutemero de leucocitos o gloacutebulos blancos se
expresapor mm3 (miliacutemetro cuacutebico)
611 Equipos
- Microscopio
- Hemocitoacutemetro (Caacutemara de Neubauer)
Consta de los siguientes elementos
diams Una laacutemina portaobjeto gruesa en el centro se hallan dos
superficiescuadriculadas iguales separadas del resto de la laacutemina por surcos y
dosbarras transversales algo maacutes elevadas
diams Una laminilla cubreobjetos oacutepticamente plana que al colocarse sobrelas barras
elevadas de la laacutemina forma una caacutemara entre el cubreobjetosy la superficie
cuadriculadaLa altura entre el cubreobjetos y la laacutemina portaobjetos es de 01
mmCada cuadriacutecula mide 3 mm de lado y se divide en 9 cuadrados grandesCada
uno de los cuales mide 1 mm2 de superficie que se subdivide a suvez en 16
cuadrados medianos El cuadrado grande central se divide en25 cuadrados
pequentildeos y cada uno de ellos en 16 cuadraditos Cadacuadrado pequentildeo mide
02 mm de lado (004 mm2 de superficie) y cadacuadradito mide 005 mm de lado
(00025 mm2 de superficie)
612 Materiales y reactivos requeridos
6121 Pipeta de gloacutebulos blancos (De Thoma) o pipeta automaacutetica (de 0 a 100 mL)Presenta cerca del extremo superior una marca de 11 inmediatamentecontinuacutea una dilatacioacuten (bulbo) que contiene una perla que funciona comomezcladora luego sigue el extremo maacutes largo de la pipeta (tallo) que estaacutedividida en 10 partes con 2 marcas 1 (parte final del bulbo) y 05 (a la mitaddel tallo) Se le acopla a su extremo superior 1 tubo de goma y una bombillapara aspirar
6122 Diluyente de gloacutebulos blancos Solucioacuten de Turk al 1
6123 Contador manual (Soacutelo si fuera necesario)
6124 Papel filtro
613 Procedimiento
6131 Una vez obtenida la sangre con anticoagulante o sangre capilar deldedo se procede a aspirar la sangre con la pipeta de gloacutebulos blancoshasta la marca de 05 y a limpiar la punta con papel absorbente
6132 Introducir la pipeta en el tubo que contenga solucioacuten de Turk y absorberhasta la marca de 11 (no debe haber burbujas)
6133 Tapar ambos extremos y proceder a mezclar manualmente o en unrotador automaacutetico por 2 oacute 3 minutos
6134 Monte la laminilla de vidrio en la caacutemara para recuento que debe estarlimpia y seca
6135 Agitar la pipeta y descartar las cuatro primeras gotas para luego colocaruna gota pequentildea de esta solucioacuten en la caacutemara
6136 Deje reposar por espacio de 3 minutos para que las ceacutelulas se sedimenten
6137 Enfocar con objetivo de 10x y contar en 4 cuadrados grandes angularesCuando se usa la pipeta automaacutetica se toma 20 mL (002 mL) desangre total con anticoagulante o sangre capilar con anticoagulante yse diluye en un tubo que contenga 380 mL de solucioacuten de Turk (aquiacutetenemos una dilucioacuten 120)
LECTURA
Fig 13
La lectura se realiza en los campos 1 3 7 y 9 como estaacute indicado en la figuraAdemaacutes de los leucocitos contados dentro de cada uno de los cuadrantes sedeben contar todos los leucocitos que se encuentren adheridos en la liacuteneahorizontal superior y vertical exterior o de lo contrario todos los leucocitosadheridos a la liacutenea horizontal inferior y vertical interior
614 Resultados
Nordm de leucocitos x mm3 = leucocitos contados en 4 camposdividealtura x dilucioacuten x aacuterea
Reemplazando = leucocitos contados en 4 camposdivide110 x 120 x 4=
Leucocitos contados en 4 camposdivide4200=
X1 divide4200= Nordm leucocitos contados x 50
615 Valores de referencia
5000 - 10 000 leucocitos mm3
616 Correccioacuten de valores para restar eritrocitos nucleados
Los normoblastos no se destruyen (lisis) en el liacutequido de dilucioacuten por lo tantopueden observarse al realizar el recuento leucocitario y confundirse con losleucocitos de tal manera que se debe emplear la siguiente foacutermula
Caacutelculo
La concentracioacuten del nuacutemero de normoblastos (por litro) esNuacutemero de normoblatos contados x concentracioacuten o nuacutemero de leucocitos100 + Nordm de normoblastos contados
Ejemplo
Si se cuentan 50 normoblastos y la concentracioacuten del nuacutemero de leucocitos es16 x 109l la concentracioacuten del nuacutemero de normoblastos seraacute
50 x16 = 53 x 109l
100 + 50
y la concentracioacuten de leucocitos corregida seraacute 16 - 53 = 107 x 109lEn unidades tradicionales las concentraciones de normoblastos y leucocitosse expresan por miliacutemetro cuacutebico En tales unidades el caacutelculo correspondienteal ejemplo que se ha dado seriacutea
50 x 16 000 = 5300 mm3
100 + 50
Recuento corregido de gloacutebulos blancos o leucocitos = 16 000 - 5300 = 10 700 mm3
Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2
62 RECUENTO DE GLOacuteBULOS ROJOS
Principio
La sangre se diluye en un liacutequido que nos permite observar claramente loshematiacutees luego esta dilucioacuten se coloca en una caacutemara de Neubauer con laayuda de una pipeta automaacutetica o pipeta Pasteur y se cuentan en el microscopioa un objetivo de 40x para calcular el nuacutemero de gloacutebulos rojos por mm3
621 Equipos
- Microscopio
- Hemocitoacutemetro (caacutemara de Neubauer)
622 Materiales y reactivos requeridos
6221 Pipeta de gloacutebulos rojos (De Thoma) o pipeta automaacutetica (de 0-100 mL)
Presenta cerca del extremo superior una marca de 101 inmediatamentecontinuacutea una dilatacioacuten (bulbo) que contiene una perla roja mezcladoraluego sigue el tallo (extremo maacutes largo) el cual estaacute dividido en 10 partescon 2 marcas 1 acabando el bulbo y 05 a la mitad del tallo Se requiereigual que el recuento de leucocitos una boquilla para aspirar
6222 Diluyente de gloacutebulos rojos Cloruro de Sodio al 09 (ver anexo)
Diluyente de Hayem (ver anexo)
6223 Contador manual (soacutelo si fuera necesario)
6224 Papel filtro
623 Procedimiento
6231 Mezclar la sangre obtenida con el anticoagulante o tomar sangre capilar
6232 Llenar la pipeta de gloacutebulos rojos con sangre hasta la marca de 05para realizar una dilucioacuten de 1200 y si se carga hasta 1 la dilucioacutenseraacute 1100 Limpiar la punta con gasa o papel absorbente
6233 Introducir la pipeta en el tubo o frasquito conteniendo diluyente (Hayem)y llenar de liacutequido de dilucioacuten hasta la marca de 101
6234 Se coloca en un rotador automaacutetico o se hace rotar manualmente de2 a 3 minutos
6235 Agitar bien la pipeta y descartar 3 a 4 gotas del tallo luego colocar unagota pequentildea cerca de un extremo de la caacutemara para que por capilaridadse llene exactamente
6236 Hacer el recuento con objetivo de 40xSe puede realizar con la pipeta automaacutetica se toma 20 mL (002mL)de sangre total con anticoagulante o sangre capilar y se deposita enun tubo de 12 x 75 que contenga 4 mL de solucioacuten de Hayem (aquiacute setiene una dilucioacuten de 1200) Se deja reposar aproximadamente 5minutos y se procede a cargar la caacutemara con la misma pipeta usandoun nuevo tip El inconveniente aquiacute es el gasto de reactivo (4 mL) perolas medidas son mas exactas
6237 Dejar en reposo por 3 minutos
6238 Enfocar la cuadriacutecula a 10x luego con el objetivo de 40x contar sobreel cuadrado grande central de la caacutemara soacutelo en 5 cuadrados pequentildeosuno central y cuatro angulares (80 cuadraditos en total)
6239 En el recuento se incluyen las ceacutelulas que cubren o tocan por dentroo por fuera las liacuteneas limitantes superior e izquierda en el cuadradopequentildeo de recuento y no se consideran los correspondientes a losliacutemites inferior y derechoSe hace el recuento en los puntos ABCD y Ey se sigue los mismos paraacutemetros del recuento de leucocitos
LECTURA
Fig 14
624 Resultados
Nordm de hematiacutees x mm3 = hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeosaltura x dilucioacuten X aacuterea
Reemplazando = hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeos110 x 1200 x 15
= hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeos divide 110 000
= hematiacutees contados x 10 000
625 Valores de referencia
(Unidades tradicionales millones de ceacutelulasmm3)
Hombres 4 500 000 - 5 500 000
Mujeres 4 000 000 - 5 000 000
Nintildeos (4 antildeos) 4 200 000 - 5 200 000
Lactantes (1 - 6 meses) 3 800 000 - 5 200 000
Recieacuten nacidos 5 000 000 - 6 000 000
Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2
63 DETERMINACIOacuteN DEL VOLUMEN GLOBULAR (Hematocrito)
Mide la fraccioacuten que comprende a los gloacutebulos rojos (masa globular) respectoal
volumen total de la muestra de sangre venosa o capilar Puede expresarseen
porcentaje o como valor decimal
Hto= altura de la columna de gloacutebulos rojosdivide altura de la columna de sangre
total(gloacutebulos rojos maacutes plasma)
631 Meacutetodo de Wintrobe
Materiales requeridos
- Tubo de Wintrobe graduado de 0 - 100 mm
- Pipetas Pasteur o pipetas de transferencia
- Tapoacuten de goma
Procedimiento
diams Llenar la sangre extraiacuteda con anticoagulante con una pipeta pasteur
comenzandodesde el fondo hasta la marca superior de 100 mm teniendocuidado
de no provocar espuma
diams Tapar el tubo con un tapoacuten de goma para evitar la evaporacioacuten
diams Centrifugar a 3000 rpm por 30 minutos
Resultados (lectura)
Del tubo graduado se mide directamente el nivel de la columna de gloacutebulosrojos
Valores de referencia
Hombres 40 - 54Mujeres 38 - 48
Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2
632 Meacutetodo de microhematocrito
Materiales requeridos
- Capilares rojos y azules (75 mm x 15 mm)
- Plastilina
Procedimiento
diams Tomar la muestra en capilares rojos heparinizados directamente del pulpejodel
dedo o utilizar capilares azules sin heparina para sangre venosacon
anticoagulante de Wintrobe o EDTA Debe llenarse aproximadamente70 - 80
del capilar
diams Ocluir (tapar) un extremo del capilar con plastilina
diams Colocar el capilar sobre la plataforma del cabezal de una centriacutefuga demicrohematocrito con el extremo ocluido adherido al reborde externo de laplataforma
diams Centrifugar por 5 minutos entre 10 000 - 12 000 rpm
Resultados (lectura)
La lectura se realiza con una escala estandarizada que expenden en el comercio
Uso de la escala
diams Sostenga el tubo frente a la escala de manera que el fondo de la columnade eritrocitos (no el extremo inferior del tubo) quede exactamente al mismonivel de la liacutenea horizontal correspondiente al cero
diams Desplace el tubo a traveacutes de la escala hasta que la liacutenea marcada con elnuacutemero 10 quede al nivel del tope de la columna de plasma Vigile que elfondo de la
columna de eritrocitos continuacutee sobre la liacutenea cero El tubodebe encontrarse completamente en posicioacuten vertical
diams La liacutenea que pase al nivel del tope de la columna de eritrocitos indicaraacute lafraccioacuten de volumen de eacutestos
Valores de referencia
Hombres 40 - 50
Mujeres 38 - 44
Nintildeos (5 antildeos) 38 - 44
Lactantes (3 meses) 37 - 42
Recieacuten nacidos 50 - 58
La disposicioacuten celular esParte superior una columna de plasmaEn la interfase estaacuten los leucocitos yplaquetasParte inferior estaacute la columna deeritrocitos (Fig 15)
64 DOSAJE DE HEMOGLOBINA
Principio
La sangre se diluye en liacutequido de Drabkin el cual hemoliza los hematiacutees yconvierte la hemoglobina en cianometahemoglobina (cianuro de hemiglobina)La solucioacuten que se produce se lee por medio de un espectrofotoacutemetro ofotocoloriacutemetro Su grado de absorbancia es proporcional a la cantidad dehemoglobina que contenga la sangre
641 Materiales y reactivos
6411 Un coloriacutemetro fotoeleacutectrico o un espectrofotoacutemetro
6412 Pipetas
diams Una pipeta para sangre (pipeta de Sahli) graduada hasta 002 mL contubo de goma y boquilla
diams Una pipeta de vidrio graduada de 5 mL
6413 Tubos de ensayo
6414 Reactivo de Drabkin para dilucioacuten
Este reactivo se puede adquirir en tabletas o polvos para disolver en 1litro de agua destilada Si se dispone de una balanza analiacutetica la preparacioacutense puede hacer en el laboratorio Esta solucioacuten se puedeconservar durante un mes en un frasco de vidrio oscuro Deseacutechese sise enturbia
MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD
21 Para la obtencioacuten de muestras el personal involucrado en los diferentesprocesos para los exaacutemenes hematoloacutegicos debe aplicar las medidas debioseguridad establecidas en el Manual de Bioseguridad Serie de NormasTeacutecnicas Nordm 18
22 Se debe controlar sobre todo
221 Al personal que trabaja en el laboratorio de hematologiacutea
222 El proceso de coloracioacuten en el que se debe aplicar las medidas debioseguridad correspondientes al uso y manipulacioacuten de sustanciastoacutexicas o canceriacutegenas
223 Ver lo referente a medidas de proteccioacuten en caso de accidentes porinoculacioacuten
SECCIOacuteN 3
OBTENCIOacuteN DE MUESTRAS SANGUIacuteNEAS
31 OBJETIVO
Establecer y uniformizar criterios en el procedimiento de obtencioacuten de muestrassanguiacuteneas con un adecuado control de calidad ya que de ello dependeque el resultado del anaacutelisis de la muestra sea el correcto Se efectuaraacute enayunas o no dependiendo de la prueba a usar
32 OBTENCIOacuteN DE SANGRE VENOSA CON JERINGA
321 Materiales y equipos requeridos
3211 Algodoacuten
3212 Alcohol al 70
3213 Ligadura o torniquete de 25 a 30 cm de largo
3214 Jeringas de 5 mL
3215 Viales con anticoagulante EDTA
322 Obtencioacuten de la muestra
3221 Verificar que los elementos por utilizar esteacuten listos y que el pacientese sienta coacutemodo
3222 Aplicar el torniquete aproximadamente cuatro dedos por encima de laflexioacuten del codo o a 10 cm del codo sujetar con un medio nudo (Fig 1)
3223 Limpiar la zona con alcohol al 70 o alcohol yodado en un aacuterea de 2pulgadas (Fig 2)
3224 El paciente deberaacute abrir y cerrar la mano durante unos segundos ydespueacutes la mantendraacute cerrada esto ayudaraacute a visualizar las venassuperficiales (Fig 3)
3225 Se retira el estuche protector de la aguja y se coge la jeringa de talmanera que el bisel se encuentre hacia arriba (Fig 4)
3226 Se coloca la aguja en direccioacuten paralela a la vena se perfora la pielhaciendo avanzar la aguja 05-1 cm en el tejido subcutaacuteneo luego seperfora la vena (Fig 5)
3227 Se aspira la jeringa hasta el volumen requerido
3228 Retirar el torniquete e indicar al paciente que deje de hacer puntildeo Secoloca el algodoacuten seco encima de la puncioacuten y se retira la aguja (Fig 6)
3229 Retirar la aguja de la jeringa Verter la muestra lentamente por lasparedes del vial con anticoagulante No olvidar colocar una gota en lalaacutemina portaobjeto para realizar el frotis
32210 Agitar el vial en ciacuterculos sobre la mesa para homogeneizar la muestracon el anticoagulante
PUNTOS PARA LA EXTRACCIOacuteN DE SANGRE
(Toma de muestra)
Se obtiene de las venas de la fosa cubital
PROCEDIMIENTO
Fig 1 Fig 2 Fig 3
Fig 4 Fig 5
Fig 6 Fig 7
33 OBTENCIOacuteN DE SANGRE VENOSA EN TUBOS AL VACIacuteO
331 Materiales requeridos
3311 Algodoacuten
3312 Alcohol al 70
3313 Ligadura o torniquete de 25 a 30 cm de largo
3314 Tubos al vaciacuteo con anticoagulante EDTA (K3) EDTA (Na2) u otroanticoagulante
3315 Agujas con dispositivo para extraccioacuten de sangre al vaciacuteo
- Nordm 21 para adultos
- Nordm 22 para nintildeos y neonatos
De preferencia ambas de bisel corto para evitar la coagulacioacuten
332 Obtencioacuten de la muestra
3321 Repetir los pasos de 3221 a 3224
3322 Se retira el estuche protector de la aguja y eacuteste se enrosca al dispositivopara extraccioacuten de sangre al vaciacuteo
3323 Colocar la ligadura cuatro dedos por encima de la flexioacuten del codo o10 cm por encima de eacuteste y pedir al paciente que abra y cierre la manovarias veces para favorecer la dilatacioacuten de las venas
3324 Una vez escogida la vena desinfectarla con una pieza de algodoacutenembebido en etanol al 70
3325 Se coloca la aguja en direccioacuten paralela a la vena se perfora la pielhaciendo avanzar la aguja entre 05 cm y 1 cm en el tejido subcutaacuteneose inserta el tubo al vaciacuteo por la parte posterior y no preocuparse porla cantidad de sangre extraiacuteda ya que el mismo sonido del vaciacuteo avisaraacuteque la extraccioacuten terminoacute (Fig 8)
3326 Retirar la ligadura tirando del extremo doblado
3327 Colocar un pedazo de algodoacuten seco sobre la parte donde se encuentraoculta la aguja Sacar la aguja con un movimiento raacutepido y depositarlaen el recipiente de metal con desinfectante (Fig 9)
3328 Pedir al paciente que presione firmemente el algodoacuten durante 3 minutoscon el brazo extendido No se recomienda que se flexione el brazoa causa del riesgo que se forme un hematoma
3329 Mezclar por inmersioacuten suave la sangre con el anticoagulante contenidoen el tubo No agitar el contenido
Fig 8 Fig 9
333 Ventajas de una extraccioacuten de sangre venosa
3331 Pueden hacerse repetidos exaacutemenes con la misma muestra
3332 Parte de la muestra (plasma o suero) puede congelarse para referenciafutura
334 Desventajas de una extraccioacuten de sangre venosa
3341 La puncioacuten venosa por su largo procedimiento requiere mayor preparacioacuten que el meacutetodo capilar
3342 El meacutetodo es teacutecnicamente difiacutecil en nintildeos individuos obesos y pacientes en shock
3343 La hemoacutelisis debe ser evitada pues se puede obtener una disminucioacuten en el recuento de eritrocitos
3344 Debe evitarse prolongada estasis venosa producida por el torniquete pues produce hemoacutelisis y otros cambios que ponen la sangre en un estado inadecuado para el anaacutelisis de gases recuentos celulares determinacioacuten de pH sanguiacuteneo y algunas pruebas de coagulacioacuten
3345 La sangre anticoagulada si no es de obtencioacuten reciente no debe ser utilizada en extensiones de sangre pues algunos anticoagulantes producen cambios en las plaquetas que pueden causar aglutinaciones agregacioacuten plaquetaria y dificultan la identificacioacuten de leucocitos
3346 Puesto que algunos de los componentes de la sangre no son estables los recuentos de leucocitos y plaquetas e iacutendice de sedimentacioacuten deben realizarse antes de que pasen dos horas desde que se obtuvo la muestra
34 OBTENCIOacuteN DE SANGRE DE LA VENA YUGULAR EXTERNA
341 Materiales requeridos
3411 Algodoacuten
3412 Alcohol al 70
3413 Jeringas de 5 mL
3414 Viales con anticoagulante EDTA
342 Obtencioacuten de la muestra
3421 El paciente es cubierto por una saacutebana de manera que los brazospermanezcan inmovilizados a lo largo del cuerpo
3422 Al paciente se le coloca de cuacutebito dorsal sobre la mesa de examen ouna
camilla de manera que la cabeza cuelgue sobre el final de lamesa y el cuerpo sea
sujetado por un asistente
3423 Cuando el paciente grita la vena yugular externa se marca claramente
3424 Limpiar la zona en un aacuterea de 2 pulgadas con alcohol al 70 o
alcoholyodado
3425 Se repiten los pasos de 3225 a 3227 de la extraccioacuten de sangrevenosa
con jeringa
3426 Retirar la aguja de la vena y presionar suavemente con un algodoacutenseco
aproximadamente de 3 a 5 minutos Pedir al paciente que permanezcaechado diez
minutos
3427 Se repiten los pasos de 3229
3428 Se repiten los pasos de 32210
343 Ventajas
Constituye un buen meacutetodo para la obtencioacuten de sangre en pacientes conshock
con venas colapsadas
344 Desventajas
Por lo delicado en su procedimiento no se recomienda como rutina soacutelo encasos
en que no se pueda obtener la muestra por meacutetodos convencionales
35 OBTENCIOacuteN DE SANGRE CAPILAR
Cuando la cantidad de sangre que se precisa es muy pequentildea o cuando
pordiferentes motivos no pueda practicarse una puncioacuten venosa debe recurrirse
a la puncioacuten capilar
351 Materiales requeridos
3512 Algodoacuten
3513 Alcohol al 70
3514 Lancetas desechables (Fig 10)
3515 Papel filtro Nordm 2
352 Procedimiento (Fig 11)
3521 La sangre capilar se obtiene de la cara lateral del dedo medio o anularen los adultos y del dedo gordo del pie o taloacuten en los nintildeos
3522 Desinfectar la zona con alcohol al 70 secar con algodoacuten esteacuteril
3523 Punzar la piel con una lanceta esteacuteril desechable (2 mm de profundidad)
3524 Usar gasa esteacuteril para desechar la primera gota y recoger las siguientesen tubos capilares Evitar comprimir la extremidad para obtenersangre porque se altera la composicioacuten sanguiacutenea
353 Ventajas
3531 Puede obtenerse con facilidad
3532 Es preferible cuando han de realizarse extensiones de sangre perifeacuterica
354 Desventajas
3541 Soacutelo se pueden obtener pequentildeas cantidades de sangre y los exaacutemenesde repeticioacuten requieren nuevas muestras
3542 La sangre en microtubos (capilares) frecuentemente se hemolizainterfiendo con la mayoriacutea de pruebas de laboratorio
3543 Los resultados obtenidos en pruebas con sangre capilar no puedenser comparados con los resultados de las pruebas con sangre venosa
3544 El dedo no soacutelo es delicado sino difiacutecil de desinfectar adecuadamenteen el tiempo disponible
3545 En pacientes con resistencia disminuida a la infeccioacuten (aquellos conleucemia agranulocitosis diabetes uremia y enfermedades con deficienciasinmunoloacutegicas) una muestra tomada del dedo es mucho maacutesprobable que conduzca a una infeccioacuten que otra tomada del brazo
3546 El recuento de eritrocitos y leucocitos asiacute como el recuento deplaquetas y reticulocitos no debe realizarse en sangre capilar debidoa la difiacutecil estandarizacioacuten del flujo sanguiacuteneo capilar
EXTRACCIOacuteN DE SANGRE CAPILAR
Fig 10
Fig 11
SECCIOacuteN 4
ANTICOAGULANTES
Una vez extraiacuteda la sangre eacutesta puede conservarse coagulada o
mantenidaincoagulable mediante la adicioacuten de un anticoagulante
41 CARACTERIacuteSTICAS BAacuteSICAS DE LOS ANTICOAGULANTES MAacuteS
USADOSEN HEMATOLOGIacuteA
bull No alterar el tamantildeo de los hematiacutees
bull No producir hemoacutelisis
bull Evitar al maacuteximo la agregacioacuten plaquetaria
bull No alterar la morfologiacutea de los leucocitos
La sangre tratada con anticoagulante debe procesarse lo antes posible
inclusomantenida bajo refrigeracioacuten (4 ordmC) si no pasan de las 2 horas El
tiempomaacuteximo entre la extraccioacuten de la sangre y su procesamiento depende
delcoagulante de eleccioacuten y no debe ser maacutes de 4 horas a excepcioacuten
delanticoagulante EDTA (etilendiaminotetraceacutetico) que puede ser hasta 24
horas(en refrigeracioacuten a 4 ordmC)
Los anticoagulantes pueden emplearse en forma soacutelida o liacutequida Los
primerosestaacuten indicados para la determinacioacuten de los paraacutemetros
hematoloacutegicosya que no producen como los anticoagulantes liacutequidos dilucioacuten de
la sangre
42 ANTICOAGULANTES SOacuteLIDOS
421 EDTA
Es la sal disoacutedica o tripotaacutesica del aacutecido etilendiaminotetraceacutetico La saldisoacutedica
(Na2EDTA) es menos soluble que la sal tripotaacutesica (K3EDTA) Estoscompuestos
realizan su accioacuten a traveacutes de un efecto quelante sobre el calcioal fijarlo impiden
su activacioacuten y por ende la coagulacioacuten sanguiacutenea
4211 Ventajas
bull Respeta la morfologiacutea eritrocitaria (especialmente la sal tripotaacutesica) yleucocitaria de manera que permite una demora de dos horas en la realizacioacutendel frotis sanguiacuteneo despueacutes de la extraccioacuten sanguiacutenea
bull Asegura la conservacioacuten de los elementos formes sanguiacuteneos durante 24horas si la sangre se mantiene a 4 ordmC
bull Al inhibir la aglutinacioacuten de las plaquetas facilita su recuento o su expresioacutensemicuantitativa a partir del frotis
bull La concentracioacuten recomendada de EDTA es de 15 mgmL de sangre Unamayor cantidad de anticoagulante puede producir retraccioacuten celular condisminucioacuten del hematocrito y un aumento de la concentracioacuten media de lahemoglobina Un exceso de sangre con relacioacuten al anticoagulante produceformacioacuten de microagregados que pueden alterar los resultados El empleode tubos al vaciacuteo con una gota (50mL) de EDTA tripotaacutesica comercialpara 5 mL de sangre es de intereacutes praacutectico dado que es cien veces maacutessoluble facilitando la mezcla de sangre con anticoagulante
4212 Desventajas
Usado en exceso afecta a los eritrocitos y a los leucocitos a los cuales les produce encogimiento y cambios en su forma por ello debe cuidarse de agregar la cantidad correcta de sangre al anticoagulante
422 Anticoagulante de Wintrobe
Es una mezcla de oxalato de amonio y potasio Actuacutea por precipitacioacuten del calcio es faacutecil de preparar Se emplea en forma de polvo en proporcioacuten de 2 de oxalato de amonio por 1 de oxalato de potasio La cantidad recomendada es de 2 mg x mL de sangre Este anticoagulante no afecta el volumen globular medio y puede usarse para determinaciones de hemoglobina hematocrito y recuento globular pero para los extendidos queda limitada a los primeros minutos tampoco es uacutetil para el recuento plaquetario porque produce formacioacuten de agregados plaquetarios
423 Heparina
El nombre de heparina proviene del griego hepar que significa hiacutegado ya que fue aislado por primera vez de las ceacutelulas de este tejido Es un mucopolisacaacuterido aacutecido Presenta el
inconveniente de que si no se agita raacutepidamente con la sangre despueacutes de extraiacuteda
pueden formarse microcoaacutegulos aunque no altera el volumeneritrocitario ni la morfologiacutea de los leucocitos No es recomendablepara el frotis sanguiacuteneo porque produce un fondo azul en la laacutemina
La heparina de sodio o litio puede usarse en forma soacutelida o liacutequida en
proporcioacutende 01 - 02 mg de heparina por 1 mL de sangre
43 ANTICOAGULANTES LIacuteQUIDOS
431 Citrato trisoacutedico
Es de eleccioacuten para las pruebas de hemostasia y la velocidad de sedimentacioacuten
Actuacutea a traveacutes de la precipitacioacuten del calcio La concentracioacuten depende de
la prueba por realizar
bull Para pruebas de hemostasia se emplea en proporcioacuten de 1 9 (05 mL
deanticoagulante para 45 mL de sangre total)
bull Para la determinacioacuten de la VSG (Velocidad de Sedimentacioacuten Globular) es14
(05 mL de anticoagulante para 2 mL de sangre)
432 Oxalato soacutedico
Recomendado tambieacuten para las pruebas de hemostasia Se emplea en
proporcioacutende un volumen de anticoagulante para 4 vol de sangre
SECCIOacuteN 5
REALIZACIOacuteN Y TINCIOacuteN DEL FROTIS SANGUIacuteNEO
La praacutectica del frotis sanguiacuteneo tambieacuten llamado extendido es de gran importanciaen hematologiacutea ya que el diagnoacutestico de muchas enfermedadeshematoloacutegicas puede realizarse con soacutelo observar las caracteriacutesticasmorfoloacutegicas de las ceacutelulas sanguiacuteneas de manera que eacuteste no debe serexcesivamente grueso ni excesivamente fino Todas las laacuteminas por usarsobre todo nuevas deben ser limpiadas con algodoacuten y alcohol al 70 paraeliminar la grasa que viene adherida
51 MEacuteTODO DE LOS DOS PORTAOBJETOS
511 Materiales
- Alcohol al 70
- Algodoacuten
- Lanceta descartable
- Portaobjetos de vidrios limpios y desgrasados (25 x 75 mm)
512 Fundamento
Consiste en la extensioacuten de una gota de sangre sobre un portaobjeto (25 x 75)empleando el canto biselado de otro portaobjeto de igual dimensioacuten (Fig 12)
513 Procedimiento
5131 Una vez extraiacuteda la sangre con cualquiera de las metodologiacuteas secoloca una pequentildea gota de sangre (5mL) (aprox 3 mm de diaacutemetro)sobre un portaobjeto a 2 cm aproximadamente de uno de los extremos
5132 Colocar el canto de otro portaobjeto esmerilado sobre la superficiedel primer portaobjeto (en la que se encuentra la gota de sangre)formando un aacutengulo de 45ordm
5134 Deslizar suavemente y a velocidad moderada el portaobjeto sobre elotro en sentido longitudinal hasta que la gota de sangre quede bienextendida sobre la
superficie del primer portaobjeto El grosor delfrotis sanguiacuteneo puede variar seguacuten sea el aacutengulo que formen entresiacute ambos portaobjetos Asiacute si es superior a 45ordm la extensioacuten obtenidaseraacute gruesa y corta si es inferior a 45ordm seraacute larga y fina El secado delfrotis es a temperatura ambiente y en posicioacuten horizontal
Fig 12
1048729 Zona excesivamente gruesa Se halla en la regioacuten inmediata al punto departida de la extensioacuten (cabeza) En ella se aprecia siempre un aumento delinfocitos
1048729 Zona excesivamente fina Corresponde al final de la extensioacuten y termina enun aacuterea donde las ceacutelulas adoptan una posicioacuten acartonada (barbas) Enesta regioacuten existe un exceso de granulocitos y monocitos
1048729 Zona ideal Corresponde a la regioacuten intermedia del frotis y en ella existe unreparto equilibrado de ceacutelulas
52 COLORACIONES USADAS
Una vez seco el frotis se procede a la tincioacuten hematoloacutegica con el colorante deRomanowsky constituido por la mezcla de eosina y azul de metileno Dentrode eacutestas tenemos
521 Colorante de Giemsa
522 Colorante de May-Grunwald
523 Colorante de Wright
524 Colorante de Leishman
Preparacioacuten de colorantes (Anexo A)
1048729 Para el estudio de las ceacutelulas sanguiacuteneas utilizar el colorante 523 y 524
1048729 Para el estudio de hemoparaacutesitos utilizar el colorante 521
1048729 Utilizar el colorante 522 para casos especiales en que se desee observar
con mayor claridad y especificidad los graacutenulos de los neutrofilos
53 TINCIOacuteN CON COLORANTE DE WRIGHT
531 Fundamento
El colorante de Wright va a permitir suministrar un medio para estudiar lasangre y determinar las variaciones y anormalidades de estructura forma ytamantildeo de los eritrocitos su contenido de hemoglobina y sus propiedades decoloracioacuten La informacioacuten obtenida de un frotis de sangre perifeacuterica dependeen gran parte de la calidad del extendido y la coloracioacuten
532 Materiales
5321 Colorante de Wright (Anexo A)
5322 Frasco gotero
5323 Solucioacuten amortiguada tamponada (Anexo A)
533 Procedimiento
5331 Una vez obtenido el frotis sanguiacuteneo se le dejaraacute secar entre 15 y 20minutos
5332 Luego se coloca la preparacioacuten en un soporte y se cubre con el colorantede Wright dejaacutendolo por espacio de 5 minutos
5333 Posteriormente se antildeade solucioacuten amortiguada tamponada en partesiguales hasta obtener un brillo metaacutelico dejando 6 minutos adicionales
5334 Finalmente se lava con agua corriente y se deja secar
5335 Se coloca en el microscopio y con pequentildeo aumento se revisa lacalidad de la coloracioacuten la cantidad aproximada de gloacutebulos blancosy se escoge el sitio para iniciar el recuento Se coloca una gota deaceite de inmersioacuten y se enfoca a un aumento de 100xLa forma de los gloacutebulos rojos se examinaraacute detenidamente observandoademaacutes del color (cantidad de hemoglobina) presencia deplaquetas su agrupacioacuten y distribucioacuten
5336 Posteriormente se hace el recuento diferencial de gloacutebulos blancosen 100
ceacutelulas para lo cual se deberaacute conocer las diferencias entreneutroacutefilos eosinoacutefilos
linfocitos y monocitosUna extensioacuten de sangre bien tentildeida debe caracterizarse
por unabuena diferenciacioacuten de las estructuras subcelulares en los leucocitosuna
coloracioacuten rosada de los hematiacutees y la ausencia de precipitados
Los defectos maacutes frecuentes observados en la tincioacuten del frotis sanguiacuteneoson
Coloracioacuten excesivamente azul debido a
1048729 Frotis excesivamente grueso
1048729 Lavado insuficiente
1048729 Tincioacuten muy prolongada
1048729 Empleo de colorante excesivamente alcalino
Coloracioacuten con una tonalidad rosada
1048729 El colorante el tampoacuten o el agua de lavado tienen un pH demasiadoaacutecido
Presencia de precipitados
1048729 Obedecen a una accioacuten excesiva del colorante Esto se puede evitarcon la
filtracioacuten
SECCIOacuteN 6
HEMOGRAMA-HEMOGLOBINA-HEMATOCRITO
El hemograma de Shilling constituye uno de los exaacutemenes de laboratorio
maacutesusados en el campo de la hematologiacutea Comprende las siguientes pruebas
61 RECUENTO LEUCOCITARIO
Principio
La sangre anticoagulada se deposita en un liacutequido que permite evidenciar
losleucocitos mantenieacutendolos visibles mientras que los eritrocitos
sonhemolizados El recuento del nuacutemero de leucocitos o gloacutebulos blancos se
expresapor mm3 (miliacutemetro cuacutebico)
611 Equipos
- Microscopio
- Hemocitoacutemetro (Caacutemara de Neubauer)
Consta de los siguientes elementos
diams Una laacutemina portaobjeto gruesa en el centro se hallan dos
superficiescuadriculadas iguales separadas del resto de la laacutemina por surcos y
dosbarras transversales algo maacutes elevadas
diams Una laminilla cubreobjetos oacutepticamente plana que al colocarse sobrelas barras
elevadas de la laacutemina forma una caacutemara entre el cubreobjetosy la superficie
cuadriculadaLa altura entre el cubreobjetos y la laacutemina portaobjetos es de 01
mmCada cuadriacutecula mide 3 mm de lado y se divide en 9 cuadrados grandesCada
uno de los cuales mide 1 mm2 de superficie que se subdivide a suvez en 16
cuadrados medianos El cuadrado grande central se divide en25 cuadrados
pequentildeos y cada uno de ellos en 16 cuadraditos Cadacuadrado pequentildeo mide
02 mm de lado (004 mm2 de superficie) y cadacuadradito mide 005 mm de lado
(00025 mm2 de superficie)
612 Materiales y reactivos requeridos
6121 Pipeta de gloacutebulos blancos (De Thoma) o pipeta automaacutetica (de 0 a 100 mL)Presenta cerca del extremo superior una marca de 11 inmediatamentecontinuacutea una dilatacioacuten (bulbo) que contiene una perla que funciona comomezcladora luego sigue el extremo maacutes largo de la pipeta (tallo) que estaacutedividida en 10 partes con 2 marcas 1 (parte final del bulbo) y 05 (a la mitaddel tallo) Se le acopla a su extremo superior 1 tubo de goma y una bombillapara aspirar
6122 Diluyente de gloacutebulos blancos Solucioacuten de Turk al 1
6123 Contador manual (Soacutelo si fuera necesario)
6124 Papel filtro
613 Procedimiento
6131 Una vez obtenida la sangre con anticoagulante o sangre capilar deldedo se procede a aspirar la sangre con la pipeta de gloacutebulos blancoshasta la marca de 05 y a limpiar la punta con papel absorbente
6132 Introducir la pipeta en el tubo que contenga solucioacuten de Turk y absorberhasta la marca de 11 (no debe haber burbujas)
6133 Tapar ambos extremos y proceder a mezclar manualmente o en unrotador automaacutetico por 2 oacute 3 minutos
6134 Monte la laminilla de vidrio en la caacutemara para recuento que debe estarlimpia y seca
6135 Agitar la pipeta y descartar las cuatro primeras gotas para luego colocaruna gota pequentildea de esta solucioacuten en la caacutemara
6136 Deje reposar por espacio de 3 minutos para que las ceacutelulas se sedimenten
6137 Enfocar con objetivo de 10x y contar en 4 cuadrados grandes angularesCuando se usa la pipeta automaacutetica se toma 20 mL (002 mL) desangre total con anticoagulante o sangre capilar con anticoagulante yse diluye en un tubo que contenga 380 mL de solucioacuten de Turk (aquiacutetenemos una dilucioacuten 120)
LECTURA
Fig 13
La lectura se realiza en los campos 1 3 7 y 9 como estaacute indicado en la figuraAdemaacutes de los leucocitos contados dentro de cada uno de los cuadrantes sedeben contar todos los leucocitos que se encuentren adheridos en la liacuteneahorizontal superior y vertical exterior o de lo contrario todos los leucocitosadheridos a la liacutenea horizontal inferior y vertical interior
614 Resultados
Nordm de leucocitos x mm3 = leucocitos contados en 4 camposdividealtura x dilucioacuten x aacuterea
Reemplazando = leucocitos contados en 4 camposdivide110 x 120 x 4=
Leucocitos contados en 4 camposdivide4200=
X1 divide4200= Nordm leucocitos contados x 50
615 Valores de referencia
5000 - 10 000 leucocitos mm3
616 Correccioacuten de valores para restar eritrocitos nucleados
Los normoblastos no se destruyen (lisis) en el liacutequido de dilucioacuten por lo tantopueden observarse al realizar el recuento leucocitario y confundirse con losleucocitos de tal manera que se debe emplear la siguiente foacutermula
Caacutelculo
La concentracioacuten del nuacutemero de normoblastos (por litro) esNuacutemero de normoblatos contados x concentracioacuten o nuacutemero de leucocitos100 + Nordm de normoblastos contados
Ejemplo
Si se cuentan 50 normoblastos y la concentracioacuten del nuacutemero de leucocitos es16 x 109l la concentracioacuten del nuacutemero de normoblastos seraacute
50 x16 = 53 x 109l
100 + 50
y la concentracioacuten de leucocitos corregida seraacute 16 - 53 = 107 x 109lEn unidades tradicionales las concentraciones de normoblastos y leucocitosse expresan por miliacutemetro cuacutebico En tales unidades el caacutelculo correspondienteal ejemplo que se ha dado seriacutea
50 x 16 000 = 5300 mm3
100 + 50
Recuento corregido de gloacutebulos blancos o leucocitos = 16 000 - 5300 = 10 700 mm3
Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2
62 RECUENTO DE GLOacuteBULOS ROJOS
Principio
La sangre se diluye en un liacutequido que nos permite observar claramente loshematiacutees luego esta dilucioacuten se coloca en una caacutemara de Neubauer con laayuda de una pipeta automaacutetica o pipeta Pasteur y se cuentan en el microscopioa un objetivo de 40x para calcular el nuacutemero de gloacutebulos rojos por mm3
621 Equipos
- Microscopio
- Hemocitoacutemetro (caacutemara de Neubauer)
622 Materiales y reactivos requeridos
6221 Pipeta de gloacutebulos rojos (De Thoma) o pipeta automaacutetica (de 0-100 mL)
Presenta cerca del extremo superior una marca de 101 inmediatamentecontinuacutea una dilatacioacuten (bulbo) que contiene una perla roja mezcladoraluego sigue el tallo (extremo maacutes largo) el cual estaacute dividido en 10 partescon 2 marcas 1 acabando el bulbo y 05 a la mitad del tallo Se requiereigual que el recuento de leucocitos una boquilla para aspirar
6222 Diluyente de gloacutebulos rojos Cloruro de Sodio al 09 (ver anexo)
Diluyente de Hayem (ver anexo)
6223 Contador manual (soacutelo si fuera necesario)
6224 Papel filtro
623 Procedimiento
6231 Mezclar la sangre obtenida con el anticoagulante o tomar sangre capilar
6232 Llenar la pipeta de gloacutebulos rojos con sangre hasta la marca de 05para realizar una dilucioacuten de 1200 y si se carga hasta 1 la dilucioacutenseraacute 1100 Limpiar la punta con gasa o papel absorbente
6233 Introducir la pipeta en el tubo o frasquito conteniendo diluyente (Hayem)y llenar de liacutequido de dilucioacuten hasta la marca de 101
6234 Se coloca en un rotador automaacutetico o se hace rotar manualmente de2 a 3 minutos
6235 Agitar bien la pipeta y descartar 3 a 4 gotas del tallo luego colocar unagota pequentildea cerca de un extremo de la caacutemara para que por capilaridadse llene exactamente
6236 Hacer el recuento con objetivo de 40xSe puede realizar con la pipeta automaacutetica se toma 20 mL (002mL)de sangre total con anticoagulante o sangre capilar y se deposita enun tubo de 12 x 75 que contenga 4 mL de solucioacuten de Hayem (aquiacute setiene una dilucioacuten de 1200) Se deja reposar aproximadamente 5minutos y se procede a cargar la caacutemara con la misma pipeta usandoun nuevo tip El inconveniente aquiacute es el gasto de reactivo (4 mL) perolas medidas son mas exactas
6237 Dejar en reposo por 3 minutos
6238 Enfocar la cuadriacutecula a 10x luego con el objetivo de 40x contar sobreel cuadrado grande central de la caacutemara soacutelo en 5 cuadrados pequentildeosuno central y cuatro angulares (80 cuadraditos en total)
6239 En el recuento se incluyen las ceacutelulas que cubren o tocan por dentroo por fuera las liacuteneas limitantes superior e izquierda en el cuadradopequentildeo de recuento y no se consideran los correspondientes a losliacutemites inferior y derechoSe hace el recuento en los puntos ABCD y Ey se sigue los mismos paraacutemetros del recuento de leucocitos
LECTURA
Fig 14
624 Resultados
Nordm de hematiacutees x mm3 = hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeosaltura x dilucioacuten X aacuterea
Reemplazando = hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeos110 x 1200 x 15
= hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeos divide 110 000
= hematiacutees contados x 10 000
625 Valores de referencia
(Unidades tradicionales millones de ceacutelulasmm3)
Hombres 4 500 000 - 5 500 000
Mujeres 4 000 000 - 5 000 000
Nintildeos (4 antildeos) 4 200 000 - 5 200 000
Lactantes (1 - 6 meses) 3 800 000 - 5 200 000
Recieacuten nacidos 5 000 000 - 6 000 000
Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2
63 DETERMINACIOacuteN DEL VOLUMEN GLOBULAR (Hematocrito)
Mide la fraccioacuten que comprende a los gloacutebulos rojos (masa globular) respectoal
volumen total de la muestra de sangre venosa o capilar Puede expresarseen
porcentaje o como valor decimal
Hto= altura de la columna de gloacutebulos rojosdivide altura de la columna de sangre
total(gloacutebulos rojos maacutes plasma)
631 Meacutetodo de Wintrobe
Materiales requeridos
- Tubo de Wintrobe graduado de 0 - 100 mm
- Pipetas Pasteur o pipetas de transferencia
- Tapoacuten de goma
Procedimiento
diams Llenar la sangre extraiacuteda con anticoagulante con una pipeta pasteur
comenzandodesde el fondo hasta la marca superior de 100 mm teniendocuidado
de no provocar espuma
diams Tapar el tubo con un tapoacuten de goma para evitar la evaporacioacuten
diams Centrifugar a 3000 rpm por 30 minutos
Resultados (lectura)
Del tubo graduado se mide directamente el nivel de la columna de gloacutebulosrojos
Valores de referencia
Hombres 40 - 54Mujeres 38 - 48
Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2
632 Meacutetodo de microhematocrito
Materiales requeridos
- Capilares rojos y azules (75 mm x 15 mm)
- Plastilina
Procedimiento
diams Tomar la muestra en capilares rojos heparinizados directamente del pulpejodel
dedo o utilizar capilares azules sin heparina para sangre venosacon
anticoagulante de Wintrobe o EDTA Debe llenarse aproximadamente70 - 80
del capilar
diams Ocluir (tapar) un extremo del capilar con plastilina
diams Colocar el capilar sobre la plataforma del cabezal de una centriacutefuga demicrohematocrito con el extremo ocluido adherido al reborde externo de laplataforma
diams Centrifugar por 5 minutos entre 10 000 - 12 000 rpm
Resultados (lectura)
La lectura se realiza con una escala estandarizada que expenden en el comercio
Uso de la escala
diams Sostenga el tubo frente a la escala de manera que el fondo de la columnade eritrocitos (no el extremo inferior del tubo) quede exactamente al mismonivel de la liacutenea horizontal correspondiente al cero
diams Desplace el tubo a traveacutes de la escala hasta que la liacutenea marcada con elnuacutemero 10 quede al nivel del tope de la columna de plasma Vigile que elfondo de la
columna de eritrocitos continuacutee sobre la liacutenea cero El tubodebe encontrarse completamente en posicioacuten vertical
diams La liacutenea que pase al nivel del tope de la columna de eritrocitos indicaraacute lafraccioacuten de volumen de eacutestos
Valores de referencia
Hombres 40 - 50
Mujeres 38 - 44
Nintildeos (5 antildeos) 38 - 44
Lactantes (3 meses) 37 - 42
Recieacuten nacidos 50 - 58
La disposicioacuten celular esParte superior una columna de plasmaEn la interfase estaacuten los leucocitos yplaquetasParte inferior estaacute la columna deeritrocitos (Fig 15)
64 DOSAJE DE HEMOGLOBINA
Principio
La sangre se diluye en liacutequido de Drabkin el cual hemoliza los hematiacutees yconvierte la hemoglobina en cianometahemoglobina (cianuro de hemiglobina)La solucioacuten que se produce se lee por medio de un espectrofotoacutemetro ofotocoloriacutemetro Su grado de absorbancia es proporcional a la cantidad dehemoglobina que contenga la sangre
641 Materiales y reactivos
6411 Un coloriacutemetro fotoeleacutectrico o un espectrofotoacutemetro
6412 Pipetas
diams Una pipeta para sangre (pipeta de Sahli) graduada hasta 002 mL contubo de goma y boquilla
diams Una pipeta de vidrio graduada de 5 mL
6413 Tubos de ensayo
6414 Reactivo de Drabkin para dilucioacuten
Este reactivo se puede adquirir en tabletas o polvos para disolver en 1litro de agua destilada Si se dispone de una balanza analiacutetica la preparacioacutense puede hacer en el laboratorio Esta solucioacuten se puedeconservar durante un mes en un frasco de vidrio oscuro Deseacutechese sise enturbia
OBTENCIOacuteN DE MUESTRAS SANGUIacuteNEAS
31 OBJETIVO
Establecer y uniformizar criterios en el procedimiento de obtencioacuten de muestrassanguiacuteneas con un adecuado control de calidad ya que de ello dependeque el resultado del anaacutelisis de la muestra sea el correcto Se efectuaraacute enayunas o no dependiendo de la prueba a usar
32 OBTENCIOacuteN DE SANGRE VENOSA CON JERINGA
321 Materiales y equipos requeridos
3211 Algodoacuten
3212 Alcohol al 70
3213 Ligadura o torniquete de 25 a 30 cm de largo
3214 Jeringas de 5 mL
3215 Viales con anticoagulante EDTA
322 Obtencioacuten de la muestra
3221 Verificar que los elementos por utilizar esteacuten listos y que el pacientese sienta coacutemodo
3222 Aplicar el torniquete aproximadamente cuatro dedos por encima de laflexioacuten del codo o a 10 cm del codo sujetar con un medio nudo (Fig 1)
3223 Limpiar la zona con alcohol al 70 o alcohol yodado en un aacuterea de 2pulgadas (Fig 2)
3224 El paciente deberaacute abrir y cerrar la mano durante unos segundos ydespueacutes la mantendraacute cerrada esto ayudaraacute a visualizar las venassuperficiales (Fig 3)
3225 Se retira el estuche protector de la aguja y se coge la jeringa de talmanera que el bisel se encuentre hacia arriba (Fig 4)
3226 Se coloca la aguja en direccioacuten paralela a la vena se perfora la pielhaciendo avanzar la aguja 05-1 cm en el tejido subcutaacuteneo luego seperfora la vena (Fig 5)
3227 Se aspira la jeringa hasta el volumen requerido
3228 Retirar el torniquete e indicar al paciente que deje de hacer puntildeo Secoloca el algodoacuten seco encima de la puncioacuten y se retira la aguja (Fig 6)
3229 Retirar la aguja de la jeringa Verter la muestra lentamente por lasparedes del vial con anticoagulante No olvidar colocar una gota en lalaacutemina portaobjeto para realizar el frotis
32210 Agitar el vial en ciacuterculos sobre la mesa para homogeneizar la muestracon el anticoagulante
PUNTOS PARA LA EXTRACCIOacuteN DE SANGRE
(Toma de muestra)
Se obtiene de las venas de la fosa cubital
PROCEDIMIENTO
Fig 1 Fig 2 Fig 3
Fig 4 Fig 5
Fig 6 Fig 7
33 OBTENCIOacuteN DE SANGRE VENOSA EN TUBOS AL VACIacuteO
331 Materiales requeridos
3311 Algodoacuten
3312 Alcohol al 70
3313 Ligadura o torniquete de 25 a 30 cm de largo
3314 Tubos al vaciacuteo con anticoagulante EDTA (K3) EDTA (Na2) u otroanticoagulante
3315 Agujas con dispositivo para extraccioacuten de sangre al vaciacuteo
- Nordm 21 para adultos
- Nordm 22 para nintildeos y neonatos
De preferencia ambas de bisel corto para evitar la coagulacioacuten
332 Obtencioacuten de la muestra
3321 Repetir los pasos de 3221 a 3224
3322 Se retira el estuche protector de la aguja y eacuteste se enrosca al dispositivopara extraccioacuten de sangre al vaciacuteo
3323 Colocar la ligadura cuatro dedos por encima de la flexioacuten del codo o10 cm por encima de eacuteste y pedir al paciente que abra y cierre la manovarias veces para favorecer la dilatacioacuten de las venas
3324 Una vez escogida la vena desinfectarla con una pieza de algodoacutenembebido en etanol al 70
3325 Se coloca la aguja en direccioacuten paralela a la vena se perfora la pielhaciendo avanzar la aguja entre 05 cm y 1 cm en el tejido subcutaacuteneose inserta el tubo al vaciacuteo por la parte posterior y no preocuparse porla cantidad de sangre extraiacuteda ya que el mismo sonido del vaciacuteo avisaraacuteque la extraccioacuten terminoacute (Fig 8)
3326 Retirar la ligadura tirando del extremo doblado
3327 Colocar un pedazo de algodoacuten seco sobre la parte donde se encuentraoculta la aguja Sacar la aguja con un movimiento raacutepido y depositarlaen el recipiente de metal con desinfectante (Fig 9)
3328 Pedir al paciente que presione firmemente el algodoacuten durante 3 minutoscon el brazo extendido No se recomienda que se flexione el brazoa causa del riesgo que se forme un hematoma
3329 Mezclar por inmersioacuten suave la sangre con el anticoagulante contenidoen el tubo No agitar el contenido
Fig 8 Fig 9
333 Ventajas de una extraccioacuten de sangre venosa
3331 Pueden hacerse repetidos exaacutemenes con la misma muestra
3332 Parte de la muestra (plasma o suero) puede congelarse para referenciafutura
334 Desventajas de una extraccioacuten de sangre venosa
3341 La puncioacuten venosa por su largo procedimiento requiere mayor preparacioacuten que el meacutetodo capilar
3342 El meacutetodo es teacutecnicamente difiacutecil en nintildeos individuos obesos y pacientes en shock
3343 La hemoacutelisis debe ser evitada pues se puede obtener una disminucioacuten en el recuento de eritrocitos
3344 Debe evitarse prolongada estasis venosa producida por el torniquete pues produce hemoacutelisis y otros cambios que ponen la sangre en un estado inadecuado para el anaacutelisis de gases recuentos celulares determinacioacuten de pH sanguiacuteneo y algunas pruebas de coagulacioacuten
3345 La sangre anticoagulada si no es de obtencioacuten reciente no debe ser utilizada en extensiones de sangre pues algunos anticoagulantes producen cambios en las plaquetas que pueden causar aglutinaciones agregacioacuten plaquetaria y dificultan la identificacioacuten de leucocitos
3346 Puesto que algunos de los componentes de la sangre no son estables los recuentos de leucocitos y plaquetas e iacutendice de sedimentacioacuten deben realizarse antes de que pasen dos horas desde que se obtuvo la muestra
34 OBTENCIOacuteN DE SANGRE DE LA VENA YUGULAR EXTERNA
341 Materiales requeridos
3411 Algodoacuten
3412 Alcohol al 70
3413 Jeringas de 5 mL
3414 Viales con anticoagulante EDTA
342 Obtencioacuten de la muestra
3421 El paciente es cubierto por una saacutebana de manera que los brazospermanezcan inmovilizados a lo largo del cuerpo
3422 Al paciente se le coloca de cuacutebito dorsal sobre la mesa de examen ouna
camilla de manera que la cabeza cuelgue sobre el final de lamesa y el cuerpo sea
sujetado por un asistente
3423 Cuando el paciente grita la vena yugular externa se marca claramente
3424 Limpiar la zona en un aacuterea de 2 pulgadas con alcohol al 70 o
alcoholyodado
3425 Se repiten los pasos de 3225 a 3227 de la extraccioacuten de sangrevenosa
con jeringa
3426 Retirar la aguja de la vena y presionar suavemente con un algodoacutenseco
aproximadamente de 3 a 5 minutos Pedir al paciente que permanezcaechado diez
minutos
3427 Se repiten los pasos de 3229
3428 Se repiten los pasos de 32210
343 Ventajas
Constituye un buen meacutetodo para la obtencioacuten de sangre en pacientes conshock
con venas colapsadas
344 Desventajas
Por lo delicado en su procedimiento no se recomienda como rutina soacutelo encasos
en que no se pueda obtener la muestra por meacutetodos convencionales
35 OBTENCIOacuteN DE SANGRE CAPILAR
Cuando la cantidad de sangre que se precisa es muy pequentildea o cuando
pordiferentes motivos no pueda practicarse una puncioacuten venosa debe recurrirse
a la puncioacuten capilar
351 Materiales requeridos
3512 Algodoacuten
3513 Alcohol al 70
3514 Lancetas desechables (Fig 10)
3515 Papel filtro Nordm 2
352 Procedimiento (Fig 11)
3521 La sangre capilar se obtiene de la cara lateral del dedo medio o anularen los adultos y del dedo gordo del pie o taloacuten en los nintildeos
3522 Desinfectar la zona con alcohol al 70 secar con algodoacuten esteacuteril
3523 Punzar la piel con una lanceta esteacuteril desechable (2 mm de profundidad)
3524 Usar gasa esteacuteril para desechar la primera gota y recoger las siguientesen tubos capilares Evitar comprimir la extremidad para obtenersangre porque se altera la composicioacuten sanguiacutenea
353 Ventajas
3531 Puede obtenerse con facilidad
3532 Es preferible cuando han de realizarse extensiones de sangre perifeacuterica
354 Desventajas
3541 Soacutelo se pueden obtener pequentildeas cantidades de sangre y los exaacutemenesde repeticioacuten requieren nuevas muestras
3542 La sangre en microtubos (capilares) frecuentemente se hemolizainterfiendo con la mayoriacutea de pruebas de laboratorio
3543 Los resultados obtenidos en pruebas con sangre capilar no puedenser comparados con los resultados de las pruebas con sangre venosa
3544 El dedo no soacutelo es delicado sino difiacutecil de desinfectar adecuadamenteen el tiempo disponible
3545 En pacientes con resistencia disminuida a la infeccioacuten (aquellos conleucemia agranulocitosis diabetes uremia y enfermedades con deficienciasinmunoloacutegicas) una muestra tomada del dedo es mucho maacutesprobable que conduzca a una infeccioacuten que otra tomada del brazo
3546 El recuento de eritrocitos y leucocitos asiacute como el recuento deplaquetas y reticulocitos no debe realizarse en sangre capilar debidoa la difiacutecil estandarizacioacuten del flujo sanguiacuteneo capilar
EXTRACCIOacuteN DE SANGRE CAPILAR
Fig 10
Fig 11
SECCIOacuteN 4
ANTICOAGULANTES
Una vez extraiacuteda la sangre eacutesta puede conservarse coagulada o
mantenidaincoagulable mediante la adicioacuten de un anticoagulante
41 CARACTERIacuteSTICAS BAacuteSICAS DE LOS ANTICOAGULANTES MAacuteS
USADOSEN HEMATOLOGIacuteA
bull No alterar el tamantildeo de los hematiacutees
bull No producir hemoacutelisis
bull Evitar al maacuteximo la agregacioacuten plaquetaria
bull No alterar la morfologiacutea de los leucocitos
La sangre tratada con anticoagulante debe procesarse lo antes posible
inclusomantenida bajo refrigeracioacuten (4 ordmC) si no pasan de las 2 horas El
tiempomaacuteximo entre la extraccioacuten de la sangre y su procesamiento depende
delcoagulante de eleccioacuten y no debe ser maacutes de 4 horas a excepcioacuten
delanticoagulante EDTA (etilendiaminotetraceacutetico) que puede ser hasta 24
horas(en refrigeracioacuten a 4 ordmC)
Los anticoagulantes pueden emplearse en forma soacutelida o liacutequida Los
primerosestaacuten indicados para la determinacioacuten de los paraacutemetros
hematoloacutegicosya que no producen como los anticoagulantes liacutequidos dilucioacuten de
la sangre
42 ANTICOAGULANTES SOacuteLIDOS
421 EDTA
Es la sal disoacutedica o tripotaacutesica del aacutecido etilendiaminotetraceacutetico La saldisoacutedica
(Na2EDTA) es menos soluble que la sal tripotaacutesica (K3EDTA) Estoscompuestos
realizan su accioacuten a traveacutes de un efecto quelante sobre el calcioal fijarlo impiden
su activacioacuten y por ende la coagulacioacuten sanguiacutenea
4211 Ventajas
bull Respeta la morfologiacutea eritrocitaria (especialmente la sal tripotaacutesica) yleucocitaria de manera que permite una demora de dos horas en la realizacioacutendel frotis sanguiacuteneo despueacutes de la extraccioacuten sanguiacutenea
bull Asegura la conservacioacuten de los elementos formes sanguiacuteneos durante 24horas si la sangre se mantiene a 4 ordmC
bull Al inhibir la aglutinacioacuten de las plaquetas facilita su recuento o su expresioacutensemicuantitativa a partir del frotis
bull La concentracioacuten recomendada de EDTA es de 15 mgmL de sangre Unamayor cantidad de anticoagulante puede producir retraccioacuten celular condisminucioacuten del hematocrito y un aumento de la concentracioacuten media de lahemoglobina Un exceso de sangre con relacioacuten al anticoagulante produceformacioacuten de microagregados que pueden alterar los resultados El empleode tubos al vaciacuteo con una gota (50mL) de EDTA tripotaacutesica comercialpara 5 mL de sangre es de intereacutes praacutectico dado que es cien veces maacutessoluble facilitando la mezcla de sangre con anticoagulante
4212 Desventajas
Usado en exceso afecta a los eritrocitos y a los leucocitos a los cuales les produce encogimiento y cambios en su forma por ello debe cuidarse de agregar la cantidad correcta de sangre al anticoagulante
422 Anticoagulante de Wintrobe
Es una mezcla de oxalato de amonio y potasio Actuacutea por precipitacioacuten del calcio es faacutecil de preparar Se emplea en forma de polvo en proporcioacuten de 2 de oxalato de amonio por 1 de oxalato de potasio La cantidad recomendada es de 2 mg x mL de sangre Este anticoagulante no afecta el volumen globular medio y puede usarse para determinaciones de hemoglobina hematocrito y recuento globular pero para los extendidos queda limitada a los primeros minutos tampoco es uacutetil para el recuento plaquetario porque produce formacioacuten de agregados plaquetarios
423 Heparina
El nombre de heparina proviene del griego hepar que significa hiacutegado ya que fue aislado por primera vez de las ceacutelulas de este tejido Es un mucopolisacaacuterido aacutecido Presenta el
inconveniente de que si no se agita raacutepidamente con la sangre despueacutes de extraiacuteda
pueden formarse microcoaacutegulos aunque no altera el volumeneritrocitario ni la morfologiacutea de los leucocitos No es recomendablepara el frotis sanguiacuteneo porque produce un fondo azul en la laacutemina
La heparina de sodio o litio puede usarse en forma soacutelida o liacutequida en
proporcioacutende 01 - 02 mg de heparina por 1 mL de sangre
43 ANTICOAGULANTES LIacuteQUIDOS
431 Citrato trisoacutedico
Es de eleccioacuten para las pruebas de hemostasia y la velocidad de sedimentacioacuten
Actuacutea a traveacutes de la precipitacioacuten del calcio La concentracioacuten depende de
la prueba por realizar
bull Para pruebas de hemostasia se emplea en proporcioacuten de 1 9 (05 mL
deanticoagulante para 45 mL de sangre total)
bull Para la determinacioacuten de la VSG (Velocidad de Sedimentacioacuten Globular) es14
