UNIVERSIDAD POLITÉCNICA DE MADRID
Escuela Técnica Superior de Ingenieros Agrónomos de Madrid
MECANISMOS IMPLICADOS EN LAS ETAPAS
INICIALES DE INFECCIÓN EN LA CANCROSIS
DE LOS CÍTRICOS PROVOCADA POR
Xanthomonas citri subsp. citri
Tesis Doctoral
Marta Sena Vélez
Ingeniera Agrónoma
2015
Departamento de Biotecnología
Escuela Técnica Superior de Ingenieros Agrónomos
Universidad Politécnica de Madrid
Tesis Doctoral
Mecanismos implicados en las etapas iniciales de infección en la cancrosis
de los cítricos provocada por Xanthomonas citri subsp. citri
Autor
Marta Sena Vélez
Ingeniera Agrónoma
Director
Jaime Cubero Dabrio
Dr. en Ciencias Biológicas
Madrid, 2015
UNIVERSIDAD POLITÉCNICA DE MADRID
iii
(D15)
Tribunal nombrado por el Magfco. y Excmo. Sr. Rector de la Universidad Politécnica
de Madrid el día de de 2015.
Presidente
Secretario
Vocal
Vocal
Vocal
Suplente
Suplente
Realizado el acto de defensa de la tesis el día de de 2015 en la Escuela
Técnica Superior de Ingenieros Agrónomos de Madrid.
Calificación:
El Presidente
El Secretario
Los Vocales
v
A mi familia, amigos y compañeros,
porque me habéis apoyado estos años, y
porque este trabajo también es un poco
vuestro.
Os quiero mucho.
vii
Ἓν οἶδα ὅτι οὐδὲν οἶδα
“Sólo sé que no sé nada”
Sócrates, 470-399 a. C.
Porque cuanto más investigamos y mayor es nuestro
conocimiento, mayor es también nuestra inquietud
por conocer y saber más, y solo así, nos damos
cuenta de todo lo que nos queda por descubrir.
“Por eso, si conoces los planes del enemigo sabrás qué
estrategias serán eficaces y cuáles no”
“Para estar seguro de tomar lo que atacas, ataca en
lugares que el enemigo no defiende. Para estar seguro de
conservar lo que proteges, defiende un lugar donde el
enemigo no ataca”
“Cuando esté unido, divídelo”
Sun Tzu
El Arte de la Guerra, Siglo IV a. C.
ix
Reconocimientos
Este trabajo ha sido realizado en el Departamento de Protección Vegetal del Instituto
Nacional de Investigaciones Agrarias y Agroalimentarias (INIA), bajo la dirección del
Dr. Jaime Cubero Dabrio.
Algunos de los estudios han sido realizados en el Citrus Research and Education Center
(CREC) y el Emerging Pathogens Institute (EPI) ambos pertenecientes a La
Universidad de Florida, con la ayuda de los Doctores James H. Graham y Jorge A.
Girón.
En este trabajo han colaborado las siguientes personas:
Dr. Jaime Cubero Dabrio, INIA
Dr. James H. Graham, CREC
Elisa Ferragud Capó, INIA
Dra. Cristina Redondo Casero, INIA
Dr. Jorge A. Girón, EPI
Dr. Pablo Rodríguez Palenzuela, CBGP-ETSIA
Dr. Evan Johnson CREC
Durante la realización de este trabajo he disfrutado de una beca FPI-INIA del Ministerio
de Ciencia e Innovación que, además, me ha permitido realizar dos estancias en el
CREC y EPI de La Universidad de Florida.
Este trabajo ha sido financiado con los siguientes proyectos nacionales e
internacionales: CRDF546/UF12170 (Citrus Advance Technology Program), FCPRAC-
NAS85 (Florida Department of Citrus-University of Florida), RTA2008-0048 (INIA) y
RTA2006-00149 (INIA).
xi
Agradecimientos
“Wi th a l i t t l e he lp o f my f r i ends”
Con la defensa de este trabajo se cierra una etapa de mi vida, mi última etapa de
estudiante, aunque creo que nunca dejaré de aprender. Durante todo este tiempo he
aprendido muchas cosas, no todas relacionadas con el laboratorio ni con Xanthomonas,
y aunque a veces se ha hecho cuesta arriba, la mayoría de los momentos han sido
buenos, muy buenos, es por ello que os agradezco a todos vuestra ayuda durante este
tiempo.
En primer lugar me gustaría dar las gracias a Jaime por haberme permitido realizar este
trabajo en su grupo y por tener siempre, la puerta de su despacho abierta. Por haber
escuchado pacientemente mis dudas y contestado siempre a mis múltiples preguntas.
Por escuchar mis ideas, que a veces eran demasiadas, por habérmelas razonado y
enseñarme a mí a razonarlas y valorarlas, a ser crítica. Por la libertad, por los pruébalo o
demuéstramelo… Algunas cosas han salido, otras no, otras necesitan todavía algún
reajuste y otras están pendientes, pero con todas he aprendido, si no las hubiéramos
probado no habríamos ganado nada. Por las estancias en el extranjero y por preocuparte
de que todo me fuera bien allí. Por los ánimos en los últimos momentos y por hacer que
siempre contemos todos en el laboratorio y que colaboremos entre nosotros. En
resumen, por ser tan buen guía en este camino que es llegar a ser doctor.
A mis compañeros de laboratorio, por todo, por las risas, los llantos, por los desayunos,
las comidas y los desayunos de los viernes que se han convertido en tradición. Porque
como dice Pilar, con vosotros venir a trabajar no es trabajo, y la verdad es que tiene
razón, sois los mejores. Por ser como sois cada uno de vosotros, y haber ocupado un
huequito de mi corazón. A Elisa porque no creo que con otra persona hubiera sido capaz
de compartir una cabina de flujo de un metro durante tantas horas y no haber muerto en
el intento. Por todas las horas de trabajo juntas y nuestras charlas para amenizar el rato.
Por compartir un poquito de ti conmigo todos los días y porque aunque no he llegado a
tu nivel soy bastante más organizada que antes. Por tu alegría, tus lágrimas y tus
abrazos, pero también por los conciertos y lo loca que estás, o mejor dicho estamos
(Como un día nos vea Jaime…). A Jerson, por su ayuda y sus ideas, pero también por su
compañía y por los ratos que salíamos a fumar. Porque es un buen amigo y siempre está
dispuesto a escuchar y a discutir cualquier idea. Por todas las pruebas que hemos hecho,
alguna en secreto, aunque no hayan salido, porque al fin y al cabo, a veces, esto es un poco
xii
como jugar, un reto, y eso lo hace divertido. Muchas gracias por hacer este camino
conmigo. A Cristina por decir las cosas como son, porque de ella he aprendido a
organizar y analizar los resultados, por preocuparse siempre por todos nosotros y estar
disponible con cualquier duda o ayuda que necesitáramos, por ser un apoyo durante
estos años. A Pilar porque también me ha enseñado un montón de cosas y me ha
apoyado y ayudado. Por ser peleona, que con algo de eso me he quedado y por
ayudarme a convencer a Jaime para hacer algunos ensayos. A Iray porque además de
ayudarme y enseñarme siempre estaba animando el laboratorio, ya sea con sustos o con
su buen humor. A Bea, Gema y Carlos que han compartido los estreses de la tesis
conmigo, por todos los ratos juntos y las tardes en el INIA que no se acababan nunca,
por vuestra amistad y vuestra alegría, y porque me habéis enseñado muchas cosas que
me han hecho ser mejor persona y científica. Aunque seáis fúngicos, os quiero también
un montón. A los Frikis en su conjunto por las cañas, los viajes y todos los ratos juntos.
A Fernando, Maite y Javiera, porque si podían ayudarme con lo que fuera siempre lo
han hecho, por vuestra alegría y buen humor y por compartir los buenos y los malos
ratos que hemos tenido en el laboratorio. A Javier y Gerardo, porque nos han dejado
ocupar su laboratorio y ayudarnos siempre que han podido, sin poner pega alguna,
muchas gracias a vosotros también.
I would like to thank Jim for his help throughout the all thesis and for inviting me either
to his laboratory at the CREC or his home. For being so critical with our work and
always show us different points of view. For making me everything so easy during my
stay in Lake Alfred, and allow full microscopes access to me. It was very nice to have
your support all these years. I have learnt many things from you, so thank you very
much. To Susan and Laura for taking care of me when I was in US. To Jim`s group for
helping me in everything I needed there, to Marta, Evan, Diane, Alma and Swapna, and
also to CREC workers.
To Diann Achor for teach me how to use the microscopes and how to treat the samples
for microscopy. To let me work in her lab and with the microscopes anytime even
without her supervision, thank you for trusting me.
A Jorge, por permitirme trabajar en su laboratorio y colaborar con nosotros, por
enseñarme a trabajar con proteínas y a usar el microscopio de transmisión. Gracias por
tu paciencia, buen humor y por quedarte hasta las mil en el laboratorio para acabar las
extracciones y los geles.
xiii
A Pablo y Emilia, por estar siempre dispuestos a colaborar y ayudar siempre que lo
hemos necesitado. Por todo lo que me aprendí de vosotros trabajando en el Labo X, y
que me ha servido mucho durante estos años.
A Ethel, Isabel y Mariel, porque aunque vinieron a nuestro laboratorio para aprender, a
mí me enseñaron mucho más. Gracias por los ratos que pasasteis con nosotros en
Madrid.
A la pandilla de Lake Alfred por acogerme en su grupo como a uno más y ofrecerme su
amistad, por las cenas, los cines, la fiesta, los bailes y thanksgiving. Sin vosotros mi
estancia en Lake Alfred no hubiera sido lo mismo. En especial a Raquel y Rubén que
además de ayudarme a conocer el laboratorio, me acogieron en su casa unos días y se
preocupaban porque siempre tuviera algo que hacer. Pero también a Evan, Megan,
Pedro, Raquel y otros cuyos nombres no recuerdo, gracias.
A Elisabeth y Angélica por ser las mejores compañeras de piso, también a Gaudi que
me hizo mucha compañía. Me alegro mucho de haberos conocido y haber pasado una
temporada en Gainesville con vosotras.
También me gustaría agradecer a Feli y Gloria, por todas las tardes que me han hecho
un poco de compañía, por su alegría y por preocuparse y preguntar siempre por
nosotros.
A mis amigos, a todos, los Agrónomos y los no agrónomos, por preocuparos por mí y
por mi trabajo todo este tiempo. Porque desde hace años habéis aguantado mis
quebraderos de cabeza, da igual donde estuvierais, siempre he sentido vuestro apoyo.
Por las quedadas y las cañas improvisadas que a veces se nos van de las manos, por los
viajes, las cenas y Gandía. Siempre es un placer con todos vosotros, os quiero un
montón.
A mi familia, de la que Edu forma ahora también parte, porque siempre me han estado
apoyando y dando fuerza para continuar, en los buenos y en los malos ratos. Por
quererme y aguantarme incluso cuando estaba de mal humor. Por darme todos los
abrazos que he necesitado e incluso más. Por ayudarme, aconsejarme, y a veces hasta
leeros algún trabajo para revisarlo. Sin vosotros, este trabajo no habría sido posible.
Muchas gracias, os quiero.
Principales abreviaturas
xv
Principales Abreviaturas
ADN: Ácido Desoxirribonucleico
ANOVA: análisis de la varianza
APHIS: Animal and Plant Health Inspection Service
ARN: Ácido Ribonucleico
cGMP: GMP cíclico
CLSM: Confocal Laser Scanning Microscopy. Microscopía de barrido láser confocal
CV: Cristal Violet. Cristal violeta
DSF: Diffusible Signal Factors. Factores de señalización difusibles
EFSA: European Food Safety Authority
FAO: Food and Agriculture Organization of the United Nations
EPPO: European and Mediterranean Plant Protection Organization
HAP: Hook Associated Protein. Proteína asociada al gancho o garfio
Hrp: hypersensitive response and pathogenicity
Hrc: hypersensitive response and conserved
GFP: Green Fluorescence Protein. Proteína verde fluorescente
IPPC: International Plant Protection Convention
ISR: Induced Systemic Response. Resistencia sistémica inducida
LB: Luria Bertani medium. Medio Luria Bertani
LPS: Lipopolisacárido
Mpb: Mega pares de bases
MCP: Methyl Accepting Chemotaxis Protein. Proteínas aceptoras de grupos Metilo
MLVA: Multiple-Locus Variable number tandem repeat Analysis
MMA: Minimal Medium A. Medio mínimo A
Principales abreviaturas
xvi
PAMP: Pathogen Associated Molecular Pattern. Patrones moleculares asociados a
patógenos
PCR: Polymerase chain reaction. Reacción en cadena de la polimerasa
PNPs: Péptidos Natriuréticos de Plantas
PYM: Peptone, Yeast, Malt medium. Medio peptona, levadura y malta.
RFLP: Restriction Fragment Length. Polymorphism. Polimorfismos en la longitud de
los fragmentos de restricción
Rpf: regulation of pathogenicity factor
SAR: Systemic Adquired Resistance-Respuesta Sistémica Adquirida
SDS: dodecil sulfato sódico
SDS-PAGE: Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis
SDW: Sterile Distilled Water. Agua destilada estéril
SEM: Scanning Electron Microscopy. Microscopía electrónica de barrido
SNK: Student Newmans-Keuls
SST2: Sistema de Secreción Tipo II
SST3: Sistema de Secreción Tipo III
SST4: Sistema de Secreción Tipo IV
SST5: Sistema de Secreción Tipo V
SOPP: Sodium Ortophenylphenate. Ortofenilfenato de sodio
STCR: Sensors of Two-Component Regulatory System. Sensores de los sistemas de
regulación de dos componentes
TBDT: TonB dependent transporters. Transportadores dependientes de TonB
TEM: Transmission Electron Microscopy. Microscopía electrónica de transmisión
TEMED: Tetramethylethylendiamina
Principales abreviaturas
xvii
ufc: unidades formadoras de colonias
USDA: United States Department of Agriculture
VBNC: Viable y no cultivable
Xac: Xanthomonas alfalfae subsp. citrumelonis
Xc: Xanthomonas campestris
Xcc: Xanthomonas citri subsp. citri
Xfa: Xanthomonas fuscans subsp. aurantifolii
Índice
xix
Índice
Reconocimientos ............................................................................................................. ix
Agradecimientos .............................................................................................................. xi
Principales Abreviaturas ................................................................................................. xv
Índice ............................................................................................................................. xix
Resumen ....................................................................................................................... xxv
Abstract ....................................................................................................................... xxvii
CAPÍTULO 1: INTRODUCCIÓN ................................................................................... 1
1. El género Xanthomonas ............................................................................................ 3
2. Cancrosis o Chancro de los Cítricos ......................................................................... 7
2.1. Tipos de cancrosis o chancros descritos ................................................................ 7
Chancro o cancrosis tipo A (Asiatic Citrus Canker) ......................................... 9 2.1.1.
El Chancro tipo B ............................................................................................ 10 2.1.2.
El Chancro tipo C ............................................................................................ 11 2.1.3.
Chancros tipo D y E ......................................................................................... 11 2.1.4.
2.2. Descripción de la enfermedad ............................................................................. 12
Síntomas ........................................................................................................... 12 2.2.1.
Ciclo de la enfermedad y epidemiología ......................................................... 16 2.2.2.
2.3. Diagnóstico y detección....................................................................................... 20
2.4. Control ................................................................................................................. 24
Prevención ....................................................................................................... 24 2.4.1.
Control químico ............................................................................................... 28 2.4.2.
Prácticas culturales .......................................................................................... 30 2.4.3.
Control biológico ............................................................................................. 31 2.4.4.
Métodos barrera: cortavientos ......................................................................... 32 2.4.5.
Uso de variedades resistentes y mejora de cítricos .......................................... 34 2.4.6.
Control integrado ............................................................................................. 35 2.4.7.
3. Xanthomonas citri subsp. citri ................................................................................ 35
4. Factores de Virulencia de Xanthomonas citri subsp. citri ...................................... 40
4.1. Sistema de Secreción Tipo III ............................................................................. 41
4.2. Exopolisacárido: goma xanthana ......................................................................... 44
4.3. Regulación tipo quorum sensing ......................................................................... 45
4.4. Enzimas Pectolíticas ............................................................................................ 46
Índice
xx
4.5. Lipopolisacáridos ................................................................................................ 47
4.6. Motilidad ............................................................................................................. 48
4.7. Hemaglutinina filamentosa y Sistema de Secreción Tipo V ............................... 48
4.8. Sistema de secreción tipo II ................................................................................. 49
4.9. Presencia de Péptido Natriurético ....................................................................... 51
4.10. Presencia del enzima fosfoglucosa isomerasa ................................................. 53
4.11. Resistencia a especies reactivas de oxígeno .................................................... 53
4.12. Proteína LOV ................................................................................................... 53
5. Motilidad y quimiotaxis .......................................................................................... 54
5.1. Motilidad dependiente del flagelo ....................................................................... 56
Motilidad tipo swimming ................................................................................. 64 5.1.1.
Motilidad tipo swarming .................................................................................. 64 5.1.2.
5.2. Motilidad tipo sliding .......................................................................................... 67
5.3. Movimiento tipo twitching .................................................................................. 68
5.4. Quimiotaxis ......................................................................................................... 70
Sistema de transducción de señales que dirige a una respuesta quimiotáctica 71 5.4.1.
Proteínas aceptoras de grupos metilo ............................................................... 74 5.4.2.
6. Formación de Biopelículas ...................................................................................... 77
6.1. Etapas en la formación de biopelículas ............................................................... 78
6.2. Factores que determinan la formación y dispersión de biopelículas ................... 81
Señales del medio en el que se encuentran las bacterias ................................. 81 6.2.1.
Mensajeros secundarios y cadenas de proteínas .............................................. 83 6.2.2.
6.3. Composición de la matriz de las biopelículas ..................................................... 86
Polisacáridos .................................................................................................... 87 6.3.1.
ADN extracelular ............................................................................................. 87 6.3.2.
Lípidos ............................................................................................................. 92 6.3.3.
Proteínas extracelulares ................................................................................... 93 6.3.4.
6.4. Biopelículas en Xanthomonas citri subsp. citri ................................................... 94
Etapas en la formación de biopelícula en Xcc ................................................. 94 6.4.1.
Factores implicados en la formación de biopelículas en Xcc .......................... 96 6.4.2.
Regulación en biopelículas formadas por Xcc ................................................. 98 6.4.3.