(05 mL de anticoagulante para 2 mL de sangre)
432 Oxalato soacutedico
Recomendado tambieacuten para las pruebas de hemostasia Se emplea en
proporcioacutende un volumen de anticoagulante para 4 vol de sangre
SECCIOacuteN 5
REALIZACIOacuteN Y TINCIOacuteN DEL FROTIS SANGUIacuteNEO
La praacutectica del frotis sanguiacuteneo tambieacuten llamado extendido es de gran importanciaen hematologiacutea ya que el diagnoacutestico de muchas enfermedadeshematoloacutegicas puede realizarse con soacutelo observar las caracteriacutesticasmorfoloacutegicas de las ceacutelulas sanguiacuteneas de manera que eacuteste no debe serexcesivamente grueso ni excesivamente fino Todas las laacuteminas por usarsobre todo nuevas deben ser limpiadas con algodoacuten y alcohol al 70 paraeliminar la grasa que viene adherida
51 MEacuteTODO DE LOS DOS PORTAOBJETOS
511 Materiales
- Alcohol al 70
- Algodoacuten
- Lanceta descartable
- Portaobjetos de vidrios limpios y desgrasados (25 x 75 mm)
512 Fundamento
Consiste en la extensioacuten de una gota de sangre sobre un portaobjeto (25 x 75)empleando el canto biselado de otro portaobjeto de igual dimensioacuten (Fig 12)
513 Procedimiento
5131 Una vez extraiacuteda la sangre con cualquiera de las metodologiacuteas secoloca una pequentildea gota de sangre (5mL) (aprox 3 mm de diaacutemetro)sobre un portaobjeto a 2 cm aproximadamente de uno de los extremos
5132 Colocar el canto de otro portaobjeto esmerilado sobre la superficiedel primer portaobjeto (en la que se encuentra la gota de sangre)formando un aacutengulo de 45ordm
5134 Deslizar suavemente y a velocidad moderada el portaobjeto sobre elotro en sentido longitudinal hasta que la gota de sangre quede bienextendida sobre la
superficie del primer portaobjeto El grosor delfrotis sanguiacuteneo puede variar seguacuten sea el aacutengulo que formen entresiacute ambos portaobjetos Asiacute si es superior a 45ordm la extensioacuten obtenidaseraacute gruesa y corta si es inferior a 45ordm seraacute larga y fina El secado delfrotis es a temperatura ambiente y en posicioacuten horizontal
Fig 12
1048729 Zona excesivamente gruesa Se halla en la regioacuten inmediata al punto departida de la extensioacuten (cabeza) En ella se aprecia siempre un aumento delinfocitos
1048729 Zona excesivamente fina Corresponde al final de la extensioacuten y termina enun aacuterea donde las ceacutelulas adoptan una posicioacuten acartonada (barbas) Enesta regioacuten existe un exceso de granulocitos y monocitos
1048729 Zona ideal Corresponde a la regioacuten intermedia del frotis y en ella existe unreparto equilibrado de ceacutelulas
52 COLORACIONES USADAS
Una vez seco el frotis se procede a la tincioacuten hematoloacutegica con el colorante deRomanowsky constituido por la mezcla de eosina y azul de metileno Dentrode eacutestas tenemos
521 Colorante de Giemsa
522 Colorante de May-Grunwald
523 Colorante de Wright
524 Colorante de Leishman
Preparacioacuten de colorantes (Anexo A)
1048729 Para el estudio de las ceacutelulas sanguiacuteneas utilizar el colorante 523 y 524
1048729 Para el estudio de hemoparaacutesitos utilizar el colorante 521
1048729 Utilizar el colorante 522 para casos especiales en que se desee observar
con mayor claridad y especificidad los graacutenulos de los neutrofilos
53 TINCIOacuteN CON COLORANTE DE WRIGHT
531 Fundamento
El colorante de Wright va a permitir suministrar un medio para estudiar lasangre y determinar las variaciones y anormalidades de estructura forma ytamantildeo de los eritrocitos su contenido de hemoglobina y sus propiedades decoloracioacuten La informacioacuten obtenida de un frotis de sangre perifeacuterica dependeen gran parte de la calidad del extendido y la coloracioacuten
532 Materiales
5321 Colorante de Wright (Anexo A)
5322 Frasco gotero
5323 Solucioacuten amortiguada tamponada (Anexo A)
533 Procedimiento
5331 Una vez obtenido el frotis sanguiacuteneo se le dejaraacute secar entre 15 y 20minutos
5332 Luego se coloca la preparacioacuten en un soporte y se cubre con el colorantede Wright dejaacutendolo por espacio de 5 minutos
5333 Posteriormente se antildeade solucioacuten amortiguada tamponada en partesiguales hasta obtener un brillo metaacutelico dejando 6 minutos adicionales
5334 Finalmente se lava con agua corriente y se deja secar
5335 Se coloca en el microscopio y con pequentildeo aumento se revisa lacalidad de la coloracioacuten la cantidad aproximada de gloacutebulos blancosy se escoge el sitio para iniciar el recuento Se coloca una gota deaceite de inmersioacuten y se enfoca a un aumento de 100xLa forma de los gloacutebulos rojos se examinaraacute detenidamente observandoademaacutes del color (cantidad de hemoglobina) presencia deplaquetas su agrupacioacuten y distribucioacuten
5336 Posteriormente se hace el recuento diferencial de gloacutebulos blancosen 100
ceacutelulas para lo cual se deberaacute conocer las diferencias entreneutroacutefilos eosinoacutefilos
linfocitos y monocitosUna extensioacuten de sangre bien tentildeida debe caracterizarse
por unabuena diferenciacioacuten de las estructuras subcelulares en los leucocitosuna
coloracioacuten rosada de los hematiacutees y la ausencia de precipitados
Los defectos maacutes frecuentes observados en la tincioacuten del frotis sanguiacuteneoson
Coloracioacuten excesivamente azul debido a
1048729 Frotis excesivamente grueso
1048729 Lavado insuficiente
1048729 Tincioacuten muy prolongada
1048729 Empleo de colorante excesivamente alcalino
Coloracioacuten con una tonalidad rosada
1048729 El colorante el tampoacuten o el agua de lavado tienen un pH demasiadoaacutecido
Presencia de precipitados
1048729 Obedecen a una accioacuten excesiva del colorante Esto se puede evitarcon la
filtracioacuten
SECCIOacuteN 6
HEMOGRAMA-HEMOGLOBINA-HEMATOCRITO
El hemograma de Shilling constituye uno de los exaacutemenes de laboratorio
maacutesusados en el campo de la hematologiacutea Comprende las siguientes pruebas
61 RECUENTO LEUCOCITARIO
Principio
La sangre anticoagulada se deposita en un liacutequido que permite evidenciar
losleucocitos mantenieacutendolos visibles mientras que los eritrocitos
sonhemolizados El recuento del nuacutemero de leucocitos o gloacutebulos blancos se
expresapor mm3 (miliacutemetro cuacutebico)
611 Equipos
- Microscopio
- Hemocitoacutemetro (Caacutemara de Neubauer)
Consta de los siguientes elementos
diams Una laacutemina portaobjeto gruesa en el centro se hallan dos
superficiescuadriculadas iguales separadas del resto de la laacutemina por surcos y
dosbarras transversales algo maacutes elevadas
diams Una laminilla cubreobjetos oacutepticamente plana que al colocarse sobrelas barras
elevadas de la laacutemina forma una caacutemara entre el cubreobjetosy la superficie
cuadriculadaLa altura entre el cubreobjetos y la laacutemina portaobjetos es de 01
mmCada cuadriacutecula mide 3 mm de lado y se divide en 9 cuadrados grandesCada
uno de los cuales mide 1 mm2 de superficie que se subdivide a suvez en 16
cuadrados medianos El cuadrado grande central se divide en25 cuadrados
pequentildeos y cada uno de ellos en 16 cuadraditos Cadacuadrado pequentildeo mide
02 mm de lado (004 mm2 de superficie) y cadacuadradito mide 005 mm de lado
(00025 mm2 de superficie)
612 Materiales y reactivos requeridos
6121 Pipeta de gloacutebulos blancos (De Thoma) o pipeta automaacutetica (de 0 a 100 mL)Presenta cerca del extremo superior una marca de 11 inmediatamentecontinuacutea una dilatacioacuten (bulbo) que contiene una perla que funciona comomezcladora luego sigue el extremo maacutes largo de la pipeta (tallo) que estaacutedividida en 10 partes con 2 marcas 1 (parte final del bulbo) y 05 (a la mitaddel tallo) Se le acopla a su extremo superior 1 tubo de goma y una bombillapara aspirar
6122 Diluyente de gloacutebulos blancos Solucioacuten de Turk al 1
6123 Contador manual (Soacutelo si fuera necesario)
6124 Papel filtro
613 Procedimiento
6131 Una vez obtenida la sangre con anticoagulante o sangre capilar deldedo se procede a aspirar la sangre con la pipeta de gloacutebulos blancoshasta la marca de 05 y a limpiar la punta con papel absorbente
6132 Introducir la pipeta en el tubo que contenga solucioacuten de Turk y absorberhasta la marca de 11 (no debe haber burbujas)
6133 Tapar ambos extremos y proceder a mezclar manualmente o en unrotador automaacutetico por 2 oacute 3 minutos
6134 Monte la laminilla de vidrio en la caacutemara para recuento que debe estarlimpia y seca
6135 Agitar la pipeta y descartar las cuatro primeras gotas para luego colocaruna gota pequentildea de esta solucioacuten en la caacutemara
6136 Deje reposar por espacio de 3 minutos para que las ceacutelulas se sedimenten
6137 Enfocar con objetivo de 10x y contar en 4 cuadrados grandes angularesCuando se usa la pipeta automaacutetica se toma 20 mL (002 mL) desangre total con anticoagulante o sangre capilar con anticoagulante yse diluye en un tubo que contenga 380 mL de solucioacuten de Turk (aquiacutetenemos una dilucioacuten 120)
LECTURA
Fig 13
La lectura se realiza en los campos 1 3 7 y 9 como estaacute indicado en la figuraAdemaacutes de los leucocitos contados dentro de cada uno de los cuadrantes sedeben contar todos los leucocitos que se encuentren adheridos en la liacuteneahorizontal superior y vertical exterior o de lo contrario todos los leucocitosadheridos a la liacutenea horizontal inferior y vertical interior
614 Resultados
Nordm de leucocitos x mm3 = leucocitos contados en 4 camposdividealtura x dilucioacuten x aacuterea
Reemplazando = leucocitos contados en 4 camposdivide110 x 120 x 4=
Leucocitos contados en 4 camposdivide4200=
X1 divide4200= Nordm leucocitos contados x 50
615 Valores de referencia
5000 - 10 000 leucocitos mm3
616 Correccioacuten de valores para restar eritrocitos nucleados
Los normoblastos no se destruyen (lisis) en el liacutequido de dilucioacuten por lo tantopueden observarse al realizar el recuento leucocitario y confundirse con losleucocitos de tal manera que se debe emplear la siguiente foacutermula
Caacutelculo
La concentracioacuten del nuacutemero de normoblastos (por litro) esNuacutemero de normoblatos contados x concentracioacuten o nuacutemero de leucocitos100 + Nordm de normoblastos contados
Ejemplo
Si se cuentan 50 normoblastos y la concentracioacuten del nuacutemero de leucocitos es16 x 109l la concentracioacuten del nuacutemero de normoblastos seraacute
50 x16 = 53 x 109l
100 + 50
y la concentracioacuten de leucocitos corregida seraacute 16 - 53 = 107 x 109lEn unidades tradicionales las concentraciones de normoblastos y leucocitosse expresan por miliacutemetro cuacutebico En tales unidades el caacutelculo correspondienteal ejemplo que se ha dado seriacutea
50 x 16 000 = 5300 mm3
100 + 50
Recuento corregido de gloacutebulos blancos o leucocitos = 16 000 - 5300 = 10 700 mm3
Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2
62 RECUENTO DE GLOacuteBULOS ROJOS
Principio
La sangre se diluye en un liacutequido que nos permite observar claramente loshematiacutees luego esta dilucioacuten se coloca en una caacutemara de Neubauer con laayuda de una pipeta automaacutetica o pipeta Pasteur y se cuentan en el microscopioa un objetivo de 40x para calcular el nuacutemero de gloacutebulos rojos por mm3
621 Equipos
- Microscopio
- Hemocitoacutemetro (caacutemara de Neubauer)
622 Materiales y reactivos requeridos
6221 Pipeta de gloacutebulos rojos (De Thoma) o pipeta automaacutetica (de 0-100 mL)
Presenta cerca del extremo superior una marca de 101 inmediatamentecontinuacutea una dilatacioacuten (bulbo) que contiene una perla roja mezcladoraluego sigue el tallo (extremo maacutes largo) el cual estaacute dividido en 10 partescon 2 marcas 1 acabando el bulbo y 05 a la mitad del tallo Se requiereigual que el recuento de leucocitos una boquilla para aspirar
6222 Diluyente de gloacutebulos rojos Cloruro de Sodio al 09 (ver anexo)
Diluyente de Hayem (ver anexo)
6223 Contador manual (soacutelo si fuera necesario)
6224 Papel filtro
623 Procedimiento
6231 Mezclar la sangre obtenida con el anticoagulante o tomar sangre capilar
6232 Llenar la pipeta de gloacutebulos rojos con sangre hasta la marca de 05para realizar una dilucioacuten de 1200 y si se carga hasta 1 la dilucioacutenseraacute 1100 Limpiar la punta con gasa o papel absorbente
6233 Introducir la pipeta en el tubo o frasquito conteniendo diluyente (Hayem)y llenar de liacutequido de dilucioacuten hasta la marca de 101
6234 Se coloca en un rotador automaacutetico o se hace rotar manualmente de2 a 3 minutos
6235 Agitar bien la pipeta y descartar 3 a 4 gotas del tallo luego colocar unagota pequentildea cerca de un extremo de la caacutemara para que por capilaridadse llene exactamente
6236 Hacer el recuento con objetivo de 40xSe puede realizar con la pipeta automaacutetica se toma 20 mL (002mL)de sangre total con anticoagulante o sangre capilar y se deposita enun tubo de 12 x 75 que contenga 4 mL de solucioacuten de Hayem (aquiacute setiene una dilucioacuten de 1200) Se deja reposar aproximadamente 5minutos y se procede a cargar la caacutemara con la misma pipeta usandoun nuevo tip El inconveniente aquiacute es el gasto de reactivo (4 mL) perolas medidas son mas exactas
6237 Dejar en reposo por 3 minutos
6238 Enfocar la cuadriacutecula a 10x luego con el objetivo de 40x contar sobreel cuadrado grande central de la caacutemara soacutelo en 5 cuadrados pequentildeosuno central y cuatro angulares (80 cuadraditos en total)
6239 En el recuento se incluyen las ceacutelulas que cubren o tocan por dentroo por fuera las liacuteneas limitantes superior e izquierda en el cuadradopequentildeo de recuento y no se consideran los correspondientes a losliacutemites inferior y derechoSe hace el recuento en los puntos ABCD y Ey se sigue los mismos paraacutemetros del recuento de leucocitos
LECTURA
Fig 14
624 Resultados
Nordm de hematiacutees x mm3 = hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeosaltura x dilucioacuten X aacuterea
Reemplazando = hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeos110 x 1200 x 15
= hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeos divide 110 000
= hematiacutees contados x 10 000
625 Valores de referencia
(Unidades tradicionales millones de ceacutelulasmm3)
Hombres 4 500 000 - 5 500 000
Mujeres 4 000 000 - 5 000 000
Nintildeos (4 antildeos) 4 200 000 - 5 200 000
Lactantes (1 - 6 meses) 3 800 000 - 5 200 000
Recieacuten nacidos 5 000 000 - 6 000 000
Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2
63 DETERMINACIOacuteN DEL VOLUMEN GLOBULAR (Hematocrito)
Mide la fraccioacuten que comprende a los gloacutebulos rojos (masa globular) respectoal
volumen total de la muestra de sangre venosa o capilar Puede expresarseen
porcentaje o como valor decimal
Hto= altura de la columna de gloacutebulos rojosdivide altura de la columna de sangre
total(gloacutebulos rojos maacutes plasma)
631 Meacutetodo de Wintrobe
Materiales requeridos
- Tubo de Wintrobe graduado de 0 - 100 mm
- Pipetas Pasteur o pipetas de transferencia
- Tapoacuten de goma
Procedimiento
diams Llenar la sangre extraiacuteda con anticoagulante con una pipeta pasteur
comenzandodesde el fondo hasta la marca superior de 100 mm teniendocuidado
de no provocar espuma
diams Tapar el tubo con un tapoacuten de goma para evitar la evaporacioacuten
diams Centrifugar a 3000 rpm por 30 minutos
Resultados (lectura)
Del tubo graduado se mide directamente el nivel de la columna de gloacutebulosrojos
Valores de referencia
Hombres 40 - 54Mujeres 38 - 48
Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2
632 Meacutetodo de microhematocrito
Materiales requeridos
- Capilares rojos y azules (75 mm x 15 mm)
- Plastilina
Procedimiento
diams Tomar la muestra en capilares rojos heparinizados directamente del pulpejodel
dedo o utilizar capilares azules sin heparina para sangre venosacon
anticoagulante de Wintrobe o EDTA Debe llenarse aproximadamente70 - 80
del capilar
diams Ocluir (tapar) un extremo del capilar con plastilina
diams Colocar el capilar sobre la plataforma del cabezal de una centriacutefuga demicrohematocrito con el extremo ocluido adherido al reborde externo de laplataforma
diams Centrifugar por 5 minutos entre 10 000 - 12 000 rpm
Resultados (lectura)
La lectura se realiza con una escala estandarizada que expenden en el comercio
Uso de la escala
diams Sostenga el tubo frente a la escala de manera que el fondo de la columnade eritrocitos (no el extremo inferior del tubo) quede exactamente al mismonivel de la liacutenea horizontal correspondiente al cero
diams Desplace el tubo a traveacutes de la escala hasta que la liacutenea marcada con elnuacutemero 10 quede al nivel del tope de la columna de plasma Vigile que elfondo de la
columna de eritrocitos continuacutee sobre la liacutenea cero El tubodebe encontrarse completamente en posicioacuten vertical
diams La liacutenea que pase al nivel del tope de la columna de eritrocitos indicaraacute lafraccioacuten de volumen de eacutestos
Valores de referencia
Hombres 40 - 50
Mujeres 38 - 44
Nintildeos (5 antildeos) 38 - 44
Lactantes (3 meses) 37 - 42
Recieacuten nacidos 50 - 58
La disposicioacuten celular esParte superior una columna de plasmaEn la interfase estaacuten los leucocitos yplaquetasParte inferior estaacute la columna deeritrocitos (Fig 15)
64 DOSAJE DE HEMOGLOBINA
Principio
La sangre se diluye en liacutequido de Drabkin el cual hemoliza los hematiacutees yconvierte la hemoglobina en cianometahemoglobina (cianuro de hemiglobina)La solucioacuten que se produce se lee por medio de un espectrofotoacutemetro ofotocoloriacutemetro Su grado de absorbancia es proporcional a la cantidad dehemoglobina que contenga la sangre
641 Materiales y reactivos
6411 Un coloriacutemetro fotoeleacutectrico o un espectrofotoacutemetro
6412 Pipetas
diams Una pipeta para sangre (pipeta de Sahli) graduada hasta 002 mL contubo de goma y boquilla
diams Una pipeta de vidrio graduada de 5 mL
6413 Tubos de ensayo
6414 Reactivo de Drabkin para dilucioacuten
Este reactivo se puede adquirir en tabletas o polvos para disolver en 1litro de agua destilada Si se dispone de una balanza analiacutetica la preparacioacutense puede hacer en el laboratorio Esta solucioacuten se puedeconservar durante un mes en un frasco de vidrio oscuro Deseacutechese sise enturbia
3228 Retirar el torniquete e indicar al paciente que deje de hacer puntildeo Secoloca el algodoacuten seco encima de la puncioacuten y se retira la aguja (Fig 6)
3229 Retirar la aguja de la jeringa Verter la muestra lentamente por lasparedes del vial con anticoagulante No olvidar colocar una gota en lalaacutemina portaobjeto para realizar el frotis
32210 Agitar el vial en ciacuterculos sobre la mesa para homogeneizar la muestracon el anticoagulante
PUNTOS PARA LA EXTRACCIOacuteN DE SANGRE
(Toma de muestra)
Se obtiene de las venas de la fosa cubital
PROCEDIMIENTO
Fig 1 Fig 2 Fig 3
Fig 4 Fig 5
Fig 6 Fig 7
33 OBTENCIOacuteN DE SANGRE VENOSA EN TUBOS AL VACIacuteO
331 Materiales requeridos
3311 Algodoacuten
3312 Alcohol al 70
3313 Ligadura o torniquete de 25 a 30 cm de largo
3314 Tubos al vaciacuteo con anticoagulante EDTA (K3) EDTA (Na2) u otroanticoagulante
3315 Agujas con dispositivo para extraccioacuten de sangre al vaciacuteo
- Nordm 21 para adultos
- Nordm 22 para nintildeos y neonatos
De preferencia ambas de bisel corto para evitar la coagulacioacuten
332 Obtencioacuten de la muestra
3321 Repetir los pasos de 3221 a 3224
3322 Se retira el estuche protector de la aguja y eacuteste se enrosca al dispositivopara extraccioacuten de sangre al vaciacuteo
3323 Colocar la ligadura cuatro dedos por encima de la flexioacuten del codo o10 cm por encima de eacuteste y pedir al paciente que abra y cierre la manovarias veces para favorecer la dilatacioacuten de las venas
3324 Una vez escogida la vena desinfectarla con una pieza de algodoacutenembebido en etanol al 70
3325 Se coloca la aguja en direccioacuten paralela a la vena se perfora la pielhaciendo avanzar la aguja entre 05 cm y 1 cm en el tejido subcutaacuteneose inserta el tubo al vaciacuteo por la parte posterior y no preocuparse porla cantidad de sangre extraiacuteda ya que el mismo sonido del vaciacuteo avisaraacuteque la extraccioacuten terminoacute (Fig 8)
3326 Retirar la ligadura tirando del extremo doblado
3327 Colocar un pedazo de algodoacuten seco sobre la parte donde se encuentraoculta la aguja Sacar la aguja con un movimiento raacutepido y depositarlaen el recipiente de metal con desinfectante (Fig 9)
3328 Pedir al paciente que presione firmemente el algodoacuten durante 3 minutoscon el brazo extendido No se recomienda que se flexione el brazoa causa del riesgo que se forme un hematoma
3329 Mezclar por inmersioacuten suave la sangre con el anticoagulante contenidoen el tubo No agitar el contenido
Fig 8 Fig 9
333 Ventajas de una extraccioacuten de sangre venosa
3331 Pueden hacerse repetidos exaacutemenes con la misma muestra
3332 Parte de la muestra (plasma o suero) puede congelarse para referenciafutura
334 Desventajas de una extraccioacuten de sangre venosa
3341 La puncioacuten venosa por su largo procedimiento requiere mayor preparacioacuten que el meacutetodo capilar
3342 El meacutetodo es teacutecnicamente difiacutecil en nintildeos individuos obesos y pacientes en shock
3343 La hemoacutelisis debe ser evitada pues se puede obtener una disminucioacuten en el recuento de eritrocitos
3344 Debe evitarse prolongada estasis venosa producida por el torniquete pues produce hemoacutelisis y otros cambios que ponen la sangre en un estado inadecuado para el anaacutelisis de gases recuentos celulares determinacioacuten de pH sanguiacuteneo y algunas pruebas de coagulacioacuten
3345 La sangre anticoagulada si no es de obtencioacuten reciente no debe ser utilizada en extensiones de sangre pues algunos anticoagulantes producen cambios en las plaquetas que pueden causar aglutinaciones agregacioacuten plaquetaria y dificultan la identificacioacuten de leucocitos
3346 Puesto que algunos de los componentes de la sangre no son estables los recuentos de leucocitos y plaquetas e iacutendice de sedimentacioacuten deben realizarse antes de que pasen dos horas desde que se obtuvo la muestra
34 OBTENCIOacuteN DE SANGRE DE LA VENA YUGULAR EXTERNA
341 Materiales requeridos
3411 Algodoacuten
3412 Alcohol al 70
3413 Jeringas de 5 mL
3414 Viales con anticoagulante EDTA
342 Obtencioacuten de la muestra
3421 El paciente es cubierto por una saacutebana de manera que los brazospermanezcan inmovilizados a lo largo del cuerpo
3422 Al paciente se le coloca de cuacutebito dorsal sobre la mesa de examen ouna
camilla de manera que la cabeza cuelgue sobre el final de lamesa y el cuerpo sea
sujetado por un asistente
3423 Cuando el paciente grita la vena yugular externa se marca claramente
3424 Limpiar la zona en un aacuterea de 2 pulgadas con alcohol al 70 o
alcoholyodado
3425 Se repiten los pasos de 3225 a 3227 de la extraccioacuten de sangrevenosa
con jeringa
3426 Retirar la aguja de la vena y presionar suavemente con un algodoacutenseco
aproximadamente de 3 a 5 minutos Pedir al paciente que permanezcaechado diez
minutos
3427 Se repiten los pasos de 3229
3428 Se repiten los pasos de 32210
343 Ventajas
Constituye un buen meacutetodo para la obtencioacuten de sangre en pacientes conshock
con venas colapsadas
344 Desventajas
Por lo delicado en su procedimiento no se recomienda como rutina soacutelo encasos
en que no se pueda obtener la muestra por meacutetodos convencionales
35 OBTENCIOacuteN DE SANGRE CAPILAR
Cuando la cantidad de sangre que se precisa es muy pequentildea o cuando
pordiferentes motivos no pueda practicarse una puncioacuten venosa debe recurrirse
a la puncioacuten capilar
351 Materiales requeridos
3512 Algodoacuten
3513 Alcohol al 70
3514 Lancetas desechables (Fig 10)
3515 Papel filtro Nordm 2
352 Procedimiento (Fig 11)
3521 La sangre capilar se obtiene de la cara lateral del dedo medio o anularen los adultos y del dedo gordo del pie o taloacuten en los nintildeos
3522 Desinfectar la zona con alcohol al 70 secar con algodoacuten esteacuteril
3523 Punzar la piel con una lanceta esteacuteril desechable (2 mm de profundidad)
3524 Usar gasa esteacuteril para desechar la primera gota y recoger las siguientesen tubos capilares Evitar comprimir la extremidad para obtenersangre porque se altera la composicioacuten sanguiacutenea
353 Ventajas
3531 Puede obtenerse con facilidad
3532 Es preferible cuando han de realizarse extensiones de sangre perifeacuterica
354 Desventajas
3541 Soacutelo se pueden obtener pequentildeas cantidades de sangre y los exaacutemenesde repeticioacuten requieren nuevas muestras
3542 La sangre en microtubos (capilares) frecuentemente se hemolizainterfiendo con la mayoriacutea de pruebas de laboratorio
3543 Los resultados obtenidos en pruebas con sangre capilar no puedenser comparados con los resultados de las pruebas con sangre venosa
3544 El dedo no soacutelo es delicado sino difiacutecil de desinfectar adecuadamenteen el tiempo disponible
3545 En pacientes con resistencia disminuida a la infeccioacuten (aquellos conleucemia agranulocitosis diabetes uremia y enfermedades con deficienciasinmunoloacutegicas) una muestra tomada del dedo es mucho maacutesprobable que conduzca a una infeccioacuten que otra tomada del brazo
3546 El recuento de eritrocitos y leucocitos asiacute como el recuento deplaquetas y reticulocitos no debe realizarse en sangre capilar debidoa la difiacutecil estandarizacioacuten del flujo sanguiacuteneo capilar
EXTRACCIOacuteN DE SANGRE CAPILAR
Fig 10
Fig 11
SECCIOacuteN 4
ANTICOAGULANTES
Una vez extraiacuteda la sangre eacutesta puede conservarse coagulada o
mantenidaincoagulable mediante la adicioacuten de un anticoagulante
41 CARACTERIacuteSTICAS BAacuteSICAS DE LOS ANTICOAGULANTES MAacuteS
USADOSEN HEMATOLOGIacuteA
bull No alterar el tamantildeo de los hematiacutees
bull No producir hemoacutelisis
bull Evitar al maacuteximo la agregacioacuten plaquetaria
bull No alterar la morfologiacutea de los leucocitos
La sangre tratada con anticoagulante debe procesarse lo antes posible
inclusomantenida bajo refrigeracioacuten (4 ordmC) si no pasan de las 2 horas El
tiempomaacuteximo entre la extraccioacuten de la sangre y su procesamiento depende
delcoagulante de eleccioacuten y no debe ser maacutes de 4 horas a excepcioacuten
delanticoagulante EDTA (etilendiaminotetraceacutetico) que puede ser hasta 24
horas(en refrigeracioacuten a 4 ordmC)
Los anticoagulantes pueden emplearse en forma soacutelida o liacutequida Los
primerosestaacuten indicados para la determinacioacuten de los paraacutemetros
hematoloacutegicosya que no producen como los anticoagulantes liacutequidos dilucioacuten de
la sangre
42 ANTICOAGULANTES SOacuteLIDOS
421 EDTA
Es la sal disoacutedica o tripotaacutesica del aacutecido etilendiaminotetraceacutetico La saldisoacutedica
(Na2EDTA) es menos soluble que la sal tripotaacutesica (K3EDTA) Estoscompuestos
realizan su accioacuten a traveacutes de un efecto quelante sobre el calcioal fijarlo impiden
su activacioacuten y por ende la coagulacioacuten sanguiacutenea
4211 Ventajas
bull Respeta la morfologiacutea eritrocitaria (especialmente la sal tripotaacutesica) yleucocitaria de manera que permite una demora de dos horas en la realizacioacutendel frotis sanguiacuteneo despueacutes de la extraccioacuten sanguiacutenea
bull Asegura la conservacioacuten de los elementos formes sanguiacuteneos durante 24horas si la sangre se mantiene a 4 ordmC
bull Al inhibir la aglutinacioacuten de las plaquetas facilita su recuento o su expresioacutensemicuantitativa a partir del frotis
bull La concentracioacuten recomendada de EDTA es de 15 mgmL de sangre Unamayor cantidad de anticoagulante puede producir retraccioacuten celular condisminucioacuten del hematocrito y un aumento de la concentracioacuten media de lahemoglobina Un exceso de sangre con relacioacuten al anticoagulante produceformacioacuten de microagregados que pueden alterar los resultados El empleode tubos al vaciacuteo con una gota (50mL) de EDTA tripotaacutesica comercialpara 5 mL de sangre es de intereacutes praacutectico dado que es cien veces maacutessoluble facilitando la mezcla de sangre con anticoagulante
4212 Desventajas
Usado en exceso afecta a los eritrocitos y a los leucocitos a los cuales les produce encogimiento y cambios en su forma por ello debe cuidarse de agregar la cantidad correcta de sangre al anticoagulante
422 Anticoagulante de Wintrobe
Es una mezcla de oxalato de amonio y potasio Actuacutea por precipitacioacuten del calcio es faacutecil de preparar Se emplea en forma de polvo en proporcioacuten de 2 de oxalato de amonio por 1 de oxalato de potasio La cantidad recomendada es de 2 mg x mL de sangre Este anticoagulante no afecta el volumen globular medio y puede usarse para determinaciones de hemoglobina hematocrito y recuento globular pero para los extendidos queda limitada a los primeros minutos tampoco es uacutetil para el recuento plaquetario porque produce formacioacuten de agregados plaquetarios
423 Heparina
El nombre de heparina proviene del griego hepar que significa hiacutegado ya que fue aislado por primera vez de las ceacutelulas de este tejido Es un mucopolisacaacuterido aacutecido Presenta el
inconveniente de que si no se agita raacutepidamente con la sangre despueacutes de extraiacuteda
pueden formarse microcoaacutegulos aunque no altera el volumeneritrocitario ni la morfologiacutea de los leucocitos No es recomendablepara el frotis sanguiacuteneo porque produce un fondo azul en la laacutemina
La heparina de sodio o litio puede usarse en forma soacutelida o liacutequida en
proporcioacutende 01 - 02 mg de heparina por 1 mL de sangre
43 ANTICOAGULANTES LIacuteQUIDOS
431 Citrato trisoacutedico
Es de eleccioacuten para las pruebas de hemostasia y la velocidad de sedimentacioacuten
Actuacutea a traveacutes de la precipitacioacuten del calcio La concentracioacuten depende de
la prueba por realizar
bull Para pruebas de hemostasia se emplea en proporcioacuten de 1 9 (05 mL
deanticoagulante para 45 mL de sangre total)
bull Para la determinacioacuten de la VSG (Velocidad de Sedimentacioacuten Globular) es14
(05 mL de anticoagulante para 2 mL de sangre)
432 Oxalato soacutedico
Recomendado tambieacuten para las pruebas de hemostasia Se emplea en
proporcioacutende un volumen de anticoagulante para 4 vol de sangre
SECCIOacuteN 5
REALIZACIOacuteN Y TINCIOacuteN DEL FROTIS SANGUIacuteNEO
La praacutectica del frotis sanguiacuteneo tambieacuten llamado extendido es de gran importanciaen hematologiacutea ya que el diagnoacutestico de muchas enfermedadeshematoloacutegicas puede realizarse con soacutelo observar las caracteriacutesticasmorfoloacutegicas de las ceacutelulas sanguiacuteneas de manera que eacuteste no debe serexcesivamente grueso ni excesivamente fino Todas las laacuteminas por usarsobre todo nuevas deben ser limpiadas con algodoacuten y alcohol al 70 paraeliminar la grasa que viene adherida
51 MEacuteTODO DE LOS DOS PORTAOBJETOS
511 Materiales
- Alcohol al 70
- Algodoacuten
- Lanceta descartable
- Portaobjetos de vidrios limpios y desgrasados (25 x 75 mm)
512 Fundamento
Consiste en la extensioacuten de una gota de sangre sobre un portaobjeto (25 x 75)empleando el canto biselado de otro portaobjeto de igual dimensioacuten (Fig 12)
513 Procedimiento
5131 Una vez extraiacuteda la sangre con cualquiera de las metodologiacuteas secoloca una pequentildea gota de sangre (5mL) (aprox 3 mm de diaacutemetro)sobre un portaobjeto a 2 cm aproximadamente de uno de los extremos
5132 Colocar el canto de otro portaobjeto esmerilado sobre la superficiedel primer portaobjeto (en la que se encuentra la gota de sangre)formando un aacutengulo de 45ordm
5134 Deslizar suavemente y a velocidad moderada el portaobjeto sobre elotro en sentido longitudinal hasta que la gota de sangre quede bienextendida sobre la
superficie del primer portaobjeto El grosor delfrotis sanguiacuteneo puede variar seguacuten sea el aacutengulo que formen entresiacute ambos portaobjetos Asiacute si es superior a 45ordm la extensioacuten obtenidaseraacute gruesa y corta si es inferior a 45ordm seraacute larga y fina El secado delfrotis es a temperatura ambiente y en posicioacuten horizontal
Fig 12
1048729 Zona excesivamente gruesa Se halla en la regioacuten inmediata al punto departida de la extensioacuten (cabeza) En ella se aprecia siempre un aumento delinfocitos
1048729 Zona excesivamente fina Corresponde al final de la extensioacuten y termina enun aacuterea donde las ceacutelulas adoptan una posicioacuten acartonada (barbas) Enesta regioacuten existe un exceso de granulocitos y monocitos
1048729 Zona ideal Corresponde a la regioacuten intermedia del frotis y en ella existe unreparto equilibrado de ceacutelulas
52 COLORACIONES USADAS
Una vez seco el frotis se procede a la tincioacuten hematoloacutegica con el colorante deRomanowsky constituido por la mezcla de eosina y azul de metileno Dentrode eacutestas tenemos
521 Colorante de Giemsa
522 Colorante de May-Grunwald
523 Colorante de Wright
524 Colorante de Leishman
Preparacioacuten de colorantes (Anexo A)
1048729 Para el estudio de las ceacutelulas sanguiacuteneas utilizar el colorante 523 y 524
1048729 Para el estudio de hemoparaacutesitos utilizar el colorante 521
1048729 Utilizar el colorante 522 para casos especiales en que se desee observar
con mayor claridad y especificidad los graacutenulos de los neutrofilos
53 TINCIOacuteN CON COLORANTE DE WRIGHT
531 Fundamento
El colorante de Wright va a permitir suministrar un medio para estudiar lasangre y determinar las variaciones y anormalidades de estructura forma ytamantildeo de los eritrocitos su contenido de hemoglobina y sus propiedades decoloracioacuten La informacioacuten obtenida de un frotis de sangre perifeacuterica dependeen gran parte de la calidad del extendido y la coloracioacuten
532 Materiales
5321 Colorante de Wright (Anexo A)
5322 Frasco gotero
5323 Solucioacuten amortiguada tamponada (Anexo A)
533 Procedimiento
5331 Una vez obtenido el frotis sanguiacuteneo se le dejaraacute secar entre 15 y 20minutos
5332 Luego se coloca la preparacioacuten en un soporte y se cubre con el colorantede Wright dejaacutendolo por espacio de 5 minutos
5333 Posteriormente se antildeade solucioacuten amortiguada tamponada en partesiguales hasta obtener un brillo metaacutelico dejando 6 minutos adicionales
5334 Finalmente se lava con agua corriente y se deja secar
5335 Se coloca en el microscopio y con pequentildeo aumento se revisa lacalidad de la coloracioacuten la cantidad aproximada de gloacutebulos blancosy se escoge el sitio para iniciar el recuento Se coloca una gota deaceite de inmersioacuten y se enfoca a un aumento de 100xLa forma de los gloacutebulos rojos se examinaraacute detenidamente observandoademaacutes del color (cantidad de hemoglobina) presencia deplaquetas su agrupacioacuten y distribucioacuten
5336 Posteriormente se hace el recuento diferencial de gloacutebulos blancosen 100
ceacutelulas para lo cual se deberaacute conocer las diferencias entreneutroacutefilos eosinoacutefilos
linfocitos y monocitosUna extensioacuten de sangre bien tentildeida debe caracterizarse
por unabuena diferenciacioacuten de las estructuras subcelulares en los leucocitosuna
coloracioacuten rosada de los hematiacutees y la ausencia de precipitados
Los defectos maacutes frecuentes observados en la tincioacuten del frotis sanguiacuteneoson
Coloracioacuten excesivamente azul debido a
1048729 Frotis excesivamente grueso
1048729 Lavado insuficiente
1048729 Tincioacuten muy prolongada
1048729 Empleo de colorante excesivamente alcalino
Coloracioacuten con una tonalidad rosada
1048729 El colorante el tampoacuten o el agua de lavado tienen un pH demasiadoaacutecido
Presencia de precipitados
1048729 Obedecen a una accioacuten excesiva del colorante Esto se puede evitarcon la
filtracioacuten
SECCIOacuteN 6
HEMOGRAMA-HEMOGLOBINA-HEMATOCRITO
El hemograma de Shilling constituye uno de los exaacutemenes de laboratorio
maacutesusados en el campo de la hematologiacutea Comprende las siguientes pruebas
61 RECUENTO LEUCOCITARIO
Principio
La sangre anticoagulada se deposita en un liacutequido que permite evidenciar
losleucocitos mantenieacutendolos visibles mientras que los eritrocitos
sonhemolizados El recuento del nuacutemero de leucocitos o gloacutebulos blancos se
expresapor mm3 (miliacutemetro cuacutebico)
611 Equipos
- Microscopio
- Hemocitoacutemetro (Caacutemara de Neubauer)
Consta de los siguientes elementos
diams Una laacutemina portaobjeto gruesa en el centro se hallan dos
superficiescuadriculadas iguales separadas del resto de la laacutemina por surcos y
dosbarras transversales algo maacutes elevadas
diams Una laminilla cubreobjetos oacutepticamente plana que al colocarse sobrelas barras
elevadas de la laacutemina forma una caacutemara entre el cubreobjetosy la superficie
cuadriculadaLa altura entre el cubreobjetos y la laacutemina portaobjetos es de 01
mmCada cuadriacutecula mide 3 mm de lado y se divide en 9 cuadrados grandesCada
uno de los cuales mide 1 mm2 de superficie que se subdivide a suvez en 16
cuadrados medianos El cuadrado grande central se divide en25 cuadrados
pequentildeos y cada uno de ellos en 16 cuadraditos Cadacuadrado pequentildeo mide
02 mm de lado (004 mm2 de superficie) y cadacuadradito mide 005 mm de lado
(00025 mm2 de superficie)
612 Materiales y reactivos requeridos
6121 Pipeta de gloacutebulos blancos (De Thoma) o pipeta automaacutetica (de 0 a 100 mL)Presenta cerca del extremo superior una marca de 11 inmediatamentecontinuacutea una dilatacioacuten (bulbo) que contiene una perla que funciona comomezcladora luego sigue el extremo maacutes largo de la pipeta (tallo) que estaacutedividida en 10 partes con 2 marcas 1 (parte final del bulbo) y 05 (a la mitaddel tallo) Se le acopla a su extremo superior 1 tubo de goma y una bombillapara aspirar
6122 Diluyente de gloacutebulos blancos Solucioacuten de Turk al 1
6123 Contador manual (Soacutelo si fuera necesario)
6124 Papel filtro
613 Procedimiento
6131 Una vez obtenida la sangre con anticoagulante o sangre capilar deldedo se procede a aspirar la sangre con la pipeta de gloacutebulos blancoshasta la marca de 05 y a limpiar la punta con papel absorbente
6132 Introducir la pipeta en el tubo que contenga solucioacuten de Turk y absorberhasta la marca de 11 (no debe haber burbujas)
6133 Tapar ambos extremos y proceder a mezclar manualmente o en unrotador automaacutetico por 2 oacute 3 minutos
6134 Monte la laminilla de vidrio en la caacutemara para recuento que debe estarlimpia y seca
6135 Agitar la pipeta y descartar las cuatro primeras gotas para luego colocaruna gota pequentildea de esta solucioacuten en la caacutemara
6136 Deje reposar por espacio de 3 minutos para que las ceacutelulas se sedimenten
6137 Enfocar con objetivo de 10x y contar en 4 cuadrados grandes angularesCuando se usa la pipeta automaacutetica se toma 20 mL (002 mL) desangre total con anticoagulante o sangre capilar con anticoagulante yse diluye en un tubo que contenga 380 mL de solucioacuten de Turk (aquiacutetenemos una dilucioacuten 120)
LECTURA
Fig 13
La lectura se realiza en los campos 1 3 7 y 9 como estaacute indicado en la figuraAdemaacutes de los leucocitos contados dentro de cada uno de los cuadrantes sedeben contar todos los leucocitos que se encuentren adheridos en la liacuteneahorizontal superior y vertical exterior o de lo contrario todos los leucocitosadheridos a la liacutenea horizontal inferior y vertical interior
614 Resultados
Nordm de leucocitos x mm3 = leucocitos contados en 4 camposdividealtura x dilucioacuten x aacuterea
Reemplazando = leucocitos contados en 4 camposdivide110 x 120 x 4=
Leucocitos contados en 4 camposdivide4200=
X1 divide4200= Nordm leucocitos contados x 50
615 Valores de referencia
5000 - 10 000 leucocitos mm3
616 Correccioacuten de valores para restar eritrocitos nucleados
Los normoblastos no se destruyen (lisis) en el liacutequido de dilucioacuten por lo tantopueden observarse al realizar el recuento leucocitario y confundirse con losleucocitos de tal manera que se debe emplear la siguiente foacutermula
Caacutelculo
La concentracioacuten del nuacutemero de normoblastos (por litro) esNuacutemero de normoblatos contados x concentracioacuten o nuacutemero de leucocitos100 + Nordm de normoblastos contados
Ejemplo
Si se cuentan 50 normoblastos y la concentracioacuten del nuacutemero de leucocitos es16 x 109l la concentracioacuten del nuacutemero de normoblastos seraacute
50 x16 = 53 x 109l
100 + 50
y la concentracioacuten de leucocitos corregida seraacute 16 - 53 = 107 x 109lEn unidades tradicionales las concentraciones de normoblastos y leucocitosse expresan por miliacutemetro cuacutebico En tales unidades el caacutelculo correspondienteal ejemplo que se ha dado seriacutea
50 x 16 000 = 5300 mm3
100 + 50
Recuento corregido de gloacutebulos blancos o leucocitos = 16 000 - 5300 = 10 700 mm3
Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2
62 RECUENTO DE GLOacuteBULOS ROJOS
Principio
La sangre se diluye en un liacutequido que nos permite observar claramente loshematiacutees luego esta dilucioacuten se coloca en una caacutemara de Neubauer con laayuda de una pipeta automaacutetica o pipeta Pasteur y se cuentan en el microscopioa un objetivo de 40x para calcular el nuacutemero de gloacutebulos rojos por mm3
621 Equipos
- Microscopio
- Hemocitoacutemetro (caacutemara de Neubauer)
622 Materiales y reactivos requeridos
6221 Pipeta de gloacutebulos rojos (De Thoma) o pipeta automaacutetica (de 0-100 mL)
Presenta cerca del extremo superior una marca de 101 inmediatamentecontinuacutea una dilatacioacuten (bulbo) que contiene una perla roja mezcladoraluego sigue el tallo (extremo maacutes largo) el cual estaacute dividido en 10 partescon 2 marcas 1 acabando el bulbo y 05 a la mitad del tallo Se requiereigual que el recuento de leucocitos una boquilla para aspirar
6222 Diluyente de gloacutebulos rojos Cloruro de Sodio al 09 (ver anexo)
Diluyente de Hayem (ver anexo)
6223 Contador manual (soacutelo si fuera necesario)
6224 Papel filtro
623 Procedimiento
6231 Mezclar la sangre obtenida con el anticoagulante o tomar sangre capilar
6232 Llenar la pipeta de gloacutebulos rojos con sangre hasta la marca de 05para realizar una dilucioacuten de 1200 y si se carga hasta 1 la dilucioacutenseraacute 1100 Limpiar la punta con gasa o papel absorbente
6233 Introducir la pipeta en el tubo o frasquito conteniendo diluyente (Hayem)y llenar de liacutequido de dilucioacuten hasta la marca de 101
6234 Se coloca en un rotador automaacutetico o se hace rotar manualmente de2 a 3 minutos
6235 Agitar bien la pipeta y descartar 3 a 4 gotas del tallo luego colocar unagota pequentildea cerca de un extremo de la caacutemara para que por capilaridadse llene exactamente
6236 Hacer el recuento con objetivo de 40xSe puede realizar con la pipeta automaacutetica se toma 20 mL (002mL)de sangre total con anticoagulante o sangre capilar y se deposita enun tubo de 12 x 75 que contenga 4 mL de solucioacuten de Hayem (aquiacute setiene una dilucioacuten de 1200) Se deja reposar aproximadamente 5minutos y se procede a cargar la caacutemara con la misma pipeta usandoun nuevo tip El inconveniente aquiacute es el gasto de reactivo (4 mL) perolas medidas son mas exactas
6237 Dejar en reposo por 3 minutos
6238 Enfocar la cuadriacutecula a 10x luego con el objetivo de 40x contar sobreel cuadrado grande central de la caacutemara soacutelo en 5 cuadrados pequentildeosuno central y cuatro angulares (80 cuadraditos en total)
6239 En el recuento se incluyen las ceacutelulas que cubren o tocan por dentroo por fuera las liacuteneas limitantes superior e izquierda en el cuadradopequentildeo de recuento y no se consideran los correspondientes a losliacutemites inferior y derechoSe hace el recuento en los puntos ABCD y Ey se sigue los mismos paraacutemetros del recuento de leucocitos
LECTURA
Fig 14
624 Resultados
Nordm de hematiacutees x mm3 = hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeosaltura x dilucioacuten X aacuterea
Reemplazando = hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeos110 x 1200 x 15
= hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeos divide 110 000
= hematiacutees contados x 10 000
625 Valores de referencia
(Unidades tradicionales millones de ceacutelulasmm3)
Hombres 4 500 000 - 5 500 000
Mujeres 4 000 000 - 5 000 000
Nintildeos (4 antildeos) 4 200 000 - 5 200 000
Lactantes (1 - 6 meses) 3 800 000 - 5 200 000
Recieacuten nacidos 5 000 000 - 6 000 000
Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2
63 DETERMINACIOacuteN DEL VOLUMEN GLOBULAR (Hematocrito)
Mide la fraccioacuten que comprende a los gloacutebulos rojos (masa globular) respectoal
volumen total de la muestra de sangre venosa o capilar Puede expresarseen
porcentaje o como valor decimal
Hto= altura de la columna de gloacutebulos rojosdivide altura de la columna de sangre
total(gloacutebulos rojos maacutes plasma)
631 Meacutetodo de Wintrobe
Materiales requeridos
- Tubo de Wintrobe graduado de 0 - 100 mm
- Pipetas Pasteur o pipetas de transferencia
- Tapoacuten de goma
Procedimiento
diams Llenar la sangre extraiacuteda con anticoagulante con una pipeta pasteur
comenzandodesde el fondo hasta la marca superior de 100 mm teniendocuidado
de no provocar espuma
diams Tapar el tubo con un tapoacuten de goma para evitar la evaporacioacuten
diams Centrifugar a 3000 rpm por 30 minutos
Resultados (lectura)
Del tubo graduado se mide directamente el nivel de la columna de gloacutebulosrojos
Valores de referencia
Hombres 40 - 54Mujeres 38 - 48
Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2
632 Meacutetodo de microhematocrito
Materiales requeridos
- Capilares rojos y azules (75 mm x 15 mm)
- Plastilina
Procedimiento
diams Tomar la muestra en capilares rojos heparinizados directamente del pulpejodel
dedo o utilizar capilares azules sin heparina para sangre venosacon
anticoagulante de Wintrobe o EDTA Debe llenarse aproximadamente70 - 80
del capilar
diams Ocluir (tapar) un extremo del capilar con plastilina
diams Colocar el capilar sobre la plataforma del cabezal de una centriacutefuga demicrohematocrito con el extremo ocluido adherido al reborde externo de laplataforma
diams Centrifugar por 5 minutos entre 10 000 - 12 000 rpm
Resultados (lectura)
La lectura se realiza con una escala estandarizada que expenden en el comercio
Uso de la escala
diams Sostenga el tubo frente a la escala de manera que el fondo de la columnade eritrocitos (no el extremo inferior del tubo) quede exactamente al mismonivel de la liacutenea horizontal correspondiente al cero
diams Desplace el tubo a traveacutes de la escala hasta que la liacutenea marcada con elnuacutemero 10 quede al nivel del tope de la columna de plasma Vigile que elfondo de la
columna de eritrocitos continuacutee sobre la liacutenea cero El tubodebe encontrarse completamente en posicioacuten vertical
diams La liacutenea que pase al nivel del tope de la columna de eritrocitos indicaraacute lafraccioacuten de volumen de eacutestos
Valores de referencia
Hombres 40 - 50
Mujeres 38 - 44
Nintildeos (5 antildeos) 38 - 44
Lactantes (3 meses) 37 - 42
Recieacuten nacidos 50 - 58
La disposicioacuten celular esParte superior una columna de plasmaEn la interfase estaacuten los leucocitos yplaquetasParte inferior estaacute la columna deeritrocitos (Fig 15)
64 DOSAJE DE HEMOGLOBINA
Principio
La sangre se diluye en liacutequido de Drabkin el cual hemoliza los hematiacutees yconvierte la hemoglobina en cianometahemoglobina (cianuro de hemiglobina)La solucioacuten que se produce se lee por medio de un espectrofotoacutemetro ofotocoloriacutemetro Su grado de absorbancia es proporcional a la cantidad dehemoglobina que contenga la sangre
641 Materiales y reactivos
6411 Un coloriacutemetro fotoeleacutectrico o un espectrofotoacutemetro
6412 Pipetas
diams Una pipeta para sangre (pipeta de Sahli) graduada hasta 002 mL contubo de goma y boquilla
diams Una pipeta de vidrio graduada de 5 mL
6413 Tubos de ensayo
6414 Reactivo de Drabkin para dilucioacuten
Este reactivo se puede adquirir en tabletas o polvos para disolver en 1litro de agua destilada Si se dispone de una balanza analiacutetica la preparacioacutense puede hacer en el laboratorio Esta solucioacuten se puedeconservar durante un mes en un frasco de vidrio oscuro Deseacutechese sise enturbia
Fig 4 Fig 5
Fig 6 Fig 7
33 OBTENCIOacuteN DE SANGRE VENOSA EN TUBOS AL VACIacuteO
331 Materiales requeridos
3311 Algodoacuten
3312 Alcohol al 70
3313 Ligadura o torniquete de 25 a 30 cm de largo
3314 Tubos al vaciacuteo con anticoagulante EDTA (K3) EDTA (Na2) u otroanticoagulante
3315 Agujas con dispositivo para extraccioacuten de sangre al vaciacuteo
- Nordm 21 para adultos
- Nordm 22 para nintildeos y neonatos
De preferencia ambas de bisel corto para evitar la coagulacioacuten
332 Obtencioacuten de la muestra
3321 Repetir los pasos de 3221 a 3224
3322 Se retira el estuche protector de la aguja y eacuteste se enrosca al dispositivopara extraccioacuten de sangre al vaciacuteo
3323 Colocar la ligadura cuatro dedos por encima de la flexioacuten del codo o10 cm por encima de eacuteste y pedir al paciente que abra y cierre la manovarias veces para favorecer la dilatacioacuten de las venas
3324 Una vez escogida la vena desinfectarla con una pieza de algodoacutenembebido en etanol al 70
3325 Se coloca la aguja en direccioacuten paralela a la vena se perfora la pielhaciendo avanzar la aguja entre 05 cm y 1 cm en el tejido subcutaacuteneose inserta el tubo al vaciacuteo por la parte posterior y no preocuparse porla cantidad de sangre extraiacuteda ya que el mismo sonido del vaciacuteo avisaraacuteque la extraccioacuten terminoacute (Fig 8)
3326 Retirar la ligadura tirando del extremo doblado
3327 Colocar un pedazo de algodoacuten seco sobre la parte donde se encuentraoculta la aguja Sacar la aguja con un movimiento raacutepido y depositarlaen el recipiente de metal con desinfectante (Fig 9)
3328 Pedir al paciente que presione firmemente el algodoacuten durante 3 minutoscon el brazo extendido No se recomienda que se flexione el brazoa causa del riesgo que se forme un hematoma
3329 Mezclar por inmersioacuten suave la sangre con el anticoagulante contenidoen el tubo No agitar el contenido
Fig 8 Fig 9
333 Ventajas de una extraccioacuten de sangre venosa
3331 Pueden hacerse repetidos exaacutemenes con la misma muestra
3332 Parte de la muestra (plasma o suero) puede congelarse para referenciafutura
334 Desventajas de una extraccioacuten de sangre venosa
3341 La puncioacuten venosa por su largo procedimiento requiere mayor preparacioacuten que el meacutetodo capilar
3342 El meacutetodo es teacutecnicamente difiacutecil en nintildeos individuos obesos y pacientes en shock
3343 La hemoacutelisis debe ser evitada pues se puede obtener una disminucioacuten en el recuento de eritrocitos
3344 Debe evitarse prolongada estasis venosa producida por el torniquete pues produce hemoacutelisis y otros cambios que ponen la sangre en un estado inadecuado para el anaacutelisis de gases recuentos celulares determinacioacuten de pH sanguiacuteneo y algunas pruebas de coagulacioacuten
3345 La sangre anticoagulada si no es de obtencioacuten reciente no debe ser utilizada en extensiones de sangre pues algunos anticoagulantes producen cambios en las plaquetas que pueden causar aglutinaciones agregacioacuten plaquetaria y dificultan la identificacioacuten de leucocitos
3346 Puesto que algunos de los componentes de la sangre no son estables los recuentos de leucocitos y plaquetas e iacutendice de sedimentacioacuten deben realizarse antes de que pasen dos horas desde que se obtuvo la muestra
34 OBTENCIOacuteN DE SANGRE DE LA VENA YUGULAR EXTERNA
341 Materiales requeridos
3411 Algodoacuten
3412 Alcohol al 70
3413 Jeringas de 5 mL
3414 Viales con anticoagulante EDTA
342 Obtencioacuten de la muestra
3421 El paciente es cubierto por una saacutebana de manera que los brazospermanezcan inmovilizados a lo largo del cuerpo
3422 Al paciente se le coloca de cuacutebito dorsal sobre la mesa de examen ouna
camilla de manera que la cabeza cuelgue sobre el final de lamesa y el cuerpo sea
sujetado por un asistente
3423 Cuando el paciente grita la vena yugular externa se marca claramente
3424 Limpiar la zona en un aacuterea de 2 pulgadas con alcohol al 70 o
alcoholyodado
3425 Se repiten los pasos de 3225 a 3227 de la extraccioacuten de sangrevenosa
con jeringa
3426 Retirar la aguja de la vena y presionar suavemente con un algodoacutenseco
aproximadamente de 3 a 5 minutos Pedir al paciente que permanezcaechado diez
minutos
3427 Se repiten los pasos de 3229
3428 Se repiten los pasos de 32210
343 Ventajas
Constituye un buen meacutetodo para la obtencioacuten de sangre en pacientes conshock
con venas colapsadas
344 Desventajas
Por lo delicado en su procedimiento no se recomienda como rutina soacutelo encasos
en que no se pueda obtener la muestra por meacutetodos convencionales
35 OBTENCIOacuteN DE SANGRE CAPILAR
Cuando la cantidad de sangre que se precisa es muy pequentildea o cuando
pordiferentes motivos no pueda practicarse una puncioacuten venosa debe recurrirse
a la puncioacuten capilar
351 Materiales requeridos
3512 Algodoacuten
3513 Alcohol al 70
3514 Lancetas desechables (Fig 10)
3515 Papel filtro Nordm 2
352 Procedimiento (Fig 11)
3521 La sangre capilar se obtiene de la cara lateral del dedo medio o anularen los adultos y del dedo gordo del pie o taloacuten en los nintildeos
3522 Desinfectar la zona con alcohol al 70 secar con algodoacuten esteacuteril
3523 Punzar la piel con una lanceta esteacuteril desechable (2 mm de profundidad)
3524 Usar gasa esteacuteril para desechar la primera gota y recoger las siguientesen tubos capilares Evitar comprimir la extremidad para obtenersangre porque se altera la composicioacuten sanguiacutenea
353 Ventajas
3531 Puede obtenerse con facilidad
3532 Es preferible cuando han de realizarse extensiones de sangre perifeacuterica
354 Desventajas
3541 Soacutelo se pueden obtener pequentildeas cantidades de sangre y los exaacutemenesde repeticioacuten requieren nuevas muestras
3542 La sangre en microtubos (capilares) frecuentemente se hemolizainterfiendo con la mayoriacutea de pruebas de laboratorio
3543 Los resultados obtenidos en pruebas con sangre capilar no puedenser comparados con los resultados de las pruebas con sangre venosa
3544 El dedo no soacutelo es delicado sino difiacutecil de desinfectar adecuadamenteen el tiempo disponible
3545 En pacientes con resistencia disminuida a la infeccioacuten (aquellos conleucemia agranulocitosis diabetes uremia y enfermedades con deficienciasinmunoloacutegicas) una muestra tomada del dedo es mucho maacutesprobable que conduzca a una infeccioacuten que otra tomada del brazo
3546 El recuento de eritrocitos y leucocitos asiacute como el recuento deplaquetas y reticulocitos no debe realizarse en sangre capilar debidoa la difiacutecil estandarizacioacuten del flujo sanguiacuteneo capilar
EXTRACCIOacuteN DE SANGRE CAPILAR
Fig 10
Fig 11
SECCIOacuteN 4
ANTICOAGULANTES
Una vez extraiacuteda la sangre eacutesta puede conservarse coagulada o
mantenidaincoagulable mediante la adicioacuten de un anticoagulante
41 CARACTERIacuteSTICAS BAacuteSICAS DE LOS ANTICOAGULANTES MAacuteS
USADOSEN HEMATOLOGIacuteA
bull No alterar el tamantildeo de los hematiacutees
bull No producir hemoacutelisis
bull Evitar al maacuteximo la agregacioacuten plaquetaria
bull No alterar la morfologiacutea de los leucocitos
La sangre tratada con anticoagulante debe procesarse lo antes posible
inclusomantenida bajo refrigeracioacuten (4 ordmC) si no pasan de las 2 horas El
tiempomaacuteximo entre la extraccioacuten de la sangre y su procesamiento depende
delcoagulante de eleccioacuten y no debe ser maacutes de 4 horas a excepcioacuten
delanticoagulante EDTA (etilendiaminotetraceacutetico) que puede ser hasta 24
horas(en refrigeracioacuten a 4 ordmC)
Los anticoagulantes pueden emplearse en forma soacutelida o liacutequida Los
primerosestaacuten indicados para la determinacioacuten de los paraacutemetros
hematoloacutegicosya que no producen como los anticoagulantes liacutequidos dilucioacuten de
la sangre
42 ANTICOAGULANTES SOacuteLIDOS
421 EDTA
Es la sal disoacutedica o tripotaacutesica del aacutecido etilendiaminotetraceacutetico La saldisoacutedica
(Na2EDTA) es menos soluble que la sal tripotaacutesica (K3EDTA) Estoscompuestos
realizan su accioacuten a traveacutes de un efecto quelante sobre el calcioal fijarlo impiden
su activacioacuten y por ende la coagulacioacuten sanguiacutenea
4211 Ventajas
bull Respeta la morfologiacutea eritrocitaria (especialmente la sal tripotaacutesica) yleucocitaria de manera que permite una demora de dos horas en la realizacioacutendel frotis sanguiacuteneo despueacutes de la extraccioacuten sanguiacutenea
bull Asegura la conservacioacuten de los elementos formes sanguiacuteneos durante 24horas si la sangre se mantiene a 4 ordmC
bull Al inhibir la aglutinacioacuten de las plaquetas facilita su recuento o su expresioacutensemicuantitativa a partir del frotis
bull La concentracioacuten recomendada de EDTA es de 15 mgmL de sangre Unamayor cantidad de anticoagulante puede producir retraccioacuten celular condisminucioacuten del hematocrito y un aumento de la concentracioacuten media de lahemoglobina Un exceso de sangre con relacioacuten al anticoagulante produceformacioacuten de microagregados que pueden alterar los resultados El empleode tubos al vaciacuteo con una gota (50mL) de EDTA tripotaacutesica comercialpara 5 mL de sangre es de intereacutes praacutectico dado que es cien veces maacutessoluble facilitando la mezcla de sangre con anticoagulante
4212 Desventajas