7. Fimbrias y pili ....................................................................................................... 100
Índice
xxi
7.1. Ensamblados mediante ruta de ujier-chaperona ................................................ 100
7.2. Pili tipo Curli ..................................................................................................... 102
7.3. Familia Pilus CS1 .............................................................................................. 103
7.4. Pili tipo IV ......................................................................................................... 104
Funciones del pili tipo IV .............................................................................. 107 7.4.1.
CAPÍTULO 2: OBJETIVOS ........................................................................................ 111
CAPÍTULO 3: MOTILIDAD Y QUIMIOTAXIS EN Xanthomonas citri subsp. citri
CON DISTINTA GAMA DE HUÉSPED .................................................................... 115
1. Abstract ................................................................................................................. 117
2. Introduction ........................................................................................................... 118
3. Results ................................................................................................................... 120
3.1. Carbon source utilization by Xanthomonas strains ........................................... 120
3.2. Chemotactic response of Xanthomonas strains to carbon compounds .............. 123
3.3. Chemotactic response of Xanthomonas strains to leaf fractions ....................... 126
CAPÍTULO 4: PROTEÍNAS ACEPTORAS DE GRUPOS METILO EN Xanthomonas
Y SU RELACIÓN CON LA GAMA DE HUÉSPED .................................................. 133
1. Abstract ................................................................................................................. 135
2. Background ........................................................................................................... 136
3. Experimental procedures ....................................................................................... 136
3.1. Bacterial strains, culture media and growth conditions ..................................... 136
3.2. Detection of methyl accepting chemotaxis proteins in silico ............................ 138
3.3. MCP detection by conventional PCR ................................................................ 138
4. Results ................................................................................................................... 139
4.1. Detection of Methyl accepting chemotaxis proteins in silico............................ 139
4.2. Presence of MCPs in non-sequenced Xanthomonas strains .............................. 142
5. Discussion ............................................................................................................. 145
CAPÍTULO 5: FORMACIÓN DE BIOPELÍCULAS EN Xanthomonas citri subsp. citri
CON DISTINTA GAMA DE HUÉSPED .................................................................... 147
1. Abstract ................................................................................................................. 149
2. Introduction ........................................................................................................... 150
3. Material and methods ............................................................................................ 151
3.1. Bacterial strains and growth conditions ............................................................ 151
3.2. Adhesion assays on an inert surface .................................................................. 152
3.3. Adhesion to plant surfaces ................................................................................. 153
Índice
xxii
3.4. Swimming motility ............................................................................................ 153
4. Results ................................................................................................................... 154
4.1. Adhesion and biofilm formation on an inert surface ......................................... 154
4.2. Adhesion and biofilm formation on plant surfaces ........................................... 155
4.3. Swimming motility ............................................................................................ 161
5. Discussion ............................................................................................................. 163
CAPÍTULO 6: PRESENCIA DE ADN EXTRACELULAR DURANTE LA
FORMACIÓN DE BIOPELÍCULAS EN Xanthomonas DE CÍTRICOS Y
CRUCÍFERAS ............................................................................................................. 167
1. Summary ............................................................................................................... 169
2. Background ........................................................................................................... 170
3. Methods ................................................................................................................. 172
3.1. Bacterial strains, culture media and growth conditions ..................................... 172
3.2. Determination of eDNA in biofilms .................................................................. 172
3.3. eDNA staining ................................................................................................... 173
4. Results ................................................................................................................... 174
4.1. Importance of eDNA in Xanthomonas biofilms ................................................ 174
4.2. Importance of eDNA in preformed biofilm ....................................................... 175
4.3. Detection of eDNA in Xanthomonas strains ..................................................... 176
5. Discussion ............................................................................................................. 180
CAPÍTULO 7: CARACTERIZACIÓN DE LA MATRIZ EXTRACELULAR
PRODUCIDA DURANTE LA FORMACIÓN DE BIOPELÍCULAS EN CEPAS DE
Xanthomonas citri subsp. citri CON DISTINTA GAMA DE HUÉSPED .................. 185
1. Abstract ................................................................................................................. 187
2. Introduction ........................................................................................................... 188
3. Materials and methods .......................................................................................... 189
3.1. Bacterial strains and growth conditions ............................................................ 189
3.2. Extracellular protein purification....................................................................... 190
3.3. Evaluation of extracellular structures in Biofilm vs. Planktonic stages ............ 191
3.4. Extracellular structures characterization by microscopic approaches ............... 191
3.5. Surface motility ................................................................................................. 192
3.6. RNA purification ............................................................................................... 193
3.7. Primers and probes design and qPCR conditions .............................................. 193
4. Results ................................................................................................................... 195
Índice
xxiii
4.1. Visualization of extracellular structures produced by Xanthomonas citri subsp.
citri ........................................................................................................................... 195
Plate growth ................................................................................................... 195 4.1.1.
Early stages of biofilm formation .................................................................. 196 4.1.2.
Surface motility .............................................................................................. 197 4.1.3.
4.2. Extracellular protein purification and characterization ..................................... 198
4.3. Microscopy of Xanthomonas citri subsp. citri; biofilm formation and planktonic
growth ........................................................................................................................ 199
4.4. Gene transcription during biofilm formation .................................................... 203
4.5. Surface motility in Xanthomonas strains ........................................................... 208
5. Discussion ............................................................................................................. 210
CAPÍTULO 8: CONCLUSIONES ............................................................................... 217
BIBLIOGRAFÍA .......................................................................................................... 223
Resumen
xxv
Resumen
La cancrosis o chancro bacteriano de los cítricos (CBC) causada por Xanthomonas citri
subsp. citri (Xcc) y X. fuscans subsp. aurantifolii, afecta a un gran número de especies
dentro de la familia de las rutáceas, especialmente cítricos. Esta enfermedad produce
graves pérdidas económicas allí donde está presente, principalmente porque la
comercialización de cítricos desde las zonas afectadas hacía zonas libres de cancrosis,
está sujeta a fuertes medidas cuarentenarias. La cancrosis se encuentra distribuida a
nivel mundial pero no se ha localizado ni en la Unión Europea ni en ningún área del
Mediterráneo.
Se han descrito tres tipos de cancrosis en función de la gama de huésped y de las
características fenotípicas y genotípicas de las bacterias que las producen. La más
extendida es la cancrosis tipo A producida por Xcc, dentro de la cual se distinguen los
subtipos Aw y A*, originarios de Florida y Sudeste Asiático, respectivamente, que de
forma natural solo son capaces de producir enfermedad en lima mejicana.
En este trabajo se presentan estudios sobre mecanismos implicados en las primeras
etapas de la infección, como la quimiotaxis y formación de biopelículas, en la cancrosis
de los cítricos.
La quimiotaxis es el proceso por el cual las bacterias se dirigen hacia zonas favorables
para su supervivencia y desarrollo. Los perfiles quimiotácticos obtenidos frente a
distintas fuentes de carbono, así como los estudios en relación al contenido de proteínas
aceptoras de grupos metilo (MCPs), permitieron agrupar a las cepas de Xanthomonas
estudiadas en este trabajo, de acuerdo a la enfermedad producida y a su gama de
huésped. Todas las cepas mostraron quimiotaxis positiva frente a extractos de hoja y
apoplasto de diferentes especies, sin embargo, Xcc 306, X. alfalfae subsp. citrumelonis
(Xac) y X. campestris pv. campestris (Xc) manifestaron respuestas más específicas
frente a extractos de apoplasto de hojas de naranjo dulce, lima y col china,
respectivamente. Dicho resultado nos permite asociar el mecanismo de quimiotaxis con
la capacidad de las cepas de Xanthomonas para colonizar estos huéspedes de forma
específica.
Resumen
xxvi
Las cepas estudiadas fueron capaces de realizar movimiento tipo swimming, twitching y
sliding en distintos medios, siendo el movimiento swimming el único en el que se
encontraron diferencias entre las cepas de Xcc con distinta gama de huésped.
En este trabajo se ha estudiado además la formación de biopelículas en superficies
bióticas y abióticas, un mecanismo importante tanto para la supervivencia en superficie
vegetal como para el desarrollo de la infección. Las cepas de Xanthomonas estudiadas
fueron capaces de formar biopelículas in vitro, siendo mayor en un medio que simula el
apoplasto y que contiene una baja concentración de nutrientes en comparación con
medios que contenían alta concentración de nutrientes. La formación de biopelículas en
superficie vegetal se encontró relacionada, en las cepas patógenas de cítricos, con la
capacidad para infectar un tejido o huésped determinado.
Se han caracterizado algunos de los componentes de la matriz extracelular producida
por Xcc, que compone hasta un 90% de las bipoelículas. Entre ellos destaca el ADN
extracelular, que tiene un papel como adhesina en las primeras etapas de formación de
biopelículas y estructural en biopelículas maduras. Además, se han identificado el pilus
tipo IV como componente importante en las biopelículas, que también participa en
motilidad.
Finalmente, se han realizado estudios sobre la expresión de genes implicados en
motilidad bacteriana y formación de biopelículas que han confirmado las diferencias
existentes entre cepas de Xcc de amplia y limitada gama de huésped, así como el papel
que juegan elementos como el pilus tipo IV o el flagelo en estos procesos.
Abstract
xxvii
Abstract
Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc) and X. fuscans subsp. aurantifolii are the causal
agents of Citrus Bacterial Canker (CBC) which is one of the most important citrus
diseases. CBC affects all Citrus species as well as other species from Rutaceae family.
CBC produces strong economic losses; furthermore the commercialization of plants and
fruits is restricted from infested to citrus canker free areas. The disease is worldwide
distributed in tropical and subtropical areas, however it is not present in the European
Union.
Three types of CBC have been described according to the host range and phenotypic
and genotypic characteristics. CBC type A caused by Xcc is he widest distributed.
Within CBC A type two subtypes Aw and A* were described from Florida and Iran
respectively, both infecting only Mexican lime.
Herein mechanisms connected to early events in the citrus bacterial canker disease such
as chemotaxis and biofilm formation, were studied.
Chemotaxis allows bacteria to move towards the more suitable environments for its
survival, host colonization and infection. Studies performed on citrus pathogenic
Xanthomonas and X. campestris pv. campestris (Xc), a crucifer pathogen, have shown
different chemotactic profiles towards carbon compound as well as different MCPs
profile, which clustered strains according to host range and disease caused. Every strain
showed positive chemotaxis toward leaf extracts and apoplastic fluids from sweet
orange, Mexican lime and Chinese cabbage leaves. However, a more specific response
was found for strains Xcc 306, X. alfalfae subsp. citrumelonis and Xc towards sweet
orange, Mexican lime and Chinese cabbage apoplastic fluids, respectively. These results
relate chemotaxis with the higher ability of those strains to specifically colonize their
proper host.
Xanthomonas strains studied were able to perform swimming, sliding and twitching
motilities. The ability to swim was variable among CBC strains and seemed related to
host range.
Biofilm formation is an important virulence factor for Xcc because it allows a better
survival onto the plant surface as well as facilitates the infection process. The studied
Xanthomonas strains were able to form biofilm in vitro, on both nutrient rich and
Abstract
xxviii
apoplast mimicking media, furthermore the biofilm formation by all the strains was
higher in the apoplast mimicking media. The ability to form biofilm in planta by Xcc
and Xac strains was dependent of the host and the tissue colonized. The wide host range
CBC strain was able to form biofilm onto several citrus leaves and fruits, however the
limited host range CBC strain produced biofilm solely onto Mexican lime leaves and
fruits. Furthermore Xac strain, which solely infects leaves of young plants, was not able
to develop biofilms on fruits.
Some components of the extracellular matrix produced by Xcc strains have been
characterized. Extracellular DNA acted as an adhesin at the very early stages of biofilm
formation and as structural component of mature biofilm for citrus pathogenic
Xanthomonas. Furthermore type IV pilus has been identified as a component of the
extracellular matrix in biofilm and motility.
Transcriptional studies of genes related with biofilm formation and motility have
confirmed the differential behavior found among wide and limited host range CBC
strains as well as the role of type IV pili and flagellum on those processes.
1
CAPÍTULO 1: INTRODUCCIÓN
Introducción
3
1. El género Xanthomonas
El nombre de Xanthomonas viene del griego “xanthos” que significa amarillo y
“monas” que significa entidad. Es uno de los géneros más importantes dentro de las
bacterias Gram negativas y sus componentes siempre se encuentran asociados a plantas,
ya sea como patógenos o como endófitos. Además es el género de bacterias
fitopatógenas que mayor gama de plantas huésped posee, al menos 68 familias y más de
240 géneros (124 especies monocotiledóneas y 268 dicotiledóneas) (Figura 1). Es un
género de bacterias muy interesante en los estudios de interacción de la bacteria con el
huésped por presentar una alta especificidad, cada género, especie o cepa está
practicamente restringida a un grupo específico de plantas huésped, pudiendo incluso
ser específicas de un tejido determinado (Brunings y Gabriel, 2003; Ryan et al., 2011).
En general son patógenos hemibiótrofos, en un principio se nutren del tejido vivo pero
según la enfermedad va avanzando producen muerte celular en planta (Büttner y Bonas,
2010). No se ha descrito, hasta el momento, la capacidad para colonizar el suelo o el
agua en ninguna de las especies existentes (Mhedbi-Hajri et al., 2013).
Figura 1. Bacterias fitopatógenas modelo del género Xanthomonas, partes de la planta que afectan y
plantas huésped. Xcc: Xanthomonas campestris pv. campestris; Xoo: X. oryzae pv. oryzae; Xac: X. citri
subsp. citri; Xcv: X. campestris pv. vesicatoria; Xoc: X. oryzae pv. oryzicola. Modificación de Büttner y
Bonnas 2010.
Introducción
4
La especialización de los patógenos vegetales parece que comenzó a tener lugar con la
domesticación de las plantas y fue evolucionando de forma conjunta al desarrollo de la
agricultura. En el caso de X. axonopodis, dentro de la que se incluía, hasta hace poco a
Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc), anteriormente X, axonopodis pv. citri y otras
especies patógenas de cítricos, pudo tener lugar en dos pasos. Se postula la aparicion de
un patógeno generalista hace aproximadamente 25.000 años, produciéndose la
especialización de estas Xanthomonas hace aproximadamente 10.000 años. Dicha
especialización tuvo lugar hacia el nicho ecológico de cada planta huésped, en su
mayoría fueron plantas monocotiledóneas. Con la llegada de la agricultura intensiva
comenzó la divergencia en patovares, debido a la especialización de las bacterias a los
cultivos intensivos, altamente homogéneos genéticamente, dando lugar a la aparición de
cepas muy eficientes en colonización y muy agresivas, pero cuya supervivencia estaba
restringida a un huésped. La globalización y el comercio de plantas, frutos y semillas
permitieron que varios de estos grupos entraran en contacto, lo que favoreció el
intercambio de material genético y la aparición de nuevos patotipos. Un ejemplo muy
claro es el de las Xanthomonas patógenas de cítricos, X. alfalfae subsp. citrumelonis se
separó de las causantes de chancros aproximadamente hace 23.000 años y las dos
especies causantes de chancros (Xcc y X. fuscans subsp. aurantifolii) hace unos 8.000
años, sin embargo todas son patógenas de cítricos e incluso producen lesiones similares
(Figura 2) (Mhedbi-Hajri et al., 2013).
La especificidad de huésped dentro de este género, parece ser debida a leves variaciones
en algunos genes relacionados con patogénesis, pudiendo ser estas variaciones en genes
codificantes para proteínas de secreción o dianas de regulación (Lu et al., 2008).
Además existen otros mecanismos implicados en las etapas tempranas de la infección
como son la quimiotaxis, sensores de variaciones ambientales y adhesión a superficies
cuya evolución ha podido producir procesos de adaptación al huésped en las distintas
Xanthomonas (Mhedbi-Hajri et al., 2011a).
Introducción
5
Figura 2. Estructura genética de X. axonopodis. Modificado de Mhebdi-Hajri y col. 2013.
El genoma de las especies pertenecientes al género Xanthomonas, de forma general, está
compuesto por un único cromosoma circular de 4,8 a 5,3 Mpb, con un contenido en GC
(Guanina-Citosina) de más del 60% y presencia de plásmidos, que pueden comprender
desde un plásmido para X. arboricola pv. pruni (Garita-Cambronero et al., 2014) a
cuatro para X. axonopodis pv. vesicatoria. El porcentaje del genoma cubierto por
marcos de lectura abierto varía entre el 83,9% en X. oryzae pv. oryzae al 90,3% en Xcc
(Ryan et al., 2011).
En los genomas secuenciados de Xanthomonas se han identificado aproximadamente el
mismo número de genes (entre 4.600 y 5.800) que en las alfaproteobacterias,
betaproteobacterias y gammaproteobacterias así como dos operones para ARN
ribosomal. Poseen además, elementos posiblemente procedentes de los Reinos Archaea,
Eukarya y Virus. Se han descrito variaciones adicionales en en los plásmidos de algunas
cepas que varían entre 2 y 138 kb y que contienen genes que codifican para efectores
del Sistema de Secreción tipo III (SST3) y el Sistema de Secreción tipo IV (SST4) entre
otros (Comas et al., 2006; Lima et al., 2008; Lu et al., 2008; Ryan et al., 2011).
Existen dos clúster relacionados con patogénesis comunes en el genoma de todas las
Xanthomonas secuenciadas, el clúster xps, que codifica para el Sistema de Secreción
Introducción
6
tipo II (SST2) y el clúster rpf (regulation of pathogenicity factors), de regulación de
factores de patogenicidad (Ryan et al., 2011). El SST2 está encargado del transporte de
enzimas degradadoras de la pared celular, está presente en todas las Xanthomonas, en
Xylella fastidiosa y el género Stenotrophomonas. Además Xanthomonas campestris pv.
campestris, Xanthomonas citri subsp. citri y Xanthomonas euvesicatoria poseen un
segundo SST2 cuya función no parece estar relacionada con virulencia. El sustrato de
este sistema de secreción es variable en función de la especie, por lo que es posible que
también influya en los procesos que determinan la especificidad de huésped. Otros dos
elementos relacionados con virulencia comunes a todas las Xanthomonas, menos a X.
albineans, son el SST3 que tiene como función inyectar efectores de virulencia en las
células del huésped y los genes gum, encargados de la producción del exopolisacárido
característico de este género, la denominada goma xanthana.