Usado en exceso afecta a los eritrocitos y a los leucocitos a los cuales les produce encogimiento y cambios en su forma por ello debe cuidarse de agregar la cantidad correcta de sangre al anticoagulante
422 Anticoagulante de Wintrobe
Es una mezcla de oxalato de amonio y potasio Actuacutea por precipitacioacuten del calcio es faacutecil de preparar Se emplea en forma de polvo en proporcioacuten de 2 de oxalato de amonio por 1 de oxalato de potasio La cantidad recomendada es de 2 mg x mL de sangre Este anticoagulante no afecta el volumen globular medio y puede usarse para determinaciones de hemoglobina hematocrito y recuento globular pero para los extendidos queda limitada a los primeros minutos tampoco es uacutetil para el recuento plaquetario porque produce formacioacuten de agregados plaquetarios
423 Heparina
El nombre de heparina proviene del griego hepar que significa hiacutegado ya que fue aislado por primera vez de las ceacutelulas de este tejido Es un mucopolisacaacuterido aacutecido Presenta el
inconveniente de que si no se agita raacutepidamente con la sangre despueacutes de extraiacuteda
pueden formarse microcoaacutegulos aunque no altera el volumeneritrocitario ni la morfologiacutea de los leucocitos No es recomendablepara el frotis sanguiacuteneo porque produce un fondo azul en la laacutemina
La heparina de sodio o litio puede usarse en forma soacutelida o liacutequida en
proporcioacutende 01 - 02 mg de heparina por 1 mL de sangre
43 ANTICOAGULANTES LIacuteQUIDOS
431 Citrato trisoacutedico
Es de eleccioacuten para las pruebas de hemostasia y la velocidad de sedimentacioacuten
Actuacutea a traveacutes de la precipitacioacuten del calcio La concentracioacuten depende de
la prueba por realizar
bull Para pruebas de hemostasia se emplea en proporcioacuten de 1 9 (05 mL
deanticoagulante para 45 mL de sangre total)
bull Para la determinacioacuten de la VSG (Velocidad de Sedimentacioacuten Globular) es14
(05 mL de anticoagulante para 2 mL de sangre)
432 Oxalato soacutedico
Recomendado tambieacuten para las pruebas de hemostasia Se emplea en
proporcioacutende un volumen de anticoagulante para 4 vol de sangre
SECCIOacuteN 5
REALIZACIOacuteN Y TINCIOacuteN DEL FROTIS SANGUIacuteNEO
La praacutectica del frotis sanguiacuteneo tambieacuten llamado extendido es de gran importanciaen hematologiacutea ya que el diagnoacutestico de muchas enfermedadeshematoloacutegicas puede realizarse con soacutelo observar las caracteriacutesticasmorfoloacutegicas de las ceacutelulas sanguiacuteneas de manera que eacuteste no debe serexcesivamente grueso ni excesivamente fino Todas las laacuteminas por usarsobre todo nuevas deben ser limpiadas con algodoacuten y alcohol al 70 paraeliminar la grasa que viene adherida
51 MEacuteTODO DE LOS DOS PORTAOBJETOS
511 Materiales
- Alcohol al 70
- Algodoacuten
- Lanceta descartable
- Portaobjetos de vidrios limpios y desgrasados (25 x 75 mm)
512 Fundamento
Consiste en la extensioacuten de una gota de sangre sobre un portaobjeto (25 x 75)empleando el canto biselado de otro portaobjeto de igual dimensioacuten (Fig 12)
513 Procedimiento
5131 Una vez extraiacuteda la sangre con cualquiera de las metodologiacuteas secoloca una pequentildea gota de sangre (5mL) (aprox 3 mm de diaacutemetro)sobre un portaobjeto a 2 cm aproximadamente de uno de los extremos
5132 Colocar el canto de otro portaobjeto esmerilado sobre la superficiedel primer portaobjeto (en la que se encuentra la gota de sangre)formando un aacutengulo de 45ordm
5134 Deslizar suavemente y a velocidad moderada el portaobjeto sobre elotro en sentido longitudinal hasta que la gota de sangre quede bienextendida sobre la
superficie del primer portaobjeto El grosor delfrotis sanguiacuteneo puede variar seguacuten sea el aacutengulo que formen entresiacute ambos portaobjetos Asiacute si es superior a 45ordm la extensioacuten obtenidaseraacute gruesa y corta si es inferior a 45ordm seraacute larga y fina El secado delfrotis es a temperatura ambiente y en posicioacuten horizontal
Fig 12
1048729 Zona excesivamente gruesa Se halla en la regioacuten inmediata al punto departida de la extensioacuten (cabeza) En ella se aprecia siempre un aumento delinfocitos
1048729 Zona excesivamente fina Corresponde al final de la extensioacuten y termina enun aacuterea donde las ceacutelulas adoptan una posicioacuten acartonada (barbas) Enesta regioacuten existe un exceso de granulocitos y monocitos
1048729 Zona ideal Corresponde a la regioacuten intermedia del frotis y en ella existe unreparto equilibrado de ceacutelulas
52 COLORACIONES USADAS
Una vez seco el frotis se procede a la tincioacuten hematoloacutegica con el colorante deRomanowsky constituido por la mezcla de eosina y azul de metileno Dentrode eacutestas tenemos
521 Colorante de Giemsa
522 Colorante de May-Grunwald
523 Colorante de Wright
524 Colorante de Leishman
Preparacioacuten de colorantes (Anexo A)
1048729 Para el estudio de las ceacutelulas sanguiacuteneas utilizar el colorante 523 y 524
1048729 Para el estudio de hemoparaacutesitos utilizar el colorante 521
1048729 Utilizar el colorante 522 para casos especiales en que se desee observar
con mayor claridad y especificidad los graacutenulos de los neutrofilos
53 TINCIOacuteN CON COLORANTE DE WRIGHT
531 Fundamento
El colorante de Wright va a permitir suministrar un medio para estudiar lasangre y determinar las variaciones y anormalidades de estructura forma ytamantildeo de los eritrocitos su contenido de hemoglobina y sus propiedades decoloracioacuten La informacioacuten obtenida de un frotis de sangre perifeacuterica dependeen gran parte de la calidad del extendido y la coloracioacuten
532 Materiales
5321 Colorante de Wright (Anexo A)
5322 Frasco gotero
5323 Solucioacuten amortiguada tamponada (Anexo A)
533 Procedimiento
5331 Una vez obtenido el frotis sanguiacuteneo se le dejaraacute secar entre 15 y 20minutos
5332 Luego se coloca la preparacioacuten en un soporte y se cubre con el colorantede Wright dejaacutendolo por espacio de 5 minutos
5333 Posteriormente se antildeade solucioacuten amortiguada tamponada en partesiguales hasta obtener un brillo metaacutelico dejando 6 minutos adicionales
5334 Finalmente se lava con agua corriente y se deja secar
5335 Se coloca en el microscopio y con pequentildeo aumento se revisa lacalidad de la coloracioacuten la cantidad aproximada de gloacutebulos blancosy se escoge el sitio para iniciar el recuento Se coloca una gota deaceite de inmersioacuten y se enfoca a un aumento de 100xLa forma de los gloacutebulos rojos se examinaraacute detenidamente observandoademaacutes del color (cantidad de hemoglobina) presencia deplaquetas su agrupacioacuten y distribucioacuten
5336 Posteriormente se hace el recuento diferencial de gloacutebulos blancosen 100
ceacutelulas para lo cual se deberaacute conocer las diferencias entreneutroacutefilos eosinoacutefilos
linfocitos y monocitosUna extensioacuten de sangre bien tentildeida debe caracterizarse
por unabuena diferenciacioacuten de las estructuras subcelulares en los leucocitosuna
coloracioacuten rosada de los hematiacutees y la ausencia de precipitados
Los defectos maacutes frecuentes observados en la tincioacuten del frotis sanguiacuteneoson
Coloracioacuten excesivamente azul debido a
1048729 Frotis excesivamente grueso
1048729 Lavado insuficiente
1048729 Tincioacuten muy prolongada
1048729 Empleo de colorante excesivamente alcalino
Coloracioacuten con una tonalidad rosada
1048729 El colorante el tampoacuten o el agua de lavado tienen un pH demasiadoaacutecido
Presencia de precipitados
1048729 Obedecen a una accioacuten excesiva del colorante Esto se puede evitarcon la
filtracioacuten
SECCIOacuteN 6
HEMOGRAMA-HEMOGLOBINA-HEMATOCRITO
El hemograma de Shilling constituye uno de los exaacutemenes de laboratorio
maacutesusados en el campo de la hematologiacutea Comprende las siguientes pruebas
61 RECUENTO LEUCOCITARIO
Principio
La sangre anticoagulada se deposita en un liacutequido que permite evidenciar
losleucocitos mantenieacutendolos visibles mientras que los eritrocitos
sonhemolizados El recuento del nuacutemero de leucocitos o gloacutebulos blancos se
expresapor mm3 (miliacutemetro cuacutebico)
611 Equipos
- Microscopio
- Hemocitoacutemetro (Caacutemara de Neubauer)
Consta de los siguientes elementos
diams Una laacutemina portaobjeto gruesa en el centro se hallan dos
superficiescuadriculadas iguales separadas del resto de la laacutemina por surcos y
dosbarras transversales algo maacutes elevadas
diams Una laminilla cubreobjetos oacutepticamente plana que al colocarse sobrelas barras
elevadas de la laacutemina forma una caacutemara entre el cubreobjetosy la superficie
cuadriculadaLa altura entre el cubreobjetos y la laacutemina portaobjetos es de 01
mmCada cuadriacutecula mide 3 mm de lado y se divide en 9 cuadrados grandesCada
uno de los cuales mide 1 mm2 de superficie que se subdivide a suvez en 16
cuadrados medianos El cuadrado grande central se divide en25 cuadrados
pequentildeos y cada uno de ellos en 16 cuadraditos Cadacuadrado pequentildeo mide
02 mm de lado (004 mm2 de superficie) y cadacuadradito mide 005 mm de lado
(00025 mm2 de superficie)
612 Materiales y reactivos requeridos
6121 Pipeta de gloacutebulos blancos (De Thoma) o pipeta automaacutetica (de 0 a 100 mL)Presenta cerca del extremo superior una marca de 11 inmediatamentecontinuacutea una dilatacioacuten (bulbo) que contiene una perla que funciona comomezcladora luego sigue el extremo maacutes largo de la pipeta (tallo) que estaacutedividida en 10 partes con 2 marcas 1 (parte final del bulbo) y 05 (a la mitaddel tallo) Se le acopla a su extremo superior 1 tubo de goma y una bombillapara aspirar
6122 Diluyente de gloacutebulos blancos Solucioacuten de Turk al 1
6123 Contador manual (Soacutelo si fuera necesario)
6124 Papel filtro
613 Procedimiento
6131 Una vez obtenida la sangre con anticoagulante o sangre capilar deldedo se procede a aspirar la sangre con la pipeta de gloacutebulos blancoshasta la marca de 05 y a limpiar la punta con papel absorbente
6132 Introducir la pipeta en el tubo que contenga solucioacuten de Turk y absorberhasta la marca de 11 (no debe haber burbujas)
6133 Tapar ambos extremos y proceder a mezclar manualmente o en unrotador automaacutetico por 2 oacute 3 minutos
6134 Monte la laminilla de vidrio en la caacutemara para recuento que debe estarlimpia y seca
6135 Agitar la pipeta y descartar las cuatro primeras gotas para luego colocaruna gota pequentildea de esta solucioacuten en la caacutemara
6136 Deje reposar por espacio de 3 minutos para que las ceacutelulas se sedimenten
6137 Enfocar con objetivo de 10x y contar en 4 cuadrados grandes angularesCuando se usa la pipeta automaacutetica se toma 20 mL (002 mL) desangre total con anticoagulante o sangre capilar con anticoagulante yse diluye en un tubo que contenga 380 mL de solucioacuten de Turk (aquiacutetenemos una dilucioacuten 120)
LECTURA
Fig 13
La lectura se realiza en los campos 1 3 7 y 9 como estaacute indicado en la figuraAdemaacutes de los leucocitos contados dentro de cada uno de los cuadrantes sedeben contar todos los leucocitos que se encuentren adheridos en la liacuteneahorizontal superior y vertical exterior o de lo contrario todos los leucocitosadheridos a la liacutenea horizontal inferior y vertical interior
614 Resultados
Nordm de leucocitos x mm3 = leucocitos contados en 4 camposdividealtura x dilucioacuten x aacuterea
Reemplazando = leucocitos contados en 4 camposdivide110 x 120 x 4=
Leucocitos contados en 4 camposdivide4200=
X1 divide4200= Nordm leucocitos contados x 50
615 Valores de referencia
5000 - 10 000 leucocitos mm3
616 Correccioacuten de valores para restar eritrocitos nucleados
Los normoblastos no se destruyen (lisis) en el liacutequido de dilucioacuten por lo tantopueden observarse al realizar el recuento leucocitario y confundirse con losleucocitos de tal manera que se debe emplear la siguiente foacutermula
Caacutelculo
La concentracioacuten del nuacutemero de normoblastos (por litro) esNuacutemero de normoblatos contados x concentracioacuten o nuacutemero de leucocitos100 + Nordm de normoblastos contados
Ejemplo
Si se cuentan 50 normoblastos y la concentracioacuten del nuacutemero de leucocitos es16 x 109l la concentracioacuten del nuacutemero de normoblastos seraacute
50 x16 = 53 x 109l
100 + 50
y la concentracioacuten de leucocitos corregida seraacute 16 - 53 = 107 x 109lEn unidades tradicionales las concentraciones de normoblastos y leucocitosse expresan por miliacutemetro cuacutebico En tales unidades el caacutelculo correspondienteal ejemplo que se ha dado seriacutea
50 x 16 000 = 5300 mm3
100 + 50
Recuento corregido de gloacutebulos blancos o leucocitos = 16 000 - 5300 = 10 700 mm3
Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2
62 RECUENTO DE GLOacuteBULOS ROJOS
Principio
La sangre se diluye en un liacutequido que nos permite observar claramente loshematiacutees luego esta dilucioacuten se coloca en una caacutemara de Neubauer con laayuda de una pipeta automaacutetica o pipeta Pasteur y se cuentan en el microscopioa un objetivo de 40x para calcular el nuacutemero de gloacutebulos rojos por mm3
621 Equipos
- Microscopio
- Hemocitoacutemetro (caacutemara de Neubauer)
622 Materiales y reactivos requeridos
6221 Pipeta de gloacutebulos rojos (De Thoma) o pipeta automaacutetica (de 0-100 mL)
Presenta cerca del extremo superior una marca de 101 inmediatamentecontinuacutea una dilatacioacuten (bulbo) que contiene una perla roja mezcladoraluego sigue el tallo (extremo maacutes largo) el cual estaacute dividido en 10 partescon 2 marcas 1 acabando el bulbo y 05 a la mitad del tallo Se requiereigual que el recuento de leucocitos una boquilla para aspirar
6222 Diluyente de gloacutebulos rojos Cloruro de Sodio al 09 (ver anexo)
Diluyente de Hayem (ver anexo)
6223 Contador manual (soacutelo si fuera necesario)
6224 Papel filtro
623 Procedimiento
6231 Mezclar la sangre obtenida con el anticoagulante o tomar sangre capilar
6232 Llenar la pipeta de gloacutebulos rojos con sangre hasta la marca de 05para realizar una dilucioacuten de 1200 y si se carga hasta 1 la dilucioacutenseraacute 1100 Limpiar la punta con gasa o papel absorbente
6233 Introducir la pipeta en el tubo o frasquito conteniendo diluyente (Hayem)y llenar de liacutequido de dilucioacuten hasta la marca de 101
6234 Se coloca en un rotador automaacutetico o se hace rotar manualmente de2 a 3 minutos
6235 Agitar bien la pipeta y descartar 3 a 4 gotas del tallo luego colocar unagota pequentildea cerca de un extremo de la caacutemara para que por capilaridadse llene exactamente
6236 Hacer el recuento con objetivo de 40xSe puede realizar con la pipeta automaacutetica se toma 20 mL (002mL)de sangre total con anticoagulante o sangre capilar y se deposita enun tubo de 12 x 75 que contenga 4 mL de solucioacuten de Hayem (aquiacute setiene una dilucioacuten de 1200) Se deja reposar aproximadamente 5minutos y se procede a cargar la caacutemara con la misma pipeta usandoun nuevo tip El inconveniente aquiacute es el gasto de reactivo (4 mL) perolas medidas son mas exactas
6237 Dejar en reposo por 3 minutos
6238 Enfocar la cuadriacutecula a 10x luego con el objetivo de 40x contar sobreel cuadrado grande central de la caacutemara soacutelo en 5 cuadrados pequentildeosuno central y cuatro angulares (80 cuadraditos en total)
6239 En el recuento se incluyen las ceacutelulas que cubren o tocan por dentroo por fuera las liacuteneas limitantes superior e izquierda en el cuadradopequentildeo de recuento y no se consideran los correspondientes a losliacutemites inferior y derechoSe hace el recuento en los puntos ABCD y Ey se sigue los mismos paraacutemetros del recuento de leucocitos
LECTURA
Fig 14
624 Resultados
Nordm de hematiacutees x mm3 = hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeosaltura x dilucioacuten X aacuterea
Reemplazando = hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeos110 x 1200 x 15
= hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeos divide 110 000
= hematiacutees contados x 10 000
625 Valores de referencia
(Unidades tradicionales millones de ceacutelulasmm3)
Hombres 4 500 000 - 5 500 000
Mujeres 4 000 000 - 5 000 000
Nintildeos (4 antildeos) 4 200 000 - 5 200 000
Lactantes (1 - 6 meses) 3 800 000 - 5 200 000
Recieacuten nacidos 5 000 000 - 6 000 000
Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2
63 DETERMINACIOacuteN DEL VOLUMEN GLOBULAR (Hematocrito)
Mide la fraccioacuten que comprende a los gloacutebulos rojos (masa globular) respectoal
volumen total de la muestra de sangre venosa o capilar Puede expresarseen
porcentaje o como valor decimal
Hto= altura de la columna de gloacutebulos rojosdivide altura de la columna de sangre
total(gloacutebulos rojos maacutes plasma)
631 Meacutetodo de Wintrobe
Materiales requeridos
- Tubo de Wintrobe graduado de 0 - 100 mm
- Pipetas Pasteur o pipetas de transferencia
- Tapoacuten de goma
Procedimiento
diams Llenar la sangre extraiacuteda con anticoagulante con una pipeta pasteur
comenzandodesde el fondo hasta la marca superior de 100 mm teniendocuidado
de no provocar espuma
diams Tapar el tubo con un tapoacuten de goma para evitar la evaporacioacuten
diams Centrifugar a 3000 rpm por 30 minutos
Resultados (lectura)
Del tubo graduado se mide directamente el nivel de la columna de gloacutebulosrojos
Valores de referencia
Hombres 40 - 54Mujeres 38 - 48
Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2
632 Meacutetodo de microhematocrito
Materiales requeridos
- Capilares rojos y azules (75 mm x 15 mm)
- Plastilina
Procedimiento
diams Tomar la muestra en capilares rojos heparinizados directamente del pulpejodel
dedo o utilizar capilares azules sin heparina para sangre venosacon
anticoagulante de Wintrobe o EDTA Debe llenarse aproximadamente70 - 80
del capilar
diams Ocluir (tapar) un extremo del capilar con plastilina
diams Colocar el capilar sobre la plataforma del cabezal de una centriacutefuga demicrohematocrito con el extremo ocluido adherido al reborde externo de laplataforma
diams Centrifugar por 5 minutos entre 10 000 - 12 000 rpm
Resultados (lectura)
La lectura se realiza con una escala estandarizada que expenden en el comercio
Uso de la escala
diams Sostenga el tubo frente a la escala de manera que el fondo de la columnade eritrocitos (no el extremo inferior del tubo) quede exactamente al mismonivel de la liacutenea horizontal correspondiente al cero
diams Desplace el tubo a traveacutes de la escala hasta que la liacutenea marcada con elnuacutemero 10 quede al nivel del tope de la columna de plasma Vigile que elfondo de la
columna de eritrocitos continuacutee sobre la liacutenea cero El tubodebe encontrarse completamente en posicioacuten vertical
diams La liacutenea que pase al nivel del tope de la columna de eritrocitos indicaraacute lafraccioacuten de volumen de eacutestos
Valores de referencia
Hombres 40 - 50
Mujeres 38 - 44
Nintildeos (5 antildeos) 38 - 44
Lactantes (3 meses) 37 - 42
Recieacuten nacidos 50 - 58
La disposicioacuten celular esParte superior una columna de plasmaEn la interfase estaacuten los leucocitos yplaquetasParte inferior estaacute la columna deeritrocitos (Fig 15)
64 DOSAJE DE HEMOGLOBINA
Principio
La sangre se diluye en liacutequido de Drabkin el cual hemoliza los hematiacutees yconvierte la hemoglobina en cianometahemoglobina (cianuro de hemiglobina)La solucioacuten que se produce se lee por medio de un espectrofotoacutemetro ofotocoloriacutemetro Su grado de absorbancia es proporcional a la cantidad dehemoglobina que contenga la sangre
641 Materiales y reactivos
6411 Un coloriacutemetro fotoeleacutectrico o un espectrofotoacutemetro
6412 Pipetas
diams Una pipeta para sangre (pipeta de Sahli) graduada hasta 002 mL contubo de goma y boquilla
diams Una pipeta de vidrio graduada de 5 mL
6413 Tubos de ensayo
6414 Reactivo de Drabkin para dilucioacuten
Este reactivo se puede adquirir en tabletas o polvos para disolver en 1litro de agua destilada Si se dispone de una balanza analiacutetica la preparacioacutense puede hacer en el laboratorio Esta solucioacuten se puedeconservar durante un mes en un frasco de vidrio oscuro Deseacutechese sise enturbia
3321 Repetir los pasos de 3221 a 3224
3322 Se retira el estuche protector de la aguja y eacuteste se enrosca al dispositivopara extraccioacuten de sangre al vaciacuteo
3323 Colocar la ligadura cuatro dedos por encima de la flexioacuten del codo o10 cm por encima de eacuteste y pedir al paciente que abra y cierre la manovarias veces para favorecer la dilatacioacuten de las venas
3324 Una vez escogida la vena desinfectarla con una pieza de algodoacutenembebido en etanol al 70
3325 Se coloca la aguja en direccioacuten paralela a la vena se perfora la pielhaciendo avanzar la aguja entre 05 cm y 1 cm en el tejido subcutaacuteneose inserta el tubo al vaciacuteo por la parte posterior y no preocuparse porla cantidad de sangre extraiacuteda ya que el mismo sonido del vaciacuteo avisaraacuteque la extraccioacuten terminoacute (Fig 8)
3326 Retirar la ligadura tirando del extremo doblado
3327 Colocar un pedazo de algodoacuten seco sobre la parte donde se encuentraoculta la aguja Sacar la aguja con un movimiento raacutepido y depositarlaen el recipiente de metal con desinfectante (Fig 9)
3328 Pedir al paciente que presione firmemente el algodoacuten durante 3 minutoscon el brazo extendido No se recomienda que se flexione el brazoa causa del riesgo que se forme un hematoma
3329 Mezclar por inmersioacuten suave la sangre con el anticoagulante contenidoen el tubo No agitar el contenido
Fig 8 Fig 9
333 Ventajas de una extraccioacuten de sangre venosa
3331 Pueden hacerse repetidos exaacutemenes con la misma muestra
3332 Parte de la muestra (plasma o suero) puede congelarse para referenciafutura
334 Desventajas de una extraccioacuten de sangre venosa
3341 La puncioacuten venosa por su largo procedimiento requiere mayor preparacioacuten que el meacutetodo capilar
3342 El meacutetodo es teacutecnicamente difiacutecil en nintildeos individuos obesos y pacientes en shock
3343 La hemoacutelisis debe ser evitada pues se puede obtener una disminucioacuten en el recuento de eritrocitos
3344 Debe evitarse prolongada estasis venosa producida por el torniquete pues produce hemoacutelisis y otros cambios que ponen la sangre en un estado inadecuado para el anaacutelisis de gases recuentos celulares determinacioacuten de pH sanguiacuteneo y algunas pruebas de coagulacioacuten
3345 La sangre anticoagulada si no es de obtencioacuten reciente no debe ser utilizada en extensiones de sangre pues algunos anticoagulantes producen cambios en las plaquetas que pueden causar aglutinaciones agregacioacuten plaquetaria y dificultan la identificacioacuten de leucocitos
3346 Puesto que algunos de los componentes de la sangre no son estables los recuentos de leucocitos y plaquetas e iacutendice de sedimentacioacuten deben realizarse antes de que pasen dos horas desde que se obtuvo la muestra
34 OBTENCIOacuteN DE SANGRE DE LA VENA YUGULAR EXTERNA
341 Materiales requeridos
3411 Algodoacuten
3412 Alcohol al 70
3413 Jeringas de 5 mL
3414 Viales con anticoagulante EDTA
342 Obtencioacuten de la muestra
3421 El paciente es cubierto por una saacutebana de manera que los brazospermanezcan inmovilizados a lo largo del cuerpo
3422 Al paciente se le coloca de cuacutebito dorsal sobre la mesa de examen ouna
camilla de manera que la cabeza cuelgue sobre el final de lamesa y el cuerpo sea
sujetado por un asistente
3423 Cuando el paciente grita la vena yugular externa se marca claramente
3424 Limpiar la zona en un aacuterea de 2 pulgadas con alcohol al 70 o
alcoholyodado
3425 Se repiten los pasos de 3225 a 3227 de la extraccioacuten de sangrevenosa
con jeringa
3426 Retirar la aguja de la vena y presionar suavemente con un algodoacutenseco
aproximadamente de 3 a 5 minutos Pedir al paciente que permanezcaechado diez
minutos
3427 Se repiten los pasos de 3229
3428 Se repiten los pasos de 32210
343 Ventajas
Constituye un buen meacutetodo para la obtencioacuten de sangre en pacientes conshock
con venas colapsadas
344 Desventajas
Por lo delicado en su procedimiento no se recomienda como rutina soacutelo encasos
en que no se pueda obtener la muestra por meacutetodos convencionales
35 OBTENCIOacuteN DE SANGRE CAPILAR
Cuando la cantidad de sangre que se precisa es muy pequentildea o cuando
pordiferentes motivos no pueda practicarse una puncioacuten venosa debe recurrirse
a la puncioacuten capilar
351 Materiales requeridos
3512 Algodoacuten
3513 Alcohol al 70
3514 Lancetas desechables (Fig 10)
3515 Papel filtro Nordm 2
352 Procedimiento (Fig 11)
3521 La sangre capilar se obtiene de la cara lateral del dedo medio o anularen los adultos y del dedo gordo del pie o taloacuten en los nintildeos
3522 Desinfectar la zona con alcohol al 70 secar con algodoacuten esteacuteril
3523 Punzar la piel con una lanceta esteacuteril desechable (2 mm de profundidad)
3524 Usar gasa esteacuteril para desechar la primera gota y recoger las siguientesen tubos capilares Evitar comprimir la extremidad para obtenersangre porque se altera la composicioacuten sanguiacutenea
353 Ventajas
3531 Puede obtenerse con facilidad
3532 Es preferible cuando han de realizarse extensiones de sangre perifeacuterica
354 Desventajas
3541 Soacutelo se pueden obtener pequentildeas cantidades de sangre y los exaacutemenesde repeticioacuten requieren nuevas muestras
3542 La sangre en microtubos (capilares) frecuentemente se hemolizainterfiendo con la mayoriacutea de pruebas de laboratorio
3543 Los resultados obtenidos en pruebas con sangre capilar no puedenser comparados con los resultados de las pruebas con sangre venosa
3544 El dedo no soacutelo es delicado sino difiacutecil de desinfectar adecuadamenteen el tiempo disponible
3545 En pacientes con resistencia disminuida a la infeccioacuten (aquellos conleucemia agranulocitosis diabetes uremia y enfermedades con deficienciasinmunoloacutegicas) una muestra tomada del dedo es mucho maacutesprobable que conduzca a una infeccioacuten que otra tomada del brazo
3546 El recuento de eritrocitos y leucocitos asiacute como el recuento deplaquetas y reticulocitos no debe realizarse en sangre capilar debidoa la difiacutecil estandarizacioacuten del flujo sanguiacuteneo capilar
EXTRACCIOacuteN DE SANGRE CAPILAR
Fig 10
Fig 11
SECCIOacuteN 4
ANTICOAGULANTES
Una vez extraiacuteda la sangre eacutesta puede conservarse coagulada o
mantenidaincoagulable mediante la adicioacuten de un anticoagulante
41 CARACTERIacuteSTICAS BAacuteSICAS DE LOS ANTICOAGULANTES MAacuteS
USADOSEN HEMATOLOGIacuteA
bull No alterar el tamantildeo de los hematiacutees
bull No producir hemoacutelisis
bull Evitar al maacuteximo la agregacioacuten plaquetaria
bull No alterar la morfologiacutea de los leucocitos
La sangre tratada con anticoagulante debe procesarse lo antes posible
inclusomantenida bajo refrigeracioacuten (4 ordmC) si no pasan de las 2 horas El
tiempomaacuteximo entre la extraccioacuten de la sangre y su procesamiento depende
delcoagulante de eleccioacuten y no debe ser maacutes de 4 horas a excepcioacuten
delanticoagulante EDTA (etilendiaminotetraceacutetico) que puede ser hasta 24
horas(en refrigeracioacuten a 4 ordmC)
Los anticoagulantes pueden emplearse en forma soacutelida o liacutequida Los
primerosestaacuten indicados para la determinacioacuten de los paraacutemetros
hematoloacutegicosya que no producen como los anticoagulantes liacutequidos dilucioacuten de
la sangre
42 ANTICOAGULANTES SOacuteLIDOS
421 EDTA
Es la sal disoacutedica o tripotaacutesica del aacutecido etilendiaminotetraceacutetico La saldisoacutedica
(Na2EDTA) es menos soluble que la sal tripotaacutesica (K3EDTA) Estoscompuestos
realizan su accioacuten a traveacutes de un efecto quelante sobre el calcioal fijarlo impiden
su activacioacuten y por ende la coagulacioacuten sanguiacutenea
4211 Ventajas
bull Respeta la morfologiacutea eritrocitaria (especialmente la sal tripotaacutesica) yleucocitaria de manera que permite una demora de dos horas en la realizacioacutendel frotis sanguiacuteneo despueacutes de la extraccioacuten sanguiacutenea
bull Asegura la conservacioacuten de los elementos formes sanguiacuteneos durante 24horas si la sangre se mantiene a 4 ordmC
bull Al inhibir la aglutinacioacuten de las plaquetas facilita su recuento o su expresioacutensemicuantitativa a partir del frotis
bull La concentracioacuten recomendada de EDTA es de 15 mgmL de sangre Unamayor cantidad de anticoagulante puede producir retraccioacuten celular condisminucioacuten del hematocrito y un aumento de la concentracioacuten media de lahemoglobina Un exceso de sangre con relacioacuten al anticoagulante produceformacioacuten de microagregados que pueden alterar los resultados El empleode tubos al vaciacuteo con una gota (50mL) de EDTA tripotaacutesica comercialpara 5 mL de sangre es de intereacutes praacutectico dado que es cien veces maacutessoluble facilitando la mezcla de sangre con anticoagulante
4212 Desventajas
Usado en exceso afecta a los eritrocitos y a los leucocitos a los cuales les produce encogimiento y cambios en su forma por ello debe cuidarse de agregar la cantidad correcta de sangre al anticoagulante
422 Anticoagulante de Wintrobe
Es una mezcla de oxalato de amonio y potasio Actuacutea por precipitacioacuten del calcio es faacutecil de preparar Se emplea en forma de polvo en proporcioacuten de 2 de oxalato de amonio por 1 de oxalato de potasio La cantidad recomendada es de 2 mg x mL de sangre Este anticoagulante no afecta el volumen globular medio y puede usarse para determinaciones de hemoglobina hematocrito y recuento globular pero para los extendidos queda limitada a los primeros minutos tampoco es uacutetil para el recuento plaquetario porque produce formacioacuten de agregados plaquetarios
423 Heparina
El nombre de heparina proviene del griego hepar que significa hiacutegado ya que fue aislado por primera vez de las ceacutelulas de este tejido Es un mucopolisacaacuterido aacutecido Presenta el
inconveniente de que si no se agita raacutepidamente con la sangre despueacutes de extraiacuteda
pueden formarse microcoaacutegulos aunque no altera el volumeneritrocitario ni la morfologiacutea de los leucocitos No es recomendablepara el frotis sanguiacuteneo porque produce un fondo azul en la laacutemina
La heparina de sodio o litio puede usarse en forma soacutelida o liacutequida en
proporcioacutende 01 - 02 mg de heparina por 1 mL de sangre
43 ANTICOAGULANTES LIacuteQUIDOS
431 Citrato trisoacutedico
Es de eleccioacuten para las pruebas de hemostasia y la velocidad de sedimentacioacuten
Actuacutea a traveacutes de la precipitacioacuten del calcio La concentracioacuten depende de
la prueba por realizar
bull Para pruebas de hemostasia se emplea en proporcioacuten de 1 9 (05 mL
deanticoagulante para 45 mL de sangre total)
bull Para la determinacioacuten de la VSG (Velocidad de Sedimentacioacuten Globular) es14
(05 mL de anticoagulante para 2 mL de sangre)
432 Oxalato soacutedico
Recomendado tambieacuten para las pruebas de hemostasia Se emplea en
proporcioacutende un volumen de anticoagulante para 4 vol de sangre
SECCIOacuteN 5
REALIZACIOacuteN Y TINCIOacuteN DEL FROTIS SANGUIacuteNEO
La praacutectica del frotis sanguiacuteneo tambieacuten llamado extendido es de gran importanciaen hematologiacutea ya que el diagnoacutestico de muchas enfermedadeshematoloacutegicas puede realizarse con soacutelo observar las caracteriacutesticasmorfoloacutegicas de las ceacutelulas sanguiacuteneas de manera que eacuteste no debe serexcesivamente grueso ni excesivamente fino Todas las laacuteminas por usarsobre todo nuevas deben ser limpiadas con algodoacuten y alcohol al 70 paraeliminar la grasa que viene adherida
51 MEacuteTODO DE LOS DOS PORTAOBJETOS
511 Materiales
- Alcohol al 70
- Algodoacuten
- Lanceta descartable
- Portaobjetos de vidrios limpios y desgrasados (25 x 75 mm)
512 Fundamento
Consiste en la extensioacuten de una gota de sangre sobre un portaobjeto (25 x 75)empleando el canto biselado de otro portaobjeto de igual dimensioacuten (Fig 12)
513 Procedimiento
5131 Una vez extraiacuteda la sangre con cualquiera de las metodologiacuteas secoloca una pequentildea gota de sangre (5mL) (aprox 3 mm de diaacutemetro)sobre un portaobjeto a 2 cm aproximadamente de uno de los extremos
5132 Colocar el canto de otro portaobjeto esmerilado sobre la superficiedel primer portaobjeto (en la que se encuentra la gota de sangre)formando un aacutengulo de 45ordm
5134 Deslizar suavemente y a velocidad moderada el portaobjeto sobre elotro en sentido longitudinal hasta que la gota de sangre quede bienextendida sobre la
superficie del primer portaobjeto El grosor delfrotis sanguiacuteneo puede variar seguacuten sea el aacutengulo que formen entresiacute ambos portaobjetos Asiacute si es superior a 45ordm la extensioacuten obtenidaseraacute gruesa y corta si es inferior a 45ordm seraacute larga y fina El secado delfrotis es a temperatura ambiente y en posicioacuten horizontal
Fig 12
1048729 Zona excesivamente gruesa Se halla en la regioacuten inmediata al punto departida de la extensioacuten (cabeza) En ella se aprecia siempre un aumento delinfocitos
1048729 Zona excesivamente fina Corresponde al final de la extensioacuten y termina enun aacuterea donde las ceacutelulas adoptan una posicioacuten acartonada (barbas) Enesta regioacuten existe un exceso de granulocitos y monocitos
1048729 Zona ideal Corresponde a la regioacuten intermedia del frotis y en ella existe unreparto equilibrado de ceacutelulas
52 COLORACIONES USADAS
Una vez seco el frotis se procede a la tincioacuten hematoloacutegica con el colorante deRomanowsky constituido por la mezcla de eosina y azul de metileno Dentrode eacutestas tenemos
521 Colorante de Giemsa
522 Colorante de May-Grunwald
523 Colorante de Wright
524 Colorante de Leishman
Preparacioacuten de colorantes (Anexo A)
1048729 Para el estudio de las ceacutelulas sanguiacuteneas utilizar el colorante 523 y 524
1048729 Para el estudio de hemoparaacutesitos utilizar el colorante 521
1048729 Utilizar el colorante 522 para casos especiales en que se desee observar
con mayor claridad y especificidad los graacutenulos de los neutrofilos
53 TINCIOacuteN CON COLORANTE DE WRIGHT
531 Fundamento
El colorante de Wright va a permitir suministrar un medio para estudiar lasangre y determinar las variaciones y anormalidades de estructura forma ytamantildeo de los eritrocitos su contenido de hemoglobina y sus propiedades decoloracioacuten La informacioacuten obtenida de un frotis de sangre perifeacuterica dependeen gran parte de la calidad del extendido y la coloracioacuten
532 Materiales
5321 Colorante de Wright (Anexo A)
5322 Frasco gotero
5323 Solucioacuten amortiguada tamponada (Anexo A)
533 Procedimiento
5331 Una vez obtenido el frotis sanguiacuteneo se le dejaraacute secar entre 15 y 20minutos
5332 Luego se coloca la preparacioacuten en un soporte y se cubre con el colorantede Wright dejaacutendolo por espacio de 5 minutos
5333 Posteriormente se antildeade solucioacuten amortiguada tamponada en partesiguales hasta obtener un brillo metaacutelico dejando 6 minutos adicionales
5334 Finalmente se lava con agua corriente y se deja secar
5335 Se coloca en el microscopio y con pequentildeo aumento se revisa lacalidad de la coloracioacuten la cantidad aproximada de gloacutebulos blancosy se escoge el sitio para iniciar el recuento Se coloca una gota deaceite de inmersioacuten y se enfoca a un aumento de 100xLa forma de los gloacutebulos rojos se examinaraacute detenidamente observandoademaacutes del color (cantidad de hemoglobina) presencia deplaquetas su agrupacioacuten y distribucioacuten
5336 Posteriormente se hace el recuento diferencial de gloacutebulos blancosen 100
ceacutelulas para lo cual se deberaacute conocer las diferencias entreneutroacutefilos eosinoacutefilos
linfocitos y monocitosUna extensioacuten de sangre bien tentildeida debe caracterizarse
por unabuena diferenciacioacuten de las estructuras subcelulares en los leucocitosuna
coloracioacuten rosada de los hematiacutees y la ausencia de precipitados
Los defectos maacutes frecuentes observados en la tincioacuten del frotis sanguiacuteneoson
Coloracioacuten excesivamente azul debido a
1048729 Frotis excesivamente grueso
1048729 Lavado insuficiente
1048729 Tincioacuten muy prolongada
1048729 Empleo de colorante excesivamente alcalino
Coloracioacuten con una tonalidad rosada
1048729 El colorante el tampoacuten o el agua de lavado tienen un pH demasiadoaacutecido
Presencia de precipitados
1048729 Obedecen a una accioacuten excesiva del colorante Esto se puede evitarcon la
filtracioacuten
SECCIOacuteN 6
HEMOGRAMA-HEMOGLOBINA-HEMATOCRITO
El hemograma de Shilling constituye uno de los exaacutemenes de laboratorio
maacutesusados en el campo de la hematologiacutea Comprende las siguientes pruebas
61 RECUENTO LEUCOCITARIO
Principio
La sangre anticoagulada se deposita en un liacutequido que permite evidenciar
losleucocitos mantenieacutendolos visibles mientras que los eritrocitos
sonhemolizados El recuento del nuacutemero de leucocitos o gloacutebulos blancos se
expresapor mm3 (miliacutemetro cuacutebico)
611 Equipos
- Microscopio
- Hemocitoacutemetro (Caacutemara de Neubauer)
Consta de los siguientes elementos
diams Una laacutemina portaobjeto gruesa en el centro se hallan dos
superficiescuadriculadas iguales separadas del resto de la laacutemina por surcos y
dosbarras transversales algo maacutes elevadas
diams Una laminilla cubreobjetos oacutepticamente plana que al colocarse sobrelas barras
elevadas de la laacutemina forma una caacutemara entre el cubreobjetosy la superficie
cuadriculadaLa altura entre el cubreobjetos y la laacutemina portaobjetos es de 01
mmCada cuadriacutecula mide 3 mm de lado y se divide en 9 cuadrados grandesCada
uno de los cuales mide 1 mm2 de superficie que se subdivide a suvez en 16
cuadrados medianos El cuadrado grande central se divide en25 cuadrados
pequentildeos y cada uno de ellos en 16 cuadraditos Cadacuadrado pequentildeo mide
02 mm de lado (004 mm2 de superficie) y cadacuadradito mide 005 mm de lado
(00025 mm2 de superficie)
612 Materiales y reactivos requeridos
6121 Pipeta de gloacutebulos blancos (De Thoma) o pipeta automaacutetica (de 0 a 100 mL)Presenta cerca del extremo superior una marca de 11 inmediatamentecontinuacutea una dilatacioacuten (bulbo) que contiene una perla que funciona comomezcladora luego sigue el extremo maacutes largo de la pipeta (tallo) que estaacutedividida en 10 partes con 2 marcas 1 (parte final del bulbo) y 05 (a la mitaddel tallo) Se le acopla a su extremo superior 1 tubo de goma y una bombillapara aspirar
6122 Diluyente de gloacutebulos blancos Solucioacuten de Turk al 1
6123 Contador manual (Soacutelo si fuera necesario)
6124 Papel filtro
613 Procedimiento
6131 Una vez obtenida la sangre con anticoagulante o sangre capilar deldedo se procede a aspirar la sangre con la pipeta de gloacutebulos blancoshasta la marca de 05 y a limpiar la punta con papel absorbente
6132 Introducir la pipeta en el tubo que contenga solucioacuten de Turk y absorberhasta la marca de 11 (no debe haber burbujas)
6133 Tapar ambos extremos y proceder a mezclar manualmente o en unrotador automaacutetico por 2 oacute 3 minutos
6134 Monte la laminilla de vidrio en la caacutemara para recuento que debe estarlimpia y seca
6135 Agitar la pipeta y descartar las cuatro primeras gotas para luego colocaruna gota pequentildea de esta solucioacuten en la caacutemara
6136 Deje reposar por espacio de 3 minutos para que las ceacutelulas se sedimenten
6137 Enfocar con objetivo de 10x y contar en 4 cuadrados grandes angularesCuando se usa la pipeta automaacutetica se toma 20 mL (002 mL) desangre total con anticoagulante o sangre capilar con anticoagulante yse diluye en un tubo que contenga 380 mL de solucioacuten de Turk (aquiacutetenemos una dilucioacuten 120)
LECTURA
Fig 13
La lectura se realiza en los campos 1 3 7 y 9 como estaacute indicado en la figuraAdemaacutes de los leucocitos contados dentro de cada uno de los cuadrantes sedeben contar todos los leucocitos que se encuentren adheridos en la liacuteneahorizontal superior y vertical exterior o de lo contrario todos los leucocitosadheridos a la liacutenea horizontal inferior y vertical interior
614 Resultados
Nordm de leucocitos x mm3 = leucocitos contados en 4 camposdividealtura x dilucioacuten x aacuterea
Reemplazando = leucocitos contados en 4 camposdivide110 x 120 x 4=
Leucocitos contados en 4 camposdivide4200=
X1 divide4200= Nordm leucocitos contados x 50
615 Valores de referencia
5000 - 10 000 leucocitos mm3
616 Correccioacuten de valores para restar eritrocitos nucleados
Los normoblastos no se destruyen (lisis) en el liacutequido de dilucioacuten por lo tantopueden observarse al realizar el recuento leucocitario y confundirse con losleucocitos de tal manera que se debe emplear la siguiente foacutermula
Caacutelculo
La concentracioacuten del nuacutemero de normoblastos (por litro) esNuacutemero de normoblatos contados x concentracioacuten o nuacutemero de leucocitos100 + Nordm de normoblastos contados
Ejemplo
Si se cuentan 50 normoblastos y la concentracioacuten del nuacutemero de leucocitos es16 x 109l la concentracioacuten del nuacutemero de normoblastos seraacute
50 x16 = 53 x 109l
100 + 50
y la concentracioacuten de leucocitos corregida seraacute 16 - 53 = 107 x 109lEn unidades tradicionales las concentraciones de normoblastos y leucocitosse expresan por miliacutemetro cuacutebico En tales unidades el caacutelculo correspondienteal ejemplo que se ha dado seriacutea
50 x 16 000 = 5300 mm3
100 + 50
Recuento corregido de gloacutebulos blancos o leucocitos = 16 000 - 5300 = 10 700 mm3
Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2
62 RECUENTO DE GLOacuteBULOS ROJOS
Principio
La sangre se diluye en un liacutequido que nos permite observar claramente loshematiacutees luego esta dilucioacuten se coloca en una caacutemara de Neubauer con laayuda de una pipeta automaacutetica o pipeta Pasteur y se cuentan en el microscopioa un objetivo de 40x para calcular el nuacutemero de gloacutebulos rojos por mm3
621 Equipos
- Microscopio
- Hemocitoacutemetro (caacutemara de Neubauer)
622 Materiales y reactivos requeridos
6221 Pipeta de gloacutebulos rojos (De Thoma) o pipeta automaacutetica (de 0-100 mL)
Presenta cerca del extremo superior una marca de 101 inmediatamentecontinuacutea una dilatacioacuten (bulbo) que contiene una perla roja mezcladoraluego sigue el tallo (extremo maacutes largo) el cual estaacute dividido en 10 partescon 2 marcas 1 acabando el bulbo y 05 a la mitad del tallo Se requiereigual que el recuento de leucocitos una boquilla para aspirar
6222 Diluyente de gloacutebulos rojos Cloruro de Sodio al 09 (ver anexo)
Diluyente de Hayem (ver anexo)
6223 Contador manual (soacutelo si fuera necesario)
6224 Papel filtro
623 Procedimiento
6231 Mezclar la sangre obtenida con el anticoagulante o tomar sangre capilar
6232 Llenar la pipeta de gloacutebulos rojos con sangre hasta la marca de 05para realizar una dilucioacuten de 1200 y si se carga hasta 1 la dilucioacutenseraacute 1100 Limpiar la punta con gasa o papel absorbente
6233 Introducir la pipeta en el tubo o frasquito conteniendo diluyente (Hayem)y llenar de liacutequido de dilucioacuten hasta la marca de 101
6234 Se coloca en un rotador automaacutetico o se hace rotar manualmente de2 a 3 minutos
6235 Agitar bien la pipeta y descartar 3 a 4 gotas del tallo luego colocar unagota pequentildea cerca de un extremo de la caacutemara para que por capilaridadse llene exactamente
6236 Hacer el recuento con objetivo de 40xSe puede realizar con la pipeta automaacutetica se toma 20 mL (002mL)de sangre total con anticoagulante o sangre capilar y se deposita enun tubo de 12 x 75 que contenga 4 mL de solucioacuten de Hayem (aquiacute setiene una dilucioacuten de 1200) Se deja reposar aproximadamente 5minutos y se procede a cargar la caacutemara con la misma pipeta usandoun nuevo tip El inconveniente aquiacute es el gasto de reactivo (4 mL) perolas medidas son mas exactas
6237 Dejar en reposo por 3 minutos
6238 Enfocar la cuadriacutecula a 10x luego con el objetivo de 40x contar sobreel cuadrado grande central de la caacutemara soacutelo en 5 cuadrados pequentildeosuno central y cuatro angulares (80 cuadraditos en total)
6239 En el recuento se incluyen las ceacutelulas que cubren o tocan por dentroo por fuera las liacuteneas limitantes superior e izquierda en el cuadradopequentildeo de recuento y no se consideran los correspondientes a losliacutemites inferior y derechoSe hace el recuento en los puntos ABCD y Ey se sigue los mismos paraacutemetros del recuento de leucocitos
LECTURA
Fig 14
624 Resultados
Nordm de hematiacutees x mm3 = hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeosaltura x dilucioacuten X aacuterea
Reemplazando = hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeos110 x 1200 x 15
= hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeos divide 110 000
= hematiacutees contados x 10 000
625 Valores de referencia
(Unidades tradicionales millones de ceacutelulasmm3)
Hombres 4 500 000 - 5 500 000
Mujeres 4 000 000 - 5 000 000
Nintildeos (4 antildeos) 4 200 000 - 5 200 000
Lactantes (1 - 6 meses) 3 800 000 - 5 200 000
Recieacuten nacidos 5 000 000 - 6 000 000
Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2
63 DETERMINACIOacuteN DEL VOLUMEN GLOBULAR (Hematocrito)
Mide la fraccioacuten que comprende a los gloacutebulos rojos (masa globular) respectoal
volumen total de la muestra de sangre venosa o capilar Puede expresarseen
porcentaje o como valor decimal
Hto= altura de la columna de gloacutebulos rojosdivide altura de la columna de sangre
total(gloacutebulos rojos maacutes plasma)
631 Meacutetodo de Wintrobe
Materiales requeridos
- Tubo de Wintrobe graduado de 0 - 100 mm
- Pipetas Pasteur o pipetas de transferencia
- Tapoacuten de goma
Procedimiento
diams Llenar la sangre extraiacuteda con anticoagulante con una pipeta pasteur
comenzandodesde el fondo hasta la marca superior de 100 mm teniendocuidado
de no provocar espuma
diams Tapar el tubo con un tapoacuten de goma para evitar la evaporacioacuten
diams Centrifugar a 3000 rpm por 30 minutos
Resultados (lectura)
Del tubo graduado se mide directamente el nivel de la columna de gloacutebulosrojos
Valores de referencia
Hombres 40 - 54Mujeres 38 - 48
Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2
632 Meacutetodo de microhematocrito
Materiales requeridos
- Capilares rojos y azules (75 mm x 15 mm)
- Plastilina
Procedimiento
diams Tomar la muestra en capilares rojos heparinizados directamente del pulpejodel
dedo o utilizar capilares azules sin heparina para sangre venosacon
anticoagulante de Wintrobe o EDTA Debe llenarse aproximadamente70 - 80
del capilar
diams Ocluir (tapar) un extremo del capilar con plastilina
diams Colocar el capilar sobre la plataforma del cabezal de una centriacutefuga demicrohematocrito con el extremo ocluido adherido al reborde externo de laplataforma
diams Centrifugar por 5 minutos entre 10 000 - 12 000 rpm
Resultados (lectura)
La lectura se realiza con una escala estandarizada que expenden en el comercio
Uso de la escala
diams Sostenga el tubo frente a la escala de manera que el fondo de la columnade eritrocitos (no el extremo inferior del tubo) quede exactamente al mismonivel de la liacutenea horizontal correspondiente al cero
diams Desplace el tubo a traveacutes de la escala hasta que la liacutenea marcada con elnuacutemero 10 quede al nivel del tope de la columna de plasma Vigile que elfondo de la
columna de eritrocitos continuacutee sobre la liacutenea cero El tubodebe encontrarse completamente en posicioacuten vertical
diams La liacutenea que pase al nivel del tope de la columna de eritrocitos indicaraacute lafraccioacuten de volumen de eacutestos
Valores de referencia
Hombres 40 - 50
Mujeres 38 - 44
Nintildeos (5 antildeos) 38 - 44
Lactantes (3 meses) 37 - 42
Recieacuten nacidos 50 - 58
La disposicioacuten celular esParte superior una columna de plasmaEn la interfase estaacuten los leucocitos yplaquetasParte inferior estaacute la columna deeritrocitos (Fig 15)
64 DOSAJE DE HEMOGLOBINA
Principio
La sangre se diluye en liacutequido de Drabkin el cual hemoliza los hematiacutees yconvierte la hemoglobina en cianometahemoglobina (cianuro de hemiglobina)La solucioacuten que se produce se lee por medio de un espectrofotoacutemetro ofotocoloriacutemetro Su grado de absorbancia es proporcional a la cantidad dehemoglobina que contenga la sangre
641 Materiales y reactivos
6411 Un coloriacutemetro fotoeleacutectrico o un espectrofotoacutemetro
6412 Pipetas
diams Una pipeta para sangre (pipeta de Sahli) graduada hasta 002 mL contubo de goma y boquilla
diams Una pipeta de vidrio graduada de 5 mL
6413 Tubos de ensayo
6414 Reactivo de Drabkin para dilucioacuten
Este reactivo se puede adquirir en tabletas o polvos para disolver en 1litro de agua destilada Si se dispone de una balanza analiacutetica la preparacioacutense puede hacer en el laboratorio Esta solucioacuten se puedeconservar durante un mes en un frasco de vidrio oscuro Deseacutechese sise enturbia
3331 Pueden hacerse repetidos exaacutemenes con la misma muestra
3332 Parte de la muestra (plasma o suero) puede congelarse para referenciafutura
334 Desventajas de una extraccioacuten de sangre venosa
3341 La puncioacuten venosa por su largo procedimiento requiere mayor preparacioacuten que el meacutetodo capilar
3342 El meacutetodo es teacutecnicamente difiacutecil en nintildeos individuos obesos y pacientes en shock
3343 La hemoacutelisis debe ser evitada pues se puede obtener una disminucioacuten en el recuento de eritrocitos
3344 Debe evitarse prolongada estasis venosa producida por el torniquete pues produce hemoacutelisis y otros cambios que ponen la sangre en un estado inadecuado para el anaacutelisis de gases recuentos celulares determinacioacuten de pH sanguiacuteneo y algunas pruebas de coagulacioacuten
3345 La sangre anticoagulada si no es de obtencioacuten reciente no debe ser utilizada en extensiones de sangre pues algunos anticoagulantes producen cambios en las plaquetas que pueden causar aglutinaciones agregacioacuten plaquetaria y dificultan la identificacioacuten de leucocitos
3346 Puesto que algunos de los componentes de la sangre no son estables los recuentos de leucocitos y plaquetas e iacutendice de sedimentacioacuten deben realizarse antes de que pasen dos horas desde que se obtuvo la muestra
34 OBTENCIOacuteN DE SANGRE DE LA VENA YUGULAR EXTERNA
341 Materiales requeridos
3411 Algodoacuten
3412 Alcohol al 70
3413 Jeringas de 5 mL
3414 Viales con anticoagulante EDTA
342 Obtencioacuten de la muestra
3421 El paciente es cubierto por una saacutebana de manera que los brazospermanezcan inmovilizados a lo largo del cuerpo
3422 Al paciente se le coloca de cuacutebito dorsal sobre la mesa de examen ouna
camilla de manera que la cabeza cuelgue sobre el final de lamesa y el cuerpo sea
sujetado por un asistente
3423 Cuando el paciente grita la vena yugular externa se marca claramente
3424 Limpiar la zona en un aacuterea de 2 pulgadas con alcohol al 70 o
alcoholyodado
3425 Se repiten los pasos de 3225 a 3227 de la extraccioacuten de sangrevenosa
con jeringa
3426 Retirar la aguja de la vena y presionar suavemente con un algodoacutenseco
aproximadamente de 3 a 5 minutos Pedir al paciente que permanezcaechado diez
minutos
3427 Se repiten los pasos de 3229
3428 Se repiten los pasos de 32210
343 Ventajas
Constituye un buen meacutetodo para la obtencioacuten de sangre en pacientes conshock
con venas colapsadas
344 Desventajas
Por lo delicado en su procedimiento no se recomienda como rutina soacutelo encasos
en que no se pueda obtener la muestra por meacutetodos convencionales
35 OBTENCIOacuteN DE SANGRE CAPILAR
Cuando la cantidad de sangre que se precisa es muy pequentildea o cuando
pordiferentes motivos no pueda practicarse una puncioacuten venosa debe recurrirse
a la puncioacuten capilar
351 Materiales requeridos
3512 Algodoacuten
3513 Alcohol al 70
3514 Lancetas desechables (Fig 10)
3515 Papel filtro Nordm 2
352 Procedimiento (Fig 11)
3521 La sangre capilar se obtiene de la cara lateral del dedo medio o anularen los adultos y del dedo gordo del pie o taloacuten en los nintildeos
3522 Desinfectar la zona con alcohol al 70 secar con algodoacuten esteacuteril
3523 Punzar la piel con una lanceta esteacuteril desechable (2 mm de profundidad)
3524 Usar gasa esteacuteril para desechar la primera gota y recoger las siguientesen tubos capilares Evitar comprimir la extremidad para obtenersangre porque se altera la composicioacuten sanguiacutenea
353 Ventajas
3531 Puede obtenerse con facilidad
3532 Es preferible cuando han de realizarse extensiones de sangre perifeacuterica
354 Desventajas
3541 Soacutelo se pueden obtener pequentildeas cantidades de sangre y los exaacutemenesde repeticioacuten requieren nuevas muestras
3542 La sangre en microtubos (capilares) frecuentemente se hemolizainterfiendo con la mayoriacutea de pruebas de laboratorio
3543 Los resultados obtenidos en pruebas con sangre capilar no puedenser comparados con los resultados de las pruebas con sangre venosa
3544 El dedo no soacutelo es delicado sino difiacutecil de desinfectar adecuadamenteen el tiempo disponible
3545 En pacientes con resistencia disminuida a la infeccioacuten (aquellos conleucemia agranulocitosis diabetes uremia y enfermedades con deficienciasinmunoloacutegicas) una muestra tomada del dedo es mucho maacutesprobable que conduzca a una infeccioacuten que otra tomada del brazo
3546 El recuento de eritrocitos y leucocitos asiacute como el recuento deplaquetas y reticulocitos no debe realizarse en sangre capilar debidoa la difiacutecil estandarizacioacuten del flujo sanguiacuteneo capilar
EXTRACCIOacuteN DE SANGRE CAPILAR
Fig 10
Fig 11
SECCIOacuteN 4
ANTICOAGULANTES
Una vez extraiacuteda la sangre eacutesta puede conservarse coagulada o
mantenidaincoagulable mediante la adicioacuten de un anticoagulante
41 CARACTERIacuteSTICAS BAacuteSICAS DE LOS ANTICOAGULANTES MAacuteS
USADOSEN HEMATOLOGIacuteA
bull No alterar el tamantildeo de los hematiacutees
bull No producir hemoacutelisis
bull Evitar al maacuteximo la agregacioacuten plaquetaria
bull No alterar la morfologiacutea de los leucocitos
La sangre tratada con anticoagulante debe procesarse lo antes posible
inclusomantenida bajo refrigeracioacuten (4 ordmC) si no pasan de las 2 horas El
tiempomaacuteximo entre la extraccioacuten de la sangre y su procesamiento depende
delcoagulante de eleccioacuten y no debe ser maacutes de 4 horas a excepcioacuten
delanticoagulante EDTA (etilendiaminotetraceacutetico) que puede ser hasta 24
horas(en refrigeracioacuten a 4 ordmC)
Los anticoagulantes pueden emplearse en forma soacutelida o liacutequida Los
primerosestaacuten indicados para la determinacioacuten de los paraacutemetros
hematoloacutegicosya que no producen como los anticoagulantes liacutequidos dilucioacuten de
la sangre
42 ANTICOAGULANTES SOacuteLIDOS
421 EDTA
Es la sal disoacutedica o tripotaacutesica del aacutecido etilendiaminotetraceacutetico La saldisoacutedica
(Na2EDTA) es menos soluble que la sal tripotaacutesica (K3EDTA) Estoscompuestos
realizan su accioacuten a traveacutes de un efecto quelante sobre el calcioal fijarlo impiden
su activacioacuten y por ende la coagulacioacuten sanguiacutenea
4211 Ventajas
bull Respeta la morfologiacutea eritrocitaria (especialmente la sal tripotaacutesica) yleucocitaria de manera que permite una demora de dos horas en la realizacioacutendel frotis sanguiacuteneo despueacutes de la extraccioacuten sanguiacutenea
bull Asegura la conservacioacuten de los elementos formes sanguiacuteneos durante 24horas si la sangre se mantiene a 4 ordmC
bull Al inhibir la aglutinacioacuten de las plaquetas facilita su recuento o su expresioacutensemicuantitativa a partir del frotis
bull La concentracioacuten recomendada de EDTA es de 15 mgmL de sangre Unamayor cantidad de anticoagulante puede producir retraccioacuten celular condisminucioacuten del hematocrito y un aumento de la concentracioacuten media de lahemoglobina Un exceso de sangre con relacioacuten al anticoagulante produceformacioacuten de microagregados que pueden alterar los resultados El empleode tubos al vaciacuteo con una gota (50mL) de EDTA tripotaacutesica comercialpara 5 mL de sangre es de intereacutes praacutectico dado que es cien veces maacutessoluble facilitando la mezcla de sangre con anticoagulante
4212 Desventajas
Usado en exceso afecta a los eritrocitos y a los leucocitos a los cuales les produce encogimiento y cambios en su forma por ello debe cuidarse de agregar la cantidad correcta de sangre al anticoagulante
422 Anticoagulante de Wintrobe
Es una mezcla de oxalato de amonio y potasio Actuacutea por precipitacioacuten del calcio es faacutecil de preparar Se emplea en forma de polvo en proporcioacuten de 2 de oxalato de amonio por 1 de oxalato de potasio La cantidad recomendada es de 2 mg x mL de sangre Este anticoagulante no afecta el volumen globular medio y puede usarse para determinaciones de hemoglobina hematocrito y recuento globular pero para los extendidos queda limitada a los primeros minutos tampoco es uacutetil para el recuento plaquetario porque produce formacioacuten de agregados plaquetarios
423 Heparina
El nombre de heparina proviene del griego hepar que significa hiacutegado ya que fue aislado por primera vez de las ceacutelulas de este tejido Es un mucopolisacaacuterido aacutecido Presenta el
inconveniente de que si no se agita raacutepidamente con la sangre despueacutes de extraiacuteda