Se han identificado en el género Xanthomonas hasta 53 efectores de virulencia. Algunos
de estos efectores poseen un papel determinante en virulencia o avirulencia y pueden ser
responsables de restringir la gama de huésped a unas especies vegetales o incluso a
variedades dentro de una misma especie vegetal. Todas las Xanthomonas estudiadas, a
excepción de X. campestris pv. armoraciae con solo seis efectores y X. albineans sin
efectores descritos, poseen nueve efectores comunes (xopR, xopK, xopL, xopN, xopP,
xopQ, xopX, xopZ y avrBs2). Además se han descrito cuatro efectores conservados tanto
en X. axonopodis, como en aquellas especies denominadas como tal en el pasado:
xopF1, xofE2, avrXacE3 y pthA. Otros efectores de virulencia descritos se han
relacionado con una única especie bacteriana en un huésped determinado, como es el
caso de varios genes xop presentes en X. campestris causantes de enfermedad en
crucíferas o los genes xopA1 y xopE3, localizados en islas de patogenicidad (o
genómicas) en X. citri subsp citri o X. fuscans subsp. aurantifolii ambos patógenos de
cítricos y X. arboricola pv. pruni patógena de frutales de hueso (Garita-Cambronero et
al., 2014; Moreira et al., 2010b; Ryan et al., 2011).
Otros elementos relacionados con patogénesis y asociados a la especificidad de huésped
o tejido son los distintos tipos de adhesinas, tanto fimbriales como no fimbriales (Ryan
et al., 2011), los sensores ambientales tales como las proteínas aceptoras de grupos
metilo (MCPs: Methyl Accepting Chemotaxis Proteins), los sensores de los sistemas de
regulación de dos componentes (STCR: Sensors of Two-Component Regulatory System)
y los transportadores dependientes de TonB (TBDT: TonB-Dependent Transporters). Se
Introducción
7
ha descrito que la mayoría de los patovares pertenecientes al género Xanthomonas
poseen patrones distintos de las proteínas anteriores, siendo X. citri subsp. citri el que
posee el mayor número de patrones distintos. Además se ha demostrado que muchos de
esos genes se encuentran bajo selección positiva en la planta huésped (Mhedbi-Hajri et
al., 2011a; Mhedbi-Hajri et al., 2011b; Ryan et al., 2011).
2. Cancrosis o Chancro de los Cítricos
La cancrosis o chancro de los cítricos está causada por las especies Xanthomonas citri
subsp. citri (Xcc) y X. fuscans subsp. aurantifolii (Xfa), es una enfermedad distribuida
en zonas tropicales y subtropicales productoras de cítricos (Figura 3, pág. 8). En la
actualidad se encuentra distribuida en más de 30 países pertenecientes a Asia, África,
América y Oceanía.
La primera detección de la enfermedad tuvo lugar en el siglo XIX, en la India,
considerándose esta zona como el centro de origen de la enfermedad (Bitancourt, 1957;
Civerolo, 1984; Civerolo, 1985; Mohammadi et al., 2001). Hoy en día el chancro de los
cítricos es una de las enfermedades de cítricos que ha causado mayores pérdidas
económicas en la producción de cítricos a nivel mundial (Stall y Civerolo, 1991).
Las Xanthomonas causantes de chancros en cítricos son catalogadas como patógenos de
cuarentena en las zonas productoras de cítricos donde no está presente. En la Unión
Europea (UE) están consideradas como organismos de cuarentena y se encuentran
reguladas por la Directiva de la comunidad europea 2000/29/EC (Diario Oficial de las
Comunidades Europeas, 2000). Además se encuentra en la lista de patógenos de
cuarentena de la Organización Europea y Mediterránea para la Protección Vegetal
(EPPO, 2005), en la Organización de Protección Vegetal Norteamericana (North
American Plant Protection Organization, NAPPO), la Comisión Fitosanitaria Inter-
Africana (Inter-African Phytosanitary Commission, IAPSC), y el Board of the
Cartegena Agreement (JUNAC).
2.1. Tipos de cancrosis o chancros descritos
Existen distintos tipos de chancros de los cítricos en función de las cepas bacterianas
que los producen. Todas ellas, dan lugar a síntomas muy similares, aunque muestran
diferente gama de huésped (Stall y Civerolo, 1991) (Figura 4). Además, las cepas
Introducción
8
responsables se han podido separar y caracterizar en función de la sensibilidad a fagos,
características serológicas, patrones de RFLPs (Restriction fragment length
polymorphism) y también es posible separarlas mediante PCR (Polymerase chain
reaction) y la utilización de distintos cebadores, entre otros (Gottwald et al., 2002a).
Figura 3. Distribución a nivel mundial de Xanthomonas citri subsp. citri (EPPO, 2005).
Figura 4. Tipos de chancros descritos y su virulencia en plantas huéspedes con distinta
susceptibilidad a la enfermedad (Brunings y Gabriel, 2003).
Introducción
9
Chancro o cancrosis tipo A (Asiatic Citrus Canker) 2.1.1.
El chancro tipo A está causado por Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc) (anteriormente
como Xanthomonas axonopodis pv. citri) (Schaad et al., 2005) es originario del
continente asiático.y es el que tiene mayor importancia económica por encontrarse
distribuido a nivel mundial, e incluso haber desplazado a los tipos B y C allí donde
estaban presentes (Stall y Civerolo, 1991). El chancro tipo A es el más agresivo y es
capaz de producir enfermedad en la mayoría de las especies de cítricos, además de en
otros géneros pertenecientes a las Rutaceae, como por ejemplo el naranjo espinoso o
trifoliado (Poncirus trifoliata). Los cítricos más susceptibles son pomelo (Citrus
paradisi), naranjo dulce (Citrus sinensis), lima mejicana (Citrus aurantifolia) y algunos
híbridos utilizados como píes en los injertos. Entre los menos susceptibles se encuentran
el mandarino (Citrus x tangerina) y el kumquat (Fortunella margarita) (Graham et al.,
2004). Está descrito que la resistencia en kumquat se debe a la activación de genes
relacionados con la muerte celular programada y la respuesta hipersensible: degradación
de proteínas, producción de especies reactivas de oxígeno y regulación de la fotosíntesis
(Abeer A Khalaf et al., 2011). Estudios comparativos de los transcriptomas del kumquat
(tolerante al chancro) y del naranjo dulce (susceptible) han mostrado que, durante la
infección, ambas especies activan genes relacionados con defensa, entre ellos quitinasas
y glucanasas En el kumquat se activan un mayor número de genes de este tipo, mientras
que en el naranjo dulce se reprimen, muchos de ellos relacionados con fotosíntesis (Fu
et al., 2012).
Dentro del chancro tipo A están descritos varios subgrupos de CBC. El primero de ellos
se ha denominado tipo A* (Vernière et al., 1998), inicialmente identificado en Oman,
Arabia Saudí, Irán e India. Tiene un impacto importante en los cultivos de lima
mejicana en Asia y África (Derso et al., 2009; Ngoc et al., 2007). Las cepas de Xcc tipo
A* poseen una limitada gama de huésped, pudiendo únicamente producir lesiones
típicas de la enfermedad en lima mejicana aunque son capaces de dar lugar a manchas
acuosas en otros cítricos y de aumentar su población en hojas de pomelo al mismo nivel
que Xcc tipo A (Escalon et al., 2013; Rybak et al., 2009; Vernière et al., 1998). Las
cepas tipo A* poseen características similares a las de los chancros tipo B y C respecto a
la gama de huésped sin embargo las pruebas de hibridación de ADN, amplificación por
PCR con cebadores específicos , perfil de RFLPs y otras pruebas fenotípicas las
clasifican claramente dentro del grupo de las Xcc A. Comparten además con Xcc A el
Introducción
10
patrón de asimilación descrito para el tipo A en las placas de Biolog® GN para L-
fucosa, D-galactosa y alaninamida (Vernière et al., 1993), aunque no reacciona con el
anticuerpo altamente específico MAb A1 ni con el antisuero policlonal para la cepa
modelo Xcc 62 (tipo A) (Vernière et al., 1998).
La cepa Xcc Aw fue descrita en el Sur de Florida (EEUU) en el año 2000 en lima
mejicana y Citrus macrophylla (Sun et al., 2004), aunque parece ser originaria de la
India (Bui Thi Ngoc et al., 2009; Schubert et al., 2001). Al igual que las cepas tipo A*,
posee una limitada gama de huésped pero es capaz de producir respuesta hipersensible
en pomelo Duncan cuando es inoculado por infiltración. Presenta un perfil similar en las
placas de Biolog® GN que las cepas tipo Xcc A y A*, además de las mismas
características génicas, sin embargo al igual que Xcc A* no reacciona con el anticuerpo
MAb A1 lo que permite distinguirlas de las cepas de amplia gama de huésped (Cubero y
Graham, 2002; Sun et al., 2004).
Se han descrito otros tipos de cepas de CBC en Taiwán que también pertenecen al
chancro tipo A, pero que son consideradas subgrupos distintos (Af, A
r y A
p). El
subgrupo Af es capaz de producir infección en lima mejicana, siendo solo capaz de
producir lesiones necróticas en otros hospedadores, al igual que sucede con los
subgrupos Aw y A*. El subgrupo A
r parece tener amplia gama de huésped produciendo
lesiones típicas de chancro que carecen del halo acuoso alrededor de la lesión,
posiblemente debido a una mutación en el gen que codifica para la pectina Pel1 (Lin et
al., 2010). El subtipo del chancro tipo A descrito como Ap, únicamente es capaz de
producir lesiones necróticas planas con halo clorótico y mancha acuosa en todos los
huéspedes. Estas cepas originarias de Taiwán comparten con Xcc las características
bioquímicas y fisiológicas descritas para esta subespecie, diferenciándose de las cepas
de limitada gama de huésped en los análisis ERIC-PCR, amplificación por PCR
convencional con primers específicos para Xanthomonas asociadas a cítricos,
secuencias del gen lrp, y actividad pectolítica que diferencia el grupo Ar del resto de las
Xcc descritas (Lin et al., 2005; Lin et al., 2008).
El Chancro tipo B 2.1.2.
El chancro tipo B está causado por Xanthomonas fuscans subsp. aurantifolii
(anteriormente Xanthomonas axonopodis pv. aurantifolii) y fue descrito en Argentina en
1923 (Civerolo, 1984). Las cepas de este tipo de chancro producen enfermedad en
Introducción
11
limonero, lima mejicana, naranjo amargo y pomelo. El chancro tipo B se distingue del
chancro tipo A a pesar de ser igual de virulento en un huésped altamente sensible como
el limonero (Gottwald y Timmer, 1995). Las cepas del tipo B se distinguen de las del
chancro tipo A en la utilización de lactosa y maltosa, la susceptibilidad al fago CP3 y en
algunas características serológicas y moleculares (Gottwald et al., 2001; Graham et al.,
2004; Stall y Civerolo, 1991).
El Chancro tipo C 2.1.3.
Al igual que el chancro tipo B, está causado por Xanthomonas fuscans subsp.
aurantifolii, fue descrito en lima mejicana en el año 1963 en el Estado de San Paulo en
Brasil. Las cepas de este chancro producen enfermedad tanto en lima mejicana como en
naranjo amargo. Estas cepas se distinguen de las de los chancros anteriores por su
resistencia a los fagos CP1 y CP2 y por otras características serológicas y moleculares
(Gottwald et al., 2001; Graham et al., 2004; Stall y Civerolo, 1991).
Chancros tipo D y E 2.1.4.
Otras enfermedades causadas por bacterias y hongos fueron descritas como chancros de
los cítricos, pero posteriormente se determinó que eran enfermedades distintas, es el
caso de los chancros tipo D y E. El primero se describió en Méjico en 1981, la
enfermedad cumplía con las características típicas de los chancros tipo A, pero producía
un reducido número de lesiones en hojas y tallo de cítricos. Fue denominado bacteriosis
de los cítricos. Posteriormente, se determinó que dicha enfermedad era producida por
Alternaria limicola y la enfermedad se denominó mancha de los cítricos (Graham et al.,
2004; Stall y Civerolo, 1991). El segundo de ellos denominado actualmente mancha
bacteriana de los cítricos (en adelante CBS, del inglés “Citrus Bacterial Spot”), está
causado por X. alfalfae subsp. citrumelonis y es un problema menor en plantas de
vivero. Esta enfermedad se caracteriza por la aparición de lesiones planas de color pardo
con mancha acuosa alrededor en hojas y tallos en diversas variedades de cítricos
(Graham et al., 2004; Stall y Civerolo, 1991). La aparición de CBS en Florida y la
confusión inicial en la identificación y caracterización de las cepas bacterianas
causantes, dio lugar a un programa de erradicación que supuso un altísimo coste para el
estado y los productores. Aún hoy en día es frecuente el error cuando el diagnóstico de
la enfermedad se basa únicamente en la observación de síntomas (Graham et al., 2004).
Introducción
12
2.2. Descripción de la enfermedad
Toda la parte aérea de la planta es susceptible a la infección por el chancro de los
cítricos, aunque cuando las hojas y frutos se encuentran completamente desarrollados
son menos susceptibles a la enfermedad (Graham et al., 2004).
En el medio natural la infección óptima tiene lugar con un inóculo de 104-10
5 cfu/ml
cuando se inoculan estomas y entre 102 y 10
3 si se inocula por herida, a pesar de esto,
los síntomas pueden producirse por la presencia de un número muy limitado de
bacterias (Gottwald y Graham, 1992).
Síntomas 2.2.1.
En hojas las infecciones se producen por la entrada del patógeno a través de estomas o
heridas (Graham et al., 1992a; Graham et al., 1992b; Koizumi y Kuhara, 1980; Pruvost
et al., 2002). Los primeros síntomas comienzan a aparecer aproximadamente a los
nueve días de la inoculación como pequeños abultamientos en la superficie foliar.
Según va avanzando la enfermedad, las lesiones adquieren un tono marrón rodeado de
un halo clorótico y aparecen manchas acuosas que desaparecen con el tiempo. El centro
de la lesión se eleva sobre la superficie de la hoja adquiriendo una textura esponjosa y
acorchada que normalmente adopta forma de cráter (Figura 5 A, B, D, E y F, pág. 13).
Cuando la enfermedad se hace más acusada puede producir caída tanto de hojas como
de frutos provocando una disminución en la producción (Schubert et al., 2001).
En frutos los síntomas son similares a los de las hojas; lesiones elevadas de textura
acorchada rodeadas de halos acuosos (Figura 5 C, pág. 13). Son variables en tamaño y
únicamente tiene lugar en la parte más externa de la piel (Civerolo, 1984). Cuando el
fruto tiene un tamaño comprendido entre 20 y 40 mm las lesiones aumentan durante un
periodo de 106 días aproximadamente (Graham et al., 1992b).
Introducción
13
Figura 5. Síntomas producidos por Xanthomonas citri subsp. citri en hojas de lima mejicana (A, E y F) (E
y F: microscopía electrónica de barrido de las lesiones) y en campo de hojas y frutos de pomelo (B, C y
D). En la imagen C se puede ver el exudado proveniente de las lesiones. Fotos realizadas por Marta Sena
Vélez.
Las lesiones en los brotes y ramas son similares a las observadas en hojas y frutos, pero
no producen halo clorótico. Además, perpetúan el inóculo prolongando la vida del
patógeno que puede ser el origen para las nuevas infecciones (Graham et al., 2004).
Figura 6. Lesiones de Xcc producidas en ramas (Gottwald et al., 2002a).
Introducción
14
La aparición de síntomas y la severidad de los mismos pueden depender de varios
factores, como la edad del tejido, la temperatura y la humedad.
La edad o estado de desarrollo del tejido es uno de los factores que más afecta a la
formación de manchas acuosas, penetración de la bacteria y desarrollo de los síntomas
(Graham et al., 1992b). Además, es un factor importarte en inoculaciones de la bacteria
mediante pulverización en hojas y frutos, siendo este método el que mejor simula el
proceso natural de infección. La sensibilidad de las hojas jóvenes se debe a su mayor
capacidad para acumular agua en su superficie y a la menor abundancia de ceras que
puedan dificultar la entrada del patógeno (Figura 7). Sin embargo, el tamaño y número
de estomas en la superficie foliar no varía con la edad de la hoja por lo que la diferencia
en la susceptibilidad de las hojas jóvenes no está relacionada con este hecho (Gottwald
y Graham, 1992; Graham et al., 1992a).
Figura 7. Microscopía electrónica de transmisión (TEM) de la cara abaxial de hojas de pomelo (Citrus
paradisi) en distintos estados de desarrollo de la hoja (A) 50% de la expansión, la cutícula todavía no se
ha formado sobre la pared celular. (B) 75% de la expansión, la cutícula es un 15% del grosor final. (C)
hoja desarrollada y cutícula completamente formada. Graham et al. 2004
Introducción
15
El periodo de mayor susceptibilidad de la hoja tiene lugar cuando éstas se encuentran
entre un 50 y un 75 % del desarrollo total (Gottwald y Graham, 1992).
El periodo de mayor susceptibilidad de los frutos comprende desde la caída de los
pétalos de la flor hasta el completo desarrollo, siendo especialmente sensibles cuando
tiene lugar la formación de los estomas (Graham et al., 1992b). Los frutos muy jóvenes,
con menos de 20 mm de diámetro, presentan una susceptibilidad menor debido a que los
estomas no se han formado todavía. Si la infección tiene lugar cuando éstos se
encuentran en una etapa temprana del desarrollo se produce mayor sintomatología y se
llegan a producir roturas y malformaciones del fruto (Vernière et al., 2003). Cuando se
inoculan frutos de forma artificial, bien produciendo heridas o por pulverización,
aquellos que tienen un menor tamaño (entre 15 y 20 mm) muestran una mayor
sensibilidad a la enfermedad. Esta sensibilidad disminuye durante la maduración del
fruto como consecuencia de la secreción de ceras y el desarrollo estomático que hacen
que el fruto retenga menos cantidad de agua en superficie (Gottwald y Graham, 1992;
Graham et al., 1992b; Vernière et al., 2003). A pesar de que los frutos maduros son muy
poco susceptibles a la infección pueden contener bacterias en su superficie y
especialmente en heridas que suponen reservorios y fuente de inóculo de nuevas
infecciones (Gottwald et al., 2009).
Los brotes y los tallos también son susceptibles de ser infectados, generalmente
mediante heridas naturales o producidas durante el manejo del cultivo y, sobre todo, se
producen en tejidos poco lignificados. Son importantes porque, pueden servir de
reservorio de inóculo por periodos más prolongados de tiempo que las hojas o los frutos
(Vernière et al., 2003).
La temperatura óptima para el desarrollo de síntomas se encuentra entre 20ºC y 30ºC
con un máximo de 35ºC (Christiano et al., 2009; Dalla Pria et al., 2006; Graham et al.,
2004). Pocas veces se observan lesiones a temperatura mayores de 42ºC o menores de
10ºC. Además, el número, tamaño y densidad de las lesiones aumenta con la
temperatura desde los 15 a los 35ºC (Figura 8). Para que se produzcan síntomas las
plantas requieren un mínimo de humedad, que tiene un especial efecto en el número,
tamaño y densidad de las lesiones, especialmente a temperaturas mayores de 30ºC
(Dalla Pria et al., 2006; Christiano et al., 2009).
Introducción
16
Figura 8. Efecto combinado de la temperatura y la humedad en el desarrollo
del chancro de los cítricos en lima de Tahití en plantas de 25 cm de altura en
cámaras de cultivo (Christiano et al., 2009). En la gráfica A se ve el efecto de
estos factores en el área debajo de la curva, B la densidad de lesiones, C el
tamaño de la lesión y D la severidad.
La enfermedad se ve favorecida por climas en los que la temperatura y la lluvia
ascienden y desciende al mismo tiempo, haciéndose por lo tanto más severo en áreas
cálidas y húmedas como son las zonas tropicales o subtropicales (Das, 2003). En zonas
como Argentina o Japón donde existen inviernos fríos, la población bacteriana
disminuye a causa de las bajas temperaturas que tienen lugar en esa época del año
(Koizumi, 1977; Stall et al., 1980). Sin embargo en zonas tropicales como la Isla
Reunión la población permanece constante durante todo el año (Pruvost et al., 2002).
Ciclo de la enfermedad y epidemiología 2.2.2.
Como se ha mencionado anteriormente Xcc es capaz de multiplicarse en todas las partes
aéreas de la planta, tanto hojas y frutos, como ramas y brotes. Desde la cavidad
subestomática y en presencia de agua en superficie las bacterias son capaces de salir al
exterior a través de los estomas pudiendo propagarse y producir nuevas infecciones
Introducción
17
(Figura 9A). El número de bacterias que se libera al exterior es solo una parte de la
población bacteriana, que se ha calculado aproximadamente en unas 100 unidades
formadoras de colonia (ufc, en adelante) por mililitro (mL) en lesiones jóvenes de entre
4 y 6 meses. Si las lesiones son más antiguas, la liberación de bacterias es menor y va
disminuyendo con el tiempo (Timmer et al., 1991). El agua de lluvia recogida de hojas
con lesiones puede contener alrededor de 100 ufc mL-1
.
El mejor agente de dispersión de Xcc es el viento, aunque ésta también tiene lugar por la
arena transportada en él o la maquinaria y enmiendas agrícolas. La dispersión se ve
favorecida por daños mecánicos y actividades humanas como el movimiento de
variedades de una zona geográfica a otra (Gottwald et al., 2002a; Irey et al., 2006).
Figura 9. A: bacterias saliendo de un estoma a las 48 horas de la inoculación; B: heridas producidas por el
movimiento del viento y las espinas de la planta infectadas con Xcc; C: Phyllocnistis citrella Stainton,
minador de los cítricos en estadio adulto y larva en la hoja; D: dispersión del patógeno en hoja causada
por el minador de los cítricos. Gottwald et al. 2002.
Introducción
18
No se ha podido probar la diseminación de Xcc a través de insectos, sin embargo el
minador de los cítricos Phyllocnistis citrella (Stainton) favorece el desarrollo de la
enfermedad, tanto en hojas como tallos jóvenes (Figura 9-C y D) y en algunos casos
frutos de pequeño tamaño (Graham et al., 2004). El daño causado por este insecto es
debido a la formación de galerías producidas por la alimentación y el movimiento del
insecto que favorece la proliferación de Xcc en el espacio subcuticular parenquimático.
La formación de galerías y la degradación del tejido vegetal producen un aumento en el
número de lesiones y la infección causada por el chancro de los cítricos (Heppner,
1993). Las galerías hacen que el tejido sea más susceptible durante un periodo
comprendido entre 7 y 14 días, mientras que las causadas por espinas o poda solo lo son
durante 24 horas (Das, 2003). Cuando se inoculan plantas con el segundo y tercer
estadío larvario o con la pupa del minador, los daños causados por el chancro son entre
el 95 y 100% de hojas infectadas porcentaje similar al producido por heridas mecánicas
(Chagas et al., 2001).
Cuando la superficie foliar de los cítricos infectados con Xcc se recubre de agua, las
bacterias se liberan al exterior de la planta, sirviendo de inóculo para nuevas
infecciones. La cantidad de agua mínima necesaria para que se liberen las bacterias es
de 8 mm h-1
. El número de bacterias que se libera de los estomas disminuye con la
duración de la lluvia como consecuencia de una disminución en el inóculo disponible
(Timmer et al., 1991) y está relacionado con la población en el interior de la hoja
(Pruvost et al., 2002). El número de lesiones disminuye en ausenciade lluvia puesto que
las hojas viejas se caen y los nuevos tejidos no son infectados (Gottwald y Timmer,
1995).
El viento se ha descrito como la forma de dispersión más importante, tanto el seco como
aquel que contiene gotas de agua en las que la bacteria está presente (Gottwald y Irey,
2007; Irey et al., 2006). El viento fuerte hace que las hojas y lesiones sean fuentes de
inóculo más eficientes (Bock et al., 2010a; Bock et al., 2010b) y de hecho el uso de
barreras de viento para proteger los huertos se ha revelado como un método eficaz para
el control de la enfermedad (Gottwald y Timmer, 1995).
Se ha demostrado que en condiciones de calma o viento suave, las hojas y gotas de agua
que contienen el inóculo se depositan en zonas cercanas o directamente en el suelo. Con
el aumento de la velocidad del viento, alrededor de 8 m sg-1
, se produce un aumento de
la cantidad de inóculo que puede ser desplazado a distancias mayores, lo que produce
Introducción
19
nuevos focos de infección en el campo. Además, las condiciones de viento turbulento
favorecen la dispersión del patógeno dentro de la misma planta, así como la entrada del
mismo al interior celular lo que produce un aumento en la severidad de la enfermedad
(Bock et al., 2010a; Bock et al., 2012; Pruvost et al., 2002).
Figura 10. Ciclo del chancro de los cítricos (Sena-Vélez et al., 2015a).
Una vez se encuentran en la superficie vegetal, las bacterias causantes de chancros en
cítricos entran por estomas o heridas al apoplasto donde son capaces de crecer y
multiplicarse. La bacteria es capaz de sobrevivir siempre que esté relacionada con la
planta huésped, ya sea en los márgenes de las lesiones de hojas y frutos en el árbol o en
el suelo hasta que se descomponen, además pueden sobrevivir en las ramas infectadas
durante varios años (Gottwald et al., 2002a).
Establecida la infección la población bacteriana disminuye significativamente con el
tiempo. Las lesiones de 1 a 6 meses tienen una población mayor que las lesiones de 8 a
18 meses. Alrededor de los 8 y 10 meses la población disminuye una unidad logarítmica
y a los 18 meses 1,5 unidades logarítmicas. En la superficie foliar el número de
bacterias detectadas está comprendido entre 102 y 10
3 cfu por gramo de hoja (Pruvost et
al., 2002).
Introducción
20
2.3. Diagnóstico y detección
En general no existen tratamientos químicos efectivos para el control de bacterias
fitopatógenas, por lo que la mejor medida de control para las bacteriosis es la
prevención (López et al., 2009). Esta medida es especialmente importante en el caso de
enfermedades de cuarentena como el chancro o cancrosis de los cítricos en la Unión
Europea (Diario Oficial de las Comunidades Europeas, 2000). La utilización de técnicas
precisas y eficientes de detección e identificación es fundamental para prevenir la
propagación de un patógeno y especialmente para el control del material vegetal. Los
síntomas causados por Xcc pueden confundirse con los producidos por otras
enfermedades como la sarna de los cítricos causada por Elsinoe fawcettii en naranjo
dulce y limonero, la antracnosis causada Glomerella cingulata o la melanosis causada
por Diaporthe citri, con lo cual la observación visual no es suficiente para el
diagnóstico correcto de la enfermedad (EPPO, 2005). Además, es conocida la existencia
de cepas de Xanthomonas saprófitas en cítricos que no son Xcc, por lo que una correcta
identificación de las cepas es imprescindible para evitar errores que puedan llevar
pérdidas innecesarias como las producidas en Florida en el caso de la mancha bacteriana
de los cítricos (EFSA Panel on Plant Health, 2014; Graham et al., 2004).
Para el diagnóstico y detección de Xcc existen un gran número de metodologías que han
ido mejorando a medida que han avanzado las técnicas de biología molecular y su
aplicación a la patología vegetal. Oficialmente a nivel europeo no existe ningún
protocolo para la detección del patógeno, sin embargo la EPPO (European and
Mediterranean Plant Protection Organization) desarrolló un protocolo (PM 7/44(1)) en
el año 2005 que se usa en varios laboratorios de la Unión Europea (EPPO, 2005). En
agosto de 2014, se publicó un protocolo por parte de la IPPC-FAO (International Plant
Protection Convention) que ha sido coordinado por investigadores de Brasil, Uruguay y
España, donde se describen protocolos para la detección de este patógeno en plantas
tanto sintomáticas como asintomáticas (Figura 11) (IPPC-FAO, 2014). En ambos
protocolos se describen técnicas similares.
Introducción
21
Figura 11. Protocolo IPPC para la detección de Xcc en plantas (IPPC-FAO, 2014).
Introducción
22
El primer paso en el diagnóstico de la cancrosis de los cítricos es la observación de los
síntomas en planta y en fruto y el aislamiento del patógeno. Para el aislamiento es
preferible la utilización de material fresco, aunque puede almacenarse entre 4 y 8ºC. Los
extractos vegetales se cultivan en placas de medio semiselectivo a los que,
preferiblemente, se les añade cefalexina o kasugamicina para evitar el crecimiento de
saprófitos (IPPC-FAO, 2014). Sin embargo la visualización de síntomas y el
aislamiento de patógeno no permiten diagnosticar con certeza la enfermedad, es por
ellos que se han desarrollado otras metodologías.
La realización de test de patogenicidad permite completar el diagnóstico de la
enfermedad mediante aislamiento e inoculación de plantas huésped. Para la
identificación de Xcc y poder distinguir los tipos de chancros se han descrito plantas
indicadoras, que además indican la gama de huésped de las posibles Xathomonas
(Pomelo Duncan, naranjo dulce var. Valencia y lima mejicana) (EPPO, 2005; IPPC-
FAO, 2014; Rybak et al., 2009).
Las técnicas serológicas pueden usarse para la detección del patógeno desde un cultivo
puro o en planta. Se basan en el reconocimiento de un antígeno correspondiente al
patógeno a través de anticuerpos y no distingue entre bacterias vivas o muertas. Para
detección e identificación del patógeno se pueden usar inmunofluorescencia, ELISA
(Enzyme-Linked Inmunosorbent Assay), DAS-ELISA o ELISA indirecto (Alvarez et al.,
1991; Alvarez, 2004; Civerolo, 1984; IPPC-FAO, 2014).
Las características bioquímicas del género Xanthomonas son muy similares entre sí, por
lo que es difícil distinguir mediante estas a las distintas Xanthomonas causantes de
chancros (tipos A, B y C) y de X. alfalfae subsp. citrumelonis. Algunas de estas
técnicas, basadas en el análisis enzimático y la utilización de distintos compuestos de
carbono, se han usado sin embargo para la identificación y caracterización de cepas
causantes de cancrosis (EPPO, 2005; IPPC-FAO, 2014; Vernière et al., 1993; Vernière
et al., 1998).
Las técnicas moleculares permiten la detección e identificación del patógeno, así como
el diagnóstico de la enfermedad en plantas sintomáticas y asintomáticas. La ventaja de
estas técnicas frente a los métodos de inoculación y pruebas de patogenicidad es la
duración del protocolo, que se reduce considerablemente. Entre las más utilizadas se
encuentran las técnicas de PCR tanto convencional como en tiempo real, el análisis
Introducción
23
multilocus, el estudio de secuencias de ADN repetidas y NASBA (Nucleic Acid
Sequence Based Amplification).
La reacción en cadena de la polimerasa o PCR con cebadores específicos se recomienda
como método eficiente y rápido para la detección de Xcc y Xfa (EPPO, 2005; Henson y
French, 1993; Mavrodieva et al., 2004). Se han descrito distintas parejas de cebadores
para la detección por PCR convencional de las cepas de CBC tipo A (incluyendo los A*
y Aw), B y C basados en distintas secuencias de diferentes partes de los genomas. Las
parejas de cebadores diseñadas por Hartung y col. en 1993 y Cubero y Graham en 2002
han sido las seleccionados por los protocolos de la EPPO y de IPPC-FAO (Cubero y
Graham, 2002; EPPO, 2005; Hartung et al., 1993; IPPC-FAO, 2014) para la detección
de patógenos causantes del chancro bacteriano de los cítricos, recomendándose, en
algunos casos el uso de ambas parejas de cebadores. Mediante PCR convencional,
también es posible identificar el tipo de cepa que está causando la enfermedad,
aspectoimportante sobre todo cuando hay en marcha un programa de erradicación. Si la
enfermedad es causada por Xcc tipos A* o Aw las medidas se aplican únicamente a sus
plantas huésped, generalmente lima mejicana; sin embargo si es causada por el chancro
tipo A, todos los cítricos de un área determinada deben ser eliminados (Cubero y
Graham, 2005; Sun et al., 2004). Para realizar la identificación se usan cultivos puros de
los patógenos aislados de la planta y dos parejas de cebadores (IPPC-FAO, 2014), los
descritos anteriormente J-pth1/2 ó J-Rxg/Rxc2, basados en la secuencia de la región
intergénica ITS (Internal Transcribed Spacer) (Cubero y Graham, 2002) junto con
Xac01/02 que corresponden con secuencias de los genes rpf (regulation of
pathogenicity factors) (Coletta-Filho et al., 2006) o XACF/R basados en la secuencia
del gen hrpW (Suk Park et al., 2006).
La PCR en tiempo real se considera el método más efectivo para la detección del
patógeno en material vegetal, sobre todo cuando se utilizan sondas Taq-Man que
aumentan la especificidad del método (Cubero y Graham, 2005; Golmohammadi et al.,
2007). Permite la detección de hasta 10 ufc mL-1
tanto en planta como en fruto
(Golmohammadi et al., 2007; Mavrodieva et al., 2004). Además, permite identificar las
distintas cepas pertenecientes a Xcc A, A* y Aw mediante discriminación alélica del gen
lrp (del inglés leucine-responsive regulatory protein) (Cubero y Graham, 2004; Cubero
y Graham, 2005).
Introducción
24
El análisis multilocus, basado en la secuenciación de entre 4 y 8 genes de
mantenimiento celular o housekeeping (IPPC-FAO, 2014) o 12 genes(Pruvost et al.,
2014b), que se concatenan en una única secuencia (multilocus), es uno de los
procedimientos utilizados en la identificación de las cepas de Xanthomonas. La
secuencia concatenada se compara con la de otras de bacterias ya conocidas disponibles
en bases de datos generales o más específicas como la Plant Associated Microbes
Database (PAMDB) determinando así el patógeno hasta nivel de patovar o gama de
huésped (Bui Thi Ngoc et al., 2010; Young et al., 2008b).
Las secuencias de ADN repetidas tales como las secuencias extragénicas palindrómicas
repetitivas (rep del inglés repetitive extragenic palindromic), las secuencias BOX y las
ERIC (enterobacterial repetitive consensus) han permitido la identificación del
patógeno hasta nivel de patotipo (Cubero y Graham, 2002; Koupaei et al., 2013; Louws
et al., 1994).
La técnica denominada NASBA (Nucleic Acid Sequence Based Amplification), ha
permitido la detección de Xcc desde material vegetal realizando una extracción de ARN
total a partir de la planta infectada. Esta técnica se basa en la amplificación de
ARNmque sirve como buen marcador de células viables al ser este ácido nucleico
inestable y sufrir una rápida degradación una vez sintetizado. El límite de detección de
esta técnica es de 104 cfu mL
-1 (Golmohammadi et al., 2012; Scuderi et al., 2010).
2.4. Control
La cancrosis de los cítricos está presente en más de 30 países. Para evitar su avance es
importante disponer de eficaces métodos de detección y control, y en los casos en los
que aún sea posible proceder a la erradicación con el fin de mantener zonas libres de
chancro, reduciendo asimismo, el impacto económico en los mercados (Golmohammadi
et al., 2007).
Prevención 2.4.1.
En la actualidad todavía no se ha encontrado ningún método efectivo para controlar la
enfermedad en campo (EFSA Panel on Plant Health, 2014), por lo que se recomienda
como primera medida de control prevenir la entrada del patógeno a zonas libres del
mismo (Civerolo, 1984; Graham et al., 2004).
Introducción
25
La Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria (EFSA en adelante del inglés
European Food Safety Authority), ha realizado un informe sobre el riesgo de entrada de
las distintas especies que causan chancro en cítricos en la Unión Europea y sus
consecuencias. Se considera que la probabilidad de entrada y establecimiento de esta
enfermedad es entre probable y moderadamente probable, dadas las prácticas culturales
que se dan en el cultivo de cítricos en la Unión Europea, la importación de material
vegetal y el clima entre otros factores (EFSA Panel on Plant Health, 2014).
Figura 12. Zonas de cultivo de cítricos en la Unión Europea (las zonas de Chipre y Malta no han sido
incluidas). Los colores determinan el riesgo de establecimiento de la enfermedad tanto en zonas
productoras como no productoras (EFSA Panel on Plant Health, 2014).
En la Figura 12 se muestra un mapa con el riesgo potencial de la entrada del chancro en
países de la Unión Europea, incluyendo áreas de cultivo y no cultivo. La introducción
de esta enfermedad en la Unión Europea tendría un alto impacto en el cultivo y la
economía de las zonas productoras; se estima que la introducción de la cancrosis o
chancro tendría graves consecuencias sociales, debido a las pérdidas directas en campo
y a aquellas indirectas consecuencia de las limitaciones que se producirían en relación a
las exportaciones de fruta a países libres de la enfermedad. Además, se produciría una
reducción en el mercado de plantas y pérdidas económicas derivadas del de la necesidad
Introducción
26
de uso de tratamientos químicos con el consiguiente impacto ambiental resultante de la
utilización de productos principalmente cúpricos.
Tabla 1. Probabilidad de entrada mediante distintos medios del chancro de los cítricos a través de material
vegetal en la Unión Europea (EFSA Panel on Plant Health, 2014).