pueden formarse microcoaacutegulos aunque no altera el volumeneritrocitario ni la morfologiacutea de los leucocitos No es recomendablepara el frotis sanguiacuteneo porque produce un fondo azul en la laacutemina
La heparina de sodio o litio puede usarse en forma soacutelida o liacutequida en
proporcioacutende 01 - 02 mg de heparina por 1 mL de sangre
43 ANTICOAGULANTES LIacuteQUIDOS
431 Citrato trisoacutedico
Es de eleccioacuten para las pruebas de hemostasia y la velocidad de sedimentacioacuten
Actuacutea a traveacutes de la precipitacioacuten del calcio La concentracioacuten depende de
la prueba por realizar
bull Para pruebas de hemostasia se emplea en proporcioacuten de 1 9 (05 mL
deanticoagulante para 45 mL de sangre total)
bull Para la determinacioacuten de la VSG (Velocidad de Sedimentacioacuten Globular) es14
(05 mL de anticoagulante para 2 mL de sangre)
432 Oxalato soacutedico
Recomendado tambieacuten para las pruebas de hemostasia Se emplea en
proporcioacutende un volumen de anticoagulante para 4 vol de sangre
SECCIOacuteN 5
REALIZACIOacuteN Y TINCIOacuteN DEL FROTIS SANGUIacuteNEO
La praacutectica del frotis sanguiacuteneo tambieacuten llamado extendido es de gran importanciaen hematologiacutea ya que el diagnoacutestico de muchas enfermedadeshematoloacutegicas puede realizarse con soacutelo observar las caracteriacutesticasmorfoloacutegicas de las ceacutelulas sanguiacuteneas de manera que eacuteste no debe serexcesivamente grueso ni excesivamente fino Todas las laacuteminas por usarsobre todo nuevas deben ser limpiadas con algodoacuten y alcohol al 70 paraeliminar la grasa que viene adherida
51 MEacuteTODO DE LOS DOS PORTAOBJETOS
511 Materiales
- Alcohol al 70
- Algodoacuten
- Lanceta descartable
- Portaobjetos de vidrios limpios y desgrasados (25 x 75 mm)
512 Fundamento
Consiste en la extensioacuten de una gota de sangre sobre un portaobjeto (25 x 75)empleando el canto biselado de otro portaobjeto de igual dimensioacuten (Fig 12)
513 Procedimiento
5131 Una vez extraiacuteda la sangre con cualquiera de las metodologiacuteas secoloca una pequentildea gota de sangre (5mL) (aprox 3 mm de diaacutemetro)sobre un portaobjeto a 2 cm aproximadamente de uno de los extremos
5132 Colocar el canto de otro portaobjeto esmerilado sobre la superficiedel primer portaobjeto (en la que se encuentra la gota de sangre)formando un aacutengulo de 45ordm
5134 Deslizar suavemente y a velocidad moderada el portaobjeto sobre elotro en sentido longitudinal hasta que la gota de sangre quede bienextendida sobre la
superficie del primer portaobjeto El grosor delfrotis sanguiacuteneo puede variar seguacuten sea el aacutengulo que formen entresiacute ambos portaobjetos Asiacute si es superior a 45ordm la extensioacuten obtenidaseraacute gruesa y corta si es inferior a 45ordm seraacute larga y fina El secado delfrotis es a temperatura ambiente y en posicioacuten horizontal
Fig 12
1048729 Zona excesivamente gruesa Se halla en la regioacuten inmediata al punto departida de la extensioacuten (cabeza) En ella se aprecia siempre un aumento delinfocitos
1048729 Zona excesivamente fina Corresponde al final de la extensioacuten y termina enun aacuterea donde las ceacutelulas adoptan una posicioacuten acartonada (barbas) Enesta regioacuten existe un exceso de granulocitos y monocitos
1048729 Zona ideal Corresponde a la regioacuten intermedia del frotis y en ella existe unreparto equilibrado de ceacutelulas
52 COLORACIONES USADAS
Una vez seco el frotis se procede a la tincioacuten hematoloacutegica con el colorante deRomanowsky constituido por la mezcla de eosina y azul de metileno Dentrode eacutestas tenemos
521 Colorante de Giemsa
522 Colorante de May-Grunwald
523 Colorante de Wright
524 Colorante de Leishman
Preparacioacuten de colorantes (Anexo A)
1048729 Para el estudio de las ceacutelulas sanguiacuteneas utilizar el colorante 523 y 524
1048729 Para el estudio de hemoparaacutesitos utilizar el colorante 521
1048729 Utilizar el colorante 522 para casos especiales en que se desee observar
con mayor claridad y especificidad los graacutenulos de los neutrofilos
53 TINCIOacuteN CON COLORANTE DE WRIGHT
531 Fundamento
El colorante de Wright va a permitir suministrar un medio para estudiar lasangre y determinar las variaciones y anormalidades de estructura forma ytamantildeo de los eritrocitos su contenido de hemoglobina y sus propiedades decoloracioacuten La informacioacuten obtenida de un frotis de sangre perifeacuterica dependeen gran parte de la calidad del extendido y la coloracioacuten
532 Materiales
5321 Colorante de Wright (Anexo A)
5322 Frasco gotero
5323 Solucioacuten amortiguada tamponada (Anexo A)
533 Procedimiento
5331 Una vez obtenido el frotis sanguiacuteneo se le dejaraacute secar entre 15 y 20minutos
5332 Luego se coloca la preparacioacuten en un soporte y se cubre con el colorantede Wright dejaacutendolo por espacio de 5 minutos
5333 Posteriormente se antildeade solucioacuten amortiguada tamponada en partesiguales hasta obtener un brillo metaacutelico dejando 6 minutos adicionales
5334 Finalmente se lava con agua corriente y se deja secar
5335 Se coloca en el microscopio y con pequentildeo aumento se revisa lacalidad de la coloracioacuten la cantidad aproximada de gloacutebulos blancosy se escoge el sitio para iniciar el recuento Se coloca una gota deaceite de inmersioacuten y se enfoca a un aumento de 100xLa forma de los gloacutebulos rojos se examinaraacute detenidamente observandoademaacutes del color (cantidad de hemoglobina) presencia deplaquetas su agrupacioacuten y distribucioacuten
5336 Posteriormente se hace el recuento diferencial de gloacutebulos blancosen 100
ceacutelulas para lo cual se deberaacute conocer las diferencias entreneutroacutefilos eosinoacutefilos
linfocitos y monocitosUna extensioacuten de sangre bien tentildeida debe caracterizarse
por unabuena diferenciacioacuten de las estructuras subcelulares en los leucocitosuna
coloracioacuten rosada de los hematiacutees y la ausencia de precipitados
Los defectos maacutes frecuentes observados en la tincioacuten del frotis sanguiacuteneoson
Coloracioacuten excesivamente azul debido a
1048729 Frotis excesivamente grueso
1048729 Lavado insuficiente
1048729 Tincioacuten muy prolongada
1048729 Empleo de colorante excesivamente alcalino
Coloracioacuten con una tonalidad rosada
1048729 El colorante el tampoacuten o el agua de lavado tienen un pH demasiadoaacutecido
Presencia de precipitados
1048729 Obedecen a una accioacuten excesiva del colorante Esto se puede evitarcon la
filtracioacuten
SECCIOacuteN 6
HEMOGRAMA-HEMOGLOBINA-HEMATOCRITO
El hemograma de Shilling constituye uno de los exaacutemenes de laboratorio
maacutesusados en el campo de la hematologiacutea Comprende las siguientes pruebas
61 RECUENTO LEUCOCITARIO
Principio
La sangre anticoagulada se deposita en un liacutequido que permite evidenciar
losleucocitos mantenieacutendolos visibles mientras que los eritrocitos
sonhemolizados El recuento del nuacutemero de leucocitos o gloacutebulos blancos se
expresapor mm3 (miliacutemetro cuacutebico)
611 Equipos
- Microscopio
- Hemocitoacutemetro (Caacutemara de Neubauer)
Consta de los siguientes elementos
diams Una laacutemina portaobjeto gruesa en el centro se hallan dos
superficiescuadriculadas iguales separadas del resto de la laacutemina por surcos y
dosbarras transversales algo maacutes elevadas
diams Una laminilla cubreobjetos oacutepticamente plana que al colocarse sobrelas barras
elevadas de la laacutemina forma una caacutemara entre el cubreobjetosy la superficie
cuadriculadaLa altura entre el cubreobjetos y la laacutemina portaobjetos es de 01
mmCada cuadriacutecula mide 3 mm de lado y se divide en 9 cuadrados grandesCada
uno de los cuales mide 1 mm2 de superficie que se subdivide a suvez en 16
cuadrados medianos El cuadrado grande central se divide en25 cuadrados
pequentildeos y cada uno de ellos en 16 cuadraditos Cadacuadrado pequentildeo mide
02 mm de lado (004 mm2 de superficie) y cadacuadradito mide 005 mm de lado
(00025 mm2 de superficie)
612 Materiales y reactivos requeridos
6121 Pipeta de gloacutebulos blancos (De Thoma) o pipeta automaacutetica (de 0 a 100 mL)Presenta cerca del extremo superior una marca de 11 inmediatamentecontinuacutea una dilatacioacuten (bulbo) que contiene una perla que funciona comomezcladora luego sigue el extremo maacutes largo de la pipeta (tallo) que estaacutedividida en 10 partes con 2 marcas 1 (parte final del bulbo) y 05 (a la mitaddel tallo) Se le acopla a su extremo superior 1 tubo de goma y una bombillapara aspirar
6122 Diluyente de gloacutebulos blancos Solucioacuten de Turk al 1
6123 Contador manual (Soacutelo si fuera necesario)
6124 Papel filtro
613 Procedimiento
6131 Una vez obtenida la sangre con anticoagulante o sangre capilar deldedo se procede a aspirar la sangre con la pipeta de gloacutebulos blancoshasta la marca de 05 y a limpiar la punta con papel absorbente
6132 Introducir la pipeta en el tubo que contenga solucioacuten de Turk y absorberhasta la marca de 11 (no debe haber burbujas)
6133 Tapar ambos extremos y proceder a mezclar manualmente o en unrotador automaacutetico por 2 oacute 3 minutos
6134 Monte la laminilla de vidrio en la caacutemara para recuento que debe estarlimpia y seca
6135 Agitar la pipeta y descartar las cuatro primeras gotas para luego colocaruna gota pequentildea de esta solucioacuten en la caacutemara
6136 Deje reposar por espacio de 3 minutos para que las ceacutelulas se sedimenten
6137 Enfocar con objetivo de 10x y contar en 4 cuadrados grandes angularesCuando se usa la pipeta automaacutetica se toma 20 mL (002 mL) desangre total con anticoagulante o sangre capilar con anticoagulante yse diluye en un tubo que contenga 380 mL de solucioacuten de Turk (aquiacutetenemos una dilucioacuten 120)
LECTURA
Fig 13
La lectura se realiza en los campos 1 3 7 y 9 como estaacute indicado en la figuraAdemaacutes de los leucocitos contados dentro de cada uno de los cuadrantes sedeben contar todos los leucocitos que se encuentren adheridos en la liacuteneahorizontal superior y vertical exterior o de lo contrario todos los leucocitosadheridos a la liacutenea horizontal inferior y vertical interior
614 Resultados
Nordm de leucocitos x mm3 = leucocitos contados en 4 camposdividealtura x dilucioacuten x aacuterea
Reemplazando = leucocitos contados en 4 camposdivide110 x 120 x 4=
Leucocitos contados en 4 camposdivide4200=
X1 divide4200= Nordm leucocitos contados x 50
615 Valores de referencia
5000 - 10 000 leucocitos mm3
616 Correccioacuten de valores para restar eritrocitos nucleados
Los normoblastos no se destruyen (lisis) en el liacutequido de dilucioacuten por lo tantopueden observarse al realizar el recuento leucocitario y confundirse con losleucocitos de tal manera que se debe emplear la siguiente foacutermula
Caacutelculo
La concentracioacuten del nuacutemero de normoblastos (por litro) esNuacutemero de normoblatos contados x concentracioacuten o nuacutemero de leucocitos100 + Nordm de normoblastos contados
Ejemplo
Si se cuentan 50 normoblastos y la concentracioacuten del nuacutemero de leucocitos es16 x 109l la concentracioacuten del nuacutemero de normoblastos seraacute
50 x16 = 53 x 109l
100 + 50
y la concentracioacuten de leucocitos corregida seraacute 16 - 53 = 107 x 109lEn unidades tradicionales las concentraciones de normoblastos y leucocitosse expresan por miliacutemetro cuacutebico En tales unidades el caacutelculo correspondienteal ejemplo que se ha dado seriacutea
50 x 16 000 = 5300 mm3
100 + 50
Recuento corregido de gloacutebulos blancos o leucocitos = 16 000 - 5300 = 10 700 mm3
Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2
62 RECUENTO DE GLOacuteBULOS ROJOS
Principio
La sangre se diluye en un liacutequido que nos permite observar claramente loshematiacutees luego esta dilucioacuten se coloca en una caacutemara de Neubauer con laayuda de una pipeta automaacutetica o pipeta Pasteur y se cuentan en el microscopioa un objetivo de 40x para calcular el nuacutemero de gloacutebulos rojos por mm3
621 Equipos
- Microscopio
- Hemocitoacutemetro (caacutemara de Neubauer)
622 Materiales y reactivos requeridos
6221 Pipeta de gloacutebulos rojos (De Thoma) o pipeta automaacutetica (de 0-100 mL)
Presenta cerca del extremo superior una marca de 101 inmediatamentecontinuacutea una dilatacioacuten (bulbo) que contiene una perla roja mezcladoraluego sigue el tallo (extremo maacutes largo) el cual estaacute dividido en 10 partescon 2 marcas 1 acabando el bulbo y 05 a la mitad del tallo Se requiereigual que el recuento de leucocitos una boquilla para aspirar
6222 Diluyente de gloacutebulos rojos Cloruro de Sodio al 09 (ver anexo)
Diluyente de Hayem (ver anexo)
6223 Contador manual (soacutelo si fuera necesario)
6224 Papel filtro
623 Procedimiento
6231 Mezclar la sangre obtenida con el anticoagulante o tomar sangre capilar
6232 Llenar la pipeta de gloacutebulos rojos con sangre hasta la marca de 05para realizar una dilucioacuten de 1200 y si se carga hasta 1 la dilucioacutenseraacute 1100 Limpiar la punta con gasa o papel absorbente
6233 Introducir la pipeta en el tubo o frasquito conteniendo diluyente (Hayem)y llenar de liacutequido de dilucioacuten hasta la marca de 101
6234 Se coloca en un rotador automaacutetico o se hace rotar manualmente de2 a 3 minutos
6235 Agitar bien la pipeta y descartar 3 a 4 gotas del tallo luego colocar unagota pequentildea cerca de un extremo de la caacutemara para que por capilaridadse llene exactamente
6236 Hacer el recuento con objetivo de 40xSe puede realizar con la pipeta automaacutetica se toma 20 mL (002mL)de sangre total con anticoagulante o sangre capilar y se deposita enun tubo de 12 x 75 que contenga 4 mL de solucioacuten de Hayem (aquiacute setiene una dilucioacuten de 1200) Se deja reposar aproximadamente 5minutos y se procede a cargar la caacutemara con la misma pipeta usandoun nuevo tip El inconveniente aquiacute es el gasto de reactivo (4 mL) perolas medidas son mas exactas
6237 Dejar en reposo por 3 minutos
6238 Enfocar la cuadriacutecula a 10x luego con el objetivo de 40x contar sobreel cuadrado grande central de la caacutemara soacutelo en 5 cuadrados pequentildeosuno central y cuatro angulares (80 cuadraditos en total)
6239 En el recuento se incluyen las ceacutelulas que cubren o tocan por dentroo por fuera las liacuteneas limitantes superior e izquierda en el cuadradopequentildeo de recuento y no se consideran los correspondientes a losliacutemites inferior y derechoSe hace el recuento en los puntos ABCD y Ey se sigue los mismos paraacutemetros del recuento de leucocitos
LECTURA
Fig 14
624 Resultados
Nordm de hematiacutees x mm3 = hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeosaltura x dilucioacuten X aacuterea
Reemplazando = hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeos110 x 1200 x 15
= hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeos divide 110 000
= hematiacutees contados x 10 000
625 Valores de referencia
(Unidades tradicionales millones de ceacutelulasmm3)
Hombres 4 500 000 - 5 500 000
Mujeres 4 000 000 - 5 000 000
Nintildeos (4 antildeos) 4 200 000 - 5 200 000
Lactantes (1 - 6 meses) 3 800 000 - 5 200 000
Recieacuten nacidos 5 000 000 - 6 000 000
Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2
63 DETERMINACIOacuteN DEL VOLUMEN GLOBULAR (Hematocrito)
Mide la fraccioacuten que comprende a los gloacutebulos rojos (masa globular) respectoal
volumen total de la muestra de sangre venosa o capilar Puede expresarseen
porcentaje o como valor decimal
Hto= altura de la columna de gloacutebulos rojosdivide altura de la columna de sangre
total(gloacutebulos rojos maacutes plasma)
631 Meacutetodo de Wintrobe
Materiales requeridos
- Tubo de Wintrobe graduado de 0 - 100 mm
- Pipetas Pasteur o pipetas de transferencia
- Tapoacuten de goma
Procedimiento
diams Llenar la sangre extraiacuteda con anticoagulante con una pipeta pasteur
comenzandodesde el fondo hasta la marca superior de 100 mm teniendocuidado
de no provocar espuma
diams Tapar el tubo con un tapoacuten de goma para evitar la evaporacioacuten
diams Centrifugar a 3000 rpm por 30 minutos
Resultados (lectura)
Del tubo graduado se mide directamente el nivel de la columna de gloacutebulosrojos
Valores de referencia
Hombres 40 - 54Mujeres 38 - 48
Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2
632 Meacutetodo de microhematocrito
Materiales requeridos
- Capilares rojos y azules (75 mm x 15 mm)
- Plastilina
Procedimiento
diams Tomar la muestra en capilares rojos heparinizados directamente del pulpejodel
dedo o utilizar capilares azules sin heparina para sangre venosacon
anticoagulante de Wintrobe o EDTA Debe llenarse aproximadamente70 - 80
del capilar
diams Ocluir (tapar) un extremo del capilar con plastilina
diams Colocar el capilar sobre la plataforma del cabezal de una centriacutefuga demicrohematocrito con el extremo ocluido adherido al reborde externo de laplataforma
diams Centrifugar por 5 minutos entre 10 000 - 12 000 rpm
Resultados (lectura)
La lectura se realiza con una escala estandarizada que expenden en el comercio
Uso de la escala
diams Sostenga el tubo frente a la escala de manera que el fondo de la columnade eritrocitos (no el extremo inferior del tubo) quede exactamente al mismonivel de la liacutenea horizontal correspondiente al cero
diams Desplace el tubo a traveacutes de la escala hasta que la liacutenea marcada con elnuacutemero 10 quede al nivel del tope de la columna de plasma Vigile que elfondo de la
columna de eritrocitos continuacutee sobre la liacutenea cero El tubodebe encontrarse completamente en posicioacuten vertical
diams La liacutenea que pase al nivel del tope de la columna de eritrocitos indicaraacute lafraccioacuten de volumen de eacutestos
Valores de referencia
Hombres 40 - 50
Mujeres 38 - 44
Nintildeos (5 antildeos) 38 - 44
Lactantes (3 meses) 37 - 42
Recieacuten nacidos 50 - 58
La disposicioacuten celular esParte superior una columna de plasmaEn la interfase estaacuten los leucocitos yplaquetasParte inferior estaacute la columna deeritrocitos (Fig 15)
64 DOSAJE DE HEMOGLOBINA
Principio
La sangre se diluye en liacutequido de Drabkin el cual hemoliza los hematiacutees yconvierte la hemoglobina en cianometahemoglobina (cianuro de hemiglobina)La solucioacuten que se produce se lee por medio de un espectrofotoacutemetro ofotocoloriacutemetro Su grado de absorbancia es proporcional a la cantidad dehemoglobina que contenga la sangre
641 Materiales y reactivos
6411 Un coloriacutemetro fotoeleacutectrico o un espectrofotoacutemetro
6412 Pipetas
diams Una pipeta para sangre (pipeta de Sahli) graduada hasta 002 mL contubo de goma y boquilla
diams Una pipeta de vidrio graduada de 5 mL
6413 Tubos de ensayo
6414 Reactivo de Drabkin para dilucioacuten
Este reactivo se puede adquirir en tabletas o polvos para disolver en 1litro de agua destilada Si se dispone de una balanza analiacutetica la preparacioacutense puede hacer en el laboratorio Esta solucioacuten se puedeconservar durante un mes en un frasco de vidrio oscuro Deseacutechese sise enturbia
3422 Al paciente se le coloca de cuacutebito dorsal sobre la mesa de examen ouna
camilla de manera que la cabeza cuelgue sobre el final de lamesa y el cuerpo sea
sujetado por un asistente
3423 Cuando el paciente grita la vena yugular externa se marca claramente
3424 Limpiar la zona en un aacuterea de 2 pulgadas con alcohol al 70 o
alcoholyodado
3425 Se repiten los pasos de 3225 a 3227 de la extraccioacuten de sangrevenosa
con jeringa
3426 Retirar la aguja de la vena y presionar suavemente con un algodoacutenseco
aproximadamente de 3 a 5 minutos Pedir al paciente que permanezcaechado diez
minutos
3427 Se repiten los pasos de 3229
3428 Se repiten los pasos de 32210
343 Ventajas
Constituye un buen meacutetodo para la obtencioacuten de sangre en pacientes conshock
con venas colapsadas
344 Desventajas
Por lo delicado en su procedimiento no se recomienda como rutina soacutelo encasos
en que no se pueda obtener la muestra por meacutetodos convencionales
35 OBTENCIOacuteN DE SANGRE CAPILAR
Cuando la cantidad de sangre que se precisa es muy pequentildea o cuando
pordiferentes motivos no pueda practicarse una puncioacuten venosa debe recurrirse
a la puncioacuten capilar
351 Materiales requeridos
3512 Algodoacuten
3513 Alcohol al 70
3514 Lancetas desechables (Fig 10)
3515 Papel filtro Nordm 2
352 Procedimiento (Fig 11)
3521 La sangre capilar se obtiene de la cara lateral del dedo medio o anularen los adultos y del dedo gordo del pie o taloacuten en los nintildeos
3522 Desinfectar la zona con alcohol al 70 secar con algodoacuten esteacuteril
3523 Punzar la piel con una lanceta esteacuteril desechable (2 mm de profundidad)
3524 Usar gasa esteacuteril para desechar la primera gota y recoger las siguientesen tubos capilares Evitar comprimir la extremidad para obtenersangre porque se altera la composicioacuten sanguiacutenea
353 Ventajas
3531 Puede obtenerse con facilidad
3532 Es preferible cuando han de realizarse extensiones de sangre perifeacuterica
354 Desventajas
3541 Soacutelo se pueden obtener pequentildeas cantidades de sangre y los exaacutemenesde repeticioacuten requieren nuevas muestras
3542 La sangre en microtubos (capilares) frecuentemente se hemolizainterfiendo con la mayoriacutea de pruebas de laboratorio
3543 Los resultados obtenidos en pruebas con sangre capilar no puedenser comparados con los resultados de las pruebas con sangre venosa
3544 El dedo no soacutelo es delicado sino difiacutecil de desinfectar adecuadamenteen el tiempo disponible
3545 En pacientes con resistencia disminuida a la infeccioacuten (aquellos conleucemia agranulocitosis diabetes uremia y enfermedades con deficienciasinmunoloacutegicas) una muestra tomada del dedo es mucho maacutesprobable que conduzca a una infeccioacuten que otra tomada del brazo
3546 El recuento de eritrocitos y leucocitos asiacute como el recuento deplaquetas y reticulocitos no debe realizarse en sangre capilar debidoa la difiacutecil estandarizacioacuten del flujo sanguiacuteneo capilar
EXTRACCIOacuteN DE SANGRE CAPILAR
Fig 10
Fig 11
SECCIOacuteN 4
ANTICOAGULANTES
Una vez extraiacuteda la sangre eacutesta puede conservarse coagulada o
mantenidaincoagulable mediante la adicioacuten de un anticoagulante
41 CARACTERIacuteSTICAS BAacuteSICAS DE LOS ANTICOAGULANTES MAacuteS
USADOSEN HEMATOLOGIacuteA
bull No alterar el tamantildeo de los hematiacutees
bull No producir hemoacutelisis
bull Evitar al maacuteximo la agregacioacuten plaquetaria
bull No alterar la morfologiacutea de los leucocitos
La sangre tratada con anticoagulante debe procesarse lo antes posible
inclusomantenida bajo refrigeracioacuten (4 ordmC) si no pasan de las 2 horas El
tiempomaacuteximo entre la extraccioacuten de la sangre y su procesamiento depende
delcoagulante de eleccioacuten y no debe ser maacutes de 4 horas a excepcioacuten
delanticoagulante EDTA (etilendiaminotetraceacutetico) que puede ser hasta 24
horas(en refrigeracioacuten a 4 ordmC)
Los anticoagulantes pueden emplearse en forma soacutelida o liacutequida Los
primerosestaacuten indicados para la determinacioacuten de los paraacutemetros
hematoloacutegicosya que no producen como los anticoagulantes liacutequidos dilucioacuten de
la sangre
42 ANTICOAGULANTES SOacuteLIDOS
421 EDTA
Es la sal disoacutedica o tripotaacutesica del aacutecido etilendiaminotetraceacutetico La saldisoacutedica
(Na2EDTA) es menos soluble que la sal tripotaacutesica (K3EDTA) Estoscompuestos
realizan su accioacuten a traveacutes de un efecto quelante sobre el calcioal fijarlo impiden
su activacioacuten y por ende la coagulacioacuten sanguiacutenea
4211 Ventajas
bull Respeta la morfologiacutea eritrocitaria (especialmente la sal tripotaacutesica) yleucocitaria de manera que permite una demora de dos horas en la realizacioacutendel frotis sanguiacuteneo despueacutes de la extraccioacuten sanguiacutenea
bull Asegura la conservacioacuten de los elementos formes sanguiacuteneos durante 24horas si la sangre se mantiene a 4 ordmC
bull Al inhibir la aglutinacioacuten de las plaquetas facilita su recuento o su expresioacutensemicuantitativa a partir del frotis
bull La concentracioacuten recomendada de EDTA es de 15 mgmL de sangre Unamayor cantidad de anticoagulante puede producir retraccioacuten celular condisminucioacuten del hematocrito y un aumento de la concentracioacuten media de lahemoglobina Un exceso de sangre con relacioacuten al anticoagulante produceformacioacuten de microagregados que pueden alterar los resultados El empleode tubos al vaciacuteo con una gota (50mL) de EDTA tripotaacutesica comercialpara 5 mL de sangre es de intereacutes praacutectico dado que es cien veces maacutessoluble facilitando la mezcla de sangre con anticoagulante
4212 Desventajas
Usado en exceso afecta a los eritrocitos y a los leucocitos a los cuales les produce encogimiento y cambios en su forma por ello debe cuidarse de agregar la cantidad correcta de sangre al anticoagulante
422 Anticoagulante de Wintrobe
Es una mezcla de oxalato de amonio y potasio Actuacutea por precipitacioacuten del calcio es faacutecil de preparar Se emplea en forma de polvo en proporcioacuten de 2 de oxalato de amonio por 1 de oxalato de potasio La cantidad recomendada es de 2 mg x mL de sangre Este anticoagulante no afecta el volumen globular medio y puede usarse para determinaciones de hemoglobina hematocrito y recuento globular pero para los extendidos queda limitada a los primeros minutos tampoco es uacutetil para el recuento plaquetario porque produce formacioacuten de agregados plaquetarios
423 Heparina
El nombre de heparina proviene del griego hepar que significa hiacutegado ya que fue aislado por primera vez de las ceacutelulas de este tejido Es un mucopolisacaacuterido aacutecido Presenta el
inconveniente de que si no se agita raacutepidamente con la sangre despueacutes de extraiacuteda
pueden formarse microcoaacutegulos aunque no altera el volumeneritrocitario ni la morfologiacutea de los leucocitos No es recomendablepara el frotis sanguiacuteneo porque produce un fondo azul en la laacutemina
La heparina de sodio o litio puede usarse en forma soacutelida o liacutequida en
proporcioacutende 01 - 02 mg de heparina por 1 mL de sangre
43 ANTICOAGULANTES LIacuteQUIDOS
431 Citrato trisoacutedico
Es de eleccioacuten para las pruebas de hemostasia y la velocidad de sedimentacioacuten
Actuacutea a traveacutes de la precipitacioacuten del calcio La concentracioacuten depende de
la prueba por realizar
bull Para pruebas de hemostasia se emplea en proporcioacuten de 1 9 (05 mL
deanticoagulante para 45 mL de sangre total)
bull Para la determinacioacuten de la VSG (Velocidad de Sedimentacioacuten Globular) es14
(05 mL de anticoagulante para 2 mL de sangre)
432 Oxalato soacutedico
Recomendado tambieacuten para las pruebas de hemostasia Se emplea en
proporcioacutende un volumen de anticoagulante para 4 vol de sangre
SECCIOacuteN 5
REALIZACIOacuteN Y TINCIOacuteN DEL FROTIS SANGUIacuteNEO
La praacutectica del frotis sanguiacuteneo tambieacuten llamado extendido es de gran importanciaen hematologiacutea ya que el diagnoacutestico de muchas enfermedadeshematoloacutegicas puede realizarse con soacutelo observar las caracteriacutesticasmorfoloacutegicas de las ceacutelulas sanguiacuteneas de manera que eacuteste no debe serexcesivamente grueso ni excesivamente fino Todas las laacuteminas por usarsobre todo nuevas deben ser limpiadas con algodoacuten y alcohol al 70 paraeliminar la grasa que viene adherida
51 MEacuteTODO DE LOS DOS PORTAOBJETOS
511 Materiales
- Alcohol al 70
- Algodoacuten
- Lanceta descartable
- Portaobjetos de vidrios limpios y desgrasados (25 x 75 mm)
512 Fundamento
Consiste en la extensioacuten de una gota de sangre sobre un portaobjeto (25 x 75)empleando el canto biselado de otro portaobjeto de igual dimensioacuten (Fig 12)
513 Procedimiento
5131 Una vez extraiacuteda la sangre con cualquiera de las metodologiacuteas secoloca una pequentildea gota de sangre (5mL) (aprox 3 mm de diaacutemetro)sobre un portaobjeto a 2 cm aproximadamente de uno de los extremos
5132 Colocar el canto de otro portaobjeto esmerilado sobre la superficiedel primer portaobjeto (en la que se encuentra la gota de sangre)formando un aacutengulo de 45ordm
5134 Deslizar suavemente y a velocidad moderada el portaobjeto sobre elotro en sentido longitudinal hasta que la gota de sangre quede bienextendida sobre la
superficie del primer portaobjeto El grosor delfrotis sanguiacuteneo puede variar seguacuten sea el aacutengulo que formen entresiacute ambos portaobjetos Asiacute si es superior a 45ordm la extensioacuten obtenidaseraacute gruesa y corta si es inferior a 45ordm seraacute larga y fina El secado delfrotis es a temperatura ambiente y en posicioacuten horizontal
Fig 12
1048729 Zona excesivamente gruesa Se halla en la regioacuten inmediata al punto departida de la extensioacuten (cabeza) En ella se aprecia siempre un aumento delinfocitos
1048729 Zona excesivamente fina Corresponde al final de la extensioacuten y termina enun aacuterea donde las ceacutelulas adoptan una posicioacuten acartonada (barbas) Enesta regioacuten existe un exceso de granulocitos y monocitos
1048729 Zona ideal Corresponde a la regioacuten intermedia del frotis y en ella existe unreparto equilibrado de ceacutelulas
52 COLORACIONES USADAS
Una vez seco el frotis se procede a la tincioacuten hematoloacutegica con el colorante deRomanowsky constituido por la mezcla de eosina y azul de metileno Dentrode eacutestas tenemos
521 Colorante de Giemsa
522 Colorante de May-Grunwald
523 Colorante de Wright
524 Colorante de Leishman
Preparacioacuten de colorantes (Anexo A)
1048729 Para el estudio de las ceacutelulas sanguiacuteneas utilizar el colorante 523 y 524
1048729 Para el estudio de hemoparaacutesitos utilizar el colorante 521
1048729 Utilizar el colorante 522 para casos especiales en que se desee observar
con mayor claridad y especificidad los graacutenulos de los neutrofilos
53 TINCIOacuteN CON COLORANTE DE WRIGHT
531 Fundamento
El colorante de Wright va a permitir suministrar un medio para estudiar lasangre y determinar las variaciones y anormalidades de estructura forma ytamantildeo de los eritrocitos su contenido de hemoglobina y sus propiedades decoloracioacuten La informacioacuten obtenida de un frotis de sangre perifeacuterica dependeen gran parte de la calidad del extendido y la coloracioacuten
532 Materiales
5321 Colorante de Wright (Anexo A)
5322 Frasco gotero
5323 Solucioacuten amortiguada tamponada (Anexo A)
533 Procedimiento
5331 Una vez obtenido el frotis sanguiacuteneo se le dejaraacute secar entre 15 y 20minutos
5332 Luego se coloca la preparacioacuten en un soporte y se cubre con el colorantede Wright dejaacutendolo por espacio de 5 minutos
5333 Posteriormente se antildeade solucioacuten amortiguada tamponada en partesiguales hasta obtener un brillo metaacutelico dejando 6 minutos adicionales
5334 Finalmente se lava con agua corriente y se deja secar
5335 Se coloca en el microscopio y con pequentildeo aumento se revisa lacalidad de la coloracioacuten la cantidad aproximada de gloacutebulos blancosy se escoge el sitio para iniciar el recuento Se coloca una gota deaceite de inmersioacuten y se enfoca a un aumento de 100xLa forma de los gloacutebulos rojos se examinaraacute detenidamente observandoademaacutes del color (cantidad de hemoglobina) presencia deplaquetas su agrupacioacuten y distribucioacuten
5336 Posteriormente se hace el recuento diferencial de gloacutebulos blancosen 100
ceacutelulas para lo cual se deberaacute conocer las diferencias entreneutroacutefilos eosinoacutefilos
linfocitos y monocitosUna extensioacuten de sangre bien tentildeida debe caracterizarse
por unabuena diferenciacioacuten de las estructuras subcelulares en los leucocitosuna
coloracioacuten rosada de los hematiacutees y la ausencia de precipitados
Los defectos maacutes frecuentes observados en la tincioacuten del frotis sanguiacuteneoson
Coloracioacuten excesivamente azul debido a
1048729 Frotis excesivamente grueso
1048729 Lavado insuficiente
1048729 Tincioacuten muy prolongada
1048729 Empleo de colorante excesivamente alcalino
Coloracioacuten con una tonalidad rosada
1048729 El colorante el tampoacuten o el agua de lavado tienen un pH demasiadoaacutecido
Presencia de precipitados
1048729 Obedecen a una accioacuten excesiva del colorante Esto se puede evitarcon la
filtracioacuten
SECCIOacuteN 6
HEMOGRAMA-HEMOGLOBINA-HEMATOCRITO
El hemograma de Shilling constituye uno de los exaacutemenes de laboratorio
maacutesusados en el campo de la hematologiacutea Comprende las siguientes pruebas
61 RECUENTO LEUCOCITARIO
Principio
La sangre anticoagulada se deposita en un liacutequido que permite evidenciar
losleucocitos mantenieacutendolos visibles mientras que los eritrocitos
sonhemolizados El recuento del nuacutemero de leucocitos o gloacutebulos blancos se
expresapor mm3 (miliacutemetro cuacutebico)
611 Equipos
- Microscopio
- Hemocitoacutemetro (Caacutemara de Neubauer)
Consta de los siguientes elementos
diams Una laacutemina portaobjeto gruesa en el centro se hallan dos
superficiescuadriculadas iguales separadas del resto de la laacutemina por surcos y
dosbarras transversales algo maacutes elevadas
diams Una laminilla cubreobjetos oacutepticamente plana que al colocarse sobrelas barras
elevadas de la laacutemina forma una caacutemara entre el cubreobjetosy la superficie
cuadriculadaLa altura entre el cubreobjetos y la laacutemina portaobjetos es de 01
mmCada cuadriacutecula mide 3 mm de lado y se divide en 9 cuadrados grandesCada
uno de los cuales mide 1 mm2 de superficie que se subdivide a suvez en 16
cuadrados medianos El cuadrado grande central se divide en25 cuadrados
pequentildeos y cada uno de ellos en 16 cuadraditos Cadacuadrado pequentildeo mide
02 mm de lado (004 mm2 de superficie) y cadacuadradito mide 005 mm de lado
(00025 mm2 de superficie)
612 Materiales y reactivos requeridos
6121 Pipeta de gloacutebulos blancos (De Thoma) o pipeta automaacutetica (de 0 a 100 mL)Presenta cerca del extremo superior una marca de 11 inmediatamentecontinuacutea una dilatacioacuten (bulbo) que contiene una perla que funciona comomezcladora luego sigue el extremo maacutes largo de la pipeta (tallo) que estaacutedividida en 10 partes con 2 marcas 1 (parte final del bulbo) y 05 (a la mitaddel tallo) Se le acopla a su extremo superior 1 tubo de goma y una bombillapara aspirar
6122 Diluyente de gloacutebulos blancos Solucioacuten de Turk al 1
6123 Contador manual (Soacutelo si fuera necesario)
6124 Papel filtro
613 Procedimiento
6131 Una vez obtenida la sangre con anticoagulante o sangre capilar deldedo se procede a aspirar la sangre con la pipeta de gloacutebulos blancoshasta la marca de 05 y a limpiar la punta con papel absorbente
6132 Introducir la pipeta en el tubo que contenga solucioacuten de Turk y absorberhasta la marca de 11 (no debe haber burbujas)
6133 Tapar ambos extremos y proceder a mezclar manualmente o en unrotador automaacutetico por 2 oacute 3 minutos
6134 Monte la laminilla de vidrio en la caacutemara para recuento que debe estarlimpia y seca
6135 Agitar la pipeta y descartar las cuatro primeras gotas para luego colocaruna gota pequentildea de esta solucioacuten en la caacutemara
6136 Deje reposar por espacio de 3 minutos para que las ceacutelulas se sedimenten
6137 Enfocar con objetivo de 10x y contar en 4 cuadrados grandes angularesCuando se usa la pipeta automaacutetica se toma 20 mL (002 mL) desangre total con anticoagulante o sangre capilar con anticoagulante yse diluye en un tubo que contenga 380 mL de solucioacuten de Turk (aquiacutetenemos una dilucioacuten 120)
LECTURA
Fig 13
La lectura se realiza en los campos 1 3 7 y 9 como estaacute indicado en la figuraAdemaacutes de los leucocitos contados dentro de cada uno de los cuadrantes sedeben contar todos los leucocitos que se encuentren adheridos en la liacuteneahorizontal superior y vertical exterior o de lo contrario todos los leucocitosadheridos a la liacutenea horizontal inferior y vertical interior
614 Resultados
Nordm de leucocitos x mm3 = leucocitos contados en 4 camposdividealtura x dilucioacuten x aacuterea
Reemplazando = leucocitos contados en 4 camposdivide110 x 120 x 4=
Leucocitos contados en 4 camposdivide4200=
X1 divide4200= Nordm leucocitos contados x 50
615 Valores de referencia
5000 - 10 000 leucocitos mm3
616 Correccioacuten de valores para restar eritrocitos nucleados
Los normoblastos no se destruyen (lisis) en el liacutequido de dilucioacuten por lo tantopueden observarse al realizar el recuento leucocitario y confundirse con losleucocitos de tal manera que se debe emplear la siguiente foacutermula
Caacutelculo
La concentracioacuten del nuacutemero de normoblastos (por litro) esNuacutemero de normoblatos contados x concentracioacuten o nuacutemero de leucocitos100 + Nordm de normoblastos contados
Ejemplo
Si se cuentan 50 normoblastos y la concentracioacuten del nuacutemero de leucocitos es16 x 109l la concentracioacuten del nuacutemero de normoblastos seraacute
50 x16 = 53 x 109l
100 + 50
y la concentracioacuten de leucocitos corregida seraacute 16 - 53 = 107 x 109lEn unidades tradicionales las concentraciones de normoblastos y leucocitosse expresan por miliacutemetro cuacutebico En tales unidades el caacutelculo correspondienteal ejemplo que se ha dado seriacutea
50 x 16 000 = 5300 mm3
100 + 50
Recuento corregido de gloacutebulos blancos o leucocitos = 16 000 - 5300 = 10 700 mm3
Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2
62 RECUENTO DE GLOacuteBULOS ROJOS
Principio
La sangre se diluye en un liacutequido que nos permite observar claramente loshematiacutees luego esta dilucioacuten se coloca en una caacutemara de Neubauer con laayuda de una pipeta automaacutetica o pipeta Pasteur y se cuentan en el microscopioa un objetivo de 40x para calcular el nuacutemero de gloacutebulos rojos por mm3
621 Equipos
- Microscopio
- Hemocitoacutemetro (caacutemara de Neubauer)
622 Materiales y reactivos requeridos
6221 Pipeta de gloacutebulos rojos (De Thoma) o pipeta automaacutetica (de 0-100 mL)
Presenta cerca del extremo superior una marca de 101 inmediatamentecontinuacutea una dilatacioacuten (bulbo) que contiene una perla roja mezcladoraluego sigue el tallo (extremo maacutes largo) el cual estaacute dividido en 10 partescon 2 marcas 1 acabando el bulbo y 05 a la mitad del tallo Se requiereigual que el recuento de leucocitos una boquilla para aspirar
6222 Diluyente de gloacutebulos rojos Cloruro de Sodio al 09 (ver anexo)
Diluyente de Hayem (ver anexo)
6223 Contador manual (soacutelo si fuera necesario)
6224 Papel filtro
623 Procedimiento
6231 Mezclar la sangre obtenida con el anticoagulante o tomar sangre capilar
6232 Llenar la pipeta de gloacutebulos rojos con sangre hasta la marca de 05para realizar una dilucioacuten de 1200 y si se carga hasta 1 la dilucioacutenseraacute 1100 Limpiar la punta con gasa o papel absorbente
6233 Introducir la pipeta en el tubo o frasquito conteniendo diluyente (Hayem)y llenar de liacutequido de dilucioacuten hasta la marca de 101
6234 Se coloca en un rotador automaacutetico o se hace rotar manualmente de2 a 3 minutos
6235 Agitar bien la pipeta y descartar 3 a 4 gotas del tallo luego colocar unagota pequentildea cerca de un extremo de la caacutemara para que por capilaridadse llene exactamente
6236 Hacer el recuento con objetivo de 40xSe puede realizar con la pipeta automaacutetica se toma 20 mL (002mL)de sangre total con anticoagulante o sangre capilar y se deposita enun tubo de 12 x 75 que contenga 4 mL de solucioacuten de Hayem (aquiacute setiene una dilucioacuten de 1200) Se deja reposar aproximadamente 5minutos y se procede a cargar la caacutemara con la misma pipeta usandoun nuevo tip El inconveniente aquiacute es el gasto de reactivo (4 mL) perolas medidas son mas exactas
6237 Dejar en reposo por 3 minutos
6238 Enfocar la cuadriacutecula a 10x luego con el objetivo de 40x contar sobreel cuadrado grande central de la caacutemara soacutelo en 5 cuadrados pequentildeosuno central y cuatro angulares (80 cuadraditos en total)
6239 En el recuento se incluyen las ceacutelulas que cubren o tocan por dentroo por fuera las liacuteneas limitantes superior e izquierda en el cuadradopequentildeo de recuento y no se consideran los correspondientes a losliacutemites inferior y derechoSe hace el recuento en los puntos ABCD y Ey se sigue los mismos paraacutemetros del recuento de leucocitos
LECTURA
Fig 14
624 Resultados
Nordm de hematiacutees x mm3 = hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeosaltura x dilucioacuten X aacuterea
Reemplazando = hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeos110 x 1200 x 15
= hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeos divide 110 000
= hematiacutees contados x 10 000
625 Valores de referencia
(Unidades tradicionales millones de ceacutelulasmm3)
Hombres 4 500 000 - 5 500 000
Mujeres 4 000 000 - 5 000 000
Nintildeos (4 antildeos) 4 200 000 - 5 200 000
Lactantes (1 - 6 meses) 3 800 000 - 5 200 000
Recieacuten nacidos 5 000 000 - 6 000 000
Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2
63 DETERMINACIOacuteN DEL VOLUMEN GLOBULAR (Hematocrito)
Mide la fraccioacuten que comprende a los gloacutebulos rojos (masa globular) respectoal
volumen total de la muestra de sangre venosa o capilar Puede expresarseen
porcentaje o como valor decimal
Hto= altura de la columna de gloacutebulos rojosdivide altura de la columna de sangre
total(gloacutebulos rojos maacutes plasma)
631 Meacutetodo de Wintrobe
Materiales requeridos
- Tubo de Wintrobe graduado de 0 - 100 mm
- Pipetas Pasteur o pipetas de transferencia
- Tapoacuten de goma
Procedimiento
diams Llenar la sangre extraiacuteda con anticoagulante con una pipeta pasteur
comenzandodesde el fondo hasta la marca superior de 100 mm teniendocuidado
de no provocar espuma
diams Tapar el tubo con un tapoacuten de goma para evitar la evaporacioacuten
diams Centrifugar a 3000 rpm por 30 minutos
Resultados (lectura)
Del tubo graduado se mide directamente el nivel de la columna de gloacutebulosrojos
Valores de referencia
Hombres 40 - 54Mujeres 38 - 48
Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2
632 Meacutetodo de microhematocrito
Materiales requeridos
- Capilares rojos y azules (75 mm x 15 mm)
- Plastilina
Procedimiento
diams Tomar la muestra en capilares rojos heparinizados directamente del pulpejodel
dedo o utilizar capilares azules sin heparina para sangre venosacon
anticoagulante de Wintrobe o EDTA Debe llenarse aproximadamente70 - 80
del capilar
diams Ocluir (tapar) un extremo del capilar con plastilina
diams Colocar el capilar sobre la plataforma del cabezal de una centriacutefuga demicrohematocrito con el extremo ocluido adherido al reborde externo de laplataforma
diams Centrifugar por 5 minutos entre 10 000 - 12 000 rpm
Resultados (lectura)
La lectura se realiza con una escala estandarizada que expenden en el comercio
Uso de la escala
diams Sostenga el tubo frente a la escala de manera que el fondo de la columnade eritrocitos (no el extremo inferior del tubo) quede exactamente al mismonivel de la liacutenea horizontal correspondiente al cero
diams Desplace el tubo a traveacutes de la escala hasta que la liacutenea marcada con elnuacutemero 10 quede al nivel del tope de la columna de plasma Vigile que elfondo de la
columna de eritrocitos continuacutee sobre la liacutenea cero El tubodebe encontrarse completamente en posicioacuten vertical
diams La liacutenea que pase al nivel del tope de la columna de eritrocitos indicaraacute lafraccioacuten de volumen de eacutestos
Valores de referencia
Hombres 40 - 50
Mujeres 38 - 44
Nintildeos (5 antildeos) 38 - 44
Lactantes (3 meses) 37 - 42
Recieacuten nacidos 50 - 58
La disposicioacuten celular esParte superior una columna de plasmaEn la interfase estaacuten los leucocitos yplaquetasParte inferior estaacute la columna deeritrocitos (Fig 15)
64 DOSAJE DE HEMOGLOBINA
Principio
La sangre se diluye en liacutequido de Drabkin el cual hemoliza los hematiacutees yconvierte la hemoglobina en cianometahemoglobina (cianuro de hemiglobina)La solucioacuten que se produce se lee por medio de un espectrofotoacutemetro ofotocoloriacutemetro Su grado de absorbancia es proporcional a la cantidad dehemoglobina que contenga la sangre
641 Materiales y reactivos
6411 Un coloriacutemetro fotoeleacutectrico o un espectrofotoacutemetro
6412 Pipetas
diams Una pipeta para sangre (pipeta de Sahli) graduada hasta 002 mL contubo de goma y boquilla
diams Una pipeta de vidrio graduada de 5 mL
6413 Tubos de ensayo
6414 Reactivo de Drabkin para dilucioacuten
Este reactivo se puede adquirir en tabletas o polvos para disolver en 1litro de agua destilada Si se dispone de una balanza analiacutetica la preparacioacutense puede hacer en el laboratorio Esta solucioacuten se puedeconservar durante un mes en un frasco de vidrio oscuro Deseacutechese sise enturbia
3515 Papel filtro Nordm 2
352 Procedimiento (Fig 11)
3521 La sangre capilar se obtiene de la cara lateral del dedo medio o anularen los adultos y del dedo gordo del pie o taloacuten en los nintildeos
3522 Desinfectar la zona con alcohol al 70 secar con algodoacuten esteacuteril
3523 Punzar la piel con una lanceta esteacuteril desechable (2 mm de profundidad)
3524 Usar gasa esteacuteril para desechar la primera gota y recoger las siguientesen tubos capilares Evitar comprimir la extremidad para obtenersangre porque se altera la composicioacuten sanguiacutenea
353 Ventajas
3531 Puede obtenerse con facilidad
3532 Es preferible cuando han de realizarse extensiones de sangre perifeacuterica
354 Desventajas
3541 Soacutelo se pueden obtener pequentildeas cantidades de sangre y los exaacutemenesde repeticioacuten requieren nuevas muestras
3542 La sangre en microtubos (capilares) frecuentemente se hemolizainterfiendo con la mayoriacutea de pruebas de laboratorio
3543 Los resultados obtenidos en pruebas con sangre capilar no puedenser comparados con los resultados de las pruebas con sangre venosa
3544 El dedo no soacutelo es delicado sino difiacutecil de desinfectar adecuadamenteen el tiempo disponible
3545 En pacientes con resistencia disminuida a la infeccioacuten (aquellos conleucemia agranulocitosis diabetes uremia y enfermedades con deficienciasinmunoloacutegicas) una muestra tomada del dedo es mucho maacutesprobable que conduzca a una infeccioacuten que otra tomada del brazo
3546 El recuento de eritrocitos y leucocitos asiacute como el recuento deplaquetas y reticulocitos no debe realizarse en sangre capilar debidoa la difiacutecil estandarizacioacuten del flujo sanguiacuteneo capilar
EXTRACCIOacuteN DE SANGRE CAPILAR
Fig 10
Fig 11
SECCIOacuteN 4
ANTICOAGULANTES
Una vez extraiacuteda la sangre eacutesta puede conservarse coagulada o
mantenidaincoagulable mediante la adicioacuten de un anticoagulante
41 CARACTERIacuteSTICAS BAacuteSICAS DE LOS ANTICOAGULANTES MAacuteS
USADOSEN HEMATOLOGIacuteA
bull No alterar el tamantildeo de los hematiacutees
bull No producir hemoacutelisis
bull Evitar al maacuteximo la agregacioacuten plaquetaria
bull No alterar la morfologiacutea de los leucocitos
La sangre tratada con anticoagulante debe procesarse lo antes posible
inclusomantenida bajo refrigeracioacuten (4 ordmC) si no pasan de las 2 horas El
tiempomaacuteximo entre la extraccioacuten de la sangre y su procesamiento depende
delcoagulante de eleccioacuten y no debe ser maacutes de 4 horas a excepcioacuten
delanticoagulante EDTA (etilendiaminotetraceacutetico) que puede ser hasta 24
horas(en refrigeracioacuten a 4 ordmC)
Los anticoagulantes pueden emplearse en forma soacutelida o liacutequida Los
primerosestaacuten indicados para la determinacioacuten de los paraacutemetros
hematoloacutegicosya que no producen como los anticoagulantes liacutequidos dilucioacuten de
la sangre
42 ANTICOAGULANTES SOacuteLIDOS
421 EDTA
Es la sal disoacutedica o tripotaacutesica del aacutecido etilendiaminotetraceacutetico La saldisoacutedica
(Na2EDTA) es menos soluble que la sal tripotaacutesica (K3EDTA) Estoscompuestos
realizan su accioacuten a traveacutes de un efecto quelante sobre el calcioal fijarlo impiden
su activacioacuten y por ende la coagulacioacuten sanguiacutenea
4211 Ventajas
bull Respeta la morfologiacutea eritrocitaria (especialmente la sal tripotaacutesica) yleucocitaria de manera que permite una demora de dos horas en la realizacioacutendel frotis sanguiacuteneo despueacutes de la extraccioacuten sanguiacutenea
bull Asegura la conservacioacuten de los elementos formes sanguiacuteneos durante 24horas si la sangre se mantiene a 4 ordmC
bull Al inhibir la aglutinacioacuten de las plaquetas facilita su recuento o su expresioacutensemicuantitativa a partir del frotis
bull La concentracioacuten recomendada de EDTA es de 15 mgmL de sangre Unamayor cantidad de anticoagulante puede producir retraccioacuten celular condisminucioacuten del hematocrito y un aumento de la concentracioacuten media de lahemoglobina Un exceso de sangre con relacioacuten al anticoagulante produceformacioacuten de microagregados que pueden alterar los resultados El empleode tubos al vaciacuteo con una gota (50mL) de EDTA tripotaacutesica comercialpara 5 mL de sangre es de intereacutes praacutectico dado que es cien veces maacutessoluble facilitando la mezcla de sangre con anticoagulante
4212 Desventajas
Usado en exceso afecta a los eritrocitos y a los leucocitos a los cuales les produce encogimiento y cambios en su forma por ello debe cuidarse de agregar la cantidad correcta de sangre al anticoagulante
422 Anticoagulante de Wintrobe
Es una mezcla de oxalato de amonio y potasio Actuacutea por precipitacioacuten del calcio es faacutecil de preparar Se emplea en forma de polvo en proporcioacuten de 2 de oxalato de amonio por 1 de oxalato de potasio La cantidad recomendada es de 2 mg x mL de sangre Este anticoagulante no afecta el volumen globular medio y puede usarse para determinaciones de hemoglobina hematocrito y recuento globular pero para los extendidos queda limitada a los primeros minutos tampoco es uacutetil para el recuento plaquetario porque produce formacioacuten de agregados plaquetarios
423 Heparina
El nombre de heparina proviene del griego hepar que significa hiacutegado ya que fue aislado por primera vez de las ceacutelulas de este tejido Es un mucopolisacaacuterido aacutecido Presenta el
inconveniente de que si no se agita raacutepidamente con la sangre despueacutes de extraiacuteda
pueden formarse microcoaacutegulos aunque no altera el volumeneritrocitario ni la morfologiacutea de los leucocitos No es recomendablepara el frotis sanguiacuteneo porque produce un fondo azul en la laacutemina
La heparina de sodio o litio puede usarse en forma soacutelida o liacutequida en
proporcioacutende 01 - 02 mg de heparina por 1 mL de sangre
43 ANTICOAGULANTES LIacuteQUIDOS
431 Citrato trisoacutedico
Es de eleccioacuten para las pruebas de hemostasia y la velocidad de sedimentacioacuten
Actuacutea a traveacutes de la precipitacioacuten del calcio La concentracioacuten depende de
la prueba por realizar
bull Para pruebas de hemostasia se emplea en proporcioacuten de 1 9 (05 mL
deanticoagulante para 45 mL de sangre total)
bull Para la determinacioacuten de la VSG (Velocidad de Sedimentacioacuten Globular) es14
(05 mL de anticoagulante para 2 mL de sangre)
432 Oxalato soacutedico
Recomendado tambieacuten para las pruebas de hemostasia Se emplea en
proporcioacutende un volumen de anticoagulante para 4 vol de sangre
SECCIOacuteN 5
REALIZACIOacuteN Y TINCIOacuteN DEL FROTIS SANGUIacuteNEO
La praacutectica del frotis sanguiacuteneo tambieacuten llamado extendido es de gran importanciaen hematologiacutea ya que el diagnoacutestico de muchas enfermedadeshematoloacutegicas puede realizarse con soacutelo observar las caracteriacutesticasmorfoloacutegicas de las ceacutelulas sanguiacuteneas de manera que eacuteste no debe serexcesivamente grueso ni excesivamente fino Todas las laacuteminas por usarsobre todo nuevas deben ser limpiadas con algodoacuten y alcohol al 70 paraeliminar la grasa que viene adherida
51 MEacuteTODO DE LOS DOS PORTAOBJETOS
511 Materiales
- Alcohol al 70
- Algodoacuten
- Lanceta descartable
- Portaobjetos de vidrios limpios y desgrasados (25 x 75 mm)
512 Fundamento
Consiste en la extensioacuten de una gota de sangre sobre un portaobjeto (25 x 75)empleando el canto biselado de otro portaobjeto de igual dimensioacuten (Fig 12)
513 Procedimiento
5131 Una vez extraiacuteda la sangre con cualquiera de las metodologiacuteas secoloca una pequentildea gota de sangre (5mL) (aprox 3 mm de diaacutemetro)sobre un portaobjeto a 2 cm aproximadamente de uno de los extremos
5132 Colocar el canto de otro portaobjeto esmerilado sobre la superficiedel primer portaobjeto (en la que se encuentra la gota de sangre)formando un aacutengulo de 45ordm
5134 Deslizar suavemente y a velocidad moderada el portaobjeto sobre elotro en sentido longitudinal hasta que la gota de sangre quede bienextendida sobre la
superficie del primer portaobjeto El grosor delfrotis sanguiacuteneo puede variar seguacuten sea el aacutengulo que formen entresiacute ambos portaobjetos Asiacute si es superior a 45ordm la extensioacuten obtenidaseraacute gruesa y corta si es inferior a 45ordm seraacute larga y fina El secado delfrotis es a temperatura ambiente y en posicioacuten horizontal
Fig 12
1048729 Zona excesivamente gruesa Se halla en la regioacuten inmediata al punto departida de la extensioacuten (cabeza) En ella se aprecia siempre un aumento delinfocitos
1048729 Zona excesivamente fina Corresponde al final de la extensioacuten y termina enun aacuterea donde las ceacutelulas adoptan una posicioacuten acartonada (barbas) Enesta regioacuten existe un exceso de granulocitos y monocitos
1048729 Zona ideal Corresponde a la regioacuten intermedia del frotis y en ella existe unreparto equilibrado de ceacutelulas
52 COLORACIONES USADAS
Una vez seco el frotis se procede a la tincioacuten hematoloacutegica con el colorante deRomanowsky constituido por la mezcla de eosina y azul de metileno Dentrode eacutestas tenemos
521 Colorante de Giemsa
522 Colorante de May-Grunwald
523 Colorante de Wright
524 Colorante de Leishman
Preparacioacuten de colorantes (Anexo A)
1048729 Para el estudio de las ceacutelulas sanguiacuteneas utilizar el colorante 523 y 524
1048729 Para el estudio de hemoparaacutesitos utilizar el colorante 521
1048729 Utilizar el colorante 522 para casos especiales en que se desee observar
con mayor claridad y especificidad los graacutenulos de los neutrofilos
53 TINCIOacuteN CON COLORANTE DE WRIGHT
531 Fundamento
El colorante de Wright va a permitir suministrar un medio para estudiar lasangre y determinar las variaciones y anormalidades de estructura forma ytamantildeo de los eritrocitos su contenido de hemoglobina y sus propiedades decoloracioacuten La informacioacuten obtenida de un frotis de sangre perifeacuterica dependeen gran parte de la calidad del extendido y la coloracioacuten
532 Materiales
5321 Colorante de Wright (Anexo A)
5322 Frasco gotero
5323 Solucioacuten amortiguada tamponada (Anexo A)
533 Procedimiento
5331 Una vez obtenido el frotis sanguiacuteneo se le dejaraacute secar entre 15 y 20minutos
5332 Luego se coloca la preparacioacuten en un soporte y se cubre con el colorantede Wright dejaacutendolo por espacio de 5 minutos
5333 Posteriormente se antildeade solucioacuten amortiguada tamponada en partesiguales hasta obtener un brillo metaacutelico dejando 6 minutos adicionales
5334 Finalmente se lava con agua corriente y se deja secar
5335 Se coloca en el microscopio y con pequentildeo aumento se revisa lacalidad de la coloracioacuten la cantidad aproximada de gloacutebulos blancosy se escoge el sitio para iniciar el recuento Se coloca una gota deaceite de inmersioacuten y se enfoca a un aumento de 100xLa forma de los gloacutebulos rojos se examinaraacute detenidamente observandoademaacutes del color (cantidad de hemoglobina) presencia deplaquetas su agrupacioacuten y distribucioacuten
5336 Posteriormente se hace el recuento diferencial de gloacutebulos blancosen 100
ceacutelulas para lo cual se deberaacute conocer las diferencias entreneutroacutefilos eosinoacutefilos
linfocitos y monocitosUna extensioacuten de sangre bien tentildeida debe caracterizarse
por unabuena diferenciacioacuten de las estructuras subcelulares en los leucocitosuna
coloracioacuten rosada de los hematiacutees y la ausencia de precipitados
Los defectos maacutes frecuentes observados en la tincioacuten del frotis sanguiacuteneoson
Coloracioacuten excesivamente azul debido a
1048729 Frotis excesivamente grueso
1048729 Lavado insuficiente
1048729 Tincioacuten muy prolongada
1048729 Empleo de colorante excesivamente alcalino
Coloracioacuten con una tonalidad rosada
1048729 El colorante el tampoacuten o el agua de lavado tienen un pH demasiadoaacutecido
Presencia de precipitados
1048729 Obedecen a una accioacuten excesiva del colorante Esto se puede evitarcon la
filtracioacuten
SECCIOacuteN 6
HEMOGRAMA-HEMOGLOBINA-HEMATOCRITO
El hemograma de Shilling constituye uno de los exaacutemenes de laboratorio
maacutesusados en el campo de la hematologiacutea Comprende las siguientes pruebas
61 RECUENTO LEUCOCITARIO
Principio
La sangre anticoagulada se deposita en un liacutequido que permite evidenciar
losleucocitos mantenieacutendolos visibles mientras que los eritrocitos
sonhemolizados El recuento del nuacutemero de leucocitos o gloacutebulos blancos se
expresapor mm3 (miliacutemetro cuacutebico)
611 Equipos
- Microscopio
- Hemocitoacutemetro (Caacutemara de Neubauer)
Consta de los siguientes elementos
diams Una laacutemina portaobjeto gruesa en el centro se hallan dos
superficiescuadriculadas iguales separadas del resto de la laacutemina por surcos y
dosbarras transversales algo maacutes elevadas
diams Una laminilla cubreobjetos oacutepticamente plana que al colocarse sobrelas barras
elevadas de la laacutemina forma una caacutemara entre el cubreobjetosy la superficie
cuadriculadaLa altura entre el cubreobjetos y la laacutemina portaobjetos es de 01
mmCada cuadriacutecula mide 3 mm de lado y se divide en 9 cuadrados grandesCada
uno de los cuales mide 1 mm2 de superficie que se subdivide a suvez en 16
cuadrados medianos El cuadrado grande central se divide en25 cuadrados
pequentildeos y cada uno de ellos en 16 cuadraditos Cadacuadrado pequentildeo mide
02 mm de lado (004 mm2 de superficie) y cadacuadradito mide 005 mm de lado
(00025 mm2 de superficie)
612 Materiales y reactivos requeridos
6121 Pipeta de gloacutebulos blancos (De Thoma) o pipeta automaacutetica (de 0 a 100 mL)Presenta cerca del extremo superior una marca de 11 inmediatamentecontinuacutea una dilatacioacuten (bulbo) que contiene una perla que funciona comomezcladora luego sigue el extremo maacutes largo de la pipeta (tallo) que estaacutedividida en 10 partes con 2 marcas 1 (parte final del bulbo) y 05 (a la mitaddel tallo) Se le acopla a su extremo superior 1 tubo de goma y una bombillapara aspirar
6122 Diluyente de gloacutebulos blancos Solucioacuten de Turk al 1
6123 Contador manual (Soacutelo si fuera necesario)
6124 Papel filtro
613 Procedimiento
6131 Una vez obtenida la sangre con anticoagulante o sangre capilar deldedo se procede a aspirar la sangre con la pipeta de gloacutebulos blancoshasta la marca de 05 y a limpiar la punta con papel absorbente
6132 Introducir la pipeta en el tubo que contenga solucioacuten de Turk y absorberhasta la marca de 11 (no debe haber burbujas)
6133 Tapar ambos extremos y proceder a mezclar manualmente o en unrotador automaacutetico por 2 oacute 3 minutos
6134 Monte la laminilla de vidrio en la caacutemara para recuento que debe estarlimpia y seca
6135 Agitar la pipeta y descartar las cuatro primeras gotas para luego colocaruna gota pequentildea de esta solucioacuten en la caacutemara
6136 Deje reposar por espacio de 3 minutos para que las ceacutelulas se sedimenten
6137 Enfocar con objetivo de 10x y contar en 4 cuadrados grandes angularesCuando se usa la pipeta automaacutetica se toma 20 mL (002 mL) desangre total con anticoagulante o sangre capilar con anticoagulante yse diluye en un tubo que contenga 380 mL de solucioacuten de Turk (aquiacutetenemos una dilucioacuten 120)
LECTURA
Fig 13
La lectura se realiza en los campos 1 3 7 y 9 como estaacute indicado en la figuraAdemaacutes de los leucocitos contados dentro de cada uno de los cuadrantes sedeben contar todos los leucocitos que se encuentren adheridos en la liacuteneahorizontal superior y vertical exterior o de lo contrario todos los leucocitosadheridos a la liacutenea horizontal inferior y vertical interior
614 Resultados
Nordm de leucocitos x mm3 = leucocitos contados en 4 camposdividealtura x dilucioacuten x aacuterea
Reemplazando = leucocitos contados en 4 camposdivide110 x 120 x 4=
Leucocitos contados en 4 camposdivide4200=
X1 divide4200= Nordm leucocitos contados x 50
615 Valores de referencia
5000 - 10 000 leucocitos mm3
616 Correccioacuten de valores para restar eritrocitos nucleados
Los normoblastos no se destruyen (lisis) en el liacutequido de dilucioacuten por lo tantopueden observarse al realizar el recuento leucocitario y confundirse con losleucocitos de tal manera que se debe emplear la siguiente foacutermula
Caacutelculo
La concentracioacuten del nuacutemero de normoblastos (por litro) esNuacutemero de normoblatos contados x concentracioacuten o nuacutemero de leucocitos100 + Nordm de normoblastos contados
Ejemplo
Si se cuentan 50 normoblastos y la concentracioacuten del nuacutemero de leucocitos es16 x 109l la concentracioacuten del nuacutemero de normoblastos seraacute
50 x16 = 53 x 109l
100 + 50
y la concentracioacuten de leucocitos corregida seraacute 16 - 53 = 107 x 109lEn unidades tradicionales las concentraciones de normoblastos y leucocitosse expresan por miliacutemetro cuacutebico En tales unidades el caacutelculo correspondienteal ejemplo que se ha dado seriacutea
50 x 16 000 = 5300 mm3
100 + 50
Recuento corregido de gloacutebulos blancos o leucocitos = 16 000 - 5300 = 10 700 mm3
Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2
62 RECUENTO DE GLOacuteBULOS ROJOS
Principio
La sangre se diluye en un liacutequido que nos permite observar claramente loshematiacutees luego esta dilucioacuten se coloca en una caacutemara de Neubauer con laayuda de una pipeta automaacutetica o pipeta Pasteur y se cuentan en el microscopioa un objetivo de 40x para calcular el nuacutemero de gloacutebulos rojos por mm3
621 Equipos
- Microscopio
- Hemocitoacutemetro (caacutemara de Neubauer)
622 Materiales y reactivos requeridos
6221 Pipeta de gloacutebulos rojos (De Thoma) o pipeta automaacutetica (de 0-100 mL)
Presenta cerca del extremo superior una marca de 101 inmediatamentecontinuacutea una dilatacioacuten (bulbo) que contiene una perla roja mezcladoraluego sigue el tallo (extremo maacutes largo) el cual estaacute dividido en 10 partescon 2 marcas 1 acabando el bulbo y 05 a la mitad del tallo Se requiereigual que el recuento de leucocitos una boquilla para aspirar
6222 Diluyente de gloacutebulos rojos Cloruro de Sodio al 09 (ver anexo)
Diluyente de Hayem (ver anexo)
6223 Contador manual (soacutelo si fuera necesario)
6224 Papel filtro
623 Procedimiento
6231 Mezclar la sangre obtenida con el anticoagulante o tomar sangre capilar
6232 Llenar la pipeta de gloacutebulos rojos con sangre hasta la marca de 05para realizar una dilucioacuten de 1200 y si se carga hasta 1 la dilucioacutenseraacute 1100 Limpiar la punta con gasa o papel absorbente
6233 Introducir la pipeta en el tubo o frasquito conteniendo diluyente (Hayem)y llenar de liacutequido de dilucioacuten hasta la marca de 101
6234 Se coloca en un rotador automaacutetico o se hace rotar manualmente de2 a 3 minutos
6235 Agitar bien la pipeta y descartar 3 a 4 gotas del tallo luego colocar unagota pequentildea cerca de un extremo de la caacutemara para que por capilaridadse llene exactamente
6236 Hacer el recuento con objetivo de 40xSe puede realizar con la pipeta automaacutetica se toma 20 mL (002mL)de sangre total con anticoagulante o sangre capilar y se deposita enun tubo de 12 x 75 que contenga 4 mL de solucioacuten de Hayem (aquiacute setiene una dilucioacuten de 1200) Se deja reposar aproximadamente 5minutos y se procede a cargar la caacutemara con la misma pipeta usandoun nuevo tip El inconveniente aquiacute es el gasto de reactivo (4 mL) perolas medidas son mas exactas
6237 Dejar en reposo por 3 minutos
6238 Enfocar la cuadriacutecula a 10x luego con el objetivo de 40x contar sobreel cuadrado grande central de la caacutemara soacutelo en 5 cuadrados pequentildeosuno central y cuatro angulares (80 cuadraditos en total)
6239 En el recuento se incluyen las ceacutelulas que cubren o tocan por dentroo por fuera las liacuteneas limitantes superior e izquierda en el cuadradopequentildeo de recuento y no se consideran los correspondientes a losliacutemites inferior y derechoSe hace el recuento en los puntos ABCD y Ey se sigue los mismos paraacutemetros del recuento de leucocitos
LECTURA
Fig 14
624 Resultados
Nordm de hematiacutees x mm3 = hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeosaltura x dilucioacuten X aacuterea
Reemplazando = hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeos110 x 1200 x 15
= hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeos divide 110 000
= hematiacutees contados x 10 000
625 Valores de referencia
(Unidades tradicionales millones de ceacutelulasmm3)
Hombres 4 500 000 - 5 500 000
Mujeres 4 000 000 - 5 000 000
Nintildeos (4 antildeos) 4 200 000 - 5 200 000
Lactantes (1 - 6 meses) 3 800 000 - 5 200 000
Recieacuten nacidos 5 000 000 - 6 000 000
Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2
63 DETERMINACIOacuteN DEL VOLUMEN GLOBULAR (Hematocrito)
Mide la fraccioacuten que comprende a los gloacutebulos rojos (masa globular) respectoal
volumen total de la muestra de sangre venosa o capilar Puede expresarseen
porcentaje o como valor decimal
Hto= altura de la columna de gloacutebulos rojosdivide altura de la columna de sangre
total(gloacutebulos rojos maacutes plasma)
631 Meacutetodo de Wintrobe
Materiales requeridos
- Tubo de Wintrobe graduado de 0 - 100 mm
- Pipetas Pasteur o pipetas de transferencia
- Tapoacuten de goma
Procedimiento
diams Llenar la sangre extraiacuteda con anticoagulante con una pipeta pasteur
comenzandodesde el fondo hasta la marca superior de 100 mm teniendocuidado
de no provocar espuma
diams Tapar el tubo con un tapoacuten de goma para evitar la evaporacioacuten
diams Centrifugar a 3000 rpm por 30 minutos
Resultados (lectura)
Del tubo graduado se mide directamente el nivel de la columna de gloacutebulosrojos
Valores de referencia
Hombres 40 - 54Mujeres 38 - 48
Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2
632 Meacutetodo de microhematocrito
Materiales requeridos
- Capilares rojos y azules (75 mm x 15 mm)
- Plastilina
Procedimiento
diams Tomar la muestra en capilares rojos heparinizados directamente del pulpejodel
dedo o utilizar capilares azules sin heparina para sangre venosacon
anticoagulante de Wintrobe o EDTA Debe llenarse aproximadamente70 - 80
del capilar
diams Ocluir (tapar) un extremo del capilar con plastilina
diams Colocar el capilar sobre la plataforma del cabezal de una centriacutefuga demicrohematocrito con el extremo ocluido adherido al reborde externo de laplataforma
diams Centrifugar por 5 minutos entre 10 000 - 12 000 rpm
Resultados (lectura)
La lectura se realiza con una escala estandarizada que expenden en el comercio
Uso de la escala
diams Sostenga el tubo frente a la escala de manera que el fondo de la columnade eritrocitos (no el extremo inferior del tubo) quede exactamente al mismonivel de la liacutenea horizontal correspondiente al cero
diams Desplace el tubo a traveacutes de la escala hasta que la liacutenea marcada con elnuacutemero 10 quede al nivel del tope de la columna de plasma Vigile que elfondo de la
columna de eritrocitos continuacutee sobre la liacutenea cero El tubodebe encontrarse completamente en posicioacuten vertical
diams La liacutenea que pase al nivel del tope de la columna de eritrocitos indicaraacute lafraccioacuten de volumen de eacutestos
Valores de referencia
Hombres 40 - 50
Mujeres 38 - 44
Nintildeos (5 antildeos) 38 - 44
Lactantes (3 meses) 37 - 42
Recieacuten nacidos 50 - 58
La disposicioacuten celular esParte superior una columna de plasmaEn la interfase estaacuten los leucocitos yplaquetasParte inferior estaacute la columna deeritrocitos (Fig 15)
64 DOSAJE DE HEMOGLOBINA
Principio
La sangre se diluye en liacutequido de Drabkin el cual hemoliza los hematiacutees yconvierte la hemoglobina en cianometahemoglobina (cianuro de hemiglobina)La solucioacuten que se produce se lee por medio de un espectrofotoacutemetro ofotocoloriacutemetro Su grado de absorbancia es proporcional a la cantidad dehemoglobina que contenga la sangre
641 Materiales y reactivos
6411 Un coloriacutemetro fotoeleacutectrico o un espectrofotoacutemetro
6412 Pipetas
diams Una pipeta para sangre (pipeta de Sahli) graduada hasta 002 mL contubo de goma y boquilla
diams Una pipeta de vidrio graduada de 5 mL
6413 Tubos de ensayo
6414 Reactivo de Drabkin para dilucioacuten
Este reactivo se puede adquirir en tabletas o polvos para disolver en 1litro de agua destilada Si se dispone de una balanza analiacutetica la preparacioacutense puede hacer en el laboratorio Esta solucioacuten se puedeconservar durante un mes en un frasco de vidrio oscuro Deseacutechese sise enturbia
EXTRACCIOacuteN DE SANGRE CAPILAR
Fig 10
Fig 11
SECCIOacuteN 4
ANTICOAGULANTES
Una vez extraiacuteda la sangre eacutesta puede conservarse coagulada o
mantenidaincoagulable mediante la adicioacuten de un anticoagulante
41 CARACTERIacuteSTICAS BAacuteSICAS DE LOS ANTICOAGULANTES MAacuteS
USADOSEN HEMATOLOGIacuteA
bull No alterar el tamantildeo de los hematiacutees
bull No producir hemoacutelisis
bull Evitar al maacuteximo la agregacioacuten plaquetaria
bull No alterar la morfologiacutea de los leucocitos
La sangre tratada con anticoagulante debe procesarse lo antes posible
inclusomantenida bajo refrigeracioacuten (4 ordmC) si no pasan de las 2 horas El
tiempomaacuteximo entre la extraccioacuten de la sangre y su procesamiento depende
delcoagulante de eleccioacuten y no debe ser maacutes de 4 horas a excepcioacuten
delanticoagulante EDTA (etilendiaminotetraceacutetico) que puede ser hasta 24
horas(en refrigeracioacuten a 4 ordmC)
Los anticoagulantes pueden emplearse en forma soacutelida o liacutequida Los
primerosestaacuten indicados para la determinacioacuten de los paraacutemetros
hematoloacutegicosya que no producen como los anticoagulantes liacutequidos dilucioacuten de
la sangre
42 ANTICOAGULANTES SOacuteLIDOS
421 EDTA
Es la sal disoacutedica o tripotaacutesica del aacutecido etilendiaminotetraceacutetico La saldisoacutedica
(Na2EDTA) es menos soluble que la sal tripotaacutesica (K3EDTA) Estoscompuestos
realizan su accioacuten a traveacutes de un efecto quelante sobre el calcioal fijarlo impiden
su activacioacuten y por ende la coagulacioacuten sanguiacutenea
4211 Ventajas
bull Respeta la morfologiacutea eritrocitaria (especialmente la sal tripotaacutesica) yleucocitaria de manera que permite una demora de dos horas en la realizacioacutendel frotis sanguiacuteneo despueacutes de la extraccioacuten sanguiacutenea
bull Asegura la conservacioacuten de los elementos formes sanguiacuteneos durante 24horas si la sangre se mantiene a 4 ordmC
bull Al inhibir la aglutinacioacuten de las plaquetas facilita su recuento o su expresioacutensemicuantitativa a partir del frotis
bull La concentracioacuten recomendada de EDTA es de 15 mgmL de sangre Unamayor cantidad de anticoagulante puede producir retraccioacuten celular condisminucioacuten del hematocrito y un aumento de la concentracioacuten media de lahemoglobina Un exceso de sangre con relacioacuten al anticoagulante produceformacioacuten de microagregados que pueden alterar los resultados El empleode tubos al vaciacuteo con una gota (50mL) de EDTA tripotaacutesica comercialpara 5 mL de sangre es de intereacutes praacutectico dado que es cien veces maacutessoluble facilitando la mezcla de sangre con anticoagulante
4212 Desventajas
Usado en exceso afecta a los eritrocitos y a los leucocitos a los cuales les produce encogimiento y cambios en su forma por ello debe cuidarse de agregar la cantidad correcta de sangre al anticoagulante
422 Anticoagulante de Wintrobe
Es una mezcla de oxalato de amonio y potasio Actuacutea por precipitacioacuten del calcio es faacutecil de preparar Se emplea en forma de polvo en proporcioacuten de 2 de oxalato de amonio por 1 de oxalato de potasio La cantidad recomendada es de 2 mg x mL de sangre Este anticoagulante no afecta el volumen globular medio y puede usarse para determinaciones de hemoglobina hematocrito y recuento globular pero para los extendidos queda limitada a los primeros minutos tampoco es uacutetil para el recuento plaquetario porque produce formacioacuten de agregados plaquetarios
423 Heparina
El nombre de heparina proviene del griego hepar que significa hiacutegado ya que fue aislado por primera vez de las ceacutelulas de este tejido Es un mucopolisacaacuterido aacutecido Presenta el
inconveniente de que si no se agita raacutepidamente con la sangre despueacutes de extraiacuteda
pueden formarse microcoaacutegulos aunque no altera el volumeneritrocitario ni la morfologiacutea de los leucocitos No es recomendablepara el frotis sanguiacuteneo porque produce un fondo azul en la laacutemina
La heparina de sodio o litio puede usarse en forma soacutelida o liacutequida en
proporcioacutende 01 - 02 mg de heparina por 1 mL de sangre
43 ANTICOAGULANTES LIacuteQUIDOS
431 Citrato trisoacutedico
Es de eleccioacuten para las pruebas de hemostasia y la velocidad de sedimentacioacuten
Actuacutea a traveacutes de la precipitacioacuten del calcio La concentracioacuten depende de
la prueba por realizar
bull Para pruebas de hemostasia se emplea en proporcioacuten de 1 9 (05 mL
deanticoagulante para 45 mL de sangre total)
bull Para la determinacioacuten de la VSG (Velocidad de Sedimentacioacuten Globular) es14
(05 mL de anticoagulante para 2 mL de sangre)
432 Oxalato soacutedico
Recomendado tambieacuten para las pruebas de hemostasia Se emplea en
proporcioacutende un volumen de anticoagulante para 4 vol de sangre
SECCIOacuteN 5
REALIZACIOacuteN Y TINCIOacuteN DEL FROTIS SANGUIacuteNEO
La praacutectica del frotis sanguiacuteneo tambieacuten llamado extendido es de gran importanciaen hematologiacutea ya que el diagnoacutestico de muchas enfermedadeshematoloacutegicas puede realizarse con soacutelo observar las caracteriacutesticasmorfoloacutegicas de las ceacutelulas sanguiacuteneas de manera que eacuteste no debe serexcesivamente grueso ni excesivamente fino Todas las laacuteminas por usarsobre todo nuevas deben ser limpiadas con algodoacuten y alcohol al 70 paraeliminar la grasa que viene adherida
51 MEacuteTODO DE LOS DOS PORTAOBJETOS
511 Materiales
- Alcohol al 70
- Algodoacuten
- Lanceta descartable
- Portaobjetos de vidrios limpios y desgrasados (25 x 75 mm)
512 Fundamento
Consiste en la extensioacuten de una gota de sangre sobre un portaobjeto (25 x 75)empleando el canto biselado de otro portaobjeto de igual dimensioacuten (Fig 12)
513 Procedimiento
5131 Una vez extraiacuteda la sangre con cualquiera de las metodologiacuteas secoloca una pequentildea gota de sangre (5mL) (aprox 3 mm de diaacutemetro)sobre un portaobjeto a 2 cm aproximadamente de uno de los extremos
5132 Colocar el canto de otro portaobjeto esmerilado sobre la superficiedel primer portaobjeto (en la que se encuentra la gota de sangre)formando un aacutengulo de 45ordm
5134 Deslizar suavemente y a velocidad moderada el portaobjeto sobre elotro en sentido longitudinal hasta que la gota de sangre quede bienextendida sobre la
superficie del primer portaobjeto El grosor delfrotis sanguiacuteneo puede variar seguacuten sea el aacutengulo que formen entresiacute ambos portaobjetos Asiacute si es superior a 45ordm la extensioacuten obtenidaseraacute gruesa y corta si es inferior a 45ordm seraacute larga y fina El secado delfrotis es a temperatura ambiente y en posicioacuten horizontal
Fig 12
1048729 Zona excesivamente gruesa Se halla en la regioacuten inmediata al punto departida de la extensioacuten (cabeza) En ella se aprecia siempre un aumento delinfocitos
1048729 Zona excesivamente fina Corresponde al final de la extensioacuten y termina enun aacuterea donde las ceacutelulas adoptan una posicioacuten acartonada (barbas) Enesta regioacuten existe un exceso de granulocitos y monocitos
1048729 Zona ideal Corresponde a la regioacuten intermedia del frotis y en ella existe unreparto equilibrado de ceacutelulas
52 COLORACIONES USADAS
Una vez seco el frotis se procede a la tincioacuten hematoloacutegica con el colorante deRomanowsky constituido por la mezcla de eosina y azul de metileno Dentrode eacutestas tenemos
521 Colorante de Giemsa
522 Colorante de May-Grunwald
523 Colorante de Wright
524 Colorante de Leishman
Preparacioacuten de colorantes (Anexo A)
1048729 Para el estudio de las ceacutelulas sanguiacuteneas utilizar el colorante 523 y 524
1048729 Para el estudio de hemoparaacutesitos utilizar el colorante 521
1048729 Utilizar el colorante 522 para casos especiales en que se desee observar
con mayor claridad y especificidad los graacutenulos de los neutrofilos
53 TINCIOacuteN CON COLORANTE DE WRIGHT
531 Fundamento
El colorante de Wright va a permitir suministrar un medio para estudiar lasangre y determinar las variaciones y anormalidades de estructura forma ytamantildeo de los eritrocitos su contenido de hemoglobina y sus propiedades decoloracioacuten La informacioacuten obtenida de un frotis de sangre perifeacuterica dependeen gran parte de la calidad del extendido y la coloracioacuten
532 Materiales
5321 Colorante de Wright (Anexo A)
5322 Frasco gotero
5323 Solucioacuten amortiguada tamponada (Anexo A)
533 Procedimiento
5331 Una vez obtenido el frotis sanguiacuteneo se le dejaraacute secar entre 15 y 20minutos
5332 Luego se coloca la preparacioacuten en un soporte y se cubre con el colorantede Wright dejaacutendolo por espacio de 5 minutos
5333 Posteriormente se antildeade solucioacuten amortiguada tamponada en partesiguales hasta obtener un brillo metaacutelico dejando 6 minutos adicionales
5334 Finalmente se lava con agua corriente y se deja secar
5335 Se coloca en el microscopio y con pequentildeo aumento se revisa lacalidad de la coloracioacuten la cantidad aproximada de gloacutebulos blancosy se escoge el sitio para iniciar el recuento Se coloca una gota deaceite de inmersioacuten y se enfoca a un aumento de 100xLa forma de los gloacutebulos rojos se examinaraacute detenidamente observandoademaacutes del color (cantidad de hemoglobina) presencia deplaquetas su agrupacioacuten y distribucioacuten
5336 Posteriormente se hace el recuento diferencial de gloacutebulos blancosen 100
ceacutelulas para lo cual se deberaacute conocer las diferencias entreneutroacutefilos eosinoacutefilos
linfocitos y monocitosUna extensioacuten de sangre bien tentildeida debe caracterizarse
por unabuena diferenciacioacuten de las estructuras subcelulares en los leucocitosuna
coloracioacuten rosada de los hematiacutees y la ausencia de precipitados
Los defectos maacutes frecuentes observados en la tincioacuten del frotis sanguiacuteneoson
Coloracioacuten excesivamente azul debido a
1048729 Frotis excesivamente grueso
1048729 Lavado insuficiente
1048729 Tincioacuten muy prolongada
1048729 Empleo de colorante excesivamente alcalino
Coloracioacuten con una tonalidad rosada
1048729 El colorante el tampoacuten o el agua de lavado tienen un pH demasiadoaacutecido
Presencia de precipitados
1048729 Obedecen a una accioacuten excesiva del colorante Esto se puede evitarcon la
filtracioacuten
SECCIOacuteN 6
HEMOGRAMA-HEMOGLOBINA-HEMATOCRITO
El hemograma de Shilling constituye uno de los exaacutemenes de laboratorio
maacutesusados en el campo de la hematologiacutea Comprende las siguientes pruebas
61 RECUENTO LEUCOCITARIO
Principio
La sangre anticoagulada se deposita en un liacutequido que permite evidenciar
losleucocitos mantenieacutendolos visibles mientras que los eritrocitos
sonhemolizados El recuento del nuacutemero de leucocitos o gloacutebulos blancos se
expresapor mm3 (miliacutemetro cuacutebico)
611 Equipos
- Microscopio
- Hemocitoacutemetro (Caacutemara de Neubauer)
Consta de los siguientes elementos
diams Una laacutemina portaobjeto gruesa en el centro se hallan dos
superficiescuadriculadas iguales separadas del resto de la laacutemina por surcos y
dosbarras transversales algo maacutes elevadas
diams Una laminilla cubreobjetos oacutepticamente plana que al colocarse sobrelas barras
elevadas de la laacutemina forma una caacutemara entre el cubreobjetosy la superficie
cuadriculadaLa altura entre el cubreobjetos y la laacutemina portaobjetos es de 01
mmCada cuadriacutecula mide 3 mm de lado y se divide en 9 cuadrados grandesCada
uno de los cuales mide 1 mm2 de superficie que se subdivide a suvez en 16
cuadrados medianos El cuadrado grande central se divide en25 cuadrados
pequentildeos y cada uno de ellos en 16 cuadraditos Cadacuadrado pequentildeo mide
02 mm de lado (004 mm2 de superficie) y cadacuadradito mide 005 mm de lado
(00025 mm2 de superficie)
612 Materiales y reactivos requeridos
6121 Pipeta de gloacutebulos blancos (De Thoma) o pipeta automaacutetica (de 0 a 100 mL)Presenta cerca del extremo superior una marca de 11 inmediatamentecontinuacutea una dilatacioacuten (bulbo) que contiene una perla que funciona comomezcladora luego sigue el extremo maacutes largo de la pipeta (tallo) que estaacutedividida en 10 partes con 2 marcas 1 (parte final del bulbo) y 05 (a la mitaddel tallo) Se le acopla a su extremo superior 1 tubo de goma y una bombillapara aspirar
6122 Diluyente de gloacutebulos blancos Solucioacuten de Turk al 1
6123 Contador manual (Soacutelo si fuera necesario)
6124 Papel filtro
613 Procedimiento
6131 Una vez obtenida la sangre con anticoagulante o sangre capilar deldedo se procede a aspirar la sangre con la pipeta de gloacutebulos blancoshasta la marca de 05 y a limpiar la punta con papel absorbente
6132 Introducir la pipeta en el tubo que contenga solucioacuten de Turk y absorberhasta la marca de 11 (no debe haber burbujas)
6133 Tapar ambos extremos y proceder a mezclar manualmente o en unrotador automaacutetico por 2 oacute 3 minutos
6134 Monte la laminilla de vidrio en la caacutemara para recuento que debe estarlimpia y seca
6135 Agitar la pipeta y descartar las cuatro primeras gotas para luego colocaruna gota pequentildea de esta solucioacuten en la caacutemara
6136 Deje reposar por espacio de 3 minutos para que las ceacutelulas se sedimenten
6137 Enfocar con objetivo de 10x y contar en 4 cuadrados grandes angularesCuando se usa la pipeta automaacutetica se toma 20 mL (002 mL) desangre total con anticoagulante o sangre capilar con anticoagulante yse diluye en un tubo que contenga 380 mL de solucioacuten de Turk (aquiacutetenemos una dilucioacuten 120)
LECTURA
Fig 13
La lectura se realiza en los campos 1 3 7 y 9 como estaacute indicado en la figuraAdemaacutes de los leucocitos contados dentro de cada uno de los cuadrantes sedeben contar todos los leucocitos que se encuentren adheridos en la liacuteneahorizontal superior y vertical exterior o de lo contrario todos los leucocitosadheridos a la liacutenea horizontal inferior y vertical interior
614 Resultados
Nordm de leucocitos x mm3 = leucocitos contados en 4 camposdividealtura x dilucioacuten x aacuterea
Reemplazando = leucocitos contados en 4 camposdivide110 x 120 x 4=
Leucocitos contados en 4 camposdivide4200=
X1 divide4200= Nordm leucocitos contados x 50
615 Valores de referencia
5000 - 10 000 leucocitos mm3
616 Correccioacuten de valores para restar eritrocitos nucleados
Los normoblastos no se destruyen (lisis) en el liacutequido de dilucioacuten por lo tantopueden observarse al realizar el recuento leucocitario y confundirse con losleucocitos de tal manera que se debe emplear la siguiente foacutermula
Caacutelculo
La concentracioacuten del nuacutemero de normoblastos (por litro) esNuacutemero de normoblatos contados x concentracioacuten o nuacutemero de leucocitos100 + Nordm de normoblastos contados
Ejemplo
Si se cuentan 50 normoblastos y la concentracioacuten del nuacutemero de leucocitos es16 x 109l la concentracioacuten del nuacutemero de normoblastos seraacute
50 x16 = 53 x 109l
100 + 50
y la concentracioacuten de leucocitos corregida seraacute 16 - 53 = 107 x 109lEn unidades tradicionales las concentraciones de normoblastos y leucocitosse expresan por miliacutemetro cuacutebico En tales unidades el caacutelculo correspondienteal ejemplo que se ha dado seriacutea
50 x 16 000 = 5300 mm3
100 + 50
Recuento corregido de gloacutebulos blancos o leucocitos = 16 000 - 5300 = 10 700 mm3
Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2
62 RECUENTO DE GLOacuteBULOS ROJOS
Principio
La sangre se diluye en un liacutequido que nos permite observar claramente loshematiacutees luego esta dilucioacuten se coloca en una caacutemara de Neubauer con laayuda de una pipeta automaacutetica o pipeta Pasteur y se cuentan en el microscopioa un objetivo de 40x para calcular el nuacutemero de gloacutebulos rojos por mm3
621 Equipos
- Microscopio
- Hemocitoacutemetro (caacutemara de Neubauer)
622 Materiales y reactivos requeridos
6221 Pipeta de gloacutebulos rojos (De Thoma) o pipeta automaacutetica (de 0-100 mL)
Presenta cerca del extremo superior una marca de 101 inmediatamentecontinuacutea una dilatacioacuten (bulbo) que contiene una perla roja mezcladoraluego sigue el tallo (extremo maacutes largo) el cual estaacute dividido en 10 partescon 2 marcas 1 acabando el bulbo y 05 a la mitad del tallo Se requiereigual que el recuento de leucocitos una boquilla para aspirar
6222 Diluyente de gloacutebulos rojos Cloruro de Sodio al 09 (ver anexo)
Diluyente de Hayem (ver anexo)
6223 Contador manual (soacutelo si fuera necesario)
6224 Papel filtro
623 Procedimiento
6231 Mezclar la sangre obtenida con el anticoagulante o tomar sangre capilar
6232 Llenar la pipeta de gloacutebulos rojos con sangre hasta la marca de 05para realizar una dilucioacuten de 1200 y si se carga hasta 1 la dilucioacutenseraacute 1100 Limpiar la punta con gasa o papel absorbente
6233 Introducir la pipeta en el tubo o frasquito conteniendo diluyente (Hayem)y llenar de liacutequido de dilucioacuten hasta la marca de 101
6234 Se coloca en un rotador automaacutetico o se hace rotar manualmente de2 a 3 minutos
6235 Agitar bien la pipeta y descartar 3 a 4 gotas del tallo luego colocar unagota pequentildea cerca de un extremo de la caacutemara para que por capilaridadse llene exactamente
6236 Hacer el recuento con objetivo de 40xSe puede realizar con la pipeta automaacutetica se toma 20 mL (002mL)de sangre total con anticoagulante o sangre capilar y se deposita enun tubo de 12 x 75 que contenga 4 mL de solucioacuten de Hayem (aquiacute setiene una dilucioacuten de 1200) Se deja reposar aproximadamente 5minutos y se procede a cargar la caacutemara con la misma pipeta usandoun nuevo tip El inconveniente aquiacute es el gasto de reactivo (4 mL) perolas medidas son mas exactas
6237 Dejar en reposo por 3 minutos
6238 Enfocar la cuadriacutecula a 10x luego con el objetivo de 40x contar sobreel cuadrado grande central de la caacutemara soacutelo en 5 cuadrados pequentildeosuno central y cuatro angulares (80 cuadraditos en total)
6239 En el recuento se incluyen las ceacutelulas que cubren o tocan por dentroo por fuera las liacuteneas limitantes superior e izquierda en el cuadradopequentildeo de recuento y no se consideran los correspondientes a losliacutemites inferior y derechoSe hace el recuento en los puntos ABCD y Ey se sigue los mismos paraacutemetros del recuento de leucocitos
LECTURA
Fig 14
624 Resultados
Nordm de hematiacutees x mm3 = hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeosaltura x dilucioacuten X aacuterea
Reemplazando = hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeos110 x 1200 x 15
= hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeos divide 110 000
= hematiacutees contados x 10 000
625 Valores de referencia
(Unidades tradicionales millones de ceacutelulasmm3)
Hombres 4 500 000 - 5 500 000
Mujeres 4 000 000 - 5 000 000
Nintildeos (4 antildeos) 4 200 000 - 5 200 000
Lactantes (1 - 6 meses) 3 800 000 - 5 200 000
Recieacuten nacidos 5 000 000 - 6 000 000
Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2
63 DETERMINACIOacuteN DEL VOLUMEN GLOBULAR (Hematocrito)
Mide la fraccioacuten que comprende a los gloacutebulos rojos (masa globular) respectoal
volumen total de la muestra de sangre venosa o capilar Puede expresarseen
porcentaje o como valor decimal
Hto= altura de la columna de gloacutebulos rojosdivide altura de la columna de sangre
total(gloacutebulos rojos maacutes plasma)
631 Meacutetodo de Wintrobe
Materiales requeridos
- Tubo de Wintrobe graduado de 0 - 100 mm
- Pipetas Pasteur o pipetas de transferencia
- Tapoacuten de goma
Procedimiento
diams Llenar la sangre extraiacuteda con anticoagulante con una pipeta pasteur
comenzandodesde el fondo hasta la marca superior de 100 mm teniendocuidado
de no provocar espuma
diams Tapar el tubo con un tapoacuten de goma para evitar la evaporacioacuten
diams Centrifugar a 3000 rpm por 30 minutos
Resultados (lectura)
Del tubo graduado se mide directamente el nivel de la columna de gloacutebulosrojos
Valores de referencia
Hombres 40 - 54Mujeres 38 - 48
Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2
632 Meacutetodo de microhematocrito
Materiales requeridos
- Capilares rojos y azules (75 mm x 15 mm)
- Plastilina
Procedimiento
diams Tomar la muestra en capilares rojos heparinizados directamente del pulpejodel
dedo o utilizar capilares azules sin heparina para sangre venosacon
anticoagulante de Wintrobe o EDTA Debe llenarse aproximadamente70 - 80
del capilar
diams Ocluir (tapar) un extremo del capilar con plastilina
diams Colocar el capilar sobre la plataforma del cabezal de una centriacutefuga demicrohematocrito con el extremo ocluido adherido al reborde externo de laplataforma
diams Centrifugar por 5 minutos entre 10 000 - 12 000 rpm
Resultados (lectura)
La lectura se realiza con una escala estandarizada que expenden en el comercio
Uso de la escala
diams Sostenga el tubo frente a la escala de manera que el fondo de la columnade eritrocitos (no el extremo inferior del tubo) quede exactamente al mismonivel de la liacutenea horizontal correspondiente al cero
diams Desplace el tubo a traveacutes de la escala hasta que la liacutenea marcada con elnuacutemero 10 quede al nivel del tope de la columna de plasma Vigile que elfondo de la
columna de eritrocitos continuacutee sobre la liacutenea cero El tubodebe encontrarse completamente en posicioacuten vertical
diams La liacutenea que pase al nivel del tope de la columna de eritrocitos indicaraacute lafraccioacuten de volumen de eacutestos
Valores de referencia
Hombres 40 - 50
Mujeres 38 - 44
Nintildeos (5 antildeos) 38 - 44
Lactantes (3 meses) 37 - 42
Recieacuten nacidos 50 - 58
La disposicioacuten celular esParte superior una columna de plasmaEn la interfase estaacuten los leucocitos yplaquetasParte inferior estaacute la columna deeritrocitos (Fig 15)
64 DOSAJE DE HEMOGLOBINA
Principio
La sangre se diluye en liacutequido de Drabkin el cual hemoliza los hematiacutees yconvierte la hemoglobina en cianometahemoglobina (cianuro de hemiglobina)La solucioacuten que se produce se lee por medio de un espectrofotoacutemetro ofotocoloriacutemetro Su grado de absorbancia es proporcional a la cantidad dehemoglobina que contenga la sangre
641 Materiales y reactivos
6411 Un coloriacutemetro fotoeleacutectrico o un espectrofotoacutemetro
6412 Pipetas
diams Una pipeta para sangre (pipeta de Sahli) graduada hasta 002 mL contubo de goma y boquilla
diams Una pipeta de vidrio graduada de 5 mL
6413 Tubos de ensayo
6414 Reactivo de Drabkin para dilucioacuten
Este reactivo se puede adquirir en tabletas o polvos para disolver en 1litro de agua destilada Si se dispone de una balanza analiacutetica la preparacioacutense puede hacer en el laboratorio Esta solucioacuten se puedeconservar durante un mes en un frasco de vidrio oscuro Deseacutechese sise enturbia
SECCIOacuteN 4
ANTICOAGULANTES
Una vez extraiacuteda la sangre eacutesta puede conservarse coagulada o
mantenidaincoagulable mediante la adicioacuten de un anticoagulante
41 CARACTERIacuteSTICAS BAacuteSICAS DE LOS ANTICOAGULANTES MAacuteS
USADOSEN HEMATOLOGIacuteA
bull No alterar el tamantildeo de los hematiacutees
bull No producir hemoacutelisis
bull Evitar al maacuteximo la agregacioacuten plaquetaria
bull No alterar la morfologiacutea de los leucocitos
La sangre tratada con anticoagulante debe procesarse lo antes posible
inclusomantenida bajo refrigeracioacuten (4 ordmC) si no pasan de las 2 horas El
tiempomaacuteximo entre la extraccioacuten de la sangre y su procesamiento depende
delcoagulante de eleccioacuten y no debe ser maacutes de 4 horas a excepcioacuten
delanticoagulante EDTA (etilendiaminotetraceacutetico) que puede ser hasta 24
horas(en refrigeracioacuten a 4 ordmC)
Los anticoagulantes pueden emplearse en forma soacutelida o liacutequida Los
primerosestaacuten indicados para la determinacioacuten de los paraacutemetros
hematoloacutegicosya que no producen como los anticoagulantes liacutequidos dilucioacuten de
la sangre
42 ANTICOAGULANTES SOacuteLIDOS
421 EDTA
Es la sal disoacutedica o tripotaacutesica del aacutecido etilendiaminotetraceacutetico La saldisoacutedica
(Na2EDTA) es menos soluble que la sal tripotaacutesica (K3EDTA) Estoscompuestos
realizan su accioacuten a traveacutes de un efecto quelante sobre el calcioal fijarlo impiden
su activacioacuten y por ende la coagulacioacuten sanguiacutenea
4211 Ventajas
bull Respeta la morfologiacutea eritrocitaria (especialmente la sal tripotaacutesica) yleucocitaria de manera que permite una demora de dos horas en la realizacioacutendel frotis sanguiacuteneo despueacutes de la extraccioacuten sanguiacutenea
bull Asegura la conservacioacuten de los elementos formes sanguiacuteneos durante 24horas si la sangre se mantiene a 4 ordmC
bull Al inhibir la aglutinacioacuten de las plaquetas facilita su recuento o su expresioacutensemicuantitativa a partir del frotis
bull La concentracioacuten recomendada de EDTA es de 15 mgmL de sangre Unamayor cantidad de anticoagulante puede producir retraccioacuten celular condisminucioacuten del hematocrito y un aumento de la concentracioacuten media de lahemoglobina Un exceso de sangre con relacioacuten al anticoagulante produceformacioacuten de microagregados que pueden alterar los resultados El empleode tubos al vaciacuteo con una gota (50mL) de EDTA tripotaacutesica comercialpara 5 mL de sangre es de intereacutes praacutectico dado que es cien veces maacutessoluble facilitando la mezcla de sangre con anticoagulante
4212 Desventajas
Usado en exceso afecta a los eritrocitos y a los leucocitos a los cuales les produce encogimiento y cambios en su forma por ello debe cuidarse de agregar la cantidad correcta de sangre al anticoagulante
422 Anticoagulante de Wintrobe
Es una mezcla de oxalato de amonio y potasio Actuacutea por precipitacioacuten del calcio es faacutecil de preparar Se emplea en forma de polvo en proporcioacuten de 2 de oxalato de amonio por 1 de oxalato de potasio La cantidad recomendada es de 2 mg x mL de sangre Este anticoagulante no afecta el volumen globular medio y puede usarse para determinaciones de hemoglobina hematocrito y recuento globular pero para los extendidos queda limitada a los primeros minutos tampoco es uacutetil para el recuento plaquetario porque produce formacioacuten de agregados plaquetarios
423 Heparina
El nombre de heparina proviene del griego hepar que significa hiacutegado ya que fue aislado por primera vez de las ceacutelulas de este tejido Es un mucopolisacaacuterido aacutecido Presenta el
inconveniente de que si no se agita raacutepidamente con la sangre despueacutes de extraiacuteda
pueden formarse microcoaacutegulos aunque no altera el volumeneritrocitario ni la morfologiacutea de los leucocitos No es recomendablepara el frotis sanguiacuteneo porque produce un fondo azul en la laacutemina
La heparina de sodio o litio puede usarse en forma soacutelida o liacutequida en
proporcioacutende 01 - 02 mg de heparina por 1 mL de sangre
43 ANTICOAGULANTES LIacuteQUIDOS
431 Citrato trisoacutedico
Es de eleccioacuten para las pruebas de hemostasia y la velocidad de sedimentacioacuten
Actuacutea a traveacutes de la precipitacioacuten del calcio La concentracioacuten depende de
la prueba por realizar
bull Para pruebas de hemostasia se emplea en proporcioacuten de 1 9 (05 mL
deanticoagulante para 45 mL de sangre total)
bull Para la determinacioacuten de la VSG (Velocidad de Sedimentacioacuten Globular) es14
(05 mL de anticoagulante para 2 mL de sangre)
432 Oxalato soacutedico
Recomendado tambieacuten para las pruebas de hemostasia Se emplea en
proporcioacutende un volumen de anticoagulante para 4 vol de sangre
SECCIOacuteN 5
REALIZACIOacuteN Y TINCIOacuteN DEL FROTIS SANGUIacuteNEO
La praacutectica del frotis sanguiacuteneo tambieacuten llamado extendido es de gran importanciaen hematologiacutea ya que el diagnoacutestico de muchas enfermedadeshematoloacutegicas puede realizarse con soacutelo observar las caracteriacutesticasmorfoloacutegicas de las ceacutelulas sanguiacuteneas de manera que eacuteste no debe serexcesivamente grueso ni excesivamente fino Todas las laacuteminas por usarsobre todo nuevas deben ser limpiadas con algodoacuten y alcohol al 70 paraeliminar la grasa que viene adherida
51 MEacuteTODO DE LOS DOS PORTAOBJETOS
511 Materiales
- Alcohol al 70
- Algodoacuten
- Lanceta descartable
- Portaobjetos de vidrios limpios y desgrasados (25 x 75 mm)
512 Fundamento
Consiste en la extensioacuten de una gota de sangre sobre un portaobjeto (25 x 75)empleando el canto biselado de otro portaobjeto de igual dimensioacuten (Fig 12)
513 Procedimiento
5131 Una vez extraiacuteda la sangre con cualquiera de las metodologiacuteas secoloca una pequentildea gota de sangre (5mL) (aprox 3 mm de diaacutemetro)sobre un portaobjeto a 2 cm aproximadamente de uno de los extremos
5132 Colocar el canto de otro portaobjeto esmerilado sobre la superficiedel primer portaobjeto (en la que se encuentra la gota de sangre)formando un aacutengulo de 45ordm
5134 Deslizar suavemente y a velocidad moderada el portaobjeto sobre elotro en sentido longitudinal hasta que la gota de sangre quede bienextendida sobre la
superficie del primer portaobjeto El grosor delfrotis sanguiacuteneo puede variar seguacuten sea el aacutengulo que formen entresiacute ambos portaobjetos Asiacute si es superior a 45ordm la extensioacuten obtenidaseraacute gruesa y corta si es inferior a 45ordm seraacute larga y fina El secado delfrotis es a temperatura ambiente y en posicioacuten horizontal
Fig 12
1048729 Zona excesivamente gruesa Se halla en la regioacuten inmediata al punto departida de la extensioacuten (cabeza) En ella se aprecia siempre un aumento delinfocitos
1048729 Zona excesivamente fina Corresponde al final de la extensioacuten y termina enun aacuterea donde las ceacutelulas adoptan una posicioacuten acartonada (barbas) Enesta regioacuten existe un exceso de granulocitos y monocitos
1048729 Zona ideal Corresponde a la regioacuten intermedia del frotis y en ella existe unreparto equilibrado de ceacutelulas
52 COLORACIONES USADAS
Una vez seco el frotis se procede a la tincioacuten hematoloacutegica con el colorante deRomanowsky constituido por la mezcla de eosina y azul de metileno Dentrode eacutestas tenemos
521 Colorante de Giemsa
522 Colorante de May-Grunwald
523 Colorante de Wright
524 Colorante de Leishman
Preparacioacuten de colorantes (Anexo A)
1048729 Para el estudio de las ceacutelulas sanguiacuteneas utilizar el colorante 523 y 524
1048729 Para el estudio de hemoparaacutesitos utilizar el colorante 521
1048729 Utilizar el colorante 522 para casos especiales en que se desee observar
con mayor claridad y especificidad los graacutenulos de los neutrofilos
53 TINCIOacuteN CON COLORANTE DE WRIGHT
531 Fundamento
El colorante de Wright va a permitir suministrar un medio para estudiar lasangre y determinar las variaciones y anormalidades de estructura forma ytamantildeo de los eritrocitos su contenido de hemoglobina y sus propiedades decoloracioacuten La informacioacuten obtenida de un frotis de sangre perifeacuterica dependeen gran parte de la calidad del extendido y la coloracioacuten
532 Materiales
5321 Colorante de Wright (Anexo A)
5322 Frasco gotero
5323 Solucioacuten amortiguada tamponada (Anexo A)
533 Procedimiento
5331 Una vez obtenido el frotis sanguiacuteneo se le dejaraacute secar entre 15 y 20minutos
5332 Luego se coloca la preparacioacuten en un soporte y se cubre con el colorantede Wright dejaacutendolo por espacio de 5 minutos
5333 Posteriormente se antildeade solucioacuten amortiguada tamponada en partesiguales hasta obtener un brillo metaacutelico dejando 6 minutos adicionales
5334 Finalmente se lava con agua corriente y se deja secar
5335 Se coloca en el microscopio y con pequentildeo aumento se revisa lacalidad de la coloracioacuten la cantidad aproximada de gloacutebulos blancosy se escoge el sitio para iniciar el recuento Se coloca una gota deaceite de inmersioacuten y se enfoca a un aumento de 100xLa forma de los gloacutebulos rojos se examinaraacute detenidamente observandoademaacutes del color (cantidad de hemoglobina) presencia deplaquetas su agrupacioacuten y distribucioacuten
5336 Posteriormente se hace el recuento diferencial de gloacutebulos blancosen 100
ceacutelulas para lo cual se deberaacute conocer las diferencias entreneutroacutefilos eosinoacutefilos
linfocitos y monocitosUna extensioacuten de sangre bien tentildeida debe caracterizarse
por unabuena diferenciacioacuten de las estructuras subcelulares en los leucocitosuna
coloracioacuten rosada de los hematiacutees y la ausencia de precipitados
Los defectos maacutes frecuentes observados en la tincioacuten del frotis sanguiacuteneoson
Coloracioacuten excesivamente azul debido a
1048729 Frotis excesivamente grueso
1048729 Lavado insuficiente
1048729 Tincioacuten muy prolongada
1048729 Empleo de colorante excesivamente alcalino
Coloracioacuten con una tonalidad rosada
1048729 El colorante el tampoacuten o el agua de lavado tienen un pH demasiadoaacutecido
Presencia de precipitados
1048729 Obedecen a una accioacuten excesiva del colorante Esto se puede evitarcon la
filtracioacuten
SECCIOacuteN 6
HEMOGRAMA-HEMOGLOBINA-HEMATOCRITO
El hemograma de Shilling constituye uno de los exaacutemenes de laboratorio
maacutesusados en el campo de la hematologiacutea Comprende las siguientes pruebas
61 RECUENTO LEUCOCITARIO
Principio
La sangre anticoagulada se deposita en un liacutequido que permite evidenciar
losleucocitos mantenieacutendolos visibles mientras que los eritrocitos
sonhemolizados El recuento del nuacutemero de leucocitos o gloacutebulos blancos se
expresapor mm3 (miliacutemetro cuacutebico)
611 Equipos
- Microscopio
- Hemocitoacutemetro (Caacutemara de Neubauer)
Consta de los siguientes elementos
diams Una laacutemina portaobjeto gruesa en el centro se hallan dos
superficiescuadriculadas iguales separadas del resto de la laacutemina por surcos y
dosbarras transversales algo maacutes elevadas
diams Una laminilla cubreobjetos oacutepticamente plana que al colocarse sobrelas barras
elevadas de la laacutemina forma una caacutemara entre el cubreobjetosy la superficie
cuadriculadaLa altura entre el cubreobjetos y la laacutemina portaobjetos es de 01
mmCada cuadriacutecula mide 3 mm de lado y se divide en 9 cuadrados grandesCada
uno de los cuales mide 1 mm2 de superficie que se subdivide a suvez en 16
cuadrados medianos El cuadrado grande central se divide en25 cuadrados
pequentildeos y cada uno de ellos en 16 cuadraditos Cadacuadrado pequentildeo mide
02 mm de lado (004 mm2 de superficie) y cadacuadradito mide 005 mm de lado
(00025 mm2 de superficie)
612 Materiales y reactivos requeridos
6121 Pipeta de gloacutebulos blancos (De Thoma) o pipeta automaacutetica (de 0 a 100 mL)Presenta cerca del extremo superior una marca de 11 inmediatamentecontinuacutea una dilatacioacuten (bulbo) que contiene una perla que funciona comomezcladora luego sigue el extremo maacutes largo de la pipeta (tallo) que estaacutedividida en 10 partes con 2 marcas 1 (parte final del bulbo) y 05 (a la mitaddel tallo) Se le acopla a su extremo superior 1 tubo de goma y una bombillapara aspirar
6122 Diluyente de gloacutebulos blancos Solucioacuten de Turk al 1
6123 Contador manual (Soacutelo si fuera necesario)
6124 Papel filtro
613 Procedimiento
6131 Una vez obtenida la sangre con anticoagulante o sangre capilar deldedo se procede a aspirar la sangre con la pipeta de gloacutebulos blancoshasta la marca de 05 y a limpiar la punta con papel absorbente
6132 Introducir la pipeta en el tubo que contenga solucioacuten de Turk y absorberhasta la marca de 11 (no debe haber burbujas)
6133 Tapar ambos extremos y proceder a mezclar manualmente o en unrotador automaacutetico por 2 oacute 3 minutos
6134 Monte la laminilla de vidrio en la caacutemara para recuento que debe estarlimpia y seca
6135 Agitar la pipeta y descartar las cuatro primeras gotas para luego colocaruna gota pequentildea de esta solucioacuten en la caacutemara
6136 Deje reposar por espacio de 3 minutos para que las ceacutelulas se sedimenten
6137 Enfocar con objetivo de 10x y contar en 4 cuadrados grandes angularesCuando se usa la pipeta automaacutetica se toma 20 mL (002 mL) desangre total con anticoagulante o sangre capilar con anticoagulante yse diluye en un tubo que contenga 380 mL de solucioacuten de Turk (aquiacutetenemos una dilucioacuten 120)
LECTURA
Fig 13
La lectura se realiza en los campos 1 3 7 y 9 como estaacute indicado en la figuraAdemaacutes de los leucocitos contados dentro de cada uno de los cuadrantes sedeben contar todos los leucocitos que se encuentren adheridos en la liacuteneahorizontal superior y vertical exterior o de lo contrario todos los leucocitosadheridos a la liacutenea horizontal inferior y vertical interior
614 Resultados
Nordm de leucocitos x mm3 = leucocitos contados en 4 camposdividealtura x dilucioacuten x aacuterea
Reemplazando = leucocitos contados en 4 camposdivide110 x 120 x 4=
Leucocitos contados en 4 camposdivide4200=
X1 divide4200= Nordm leucocitos contados x 50
615 Valores de referencia
5000 - 10 000 leucocitos mm3
616 Correccioacuten de valores para restar eritrocitos nucleados
Los normoblastos no se destruyen (lisis) en el liacutequido de dilucioacuten por lo tantopueden observarse al realizar el recuento leucocitario y confundirse con losleucocitos de tal manera que se debe emplear la siguiente foacutermula
Caacutelculo
La concentracioacuten del nuacutemero de normoblastos (por litro) esNuacutemero de normoblatos contados x concentracioacuten o nuacutemero de leucocitos100 + Nordm de normoblastos contados
Ejemplo
Si se cuentan 50 normoblastos y la concentracioacuten del nuacutemero de leucocitos es16 x 109l la concentracioacuten del nuacutemero de normoblastos seraacute
50 x16 = 53 x 109l
100 + 50
y la concentracioacuten de leucocitos corregida seraacute 16 - 53 = 107 x 109lEn unidades tradicionales las concentraciones de normoblastos y leucocitosse expresan por miliacutemetro cuacutebico En tales unidades el caacutelculo correspondienteal ejemplo que se ha dado seriacutea
50 x 16 000 = 5300 mm3
100 + 50
Recuento corregido de gloacutebulos blancos o leucocitos = 16 000 - 5300 = 10 700 mm3
Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2
62 RECUENTO DE GLOacuteBULOS ROJOS
Principio
La sangre se diluye en un liacutequido que nos permite observar claramente loshematiacutees luego esta dilucioacuten se coloca en una caacutemara de Neubauer con laayuda de una pipeta automaacutetica o pipeta Pasteur y se cuentan en el microscopioa un objetivo de 40x para calcular el nuacutemero de gloacutebulos rojos por mm3
621 Equipos
- Microscopio
- Hemocitoacutemetro (caacutemara de Neubauer)
622 Materiales y reactivos requeridos
6221 Pipeta de gloacutebulos rojos (De Thoma) o pipeta automaacutetica (de 0-100 mL)
Presenta cerca del extremo superior una marca de 101 inmediatamentecontinuacutea una dilatacioacuten (bulbo) que contiene una perla roja mezcladoraluego sigue el tallo (extremo maacutes largo) el cual estaacute dividido en 10 partescon 2 marcas 1 acabando el bulbo y 05 a la mitad del tallo Se requiereigual que el recuento de leucocitos una boquilla para aspirar
6222 Diluyente de gloacutebulos rojos Cloruro de Sodio al 09 (ver anexo)
Diluyente de Hayem (ver anexo)
6223 Contador manual (soacutelo si fuera necesario)
6224 Papel filtro
623 Procedimiento
6231 Mezclar la sangre obtenida con el anticoagulante o tomar sangre capilar
6232 Llenar la pipeta de gloacutebulos rojos con sangre hasta la marca de 05para realizar una dilucioacuten de 1200 y si se carga hasta 1 la dilucioacutenseraacute 1100 Limpiar la punta con gasa o papel absorbente
6233 Introducir la pipeta en el tubo o frasquito conteniendo diluyente (Hayem)y llenar de liacutequido de dilucioacuten hasta la marca de 101
6234 Se coloca en un rotador automaacutetico o se hace rotar manualmente de2 a 3 minutos
6235 Agitar bien la pipeta y descartar 3 a 4 gotas del tallo luego colocar unagota pequentildea cerca de un extremo de la caacutemara para que por capilaridadse llene exactamente
6236 Hacer el recuento con objetivo de 40xSe puede realizar con la pipeta automaacutetica se toma 20 mL (002mL)de sangre total con anticoagulante o sangre capilar y se deposita enun tubo de 12 x 75 que contenga 4 mL de solucioacuten de Hayem (aquiacute setiene una dilucioacuten de 1200) Se deja reposar aproximadamente 5minutos y se procede a cargar la caacutemara con la misma pipeta usandoun nuevo tip El inconveniente aquiacute es el gasto de reactivo (4 mL) perolas medidas son mas exactas
6237 Dejar en reposo por 3 minutos
6238 Enfocar la cuadriacutecula a 10x luego con el objetivo de 40x contar sobreel cuadrado grande central de la caacutemara soacutelo en 5 cuadrados pequentildeosuno central y cuatro angulares (80 cuadraditos en total)
6239 En el recuento se incluyen las ceacutelulas que cubren o tocan por dentroo por fuera las liacuteneas limitantes superior e izquierda en el cuadradopequentildeo de recuento y no se consideran los correspondientes a losliacutemites inferior y derechoSe hace el recuento en los puntos ABCD y Ey se sigue los mismos paraacutemetros del recuento de leucocitos
LECTURA
Fig 14
624 Resultados
Nordm de hematiacutees x mm3 = hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeosaltura x dilucioacuten X aacuterea
Reemplazando = hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeos110 x 1200 x 15
= hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeos divide 110 000
= hematiacutees contados x 10 000
625 Valores de referencia
(Unidades tradicionales millones de ceacutelulasmm3)
Hombres 4 500 000 - 5 500 000
Mujeres 4 000 000 - 5 000 000
Nintildeos (4 antildeos) 4 200 000 - 5 200 000
Lactantes (1 - 6 meses) 3 800 000 - 5 200 000
Recieacuten nacidos 5 000 000 - 6 000 000
Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2
63 DETERMINACIOacuteN DEL VOLUMEN GLOBULAR (Hematocrito)
Mide la fraccioacuten que comprende a los gloacutebulos rojos (masa globular) respectoal
volumen total de la muestra de sangre venosa o capilar Puede expresarseen
porcentaje o como valor decimal
Hto= altura de la columna de gloacutebulos rojosdivide altura de la columna de sangre
total(gloacutebulos rojos maacutes plasma)
631 Meacutetodo de Wintrobe
Materiales requeridos
- Tubo de Wintrobe graduado de 0 - 100 mm
- Pipetas Pasteur o pipetas de transferencia
- Tapoacuten de goma
Procedimiento
diams Llenar la sangre extraiacuteda con anticoagulante con una pipeta pasteur
comenzandodesde el fondo hasta la marca superior de 100 mm teniendocuidado
de no provocar espuma
diams Tapar el tubo con un tapoacuten de goma para evitar la evaporacioacuten
diams Centrifugar a 3000 rpm por 30 minutos
Resultados (lectura)
Del tubo graduado se mide directamente el nivel de la columna de gloacutebulosrojos
Valores de referencia
Hombres 40 - 54Mujeres 38 - 48
Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2
632 Meacutetodo de microhematocrito
Materiales requeridos
- Capilares rojos y azules (75 mm x 15 mm)
- Plastilina
Procedimiento
diams Tomar la muestra en capilares rojos heparinizados directamente del pulpejodel
dedo o utilizar capilares azules sin heparina para sangre venosacon
anticoagulante de Wintrobe o EDTA Debe llenarse aproximadamente70 - 80
del capilar
diams Ocluir (tapar) un extremo del capilar con plastilina
diams Colocar el capilar sobre la plataforma del cabezal de una centriacutefuga demicrohematocrito con el extremo ocluido adherido al reborde externo de laplataforma
diams Centrifugar por 5 minutos entre 10 000 - 12 000 rpm
Resultados (lectura)
La lectura se realiza con una escala estandarizada que expenden en el comercio
Uso de la escala
diams Sostenga el tubo frente a la escala de manera que el fondo de la columnade eritrocitos (no el extremo inferior del tubo) quede exactamente al mismonivel de la liacutenea horizontal correspondiente al cero
diams Desplace el tubo a traveacutes de la escala hasta que la liacutenea marcada con elnuacutemero 10 quede al nivel del tope de la columna de plasma Vigile que elfondo de la
columna de eritrocitos continuacutee sobre la liacutenea cero El tubodebe encontrarse completamente en posicioacuten vertical
diams La liacutenea que pase al nivel del tope de la columna de eritrocitos indicaraacute lafraccioacuten de volumen de eacutestos
Valores de referencia
Hombres 40 - 50
Mujeres 38 - 44
Nintildeos (5 antildeos) 38 - 44
Lactantes (3 meses) 37 - 42
Recieacuten nacidos 50 - 58
La disposicioacuten celular esParte superior una columna de plasmaEn la interfase estaacuten los leucocitos yplaquetasParte inferior estaacute la columna deeritrocitos (Fig 15)
64 DOSAJE DE HEMOGLOBINA
Principio
La sangre se diluye en liacutequido de Drabkin el cual hemoliza los hematiacutees yconvierte la hemoglobina en cianometahemoglobina (cianuro de hemiglobina)La solucioacuten que se produce se lee por medio de un espectrofotoacutemetro ofotocoloriacutemetro Su grado de absorbancia es proporcional a la cantidad dehemoglobina que contenga la sangre
641 Materiales y reactivos
6411 Un coloriacutemetro fotoeleacutectrico o un espectrofotoacutemetro
6412 Pipetas
diams Una pipeta para sangre (pipeta de Sahli) graduada hasta 002 mL contubo de goma y boquilla
diams Una pipeta de vidrio graduada de 5 mL
6413 Tubos de ensayo
6414 Reactivo de Drabkin para dilucioacuten
Este reactivo se puede adquirir en tabletas o polvos para disolver en 1litro de agua destilada Si se dispone de una balanza analiacutetica la preparacioacutense puede hacer en el laboratorio Esta solucioacuten se puedeconservar durante un mes en un frasco de vidrio oscuro Deseacutechese sise enturbia
realizan su accioacuten a traveacutes de un efecto quelante sobre el calcioal fijarlo impiden
su activacioacuten y por ende la coagulacioacuten sanguiacutenea
4211 Ventajas