Producto
Probabilidad de
entrada en la UE
derivada de la
presencia del patógeno
en origen
Probabilidad de
supervivencia
durante el
transporte
Probabilidad de
supervivencia tras
tratamientos
fitosanitarios
Probabilidad de
transmisión a otras
plantas huésped
Prob. Certeza Prob. Certeza Prob. Certeza Prob. Certeza
Fruta
Actividades
comerciales Probable Media Muy
probable Baja Muy
probable Baja Improbable Alta
Viajeros
De
probable a
muy probable
Media Muy
probable Baja
Muy
probable Baja Improbable Alta
Plantas para
producción
Actividades
comerciales Probable Media Muy
probable Baja Muy
probable Baja Muy
probable Baja
Viajeros Probable Media Muy
probable
Baja Muy
probable
Baja Muy
probable
Baja
Cítricos y
otras
rutáceas
para
ornamentales
Actividades
comerciales
Probable
para huéspedes
naturales
Moderada
para
posibles huéspedes
Baja para huéspedes
naturales
Alta para
posibles
huéspedes
Muy
probable Baja
Muy
probable Baja
Muy
probable Baja
Viajeros
Probable
para
huéspedes
naturales
Moderada
para posibles
huéspedes
Baja para
huéspedes
naturales
Alta para
posibles huéspedes
Muy
probable Baja
Muy
probable Baja
Muy
probable Alta
Hojas y
brotes
Actividades
comerciales
y viajeros
Probable Media Muy
probable Baja
Muy probable
Baja Muy
probable Alta
En España se cultivan 314.908 hectáreas de cítricos en todo el territorio, siendo el
mayor exportador de fruta de calidad a nivel mundial, además se realizan exportaciones
de material vegetativo libre de enfermedad a otros países. El sureste de España presenta
un clima relativamente favorable para el desarrollo y dispersión de la enfermedad,
puesto que en invierno las temperaturas no son muy bajas y en determinadas situaciones
se producen abundantes precipitaciones con altas temperaturas (EFSA Panel on Plant
Health, 2014). Debido al riesgo de entrada de los agentes causales de chancro en la
Unión Europea y las graves consecuencias que tendría en países mediterráneos, esta
enfermedad es objeto de preocupación por parte de la Unión Europea. Como
Introducción
27
consecuencia de ello se aplican fuertes medidas de cuarentena e incluso las cepas
pertenecientes a Xcc han sido consideradas como potenciales armas biológicas
(directiva 394/2006 EC) (Young et al., 2008a).
En la Unión Europea los agentes causales del chancro bacteriano de los cítricos (CBC)
se encuentran regulados por la Directiva 2000/29/CE. Todo el material que sea
importado y esté dentro de esa lista debe pasar controles y cumplir los requisitos
establecidos para poder ser introducido en la Unión Europea, entre ellos plantas o frutos
susceptibles de estar infectados por esta enfermedad. Todos los cítricos que entren en la
Unión Europea, deberán llevar un certificado fitosanitario y demostrar que están libres
de enfermedad en destino. Además, las plantas que sean introducidas se someterán a
controles cuarentenarios para comprobar que se encuentran libres de CBC. En el caso de
que algunos de los protocolos establecidos no se cumpla, o se detecte el patógeno, se
negará la entrada a dichos productos en la Unión Europea. Los países que detecten estos
problemas, deberán comunicárselo a los otros estados miembros
(http://ec.europa.eu/food/plant/organisms/imports/inspection_es.htm).
La cancrosis de los cítricos se ha descrito como una enfermedad susceptible de ser
erradicada dado que infecta un cultivo que es de un alto valor económico y alimentario,
posee una tasa moderada de dispersión y no existe un vector que transmita la
enfermedad, además la supervivencia de Xanthomonas en ausencia de planta huésped es
muy reducida. Los síntomas producidos por este patógeno son relativamente fáciles de
reconocer y su gama de huésped se encuentra restringida a la familia Rutaceae. Por
último, las medidas de control de Xcc son poco eficientes y de alto coste económico
(Barkley et al., 2014; Graham et al., 2004). En algunas zonas se han llevado a cabo
costosos programas de erradicación, que aunque han sido positivos en el control del
avance de la enfermedad no han conseguido eliminar completamente la bacteria en la
zona (Barkley et al., 2014; Gottwald et al., 2002b).
En los programas de erradicación tras realizar la eliminación de árboles, se deben hacer
controles periódicos para comprobar que no hay más introducciones, y pasado un
tiempo determinado la zona se puede declarar libre de enfermedad. Los protocolos a
realizar para la erradicación son variables en cada país (Barkley et al., 2014).
Introducción
28
Control químico 2.4.2.
Los tratamientos químicos más eficientes y más utilizados para el control de la
cancrosis de los cítricos son aquellos basados en derivados del cobre, como el caldo
bordelés, sulfato de cobre o hidróxido de cobre. Estos tratamientos disminuyen la
población de bacteria en el árbol y reducen la cantidad de inóculo y la probabilidad de
dispersión. El tipo de tratamiento y su efectividad, así como los tiempos y número de
aplicaciones dependen de la susceptibilidad, edad y fisiología de la planta, así como de
las condiciones climáticas de la zona y de los métodos control utilizados para otras
enfermedades (Behlau et al., 2010; Civerolo, 1984; EFSA Panel on Plant Health, 2014).
Los compuestos derivados del cobre son bactericidas de tipo protector, que deben de ser
aplicados antes de la llegada del patógeno, ya que una vez éste está establecido en el
interior de la planta ven reducida su eficacia. El cobre queda adherido a la superficie de
la planta, por lo tanto cuando las hojas o los frutos aumentan de tamaño el área no
cubierta por el producto es susceptible de ser infectada (Agrios, 2005; Dewdney et al.,
2012). No se conoce en profundidad el modo de acción, sin embargo se ha sugerido que
los iones de cobre producen rotura de la membrana celular, además parece que inducen
la formación de especies reactivas de oxígeno, lo que aumenta el estrés oxidativo (Grass
et al., 2011). En Xcc los tratamientos con cobre inducen el estado viable y no cultivable
(VBNC), un estado reversible en el cual las bacterias son incapaces de crecer en un
medio de cultivo, pero presentan actividad metabólica e incluso pueden mantener su
capacidad infectiva. El estado VBNC se considera como un estado de latencia de la
bacteria que puede prolongarse durante meses, y que constituye un mecanismo de
resistencia para la bacteria en condiciones de estrés (Del Campo et al., 2009;
Golmohammadi et al., 2013).
El tratamiento con cobre se considera bastante efectivo para evitar la infección de
frutos, sobre todo al inicio del desarrollo de los mismos, mientras que que en hojas
presentan una efectividad menor (Dewdney y Graham, 2011; Dewdney y Graham,
2013). El principal problema de los tratamientos con cobre es su limitación en el
tiempo, que obliga a realizar varias aplicaciones. Además tiene otros inconvenientes
como su carácter contaminante y su efecto fitotóxico, puesto que en suelos con alta
concentración de cobre el acceso a la planta de determinados nutrientes como el hierro
se reduce (Dewdney et al., 2012; Francis et al., 2008).
Introducción
29
Para el control del chancro de los cítricos en Florida, la Universidad de Florida ha
elaborado guías donde se describen los distintos métodos de control para la enfermedad.
En zonas donde la enfermedad es endémica, se recomienda la aplicación de cinco
tratamientos con base de cobre a partir del mes de abril, lo que se considera suficiente
para evitar el daño en naranjo variedad Valencia. Para otras variedades se recomienda
un mayor número de tratamientos dado el momento de recogida del fruto y la variedad,
que como hemos mencionado antes son factores importantes a tener en cuenta para
obtener un efectivo control del chancro. Además existe una página web perteneciente a
la Universidad de Florida para los citricultores donde se describe el tratamiento y el
momento de la aplicación en función de la meteorología y las variedad cultivada
(Dewdney y Graham, 2011; Dewdney y Graham, 2013; Dewdney et al., 2012).
Los tratamientos continuados con cobre pueden desembocar en la generación de
resistencias, en Xcc se describió por primera vez la aparición de cepas resistentes a
cobre en 1994 en Argentina. Además se ha demostrado la presencia de especies
bacterianas epífitas resistentes a cobre en cítricos. Se piensa que la transmisión de los
genes de resistencia a cobre, operón copLAB, pudo y puede darse en la fase epifita de la
bacteria especialmente cuando éstas forman agregados organizados tipo biopelícula. En
biopelículas, los fenómenos de intercambio génico se han demostrado en un gran
número de especies bacterianas (Behlau et al., 2011; Behlau et al., 2012a; Behlau et al.,
2012b). Un estudio realizado por nuestro grupo ha mostrado que concentraciones
subletales de bactericidas, entre ellos el sulfato de cobre, incrementan la formación de
biopelículas tanto in vitro como in planta, lo que aumenta la resistencia de las bacterias
a los tratamientos, además de favorecer el intercambio de material genético y la
aparición de resistencia a dichos agentes (Redondo, C. et al. Enviado).
En la actualidad se están ensayando otros compuestos químicos para el control del
chancro bacteriano de los cítricos que no tengan consecuencias para el medio ambiente.
Se están probando tanto compuestos antimicrobianos que reducen el crecimiento y el
desarrollo en planta de la bacteria, como compuestos que inducen resistencia en plantas.
Algunos de ellos se describen a continuación.
Los tratamientos dirigidos a inducir respuesta sistémica adquirida (SAR) con
Imidacloprid, Thiamethoxam, y Acibenzolar-S-Methyl o la respuesta sistémica inducida
(ISR), como la proteína harpina denominada Messenger, en hojas se han mostrado
eficientes en el control del chancro. El Imidacloprid, además, se ha mostrado muy
Introducción
30
eficiente para el control de psílidos y el minador de los cítricos (Francis et al., 2008;
Graham y Leite, 2004; Graham y Myers, 2011; Graham y Myers, 2013; Sétamou et al.,
2010).
Los alkil-galatos son inhibidores de la división celular, han mostrado ser capaces de
inhibir la colonización bacteriana y de disminuir la producción de chancros en planta,
así como reducir la dispersión de la bacteria desde los chancros a otras partes de la
planta. Sin embargo, todavía no se ha comprobado la eficiencia de estos productos en
campo (Silva et al., 2013).
Un estudio reciente ha descrito como método de control diversas sustancias inhibidoras
de la formación de biopelículas in vitro como la D-leucina y los indoles. Se ha
demostrado que estos compuestos son capaces de reducir el número de lesiones en
plantas de invernadero cuando son combinados con tratamientos de cobre, aunque su
eficiencia todavía no ha sido tampoco probada en campo (Li y Wang, 2014).
En post-cosecha los tratamientos se realizan principalmente para eliminar
completamente Xcc de la superficie del fruto y así poder exportarlos a zonas libres de
chancro. Los principales tratamientos que se dan a los cítricos son clorinas y orto-fenil-
fenato sódico (SOPP del inglés sodium orto-phenyl-phenate), normalmente de forma
combinada (Gottwald et al., 2009). Sin embargo, aunque estos tratamientos disminuyen
o eliminan la población del patógeno en fruto, en algunos casos se ha detectado Xcc a
concentraciones mayores de 103 ufc mL
-1. No obstante, el USDA y la APHIS afirman
que el riesgo de transmisión de la bacteria a partir de frutos infectados a material vegetal
en las zonas libres de chancro es muy bajo o nulo, ya que su supervivencia en almacén
tras los tratamientos es prácticamente inexistente. En Estados Unidos, en la actualidad,
no se aplican generalmente medidas de cuarentena respecto al transporte de frutos entre
estados donde el chancro es endémico y estados libres de la enfermedad; además en la
Unión Europea la detección de Xcc en los frutos importados desde Estados Unidos es
prácticamente nula (EFSA, 2013; Gottwald et al., 2009; Shiotani et al., 2009).
Prácticas culturales 2.4.3.
La realización de unas buenas prácticas culturales en el campo de cultivo ayuda a
reducir la dispersión del inóculo a otros árboles, o de unas áreas a otras y posibilita la
reducción de la agresividad de la enfermedad. La selección de variedades certificadas
libres de chancro es primordial para el control de la enfermedad así como un control
Introducción
31
apropiado de la densidad poblacional de Xcc en el campo en aquellas zonas donde la
enfermedad está presente. La correcta desinfección de la maquinaria y del personal de
trabajo también son indispensables para evitar la dispersión del patógeno (Dewdney y
Graham, 2011; EFSA Panel on Plant Health, 2014). Además hay que tener en cuenta el
método de riego; el riego por aspersión favorece la salida del patógeno a través de los
estomas y ayuda a disolver los exudados de las lesiones, contribuyendo a una mejor
diseminación de la bacteria. El riego por inundación o el micro-riego en los que el agua
se aplica directamente al suelo presenta un impacto menor para la dispersión del
patógeno (EFSA Panel on Plant Health, 2014).
Xcc no es un patógeno sistémico y no es capaz de desplazarse a través de la planta, por
lo que la eliminación de las hojas o ramas infectadas puede reducir el nivel de inóculo y
disminuir la aparición posterior de lesiones. La poda de los árboles o defoliación de los
mismos debe realizarse antes de la floración de forma cuidadosa, teniendo en cuenta que
las nuevas hojas van a ser altamente sensibles a la bacteria por lo que se recomienda
aplicar tratamientos con base de cobre a los nuevos brotes foliares. La defoliación de los
árboles se realiza aplicando al árbol altas concentraciones de cobre o fertilizantes ya que
actualmente no existe ningún defoliante comercial autorizado. La eliminación de
árboles infectados con el patógeno solo está recomendado en casos en los que la
infección esté muy localizada, además se deberá realizar una inspección de los árboles
colindantes (Dewdney y Graham, 2011; Dewdney y Graham, 2013; EFSA Panel on
Plant Health, 2014; Gottwald et al., 2002b; Graham et al., 2004).
Control biológico 2.4.4.
Se han descrito diferentes agentes de biocontrol para Xcc, muchos de ellos son cepas o
aislados bacterianos obtenidos de la superficie foliar o del suelo con posibles efectos
para el biocontrol de Xcc (Kalita et al., 1996; Dong et al., 2012). Entre ellos se
encuentran bacterias de los géneros Pseudomonas, Erwinia, Bacillus, Streptomyces y
Burkholderia (de Oliveira et al., 2011; Dong et al., 2012; Kalita et al., 1996).
Burkholderia cepacia es capaz de reducir el daño causado por Xcc hasta en un 60%,
además se ha demostrado capaz de controlar en invernadero otros patógenos de cítricos;
sin embargo, aunque este producto está registrado como agente de biocontrol, su uso no
está permitido por la posibilidad de que cause enfermedad en personas
inmunodeprimidas (XiaoYan et al., 2007). Se han probado diversas cepas de Bacillus
Introducción
32
subtillis, como agentes de biocontrol frente a Xcc, mostrando efecto en reducción de
biopelículas y virulencia de Xcc (Huang et al., 2012). El exudado obtenido de
Pseudomonas spp., es capaz de reducir el crecimiento bacteriano in vitro así como la
incidencia del chancro de los cítricos en plantas de invernadero al aplicarse con fines
preventivos o curativos. Parece afectar a la producción de exopolisacárido y a la
viabilidad bacteriana (de Oliveira et al., 2011). De manera similar los metabolitos
secundarios obtenidos de P. aeruginosa, son capaces de reducir la formación de
biopelículas de Xcc, así como de reducir la virulencia tanto de Xcc en naranjo como de
X. axonopodis pv. malvacearum en el algodón (Spago et al., 2014).
En el caso del chancro de los cítricos, también se ha probado como estrategia de control
el uso de bacteriófagos que son capaces de infectar un gran número de bacterias
patógenas de plantas. Las principales dificultades que tiene el uso de bacteriófagos son
su amplia gama de huésped, el desarrollo de resistencias y su baja persistencia en planta
(Balogh et al., 2010). El fago filamentoso XacF1 es capaz de reducir la virulencia de
Xcc en limonero al afectar a la producción de exopolisacárido, y motilidad, aunque se
producen lesiones cuando la inoculación se realiza por infiltración, (Ahmad et al.,
2014a). Además se están caracterizando los fagos CP1 y CP2 que se habían utilizado
para la identificación de los distintos tipos de Xcc y que han mostrado afectar al
desarrollo del patógeno (Ahmad et al., 2014b). Finalmente también se están
caracterizando otros fagos aislados de Xcc procedentes de Argentina y Florida que
presentan características similares a CP1 y CP2 (Balogh et al., 2013).
Métodos barrera: cortavientos 2.4.5.
Como se ha mencionado en apartados anteriores el principal método de dispersión de
Xcc es el viento que arrastra las gotas de agua con la bacteria a árboles, hojas, ramas y
fruto sanos. La presencia de barreras cortavientos disminuye este flujo y minimiza el
riesgo de aparición de nuevos focos de infección (Figura 13). Los cortavientos son
efectivos para el control de la dispersión del patógeno, reduciendo además la severidad
de la enfermedad en zonas donde es endémica, especialmente cuando son combinados
con tratamientos de cobre (Figura 14). La dispersión de Xcc se ve afectada de distinta
forma en función de la longitud y altura de los cortavientos, pero no parece estar
relacionada con su densidad. En cualquier caso, la utilización de este método de control
no siempre es efectiva, especialmente cuando la enfermedad está muy extendida o
Introducción
33
cuando los cortavientos no tienen la altura apropiada (Behlau et al., 2008; Behlau et al.,
2010; Dewdney y Graham, 2011; Dewdney y Graham, 2013).
Figura 13. Uso de árboles del género Grevellia (al fondo) como cortavientos para evitar la dispersión y
controlar el número de lesiones causadas por el chancro de los cítricos en Brasil (Gottwald et al., 2002a).
Figura 14. Gradientes de enfermedad en cultivos de pomelo Duncan bajo distintos tratamientos para el
control del chancro de los cítricos (Gottwald y Timmer, 1995). La combinación de los tratamientos con
cobre junto con los cortavientos presenta una mayor reducción de la enfermedad que el uso aislado de
cada uno de ellos. Imagen tomada de la página web de la Universidad de Florida.
Introducción
34
Uso de variedades resistentes y mejora de cítricos 2.4.6.
La utilización de especies y variedades lo menos susceptibles posible al chancro de los
cítricos es otra de las estrategias encaminadas al control del a enfermedad,
especialmente en aquellos lugares donde la enfermedad está presente. Se han realizado
numerosos estudios dirigidos a determinar la sensibilidad de diferentes variedades de
cítricos en campo, aunque ninguna de ellas ha mostrado una resistencia total (Carvalho
et al., 2015; Gottwald et al., 2002a; Gottwald et al., 2002b; Graham et al., 2004).
Para la obtención de variedades resistentes al chancro de los cítricos se han seguido
tanto estrategias de mejora genética tradicional, como el desarrollo de plantas
transgénicas. En el caso de los cítricos la mejora tradicional presenta el problema de la
poliembrionía, que dificulta el desarrollo del embrión sexual. Además, algunas
variedades de gran importancia económica presentan esterilidad del polen o de los
megaesporofitos, a lo que hay que sumar el alto grado de heterocigosis de los cítricos
que obliga a analizar un alto número de híbridos (Donmez et al., 2013; Navarro y
Juárez). Por otro lado, aunque existen variedades poco susceptibles en campo al
chancro, como la mandarina var. Cleopatra, mandarina var. Sunkin, tres variedades de
calamondín (Citrus madurensis Lour.), kumquats (Fortunella margarita), limequats (C.
aurantiifolia × F. margarita) vars. Eustis y Lake (Reddy, 1997), el cruzamiento de éstas
con variedades comerciales ha dado como resultado productos de escaso valor
comercial. Un ejemplo es el limequat, una variedad supuestamente resistente al chancro
obtenida por cruzamiento entre lima y kumquat cuyos frutos son comestibles pero de
pequeño tamaño. Cruzamientos de éste con otros cítricos como el naranjo dulce han
dado lugar a líneas con mayor o menor resistencia al chancro considerándose por ello
como un buen progenitor para futuros cruzamientos (Viloria et al., 2004).
Debido a la falta de resistencias naturales con las que se puedan realizar mejora genética
tradicional para la obtención de variedades económicamente viables, se están realizando
diversos estudios con variedades transgénicas. La ventaja de la transformación genética,
es la posibilidad de introducir nuevos caracteres sin alterar el fondo genético de la
planta (Donmez et al., 2013). Sin embargo debido a las altas restricciones existentes
respecto al cultivo y consumo de plantas genéticamente modificadas, en especial en
zonas como la Unión europea, en la actualidad es difícil que variedades transgénicas
lleguen a cultivarse y a comercializarse.
Introducción
35
Aun así, diversos estudios han desarrollado plantas modificadas genéticamente
resistentes al chancro de los cítricos, por ejemplo mediante la transformación y
expresión de péptidos antimicrobianos como la atacina A o la dermaseptina (Cardoso et
al., 2010; Furman et al., 2013). Se han creado también cítricos que son capaces de
producir respuesta hipersensible en presencia de cualquiera de los agentes causantes de
chancro (Jones et al., 2014). Asimismo se han introducido genes de resistencia de otras
especies vegetales, entre ellos el gen Bs2 proveniente de plantas de pepino, que confiere
resistencia a variedades sensibles a X. campestris pv. vesicatoria de tomate y pepino o el
gen Xa-21 que confiere resistencia a X. oryzae pv. oryzae a plantas de arroz, ambos
genes cuando han sido introducidos en cítricos han sido capaces de inducir una
disminución del daño producido por Xcc (Mendes et al., 2010; Sendín et al., 2012). Por
último, en un estudio reciente se han transformado varios cítricos susceptibles al
chancro con el gen rpfF de Xylella fastidiosa. Este gen está relacionado con la
producción de factores de señalización difusibles (DSF del inglés Difusible signal
factor), que es el sistema de quórum sensing en Xanthomonas. La expresión de este gen
en la planta disminuye la incidencia de la enfermedad afectando probablemente a la
motilidad, formación de biofilm y otros factores de virulencia en el patógeno (Caserta et
al., 2014).
Control integrado 2.4.7.
En áreas donde el chancro de los cítricos es endémico se recomienda el control
integrado de la enfermedad (Graham et al., 2004). Esta estrategia incorpora varios de los
métodos de control descritos en apartados anteriores y que se resumen en el uso de
variedades resistentes a la enfermedad, producción de las plantas en invernaderos libres
de chancros, establecimiento de cortavientos en campo, defoliación y poda para reducir
el inóculo, realizar tratamientos preventivos tanto para el chancro como para el minador
de los cítricos y control y desinfección tanto de la maquinaria como del personal que
accede al campo. Además se recomienda la realización de inspecciones de los frutos
para evitar que se propague a otras áreas o países libres de la enfermedad.
3. Xanthomonas citri subsp. citri
Xcc al igual que otras Xanthomonas es una bacteria aeróbica Gram negativa, con un
único flagelo polar y forma de bacilo que mide entre 0,4 y 0,7 µm de ancho y 0,7 y 1,8
Introducción
36
µm de largo. Es una bacteria de crecimiento lento y parásito obligado puesto que no
puede sobrevivir en ausencia de su planta huésped. En placa de cultivo produce colonias
convexas de color amarillo cuya mucosidad depende del medio en el que se cultive y la
cepa o aislado, su temperatura óptima de cultivo es entre 25 y 30 ºC (Figura 15)
(Graham et al., 2004).
Figura 15. Imágenes de Xcc. A, microscopía electrónica de transmisión de Xcc teñidas con ácido
fosfotúnsgtico donde se ve la presencia del único flagelo polar; B, estructura convexa de una colonia de
Xcc transformada con el plásmido estable que contiene el gen que codifica para la GFP, PUFZ75; C:
crecimiento en placa de Xcc. Fotos realizadas por Marta Sena Vélez y Jaime Cubero.
Como se ha mencionado antes dentro de Xcc existen varias cepas que producen distintos
tipos de chancros, la principal diferencia entre estas cepas es la gama de huésped. Las
cepas pertenecientes al chancro tipo A producen enfermedad en un gran número de
rutáceas y sin embargo las cepas A* y Aw, en campo, únicamente producen infección en
lima mejicana y en su patrón de injerto. Aunque infecciones producidas in vitro, en su
mayoría mediante infiltración, han mostrado que pueden producir respuesta
hipersensible en algunos huéspedes como el pomelo, naranjo dulce o mandarino y
lesiones menos severas que las de tipo A en otras especies de cítricos. Se ha demostrado
que una de las diferencias existentes entre los distintos tipos de cepas es la presencia del
gen AvrGf1/XopAG, de localización cromosómica, que no está presente en los chancros
tipo A, B o C ni en las cepas de A* originarias de Irán. En ausencia de este gen Xcc Aw
es capaz de producir lesiones tipo chancro en pomelo a un nivel menor que Xcc tipo A,
lo que indica que otros procesos relacionados con virulencia están implicados en el
desarrollo de la enfermedad (Escalon et al., 2013; Rybak et al., 2009; Sun et al., 2004).
Se ha descrito que todas las cepas de Xcc independientemente de su gama de huésped
presentan un crecimiento poblacional similar en lima mejicana cuando son inoculadas
Introducción
37
por infiltración, sin embargo cuando son inoculadas en hojas de pomelo o naranjo dulce,
en las mismas condiciones, el crecimiento es menor en las cepas tipo Xcc A* y Xcc Aw
(limitada gama de huésped) comparado con Xcc A. Estas diferencias son menores o
incluso inexistentes a altas concentraciones del patógeno (Escalon et al., 2013; Rybak et
al., 2009; Sun et al., 2004).
Inicialmente se describió que las cepas de Xcc presentaban una alta homología a nivel
genético (Shiotani et al., 2000), a lo largo del tiempo se han realizado gran cantidad de
estudios dirigidos a relacionar los contenidos genéticos y fenotípicos de Xcc con la
gama de huésped (Bui Thi Ngoc et al., 2009; Cubero y Graham, 2002; Cubero y
Graham, 2004; Cubero y Graham, 2005; Graham et al., 2004; Jalan et al., 2013a; Li et
al., 2007a; Pruvost et al., 2014b; Vernière et al., 1998). Los primeros estudios realizados
se basaron en la identificación y caracterización de las cepas mediante técnicas
serológicas, y posteriormente en la amplificación por PCR y secuenciación del gen de
virulencia pthA, sin embargo estos estudios no consiguieron ni tan siquiera diferenciar
las cepas de amplia y limitada gama de huésped. A partir de perfiles de bandas
generadas por rep-PCR se pudieron separar las cepas de tipo A de amplia y limitada
gama de huésped, además de situar claramente en un grupo diferente a las cepas
causantes de chancros tipo B y C (Cubero y Graham, 2002). Posteriormente, el análisis
de la secuencia de un gen regulador dependiente de leucina, lrp, permitió distinguir
entre cepas de amplia y limitada gama de huésped, sugiriéndose además que la
variación en este gen puede estar relacionada con la adaptación del patógeno al huésped
(Cubero y Graham, 2005).
Un estudio reciente basado en el análisis multilocus de secuencias repetidas en tándem
(MLVA, Multilocus Variable number of tandem repeat Analysis) ha conseguido
establecer una mejor separación entre las cepas pertenecientes a Xcc con distinta gama
de huésped y diferente localización geográfica estableciéndose 4 grupos (Figura 16).
Los grupos 1 y 2 corresponden a cepas de amplia gama de huésped, dentro de estos
grupos el subgrupo más numeroso es el 1.1, que contiene cepas procedentes de varias
zonas geográficas; los subgrupos 1.2 y 1.3 provienen de las Islas Maldivas y Paquistán
respectivamente, el grupo 2 contiene cepas provenientes de Asia Occidental. El grupo3
contiene las cepas pertenecientes al chancro tipo Aw procedentes de Florida e India y el
grupo 4 contiene las cepas pertenecientes al tipo A* y se subdivide a su vez en varios
subgrupos: el subgrupo 4.1 incluye cepas procedentes de Irán y Arabia Saudí, el
Introducción
38
subgrupo 4.2, aquellas aisladas en Omán y Arabia Saudí y por último el subgrupo 4.3
que contiene cepas originarias de Camboya y Tailandia. Los resultados de este estudio
sugieren que no fue hasta el siglo XIX cuando se produjo la dispersión del patógeno a
nivel mundial, al transportarse plantas que podían estar infectadas por el patógeno, por
ello la mayoría de las cepas de amplia gama de huésped con diversos orígenes
geográficos se agrupan en un mismo grupo, es decir, son más similares entre sí que con
otros grupos incluso si se aislaron de zonas geográficas similares (Pruvost et al., 2014).
Figura 16. Árbol categórico de mínima expansión con datos obtenidos a partir de
un análisis MLVA-31 (129 cepas y 72 haplotipos). Este árbol muestra la
variabilidad genética en relación con la gama de huésped en cepas de Xcc con
diversos orígenes geográficos. Las cepas de amplia gama de huésped están
marcadas en color rojo, las cepas pertenecientes al CBC tipo A* en azul y las del
tipo Aw en verde (Pruvost et al., 2014).
Los genomas de tres Xcc están disponibles en las bases de datos; las cepas Xcc 306
procedente de Brasil, l Xcc 12879 Aw aislada en Florida (Jalan et al., 2013b) y Xac29_1
aislada en China cuyo genoma no ha sido publicado (Ye et al., 2013). Las propiedades
de los genomas pertenecientes a las cepas Xcc 306 y Xcc Aw 12879 se muestran en la
Tabla 2.
Introducción
39
Tabla 2: resumen de las propiedades de los dos genomas secuenciados y publicados de Xcc (da Silva et
al., 2002; Jalan et al., 2013a; Jalan et al., 2013b).
Cepa/Propiedades Xcc 306 Xcc 12879 Aw
Tamaño del genoma (pb) 5.175.554 5.320.000
Plásmidos pXAC33-pXAC64 pXacw19-pXacw58
Contenido en G+C 64,7% 64,71%
Genes codificantes 4.603 4.760
Con función asignada 2.710 3.457
Proteínas hipotéticas conservadas 1.272 -
Proteínas hipotéticas 331 -
ARN de transferencia 54 54
Operones ARN ribosomal 2 2
Elementos de secuencias insertadas 87
Proteínas ortólogas 4.428
Proteínas única para cada cepa 175 332
A pesar de que los genomas de las cepas Xcc 306 y Xcc Aw 12879 son muy similares
(aunque presentan varias translocaciones y reinserciones), las diferencias existentes
tanto en el cromosoma como en los plásmidos sugieren que algunos de sus elementos
genómicos proviene de distintas especies, posiblemente debido a su distinto origen
geográfico y como consecuencia de la exposición a diferentes comunidades bacterianas
con las que han estado en contacto (Jalan et al., 2013a).
Una de las principales diferencias entre estas dos cepas se encuentra a nivel plasmídico,
la cepa Xcc Aw 12879 contiene dos plásmidos denominados pXacw19 y pXacw58, el
primero de ellos no posee homología de secuencia con ninguno de los plásmidos de Xcc
306, siendo la similitud del segundo únicamente del 35% con pXAC64. En el plásmido
pXacw58 se encuentra el gen pthAw2 que codifica para el efector de virulencia similar
al gen pthA4 que es el causante de los síntomas del chancro, pero no contiene el sistema
de secreción tipo 4 presente en el plásmido pXAC64 de Xcc 306. Otras diferencias en el
genoma están relacionadas con el origen de determinadas zonas en la cepa Xcc Aw
12879, como sucede en la zona que codifica para el lipolisacárido (LPS), que contiene
genes similares a X. oryzae pv. oryzicola, y genes homólogos a 306. El LPS es un factor
importante en adhesión en Xanthomonas por lo que la variación de este clúster podría
estar relacionada con la gama de huésped del patógeno. La cepa Xcc Aw 12879 posee
una zona del genoma que presenta alta sintenia con la cepa 8004 de X. campestris pv.
campestris, esta región contiene tres reguladores transcripcionales, un sistema de dos
componentes y un regulador de la respuesta. Además entre estas cepas existe variación
Introducción
40
en varios sensores ambientales y en el contenido de proteínas aceptoras de grupos
metilo o MCPs (Jalan et al., 2013a; Mhedbi-Hajri et al., 2011a; Mhedbi-Hajri et al.,
2011b).
Estudios transcriptómicos comparativos entre la cepas Xcc 306 y Xcc Aw 12879, han
mostrado diferencias en la expresión de determinados genes en función del medio en el
que se encuentren. En medio de cultivo XVM2, que simula condiciones de apoplasto de
la planta se sobreexpresan, en ambas cepas, los genes relacionados con el Sistema de
Secreción Tipo III (SST3), sin embargo hay diferencias en algunos de los efectores
expresados, en Xcc 306 se sobreexpresan de forma diferencial pthA1, pthA2, avrXacE3
y xopK en Xcc Aw 12879 xopL, xopR, xopAI, xopAK, xopAF y xopAG. Mayores
diferencias se han observado en la expresión de genes relacionados con el Sistema de
Secreción Tipo II (SST2) que parece reprimido en medio XVM2 cuando se compara
con medio general NB en la cepa Xcc Aw 12879. Sin embargo en Xcc 306 no hay
diferencias de expresión en ambos medios, existiendo también diferencias de expresión
en genes que codifican para sustratos del SST2. Los genes relacionados con motilidad y
quimiotaxis se encuentran reprimidos en medio XVM2 en ambas cepas, al igual que los
genes relacionados con la producción de LPS, sin embargo los genes relacionados con
la producción de exopolisacárido se sobreexpresan en medio XVM2. Además en la cepa
Xcc 306 se observó mayor expresión de genes relacionados con virulencia en
comparación con la cepa de limitada gama de huésped. Se encontraron diferennias
notables en genes de respuesta a especies reactivas de oxígeno, falta de nutrientes,
adherencia, quimiotaxis y transportadores de membrana entre otros, sugiriendo una
mayor adaptación de la cepa de amplia gama de huésped a las condiciones de estrés
impuestas por la planta (Jalan et al., 2013a).
4. Factores de Virulencia de Xanthomonas citri subsp. citri
Las bacterias fitopatógenas son en su mayoría colonizadores del apoplasto vegetal. El
apoplasto está constituido por un sistema continuo que comprende las paredes y los
espacios intercelulares existentes en los tejidos vegetales (Grignon y Sentenac, 1991;
Taiz y Zeiger, 1991), es decir, se puede considerar apoplasto todo el tejido vegetal a
excepción del contenido de las células vegetales (protoplasto).
Introducción
41
Para colonizar el apoplasto y salir adelante en este medio inicialmente hostil, las
bacterias han de tener capacidad para superar los mecanismos de defensa desarrollados
por la planta dirigidos a evitar la infección. Estos mecanismos pueden ser constitutivos,
como la cutícula y factores químicos pre-existentes o inducibles, que se activan una vez
el patógeno ha conseguido penetrar en la planta, y que comprenden desde las
producción de especies reactivas de oxígeno (Levine et al., 1994), cambios en la
estructura de la pared celular (Hammerschmidt y Kuc, 1982), síntesis de antibióticos de
bajo peso molecular como las fitoalexinas (Dixon, 1986), producción de péptidos
antimicrobianos (Molina y García-Olmedo, 1993), producción de proteínas de defensa
(Loon, 1985), o incluso la muerte celular relacionada con la respuesta hipersensible
(Dixon et al., 1994).
Los patógenos vegetales han desarrollado sistemas para superar las barreras vegetales y
para facilitar la colonización del apoplasto y la posterior muerte celular para poder
adquirir nutrientes e incrementar su población. A continuación se describen algunos de
estos factores de virulencia en Xcc.
4.1. Sistema de Secreción Tipo III
Uno de los factores de virulencia más importantes tanto en patógenos de plantas como
de animales es el Sistema de Secreción Tipo III (SST3) (Ghosh, 2004), se encarga de la
secreción de proteínas de virulencia (proteínas Avr/Pth) y otros efectores de
patogenicidad al interior de las células vegetales o animales. La inyección por parte del
patógeno de estas proteínas en el tejido vegetal conduce al desarrollo de la enfermedad
en plantas huésped, o a la producción de respuesta hipersensible (HR) en plantas no
huésped, además participa en otros procesos celulares como la adhesión y formación de
agregados (Lahaye y Bonas, 2001).
En las bacterias patógenas de plantas el SST3 es codificado por los genes hrp
(Hypersensitive response and pathogenicity) y hrc (Hypersensitive response and
conserved) los últimos se denominan así debido a que se encuentran altamente
conservados entre los distintos géneros bacterianos ya sean patógenos de animales como
de plantas; además presentan similitudes con genes del flagelo. Por esta razón su
estructura es similar, con forma de pelo de 100-200 nm (Figura 17B) orientado hacia el
exterior celular. Los genes hrp y hrc no se suelen expresar en medios de crecimiento
Introducción
42
ricos, pero sí que se expresan en medios mínimos con pH ácido cuya composición sea
similar a los compuestos presentes en el apoplasto vegetal (Alfano y Collmer, 1997).
Figura 17. Representación esquemática del SST3 en Xcc (Gottig et al., 2010).