bull Respeta la morfologiacutea eritrocitaria (especialmente la sal tripotaacutesica) yleucocitaria de manera que permite una demora de dos horas en la realizacioacutendel frotis sanguiacuteneo despueacutes de la extraccioacuten sanguiacutenea
bull Asegura la conservacioacuten de los elementos formes sanguiacuteneos durante 24horas si la sangre se mantiene a 4 ordmC
bull Al inhibir la aglutinacioacuten de las plaquetas facilita su recuento o su expresioacutensemicuantitativa a partir del frotis
bull La concentracioacuten recomendada de EDTA es de 15 mgmL de sangre Unamayor cantidad de anticoagulante puede producir retraccioacuten celular condisminucioacuten del hematocrito y un aumento de la concentracioacuten media de lahemoglobina Un exceso de sangre con relacioacuten al anticoagulante produceformacioacuten de microagregados que pueden alterar los resultados El empleode tubos al vaciacuteo con una gota (50mL) de EDTA tripotaacutesica comercialpara 5 mL de sangre es de intereacutes praacutectico dado que es cien veces maacutessoluble facilitando la mezcla de sangre con anticoagulante
4212 Desventajas
Usado en exceso afecta a los eritrocitos y a los leucocitos a los cuales les produce encogimiento y cambios en su forma por ello debe cuidarse de agregar la cantidad correcta de sangre al anticoagulante
422 Anticoagulante de Wintrobe
Es una mezcla de oxalato de amonio y potasio Actuacutea por precipitacioacuten del calcio es faacutecil de preparar Se emplea en forma de polvo en proporcioacuten de 2 de oxalato de amonio por 1 de oxalato de potasio La cantidad recomendada es de 2 mg x mL de sangre Este anticoagulante no afecta el volumen globular medio y puede usarse para determinaciones de hemoglobina hematocrito y recuento globular pero para los extendidos queda limitada a los primeros minutos tampoco es uacutetil para el recuento plaquetario porque produce formacioacuten de agregados plaquetarios
423 Heparina
El nombre de heparina proviene del griego hepar que significa hiacutegado ya que fue aislado por primera vez de las ceacutelulas de este tejido Es un mucopolisacaacuterido aacutecido Presenta el
inconveniente de que si no se agita raacutepidamente con la sangre despueacutes de extraiacuteda
pueden formarse microcoaacutegulos aunque no altera el volumeneritrocitario ni la morfologiacutea de los leucocitos No es recomendablepara el frotis sanguiacuteneo porque produce un fondo azul en la laacutemina
La heparina de sodio o litio puede usarse en forma soacutelida o liacutequida en
proporcioacutende 01 - 02 mg de heparina por 1 mL de sangre
43 ANTICOAGULANTES LIacuteQUIDOS
431 Citrato trisoacutedico
Es de eleccioacuten para las pruebas de hemostasia y la velocidad de sedimentacioacuten
Actuacutea a traveacutes de la precipitacioacuten del calcio La concentracioacuten depende de
la prueba por realizar
bull Para pruebas de hemostasia se emplea en proporcioacuten de 1 9 (05 mL
deanticoagulante para 45 mL de sangre total)
bull Para la determinacioacuten de la VSG (Velocidad de Sedimentacioacuten Globular) es14
(05 mL de anticoagulante para 2 mL de sangre)
432 Oxalato soacutedico
Recomendado tambieacuten para las pruebas de hemostasia Se emplea en
proporcioacutende un volumen de anticoagulante para 4 vol de sangre
SECCIOacuteN 5
REALIZACIOacuteN Y TINCIOacuteN DEL FROTIS SANGUIacuteNEO
La praacutectica del frotis sanguiacuteneo tambieacuten llamado extendido es de gran importanciaen hematologiacutea ya que el diagnoacutestico de muchas enfermedadeshematoloacutegicas puede realizarse con soacutelo observar las caracteriacutesticasmorfoloacutegicas de las ceacutelulas sanguiacuteneas de manera que eacuteste no debe serexcesivamente grueso ni excesivamente fino Todas las laacuteminas por usarsobre todo nuevas deben ser limpiadas con algodoacuten y alcohol al 70 paraeliminar la grasa que viene adherida
51 MEacuteTODO DE LOS DOS PORTAOBJETOS
511 Materiales
- Alcohol al 70
- Algodoacuten
- Lanceta descartable
- Portaobjetos de vidrios limpios y desgrasados (25 x 75 mm)
512 Fundamento
Consiste en la extensioacuten de una gota de sangre sobre un portaobjeto (25 x 75)empleando el canto biselado de otro portaobjeto de igual dimensioacuten (Fig 12)
513 Procedimiento
5131 Una vez extraiacuteda la sangre con cualquiera de las metodologiacuteas secoloca una pequentildea gota de sangre (5mL) (aprox 3 mm de diaacutemetro)sobre un portaobjeto a 2 cm aproximadamente de uno de los extremos
5132 Colocar el canto de otro portaobjeto esmerilado sobre la superficiedel primer portaobjeto (en la que se encuentra la gota de sangre)formando un aacutengulo de 45ordm
5134 Deslizar suavemente y a velocidad moderada el portaobjeto sobre elotro en sentido longitudinal hasta que la gota de sangre quede bienextendida sobre la
superficie del primer portaobjeto El grosor delfrotis sanguiacuteneo puede variar seguacuten sea el aacutengulo que formen entresiacute ambos portaobjetos Asiacute si es superior a 45ordm la extensioacuten obtenidaseraacute gruesa y corta si es inferior a 45ordm seraacute larga y fina El secado delfrotis es a temperatura ambiente y en posicioacuten horizontal
Fig 12
1048729 Zona excesivamente gruesa Se halla en la regioacuten inmediata al punto departida de la extensioacuten (cabeza) En ella se aprecia siempre un aumento delinfocitos
1048729 Zona excesivamente fina Corresponde al final de la extensioacuten y termina enun aacuterea donde las ceacutelulas adoptan una posicioacuten acartonada (barbas) Enesta regioacuten existe un exceso de granulocitos y monocitos
1048729 Zona ideal Corresponde a la regioacuten intermedia del frotis y en ella existe unreparto equilibrado de ceacutelulas
52 COLORACIONES USADAS
Una vez seco el frotis se procede a la tincioacuten hematoloacutegica con el colorante deRomanowsky constituido por la mezcla de eosina y azul de metileno Dentrode eacutestas tenemos
521 Colorante de Giemsa
522 Colorante de May-Grunwald
523 Colorante de Wright
524 Colorante de Leishman
Preparacioacuten de colorantes (Anexo A)
1048729 Para el estudio de las ceacutelulas sanguiacuteneas utilizar el colorante 523 y 524
1048729 Para el estudio de hemoparaacutesitos utilizar el colorante 521
1048729 Utilizar el colorante 522 para casos especiales en que se desee observar
con mayor claridad y especificidad los graacutenulos de los neutrofilos
53 TINCIOacuteN CON COLORANTE DE WRIGHT
531 Fundamento
El colorante de Wright va a permitir suministrar un medio para estudiar lasangre y determinar las variaciones y anormalidades de estructura forma ytamantildeo de los eritrocitos su contenido de hemoglobina y sus propiedades decoloracioacuten La informacioacuten obtenida de un frotis de sangre perifeacuterica dependeen gran parte de la calidad del extendido y la coloracioacuten
532 Materiales
5321 Colorante de Wright (Anexo A)
5322 Frasco gotero
5323 Solucioacuten amortiguada tamponada (Anexo A)
533 Procedimiento
5331 Una vez obtenido el frotis sanguiacuteneo se le dejaraacute secar entre 15 y 20minutos
5332 Luego se coloca la preparacioacuten en un soporte y se cubre con el colorantede Wright dejaacutendolo por espacio de 5 minutos
5333 Posteriormente se antildeade solucioacuten amortiguada tamponada en partesiguales hasta obtener un brillo metaacutelico dejando 6 minutos adicionales
5334 Finalmente se lava con agua corriente y se deja secar
5335 Se coloca en el microscopio y con pequentildeo aumento se revisa lacalidad de la coloracioacuten la cantidad aproximada de gloacutebulos blancosy se escoge el sitio para iniciar el recuento Se coloca una gota deaceite de inmersioacuten y se enfoca a un aumento de 100xLa forma de los gloacutebulos rojos se examinaraacute detenidamente observandoademaacutes del color (cantidad de hemoglobina) presencia deplaquetas su agrupacioacuten y distribucioacuten
5336 Posteriormente se hace el recuento diferencial de gloacutebulos blancosen 100
ceacutelulas para lo cual se deberaacute conocer las diferencias entreneutroacutefilos eosinoacutefilos
linfocitos y monocitosUna extensioacuten de sangre bien tentildeida debe caracterizarse
por unabuena diferenciacioacuten de las estructuras subcelulares en los leucocitosuna
coloracioacuten rosada de los hematiacutees y la ausencia de precipitados
Los defectos maacutes frecuentes observados en la tincioacuten del frotis sanguiacuteneoson
Coloracioacuten excesivamente azul debido a
1048729 Frotis excesivamente grueso
1048729 Lavado insuficiente
1048729 Tincioacuten muy prolongada
1048729 Empleo de colorante excesivamente alcalino
Coloracioacuten con una tonalidad rosada
1048729 El colorante el tampoacuten o el agua de lavado tienen un pH demasiadoaacutecido
Presencia de precipitados
1048729 Obedecen a una accioacuten excesiva del colorante Esto se puede evitarcon la
filtracioacuten
SECCIOacuteN 6
HEMOGRAMA-HEMOGLOBINA-HEMATOCRITO
El hemograma de Shilling constituye uno de los exaacutemenes de laboratorio
maacutesusados en el campo de la hematologiacutea Comprende las siguientes pruebas
61 RECUENTO LEUCOCITARIO
Principio
La sangre anticoagulada se deposita en un liacutequido que permite evidenciar
losleucocitos mantenieacutendolos visibles mientras que los eritrocitos
sonhemolizados El recuento del nuacutemero de leucocitos o gloacutebulos blancos se
expresapor mm3 (miliacutemetro cuacutebico)
611 Equipos
- Microscopio
- Hemocitoacutemetro (Caacutemara de Neubauer)
Consta de los siguientes elementos
diams Una laacutemina portaobjeto gruesa en el centro se hallan dos
superficiescuadriculadas iguales separadas del resto de la laacutemina por surcos y
dosbarras transversales algo maacutes elevadas
diams Una laminilla cubreobjetos oacutepticamente plana que al colocarse sobrelas barras
elevadas de la laacutemina forma una caacutemara entre el cubreobjetosy la superficie
cuadriculadaLa altura entre el cubreobjetos y la laacutemina portaobjetos es de 01
mmCada cuadriacutecula mide 3 mm de lado y se divide en 9 cuadrados grandesCada
uno de los cuales mide 1 mm2 de superficie que se subdivide a suvez en 16
cuadrados medianos El cuadrado grande central se divide en25 cuadrados
pequentildeos y cada uno de ellos en 16 cuadraditos Cadacuadrado pequentildeo mide
02 mm de lado (004 mm2 de superficie) y cadacuadradito mide 005 mm de lado
(00025 mm2 de superficie)
612 Materiales y reactivos requeridos
6121 Pipeta de gloacutebulos blancos (De Thoma) o pipeta automaacutetica (de 0 a 100 mL)Presenta cerca del extremo superior una marca de 11 inmediatamentecontinuacutea una dilatacioacuten (bulbo) que contiene una perla que funciona comomezcladora luego sigue el extremo maacutes largo de la pipeta (tallo) que estaacutedividida en 10 partes con 2 marcas 1 (parte final del bulbo) y 05 (a la mitaddel tallo) Se le acopla a su extremo superior 1 tubo de goma y una bombillapara aspirar
6122 Diluyente de gloacutebulos blancos Solucioacuten de Turk al 1
6123 Contador manual (Soacutelo si fuera necesario)
6124 Papel filtro
613 Procedimiento
6131 Una vez obtenida la sangre con anticoagulante o sangre capilar deldedo se procede a aspirar la sangre con la pipeta de gloacutebulos blancoshasta la marca de 05 y a limpiar la punta con papel absorbente
6132 Introducir la pipeta en el tubo que contenga solucioacuten de Turk y absorberhasta la marca de 11 (no debe haber burbujas)
6133 Tapar ambos extremos y proceder a mezclar manualmente o en unrotador automaacutetico por 2 oacute 3 minutos
6134 Monte la laminilla de vidrio en la caacutemara para recuento que debe estarlimpia y seca
6135 Agitar la pipeta y descartar las cuatro primeras gotas para luego colocaruna gota pequentildea de esta solucioacuten en la caacutemara
6136 Deje reposar por espacio de 3 minutos para que las ceacutelulas se sedimenten
6137 Enfocar con objetivo de 10x y contar en 4 cuadrados grandes angularesCuando se usa la pipeta automaacutetica se toma 20 mL (002 mL) desangre total con anticoagulante o sangre capilar con anticoagulante yse diluye en un tubo que contenga 380 mL de solucioacuten de Turk (aquiacutetenemos una dilucioacuten 120)
LECTURA
Fig 13
La lectura se realiza en los campos 1 3 7 y 9 como estaacute indicado en la figuraAdemaacutes de los leucocitos contados dentro de cada uno de los cuadrantes sedeben contar todos los leucocitos que se encuentren adheridos en la liacuteneahorizontal superior y vertical exterior o de lo contrario todos los leucocitosadheridos a la liacutenea horizontal inferior y vertical interior
614 Resultados
Nordm de leucocitos x mm3 = leucocitos contados en 4 camposdividealtura x dilucioacuten x aacuterea
Reemplazando = leucocitos contados en 4 camposdivide110 x 120 x 4=
Leucocitos contados en 4 camposdivide4200=
X1 divide4200= Nordm leucocitos contados x 50
615 Valores de referencia
5000 - 10 000 leucocitos mm3
616 Correccioacuten de valores para restar eritrocitos nucleados
Los normoblastos no se destruyen (lisis) en el liacutequido de dilucioacuten por lo tantopueden observarse al realizar el recuento leucocitario y confundirse con losleucocitos de tal manera que se debe emplear la siguiente foacutermula
Caacutelculo
La concentracioacuten del nuacutemero de normoblastos (por litro) esNuacutemero de normoblatos contados x concentracioacuten o nuacutemero de leucocitos100 + Nordm de normoblastos contados
Ejemplo
Si se cuentan 50 normoblastos y la concentracioacuten del nuacutemero de leucocitos es16 x 109l la concentracioacuten del nuacutemero de normoblastos seraacute
50 x16 = 53 x 109l
100 + 50
y la concentracioacuten de leucocitos corregida seraacute 16 - 53 = 107 x 109lEn unidades tradicionales las concentraciones de normoblastos y leucocitosse expresan por miliacutemetro cuacutebico En tales unidades el caacutelculo correspondienteal ejemplo que se ha dado seriacutea
50 x 16 000 = 5300 mm3
100 + 50
Recuento corregido de gloacutebulos blancos o leucocitos = 16 000 - 5300 = 10 700 mm3
Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2
62 RECUENTO DE GLOacuteBULOS ROJOS
Principio
La sangre se diluye en un liacutequido que nos permite observar claramente loshematiacutees luego esta dilucioacuten se coloca en una caacutemara de Neubauer con laayuda de una pipeta automaacutetica o pipeta Pasteur y se cuentan en el microscopioa un objetivo de 40x para calcular el nuacutemero de gloacutebulos rojos por mm3
621 Equipos
- Microscopio
- Hemocitoacutemetro (caacutemara de Neubauer)
622 Materiales y reactivos requeridos
6221 Pipeta de gloacutebulos rojos (De Thoma) o pipeta automaacutetica (de 0-100 mL)
Presenta cerca del extremo superior una marca de 101 inmediatamentecontinuacutea una dilatacioacuten (bulbo) que contiene una perla roja mezcladoraluego sigue el tallo (extremo maacutes largo) el cual estaacute dividido en 10 partescon 2 marcas 1 acabando el bulbo y 05 a la mitad del tallo Se requiereigual que el recuento de leucocitos una boquilla para aspirar
6222 Diluyente de gloacutebulos rojos Cloruro de Sodio al 09 (ver anexo)
Diluyente de Hayem (ver anexo)
6223 Contador manual (soacutelo si fuera necesario)
6224 Papel filtro
623 Procedimiento
6231 Mezclar la sangre obtenida con el anticoagulante o tomar sangre capilar
6232 Llenar la pipeta de gloacutebulos rojos con sangre hasta la marca de 05para realizar una dilucioacuten de 1200 y si se carga hasta 1 la dilucioacutenseraacute 1100 Limpiar la punta con gasa o papel absorbente
6233 Introducir la pipeta en el tubo o frasquito conteniendo diluyente (Hayem)y llenar de liacutequido de dilucioacuten hasta la marca de 101
6234 Se coloca en un rotador automaacutetico o se hace rotar manualmente de2 a 3 minutos
6235 Agitar bien la pipeta y descartar 3 a 4 gotas del tallo luego colocar unagota pequentildea cerca de un extremo de la caacutemara para que por capilaridadse llene exactamente
6236 Hacer el recuento con objetivo de 40xSe puede realizar con la pipeta automaacutetica se toma 20 mL (002mL)de sangre total con anticoagulante o sangre capilar y se deposita enun tubo de 12 x 75 que contenga 4 mL de solucioacuten de Hayem (aquiacute setiene una dilucioacuten de 1200) Se deja reposar aproximadamente 5minutos y se procede a cargar la caacutemara con la misma pipeta usandoun nuevo tip El inconveniente aquiacute es el gasto de reactivo (4 mL) perolas medidas son mas exactas
6237 Dejar en reposo por 3 minutos
6238 Enfocar la cuadriacutecula a 10x luego con el objetivo de 40x contar sobreel cuadrado grande central de la caacutemara soacutelo en 5 cuadrados pequentildeosuno central y cuatro angulares (80 cuadraditos en total)
6239 En el recuento se incluyen las ceacutelulas que cubren o tocan por dentroo por fuera las liacuteneas limitantes superior e izquierda en el cuadradopequentildeo de recuento y no se consideran los correspondientes a losliacutemites inferior y derechoSe hace el recuento en los puntos ABCD y Ey se sigue los mismos paraacutemetros del recuento de leucocitos
LECTURA
Fig 14
624 Resultados
Nordm de hematiacutees x mm3 = hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeosaltura x dilucioacuten X aacuterea
Reemplazando = hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeos110 x 1200 x 15
= hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeos divide 110 000
= hematiacutees contados x 10 000
625 Valores de referencia
(Unidades tradicionales millones de ceacutelulasmm3)
Hombres 4 500 000 - 5 500 000
Mujeres 4 000 000 - 5 000 000
Nintildeos (4 antildeos) 4 200 000 - 5 200 000
Lactantes (1 - 6 meses) 3 800 000 - 5 200 000
Recieacuten nacidos 5 000 000 - 6 000 000
Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2
63 DETERMINACIOacuteN DEL VOLUMEN GLOBULAR (Hematocrito)
Mide la fraccioacuten que comprende a los gloacutebulos rojos (masa globular) respectoal
volumen total de la muestra de sangre venosa o capilar Puede expresarseen
porcentaje o como valor decimal
Hto= altura de la columna de gloacutebulos rojosdivide altura de la columna de sangre
total(gloacutebulos rojos maacutes plasma)
631 Meacutetodo de Wintrobe
Materiales requeridos
- Tubo de Wintrobe graduado de 0 - 100 mm
- Pipetas Pasteur o pipetas de transferencia
- Tapoacuten de goma
Procedimiento
diams Llenar la sangre extraiacuteda con anticoagulante con una pipeta pasteur
comenzandodesde el fondo hasta la marca superior de 100 mm teniendocuidado
de no provocar espuma
diams Tapar el tubo con un tapoacuten de goma para evitar la evaporacioacuten
diams Centrifugar a 3000 rpm por 30 minutos
Resultados (lectura)
Del tubo graduado se mide directamente el nivel de la columna de gloacutebulosrojos
Valores de referencia
Hombres 40 - 54Mujeres 38 - 48
Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2
632 Meacutetodo de microhematocrito
Materiales requeridos
- Capilares rojos y azules (75 mm x 15 mm)
- Plastilina
Procedimiento
diams Tomar la muestra en capilares rojos heparinizados directamente del pulpejodel
dedo o utilizar capilares azules sin heparina para sangre venosacon
anticoagulante de Wintrobe o EDTA Debe llenarse aproximadamente70 - 80
del capilar
diams Ocluir (tapar) un extremo del capilar con plastilina
diams Colocar el capilar sobre la plataforma del cabezal de una centriacutefuga demicrohematocrito con el extremo ocluido adherido al reborde externo de laplataforma
diams Centrifugar por 5 minutos entre 10 000 - 12 000 rpm
Resultados (lectura)
La lectura se realiza con una escala estandarizada que expenden en el comercio
Uso de la escala
diams Sostenga el tubo frente a la escala de manera que el fondo de la columnade eritrocitos (no el extremo inferior del tubo) quede exactamente al mismonivel de la liacutenea horizontal correspondiente al cero
diams Desplace el tubo a traveacutes de la escala hasta que la liacutenea marcada con elnuacutemero 10 quede al nivel del tope de la columna de plasma Vigile que elfondo de la
columna de eritrocitos continuacutee sobre la liacutenea cero El tubodebe encontrarse completamente en posicioacuten vertical
diams La liacutenea que pase al nivel del tope de la columna de eritrocitos indicaraacute lafraccioacuten de volumen de eacutestos
Valores de referencia
Hombres 40 - 50
Mujeres 38 - 44
Nintildeos (5 antildeos) 38 - 44
Lactantes (3 meses) 37 - 42
Recieacuten nacidos 50 - 58
La disposicioacuten celular esParte superior una columna de plasmaEn la interfase estaacuten los leucocitos yplaquetasParte inferior estaacute la columna deeritrocitos (Fig 15)
64 DOSAJE DE HEMOGLOBINA
Principio
La sangre se diluye en liacutequido de Drabkin el cual hemoliza los hematiacutees yconvierte la hemoglobina en cianometahemoglobina (cianuro de hemiglobina)La solucioacuten que se produce se lee por medio de un espectrofotoacutemetro ofotocoloriacutemetro Su grado de absorbancia es proporcional a la cantidad dehemoglobina que contenga la sangre
641 Materiales y reactivos
6411 Un coloriacutemetro fotoeleacutectrico o un espectrofotoacutemetro
6412 Pipetas
diams Una pipeta para sangre (pipeta de Sahli) graduada hasta 002 mL contubo de goma y boquilla
diams Una pipeta de vidrio graduada de 5 mL
6413 Tubos de ensayo
6414 Reactivo de Drabkin para dilucioacuten
Este reactivo se puede adquirir en tabletas o polvos para disolver en 1litro de agua destilada Si se dispone de una balanza analiacutetica la preparacioacutense puede hacer en el laboratorio Esta solucioacuten se puedeconservar durante un mes en un frasco de vidrio oscuro Deseacutechese sise enturbia
inconveniente de que si no se agita raacutepidamente con la sangre despueacutes de extraiacuteda
pueden formarse microcoaacutegulos aunque no altera el volumeneritrocitario ni la morfologiacutea de los leucocitos No es recomendablepara el frotis sanguiacuteneo porque produce un fondo azul en la laacutemina
La heparina de sodio o litio puede usarse en forma soacutelida o liacutequida en
proporcioacutende 01 - 02 mg de heparina por 1 mL de sangre
43 ANTICOAGULANTES LIacuteQUIDOS
431 Citrato trisoacutedico
Es de eleccioacuten para las pruebas de hemostasia y la velocidad de sedimentacioacuten
Actuacutea a traveacutes de la precipitacioacuten del calcio La concentracioacuten depende de
la prueba por realizar
bull Para pruebas de hemostasia se emplea en proporcioacuten de 1 9 (05 mL
deanticoagulante para 45 mL de sangre total)
bull Para la determinacioacuten de la VSG (Velocidad de Sedimentacioacuten Globular) es14
(05 mL de anticoagulante para 2 mL de sangre)
432 Oxalato soacutedico
Recomendado tambieacuten para las pruebas de hemostasia Se emplea en
proporcioacutende un volumen de anticoagulante para 4 vol de sangre
SECCIOacuteN 5
REALIZACIOacuteN Y TINCIOacuteN DEL FROTIS SANGUIacuteNEO
La praacutectica del frotis sanguiacuteneo tambieacuten llamado extendido es de gran importanciaen hematologiacutea ya que el diagnoacutestico de muchas enfermedadeshematoloacutegicas puede realizarse con soacutelo observar las caracteriacutesticasmorfoloacutegicas de las ceacutelulas sanguiacuteneas de manera que eacuteste no debe serexcesivamente grueso ni excesivamente fino Todas las laacuteminas por usarsobre todo nuevas deben ser limpiadas con algodoacuten y alcohol al 70 paraeliminar la grasa que viene adherida
51 MEacuteTODO DE LOS DOS PORTAOBJETOS
511 Materiales
- Alcohol al 70
- Algodoacuten
- Lanceta descartable
- Portaobjetos de vidrios limpios y desgrasados (25 x 75 mm)
512 Fundamento
Consiste en la extensioacuten de una gota de sangre sobre un portaobjeto (25 x 75)empleando el canto biselado de otro portaobjeto de igual dimensioacuten (Fig 12)
513 Procedimiento
5131 Una vez extraiacuteda la sangre con cualquiera de las metodologiacuteas secoloca una pequentildea gota de sangre (5mL) (aprox 3 mm de diaacutemetro)sobre un portaobjeto a 2 cm aproximadamente de uno de los extremos
5132 Colocar el canto de otro portaobjeto esmerilado sobre la superficiedel primer portaobjeto (en la que se encuentra la gota de sangre)formando un aacutengulo de 45ordm
5134 Deslizar suavemente y a velocidad moderada el portaobjeto sobre elotro en sentido longitudinal hasta que la gota de sangre quede bienextendida sobre la
superficie del primer portaobjeto El grosor delfrotis sanguiacuteneo puede variar seguacuten sea el aacutengulo que formen entresiacute ambos portaobjetos Asiacute si es superior a 45ordm la extensioacuten obtenidaseraacute gruesa y corta si es inferior a 45ordm seraacute larga y fina El secado delfrotis es a temperatura ambiente y en posicioacuten horizontal
Fig 12
1048729 Zona excesivamente gruesa Se halla en la regioacuten inmediata al punto departida de la extensioacuten (cabeza) En ella se aprecia siempre un aumento delinfocitos
1048729 Zona excesivamente fina Corresponde al final de la extensioacuten y termina enun aacuterea donde las ceacutelulas adoptan una posicioacuten acartonada (barbas) Enesta regioacuten existe un exceso de granulocitos y monocitos
1048729 Zona ideal Corresponde a la regioacuten intermedia del frotis y en ella existe unreparto equilibrado de ceacutelulas
52 COLORACIONES USADAS
Una vez seco el frotis se procede a la tincioacuten hematoloacutegica con el colorante deRomanowsky constituido por la mezcla de eosina y azul de metileno Dentrode eacutestas tenemos
521 Colorante de Giemsa
522 Colorante de May-Grunwald
523 Colorante de Wright
524 Colorante de Leishman
Preparacioacuten de colorantes (Anexo A)
1048729 Para el estudio de las ceacutelulas sanguiacuteneas utilizar el colorante 523 y 524
1048729 Para el estudio de hemoparaacutesitos utilizar el colorante 521
1048729 Utilizar el colorante 522 para casos especiales en que se desee observar
con mayor claridad y especificidad los graacutenulos de los neutrofilos
53 TINCIOacuteN CON COLORANTE DE WRIGHT
531 Fundamento
El colorante de Wright va a permitir suministrar un medio para estudiar lasangre y determinar las variaciones y anormalidades de estructura forma ytamantildeo de los eritrocitos su contenido de hemoglobina y sus propiedades decoloracioacuten La informacioacuten obtenida de un frotis de sangre perifeacuterica dependeen gran parte de la calidad del extendido y la coloracioacuten
532 Materiales
5321 Colorante de Wright (Anexo A)
5322 Frasco gotero
5323 Solucioacuten amortiguada tamponada (Anexo A)
533 Procedimiento
5331 Una vez obtenido el frotis sanguiacuteneo se le dejaraacute secar entre 15 y 20minutos
5332 Luego se coloca la preparacioacuten en un soporte y se cubre con el colorantede Wright dejaacutendolo por espacio de 5 minutos
5333 Posteriormente se antildeade solucioacuten amortiguada tamponada en partesiguales hasta obtener un brillo metaacutelico dejando 6 minutos adicionales
5334 Finalmente se lava con agua corriente y se deja secar
5335 Se coloca en el microscopio y con pequentildeo aumento se revisa lacalidad de la coloracioacuten la cantidad aproximada de gloacutebulos blancosy se escoge el sitio para iniciar el recuento Se coloca una gota deaceite de inmersioacuten y se enfoca a un aumento de 100xLa forma de los gloacutebulos rojos se examinaraacute detenidamente observandoademaacutes del color (cantidad de hemoglobina) presencia deplaquetas su agrupacioacuten y distribucioacuten
5336 Posteriormente se hace el recuento diferencial de gloacutebulos blancosen 100
ceacutelulas para lo cual se deberaacute conocer las diferencias entreneutroacutefilos eosinoacutefilos
linfocitos y monocitosUna extensioacuten de sangre bien tentildeida debe caracterizarse
por unabuena diferenciacioacuten de las estructuras subcelulares en los leucocitosuna
coloracioacuten rosada de los hematiacutees y la ausencia de precipitados
Los defectos maacutes frecuentes observados en la tincioacuten del frotis sanguiacuteneoson
Coloracioacuten excesivamente azul debido a
1048729 Frotis excesivamente grueso
1048729 Lavado insuficiente
1048729 Tincioacuten muy prolongada
1048729 Empleo de colorante excesivamente alcalino
Coloracioacuten con una tonalidad rosada
1048729 El colorante el tampoacuten o el agua de lavado tienen un pH demasiadoaacutecido
Presencia de precipitados
1048729 Obedecen a una accioacuten excesiva del colorante Esto se puede evitarcon la
filtracioacuten
SECCIOacuteN 6
HEMOGRAMA-HEMOGLOBINA-HEMATOCRITO
El hemograma de Shilling constituye uno de los exaacutemenes de laboratorio
maacutesusados en el campo de la hematologiacutea Comprende las siguientes pruebas
61 RECUENTO LEUCOCITARIO
Principio
La sangre anticoagulada se deposita en un liacutequido que permite evidenciar
losleucocitos mantenieacutendolos visibles mientras que los eritrocitos
sonhemolizados El recuento del nuacutemero de leucocitos o gloacutebulos blancos se
expresapor mm3 (miliacutemetro cuacutebico)
611 Equipos
- Microscopio
- Hemocitoacutemetro (Caacutemara de Neubauer)
Consta de los siguientes elementos
diams Una laacutemina portaobjeto gruesa en el centro se hallan dos
superficiescuadriculadas iguales separadas del resto de la laacutemina por surcos y
dosbarras transversales algo maacutes elevadas
diams Una laminilla cubreobjetos oacutepticamente plana que al colocarse sobrelas barras
elevadas de la laacutemina forma una caacutemara entre el cubreobjetosy la superficie
cuadriculadaLa altura entre el cubreobjetos y la laacutemina portaobjetos es de 01
mmCada cuadriacutecula mide 3 mm de lado y se divide en 9 cuadrados grandesCada
uno de los cuales mide 1 mm2 de superficie que se subdivide a suvez en 16
cuadrados medianos El cuadrado grande central se divide en25 cuadrados
pequentildeos y cada uno de ellos en 16 cuadraditos Cadacuadrado pequentildeo mide
02 mm de lado (004 mm2 de superficie) y cadacuadradito mide 005 mm de lado
(00025 mm2 de superficie)
612 Materiales y reactivos requeridos
6121 Pipeta de gloacutebulos blancos (De Thoma) o pipeta automaacutetica (de 0 a 100 mL)Presenta cerca del extremo superior una marca de 11 inmediatamentecontinuacutea una dilatacioacuten (bulbo) que contiene una perla que funciona comomezcladora luego sigue el extremo maacutes largo de la pipeta (tallo) que estaacutedividida en 10 partes con 2 marcas 1 (parte final del bulbo) y 05 (a la mitaddel tallo) Se le acopla a su extremo superior 1 tubo de goma y una bombillapara aspirar
6122 Diluyente de gloacutebulos blancos Solucioacuten de Turk al 1
6123 Contador manual (Soacutelo si fuera necesario)
6124 Papel filtro
613 Procedimiento
6131 Una vez obtenida la sangre con anticoagulante o sangre capilar deldedo se procede a aspirar la sangre con la pipeta de gloacutebulos blancoshasta la marca de 05 y a limpiar la punta con papel absorbente
6132 Introducir la pipeta en el tubo que contenga solucioacuten de Turk y absorberhasta la marca de 11 (no debe haber burbujas)
6133 Tapar ambos extremos y proceder a mezclar manualmente o en unrotador automaacutetico por 2 oacute 3 minutos
6134 Monte la laminilla de vidrio en la caacutemara para recuento que debe estarlimpia y seca
6135 Agitar la pipeta y descartar las cuatro primeras gotas para luego colocaruna gota pequentildea de esta solucioacuten en la caacutemara
6136 Deje reposar por espacio de 3 minutos para que las ceacutelulas se sedimenten
6137 Enfocar con objetivo de 10x y contar en 4 cuadrados grandes angularesCuando se usa la pipeta automaacutetica se toma 20 mL (002 mL) desangre total con anticoagulante o sangre capilar con anticoagulante yse diluye en un tubo que contenga 380 mL de solucioacuten de Turk (aquiacutetenemos una dilucioacuten 120)
LECTURA
Fig 13
La lectura se realiza en los campos 1 3 7 y 9 como estaacute indicado en la figuraAdemaacutes de los leucocitos contados dentro de cada uno de los cuadrantes sedeben contar todos los leucocitos que se encuentren adheridos en la liacuteneahorizontal superior y vertical exterior o de lo contrario todos los leucocitosadheridos a la liacutenea horizontal inferior y vertical interior
614 Resultados
Nordm de leucocitos x mm3 = leucocitos contados en 4 camposdividealtura x dilucioacuten x aacuterea
Reemplazando = leucocitos contados en 4 camposdivide110 x 120 x 4=
Leucocitos contados en 4 camposdivide4200=
X1 divide4200= Nordm leucocitos contados x 50
615 Valores de referencia
5000 - 10 000 leucocitos mm3
616 Correccioacuten de valores para restar eritrocitos nucleados
Los normoblastos no se destruyen (lisis) en el liacutequido de dilucioacuten por lo tantopueden observarse al realizar el recuento leucocitario y confundirse con losleucocitos de tal manera que se debe emplear la siguiente foacutermula
Caacutelculo
La concentracioacuten del nuacutemero de normoblastos (por litro) esNuacutemero de normoblatos contados x concentracioacuten o nuacutemero de leucocitos100 + Nordm de normoblastos contados
Ejemplo
Si se cuentan 50 normoblastos y la concentracioacuten del nuacutemero de leucocitos es16 x 109l la concentracioacuten del nuacutemero de normoblastos seraacute
50 x16 = 53 x 109l
100 + 50
y la concentracioacuten de leucocitos corregida seraacute 16 - 53 = 107 x 109lEn unidades tradicionales las concentraciones de normoblastos y leucocitosse expresan por miliacutemetro cuacutebico En tales unidades el caacutelculo correspondienteal ejemplo que se ha dado seriacutea
50 x 16 000 = 5300 mm3
100 + 50
Recuento corregido de gloacutebulos blancos o leucocitos = 16 000 - 5300 = 10 700 mm3
Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2
62 RECUENTO DE GLOacuteBULOS ROJOS
Principio
La sangre se diluye en un liacutequido que nos permite observar claramente loshematiacutees luego esta dilucioacuten se coloca en una caacutemara de Neubauer con laayuda de una pipeta automaacutetica o pipeta Pasteur y se cuentan en el microscopioa un objetivo de 40x para calcular el nuacutemero de gloacutebulos rojos por mm3
621 Equipos
- Microscopio
- Hemocitoacutemetro (caacutemara de Neubauer)
622 Materiales y reactivos requeridos
6221 Pipeta de gloacutebulos rojos (De Thoma) o pipeta automaacutetica (de 0-100 mL)
Presenta cerca del extremo superior una marca de 101 inmediatamentecontinuacutea una dilatacioacuten (bulbo) que contiene una perla roja mezcladoraluego sigue el tallo (extremo maacutes largo) el cual estaacute dividido en 10 partescon 2 marcas 1 acabando el bulbo y 05 a la mitad del tallo Se requiereigual que el recuento de leucocitos una boquilla para aspirar
6222 Diluyente de gloacutebulos rojos Cloruro de Sodio al 09 (ver anexo)
Diluyente de Hayem (ver anexo)
6223 Contador manual (soacutelo si fuera necesario)
6224 Papel filtro
623 Procedimiento
6231 Mezclar la sangre obtenida con el anticoagulante o tomar sangre capilar
6232 Llenar la pipeta de gloacutebulos rojos con sangre hasta la marca de 05para realizar una dilucioacuten de 1200 y si se carga hasta 1 la dilucioacutenseraacute 1100 Limpiar la punta con gasa o papel absorbente
6233 Introducir la pipeta en el tubo o frasquito conteniendo diluyente (Hayem)y llenar de liacutequido de dilucioacuten hasta la marca de 101
6234 Se coloca en un rotador automaacutetico o se hace rotar manualmente de2 a 3 minutos
6235 Agitar bien la pipeta y descartar 3 a 4 gotas del tallo luego colocar unagota pequentildea cerca de un extremo de la caacutemara para que por capilaridadse llene exactamente
6236 Hacer el recuento con objetivo de 40xSe puede realizar con la pipeta automaacutetica se toma 20 mL (002mL)de sangre total con anticoagulante o sangre capilar y se deposita enun tubo de 12 x 75 que contenga 4 mL de solucioacuten de Hayem (aquiacute setiene una dilucioacuten de 1200) Se deja reposar aproximadamente 5minutos y se procede a cargar la caacutemara con la misma pipeta usandoun nuevo tip El inconveniente aquiacute es el gasto de reactivo (4 mL) perolas medidas son mas exactas
6237 Dejar en reposo por 3 minutos
6238 Enfocar la cuadriacutecula a 10x luego con el objetivo de 40x contar sobreel cuadrado grande central de la caacutemara soacutelo en 5 cuadrados pequentildeosuno central y cuatro angulares (80 cuadraditos en total)
6239 En el recuento se incluyen las ceacutelulas que cubren o tocan por dentroo por fuera las liacuteneas limitantes superior e izquierda en el cuadradopequentildeo de recuento y no se consideran los correspondientes a losliacutemites inferior y derechoSe hace el recuento en los puntos ABCD y Ey se sigue los mismos paraacutemetros del recuento de leucocitos
LECTURA
Fig 14
624 Resultados
Nordm de hematiacutees x mm3 = hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeosaltura x dilucioacuten X aacuterea
Reemplazando = hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeos110 x 1200 x 15
= hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeos divide 110 000
= hematiacutees contados x 10 000
625 Valores de referencia
(Unidades tradicionales millones de ceacutelulasmm3)
Hombres 4 500 000 - 5 500 000
Mujeres 4 000 000 - 5 000 000
Nintildeos (4 antildeos) 4 200 000 - 5 200 000
Lactantes (1 - 6 meses) 3 800 000 - 5 200 000
Recieacuten nacidos 5 000 000 - 6 000 000
Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2
63 DETERMINACIOacuteN DEL VOLUMEN GLOBULAR (Hematocrito)
Mide la fraccioacuten que comprende a los gloacutebulos rojos (masa globular) respectoal
volumen total de la muestra de sangre venosa o capilar Puede expresarseen
porcentaje o como valor decimal
Hto= altura de la columna de gloacutebulos rojosdivide altura de la columna de sangre
total(gloacutebulos rojos maacutes plasma)
631 Meacutetodo de Wintrobe
Materiales requeridos
- Tubo de Wintrobe graduado de 0 - 100 mm
- Pipetas Pasteur o pipetas de transferencia
- Tapoacuten de goma
Procedimiento
diams Llenar la sangre extraiacuteda con anticoagulante con una pipeta pasteur
comenzandodesde el fondo hasta la marca superior de 100 mm teniendocuidado
de no provocar espuma
diams Tapar el tubo con un tapoacuten de goma para evitar la evaporacioacuten
diams Centrifugar a 3000 rpm por 30 minutos
Resultados (lectura)
Del tubo graduado se mide directamente el nivel de la columna de gloacutebulosrojos
Valores de referencia
Hombres 40 - 54Mujeres 38 - 48
Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2
632 Meacutetodo de microhematocrito
Materiales requeridos
- Capilares rojos y azules (75 mm x 15 mm)
- Plastilina
Procedimiento
diams Tomar la muestra en capilares rojos heparinizados directamente del pulpejodel
dedo o utilizar capilares azules sin heparina para sangre venosacon
anticoagulante de Wintrobe o EDTA Debe llenarse aproximadamente70 - 80
del capilar
diams Ocluir (tapar) un extremo del capilar con plastilina
diams Colocar el capilar sobre la plataforma del cabezal de una centriacutefuga demicrohematocrito con el extremo ocluido adherido al reborde externo de laplataforma
diams Centrifugar por 5 minutos entre 10 000 - 12 000 rpm
Resultados (lectura)
La lectura se realiza con una escala estandarizada que expenden en el comercio
Uso de la escala
diams Sostenga el tubo frente a la escala de manera que el fondo de la columnade eritrocitos (no el extremo inferior del tubo) quede exactamente al mismonivel de la liacutenea horizontal correspondiente al cero
diams Desplace el tubo a traveacutes de la escala hasta que la liacutenea marcada con elnuacutemero 10 quede al nivel del tope de la columna de plasma Vigile que elfondo de la
columna de eritrocitos continuacutee sobre la liacutenea cero El tubodebe encontrarse completamente en posicioacuten vertical
diams La liacutenea que pase al nivel del tope de la columna de eritrocitos indicaraacute lafraccioacuten de volumen de eacutestos
Valores de referencia
Hombres 40 - 50
Mujeres 38 - 44
Nintildeos (5 antildeos) 38 - 44
Lactantes (3 meses) 37 - 42
Recieacuten nacidos 50 - 58
La disposicioacuten celular esParte superior una columna de plasmaEn la interfase estaacuten los leucocitos yplaquetasParte inferior estaacute la columna deeritrocitos (Fig 15)
64 DOSAJE DE HEMOGLOBINA
Principio
La sangre se diluye en liacutequido de Drabkin el cual hemoliza los hematiacutees yconvierte la hemoglobina en cianometahemoglobina (cianuro de hemiglobina)La solucioacuten que se produce se lee por medio de un espectrofotoacutemetro ofotocoloriacutemetro Su grado de absorbancia es proporcional a la cantidad dehemoglobina que contenga la sangre
641 Materiales y reactivos
6411 Un coloriacutemetro fotoeleacutectrico o un espectrofotoacutemetro
6412 Pipetas
diams Una pipeta para sangre (pipeta de Sahli) graduada hasta 002 mL contubo de goma y boquilla
diams Una pipeta de vidrio graduada de 5 mL
6413 Tubos de ensayo
6414 Reactivo de Drabkin para dilucioacuten
Este reactivo se puede adquirir en tabletas o polvos para disolver en 1litro de agua destilada Si se dispone de una balanza analiacutetica la preparacioacutense puede hacer en el laboratorio Esta solucioacuten se puedeconservar durante un mes en un frasco de vidrio oscuro Deseacutechese sise enturbia
SECCIOacuteN 5
REALIZACIOacuteN Y TINCIOacuteN DEL FROTIS SANGUIacuteNEO
La praacutectica del frotis sanguiacuteneo tambieacuten llamado extendido es de gran importanciaen hematologiacutea ya que el diagnoacutestico de muchas enfermedadeshematoloacutegicas puede realizarse con soacutelo observar las caracteriacutesticasmorfoloacutegicas de las ceacutelulas sanguiacuteneas de manera que eacuteste no debe serexcesivamente grueso ni excesivamente fino Todas las laacuteminas por usarsobre todo nuevas deben ser limpiadas con algodoacuten y alcohol al 70 paraeliminar la grasa que viene adherida
51 MEacuteTODO DE LOS DOS PORTAOBJETOS
511 Materiales
- Alcohol al 70
- Algodoacuten
- Lanceta descartable
- Portaobjetos de vidrios limpios y desgrasados (25 x 75 mm)
512 Fundamento
Consiste en la extensioacuten de una gota de sangre sobre un portaobjeto (25 x 75)empleando el canto biselado de otro portaobjeto de igual dimensioacuten (Fig 12)
513 Procedimiento
5131 Una vez extraiacuteda la sangre con cualquiera de las metodologiacuteas secoloca una pequentildea gota de sangre (5mL) (aprox 3 mm de diaacutemetro)sobre un portaobjeto a 2 cm aproximadamente de uno de los extremos
5132 Colocar el canto de otro portaobjeto esmerilado sobre la superficiedel primer portaobjeto (en la que se encuentra la gota de sangre)formando un aacutengulo de 45ordm
5134 Deslizar suavemente y a velocidad moderada el portaobjeto sobre elotro en sentido longitudinal hasta que la gota de sangre quede bienextendida sobre la
superficie del primer portaobjeto El grosor delfrotis sanguiacuteneo puede variar seguacuten sea el aacutengulo que formen entresiacute ambos portaobjetos Asiacute si es superior a 45ordm la extensioacuten obtenidaseraacute gruesa y corta si es inferior a 45ordm seraacute larga y fina El secado delfrotis es a temperatura ambiente y en posicioacuten horizontal
Fig 12
1048729 Zona excesivamente gruesa Se halla en la regioacuten inmediata al punto departida de la extensioacuten (cabeza) En ella se aprecia siempre un aumento delinfocitos
1048729 Zona excesivamente fina Corresponde al final de la extensioacuten y termina enun aacuterea donde las ceacutelulas adoptan una posicioacuten acartonada (barbas) Enesta regioacuten existe un exceso de granulocitos y monocitos
1048729 Zona ideal Corresponde a la regioacuten intermedia del frotis y en ella existe unreparto equilibrado de ceacutelulas
52 COLORACIONES USADAS
Una vez seco el frotis se procede a la tincioacuten hematoloacutegica con el colorante deRomanowsky constituido por la mezcla de eosina y azul de metileno Dentrode eacutestas tenemos
521 Colorante de Giemsa
522 Colorante de May-Grunwald
523 Colorante de Wright
524 Colorante de Leishman
Preparacioacuten de colorantes (Anexo A)
1048729 Para el estudio de las ceacutelulas sanguiacuteneas utilizar el colorante 523 y 524
1048729 Para el estudio de hemoparaacutesitos utilizar el colorante 521
1048729 Utilizar el colorante 522 para casos especiales en que se desee observar
con mayor claridad y especificidad los graacutenulos de los neutrofilos
53 TINCIOacuteN CON COLORANTE DE WRIGHT
531 Fundamento
El colorante de Wright va a permitir suministrar un medio para estudiar lasangre y determinar las variaciones y anormalidades de estructura forma ytamantildeo de los eritrocitos su contenido de hemoglobina y sus propiedades decoloracioacuten La informacioacuten obtenida de un frotis de sangre perifeacuterica dependeen gran parte de la calidad del extendido y la coloracioacuten
532 Materiales
5321 Colorante de Wright (Anexo A)
5322 Frasco gotero
5323 Solucioacuten amortiguada tamponada (Anexo A)
533 Procedimiento
5331 Una vez obtenido el frotis sanguiacuteneo se le dejaraacute secar entre 15 y 20minutos
5332 Luego se coloca la preparacioacuten en un soporte y se cubre con el colorantede Wright dejaacutendolo por espacio de 5 minutos
5333 Posteriormente se antildeade solucioacuten amortiguada tamponada en partesiguales hasta obtener un brillo metaacutelico dejando 6 minutos adicionales
5334 Finalmente se lava con agua corriente y se deja secar
5335 Se coloca en el microscopio y con pequentildeo aumento se revisa lacalidad de la coloracioacuten la cantidad aproximada de gloacutebulos blancosy se escoge el sitio para iniciar el recuento Se coloca una gota deaceite de inmersioacuten y se enfoca a un aumento de 100xLa forma de los gloacutebulos rojos se examinaraacute detenidamente observandoademaacutes del color (cantidad de hemoglobina) presencia deplaquetas su agrupacioacuten y distribucioacuten
5336 Posteriormente se hace el recuento diferencial de gloacutebulos blancosen 100
ceacutelulas para lo cual se deberaacute conocer las diferencias entreneutroacutefilos eosinoacutefilos
linfocitos y monocitosUna extensioacuten de sangre bien tentildeida debe caracterizarse
por unabuena diferenciacioacuten de las estructuras subcelulares en los leucocitosuna
coloracioacuten rosada de los hematiacutees y la ausencia de precipitados
Los defectos maacutes frecuentes observados en la tincioacuten del frotis sanguiacuteneoson
Coloracioacuten excesivamente azul debido a
1048729 Frotis excesivamente grueso
1048729 Lavado insuficiente
1048729 Tincioacuten muy prolongada
1048729 Empleo de colorante excesivamente alcalino
Coloracioacuten con una tonalidad rosada
1048729 El colorante el tampoacuten o el agua de lavado tienen un pH demasiadoaacutecido
Presencia de precipitados
1048729 Obedecen a una accioacuten excesiva del colorante Esto se puede evitarcon la
filtracioacuten
SECCIOacuteN 6
HEMOGRAMA-HEMOGLOBINA-HEMATOCRITO
El hemograma de Shilling constituye uno de los exaacutemenes de laboratorio
maacutesusados en el campo de la hematologiacutea Comprende las siguientes pruebas
61 RECUENTO LEUCOCITARIO
Principio
La sangre anticoagulada se deposita en un liacutequido que permite evidenciar
losleucocitos mantenieacutendolos visibles mientras que los eritrocitos
sonhemolizados El recuento del nuacutemero de leucocitos o gloacutebulos blancos se
expresapor mm3 (miliacutemetro cuacutebico)
611 Equipos
- Microscopio
- Hemocitoacutemetro (Caacutemara de Neubauer)
Consta de los siguientes elementos
diams Una laacutemina portaobjeto gruesa en el centro se hallan dos
superficiescuadriculadas iguales separadas del resto de la laacutemina por surcos y
dosbarras transversales algo maacutes elevadas
diams Una laminilla cubreobjetos oacutepticamente plana que al colocarse sobrelas barras
elevadas de la laacutemina forma una caacutemara entre el cubreobjetosy la superficie
cuadriculadaLa altura entre el cubreobjetos y la laacutemina portaobjetos es de 01
mmCada cuadriacutecula mide 3 mm de lado y se divide en 9 cuadrados grandesCada
uno de los cuales mide 1 mm2 de superficie que se subdivide a suvez en 16
cuadrados medianos El cuadrado grande central se divide en25 cuadrados
pequentildeos y cada uno de ellos en 16 cuadraditos Cadacuadrado pequentildeo mide
02 mm de lado (004 mm2 de superficie) y cadacuadradito mide 005 mm de lado
(00025 mm2 de superficie)
612 Materiales y reactivos requeridos
6121 Pipeta de gloacutebulos blancos (De Thoma) o pipeta automaacutetica (de 0 a 100 mL)Presenta cerca del extremo superior una marca de 11 inmediatamentecontinuacutea una dilatacioacuten (bulbo) que contiene una perla que funciona comomezcladora luego sigue el extremo maacutes largo de la pipeta (tallo) que estaacutedividida en 10 partes con 2 marcas 1 (parte final del bulbo) y 05 (a la mitaddel tallo) Se le acopla a su extremo superior 1 tubo de goma y una bombillapara aspirar
6122 Diluyente de gloacutebulos blancos Solucioacuten de Turk al 1
6123 Contador manual (Soacutelo si fuera necesario)
6124 Papel filtro
613 Procedimiento
6131 Una vez obtenida la sangre con anticoagulante o sangre capilar deldedo se procede a aspirar la sangre con la pipeta de gloacutebulos blancoshasta la marca de 05 y a limpiar la punta con papel absorbente
6132 Introducir la pipeta en el tubo que contenga solucioacuten de Turk y absorberhasta la marca de 11 (no debe haber burbujas)
6133 Tapar ambos extremos y proceder a mezclar manualmente o en unrotador automaacutetico por 2 oacute 3 minutos
6134 Monte la laminilla de vidrio en la caacutemara para recuento que debe estarlimpia y seca
6135 Agitar la pipeta y descartar las cuatro primeras gotas para luego colocaruna gota pequentildea de esta solucioacuten en la caacutemara
6136 Deje reposar por espacio de 3 minutos para que las ceacutelulas se sedimenten
6137 Enfocar con objetivo de 10x y contar en 4 cuadrados grandes angularesCuando se usa la pipeta automaacutetica se toma 20 mL (002 mL) desangre total con anticoagulante o sangre capilar con anticoagulante yse diluye en un tubo que contenga 380 mL de solucioacuten de Turk (aquiacutetenemos una dilucioacuten 120)
LECTURA
Fig 13
La lectura se realiza en los campos 1 3 7 y 9 como estaacute indicado en la figuraAdemaacutes de los leucocitos contados dentro de cada uno de los cuadrantes sedeben contar todos los leucocitos que se encuentren adheridos en la liacuteneahorizontal superior y vertical exterior o de lo contrario todos los leucocitosadheridos a la liacutenea horizontal inferior y vertical interior
614 Resultados
Nordm de leucocitos x mm3 = leucocitos contados en 4 camposdividealtura x dilucioacuten x aacuterea
Reemplazando = leucocitos contados en 4 camposdivide110 x 120 x 4=
Leucocitos contados en 4 camposdivide4200=
X1 divide4200= Nordm leucocitos contados x 50
615 Valores de referencia
5000 - 10 000 leucocitos mm3
616 Correccioacuten de valores para restar eritrocitos nucleados
Los normoblastos no se destruyen (lisis) en el liacutequido de dilucioacuten por lo tantopueden observarse al realizar el recuento leucocitario y confundirse con losleucocitos de tal manera que se debe emplear la siguiente foacutermula
Caacutelculo
La concentracioacuten del nuacutemero de normoblastos (por litro) esNuacutemero de normoblatos contados x concentracioacuten o nuacutemero de leucocitos100 + Nordm de normoblastos contados
Ejemplo
Si se cuentan 50 normoblastos y la concentracioacuten del nuacutemero de leucocitos es16 x 109l la concentracioacuten del nuacutemero de normoblastos seraacute
50 x16 = 53 x 109l
100 + 50
y la concentracioacuten de leucocitos corregida seraacute 16 - 53 = 107 x 109lEn unidades tradicionales las concentraciones de normoblastos y leucocitosse expresan por miliacutemetro cuacutebico En tales unidades el caacutelculo correspondienteal ejemplo que se ha dado seriacutea
50 x 16 000 = 5300 mm3
100 + 50
Recuento corregido de gloacutebulos blancos o leucocitos = 16 000 - 5300 = 10 700 mm3
Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2
62 RECUENTO DE GLOacuteBULOS ROJOS
Principio
La sangre se diluye en un liacutequido que nos permite observar claramente loshematiacutees luego esta dilucioacuten se coloca en una caacutemara de Neubauer con laayuda de una pipeta automaacutetica o pipeta Pasteur y se cuentan en el microscopioa un objetivo de 40x para calcular el nuacutemero de gloacutebulos rojos por mm3
621 Equipos
- Microscopio
- Hemocitoacutemetro (caacutemara de Neubauer)
622 Materiales y reactivos requeridos
6221 Pipeta de gloacutebulos rojos (De Thoma) o pipeta automaacutetica (de 0-100 mL)
Presenta cerca del extremo superior una marca de 101 inmediatamentecontinuacutea una dilatacioacuten (bulbo) que contiene una perla roja mezcladoraluego sigue el tallo (extremo maacutes largo) el cual estaacute dividido en 10 partescon 2 marcas 1 acabando el bulbo y 05 a la mitad del tallo Se requiereigual que el recuento de leucocitos una boquilla para aspirar
6222 Diluyente de gloacutebulos rojos Cloruro de Sodio al 09 (ver anexo)
Diluyente de Hayem (ver anexo)
6223 Contador manual (soacutelo si fuera necesario)
6224 Papel filtro
623 Procedimiento
6231 Mezclar la sangre obtenida con el anticoagulante o tomar sangre capilar
6232 Llenar la pipeta de gloacutebulos rojos con sangre hasta la marca de 05para realizar una dilucioacuten de 1200 y si se carga hasta 1 la dilucioacutenseraacute 1100 Limpiar la punta con gasa o papel absorbente
6233 Introducir la pipeta en el tubo o frasquito conteniendo diluyente (Hayem)y llenar de liacutequido de dilucioacuten hasta la marca de 101
6234 Se coloca en un rotador automaacutetico o se hace rotar manualmente de2 a 3 minutos
6235 Agitar bien la pipeta y descartar 3 a 4 gotas del tallo luego colocar unagota pequentildea cerca de un extremo de la caacutemara para que por capilaridadse llene exactamente
6236 Hacer el recuento con objetivo de 40xSe puede realizar con la pipeta automaacutetica se toma 20 mL (002mL)de sangre total con anticoagulante o sangre capilar y se deposita enun tubo de 12 x 75 que contenga 4 mL de solucioacuten de Hayem (aquiacute setiene una dilucioacuten de 1200) Se deja reposar aproximadamente 5minutos y se procede a cargar la caacutemara con la misma pipeta usandoun nuevo tip El inconveniente aquiacute es el gasto de reactivo (4 mL) perolas medidas son mas exactas
6237 Dejar en reposo por 3 minutos
6238 Enfocar la cuadriacutecula a 10x luego con el objetivo de 40x contar sobreel cuadrado grande central de la caacutemara soacutelo en 5 cuadrados pequentildeosuno central y cuatro angulares (80 cuadraditos en total)
6239 En el recuento se incluyen las ceacutelulas que cubren o tocan por dentroo por fuera las liacuteneas limitantes superior e izquierda en el cuadradopequentildeo de recuento y no se consideran los correspondientes a losliacutemites inferior y derechoSe hace el recuento en los puntos ABCD y Ey se sigue los mismos paraacutemetros del recuento de leucocitos
LECTURA
Fig 14
624 Resultados
Nordm de hematiacutees x mm3 = hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeosaltura x dilucioacuten X aacuterea
Reemplazando = hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeos110 x 1200 x 15
= hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeos divide 110 000
= hematiacutees contados x 10 000
625 Valores de referencia
(Unidades tradicionales millones de ceacutelulasmm3)
Hombres 4 500 000 - 5 500 000
Mujeres 4 000 000 - 5 000 000
Nintildeos (4 antildeos) 4 200 000 - 5 200 000
Lactantes (1 - 6 meses) 3 800 000 - 5 200 000
Recieacuten nacidos 5 000 000 - 6 000 000
Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2
63 DETERMINACIOacuteN DEL VOLUMEN GLOBULAR (Hematocrito)
Mide la fraccioacuten que comprende a los gloacutebulos rojos (masa globular) respectoal
volumen total de la muestra de sangre venosa o capilar Puede expresarseen
porcentaje o como valor decimal
Hto= altura de la columna de gloacutebulos rojosdivide altura de la columna de sangre
total(gloacutebulos rojos maacutes plasma)
631 Meacutetodo de Wintrobe
Materiales requeridos
- Tubo de Wintrobe graduado de 0 - 100 mm
- Pipetas Pasteur o pipetas de transferencia
- Tapoacuten de goma
Procedimiento
diams Llenar la sangre extraiacuteda con anticoagulante con una pipeta pasteur
comenzandodesde el fondo hasta la marca superior de 100 mm teniendocuidado
de no provocar espuma
diams Tapar el tubo con un tapoacuten de goma para evitar la evaporacioacuten
diams Centrifugar a 3000 rpm por 30 minutos
Resultados (lectura)
Del tubo graduado se mide directamente el nivel de la columna de gloacutebulosrojos
Valores de referencia
Hombres 40 - 54Mujeres 38 - 48
Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2
632 Meacutetodo de microhematocrito
Materiales requeridos
- Capilares rojos y azules (75 mm x 15 mm)
- Plastilina
Procedimiento
diams Tomar la muestra en capilares rojos heparinizados directamente del pulpejodel
dedo o utilizar capilares azules sin heparina para sangre venosacon
anticoagulante de Wintrobe o EDTA Debe llenarse aproximadamente70 - 80
del capilar
diams Ocluir (tapar) un extremo del capilar con plastilina
diams Colocar el capilar sobre la plataforma del cabezal de una centriacutefuga demicrohematocrito con el extremo ocluido adherido al reborde externo de laplataforma
diams Centrifugar por 5 minutos entre 10 000 - 12 000 rpm
Resultados (lectura)
La lectura se realiza con una escala estandarizada que expenden en el comercio
Uso de la escala
diams Sostenga el tubo frente a la escala de manera que el fondo de la columnade eritrocitos (no el extremo inferior del tubo) quede exactamente al mismonivel de la liacutenea horizontal correspondiente al cero
diams Desplace el tubo a traveacutes de la escala hasta que la liacutenea marcada con elnuacutemero 10 quede al nivel del tope de la columna de plasma Vigile que elfondo de la
columna de eritrocitos continuacutee sobre la liacutenea cero El tubodebe encontrarse completamente en posicioacuten vertical
diams La liacutenea que pase al nivel del tope de la columna de eritrocitos indicaraacute lafraccioacuten de volumen de eacutestos
Valores de referencia
Hombres 40 - 50
Mujeres 38 - 44
Nintildeos (5 antildeos) 38 - 44
Lactantes (3 meses) 37 - 42
Recieacuten nacidos 50 - 58
La disposicioacuten celular esParte superior una columna de plasmaEn la interfase estaacuten los leucocitos yplaquetasParte inferior estaacute la columna deeritrocitos (Fig 15)
64 DOSAJE DE HEMOGLOBINA
Principio
La sangre se diluye en liacutequido de Drabkin el cual hemoliza los hematiacutees yconvierte la hemoglobina en cianometahemoglobina (cianuro de hemiglobina)La solucioacuten que se produce se lee por medio de un espectrofotoacutemetro ofotocoloriacutemetro Su grado de absorbancia es proporcional a la cantidad dehemoglobina que contenga la sangre
641 Materiales y reactivos
6411 Un coloriacutemetro fotoeleacutectrico o un espectrofotoacutemetro
6412 Pipetas
diams Una pipeta para sangre (pipeta de Sahli) graduada hasta 002 mL contubo de goma y boquilla
diams Una pipeta de vidrio graduada de 5 mL
6413 Tubos de ensayo
6414 Reactivo de Drabkin para dilucioacuten
Este reactivo se puede adquirir en tabletas o polvos para disolver en 1litro de agua destilada Si se dispone de una balanza analiacutetica la preparacioacutense puede hacer en el laboratorio Esta solucioacuten se puedeconservar durante un mes en un frasco de vidrio oscuro Deseacutechese sise enturbia
superficie del primer portaobjeto El grosor delfrotis sanguiacuteneo puede variar seguacuten sea el aacutengulo que formen entresiacute ambos portaobjetos Asiacute si es superior a 45ordm la extensioacuten obtenidaseraacute gruesa y corta si es inferior a 45ordm seraacute larga y fina El secado delfrotis es a temperatura ambiente y en posicioacuten horizontal
Fig 12
1048729 Zona excesivamente gruesa Se halla en la regioacuten inmediata al punto departida de la extensioacuten (cabeza) En ella se aprecia siempre un aumento delinfocitos
1048729 Zona excesivamente fina Corresponde al final de la extensioacuten y termina enun aacuterea donde las ceacutelulas adoptan una posicioacuten acartonada (barbas) Enesta regioacuten existe un exceso de granulocitos y monocitos
1048729 Zona ideal Corresponde a la regioacuten intermedia del frotis y en ella existe unreparto equilibrado de ceacutelulas
52 COLORACIONES USADAS
Una vez seco el frotis se procede a la tincioacuten hematoloacutegica con el colorante deRomanowsky constituido por la mezcla de eosina y azul de metileno Dentrode eacutestas tenemos
521 Colorante de Giemsa
522 Colorante de May-Grunwald
523 Colorante de Wright
524 Colorante de Leishman
Preparacioacuten de colorantes (Anexo A)
1048729 Para el estudio de las ceacutelulas sanguiacuteneas utilizar el colorante 523 y 524
1048729 Para el estudio de hemoparaacutesitos utilizar el colorante 521
1048729 Utilizar el colorante 522 para casos especiales en que se desee observar
con mayor claridad y especificidad los graacutenulos de los neutrofilos
53 TINCIOacuteN CON COLORANTE DE WRIGHT
531 Fundamento
El colorante de Wright va a permitir suministrar un medio para estudiar lasangre y determinar las variaciones y anormalidades de estructura forma ytamantildeo de los eritrocitos su contenido de hemoglobina y sus propiedades decoloracioacuten La informacioacuten obtenida de un frotis de sangre perifeacuterica dependeen gran parte de la calidad del extendido y la coloracioacuten
532 Materiales
5321 Colorante de Wright (Anexo A)
5322 Frasco gotero
5323 Solucioacuten amortiguada tamponada (Anexo A)
533 Procedimiento
5331 Una vez obtenido el frotis sanguiacuteneo se le dejaraacute secar entre 15 y 20minutos
5332 Luego se coloca la preparacioacuten en un soporte y se cubre con el colorantede Wright dejaacutendolo por espacio de 5 minutos
5333 Posteriormente se antildeade solucioacuten amortiguada tamponada en partesiguales hasta obtener un brillo metaacutelico dejando 6 minutos adicionales
5334 Finalmente se lava con agua corriente y se deja secar
5335 Se coloca en el microscopio y con pequentildeo aumento se revisa lacalidad de la coloracioacuten la cantidad aproximada de gloacutebulos blancosy se escoge el sitio para iniciar el recuento Se coloca una gota deaceite de inmersioacuten y se enfoca a un aumento de 100xLa forma de los gloacutebulos rojos se examinaraacute detenidamente observandoademaacutes del color (cantidad de hemoglobina) presencia deplaquetas su agrupacioacuten y distribucioacuten
5336 Posteriormente se hace el recuento diferencial de gloacutebulos blancosen 100
ceacutelulas para lo cual se deberaacute conocer las diferencias entreneutroacutefilos eosinoacutefilos
linfocitos y monocitosUna extensioacuten de sangre bien tentildeida debe caracterizarse
por unabuena diferenciacioacuten de las estructuras subcelulares en los leucocitosuna
coloracioacuten rosada de los hematiacutees y la ausencia de precipitados
Los defectos maacutes frecuentes observados en la tincioacuten del frotis sanguiacuteneoson
Coloracioacuten excesivamente azul debido a
1048729 Frotis excesivamente grueso
1048729 Lavado insuficiente
1048729 Tincioacuten muy prolongada
1048729 Empleo de colorante excesivamente alcalino
Coloracioacuten con una tonalidad rosada
1048729 El colorante el tampoacuten o el agua de lavado tienen un pH demasiadoaacutecido
Presencia de precipitados
1048729 Obedecen a una accioacuten excesiva del colorante Esto se puede evitarcon la
filtracioacuten
SECCIOacuteN 6
HEMOGRAMA-HEMOGLOBINA-HEMATOCRITO
El hemograma de Shilling constituye uno de los exaacutemenes de laboratorio
maacutesusados en el campo de la hematologiacutea Comprende las siguientes pruebas
61 RECUENTO LEUCOCITARIO
Principio
La sangre anticoagulada se deposita en un liacutequido que permite evidenciar
losleucocitos mantenieacutendolos visibles mientras que los eritrocitos
sonhemolizados El recuento del nuacutemero de leucocitos o gloacutebulos blancos se
expresapor mm3 (miliacutemetro cuacutebico)
611 Equipos
- Microscopio
- Hemocitoacutemetro (Caacutemara de Neubauer)
Consta de los siguientes elementos
diams Una laacutemina portaobjeto gruesa en el centro se hallan dos
superficiescuadriculadas iguales separadas del resto de la laacutemina por surcos y
dosbarras transversales algo maacutes elevadas
diams Una laminilla cubreobjetos oacutepticamente plana que al colocarse sobrelas barras
elevadas de la laacutemina forma una caacutemara entre el cubreobjetosy la superficie
cuadriculadaLa altura entre el cubreobjetos y la laacutemina portaobjetos es de 01
mmCada cuadriacutecula mide 3 mm de lado y se divide en 9 cuadrados grandesCada
uno de los cuales mide 1 mm2 de superficie que se subdivide a suvez en 16
cuadrados medianos El cuadrado grande central se divide en25 cuadrados
pequentildeos y cada uno de ellos en 16 cuadraditos Cadacuadrado pequentildeo mide
02 mm de lado (004 mm2 de superficie) y cadacuadradito mide 005 mm de lado
(00025 mm2 de superficie)
612 Materiales y reactivos requeridos
6121 Pipeta de gloacutebulos blancos (De Thoma) o pipeta automaacutetica (de 0 a 100 mL)Presenta cerca del extremo superior una marca de 11 inmediatamentecontinuacutea una dilatacioacuten (bulbo) que contiene una perla que funciona comomezcladora luego sigue el extremo maacutes largo de la pipeta (tallo) que estaacutedividida en 10 partes con 2 marcas 1 (parte final del bulbo) y 05 (a la mitaddel tallo) Se le acopla a su extremo superior 1 tubo de goma y una bombillapara aspirar
6122 Diluyente de gloacutebulos blancos Solucioacuten de Turk al 1
6123 Contador manual (Soacutelo si fuera necesario)
6124 Papel filtro
613 Procedimiento
6131 Una vez obtenida la sangre con anticoagulante o sangre capilar deldedo se procede a aspirar la sangre con la pipeta de gloacutebulos blancoshasta la marca de 05 y a limpiar la punta con papel absorbente
6132 Introducir la pipeta en el tubo que contenga solucioacuten de Turk y absorberhasta la marca de 11 (no debe haber burbujas)
6133 Tapar ambos extremos y proceder a mezclar manualmente o en unrotador automaacutetico por 2 oacute 3 minutos
6134 Monte la laminilla de vidrio en la caacutemara para recuento que debe estarlimpia y seca
6135 Agitar la pipeta y descartar las cuatro primeras gotas para luego colocaruna gota pequentildea de esta solucioacuten en la caacutemara
6136 Deje reposar por espacio de 3 minutos para que las ceacutelulas se sedimenten
6137 Enfocar con objetivo de 10x y contar en 4 cuadrados grandes angularesCuando se usa la pipeta automaacutetica se toma 20 mL (002 mL) desangre total con anticoagulante o sangre capilar con anticoagulante yse diluye en un tubo que contenga 380 mL de solucioacuten de Turk (aquiacutetenemos una dilucioacuten 120)
LECTURA
Fig 13
La lectura se realiza en los campos 1 3 7 y 9 como estaacute indicado en la figuraAdemaacutes de los leucocitos contados dentro de cada uno de los cuadrantes sedeben contar todos los leucocitos que se encuentren adheridos en la liacuteneahorizontal superior y vertical exterior o de lo contrario todos los leucocitosadheridos a la liacutenea horizontal inferior y vertical interior
614 Resultados
Nordm de leucocitos x mm3 = leucocitos contados en 4 camposdividealtura x dilucioacuten x aacuterea
Reemplazando = leucocitos contados en 4 camposdivide110 x 120 x 4=
Leucocitos contados en 4 camposdivide4200=
X1 divide4200= Nordm leucocitos contados x 50
615 Valores de referencia
5000 - 10 000 leucocitos mm3
616 Correccioacuten de valores para restar eritrocitos nucleados
Los normoblastos no se destruyen (lisis) en el liacutequido de dilucioacuten por lo tantopueden observarse al realizar el recuento leucocitario y confundirse con losleucocitos de tal manera que se debe emplear la siguiente foacutermula
Caacutelculo
La concentracioacuten del nuacutemero de normoblastos (por litro) esNuacutemero de normoblatos contados x concentracioacuten o nuacutemero de leucocitos100 + Nordm de normoblastos contados
Ejemplo
Si se cuentan 50 normoblastos y la concentracioacuten del nuacutemero de leucocitos es16 x 109l la concentracioacuten del nuacutemero de normoblastos seraacute
50 x16 = 53 x 109l
100 + 50
y la concentracioacuten de leucocitos corregida seraacute 16 - 53 = 107 x 109lEn unidades tradicionales las concentraciones de normoblastos y leucocitosse expresan por miliacutemetro cuacutebico En tales unidades el caacutelculo correspondienteal ejemplo que se ha dado seriacutea
50 x 16 000 = 5300 mm3
100 + 50
Recuento corregido de gloacutebulos blancos o leucocitos = 16 000 - 5300 = 10 700 mm3
Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2
62 RECUENTO DE GLOacuteBULOS ROJOS
Principio
La sangre se diluye en un liacutequido que nos permite observar claramente loshematiacutees luego esta dilucioacuten se coloca en una caacutemara de Neubauer con laayuda de una pipeta automaacutetica o pipeta Pasteur y se cuentan en el microscopioa un objetivo de 40x para calcular el nuacutemero de gloacutebulos rojos por mm3
621 Equipos
- Microscopio
- Hemocitoacutemetro (caacutemara de Neubauer)
622 Materiales y reactivos requeridos
6221 Pipeta de gloacutebulos rojos (De Thoma) o pipeta automaacutetica (de 0-100 mL)
Presenta cerca del extremo superior una marca de 101 inmediatamentecontinuacutea una dilatacioacuten (bulbo) que contiene una perla roja mezcladoraluego sigue el tallo (extremo maacutes largo) el cual estaacute dividido en 10 partescon 2 marcas 1 acabando el bulbo y 05 a la mitad del tallo Se requiereigual que el recuento de leucocitos una boquilla para aspirar
6222 Diluyente de gloacutebulos rojos Cloruro de Sodio al 09 (ver anexo)
Diluyente de Hayem (ver anexo)
6223 Contador manual (soacutelo si fuera necesario)
6224 Papel filtro
623 Procedimiento
6231 Mezclar la sangre obtenida con el anticoagulante o tomar sangre capilar
6232 Llenar la pipeta de gloacutebulos rojos con sangre hasta la marca de 05para realizar una dilucioacuten de 1200 y si se carga hasta 1 la dilucioacutenseraacute 1100 Limpiar la punta con gasa o papel absorbente
6233 Introducir la pipeta en el tubo o frasquito conteniendo diluyente (Hayem)y llenar de liacutequido de dilucioacuten hasta la marca de 101
6234 Se coloca en un rotador automaacutetico o se hace rotar manualmente de2 a 3 minutos
6235 Agitar bien la pipeta y descartar 3 a 4 gotas del tallo luego colocar unagota pequentildea cerca de un extremo de la caacutemara para que por capilaridadse llene exactamente
6236 Hacer el recuento con objetivo de 40xSe puede realizar con la pipeta automaacutetica se toma 20 mL (002mL)de sangre total con anticoagulante o sangre capilar y se deposita enun tubo de 12 x 75 que contenga 4 mL de solucioacuten de Hayem (aquiacute setiene una dilucioacuten de 1200) Se deja reposar aproximadamente 5minutos y se procede a cargar la caacutemara con la misma pipeta usandoun nuevo tip El inconveniente aquiacute es el gasto de reactivo (4 mL) perolas medidas son mas exactas
6237 Dejar en reposo por 3 minutos
6238 Enfocar la cuadriacutecula a 10x luego con el objetivo de 40x contar sobreel cuadrado grande central de la caacutemara soacutelo en 5 cuadrados pequentildeosuno central y cuatro angulares (80 cuadraditos en total)
6239 En el recuento se incluyen las ceacutelulas que cubren o tocan por dentroo por fuera las liacuteneas limitantes superior e izquierda en el cuadradopequentildeo de recuento y no se consideran los correspondientes a losliacutemites inferior y derechoSe hace el recuento en los puntos ABCD y Ey se sigue los mismos paraacutemetros del recuento de leucocitos
LECTURA
Fig 14
624 Resultados
Nordm de hematiacutees x mm3 = hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeosaltura x dilucioacuten X aacuterea
Reemplazando = hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeos110 x 1200 x 15
= hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeos divide 110 000
= hematiacutees contados x 10 000
625 Valores de referencia
(Unidades tradicionales millones de ceacutelulasmm3)
Hombres 4 500 000 - 5 500 000
Mujeres 4 000 000 - 5 000 000
Nintildeos (4 antildeos) 4 200 000 - 5 200 000
Lactantes (1 - 6 meses) 3 800 000 - 5 200 000
Recieacuten nacidos 5 000 000 - 6 000 000
Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2
63 DETERMINACIOacuteN DEL VOLUMEN GLOBULAR (Hematocrito)
Mide la fraccioacuten que comprende a los gloacutebulos rojos (masa globular) respectoal
volumen total de la muestra de sangre venosa o capilar Puede expresarseen
porcentaje o como valor decimal
Hto= altura de la columna de gloacutebulos rojosdivide altura de la columna de sangre
total(gloacutebulos rojos maacutes plasma)
631 Meacutetodo de Wintrobe
Materiales requeridos
- Tubo de Wintrobe graduado de 0 - 100 mm
- Pipetas Pasteur o pipetas de transferencia
- Tapoacuten de goma
Procedimiento
diams Llenar la sangre extraiacuteda con anticoagulante con una pipeta pasteur
comenzandodesde el fondo hasta la marca superior de 100 mm teniendocuidado
de no provocar espuma
diams Tapar el tubo con un tapoacuten de goma para evitar la evaporacioacuten
diams Centrifugar a 3000 rpm por 30 minutos
Resultados (lectura)
Del tubo graduado se mide directamente el nivel de la columna de gloacutebulosrojos
Valores de referencia
Hombres 40 - 54Mujeres 38 - 48
Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2
632 Meacutetodo de microhematocrito
Materiales requeridos
- Capilares rojos y azules (75 mm x 15 mm)
- Plastilina
Procedimiento
diams Tomar la muestra en capilares rojos heparinizados directamente del pulpejodel
dedo o utilizar capilares azules sin heparina para sangre venosacon
anticoagulante de Wintrobe o EDTA Debe llenarse aproximadamente70 - 80
del capilar
diams Ocluir (tapar) un extremo del capilar con plastilina
diams Colocar el capilar sobre la plataforma del cabezal de una centriacutefuga demicrohematocrito con el extremo ocluido adherido al reborde externo de laplataforma
diams Centrifugar por 5 minutos entre 10 000 - 12 000 rpm
Resultados (lectura)
La lectura se realiza con una escala estandarizada que expenden en el comercio
Uso de la escala
diams Sostenga el tubo frente a la escala de manera que el fondo de la columnade eritrocitos (no el extremo inferior del tubo) quede exactamente al mismonivel de la liacutenea horizontal correspondiente al cero
diams Desplace el tubo a traveacutes de la escala hasta que la liacutenea marcada con elnuacutemero 10 quede al nivel del tope de la columna de plasma Vigile que elfondo de la
columna de eritrocitos continuacutee sobre la liacutenea cero El tubodebe encontrarse completamente en posicioacuten vertical
diams La liacutenea que pase al nivel del tope de la columna de eritrocitos indicaraacute lafraccioacuten de volumen de eacutestos
Valores de referencia
Hombres 40 - 50
Mujeres 38 - 44
Nintildeos (5 antildeos) 38 - 44
Lactantes (3 meses) 37 - 42
Recieacuten nacidos 50 - 58
La disposicioacuten celular esParte superior una columna de plasmaEn la interfase estaacuten los leucocitos yplaquetasParte inferior estaacute la columna deeritrocitos (Fig 15)
64 DOSAJE DE HEMOGLOBINA
Principio
La sangre se diluye en liacutequido de Drabkin el cual hemoliza los hematiacutees yconvierte la hemoglobina en cianometahemoglobina (cianuro de hemiglobina)La solucioacuten que se produce se lee por medio de un espectrofotoacutemetro ofotocoloriacutemetro Su grado de absorbancia es proporcional a la cantidad dehemoglobina que contenga la sangre
641 Materiales y reactivos
6411 Un coloriacutemetro fotoeleacutectrico o un espectrofotoacutemetro
6412 Pipetas
diams Una pipeta para sangre (pipeta de Sahli) graduada hasta 002 mL contubo de goma y boquilla
diams Una pipeta de vidrio graduada de 5 mL
6413 Tubos de ensayo
6414 Reactivo de Drabkin para dilucioacuten
Este reactivo se puede adquirir en tabletas o polvos para disolver en 1litro de agua destilada Si se dispone de una balanza analiacutetica la preparacioacutense puede hacer en el laboratorio Esta solucioacuten se puedeconservar durante un mes en un frasco de vidrio oscuro Deseacutechese sise enturbia
Preparacioacuten de colorantes (Anexo A)
1048729 Para el estudio de las ceacutelulas sanguiacuteneas utilizar el colorante 523 y 524
1048729 Para el estudio de hemoparaacutesitos utilizar el colorante 521
1048729 Utilizar el colorante 522 para casos especiales en que se desee observar
con mayor claridad y especificidad los graacutenulos de los neutrofilos
53 TINCIOacuteN CON COLORANTE DE WRIGHT
531 Fundamento
El colorante de Wright va a permitir suministrar un medio para estudiar lasangre y determinar las variaciones y anormalidades de estructura forma ytamantildeo de los eritrocitos su contenido de hemoglobina y sus propiedades decoloracioacuten La informacioacuten obtenida de un frotis de sangre perifeacuterica dependeen gran parte de la calidad del extendido y la coloracioacuten
532 Materiales
5321 Colorante de Wright (Anexo A)
5322 Frasco gotero
5323 Solucioacuten amortiguada tamponada (Anexo A)
533 Procedimiento
5331 Una vez obtenido el frotis sanguiacuteneo se le dejaraacute secar entre 15 y 20minutos
5332 Luego se coloca la preparacioacuten en un soporte y se cubre con el colorantede Wright dejaacutendolo por espacio de 5 minutos
5333 Posteriormente se antildeade solucioacuten amortiguada tamponada en partesiguales hasta obtener un brillo metaacutelico dejando 6 minutos adicionales
5334 Finalmente se lava con agua corriente y se deja secar
5335 Se coloca en el microscopio y con pequentildeo aumento se revisa lacalidad de la coloracioacuten la cantidad aproximada de gloacutebulos blancosy se escoge el sitio para iniciar el recuento Se coloca una gota deaceite de inmersioacuten y se enfoca a un aumento de 100xLa forma de los gloacutebulos rojos se examinaraacute detenidamente observandoademaacutes del color (cantidad de hemoglobina) presencia deplaquetas su agrupacioacuten y distribucioacuten
5336 Posteriormente se hace el recuento diferencial de gloacutebulos blancosen 100
ceacutelulas para lo cual se deberaacute conocer las diferencias entreneutroacutefilos eosinoacutefilos
linfocitos y monocitosUna extensioacuten de sangre bien tentildeida debe caracterizarse
por unabuena diferenciacioacuten de las estructuras subcelulares en los leucocitosuna
coloracioacuten rosada de los hematiacutees y la ausencia de precipitados
Los defectos maacutes frecuentes observados en la tincioacuten del frotis sanguiacuteneoson
Coloracioacuten excesivamente azul debido a
1048729 Frotis excesivamente grueso
1048729 Lavado insuficiente
1048729 Tincioacuten muy prolongada
1048729 Empleo de colorante excesivamente alcalino
Coloracioacuten con una tonalidad rosada
1048729 El colorante el tampoacuten o el agua de lavado tienen un pH demasiadoaacutecido
Presencia de precipitados
1048729 Obedecen a una accioacuten excesiva del colorante Esto se puede evitarcon la
filtracioacuten
SECCIOacuteN 6
HEMOGRAMA-HEMOGLOBINA-HEMATOCRITO
El hemograma de Shilling constituye uno de los exaacutemenes de laboratorio
maacutesusados en el campo de la hematologiacutea Comprende las siguientes pruebas
61 RECUENTO LEUCOCITARIO
Principio
La sangre anticoagulada se deposita en un liacutequido que permite evidenciar
losleucocitos mantenieacutendolos visibles mientras que los eritrocitos
sonhemolizados El recuento del nuacutemero de leucocitos o gloacutebulos blancos se
expresapor mm3 (miliacutemetro cuacutebico)
611 Equipos
- Microscopio
- Hemocitoacutemetro (Caacutemara de Neubauer)
Consta de los siguientes elementos
diams Una laacutemina portaobjeto gruesa en el centro se hallan dos
superficiescuadriculadas iguales separadas del resto de la laacutemina por surcos y
dosbarras transversales algo maacutes elevadas
diams Una laminilla cubreobjetos oacutepticamente plana que al colocarse sobrelas barras
elevadas de la laacutemina forma una caacutemara entre el cubreobjetosy la superficie
cuadriculadaLa altura entre el cubreobjetos y la laacutemina portaobjetos es de 01
mmCada cuadriacutecula mide 3 mm de lado y se divide en 9 cuadrados grandesCada
uno de los cuales mide 1 mm2 de superficie que se subdivide a suvez en 16
cuadrados medianos El cuadrado grande central se divide en25 cuadrados
pequentildeos y cada uno de ellos en 16 cuadraditos Cadacuadrado pequentildeo mide
02 mm de lado (004 mm2 de superficie) y cadacuadradito mide 005 mm de lado
(00025 mm2 de superficie)
612 Materiales y reactivos requeridos
6121 Pipeta de gloacutebulos blancos (De Thoma) o pipeta automaacutetica (de 0 a 100 mL)Presenta cerca del extremo superior una marca de 11 inmediatamentecontinuacutea una dilatacioacuten (bulbo) que contiene una perla que funciona comomezcladora luego sigue el extremo maacutes largo de la pipeta (tallo) que estaacutedividida en 10 partes con 2 marcas 1 (parte final del bulbo) y 05 (a la mitaddel tallo) Se le acopla a su extremo superior 1 tubo de goma y una bombillapara aspirar
6122 Diluyente de gloacutebulos blancos Solucioacuten de Turk al 1
6123 Contador manual (Soacutelo si fuera necesario)
6124 Papel filtro
613 Procedimiento
6131 Una vez obtenida la sangre con anticoagulante o sangre capilar deldedo se procede a aspirar la sangre con la pipeta de gloacutebulos blancoshasta la marca de 05 y a limpiar la punta con papel absorbente
6132 Introducir la pipeta en el tubo que contenga solucioacuten de Turk y absorberhasta la marca de 11 (no debe haber burbujas)
6133 Tapar ambos extremos y proceder a mezclar manualmente o en unrotador automaacutetico por 2 oacute 3 minutos
6134 Monte la laminilla de vidrio en la caacutemara para recuento que debe estarlimpia y seca
6135 Agitar la pipeta y descartar las cuatro primeras gotas para luego colocaruna gota pequentildea de esta solucioacuten en la caacutemara
6136 Deje reposar por espacio de 3 minutos para que las ceacutelulas se sedimenten
6137 Enfocar con objetivo de 10x y contar en 4 cuadrados grandes angularesCuando se usa la pipeta automaacutetica se toma 20 mL (002 mL) desangre total con anticoagulante o sangre capilar con anticoagulante yse diluye en un tubo que contenga 380 mL de solucioacuten de Turk (aquiacutetenemos una dilucioacuten 120)
LECTURA
Fig 13
La lectura se realiza en los campos 1 3 7 y 9 como estaacute indicado en la figuraAdemaacutes de los leucocitos contados dentro de cada uno de los cuadrantes sedeben contar todos los leucocitos que se encuentren adheridos en la liacuteneahorizontal superior y vertical exterior o de lo contrario todos los leucocitosadheridos a la liacutenea horizontal inferior y vertical interior
614 Resultados
Nordm de leucocitos x mm3 = leucocitos contados en 4 camposdividealtura x dilucioacuten x aacuterea
Reemplazando = leucocitos contados en 4 camposdivide110 x 120 x 4=
Leucocitos contados en 4 camposdivide4200=
X1 divide4200= Nordm leucocitos contados x 50
615 Valores de referencia
5000 - 10 000 leucocitos mm3
616 Correccioacuten de valores para restar eritrocitos nucleados
Los normoblastos no se destruyen (lisis) en el liacutequido de dilucioacuten por lo tantopueden observarse al realizar el recuento leucocitario y confundirse con losleucocitos de tal manera que se debe emplear la siguiente foacutermula
Caacutelculo
La concentracioacuten del nuacutemero de normoblastos (por litro) esNuacutemero de normoblatos contados x concentracioacuten o nuacutemero de leucocitos100 + Nordm de normoblastos contados
Ejemplo
Si se cuentan 50 normoblastos y la concentracioacuten del nuacutemero de leucocitos es16 x 109l la concentracioacuten del nuacutemero de normoblastos seraacute
50 x16 = 53 x 109l
100 + 50
y la concentracioacuten de leucocitos corregida seraacute 16 - 53 = 107 x 109lEn unidades tradicionales las concentraciones de normoblastos y leucocitosse expresan por miliacutemetro cuacutebico En tales unidades el caacutelculo correspondienteal ejemplo que se ha dado seriacutea
50 x 16 000 = 5300 mm3
100 + 50
Recuento corregido de gloacutebulos blancos o leucocitos = 16 000 - 5300 = 10 700 mm3
Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2
62 RECUENTO DE GLOacuteBULOS ROJOS
Principio
La sangre se diluye en un liacutequido que nos permite observar claramente loshematiacutees luego esta dilucioacuten se coloca en una caacutemara de Neubauer con laayuda de una pipeta automaacutetica o pipeta Pasteur y se cuentan en el microscopioa un objetivo de 40x para calcular el nuacutemero de gloacutebulos rojos por mm3
621 Equipos
- Microscopio
- Hemocitoacutemetro (caacutemara de Neubauer)
622 Materiales y reactivos requeridos
6221 Pipeta de gloacutebulos rojos (De Thoma) o pipeta automaacutetica (de 0-100 mL)
Presenta cerca del extremo superior una marca de 101 inmediatamentecontinuacutea una dilatacioacuten (bulbo) que contiene una perla roja mezcladoraluego sigue el tallo (extremo maacutes largo) el cual estaacute dividido en 10 partescon 2 marcas 1 acabando el bulbo y 05 a la mitad del tallo Se requiereigual que el recuento de leucocitos una boquilla para aspirar
6222 Diluyente de gloacutebulos rojos Cloruro de Sodio al 09 (ver anexo)
Diluyente de Hayem (ver anexo)
6223 Contador manual (soacutelo si fuera necesario)
6224 Papel filtro
623 Procedimiento
6231 Mezclar la sangre obtenida con el anticoagulante o tomar sangre capilar
6232 Llenar la pipeta de gloacutebulos rojos con sangre hasta la marca de 05para realizar una dilucioacuten de 1200 y si se carga hasta 1 la dilucioacutenseraacute 1100 Limpiar la punta con gasa o papel absorbente
6233 Introducir la pipeta en el tubo o frasquito conteniendo diluyente (Hayem)y llenar de liacutequido de dilucioacuten hasta la marca de 101
6234 Se coloca en un rotador automaacutetico o se hace rotar manualmente de2 a 3 minutos
6235 Agitar bien la pipeta y descartar 3 a 4 gotas del tallo luego colocar unagota pequentildea cerca de un extremo de la caacutemara para que por capilaridadse llene exactamente
6236 Hacer el recuento con objetivo de 40xSe puede realizar con la pipeta automaacutetica se toma 20 mL (002mL)de sangre total con anticoagulante o sangre capilar y se deposita enun tubo de 12 x 75 que contenga 4 mL de solucioacuten de Hayem (aquiacute setiene una dilucioacuten de 1200) Se deja reposar aproximadamente 5minutos y se procede a cargar la caacutemara con la misma pipeta usandoun nuevo tip El inconveniente aquiacute es el gasto de reactivo (4 mL) perolas medidas son mas exactas
6237 Dejar en reposo por 3 minutos
6238 Enfocar la cuadriacutecula a 10x luego con el objetivo de 40x contar sobreel cuadrado grande central de la caacutemara soacutelo en 5 cuadrados pequentildeosuno central y cuatro angulares (80 cuadraditos en total)
6239 En el recuento se incluyen las ceacutelulas que cubren o tocan por dentroo por fuera las liacuteneas limitantes superior e izquierda en el cuadradopequentildeo de recuento y no se consideran los correspondientes a losliacutemites inferior y derechoSe hace el recuento en los puntos ABCD y Ey se sigue los mismos paraacutemetros del recuento de leucocitos
LECTURA
Fig 14
624 Resultados
Nordm de hematiacutees x mm3 = hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeosaltura x dilucioacuten X aacuterea
Reemplazando = hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeos110 x 1200 x 15
= hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeos divide 110 000
= hematiacutees contados x 10 000
625 Valores de referencia
(Unidades tradicionales millones de ceacutelulasmm3)
Hombres 4 500 000 - 5 500 000
Mujeres 4 000 000 - 5 000 000
Nintildeos (4 antildeos) 4 200 000 - 5 200 000
Lactantes (1 - 6 meses) 3 800 000 - 5 200 000
Recieacuten nacidos 5 000 000 - 6 000 000
Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2
63 DETERMINACIOacuteN DEL VOLUMEN GLOBULAR (Hematocrito)
Mide la fraccioacuten que comprende a los gloacutebulos rojos (masa globular) respectoal
volumen total de la muestra de sangre venosa o capilar Puede expresarseen
porcentaje o como valor decimal
Hto= altura de la columna de gloacutebulos rojosdivide altura de la columna de sangre
total(gloacutebulos rojos maacutes plasma)
631 Meacutetodo de Wintrobe
Materiales requeridos
- Tubo de Wintrobe graduado de 0 - 100 mm
- Pipetas Pasteur o pipetas de transferencia
- Tapoacuten de goma
Procedimiento
diams Llenar la sangre extraiacuteda con anticoagulante con una pipeta pasteur
comenzandodesde el fondo hasta la marca superior de 100 mm teniendocuidado
de no provocar espuma
diams Tapar el tubo con un tapoacuten de goma para evitar la evaporacioacuten
diams Centrifugar a 3000 rpm por 30 minutos
Resultados (lectura)
Del tubo graduado se mide directamente el nivel de la columna de gloacutebulosrojos
Valores de referencia
Hombres 40 - 54Mujeres 38 - 48
Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2
632 Meacutetodo de microhematocrito
Materiales requeridos
- Capilares rojos y azules (75 mm x 15 mm)
- Plastilina
Procedimiento
diams Tomar la muestra en capilares rojos heparinizados directamente del pulpejodel
dedo o utilizar capilares azules sin heparina para sangre venosacon
anticoagulante de Wintrobe o EDTA Debe llenarse aproximadamente70 - 80
del capilar
diams Ocluir (tapar) un extremo del capilar con plastilina
diams Colocar el capilar sobre la plataforma del cabezal de una centriacutefuga demicrohematocrito con el extremo ocluido adherido al reborde externo de laplataforma
diams Centrifugar por 5 minutos entre 10 000 - 12 000 rpm
Resultados (lectura)
La lectura se realiza con una escala estandarizada que expenden en el comercio
Uso de la escala
diams Sostenga el tubo frente a la escala de manera que el fondo de la columnade eritrocitos (no el extremo inferior del tubo) quede exactamente al mismonivel de la liacutenea horizontal correspondiente al cero
diams Desplace el tubo a traveacutes de la escala hasta que la liacutenea marcada con elnuacutemero 10 quede al nivel del tope de la columna de plasma Vigile que elfondo de la
columna de eritrocitos continuacutee sobre la liacutenea cero El tubodebe encontrarse completamente en posicioacuten vertical
diams La liacutenea que pase al nivel del tope de la columna de eritrocitos indicaraacute lafraccioacuten de volumen de eacutestos
Valores de referencia
Hombres 40 - 50
Mujeres 38 - 44
Nintildeos (5 antildeos) 38 - 44
Lactantes (3 meses) 37 - 42
Recieacuten nacidos 50 - 58
La disposicioacuten celular esParte superior una columna de plasmaEn la interfase estaacuten los leucocitos yplaquetasParte inferior estaacute la columna deeritrocitos (Fig 15)
64 DOSAJE DE HEMOGLOBINA
Principio
La sangre se diluye en liacutequido de Drabkin el cual hemoliza los hematiacutees yconvierte la hemoglobina en cianometahemoglobina (cianuro de hemiglobina)La solucioacuten que se produce se lee por medio de un espectrofotoacutemetro ofotocoloriacutemetro Su grado de absorbancia es proporcional a la cantidad dehemoglobina que contenga la sangre
641 Materiales y reactivos
6411 Un coloriacutemetro fotoeleacutectrico o un espectrofotoacutemetro
6412 Pipetas
diams Una pipeta para sangre (pipeta de Sahli) graduada hasta 002 mL contubo de goma y boquilla
diams Una pipeta de vidrio graduada de 5 mL
6413 Tubos de ensayo
6414 Reactivo de Drabkin para dilucioacuten
Este reactivo se puede adquirir en tabletas o polvos para disolver en 1litro de agua destilada Si se dispone de una balanza analiacutetica la preparacioacutense puede hacer en el laboratorio Esta solucioacuten se puedeconservar durante un mes en un frasco de vidrio oscuro Deseacutechese sise enturbia
5335 Se coloca en el microscopio y con pequentildeo aumento se revisa lacalidad de la coloracioacuten la cantidad aproximada de gloacutebulos blancosy se escoge el sitio para iniciar el recuento Se coloca una gota deaceite de inmersioacuten y se enfoca a un aumento de 100xLa forma de los gloacutebulos rojos se examinaraacute detenidamente observandoademaacutes del color (cantidad de hemoglobina) presencia deplaquetas su agrupacioacuten y distribucioacuten
5336 Posteriormente se hace el recuento diferencial de gloacutebulos blancosen 100
ceacutelulas para lo cual se deberaacute conocer las diferencias entreneutroacutefilos eosinoacutefilos
linfocitos y monocitosUna extensioacuten de sangre bien tentildeida debe caracterizarse
por unabuena diferenciacioacuten de las estructuras subcelulares en los leucocitosuna
coloracioacuten rosada de los hematiacutees y la ausencia de precipitados
Los defectos maacutes frecuentes observados en la tincioacuten del frotis sanguiacuteneoson
Coloracioacuten excesivamente azul debido a
1048729 Frotis excesivamente grueso
1048729 Lavado insuficiente
1048729 Tincioacuten muy prolongada
1048729 Empleo de colorante excesivamente alcalino
Coloracioacuten con una tonalidad rosada
1048729 El colorante el tampoacuten o el agua de lavado tienen un pH demasiadoaacutecido
Presencia de precipitados
1048729 Obedecen a una accioacuten excesiva del colorante Esto se puede evitarcon la
filtracioacuten
SECCIOacuteN 6
HEMOGRAMA-HEMOGLOBINA-HEMATOCRITO
El hemograma de Shilling constituye uno de los exaacutemenes de laboratorio
maacutesusados en el campo de la hematologiacutea Comprende las siguientes pruebas
61 RECUENTO LEUCOCITARIO
Principio
La sangre anticoagulada se deposita en un liacutequido que permite evidenciar
losleucocitos mantenieacutendolos visibles mientras que los eritrocitos
sonhemolizados El recuento del nuacutemero de leucocitos o gloacutebulos blancos se
expresapor mm3 (miliacutemetro cuacutebico)
611 Equipos
- Microscopio
- Hemocitoacutemetro (Caacutemara de Neubauer)
Consta de los siguientes elementos
diams Una laacutemina portaobjeto gruesa en el centro se hallan dos
superficiescuadriculadas iguales separadas del resto de la laacutemina por surcos y
dosbarras transversales algo maacutes elevadas
diams Una laminilla cubreobjetos oacutepticamente plana que al colocarse sobrelas barras
elevadas de la laacutemina forma una caacutemara entre el cubreobjetosy la superficie
cuadriculadaLa altura entre el cubreobjetos y la laacutemina portaobjetos es de 01
mmCada cuadriacutecula mide 3 mm de lado y se divide en 9 cuadrados grandesCada
uno de los cuales mide 1 mm2 de superficie que se subdivide a suvez en 16
cuadrados medianos El cuadrado grande central se divide en25 cuadrados
pequentildeos y cada uno de ellos en 16 cuadraditos Cadacuadrado pequentildeo mide
02 mm de lado (004 mm2 de superficie) y cadacuadradito mide 005 mm de lado
(00025 mm2 de superficie)
612 Materiales y reactivos requeridos
6121 Pipeta de gloacutebulos blancos (De Thoma) o pipeta automaacutetica (de 0 a 100 mL)Presenta cerca del extremo superior una marca de 11 inmediatamentecontinuacutea una dilatacioacuten (bulbo) que contiene una perla que funciona comomezcladora luego sigue el extremo maacutes largo de la pipeta (tallo) que estaacutedividida en 10 partes con 2 marcas 1 (parte final del bulbo) y 05 (a la mitaddel tallo) Se le acopla a su extremo superior 1 tubo de goma y una bombillapara aspirar
6122 Diluyente de gloacutebulos blancos Solucioacuten de Turk al 1
6123 Contador manual (Soacutelo si fuera necesario)
6124 Papel filtro
613 Procedimiento
6131 Una vez obtenida la sangre con anticoagulante o sangre capilar deldedo se procede a aspirar la sangre con la pipeta de gloacutebulos blancoshasta la marca de 05 y a limpiar la punta con papel absorbente
6132 Introducir la pipeta en el tubo que contenga solucioacuten de Turk y absorberhasta la marca de 11 (no debe haber burbujas)
6133 Tapar ambos extremos y proceder a mezclar manualmente o en unrotador automaacutetico por 2 oacute 3 minutos
6134 Monte la laminilla de vidrio en la caacutemara para recuento que debe estarlimpia y seca
6135 Agitar la pipeta y descartar las cuatro primeras gotas para luego colocaruna gota pequentildea de esta solucioacuten en la caacutemara
6136 Deje reposar por espacio de 3 minutos para que las ceacutelulas se sedimenten
6137 Enfocar con objetivo de 10x y contar en 4 cuadrados grandes angularesCuando se usa la pipeta automaacutetica se toma 20 mL (002 mL) desangre total con anticoagulante o sangre capilar con anticoagulante yse diluye en un tubo que contenga 380 mL de solucioacuten de Turk (aquiacutetenemos una dilucioacuten 120)
LECTURA
Fig 13
La lectura se realiza en los campos 1 3 7 y 9 como estaacute indicado en la figuraAdemaacutes de los leucocitos contados dentro de cada uno de los cuadrantes sedeben contar todos los leucocitos que se encuentren adheridos en la liacuteneahorizontal superior y vertical exterior o de lo contrario todos los leucocitosadheridos a la liacutenea horizontal inferior y vertical interior
614 Resultados
Nordm de leucocitos x mm3 = leucocitos contados en 4 camposdividealtura x dilucioacuten x aacuterea
Reemplazando = leucocitos contados en 4 camposdivide110 x 120 x 4=
Leucocitos contados en 4 camposdivide4200=
X1 divide4200= Nordm leucocitos contados x 50
615 Valores de referencia
5000 - 10 000 leucocitos mm3
616 Correccioacuten de valores para restar eritrocitos nucleados
Los normoblastos no se destruyen (lisis) en el liacutequido de dilucioacuten por lo tantopueden observarse al realizar el recuento leucocitario y confundirse con losleucocitos de tal manera que se debe emplear la siguiente foacutermula
Caacutelculo
La concentracioacuten del nuacutemero de normoblastos (por litro) esNuacutemero de normoblatos contados x concentracioacuten o nuacutemero de leucocitos100 + Nordm de normoblastos contados
Ejemplo
Si se cuentan 50 normoblastos y la concentracioacuten del nuacutemero de leucocitos es16 x 109l la concentracioacuten del nuacutemero de normoblastos seraacute
50 x16 = 53 x 109l
100 + 50
y la concentracioacuten de leucocitos corregida seraacute 16 - 53 = 107 x 109lEn unidades tradicionales las concentraciones de normoblastos y leucocitosse expresan por miliacutemetro cuacutebico En tales unidades el caacutelculo correspondienteal ejemplo que se ha dado seriacutea
50 x 16 000 = 5300 mm3
100 + 50
Recuento corregido de gloacutebulos blancos o leucocitos = 16 000 - 5300 = 10 700 mm3
Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2
62 RECUENTO DE GLOacuteBULOS ROJOS
Principio
La sangre se diluye en un liacutequido que nos permite observar claramente loshematiacutees luego esta dilucioacuten se coloca en una caacutemara de Neubauer con laayuda de una pipeta automaacutetica o pipeta Pasteur y se cuentan en el microscopioa un objetivo de 40x para calcular el nuacutemero de gloacutebulos rojos por mm3
621 Equipos
- Microscopio
- Hemocitoacutemetro (caacutemara de Neubauer)
622 Materiales y reactivos requeridos
6221 Pipeta de gloacutebulos rojos (De Thoma) o pipeta automaacutetica (de 0-100 mL)
Presenta cerca del extremo superior una marca de 101 inmediatamentecontinuacutea una dilatacioacuten (bulbo) que contiene una perla roja mezcladoraluego sigue el tallo (extremo maacutes largo) el cual estaacute dividido en 10 partescon 2 marcas 1 acabando el bulbo y 05 a la mitad del tallo Se requiereigual que el recuento de leucocitos una boquilla para aspirar
6222 Diluyente de gloacutebulos rojos Cloruro de Sodio al 09 (ver anexo)
Diluyente de Hayem (ver anexo)
6223 Contador manual (soacutelo si fuera necesario)
6224 Papel filtro
623 Procedimiento
6231 Mezclar la sangre obtenida con el anticoagulante o tomar sangre capilar
6232 Llenar la pipeta de gloacutebulos rojos con sangre hasta la marca de 05para realizar una dilucioacuten de 1200 y si se carga hasta 1 la dilucioacutenseraacute 1100 Limpiar la punta con gasa o papel absorbente
6233 Introducir la pipeta en el tubo o frasquito conteniendo diluyente (Hayem)y llenar de liacutequido de dilucioacuten hasta la marca de 101
6234 Se coloca en un rotador automaacutetico o se hace rotar manualmente de2 a 3 minutos
6235 Agitar bien la pipeta y descartar 3 a 4 gotas del tallo luego colocar unagota pequentildea cerca de un extremo de la caacutemara para que por capilaridadse llene exactamente
6236 Hacer el recuento con objetivo de 40xSe puede realizar con la pipeta automaacutetica se toma 20 mL (002mL)de sangre total con anticoagulante o sangre capilar y se deposita enun tubo de 12 x 75 que contenga 4 mL de solucioacuten de Hayem (aquiacute setiene una dilucioacuten de 1200) Se deja reposar aproximadamente 5minutos y se procede a cargar la caacutemara con la misma pipeta usandoun nuevo tip El inconveniente aquiacute es el gasto de reactivo (4 mL) perolas medidas son mas exactas
6237 Dejar en reposo por 3 minutos
6238 Enfocar la cuadriacutecula a 10x luego con el objetivo de 40x contar sobreel cuadrado grande central de la caacutemara soacutelo en 5 cuadrados pequentildeosuno central y cuatro angulares (80 cuadraditos en total)
6239 En el recuento se incluyen las ceacutelulas que cubren o tocan por dentroo por fuera las liacuteneas limitantes superior e izquierda en el cuadradopequentildeo de recuento y no se consideran los correspondientes a losliacutemites inferior y derechoSe hace el recuento en los puntos ABCD y Ey se sigue los mismos paraacutemetros del recuento de leucocitos
LECTURA
Fig 14
624 Resultados
Nordm de hematiacutees x mm3 = hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeosaltura x dilucioacuten X aacuterea
Reemplazando = hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeos110 x 1200 x 15
= hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeos divide 110 000
= hematiacutees contados x 10 000
625 Valores de referencia
(Unidades tradicionales millones de ceacutelulasmm3)
Hombres 4 500 000 - 5 500 000
Mujeres 4 000 000 - 5 000 000
Nintildeos (4 antildeos) 4 200 000 - 5 200 000
Lactantes (1 - 6 meses) 3 800 000 - 5 200 000
Recieacuten nacidos 5 000 000 - 6 000 000
Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2
63 DETERMINACIOacuteN DEL VOLUMEN GLOBULAR (Hematocrito)
Mide la fraccioacuten que comprende a los gloacutebulos rojos (masa globular) respectoal
volumen total de la muestra de sangre venosa o capilar Puede expresarseen
porcentaje o como valor decimal
Hto= altura de la columna de gloacutebulos rojosdivide altura de la columna de sangre
total(gloacutebulos rojos maacutes plasma)
631 Meacutetodo de Wintrobe
Materiales requeridos
- Tubo de Wintrobe graduado de 0 - 100 mm
- Pipetas Pasteur o pipetas de transferencia
- Tapoacuten de goma
Procedimiento
diams Llenar la sangre extraiacuteda con anticoagulante con una pipeta pasteur
comenzandodesde el fondo hasta la marca superior de 100 mm teniendocuidado
de no provocar espuma
diams Tapar el tubo con un tapoacuten de goma para evitar la evaporacioacuten
diams Centrifugar a 3000 rpm por 30 minutos
Resultados (lectura)
Del tubo graduado se mide directamente el nivel de la columna de gloacutebulosrojos
Valores de referencia
Hombres 40 - 54Mujeres 38 - 48
Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2
632 Meacutetodo de microhematocrito
Materiales requeridos
- Capilares rojos y azules (75 mm x 15 mm)
- Plastilina
Procedimiento
diams Tomar la muestra en capilares rojos heparinizados directamente del pulpejodel
dedo o utilizar capilares azules sin heparina para sangre venosacon
anticoagulante de Wintrobe o EDTA Debe llenarse aproximadamente70 - 80
del capilar
diams Ocluir (tapar) un extremo del capilar con plastilina
diams Colocar el capilar sobre la plataforma del cabezal de una centriacutefuga demicrohematocrito con el extremo ocluido adherido al reborde externo de laplataforma
diams Centrifugar por 5 minutos entre 10 000 - 12 000 rpm
Resultados (lectura)
La lectura se realiza con una escala estandarizada que expenden en el comercio
Uso de la escala
diams Sostenga el tubo frente a la escala de manera que el fondo de la columnade eritrocitos (no el extremo inferior del tubo) quede exactamente al mismonivel de la liacutenea horizontal correspondiente al cero
diams Desplace el tubo a traveacutes de la escala hasta que la liacutenea marcada con elnuacutemero 10 quede al nivel del tope de la columna de plasma Vigile que elfondo de la
columna de eritrocitos continuacutee sobre la liacutenea cero El tubodebe encontrarse completamente en posicioacuten vertical
diams La liacutenea que pase al nivel del tope de la columna de eritrocitos indicaraacute lafraccioacuten de volumen de eacutestos
Valores de referencia
Hombres 40 - 50
Mujeres 38 - 44
Nintildeos (5 antildeos) 38 - 44
Lactantes (3 meses) 37 - 42
Recieacuten nacidos 50 - 58
La disposicioacuten celular esParte superior una columna de plasmaEn la interfase estaacuten los leucocitos yplaquetasParte inferior estaacute la columna deeritrocitos (Fig 15)
64 DOSAJE DE HEMOGLOBINA
Principio
La sangre se diluye en liacutequido de Drabkin el cual hemoliza los hematiacutees yconvierte la hemoglobina en cianometahemoglobina (cianuro de hemiglobina)La solucioacuten que se produce se lee por medio de un espectrofotoacutemetro ofotocoloriacutemetro Su grado de absorbancia es proporcional a la cantidad dehemoglobina que contenga la sangre
641 Materiales y reactivos
6411 Un coloriacutemetro fotoeleacutectrico o un espectrofotoacutemetro
6412 Pipetas
diams Una pipeta para sangre (pipeta de Sahli) graduada hasta 002 mL contubo de goma y boquilla
diams Una pipeta de vidrio graduada de 5 mL
6413 Tubos de ensayo
6414 Reactivo de Drabkin para dilucioacuten
Este reactivo se puede adquirir en tabletas o polvos para disolver en 1litro de agua destilada Si se dispone de una balanza analiacutetica la preparacioacutense puede hacer en el laboratorio Esta solucioacuten se puedeconservar durante un mes en un frasco de vidrio oscuro Deseacutechese sise enturbia
SECCIOacuteN 6
HEMOGRAMA-HEMOGLOBINA-HEMATOCRITO
El hemograma de Shilling constituye uno de los exaacutemenes de laboratorio
maacutesusados en el campo de la hematologiacutea Comprende las siguientes pruebas
61 RECUENTO LEUCOCITARIO
Principio
La sangre anticoagulada se deposita en un liacutequido que permite evidenciar
losleucocitos mantenieacutendolos visibles mientras que los eritrocitos
sonhemolizados El recuento del nuacutemero de leucocitos o gloacutebulos blancos se
expresapor mm3 (miliacutemetro cuacutebico)
611 Equipos
- Microscopio
- Hemocitoacutemetro (Caacutemara de Neubauer)
Consta de los siguientes elementos
diams Una laacutemina portaobjeto gruesa en el centro se hallan dos
superficiescuadriculadas iguales separadas del resto de la laacutemina por surcos y
dosbarras transversales algo maacutes elevadas
diams Una laminilla cubreobjetos oacutepticamente plana que al colocarse sobrelas barras
elevadas de la laacutemina forma una caacutemara entre el cubreobjetosy la superficie
cuadriculadaLa altura entre el cubreobjetos y la laacutemina portaobjetos es de 01
mmCada cuadriacutecula mide 3 mm de lado y se divide en 9 cuadrados grandesCada
uno de los cuales mide 1 mm2 de superficie que se subdivide a suvez en 16
cuadrados medianos El cuadrado grande central se divide en25 cuadrados
pequentildeos y cada uno de ellos en 16 cuadraditos Cadacuadrado pequentildeo mide
02 mm de lado (004 mm2 de superficie) y cadacuadradito mide 005 mm de lado
(00025 mm2 de superficie)
612 Materiales y reactivos requeridos
6121 Pipeta de gloacutebulos blancos (De Thoma) o pipeta automaacutetica (de 0 a 100 mL)Presenta cerca del extremo superior una marca de 11 inmediatamentecontinuacutea una dilatacioacuten (bulbo) que contiene una perla que funciona comomezcladora luego sigue el extremo maacutes largo de la pipeta (tallo) que estaacutedividida en 10 partes con 2 marcas 1 (parte final del bulbo) y 05 (a la mitaddel tallo) Se le acopla a su extremo superior 1 tubo de goma y una bombillapara aspirar
6122 Diluyente de gloacutebulos blancos Solucioacuten de Turk al 1
6123 Contador manual (Soacutelo si fuera necesario)
6124 Papel filtro
613 Procedimiento
6131 Una vez obtenida la sangre con anticoagulante o sangre capilar deldedo se procede a aspirar la sangre con la pipeta de gloacutebulos blancoshasta la marca de 05 y a limpiar la punta con papel absorbente
6132 Introducir la pipeta en el tubo que contenga solucioacuten de Turk y absorberhasta la marca de 11 (no debe haber burbujas)
6133 Tapar ambos extremos y proceder a mezclar manualmente o en unrotador automaacutetico por 2 oacute 3 minutos
6134 Monte la laminilla de vidrio en la caacutemara para recuento que debe estarlimpia y seca
6135 Agitar la pipeta y descartar las cuatro primeras gotas para luego colocaruna gota pequentildea de esta solucioacuten en la caacutemara
6136 Deje reposar por espacio de 3 minutos para que las ceacutelulas se sedimenten
6137 Enfocar con objetivo de 10x y contar en 4 cuadrados grandes angularesCuando se usa la pipeta automaacutetica se toma 20 mL (002 mL) desangre total con anticoagulante o sangre capilar con anticoagulante yse diluye en un tubo que contenga 380 mL de solucioacuten de Turk (aquiacutetenemos una dilucioacuten 120)
LECTURA
Fig 13
La lectura se realiza en los campos 1 3 7 y 9 como estaacute indicado en la figuraAdemaacutes de los leucocitos contados dentro de cada uno de los cuadrantes sedeben contar todos los leucocitos que se encuentren adheridos en la liacuteneahorizontal superior y vertical exterior o de lo contrario todos los leucocitosadheridos a la liacutenea horizontal inferior y vertical interior
614 Resultados
Nordm de leucocitos x mm3 = leucocitos contados en 4 camposdividealtura x dilucioacuten x aacuterea
Reemplazando = leucocitos contados en 4 camposdivide110 x 120 x 4=
Leucocitos contados en 4 camposdivide4200=
X1 divide4200= Nordm leucocitos contados x 50
615 Valores de referencia
5000 - 10 000 leucocitos mm3
616 Correccioacuten de valores para restar eritrocitos nucleados
Los normoblastos no se destruyen (lisis) en el liacutequido de dilucioacuten por lo tantopueden observarse al realizar el recuento leucocitario y confundirse con losleucocitos de tal manera que se debe emplear la siguiente foacutermula
Caacutelculo
La concentracioacuten del nuacutemero de normoblastos (por litro) esNuacutemero de normoblatos contados x concentracioacuten o nuacutemero de leucocitos100 + Nordm de normoblastos contados
Ejemplo
Si se cuentan 50 normoblastos y la concentracioacuten del nuacutemero de leucocitos es16 x 109l la concentracioacuten del nuacutemero de normoblastos seraacute
50 x16 = 53 x 109l
100 + 50
y la concentracioacuten de leucocitos corregida seraacute 16 - 53 = 107 x 109lEn unidades tradicionales las concentraciones de normoblastos y leucocitosse expresan por miliacutemetro cuacutebico En tales unidades el caacutelculo correspondienteal ejemplo que se ha dado seriacutea
50 x 16 000 = 5300 mm3
100 + 50
Recuento corregido de gloacutebulos blancos o leucocitos = 16 000 - 5300 = 10 700 mm3
Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2
62 RECUENTO DE GLOacuteBULOS ROJOS
Principio
La sangre se diluye en un liacutequido que nos permite observar claramente loshematiacutees luego esta dilucioacuten se coloca en una caacutemara de Neubauer con laayuda de una pipeta automaacutetica o pipeta Pasteur y se cuentan en el microscopioa un objetivo de 40x para calcular el nuacutemero de gloacutebulos rojos por mm3
621 Equipos
- Microscopio
- Hemocitoacutemetro (caacutemara de Neubauer)
622 Materiales y reactivos requeridos
6221 Pipeta de gloacutebulos rojos (De Thoma) o pipeta automaacutetica (de 0-100 mL)
Presenta cerca del extremo superior una marca de 101 inmediatamentecontinuacutea una dilatacioacuten (bulbo) que contiene una perla roja mezcladoraluego sigue el tallo (extremo maacutes largo) el cual estaacute dividido en 10 partescon 2 marcas 1 acabando el bulbo y 05 a la mitad del tallo Se requiereigual que el recuento de leucocitos una boquilla para aspirar
6222 Diluyente de gloacutebulos rojos Cloruro de Sodio al 09 (ver anexo)
Diluyente de Hayem (ver anexo)
6223 Contador manual (soacutelo si fuera necesario)
6224 Papel filtro
623 Procedimiento
6231 Mezclar la sangre obtenida con el anticoagulante o tomar sangre capilar
6232 Llenar la pipeta de gloacutebulos rojos con sangre hasta la marca de 05para realizar una dilucioacuten de 1200 y si se carga hasta 1 la dilucioacutenseraacute 1100 Limpiar la punta con gasa o papel absorbente
6233 Introducir la pipeta en el tubo o frasquito conteniendo diluyente (Hayem)y llenar de liacutequido de dilucioacuten hasta la marca de 101
6234 Se coloca en un rotador automaacutetico o se hace rotar manualmente de2 a 3 minutos
6235 Agitar bien la pipeta y descartar 3 a 4 gotas del tallo luego colocar unagota pequentildea cerca de un extremo de la caacutemara para que por capilaridadse llene exactamente
6236 Hacer el recuento con objetivo de 40xSe puede realizar con la pipeta automaacutetica se toma 20 mL (002mL)de sangre total con anticoagulante o sangre capilar y se deposita enun tubo de 12 x 75 que contenga 4 mL de solucioacuten de Hayem (aquiacute setiene una dilucioacuten de 1200) Se deja reposar aproximadamente 5minutos y se procede a cargar la caacutemara con la misma pipeta usandoun nuevo tip El inconveniente aquiacute es el gasto de reactivo (4 mL) perolas medidas son mas exactas
6237 Dejar en reposo por 3 minutos
6238 Enfocar la cuadriacutecula a 10x luego con el objetivo de 40x contar sobreel cuadrado grande central de la caacutemara soacutelo en 5 cuadrados pequentildeosuno central y cuatro angulares (80 cuadraditos en total)
6239 En el recuento se incluyen las ceacutelulas que cubren o tocan por dentroo por fuera las liacuteneas limitantes superior e izquierda en el cuadradopequentildeo de recuento y no se consideran los correspondientes a losliacutemites inferior y derechoSe hace el recuento en los puntos ABCD y Ey se sigue los mismos paraacutemetros del recuento de leucocitos
LECTURA
Fig 14
624 Resultados
Nordm de hematiacutees x mm3 = hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeosaltura x dilucioacuten X aacuterea
Reemplazando = hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeos110 x 1200 x 15
= hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeos divide 110 000
= hematiacutees contados x 10 000
625 Valores de referencia
(Unidades tradicionales millones de ceacutelulasmm3)
Hombres 4 500 000 - 5 500 000
Mujeres 4 000 000 - 5 000 000
Nintildeos (4 antildeos) 4 200 000 - 5 200 000
Lactantes (1 - 6 meses) 3 800 000 - 5 200 000
Recieacuten nacidos 5 000 000 - 6 000 000
Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2
63 DETERMINACIOacuteN DEL VOLUMEN GLOBULAR (Hematocrito)
Mide la fraccioacuten que comprende a los gloacutebulos rojos (masa globular) respectoal
volumen total de la muestra de sangre venosa o capilar Puede expresarseen
porcentaje o como valor decimal
Hto= altura de la columna de gloacutebulos rojosdivide altura de la columna de sangre
total(gloacutebulos rojos maacutes plasma)
631 Meacutetodo de Wintrobe
Materiales requeridos
- Tubo de Wintrobe graduado de 0 - 100 mm
- Pipetas Pasteur o pipetas de transferencia
- Tapoacuten de goma
Procedimiento
diams Llenar la sangre extraiacuteda con anticoagulante con una pipeta pasteur
comenzandodesde el fondo hasta la marca superior de 100 mm teniendocuidado
de no provocar espuma
diams Tapar el tubo con un tapoacuten de goma para evitar la evaporacioacuten
diams Centrifugar a 3000 rpm por 30 minutos
Resultados (lectura)
Del tubo graduado se mide directamente el nivel de la columna de gloacutebulosrojos
Valores de referencia
Hombres 40 - 54Mujeres 38 - 48
Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2
632 Meacutetodo de microhematocrito
Materiales requeridos
- Capilares rojos y azules (75 mm x 15 mm)
- Plastilina
Procedimiento
diams Tomar la muestra en capilares rojos heparinizados directamente del pulpejodel
dedo o utilizar capilares azules sin heparina para sangre venosacon
anticoagulante de Wintrobe o EDTA Debe llenarse aproximadamente70 - 80
del capilar
diams Ocluir (tapar) un extremo del capilar con plastilina
diams Colocar el capilar sobre la plataforma del cabezal de una centriacutefuga demicrohematocrito con el extremo ocluido adherido al reborde externo de laplataforma
diams Centrifugar por 5 minutos entre 10 000 - 12 000 rpm
Resultados (lectura)
La lectura se realiza con una escala estandarizada que expenden en el comercio
Uso de la escala
diams Sostenga el tubo frente a la escala de manera que el fondo de la columnade eritrocitos (no el extremo inferior del tubo) quede exactamente al mismonivel de la liacutenea horizontal correspondiente al cero
diams Desplace el tubo a traveacutes de la escala hasta que la liacutenea marcada con elnuacutemero 10 quede al nivel del tope de la columna de plasma Vigile que elfondo de la
columna de eritrocitos continuacutee sobre la liacutenea cero El tubodebe encontrarse completamente en posicioacuten vertical