En las bacterias patógenas de plantas el SST3 es codificado por los genes hrp
(Hypersensitive response and pathogenicity) y hrc (Hypersensitive response and
conserved) los últimos se denominan así debido a que se encuentran altamente
conservados entre los distintos géneros bacterianos ya sean patógenos de animales como
de plantas; además presentan similitudes con genes del flagelo. Por esta razón su
estructura es similar, con forma de pelo de 100-200 nm (Figura 17) orientado hacia el
exterior celular. Los genes hrp y hrc no se suelen expresar en medios de crecimiento
ricos, pero sí que se expresan en medios mínimos con pH ácido cuya composición sea
similar a los compuestos presentes en el apoplasto vegetal (Alfano y Collmer, 1997).
En Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc) el SST3 es codificado por un clúster de genes
de respuesta hipersensible y patogenicidad (hrp). La expresión de estos genes está
controlada por las proteínas HrpX y HrpG, mutantes en los genes que codifican para
estas proteínas han mostrado pérdida de patogenicidad. Estas proteínas regulan la
expresión de genes relacionados con diversas funciones celulares, como son
supervivencia en la planta, resistencia frente a las defensas vegetales, sustratos del
sistema de secreción tipo 2 (SST2) que incluyen enzimas de degradación de la pared
Introducción
43
celular, y hasta 21 genes relacionados con regulación en Xcc y un factor sigma (rpoE)
entre otros. HrpG controla de forma negativa la expresión de reguladores tales como
rpfG que está relacionado con quorum sensing (Guo et al., 2011).
La proteína de mayor importancia en Xcc secretada por este sistema es la proteína PthA,
y sus homólogos en otras Xanthomonas causantes de chancro en cítricos. PthA,
pertenece a la familia AvrBs3/PthA de reguladores transcripcionales y modula la
regulación génica de la planta; en cítricos induce división celular que deriva en
hiperplasia y posterior necrosis del tejido vegetal. Este mecanismo libera nutrientes al
apoplasto que son asimilados por el patógeno permitiendo el crecimiento de la
población bacteriana en el interior de la planta y su posterior dispersión. Mutantes de
Xcc en este gen o sus homólogos no son capaces de inducir lesiones ni de aumentar su
población en el tejido vegetal. X. alfalfae subsp. citrumelonis (Xac) agente causal de la
mancha bacteriana de los cítricos, que carece de esta proteína, es capaz de inducir
lesiones tipo chancro cuando PthA es expresada de forma artificial, al igual que sucede
en Eschericha coli o incluso si está proteína es expresada en plantas de cítricos hay
aparición de lesiones tipo chancro en la zona transformada. La proteína PthA además
induce necrosis en las células epidérmicas cercanas a la zona de infección lo que
permite a las células salir y crear nuevas infecciones en la planta.
A pesar de la existencia de distintos genes pth en las distintas Xanthomonas causantes
de chancro, ninguno de ellos ha demostrado estar relacionado con la especificidad de
huésped que existe en los distintos patotipos de esta enfermedad (Escalon et al., 2013).
Está descrito que mutantes en pthA de Xcc que no son capaces de producir síntomas en
cítricos cuando son transformados con los genes pthAw y pthA* procedentes de cepas de
limitada gama de huésped producen síntomas tanto en lima mejicana como en pomelo
Duncan. En el caso de Xcc tipo Aw y en todas las cepas de Xcc de tipo A*, menos las
procedentes de Irán, el gen avrGf/XopAG es el causante de la respuesta hipersensible
que tiene lugar en hojas pomelo cuando son inoculadas por infiltración (Rybak et al.,
2009; Escalon et al., 2013). Un fenómeno similar se ha comprobado en X. fuscans
subsp. aurantifolia (Xfa) tipo C, el gen xopAG de la familia avrGf1 restringe la gama de
huésped este patógeno a lima mejicana, Xfa tipo B posee también este gen, pero en este
caso está truncado por un transposón. Las cepas A* aisladas en Irán carecen de este gen
y sin embargo ninguna de ellas produce lesiones en naranjo dulce o pomelo, por lo que
se piensa que deben existir otros efectores de virulencia u otros procesos relacionados
Introducción
44
con el avance de la enfermedad cuya implicación en la gama de huésped se desconoce
actualmente (Moreira et al., 2010; Escalon et al., 2013).
Xcc posee 26 efectores de virulencia, siendo 19 los comunes a todas las especies
productoras de chancros, independientemente de la zona geográfica y el rango de
huésped. Existen dos efectores de virulencia que solo están presentes en las cepas de
limitada gama de huésped, el efector XopAG mencionado anteriormente y del que
existen ortólogos en cepas de X. campestris, Xfa (chancros tipo B y C) y X. citri pv.
bilvae, que además produce respuesta hipersensible en naranjo dulce y pomelo, y el
efector XopC1 presente únicamente en las cepas tipo A* que presenta alta homología
con el mismo efector de X. euvesicatoria. La delección de este gen sin embargo, no
presenta un efecto significativo en la evolución de la cepa A* en planta, además
tampoco presenta ningún efecto en virulencia (Escalon et al., 2013). En la cepa Aw
parece que el gen xopAF es importante para el crecimiento del patógeno en plantas tanto
huésped como no huésped (Jalan et al., 2013a).
Un estudio reciente ha mostrado la importancia del SST3 en la formación de
biopelículas, así como en la colonización de la filosfera y como ya se había descrito
antes en virulencia. El SST3 no parece influir en las primeras etapas de adhesión a
planta, sin embargo las biopelículas formadas por los mutantes en el operón hrpB son
más estrechas y menos estructuradas. Además parece influir en el crecimiento en planta
y la expresión de un gran número de procesos relacionados con virulencia como la
motilidad o la producción de exopolisacárido (Zimaro et al., 2014).
4.2. Exopolisacárido: goma xanthana
Los exopolisacáridos son secretados como un material licuoso o encapsulado y parecen
contribuir a la enfermedad a través de la retención de agua en los espacios
intercelulares, protegiendo a la bacteria de compuestos antimicrobianos o de señales
activadoras de las defensas de las plantas (Denny, 1995). Además en X. campestris
participan en la formación de biopelículas (Dow et al., 2003) y juegan un papel el la
supresión de las defensas de las plantas impidiendo la deposición de callosa (Yun et al.,
2006).
El exopolisacárido secretado por el género Xanthomonas es la goma xanthana o
xanthano, un polímero formado por unidades repetidas de pentasacáridos con estructura
manosa-(β-1,4)-ácido glucurónico-(β-1,2)-manosa-(α-1,3)-celobiosa (Jansson et al.,
Introducción
45
1975). Se caracteriza por ser altamente higroscópico permitiendo a la bacteria conservar
la humedad y superar los estreses abióticos a los que está sometida en la superficie
vegetal. Es necesario para la supervivencia y multiplicación en planta participando en la
formación de biopelículas (Rigano et al., 2007). Existen varios genes implicados en la
producción de exopolisacáridos, entre ellos los genes gum y galU. Mutantes en el gen
que codifica para la proteína que polimeriza los pentasacáridos (gumB) no eran capaces
de producir biofilm en hojas de limón. Además, al contrario que la cepa silvestre, que
era capaz de aumentar su población en dos unidades logarítmicas tras 24 horas de la
inoculación, la población del mutante gumB en Xcc decrecía con el tiempo (Rigano et
al., 2007). Sin embargo el gen gumD, que participa en la síntesis de exopolisacáridos,
no parece estar implicado en virulencia, aunque sí en supervivencia en la superficie
vegetal (Dunger et al., 2007). Otro gen relacionado con la producción de
exopolisacáridos es galU que está implicado en la síntesis de exopolisacáridos,
crecimiento en planta y producción de síntomas en pomelo.
El clúster de los genes gum posee características de isla de patogénesis puesto que posee
un contenido en G+C que difiere del resto y además a pesar de que las secuencias
colindantes sean similares a Stenotrophomonas malthophila, incluido el gen que
codifica para el ARN de transferencia, esta bacteria carece del clúster gum por lo que es
posible que sean el resultado de una adaptación a la planta (Lima et al., 2008; Lu et al.,
2008).
Los genes gum parecen estar relacionados con su virulencia en limonero (Citrus limon)
(Rigano et al., 2007), pero no en naranjo (Citrus sinensis) (Dunger et al., 2007; Laia et
al., 2009).
4.3. Regulación tipo quorum sensing
El quorum sensing es un mecanismo de regulación de la expresión génica dependiente
de la densidad de bacterias. El aumento de la población bacteriana supone la activación
o represión de la expresión de determinados genes, por ejemplo de aquellos
relacionados con patogénesis como es el caso de la goma xanthana. El sistema quorum
sensing en Xanthomonas está mediado por proteínas DSF (Difussible signal factor)
expresados por genes rpf. Este sistema regula de forma positiva la producción de
exopolisacáridos, de enzimas extracelulares como proteasas, endoglucanasas y también
Introducción
46
de otros genes relacionados con virulencia (Dow et al., 2003; Dow et al., 2000a; He et
al., 2006).
En Xanthomonas campestris está descrito que los altos niveles de DSF se producen en
las fases exponencial tardía y estacionaria del crecimiento (Dow et al., 2000a). Los DSF
son secretados como autoinductores del quorum sensing y se unen de forma directa o
indirecta al dominio N-terminal de RpfC. Esta unión produce la autofosforilación del
dominio histidín kinasa de RpfC. El grupo fosfato liberado podrá unirse a RpfG
modulando la actividad del dominio HD-GYP que conlleva a la activación de genes
relacionados con la actividad endoglucanasa, proteasa y la producción de
exopolisacárido (Andrade et al., 2006). Xcc posee todos los genes necesarios para la
regulación por quorum sensing, además se ha demostrado que son importantes para la
formación de biopelículas tanto en planta como in vitro así como para la virulencia del
patógeno (da Silva et al., 2002; Guo et al., 2012; Huang et al., 2013). De hecho plantas
de naranjo dulce y carrizo cintrange (Citrus sinensis 'Washington' x Poncirus trifoliata)
transformadas con el gen rpfF de Xylella fastidiosa mostraron una disminución de
síntomas cuando fueron inoculadas con Xcc (Caserta et al., 2014).
4.4. Enzimas Pectolíticas
Las enzimas pectolíticas presentan gran importancia en virulencia para muchos
patógenos vegetales puesto que son las causantes de la muerte celular y la maceración
del tejido vegetal. Los productos de degradación de la pared vegetal son capaces de
inducir los mecanismos de defensa de la planta, por lo tanto estas enzimas participan en
otros procesos relacionados con la interacción planta-patógeno (Collmer y Keen, 1986;
Esquerré-Tugayé et al., 2000).
Xcc posee tres pectato liasas, seis celulasas, cinco xilanasas, dos poligalacturonasas y
una endoglucanasa que son secretadas a través del SST2, también posee una permeasa
que le permite importar al interior pectinas degradadas (da Silva et al., 2002; Brunings y
Gabriel, 2003). La actividad pectato liasa de la cepa Xcc 306 es mayor que la de la cepa
Xcc Aw
12879, lo que puede influir en su virulencia (Jalan et al., 2013a). Sin embargo
estas enzimas no son suficientes para degradar el tejido vegetal, siendo necesaria una
previa secreción de PthA que induzca necrosis celular en la planta para que las células
puedan multiplicarse en el espacio intercelular (Brunings y Gabriel, 2003).
Introducción
47
Por otro lado la presencia de algunas enzimas pectolíticas en Xcc como Pel1,
conservadas en el género Xanthomonas (similitud de secuencia del 80%) parece estar
relacionada con la formación de manchas de agua durante la infección. Otras enzimas
pectolíticas (Pel2 y Pel3) o poligalacturanasas (Peh1 y Peh2) no parecen realizar
actividad pectolítica en esta especie (Lin et al., 2010).
4.5. Lipopolisacáridos
El lipopolisacárido (LPS) es una molécula anfipática que forma parte de la superficie
más externa de las bacterias Gram (-). Se encuentra dividida en tres partes, el lípido A,
la región central y el antígeno O, que es el componente inmunodominante de la
superficie bacteriana. El LPS es importante para la interacción de la bacteria con el
huésped tanto en plantas como animales, habiendo sido identificado como PAMP
(pathogen-associated molecular pattern). El LPS obtenido de Xcc produce la
deposición de callosa, activación de especies reactivas de oxígeno y el cierre de los
estomas en hojas de naranjo, además induce la expresión de genes relacionados defensa
de plantas (Casabuono et al., 2011).
La estructura del LPS presente en Xcc muestra grandes variaciones cuando es
comparada con la estructura de otras Xanthomonas, además existen diferencias en el
clúster que codifica para la formación del LPS entre Xcc 306 y Xcc Aw 12879,
presentando ésta última similitud del 50% con Xcc 306 y el otro 50% con X. oryzae pv.
oryzicola (Jalan et al., 2013a). Estas variaciones pueden ser importantes a la hora del
establecimiento la infección, por ejemplo, diferencias en los ácidos grasos pueden
permitir que el patógeno supere las defensas del hospedador (Casabuono et al., 2011;
Dow et al., 2000b). Xcc 306 posee un clúster formado por 16 genes que se han descrito
como implicados en la síntesis de LPS (da Silva et al., 2002; Yan et al., 2012). Dentro
de este clúster el gen nlxA parece codificar para una rhamnoltransferasa, el gen wtz
codifica para la proteína de unión de ATP en transportadores ABC, wxacO es una
proteína transmembrana encargada del ensamblaje y secreción de exopolisacáridos,
rfbC parece ser un glicosil-transferasa que participa en la síntesis de exopolisacáridos.
Estos y otros genes pertenecientes al clúster de genes relacionados con biosíntesis de
lipolisacáridos participan en la virulencia de Xcc posiblemente por la implicación del
LPS en motilidad, formación de biopelículas, producción de exopolisacáridos y
supervivencia (resistencia a compuestos fenólicos y peróxido de hidrógeno) (Casabuono
et al., 2011; Laia et al., 2009; Li y Wang, 2011a; Petrocelli et al., 2012; Yan et al.,
Introducción
48
2012). La producción de LPS protege al patógeno de radiación ultravioleta, variación de
la temperatura, desecación, presencia de compuestos detergentes, compuesto químicos
entre los que se encuentran dodecyl sulfato sódico (SDS), poliximina-B, peróxido de
hidrógeno, fenol, sulfato de cobre, y sulfato de zinc y de estrés osmótico, térmico y
oxidativo. Mutantes deficientes en producción de LPS no son capaces de sobrevivir en
la superficie vegetal siendo únicamente capaces de producir síntomas cuando son
inoculados por infiltración (Yan et al., 2012). En las Xanthomonas causantes de los
chancros tipo B y C (X. fuscans subsp. aurantifolii), que son menos virulentas que Xcc,
el gen wtz carece del extremo C-terminal de la proteína siendo probable que ésta sea una
de las causas de su reducida virulencia (Moreira et al., 2010b; Petrocelli et al., 2012).
4.6. Motilidad
Xcc produce movimiento tipo swimming y es capaz de moverse en placas con 0,7% de
agar en superficie, existiendo discrepancia entre los autores sobre si este movimiento es
swarming o sliding. Está descrito que mutantes de Xcc carentes de flagelina, que ven
disminuida su habilidad en swimming no presentan variaciones en virulencia; en cambio
mutantes en flgE que codifica para el gancho del flagelo sí que ven disminuida su
virulencia, además de su capacidad para hacer swimming. Lo que sí que está demostrado
es la implicación del flagelo en la formación de agregados y biofilm, tanto en
superficies inertes como en planta (Malamud et al., 2011).
4.7. Hemaglutinina filamentosa y Sistema de Secreción Tipo V
El Sistema de secreción tipo V (SST5) transporta proteínas de gran tamaño o dominios
proteicos, en su mayoría adhesinas y hemolisinas, que median la adhesión bacteriana y
que poseen una estructura primaria similar. Existen diversos tipos de SST5, el
autotransportador,tipo 5a, el transportador de dos componentes, tipo 5b y el tipo 5c. Las
hemaglutininas son secretadas por el transportador de dos componentes en el que
participan la proteína transportada y la transportadora. En un primer paso la proteína es
transportada al periplasma mediante el sistema de secreción Sec pasando posteriormente
a través del transportador que modifica la proteína permitiendo su plegamiento y
activación. La activación consiste en la pérdida del dominio C-terminal mediante
proteólisis, la energía requerida para el transporte de la proteína se cree que proviene de
la energía emitida durante el plegamiento de la misma (Gottig et al., 2010; Henderson et
al., 2004).
Introducción
49
En Xcc la hemaglutinina es codificada por el gen fhaB, que es secretada mediante el
sistema de transporte de dos componentes (SST5b) que comprende la proteína FhaC;
además posee otros dos marcos de lectura abiertos a continuación de fhaB y fhaC que
por similitud de secuencias han sido descritos como hemaglutininas, pero que carecen
de la secuencia en el extremo N-terminal y no son funcionales. Este mismo fenómeno
también se ha observado en X. campestris pv. vesicatoria (da Silva et al., 2002; Gottig
et al., 2009; Mhedbi-Hajri et al., 2011a). La hemaglutinina FhaB posee un papel
importante en virulencia en las primeras etapas de la infección puesto que media la
adhesión entre la bacteria y el tejido vegetal y está relacionada con la supervivencia en
el interior del apoplasto. Esta hemaglutinina es secretada por la porina FhaC, aunque es
posible que exista un mecanismo alternativo de secreción puesto que los mutantes en
FhaC presentan un fenotipo intermedio para adherencia o fitness en planta o superficies
abióticas, e infección mediante pulverización. Estos mutantes se comportan de forma
similar al de la cepa silvestre respecto a la motilidad tipo swarming, inoculación por
infiltración, formación de biopelículas y crecimiento en planta (Gottig et al., 2009).
4.8. Sistema de secreción tipo II
El sistema de secreción tipo II (SST2) se descubrió por primera vez en Klebsiella
pneumoniae en 1987 como pululanasas y lipoproteínas hidrolizadoras de almidón
(d'Enfert et al., 1987). Realiza el transporte de proteínas desde el citoplasma al espacio
extracelular en dos etapas; en un primer paso las proteínas pasan al periplasma mediante
sistemas de secreción dependientes de Sec o mediante la ruta Tat (twin–arginine
traslocation) en función de la secuencia del péptido señal. Desde el espacio
periplasmático las proteínas, tras perder la zona correspondiente al péptido señal, pasan
a través del SST2 al exterior celular (Jha et al., 2005). En la mayoría de las bacterias
patógenas de plantas, entre ellas los géneros Erwinia, Pseudomonas, Xanthomonas,
Xylella y Ralstonia, realiza el transporte de toxinas y enzimas hidrolíticas entre las que
se encuentra celulasas, poligalacturonasas, xilanasas y proteasas, proteínas encargadas
de la degradación de la pared celular de las plantas (Jha et al., 2005; Johnson et al.,
2006).