diams La liacutenea que pase al nivel del tope de la columna de eritrocitos indicaraacute lafraccioacuten de volumen de eacutestos
Valores de referencia
Hombres 40 - 50
Mujeres 38 - 44
Nintildeos (5 antildeos) 38 - 44
Lactantes (3 meses) 37 - 42
Recieacuten nacidos 50 - 58
La disposicioacuten celular esParte superior una columna de plasmaEn la interfase estaacuten los leucocitos yplaquetasParte inferior estaacute la columna deeritrocitos (Fig 15)
64 DOSAJE DE HEMOGLOBINA
Principio
La sangre se diluye en liacutequido de Drabkin el cual hemoliza los hematiacutees yconvierte la hemoglobina en cianometahemoglobina (cianuro de hemiglobina)La solucioacuten que se produce se lee por medio de un espectrofotoacutemetro ofotocoloriacutemetro Su grado de absorbancia es proporcional a la cantidad dehemoglobina que contenga la sangre
641 Materiales y reactivos
6411 Un coloriacutemetro fotoeleacutectrico o un espectrofotoacutemetro
6412 Pipetas
diams Una pipeta para sangre (pipeta de Sahli) graduada hasta 002 mL contubo de goma y boquilla
diams Una pipeta de vidrio graduada de 5 mL
6413 Tubos de ensayo
6414 Reactivo de Drabkin para dilucioacuten
Este reactivo se puede adquirir en tabletas o polvos para disolver en 1litro de agua destilada Si se dispone de una balanza analiacutetica la preparacioacutense puede hacer en el laboratorio Esta solucioacuten se puedeconservar durante un mes en un frasco de vidrio oscuro Deseacutechese sise enturbia
uno de los cuales mide 1 mm2 de superficie que se subdivide a suvez en 16
cuadrados medianos El cuadrado grande central se divide en25 cuadrados
pequentildeos y cada uno de ellos en 16 cuadraditos Cadacuadrado pequentildeo mide
02 mm de lado (004 mm2 de superficie) y cadacuadradito mide 005 mm de lado
(00025 mm2 de superficie)
612 Materiales y reactivos requeridos
6121 Pipeta de gloacutebulos blancos (De Thoma) o pipeta automaacutetica (de 0 a 100 mL)Presenta cerca del extremo superior una marca de 11 inmediatamentecontinuacutea una dilatacioacuten (bulbo) que contiene una perla que funciona comomezcladora luego sigue el extremo maacutes largo de la pipeta (tallo) que estaacutedividida en 10 partes con 2 marcas 1 (parte final del bulbo) y 05 (a la mitaddel tallo) Se le acopla a su extremo superior 1 tubo de goma y una bombillapara aspirar
6122 Diluyente de gloacutebulos blancos Solucioacuten de Turk al 1
6123 Contador manual (Soacutelo si fuera necesario)
6124 Papel filtro
613 Procedimiento
6131 Una vez obtenida la sangre con anticoagulante o sangre capilar deldedo se procede a aspirar la sangre con la pipeta de gloacutebulos blancoshasta la marca de 05 y a limpiar la punta con papel absorbente
6132 Introducir la pipeta en el tubo que contenga solucioacuten de Turk y absorberhasta la marca de 11 (no debe haber burbujas)
6133 Tapar ambos extremos y proceder a mezclar manualmente o en unrotador automaacutetico por 2 oacute 3 minutos
6134 Monte la laminilla de vidrio en la caacutemara para recuento que debe estarlimpia y seca
6135 Agitar la pipeta y descartar las cuatro primeras gotas para luego colocaruna gota pequentildea de esta solucioacuten en la caacutemara
6136 Deje reposar por espacio de 3 minutos para que las ceacutelulas se sedimenten
6137 Enfocar con objetivo de 10x y contar en 4 cuadrados grandes angularesCuando se usa la pipeta automaacutetica se toma 20 mL (002 mL) desangre total con anticoagulante o sangre capilar con anticoagulante yse diluye en un tubo que contenga 380 mL de solucioacuten de Turk (aquiacutetenemos una dilucioacuten 120)
LECTURA
Fig 13
La lectura se realiza en los campos 1 3 7 y 9 como estaacute indicado en la figuraAdemaacutes de los leucocitos contados dentro de cada uno de los cuadrantes sedeben contar todos los leucocitos que se encuentren adheridos en la liacuteneahorizontal superior y vertical exterior o de lo contrario todos los leucocitosadheridos a la liacutenea horizontal inferior y vertical interior
614 Resultados
Nordm de leucocitos x mm3 = leucocitos contados en 4 camposdividealtura x dilucioacuten x aacuterea
Reemplazando = leucocitos contados en 4 camposdivide110 x 120 x 4=
Leucocitos contados en 4 camposdivide4200=
X1 divide4200= Nordm leucocitos contados x 50
615 Valores de referencia
5000 - 10 000 leucocitos mm3
616 Correccioacuten de valores para restar eritrocitos nucleados
Los normoblastos no se destruyen (lisis) en el liacutequido de dilucioacuten por lo tantopueden observarse al realizar el recuento leucocitario y confundirse con losleucocitos de tal manera que se debe emplear la siguiente foacutermula
Caacutelculo
La concentracioacuten del nuacutemero de normoblastos (por litro) esNuacutemero de normoblatos contados x concentracioacuten o nuacutemero de leucocitos100 + Nordm de normoblastos contados
Ejemplo
Si se cuentan 50 normoblastos y la concentracioacuten del nuacutemero de leucocitos es16 x 109l la concentracioacuten del nuacutemero de normoblastos seraacute
50 x16 = 53 x 109l
100 + 50
y la concentracioacuten de leucocitos corregida seraacute 16 - 53 = 107 x 109lEn unidades tradicionales las concentraciones de normoblastos y leucocitosse expresan por miliacutemetro cuacutebico En tales unidades el caacutelculo correspondienteal ejemplo que se ha dado seriacutea
50 x 16 000 = 5300 mm3
100 + 50
Recuento corregido de gloacutebulos blancos o leucocitos = 16 000 - 5300 = 10 700 mm3
Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2
62 RECUENTO DE GLOacuteBULOS ROJOS
Principio
La sangre se diluye en un liacutequido que nos permite observar claramente loshematiacutees luego esta dilucioacuten se coloca en una caacutemara de Neubauer con laayuda de una pipeta automaacutetica o pipeta Pasteur y se cuentan en el microscopioa un objetivo de 40x para calcular el nuacutemero de gloacutebulos rojos por mm3
621 Equipos
- Microscopio
- Hemocitoacutemetro (caacutemara de Neubauer)
622 Materiales y reactivos requeridos
6221 Pipeta de gloacutebulos rojos (De Thoma) o pipeta automaacutetica (de 0-100 mL)
Presenta cerca del extremo superior una marca de 101 inmediatamentecontinuacutea una dilatacioacuten (bulbo) que contiene una perla roja mezcladoraluego sigue el tallo (extremo maacutes largo) el cual estaacute dividido en 10 partescon 2 marcas 1 acabando el bulbo y 05 a la mitad del tallo Se requiereigual que el recuento de leucocitos una boquilla para aspirar
6222 Diluyente de gloacutebulos rojos Cloruro de Sodio al 09 (ver anexo)
Diluyente de Hayem (ver anexo)
6223 Contador manual (soacutelo si fuera necesario)
6224 Papel filtro
623 Procedimiento
6231 Mezclar la sangre obtenida con el anticoagulante o tomar sangre capilar
6232 Llenar la pipeta de gloacutebulos rojos con sangre hasta la marca de 05para realizar una dilucioacuten de 1200 y si se carga hasta 1 la dilucioacutenseraacute 1100 Limpiar la punta con gasa o papel absorbente
6233 Introducir la pipeta en el tubo o frasquito conteniendo diluyente (Hayem)y llenar de liacutequido de dilucioacuten hasta la marca de 101
6234 Se coloca en un rotador automaacutetico o se hace rotar manualmente de2 a 3 minutos
6235 Agitar bien la pipeta y descartar 3 a 4 gotas del tallo luego colocar unagota pequentildea cerca de un extremo de la caacutemara para que por capilaridadse llene exactamente
6236 Hacer el recuento con objetivo de 40xSe puede realizar con la pipeta automaacutetica se toma 20 mL (002mL)de sangre total con anticoagulante o sangre capilar y se deposita enun tubo de 12 x 75 que contenga 4 mL de solucioacuten de Hayem (aquiacute setiene una dilucioacuten de 1200) Se deja reposar aproximadamente 5minutos y se procede a cargar la caacutemara con la misma pipeta usandoun nuevo tip El inconveniente aquiacute es el gasto de reactivo (4 mL) perolas medidas son mas exactas
6237 Dejar en reposo por 3 minutos
6238 Enfocar la cuadriacutecula a 10x luego con el objetivo de 40x contar sobreel cuadrado grande central de la caacutemara soacutelo en 5 cuadrados pequentildeosuno central y cuatro angulares (80 cuadraditos en total)
6239 En el recuento se incluyen las ceacutelulas que cubren o tocan por dentroo por fuera las liacuteneas limitantes superior e izquierda en el cuadradopequentildeo de recuento y no se consideran los correspondientes a losliacutemites inferior y derechoSe hace el recuento en los puntos ABCD y Ey se sigue los mismos paraacutemetros del recuento de leucocitos
LECTURA
Fig 14
624 Resultados
Nordm de hematiacutees x mm3 = hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeosaltura x dilucioacuten X aacuterea
Reemplazando = hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeos110 x 1200 x 15
= hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeos divide 110 000
= hematiacutees contados x 10 000
625 Valores de referencia
(Unidades tradicionales millones de ceacutelulasmm3)
Hombres 4 500 000 - 5 500 000
Mujeres 4 000 000 - 5 000 000
Nintildeos (4 antildeos) 4 200 000 - 5 200 000
Lactantes (1 - 6 meses) 3 800 000 - 5 200 000
Recieacuten nacidos 5 000 000 - 6 000 000
Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2
63 DETERMINACIOacuteN DEL VOLUMEN GLOBULAR (Hematocrito)
Mide la fraccioacuten que comprende a los gloacutebulos rojos (masa globular) respectoal
volumen total de la muestra de sangre venosa o capilar Puede expresarseen
porcentaje o como valor decimal
Hto= altura de la columna de gloacutebulos rojosdivide altura de la columna de sangre
total(gloacutebulos rojos maacutes plasma)
631 Meacutetodo de Wintrobe
Materiales requeridos
- Tubo de Wintrobe graduado de 0 - 100 mm
- Pipetas Pasteur o pipetas de transferencia
- Tapoacuten de goma
Procedimiento
diams Llenar la sangre extraiacuteda con anticoagulante con una pipeta pasteur
comenzandodesde el fondo hasta la marca superior de 100 mm teniendocuidado
de no provocar espuma
diams Tapar el tubo con un tapoacuten de goma para evitar la evaporacioacuten
diams Centrifugar a 3000 rpm por 30 minutos
Resultados (lectura)
Del tubo graduado se mide directamente el nivel de la columna de gloacutebulosrojos
Valores de referencia
Hombres 40 - 54Mujeres 38 - 48
Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2
632 Meacutetodo de microhematocrito
Materiales requeridos
- Capilares rojos y azules (75 mm x 15 mm)
- Plastilina
Procedimiento
diams Tomar la muestra en capilares rojos heparinizados directamente del pulpejodel
dedo o utilizar capilares azules sin heparina para sangre venosacon
anticoagulante de Wintrobe o EDTA Debe llenarse aproximadamente70 - 80
del capilar
diams Ocluir (tapar) un extremo del capilar con plastilina
diams Colocar el capilar sobre la plataforma del cabezal de una centriacutefuga demicrohematocrito con el extremo ocluido adherido al reborde externo de laplataforma
diams Centrifugar por 5 minutos entre 10 000 - 12 000 rpm
Resultados (lectura)
La lectura se realiza con una escala estandarizada que expenden en el comercio
Uso de la escala
diams Sostenga el tubo frente a la escala de manera que el fondo de la columnade eritrocitos (no el extremo inferior del tubo) quede exactamente al mismonivel de la liacutenea horizontal correspondiente al cero
diams Desplace el tubo a traveacutes de la escala hasta que la liacutenea marcada con elnuacutemero 10 quede al nivel del tope de la columna de plasma Vigile que elfondo de la
columna de eritrocitos continuacutee sobre la liacutenea cero El tubodebe encontrarse completamente en posicioacuten vertical
diams La liacutenea que pase al nivel del tope de la columna de eritrocitos indicaraacute lafraccioacuten de volumen de eacutestos
Valores de referencia
Hombres 40 - 50
Mujeres 38 - 44
Nintildeos (5 antildeos) 38 - 44
Lactantes (3 meses) 37 - 42
Recieacuten nacidos 50 - 58
La disposicioacuten celular esParte superior una columna de plasmaEn la interfase estaacuten los leucocitos yplaquetasParte inferior estaacute la columna deeritrocitos (Fig 15)
64 DOSAJE DE HEMOGLOBINA
Principio
La sangre se diluye en liacutequido de Drabkin el cual hemoliza los hematiacutees yconvierte la hemoglobina en cianometahemoglobina (cianuro de hemiglobina)La solucioacuten que se produce se lee por medio de un espectrofotoacutemetro ofotocoloriacutemetro Su grado de absorbancia es proporcional a la cantidad dehemoglobina que contenga la sangre
641 Materiales y reactivos
6411 Un coloriacutemetro fotoeleacutectrico o un espectrofotoacutemetro
6412 Pipetas
diams Una pipeta para sangre (pipeta de Sahli) graduada hasta 002 mL contubo de goma y boquilla
diams Una pipeta de vidrio graduada de 5 mL
6413 Tubos de ensayo
6414 Reactivo de Drabkin para dilucioacuten
Este reactivo se puede adquirir en tabletas o polvos para disolver en 1litro de agua destilada Si se dispone de una balanza analiacutetica la preparacioacutense puede hacer en el laboratorio Esta solucioacuten se puedeconservar durante un mes en un frasco de vidrio oscuro Deseacutechese sise enturbia
6137 Enfocar con objetivo de 10x y contar en 4 cuadrados grandes angularesCuando se usa la pipeta automaacutetica se toma 20 mL (002 mL) desangre total con anticoagulante o sangre capilar con anticoagulante yse diluye en un tubo que contenga 380 mL de solucioacuten de Turk (aquiacutetenemos una dilucioacuten 120)
LECTURA
Fig 13
La lectura se realiza en los campos 1 3 7 y 9 como estaacute indicado en la figuraAdemaacutes de los leucocitos contados dentro de cada uno de los cuadrantes sedeben contar todos los leucocitos que se encuentren adheridos en la liacuteneahorizontal superior y vertical exterior o de lo contrario todos los leucocitosadheridos a la liacutenea horizontal inferior y vertical interior
614 Resultados
Nordm de leucocitos x mm3 = leucocitos contados en 4 camposdividealtura x dilucioacuten x aacuterea
Reemplazando = leucocitos contados en 4 camposdivide110 x 120 x 4=
Leucocitos contados en 4 camposdivide4200=
X1 divide4200= Nordm leucocitos contados x 50
615 Valores de referencia
5000 - 10 000 leucocitos mm3
616 Correccioacuten de valores para restar eritrocitos nucleados
Los normoblastos no se destruyen (lisis) en el liacutequido de dilucioacuten por lo tantopueden observarse al realizar el recuento leucocitario y confundirse con losleucocitos de tal manera que se debe emplear la siguiente foacutermula
Caacutelculo
La concentracioacuten del nuacutemero de normoblastos (por litro) esNuacutemero de normoblatos contados x concentracioacuten o nuacutemero de leucocitos100 + Nordm de normoblastos contados
Ejemplo
Si se cuentan 50 normoblastos y la concentracioacuten del nuacutemero de leucocitos es16 x 109l la concentracioacuten del nuacutemero de normoblastos seraacute
50 x16 = 53 x 109l
100 + 50
y la concentracioacuten de leucocitos corregida seraacute 16 - 53 = 107 x 109lEn unidades tradicionales las concentraciones de normoblastos y leucocitosse expresan por miliacutemetro cuacutebico En tales unidades el caacutelculo correspondienteal ejemplo que se ha dado seriacutea
50 x 16 000 = 5300 mm3
100 + 50
Recuento corregido de gloacutebulos blancos o leucocitos = 16 000 - 5300 = 10 700 mm3
Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2
62 RECUENTO DE GLOacuteBULOS ROJOS
Principio
La sangre se diluye en un liacutequido que nos permite observar claramente loshematiacutees luego esta dilucioacuten se coloca en una caacutemara de Neubauer con laayuda de una pipeta automaacutetica o pipeta Pasteur y se cuentan en el microscopioa un objetivo de 40x para calcular el nuacutemero de gloacutebulos rojos por mm3
621 Equipos
- Microscopio
- Hemocitoacutemetro (caacutemara de Neubauer)
622 Materiales y reactivos requeridos
6221 Pipeta de gloacutebulos rojos (De Thoma) o pipeta automaacutetica (de 0-100 mL)
Presenta cerca del extremo superior una marca de 101 inmediatamentecontinuacutea una dilatacioacuten (bulbo) que contiene una perla roja mezcladoraluego sigue el tallo (extremo maacutes largo) el cual estaacute dividido en 10 partescon 2 marcas 1 acabando el bulbo y 05 a la mitad del tallo Se requiereigual que el recuento de leucocitos una boquilla para aspirar
6222 Diluyente de gloacutebulos rojos Cloruro de Sodio al 09 (ver anexo)
Diluyente de Hayem (ver anexo)
6223 Contador manual (soacutelo si fuera necesario)
6224 Papel filtro
623 Procedimiento
6231 Mezclar la sangre obtenida con el anticoagulante o tomar sangre capilar
6232 Llenar la pipeta de gloacutebulos rojos con sangre hasta la marca de 05para realizar una dilucioacuten de 1200 y si se carga hasta 1 la dilucioacutenseraacute 1100 Limpiar la punta con gasa o papel absorbente
6233 Introducir la pipeta en el tubo o frasquito conteniendo diluyente (Hayem)y llenar de liacutequido de dilucioacuten hasta la marca de 101
6234 Se coloca en un rotador automaacutetico o se hace rotar manualmente de2 a 3 minutos
6235 Agitar bien la pipeta y descartar 3 a 4 gotas del tallo luego colocar unagota pequentildea cerca de un extremo de la caacutemara para que por capilaridadse llene exactamente
6236 Hacer el recuento con objetivo de 40xSe puede realizar con la pipeta automaacutetica se toma 20 mL (002mL)de sangre total con anticoagulante o sangre capilar y se deposita enun tubo de 12 x 75 que contenga 4 mL de solucioacuten de Hayem (aquiacute setiene una dilucioacuten de 1200) Se deja reposar aproximadamente 5minutos y se procede a cargar la caacutemara con la misma pipeta usandoun nuevo tip El inconveniente aquiacute es el gasto de reactivo (4 mL) perolas medidas son mas exactas
6237 Dejar en reposo por 3 minutos
6238 Enfocar la cuadriacutecula a 10x luego con el objetivo de 40x contar sobreel cuadrado grande central de la caacutemara soacutelo en 5 cuadrados pequentildeosuno central y cuatro angulares (80 cuadraditos en total)
6239 En el recuento se incluyen las ceacutelulas que cubren o tocan por dentroo por fuera las liacuteneas limitantes superior e izquierda en el cuadradopequentildeo de recuento y no se consideran los correspondientes a losliacutemites inferior y derechoSe hace el recuento en los puntos ABCD y Ey se sigue los mismos paraacutemetros del recuento de leucocitos
LECTURA
Fig 14
624 Resultados
Nordm de hematiacutees x mm3 = hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeosaltura x dilucioacuten X aacuterea
Reemplazando = hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeos110 x 1200 x 15
= hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeos divide 110 000
= hematiacutees contados x 10 000
625 Valores de referencia
(Unidades tradicionales millones de ceacutelulasmm3)
Hombres 4 500 000 - 5 500 000
Mujeres 4 000 000 - 5 000 000
Nintildeos (4 antildeos) 4 200 000 - 5 200 000
Lactantes (1 - 6 meses) 3 800 000 - 5 200 000
Recieacuten nacidos 5 000 000 - 6 000 000
Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2
63 DETERMINACIOacuteN DEL VOLUMEN GLOBULAR (Hematocrito)
Mide la fraccioacuten que comprende a los gloacutebulos rojos (masa globular) respectoal
volumen total de la muestra de sangre venosa o capilar Puede expresarseen
porcentaje o como valor decimal
Hto= altura de la columna de gloacutebulos rojosdivide altura de la columna de sangre
total(gloacutebulos rojos maacutes plasma)
631 Meacutetodo de Wintrobe
Materiales requeridos
- Tubo de Wintrobe graduado de 0 - 100 mm
- Pipetas Pasteur o pipetas de transferencia
- Tapoacuten de goma
Procedimiento
diams Llenar la sangre extraiacuteda con anticoagulante con una pipeta pasteur
comenzandodesde el fondo hasta la marca superior de 100 mm teniendocuidado
de no provocar espuma
diams Tapar el tubo con un tapoacuten de goma para evitar la evaporacioacuten
diams Centrifugar a 3000 rpm por 30 minutos
Resultados (lectura)
Del tubo graduado se mide directamente el nivel de la columna de gloacutebulosrojos
Valores de referencia
Hombres 40 - 54Mujeres 38 - 48
Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2
632 Meacutetodo de microhematocrito
Materiales requeridos
- Capilares rojos y azules (75 mm x 15 mm)
- Plastilina
Procedimiento
diams Tomar la muestra en capilares rojos heparinizados directamente del pulpejodel
dedo o utilizar capilares azules sin heparina para sangre venosacon
anticoagulante de Wintrobe o EDTA Debe llenarse aproximadamente70 - 80
del capilar
diams Ocluir (tapar) un extremo del capilar con plastilina
diams Colocar el capilar sobre la plataforma del cabezal de una centriacutefuga demicrohematocrito con el extremo ocluido adherido al reborde externo de laplataforma
diams Centrifugar por 5 minutos entre 10 000 - 12 000 rpm
Resultados (lectura)
La lectura se realiza con una escala estandarizada que expenden en el comercio
Uso de la escala
diams Sostenga el tubo frente a la escala de manera que el fondo de la columnade eritrocitos (no el extremo inferior del tubo) quede exactamente al mismonivel de la liacutenea horizontal correspondiente al cero
diams Desplace el tubo a traveacutes de la escala hasta que la liacutenea marcada con elnuacutemero 10 quede al nivel del tope de la columna de plasma Vigile que elfondo de la
columna de eritrocitos continuacutee sobre la liacutenea cero El tubodebe encontrarse completamente en posicioacuten vertical
diams La liacutenea que pase al nivel del tope de la columna de eritrocitos indicaraacute lafraccioacuten de volumen de eacutestos
Valores de referencia
Hombres 40 - 50
Mujeres 38 - 44
Nintildeos (5 antildeos) 38 - 44
Lactantes (3 meses) 37 - 42
Recieacuten nacidos 50 - 58
La disposicioacuten celular esParte superior una columna de plasmaEn la interfase estaacuten los leucocitos yplaquetasParte inferior estaacute la columna deeritrocitos (Fig 15)
64 DOSAJE DE HEMOGLOBINA
Principio
La sangre se diluye en liacutequido de Drabkin el cual hemoliza los hematiacutees yconvierte la hemoglobina en cianometahemoglobina (cianuro de hemiglobina)La solucioacuten que se produce se lee por medio de un espectrofotoacutemetro ofotocoloriacutemetro Su grado de absorbancia es proporcional a la cantidad dehemoglobina que contenga la sangre
641 Materiales y reactivos
6411 Un coloriacutemetro fotoeleacutectrico o un espectrofotoacutemetro
6412 Pipetas
diams Una pipeta para sangre (pipeta de Sahli) graduada hasta 002 mL contubo de goma y boquilla
diams Una pipeta de vidrio graduada de 5 mL
6413 Tubos de ensayo
6414 Reactivo de Drabkin para dilucioacuten
Este reactivo se puede adquirir en tabletas o polvos para disolver en 1litro de agua destilada Si se dispone de una balanza analiacutetica la preparacioacutense puede hacer en el laboratorio Esta solucioacuten se puedeconservar durante un mes en un frasco de vidrio oscuro Deseacutechese sise enturbia
615 Valores de referencia
5000 - 10 000 leucocitos mm3
616 Correccioacuten de valores para restar eritrocitos nucleados
Los normoblastos no se destruyen (lisis) en el liacutequido de dilucioacuten por lo tantopueden observarse al realizar el recuento leucocitario y confundirse con losleucocitos de tal manera que se debe emplear la siguiente foacutermula
Caacutelculo
La concentracioacuten del nuacutemero de normoblastos (por litro) esNuacutemero de normoblatos contados x concentracioacuten o nuacutemero de leucocitos100 + Nordm de normoblastos contados
Ejemplo
Si se cuentan 50 normoblastos y la concentracioacuten del nuacutemero de leucocitos es16 x 109l la concentracioacuten del nuacutemero de normoblastos seraacute
50 x16 = 53 x 109l
100 + 50
y la concentracioacuten de leucocitos corregida seraacute 16 - 53 = 107 x 109lEn unidades tradicionales las concentraciones de normoblastos y leucocitosse expresan por miliacutemetro cuacutebico En tales unidades el caacutelculo correspondienteal ejemplo que se ha dado seriacutea
50 x 16 000 = 5300 mm3
100 + 50
Recuento corregido de gloacutebulos blancos o leucocitos = 16 000 - 5300 = 10 700 mm3
Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2
62 RECUENTO DE GLOacuteBULOS ROJOS
Principio
La sangre se diluye en un liacutequido que nos permite observar claramente loshematiacutees luego esta dilucioacuten se coloca en una caacutemara de Neubauer con laayuda de una pipeta automaacutetica o pipeta Pasteur y se cuentan en el microscopioa un objetivo de 40x para calcular el nuacutemero de gloacutebulos rojos por mm3
621 Equipos
- Microscopio
- Hemocitoacutemetro (caacutemara de Neubauer)
622 Materiales y reactivos requeridos
6221 Pipeta de gloacutebulos rojos (De Thoma) o pipeta automaacutetica (de 0-100 mL)
Presenta cerca del extremo superior una marca de 101 inmediatamentecontinuacutea una dilatacioacuten (bulbo) que contiene una perla roja mezcladoraluego sigue el tallo (extremo maacutes largo) el cual estaacute dividido en 10 partescon 2 marcas 1 acabando el bulbo y 05 a la mitad del tallo Se requiereigual que el recuento de leucocitos una boquilla para aspirar
6222 Diluyente de gloacutebulos rojos Cloruro de Sodio al 09 (ver anexo)
Diluyente de Hayem (ver anexo)
6223 Contador manual (soacutelo si fuera necesario)
6224 Papel filtro
623 Procedimiento
6231 Mezclar la sangre obtenida con el anticoagulante o tomar sangre capilar
6232 Llenar la pipeta de gloacutebulos rojos con sangre hasta la marca de 05para realizar una dilucioacuten de 1200 y si se carga hasta 1 la dilucioacutenseraacute 1100 Limpiar la punta con gasa o papel absorbente
6233 Introducir la pipeta en el tubo o frasquito conteniendo diluyente (Hayem)y llenar de liacutequido de dilucioacuten hasta la marca de 101
6234 Se coloca en un rotador automaacutetico o se hace rotar manualmente de2 a 3 minutos
6235 Agitar bien la pipeta y descartar 3 a 4 gotas del tallo luego colocar unagota pequentildea cerca de un extremo de la caacutemara para que por capilaridadse llene exactamente
6236 Hacer el recuento con objetivo de 40xSe puede realizar con la pipeta automaacutetica se toma 20 mL (002mL)de sangre total con anticoagulante o sangre capilar y se deposita enun tubo de 12 x 75 que contenga 4 mL de solucioacuten de Hayem (aquiacute setiene una dilucioacuten de 1200) Se deja reposar aproximadamente 5minutos y se procede a cargar la caacutemara con la misma pipeta usandoun nuevo tip El inconveniente aquiacute es el gasto de reactivo (4 mL) perolas medidas son mas exactas
6237 Dejar en reposo por 3 minutos
6238 Enfocar la cuadriacutecula a 10x luego con el objetivo de 40x contar sobreel cuadrado grande central de la caacutemara soacutelo en 5 cuadrados pequentildeosuno central y cuatro angulares (80 cuadraditos en total)
6239 En el recuento se incluyen las ceacutelulas que cubren o tocan por dentroo por fuera las liacuteneas limitantes superior e izquierda en el cuadradopequentildeo de recuento y no se consideran los correspondientes a losliacutemites inferior y derechoSe hace el recuento en los puntos ABCD y Ey se sigue los mismos paraacutemetros del recuento de leucocitos
LECTURA
Fig 14
624 Resultados
Nordm de hematiacutees x mm3 = hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeosaltura x dilucioacuten X aacuterea
Reemplazando = hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeos110 x 1200 x 15
= hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeos divide 110 000
= hematiacutees contados x 10 000
625 Valores de referencia
(Unidades tradicionales millones de ceacutelulasmm3)
Hombres 4 500 000 - 5 500 000
Mujeres 4 000 000 - 5 000 000
Nintildeos (4 antildeos) 4 200 000 - 5 200 000
Lactantes (1 - 6 meses) 3 800 000 - 5 200 000
Recieacuten nacidos 5 000 000 - 6 000 000
Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2
63 DETERMINACIOacuteN DEL VOLUMEN GLOBULAR (Hematocrito)
Mide la fraccioacuten que comprende a los gloacutebulos rojos (masa globular) respectoal
volumen total de la muestra de sangre venosa o capilar Puede expresarseen
porcentaje o como valor decimal
Hto= altura de la columna de gloacutebulos rojosdivide altura de la columna de sangre
total(gloacutebulos rojos maacutes plasma)
631 Meacutetodo de Wintrobe
Materiales requeridos
- Tubo de Wintrobe graduado de 0 - 100 mm
- Pipetas Pasteur o pipetas de transferencia
- Tapoacuten de goma
Procedimiento
diams Llenar la sangre extraiacuteda con anticoagulante con una pipeta pasteur
comenzandodesde el fondo hasta la marca superior de 100 mm teniendocuidado
de no provocar espuma
diams Tapar el tubo con un tapoacuten de goma para evitar la evaporacioacuten
diams Centrifugar a 3000 rpm por 30 minutos
Resultados (lectura)
Del tubo graduado se mide directamente el nivel de la columna de gloacutebulosrojos
Valores de referencia
Hombres 40 - 54Mujeres 38 - 48
Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2
632 Meacutetodo de microhematocrito
Materiales requeridos
- Capilares rojos y azules (75 mm x 15 mm)
- Plastilina
Procedimiento
diams Tomar la muestra en capilares rojos heparinizados directamente del pulpejodel
dedo o utilizar capilares azules sin heparina para sangre venosacon
anticoagulante de Wintrobe o EDTA Debe llenarse aproximadamente70 - 80
del capilar
diams Ocluir (tapar) un extremo del capilar con plastilina
diams Colocar el capilar sobre la plataforma del cabezal de una centriacutefuga demicrohematocrito con el extremo ocluido adherido al reborde externo de laplataforma
diams Centrifugar por 5 minutos entre 10 000 - 12 000 rpm
Resultados (lectura)
La lectura se realiza con una escala estandarizada que expenden en el comercio
Uso de la escala
diams Sostenga el tubo frente a la escala de manera que el fondo de la columnade eritrocitos (no el extremo inferior del tubo) quede exactamente al mismonivel de la liacutenea horizontal correspondiente al cero
diams Desplace el tubo a traveacutes de la escala hasta que la liacutenea marcada con elnuacutemero 10 quede al nivel del tope de la columna de plasma Vigile que elfondo de la
columna de eritrocitos continuacutee sobre la liacutenea cero El tubodebe encontrarse completamente en posicioacuten vertical
diams La liacutenea que pase al nivel del tope de la columna de eritrocitos indicaraacute lafraccioacuten de volumen de eacutestos
Valores de referencia
Hombres 40 - 50
Mujeres 38 - 44
Nintildeos (5 antildeos) 38 - 44
Lactantes (3 meses) 37 - 42
Recieacuten nacidos 50 - 58
La disposicioacuten celular esParte superior una columna de plasmaEn la interfase estaacuten los leucocitos yplaquetasParte inferior estaacute la columna deeritrocitos (Fig 15)
64 DOSAJE DE HEMOGLOBINA
Principio
La sangre se diluye en liacutequido de Drabkin el cual hemoliza los hematiacutees yconvierte la hemoglobina en cianometahemoglobina (cianuro de hemiglobina)La solucioacuten que se produce se lee por medio de un espectrofotoacutemetro ofotocoloriacutemetro Su grado de absorbancia es proporcional a la cantidad dehemoglobina que contenga la sangre
641 Materiales y reactivos
6411 Un coloriacutemetro fotoeleacutectrico o un espectrofotoacutemetro
6412 Pipetas
diams Una pipeta para sangre (pipeta de Sahli) graduada hasta 002 mL contubo de goma y boquilla
diams Una pipeta de vidrio graduada de 5 mL
6413 Tubos de ensayo
6414 Reactivo de Drabkin para dilucioacuten
Este reactivo se puede adquirir en tabletas o polvos para disolver en 1litro de agua destilada Si se dispone de una balanza analiacutetica la preparacioacutense puede hacer en el laboratorio Esta solucioacuten se puedeconservar durante un mes en un frasco de vidrio oscuro Deseacutechese sise enturbia
62 RECUENTO DE GLOacuteBULOS ROJOS
Principio
La sangre se diluye en un liacutequido que nos permite observar claramente loshematiacutees luego esta dilucioacuten se coloca en una caacutemara de Neubauer con laayuda de una pipeta automaacutetica o pipeta Pasteur y se cuentan en el microscopioa un objetivo de 40x para calcular el nuacutemero de gloacutebulos rojos por mm3
621 Equipos
- Microscopio
- Hemocitoacutemetro (caacutemara de Neubauer)
622 Materiales y reactivos requeridos
6221 Pipeta de gloacutebulos rojos (De Thoma) o pipeta automaacutetica (de 0-100 mL)
Presenta cerca del extremo superior una marca de 101 inmediatamentecontinuacutea una dilatacioacuten (bulbo) que contiene una perla roja mezcladoraluego sigue el tallo (extremo maacutes largo) el cual estaacute dividido en 10 partescon 2 marcas 1 acabando el bulbo y 05 a la mitad del tallo Se requiereigual que el recuento de leucocitos una boquilla para aspirar
6222 Diluyente de gloacutebulos rojos Cloruro de Sodio al 09 (ver anexo)
Diluyente de Hayem (ver anexo)
6223 Contador manual (soacutelo si fuera necesario)
6224 Papel filtro
623 Procedimiento
6231 Mezclar la sangre obtenida con el anticoagulante o tomar sangre capilar
6232 Llenar la pipeta de gloacutebulos rojos con sangre hasta la marca de 05para realizar una dilucioacuten de 1200 y si se carga hasta 1 la dilucioacutenseraacute 1100 Limpiar la punta con gasa o papel absorbente
6233 Introducir la pipeta en el tubo o frasquito conteniendo diluyente (Hayem)y llenar de liacutequido de dilucioacuten hasta la marca de 101
6234 Se coloca en un rotador automaacutetico o se hace rotar manualmente de2 a 3 minutos
6235 Agitar bien la pipeta y descartar 3 a 4 gotas del tallo luego colocar unagota pequentildea cerca de un extremo de la caacutemara para que por capilaridadse llene exactamente
6236 Hacer el recuento con objetivo de 40xSe puede realizar con la pipeta automaacutetica se toma 20 mL (002mL)de sangre total con anticoagulante o sangre capilar y se deposita enun tubo de 12 x 75 que contenga 4 mL de solucioacuten de Hayem (aquiacute setiene una dilucioacuten de 1200) Se deja reposar aproximadamente 5minutos y se procede a cargar la caacutemara con la misma pipeta usandoun nuevo tip El inconveniente aquiacute es el gasto de reactivo (4 mL) perolas medidas son mas exactas
6237 Dejar en reposo por 3 minutos
6238 Enfocar la cuadriacutecula a 10x luego con el objetivo de 40x contar sobreel cuadrado grande central de la caacutemara soacutelo en 5 cuadrados pequentildeosuno central y cuatro angulares (80 cuadraditos en total)
6239 En el recuento se incluyen las ceacutelulas que cubren o tocan por dentroo por fuera las liacuteneas limitantes superior e izquierda en el cuadradopequentildeo de recuento y no se consideran los correspondientes a losliacutemites inferior y derechoSe hace el recuento en los puntos ABCD y Ey se sigue los mismos paraacutemetros del recuento de leucocitos
LECTURA
Fig 14
624 Resultados
Nordm de hematiacutees x mm3 = hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeosaltura x dilucioacuten X aacuterea
Reemplazando = hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeos110 x 1200 x 15
= hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeos divide 110 000
= hematiacutees contados x 10 000
625 Valores de referencia
(Unidades tradicionales millones de ceacutelulasmm3)
Hombres 4 500 000 - 5 500 000
Mujeres 4 000 000 - 5 000 000
Nintildeos (4 antildeos) 4 200 000 - 5 200 000
Lactantes (1 - 6 meses) 3 800 000 - 5 200 000
Recieacuten nacidos 5 000 000 - 6 000 000
Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2
63 DETERMINACIOacuteN DEL VOLUMEN GLOBULAR (Hematocrito)
Mide la fraccioacuten que comprende a los gloacutebulos rojos (masa globular) respectoal
volumen total de la muestra de sangre venosa o capilar Puede expresarseen
porcentaje o como valor decimal
Hto= altura de la columna de gloacutebulos rojosdivide altura de la columna de sangre
total(gloacutebulos rojos maacutes plasma)
631 Meacutetodo de Wintrobe
Materiales requeridos
- Tubo de Wintrobe graduado de 0 - 100 mm
- Pipetas Pasteur o pipetas de transferencia
- Tapoacuten de goma
Procedimiento
diams Llenar la sangre extraiacuteda con anticoagulante con una pipeta pasteur
comenzandodesde el fondo hasta la marca superior de 100 mm teniendocuidado
de no provocar espuma
diams Tapar el tubo con un tapoacuten de goma para evitar la evaporacioacuten
diams Centrifugar a 3000 rpm por 30 minutos
Resultados (lectura)
Del tubo graduado se mide directamente el nivel de la columna de gloacutebulosrojos
Valores de referencia
Hombres 40 - 54Mujeres 38 - 48
Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2
632 Meacutetodo de microhematocrito
Materiales requeridos
- Capilares rojos y azules (75 mm x 15 mm)
- Plastilina
Procedimiento
diams Tomar la muestra en capilares rojos heparinizados directamente del pulpejodel
dedo o utilizar capilares azules sin heparina para sangre venosacon
anticoagulante de Wintrobe o EDTA Debe llenarse aproximadamente70 - 80
del capilar
diams Ocluir (tapar) un extremo del capilar con plastilina
diams Colocar el capilar sobre la plataforma del cabezal de una centriacutefuga demicrohematocrito con el extremo ocluido adherido al reborde externo de laplataforma
diams Centrifugar por 5 minutos entre 10 000 - 12 000 rpm
Resultados (lectura)
La lectura se realiza con una escala estandarizada que expenden en el comercio
Uso de la escala
diams Sostenga el tubo frente a la escala de manera que el fondo de la columnade eritrocitos (no el extremo inferior del tubo) quede exactamente al mismonivel de la liacutenea horizontal correspondiente al cero
diams Desplace el tubo a traveacutes de la escala hasta que la liacutenea marcada con elnuacutemero 10 quede al nivel del tope de la columna de plasma Vigile que elfondo de la
columna de eritrocitos continuacutee sobre la liacutenea cero El tubodebe encontrarse completamente en posicioacuten vertical
diams La liacutenea que pase al nivel del tope de la columna de eritrocitos indicaraacute lafraccioacuten de volumen de eacutestos
Valores de referencia
Hombres 40 - 50
Mujeres 38 - 44
Nintildeos (5 antildeos) 38 - 44
Lactantes (3 meses) 37 - 42
Recieacuten nacidos 50 - 58
La disposicioacuten celular esParte superior una columna de plasmaEn la interfase estaacuten los leucocitos yplaquetasParte inferior estaacute la columna deeritrocitos (Fig 15)
64 DOSAJE DE HEMOGLOBINA
Principio
La sangre se diluye en liacutequido de Drabkin el cual hemoliza los hematiacutees yconvierte la hemoglobina en cianometahemoglobina (cianuro de hemiglobina)La solucioacuten que se produce se lee por medio de un espectrofotoacutemetro ofotocoloriacutemetro Su grado de absorbancia es proporcional a la cantidad dehemoglobina que contenga la sangre
641 Materiales y reactivos
6411 Un coloriacutemetro fotoeleacutectrico o un espectrofotoacutemetro
6412 Pipetas
diams Una pipeta para sangre (pipeta de Sahli) graduada hasta 002 mL contubo de goma y boquilla
diams Una pipeta de vidrio graduada de 5 mL
6413 Tubos de ensayo
6414 Reactivo de Drabkin para dilucioacuten
Este reactivo se puede adquirir en tabletas o polvos para disolver en 1litro de agua destilada Si se dispone de una balanza analiacutetica la preparacioacutense puede hacer en el laboratorio Esta solucioacuten se puedeconservar durante un mes en un frasco de vidrio oscuro Deseacutechese sise enturbia
6232 Llenar la pipeta de gloacutebulos rojos con sangre hasta la marca de 05para realizar una dilucioacuten de 1200 y si se carga hasta 1 la dilucioacutenseraacute 1100 Limpiar la punta con gasa o papel absorbente
6233 Introducir la pipeta en el tubo o frasquito conteniendo diluyente (Hayem)y llenar de liacutequido de dilucioacuten hasta la marca de 101
6234 Se coloca en un rotador automaacutetico o se hace rotar manualmente de2 a 3 minutos
6235 Agitar bien la pipeta y descartar 3 a 4 gotas del tallo luego colocar unagota pequentildea cerca de un extremo de la caacutemara para que por capilaridadse llene exactamente
6236 Hacer el recuento con objetivo de 40xSe puede realizar con la pipeta automaacutetica se toma 20 mL (002mL)de sangre total con anticoagulante o sangre capilar y se deposita enun tubo de 12 x 75 que contenga 4 mL de solucioacuten de Hayem (aquiacute setiene una dilucioacuten de 1200) Se deja reposar aproximadamente 5minutos y se procede a cargar la caacutemara con la misma pipeta usandoun nuevo tip El inconveniente aquiacute es el gasto de reactivo (4 mL) perolas medidas son mas exactas
6237 Dejar en reposo por 3 minutos
6238 Enfocar la cuadriacutecula a 10x luego con el objetivo de 40x contar sobreel cuadrado grande central de la caacutemara soacutelo en 5 cuadrados pequentildeosuno central y cuatro angulares (80 cuadraditos en total)
6239 En el recuento se incluyen las ceacutelulas que cubren o tocan por dentroo por fuera las liacuteneas limitantes superior e izquierda en el cuadradopequentildeo de recuento y no se consideran los correspondientes a losliacutemites inferior y derechoSe hace el recuento en los puntos ABCD y Ey se sigue los mismos paraacutemetros del recuento de leucocitos
LECTURA
Fig 14
624 Resultados
Nordm de hematiacutees x mm3 = hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeosaltura x dilucioacuten X aacuterea
Reemplazando = hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeos110 x 1200 x 15
= hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeos divide 110 000
= hematiacutees contados x 10 000
625 Valores de referencia
(Unidades tradicionales millones de ceacutelulasmm3)
Hombres 4 500 000 - 5 500 000
Mujeres 4 000 000 - 5 000 000
Nintildeos (4 antildeos) 4 200 000 - 5 200 000
Lactantes (1 - 6 meses) 3 800 000 - 5 200 000
Recieacuten nacidos 5 000 000 - 6 000 000
Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2
63 DETERMINACIOacuteN DEL VOLUMEN GLOBULAR (Hematocrito)
Mide la fraccioacuten que comprende a los gloacutebulos rojos (masa globular) respectoal
volumen total de la muestra de sangre venosa o capilar Puede expresarseen
porcentaje o como valor decimal
Hto= altura de la columna de gloacutebulos rojosdivide altura de la columna de sangre
total(gloacutebulos rojos maacutes plasma)
631 Meacutetodo de Wintrobe
Materiales requeridos
- Tubo de Wintrobe graduado de 0 - 100 mm
- Pipetas Pasteur o pipetas de transferencia
- Tapoacuten de goma
Procedimiento
diams Llenar la sangre extraiacuteda con anticoagulante con una pipeta pasteur
comenzandodesde el fondo hasta la marca superior de 100 mm teniendocuidado
de no provocar espuma
diams Tapar el tubo con un tapoacuten de goma para evitar la evaporacioacuten
diams Centrifugar a 3000 rpm por 30 minutos
Resultados (lectura)
Del tubo graduado se mide directamente el nivel de la columna de gloacutebulosrojos
Valores de referencia
Hombres 40 - 54Mujeres 38 - 48
Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2
632 Meacutetodo de microhematocrito
Materiales requeridos
- Capilares rojos y azules (75 mm x 15 mm)
- Plastilina
Procedimiento
diams Tomar la muestra en capilares rojos heparinizados directamente del pulpejodel
dedo o utilizar capilares azules sin heparina para sangre venosacon
anticoagulante de Wintrobe o EDTA Debe llenarse aproximadamente70 - 80
del capilar
diams Ocluir (tapar) un extremo del capilar con plastilina
diams Colocar el capilar sobre la plataforma del cabezal de una centriacutefuga demicrohematocrito con el extremo ocluido adherido al reborde externo de laplataforma
diams Centrifugar por 5 minutos entre 10 000 - 12 000 rpm
Resultados (lectura)
La lectura se realiza con una escala estandarizada que expenden en el comercio
Uso de la escala
diams Sostenga el tubo frente a la escala de manera que el fondo de la columnade eritrocitos (no el extremo inferior del tubo) quede exactamente al mismonivel de la liacutenea horizontal correspondiente al cero
diams Desplace el tubo a traveacutes de la escala hasta que la liacutenea marcada con elnuacutemero 10 quede al nivel del tope de la columna de plasma Vigile que elfondo de la
columna de eritrocitos continuacutee sobre la liacutenea cero El tubodebe encontrarse completamente en posicioacuten vertical
diams La liacutenea que pase al nivel del tope de la columna de eritrocitos indicaraacute lafraccioacuten de volumen de eacutestos
Valores de referencia
Hombres 40 - 50
Mujeres 38 - 44
Nintildeos (5 antildeos) 38 - 44
Lactantes (3 meses) 37 - 42
Recieacuten nacidos 50 - 58
La disposicioacuten celular esParte superior una columna de plasmaEn la interfase estaacuten los leucocitos yplaquetasParte inferior estaacute la columna deeritrocitos (Fig 15)
64 DOSAJE DE HEMOGLOBINA
Principio
La sangre se diluye en liacutequido de Drabkin el cual hemoliza los hematiacutees yconvierte la hemoglobina en cianometahemoglobina (cianuro de hemiglobina)La solucioacuten que se produce se lee por medio de un espectrofotoacutemetro ofotocoloriacutemetro Su grado de absorbancia es proporcional a la cantidad dehemoglobina que contenga la sangre
641 Materiales y reactivos
6411 Un coloriacutemetro fotoeleacutectrico o un espectrofotoacutemetro
6412 Pipetas
diams Una pipeta para sangre (pipeta de Sahli) graduada hasta 002 mL contubo de goma y boquilla
diams Una pipeta de vidrio graduada de 5 mL
6413 Tubos de ensayo
6414 Reactivo de Drabkin para dilucioacuten
Este reactivo se puede adquirir en tabletas o polvos para disolver en 1litro de agua destilada Si se dispone de una balanza analiacutetica la preparacioacutense puede hacer en el laboratorio Esta solucioacuten se puedeconservar durante un mes en un frasco de vidrio oscuro Deseacutechese sise enturbia
Fig 14
624 Resultados
Nordm de hematiacutees x mm3 = hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeosaltura x dilucioacuten X aacuterea
Reemplazando = hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeos110 x 1200 x 15
= hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeos divide 110 000
= hematiacutees contados x 10 000
625 Valores de referencia
(Unidades tradicionales millones de ceacutelulasmm3)
Hombres 4 500 000 - 5 500 000
Mujeres 4 000 000 - 5 000 000
Nintildeos (4 antildeos) 4 200 000 - 5 200 000
Lactantes (1 - 6 meses) 3 800 000 - 5 200 000
Recieacuten nacidos 5 000 000 - 6 000 000
Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2
63 DETERMINACIOacuteN DEL VOLUMEN GLOBULAR (Hematocrito)
Mide la fraccioacuten que comprende a los gloacutebulos rojos (masa globular) respectoal
volumen total de la muestra de sangre venosa o capilar Puede expresarseen
porcentaje o como valor decimal
Hto= altura de la columna de gloacutebulos rojosdivide altura de la columna de sangre
total(gloacutebulos rojos maacutes plasma)
631 Meacutetodo de Wintrobe
Materiales requeridos
- Tubo de Wintrobe graduado de 0 - 100 mm
- Pipetas Pasteur o pipetas de transferencia
- Tapoacuten de goma
Procedimiento
diams Llenar la sangre extraiacuteda con anticoagulante con una pipeta pasteur
comenzandodesde el fondo hasta la marca superior de 100 mm teniendocuidado
de no provocar espuma
diams Tapar el tubo con un tapoacuten de goma para evitar la evaporacioacuten
diams Centrifugar a 3000 rpm por 30 minutos
Resultados (lectura)
Del tubo graduado se mide directamente el nivel de la columna de gloacutebulosrojos
Valores de referencia
Hombres 40 - 54Mujeres 38 - 48
Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2
632 Meacutetodo de microhematocrito
Materiales requeridos
- Capilares rojos y azules (75 mm x 15 mm)
- Plastilina
Procedimiento
diams Tomar la muestra en capilares rojos heparinizados directamente del pulpejodel
dedo o utilizar capilares azules sin heparina para sangre venosacon
anticoagulante de Wintrobe o EDTA Debe llenarse aproximadamente70 - 80
del capilar
diams Ocluir (tapar) un extremo del capilar con plastilina
diams Colocar el capilar sobre la plataforma del cabezal de una centriacutefuga demicrohematocrito con el extremo ocluido adherido al reborde externo de laplataforma
diams Centrifugar por 5 minutos entre 10 000 - 12 000 rpm
Resultados (lectura)
La lectura se realiza con una escala estandarizada que expenden en el comercio
Uso de la escala
diams Sostenga el tubo frente a la escala de manera que el fondo de la columnade eritrocitos (no el extremo inferior del tubo) quede exactamente al mismonivel de la liacutenea horizontal correspondiente al cero
diams Desplace el tubo a traveacutes de la escala hasta que la liacutenea marcada con elnuacutemero 10 quede al nivel del tope de la columna de plasma Vigile que elfondo de la
columna de eritrocitos continuacutee sobre la liacutenea cero El tubodebe encontrarse completamente en posicioacuten vertical
diams La liacutenea que pase al nivel del tope de la columna de eritrocitos indicaraacute lafraccioacuten de volumen de eacutestos
Valores de referencia
Hombres 40 - 50
Mujeres 38 - 44
Nintildeos (5 antildeos) 38 - 44
Lactantes (3 meses) 37 - 42
Recieacuten nacidos 50 - 58
La disposicioacuten celular esParte superior una columna de plasmaEn la interfase estaacuten los leucocitos yplaquetasParte inferior estaacute la columna deeritrocitos (Fig 15)
64 DOSAJE DE HEMOGLOBINA
Principio
La sangre se diluye en liacutequido de Drabkin el cual hemoliza los hematiacutees yconvierte la hemoglobina en cianometahemoglobina (cianuro de hemiglobina)La solucioacuten que se produce se lee por medio de un espectrofotoacutemetro ofotocoloriacutemetro Su grado de absorbancia es proporcional a la cantidad dehemoglobina que contenga la sangre
641 Materiales y reactivos
6411 Un coloriacutemetro fotoeleacutectrico o un espectrofotoacutemetro
6412 Pipetas
diams Una pipeta para sangre (pipeta de Sahli) graduada hasta 002 mL contubo de goma y boquilla
diams Una pipeta de vidrio graduada de 5 mL
6413 Tubos de ensayo
6414 Reactivo de Drabkin para dilucioacuten
Este reactivo se puede adquirir en tabletas o polvos para disolver en 1litro de agua destilada Si se dispone de una balanza analiacutetica la preparacioacutense puede hacer en el laboratorio Esta solucioacuten se puedeconservar durante un mes en un frasco de vidrio oscuro Deseacutechese sise enturbia
Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2
63 DETERMINACIOacuteN DEL VOLUMEN GLOBULAR (Hematocrito)
Mide la fraccioacuten que comprende a los gloacutebulos rojos (masa globular) respectoal
volumen total de la muestra de sangre venosa o capilar Puede expresarseen
porcentaje o como valor decimal
Hto= altura de la columna de gloacutebulos rojosdivide altura de la columna de sangre
total(gloacutebulos rojos maacutes plasma)
631 Meacutetodo de Wintrobe
Materiales requeridos
- Tubo de Wintrobe graduado de 0 - 100 mm
- Pipetas Pasteur o pipetas de transferencia
- Tapoacuten de goma
Procedimiento
diams Llenar la sangre extraiacuteda con anticoagulante con una pipeta pasteur
comenzandodesde el fondo hasta la marca superior de 100 mm teniendocuidado
de no provocar espuma
diams Tapar el tubo con un tapoacuten de goma para evitar la evaporacioacuten
diams Centrifugar a 3000 rpm por 30 minutos
Resultados (lectura)
Del tubo graduado se mide directamente el nivel de la columna de gloacutebulosrojos
Valores de referencia
Hombres 40 - 54Mujeres 38 - 48
Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2
632 Meacutetodo de microhematocrito
Materiales requeridos
- Capilares rojos y azules (75 mm x 15 mm)
- Plastilina
Procedimiento
diams Tomar la muestra en capilares rojos heparinizados directamente del pulpejodel
dedo o utilizar capilares azules sin heparina para sangre venosacon
anticoagulante de Wintrobe o EDTA Debe llenarse aproximadamente70 - 80
del capilar
diams Ocluir (tapar) un extremo del capilar con plastilina
diams Colocar el capilar sobre la plataforma del cabezal de una centriacutefuga demicrohematocrito con el extremo ocluido adherido al reborde externo de laplataforma
diams Centrifugar por 5 minutos entre 10 000 - 12 000 rpm
Resultados (lectura)
La lectura se realiza con una escala estandarizada que expenden en el comercio
Uso de la escala
diams Sostenga el tubo frente a la escala de manera que el fondo de la columnade eritrocitos (no el extremo inferior del tubo) quede exactamente al mismonivel de la liacutenea horizontal correspondiente al cero
diams Desplace el tubo a traveacutes de la escala hasta que la liacutenea marcada con elnuacutemero 10 quede al nivel del tope de la columna de plasma Vigile que elfondo de la
columna de eritrocitos continuacutee sobre la liacutenea cero El tubodebe encontrarse completamente en posicioacuten vertical
diams La liacutenea que pase al nivel del tope de la columna de eritrocitos indicaraacute lafraccioacuten de volumen de eacutestos
Valores de referencia
Hombres 40 - 50
Mujeres 38 - 44
Nintildeos (5 antildeos) 38 - 44
Lactantes (3 meses) 37 - 42
Recieacuten nacidos 50 - 58
La disposicioacuten celular esParte superior una columna de plasmaEn la interfase estaacuten los leucocitos yplaquetasParte inferior estaacute la columna deeritrocitos (Fig 15)
64 DOSAJE DE HEMOGLOBINA
Principio
La sangre se diluye en liacutequido de Drabkin el cual hemoliza los hematiacutees yconvierte la hemoglobina en cianometahemoglobina (cianuro de hemiglobina)La solucioacuten que se produce se lee por medio de un espectrofotoacutemetro ofotocoloriacutemetro Su grado de absorbancia es proporcional a la cantidad dehemoglobina que contenga la sangre
641 Materiales y reactivos
6411 Un coloriacutemetro fotoeleacutectrico o un espectrofotoacutemetro
6412 Pipetas
diams Una pipeta para sangre (pipeta de Sahli) graduada hasta 002 mL contubo de goma y boquilla
diams Una pipeta de vidrio graduada de 5 mL
6413 Tubos de ensayo
6414 Reactivo de Drabkin para dilucioacuten
Este reactivo se puede adquirir en tabletas o polvos para disolver en 1litro de agua destilada Si se dispone de una balanza analiacutetica la preparacioacutense puede hacer en el laboratorio Esta solucioacuten se puedeconservar durante un mes en un frasco de vidrio oscuro Deseacutechese sise enturbia
Del tubo graduado se mide directamente el nivel de la columna de gloacutebulosrojos
Valores de referencia
Hombres 40 - 54Mujeres 38 - 48
Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2
632 Meacutetodo de microhematocrito
Materiales requeridos
- Capilares rojos y azules (75 mm x 15 mm)
- Plastilina
Procedimiento
diams Tomar la muestra en capilares rojos heparinizados directamente del pulpejodel
dedo o utilizar capilares azules sin heparina para sangre venosacon
anticoagulante de Wintrobe o EDTA Debe llenarse aproximadamente70 - 80
del capilar
diams Ocluir (tapar) un extremo del capilar con plastilina
diams Colocar el capilar sobre la plataforma del cabezal de una centriacutefuga demicrohematocrito con el extremo ocluido adherido al reborde externo de laplataforma
diams Centrifugar por 5 minutos entre 10 000 - 12 000 rpm
Resultados (lectura)
La lectura se realiza con una escala estandarizada que expenden en el comercio
Uso de la escala
diams Sostenga el tubo frente a la escala de manera que el fondo de la columnade eritrocitos (no el extremo inferior del tubo) quede exactamente al mismonivel de la liacutenea horizontal correspondiente al cero
diams Desplace el tubo a traveacutes de la escala hasta que la liacutenea marcada con elnuacutemero 10 quede al nivel del tope de la columna de plasma Vigile que elfondo de la
columna de eritrocitos continuacutee sobre la liacutenea cero El tubodebe encontrarse completamente en posicioacuten vertical
diams La liacutenea que pase al nivel del tope de la columna de eritrocitos indicaraacute lafraccioacuten de volumen de eacutestos
Valores de referencia
Hombres 40 - 50
Mujeres 38 - 44
Nintildeos (5 antildeos) 38 - 44
Lactantes (3 meses) 37 - 42
Recieacuten nacidos 50 - 58
La disposicioacuten celular esParte superior una columna de plasmaEn la interfase estaacuten los leucocitos yplaquetasParte inferior estaacute la columna deeritrocitos (Fig 15)
64 DOSAJE DE HEMOGLOBINA
Principio
La sangre se diluye en liacutequido de Drabkin el cual hemoliza los hematiacutees yconvierte la hemoglobina en cianometahemoglobina (cianuro de hemiglobina)La solucioacuten que se produce se lee por medio de un espectrofotoacutemetro ofotocoloriacutemetro Su grado de absorbancia es proporcional a la cantidad dehemoglobina que contenga la sangre
641 Materiales y reactivos
6411 Un coloriacutemetro fotoeleacutectrico o un espectrofotoacutemetro
6412 Pipetas
diams Una pipeta para sangre (pipeta de Sahli) graduada hasta 002 mL contubo de goma y boquilla
diams Una pipeta de vidrio graduada de 5 mL
6413 Tubos de ensayo
6414 Reactivo de Drabkin para dilucioacuten
Este reactivo se puede adquirir en tabletas o polvos para disolver en 1litro de agua destilada Si se dispone de una balanza analiacutetica la preparacioacutense puede hacer en el laboratorio Esta solucioacuten se puedeconservar durante un mes en un frasco de vidrio oscuro Deseacutechese sise enturbia
columna de eritrocitos continuacutee sobre la liacutenea cero El tubodebe encontrarse completamente en posicioacuten vertical
diams La liacutenea que pase al nivel del tope de la columna de eritrocitos indicaraacute lafraccioacuten de volumen de eacutestos
Valores de referencia
Hombres 40 - 50
Mujeres 38 - 44
Nintildeos (5 antildeos) 38 - 44
Lactantes (3 meses) 37 - 42
Recieacuten nacidos 50 - 58
La disposicioacuten celular esParte superior una columna de plasmaEn la interfase estaacuten los leucocitos yplaquetasParte inferior estaacute la columna deeritrocitos (Fig 15)
64 DOSAJE DE HEMOGLOBINA
Principio
La sangre se diluye en liacutequido de Drabkin el cual hemoliza los hematiacutees yconvierte la hemoglobina en cianometahemoglobina (cianuro de hemiglobina)La solucioacuten que se produce se lee por medio de un espectrofotoacutemetro ofotocoloriacutemetro Su grado de absorbancia es proporcional a la cantidad dehemoglobina que contenga la sangre
641 Materiales y reactivos
6411 Un coloriacutemetro fotoeleacutectrico o un espectrofotoacutemetro
6412 Pipetas
diams Una pipeta para sangre (pipeta de Sahli) graduada hasta 002 mL contubo de goma y boquilla
diams Una pipeta de vidrio graduada de 5 mL
6413 Tubos de ensayo
6414 Reactivo de Drabkin para dilucioacuten
Este reactivo se puede adquirir en tabletas o polvos para disolver en 1litro de agua destilada Si se dispone de una balanza analiacutetica la preparacioacutense puede hacer en el laboratorio Esta solucioacuten se puedeconservar durante un mes en un frasco de vidrio oscuro Deseacutechese sise enturbia
6413 Tubos de ensayo
6414 Reactivo de Drabkin para dilucioacuten
Este reactivo se puede adquirir en tabletas o polvos para disolver en 1litro de agua destilada Si se dispone de una balanza analiacutetica la preparacioacutense puede hacer en el laboratorio Esta solucioacuten se puedeconservar durante un mes en un frasco de vidrio oscuro Deseacutechese sise enturbia