Posee una estructura similar al pilus tipo IV, puesto que es capaz de formar un
pseudopili que suele permanecer en el espacio periplasmático, posiblemente debido a la
falta de estabilidad de las pseudopilinas que lo conforman. Este aspecto las diferencia
del pilus tipo IV, cuyas pilinas se estabilizan mediante puentes disulfuro mientras que
Introducción
50
las pseudopilinas del SST2 lo hacen con iones Ca2+
(Cisneros et al., 2012). El SST2
consta de tres partes esenciales para el proceso de secreción (Figura 18), la primera de
ellas es la secretina, que junto con otras proteínas determina la especificidad del sustrato
a secretar. En la membrana externa el SST2 posee un complejo formado por varias
copias de una misma proteína que permite el paso del sustrato a secretar, por último el
pseudopilus funciona a modo de pistón impulsando las proteínas desde el periplasma al
exterior celular a través del complejo de la membrana externa (Johnson et al., 2006;
Reichow et al., 2011).
Figura 18. Modelo de secreción a través del SST2 de Vibrio cholerae, en la
imagen la tóxina del cólera AB5 está siendo secretada por este sistema
(Johnson et al., 2006).
En la formación y función de este sistema de secreción y pseudopilus participan entre
12 y 16 genes que generalmente se encuentran en un único clúster de genes presente en
el género Xanthomonas. X. campestris pv. vesicatoria (Xcv), Xc y Xcc poseen dos
clústeres de genes denominados xps y xcs que codifican para dos sistemas de secreción
distintos (da Silva et al., 2002; Lu et al., 2008) que no parecen ser parálogos entre sí, es
decir, han sido adquiridos de forma distinta sin que haya habido un mecanismo de
duplicación, pero sí que son ortólogos entre las cepas mencionadas anteriormente. El
clúster xcs está formado por una única unidad transcripcional con 13 marcos de lectura
abiertos y parece haber sido adquirido de forma horizontal. El clúster xps consiste en 12
genes pertenecientes a dos unidades transcripcionales (Brunings y Gabriel, 2003). Los
Introducción
51
dos SST2 de P. aeruginosa transportan distintos tipos de compuestos, lo que le confiere
una mayor adaptación a distintos ambientes. Es posible que las Xanthomonas que
poseen dos SST2 muestren una mejor adaptación al medio (Jha et al., 2005).
Se ha descrito que el SST2 de algunas Xanthomonas es capaz de traslocar amilasas,
proteasas, xilanasas y poligalacturonasas, existiendo cierta especificidad por el sustrato,
puesto que los SST2 de algunas Xanthomonas, como X. campestris pv. vesicatoria no
secretan determinadas proteínas (Chen et al., 2005; Ray et al., 2000; Szczesny et al.,
2010; Wang et al., 2008; Yamazaki et al., 2008).
En Xcc, mutantes en el gen xpsD, que codifica para las proteínas del complejo de la
membrana externa del SST2, se describió que carecían de actividad celulasa y eran
únicamente capaces de desarrollar síntomas de forma tardía al compararse con la cepa
silvestre, disminuyendo además su crecimiento en planta. Estas variaciones fueron
producidas por una disminución en la secreción de enzimas degradadoras de la pared
celular (Baptista et al., 2010).
4.9. Presencia de Péptido Natriurético
Los péptidos natriuréticos están presentes en animales y plantas, son moléculas que
presentan actividad biológica a concentraciones muy bajas. En animales están
relacionados con el balance de agua y sales de los órganos (Gottig et al., 2010), mientras
que en planta favorecen la apertura de estomas y por lo tanto el intercambio de gases, el
aumento de los niveles de cGMP en las células, y la modulación en los niveles de los
iones potasio, sodio y protones. Además los péptidos natriuréticos de planta (PNPs)
están relacionados con la regulación homeostática en tejidos vegetales y crecimiento
(Nembaware et al., 2004).
En planta, esta proteína se expresa en condiciones de estrés osmótico y carencia de
potasio. Se ha encontrado tanto en el proteoma del apoplasto como del xilema (Gottig et
al., 2010). El limonero rugoso (Citrus jambhiri) expresa PNPs cuando está afectado por
la enfermedad del decaimiento de los cítricos, que afecta a la homeostasis de la planta
produciendo marchitez en los brotes. La expresión de esta proteína tiene lugar en los
primeros momentos de la interacción, disminuyendo la disponibilidad de agua y
nutrientes para el patógeno (Nembaware et al., 2004).
Introducción
52
Xcc contiene un gen que codifica para un péptido natriurético que se expresa durante el
proceso infectivo. La transcripción de este gen parece comenzar a las 24 horas de la
inoculación y se incrementa a lo largo del tiempo (Garavaglia et al., 2010a; Nembaware
et al., 2004). No se ha observado la presencia de este gen en otras especies del género
Xanthomonas. Los estudios bioinformáticos que se han realizado para comparar esta
proteína con el péptido natriurético de Arabidopsis thaliana AtPNP-A muestran que
ambas tienen un péptido señal en el extremo N-terminal de la proteína que dirige el
péptido al espacio extracelular. Además presentan una zona altamente conservada entre
los aminoácidos 33 y 66 que corresponde al dominio relacionado con homeostasis. La
comparación de la estructura terciaria de ambas proteínas también ha mostrado un
plegamiento similar en el dominio N-terminal. Estas similitudes sugieren que ambas
proteínas tienen la misma función biológica. Se piensa que la adquisición de este gen
tuvo lugar de forma horizontal después de que esta proteína divergiera de la familia
proteica de las extensinas (Nembaware et al., 2004).
El mecanismo de acción de este péptido en Xcc está basado en la modificación de
parámetros fotosintéticos y del proteoma de la planta. Cuando el péptido se infiltra en
hojas de cítricos actúa sobre la hidratación del tejido disminuyendo el potencial hídrico
de la hoja y mejorando el transporte de electrones a través del fotosistema II.
Normalmente al disminuir el potencial hídrico en las hojas disminuye también el
rendimiento del fotosistema II. Además induce en planta la expresión de proteínas como
el activador de la Rubisco, ATP sintasas, la maturasa K y las α y β tubulinas
(Garavaglia et al., 2010a; Garavaglia et al., 2010b; Gottig et al., 2008). Cuando se
inocula la planta con mutantes de la bacteria carentes del péptido natriurético la
expresión de genes relacionados con fotosíntesis se reduce (Garavaglia et al., 2010a) de
lo que se deduce que éste péptido permite mantener el rendimiento metabólico de la
planta.
Mutantes en el gen que codifica para el péptido natriurético en Xcc mostraron el mismo
número y tamaño de lesiones que la cepa silvestre cuando fueron inoculadas por
infiltración en hojas de naranjo, sin embargo el tejido infectado presentaba mayor nivel
de necrosis que la cepa silvestre produciendo una disminución en la población del
patógeno. Este fenómeno se revertía al complementar el mutante tanto con el péptido de
Xcc como con el de A. thaliana AtPNP-A, confirmando que tanto la proteína de Xcc
como la de arabidopsis cumplen funciones similares (Gottig et al., 2008).
Introducción
53
Xcc es un patógeno biótrofo que, como se ha mencionado anteriormente, necesita estar
en contacto con la planta hospedadora para sobrevivir (Graham et al., 2004) y para ello
tiene que evitar los mecanismos de defensa de ésta tales como la inducción de muerte
celular programada (Garavaglia et al., 2010a). La secreción del péptido natriurético de
Xcc permite que el tejido infectado se mantenga vivo lo cual posibilita la supervivencia
del patógeno.
4.10. Presencia del enzima fosfoglucosa isomerasa
La fosfoglucosa isomerasa es un enzima que cataliza de forma reversible la
isomerización de la glucosa-6-fosfato y la fructosa-6-fosfato. Se ha descrito que
mutantes en Xcc muestran perdida de virulencia en hojas de limonero siendo incapaces
de crecer en medios mínimos con fructosa y glicerol como única fuente de carbono
(Tung y Kuo, 1999).
4.11. Resistencia a especies reactivas de oxígeno
Al igual que muchos patógenos vegetales Xcc tiene que hacer frente a las defensas de
las plantas para establecer la infección, la producción de especies reactivas de oxígeno
(ROS, en adelante) es una de ellas. Las bacterias poseen diversas enzimas que se
encargan de la detoxificación de estos compuestos, entre ellas se encuentran las
catalasas que transforman el peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno. Los niveles de la
actividad catalasa en Xcc se duplican cuando el cultivo pasa a fase estacionaria
manteniéndose constantes al menos hasta 48 horas. En naranjo dulce (Citrus sinensis cv.
Valencia) mutantes en la catalasa monofuncional KatE, que manifestaron sensibilidad a
ROS, mostraron un número reducido de lesiones posiblemente debido a la baja
supervivencia del patógeno en el apoplasto (Tondo et al., 2010). Por otro lado se ha
descrito la presencia de una ferredoxina-NADP+ reductasa, que se acumula en presencia
de ROS cuyo papel en virulencia no se ha demostrado todavía (Tondo et al., 2011).
4.12. Proteína LOV
Las bacterias son capaces de captar señales del medio en el que viven y reaccionar ante
ellas. Una de estas señales es la luz, muchas especies bacterianas poseen fotorreceptores
capaces de percibir longitudes de onda en los rangos del rojo y rojo lejano que utilizan
para regular su metabolismo. Además perciben longitudes de onda en el rango de
ultravioleta y el ultravioleta lejano que inducen la producción de pigmentos con el fin de
Introducción
54
evitar las modificaciones en el ADN causadas por esta radiación o favoreciendo la
reparación del mismo. También son capaces de percibir longitudes de onda en el rango
del azul a través de dos fotorreceptores denominados BLUF (del inglés blue ligth
sensing using FAD) y LOV (de luz, oxígeno y potencial o voltaje, del inglés ligth,
oxygen or voltaje), este último regula varios procesos en muchas especies bacterianas,
entre ellos adhesión celular, respuesta a estrés, síntesis de di-GMP cíclico y virulencia
(Herrou y Crosson, 2011).
Xcc posee tres posibles fotorreceptores de luz azul, dos que presentan similitud con
proteínas BLUF y uno con la proteína LOV (da Silva et al., 2002; Van Sluys et al.,
2002). En esta especie bacteriana la proteína LOV parece estar implicada en diferentes
procesos como la motilidad, la producción de exopolisacáridos, la adhesión y la
formación de biopelículas y virulencia. La luz juega un papel importante en formación
de biopelículas favoreciendo la formación de agregados y en virulencia, puesto que en
oscuridad el tejido inoculado se necrosa al igual que sucede con el mutante en la
proteína LOV en condiciones de luz y oscuridad. Respecto al resto de los procesos
celulares no parece haber diferencia de fenotipo en presencia o ausencia de luz
(Kraiselburd et al., 2012).
5. Motilidad y quimiotaxis
Las bacterias fitopatógenas han evolucionado de forma que aprovechan el contenido de
las células vegetales, el protoplasto, para su desarrollo y supervivencia. Para poder
acceder a estas fuentes de nutrientes primero deben colonizar el interior del tejido
vegetal, puesto que las células presentes en la superficie de la planta están protegidas
por celulosa en las raíces y ceras y cutícula en las de las partes aéreas. Las principales
vías de entrada de los patógenos al apoplasto, son los estomas y las heridas, aunque
también puede tener lugar a través de hiátodos, como sucede en X. campestris pv.
campestris (Hugouvieux et al., 1998) y lenticelas. Existen bacterias, como Xylella
fastidiosa que penetran en la planta a través de las heridas causadas por el insecto que
las transporta (Chatterjee et al., 2008), sin embargo la mayoría de las bacterias
fitopatógenas tiene que hacerlo a través de heridas o estomas en procesos en los que
juega un papel importante la motilidad tipo swimming (Agrios, 2005). El movimiento
que tiene lugar hacia las entradas de la planta normalmente es mediado por quimiotaxis,
Introducción
55
que permite a las bacterias dirigirse hacia los ambientes más favorables para su
desarrollo y alejarse de aquellos que sean nocivos para ellas (Adler, 1966).
La superficie foliar no es homogénea, existen zonas con mayor cantidad de nutrientes
que otras, o con mayor exposición a agentes deletéreos que pueden influir en el
comportamiento y desarrollo de las bacterias en su superficie (Monier y Lindow, 2003).
De esta manera, se ha descrito que Xcc en superficie vegetal no se distribuye de forma
aleatoria sino que se dirige hacia nichos determinados que favorecen su supervivencia y
la entrada al interior de la planta (Figura 19) (Cubero et al., 2011).
Figura 19. Imágenes en microscopía con focal de Xcc inoculada en mandarina a distintos tiempos
marcadas con la proteína GFP estable (plásmido PUFZ75) y la proteína GFP inestable (LVA,
plásmido PUFZLVA). En las distintas imágenes se puede observar la distribución de las bacterias
en la superficie del fruto a distintos tiempos, mostrando que Xcc no se distribuye de forma
aleatoria, sino que se dirige hacia zonas determinadas (Cubero et al., 2011).
Los fenómenos de quimiotaxis y motilidad se han estudiado en varias especies
bacterianas tanto patógenas como no patógenas de plantas, siendo un factor importante
para la colonización. Ralstonia solanacearum coloniza las raíces de sus plantas huésped
mediante procesos de motilidad dependiente del flagelo mediados por quimiotaxis. Sin
embargo una vez ha colonizado la raíz y comienza a distribuirse a través del xilema la
motilidad no es importante para que se produzca la infección (Yao y Allen, 2006; Yao y
Allen, 2007). Dickeya dadantii necesita la presencia de un flagelo mótil y de
quimiotaxis para producir infección en hojas de endibia. En este patógeno se ha
Introducción
56
demostrado que la entrada a través de heridas es dependiente del ácido jasmónico que
funciona como quimioatrayente, habiéndose descrito las proteínas sensoras para este
compuesto (Antunez-Lamas et al., 2009a; Antunez-Lamas et al., 2009b; Río-Álvarez et
al., 2014).
La alta expresión génica de genes relacionados con motilidad y quimiotaxis que tiene
lugar cuando P. syringae se desarrolla de forma epífita en la superficie de hoja de judía,
y la represión de dichos genes cuando esta bacteria ha colonizado el apoplasto, sugiere
la necesidad de la bacteria de moverse en la superficie foliar en busca de nutrientes y
condiciones más óptimas para su supervivencia y de llegar al estoma para colonizar el
apoplasto (Yu et al., 2013).
Las bacterias son capaces de moverse en distintos medios, normalmente sus
movimientos son dirigidos hacia zonas apropiadas para su desarrollo a través de los
sistemas de quimiotaxis. En función del medio en el que se encuentren, las bacterias
realizan distintos tipos de movimiento, que pueden ser dependientes del flagelo comolos
movimientos swimming y swarming, o ser dependientes de otras estructuras diferente al
flagelo como el pilus tipo IV que posibilitan los movimentos el twitching y gliding,
además existen otros tipos de movimiento como sliding o darting (Henrichsen, 1972).
5.1. Motilidad dependiente del flagelo
El flagelo es la estructura que más se ha relacionado con motilidad y quimiotaxis en
bacterias, además está implicado en virulencia, adhesión a superficies y posterior
formación y dispersión de biopelículas (Soutourina y Bertin, 2003). Posee una
estructura helicoidal anclado a la membrana bacteriana mediante el cuerpo basal y unido
al motor que permite su movimiento (Figura 20) y puede tener una longitud de hasta 15
µm y un diámetro de 0,02 µm (Jarrell y McBride, 2008; Rossez et al., 2015). Posee una
estructura altamente compleja formada por un gran número de proteínas distintas, cuya
expresión se encuentra altamente regulada dado el alto requerimiento energético
necesario para su síntesis (Jarrell y McBride, 2008). La homología entre los distintos
grupos de proteínas que la componen y su similitud con el SST3 sugieren que esta
estructura ha surgido mediante la duplicación y diferenciación de sus genes, siendo el
producto de miles de años de evolución (Evans et al., 2014; Pallen y Matzke, 2006). La
estructura del flagelo se ha estudiado ampliamente tanto en Salmonella como en E. coli,
siendo bastante similar a la de la mayoría de las bacterias salvo por pequeñas
Introducción
57
modificaciones. Además hay géneros bacterianos que poseen más de un sistema flagelar
como es el caso de Aeromonas o Vibrio entre otros (McCarter, 2004). Estas bacterias
poseen un flagelo polar similar al del resto de las bacterias y flagelos laterales cuyas
secuencias difieren de la del flagelo polar y son codificadas por los genes laf. Los
flagelos laterales participan en swarming, pero no en swimming, participando además en
colonización y formación de biopelículas. Este sistema está relacionado con la adhesión
a células animales en Aeromonas causantes de diarrea y a las cubiertas de quitina
presentes en los crustáceos en Vibrio (Kirov et al., 2002; Kirov et al., 2004; McCarter,
2001; McCarter, 2004).
Figura 20. Visualización de flagelos en Xcc Aw
12879. A y B, microscopía electrónica de
transmisión de bacterias incubadas en placas de LB durante 48h. C y D, microscopía
óptica de bacterias en biopelículas de 72 h, teñidas mediante tinción de flagelos, C
magnificación 1000x y D ampliación digital de la imagen con magnificación 1000x. En
ambas imágenes se puede observar la presencia de un único flagelo polar que tiene forma
helicoidal y puede ser de longitud variable, llegando a ser casi 10 veces el tamaño de la
bacteria. Fotos realizadas por Marta Sena Vélez.
El filamento del flagelo es una estructura helicoidal que funciona como propulsor de la
bacteria y está formado por varias subunidades iguales de flagelina (FliC), a razón de
Introducción
58
once unidades por cada dos vueltas de la hélice, que componen los once profilamentos.
En algunos casos puede tener otras subunidades menores presentes. Además en el
extremo terminal del filamento se encuentra la proteína HAP2 (Proteína asociada al
gancho del inglés Hook Associated Protein) que forma la cubierta del mismo y es
necesaria para una correcta formación del filamento (Galkin et al., 2008; McCarter,
2001; Rossez et al., 2015; Vonderviszt et al., 1995). El filamento tiene una estructura
rígida cuya forma depende de la secuencia aminoacídica, el pH, la fuerza iónica y la
torsión del mismo que puede ser rizada cuando el motor gira en sentido opuesto a las
agujas del reloj o semienroscada si gira en el sentido de las agujas del reloj (Berg,
2003).
El gancho o garfio es una estructura corta, curva, más o menos flexible que une el
filamento al cuerpo basal de flagelo. Está formado por alrededor de 120 copias de una
proteína única denominada FlgE y dos proteínas asociadas HAP1 y HAP3, que unen el
filamento con el gancho y sirven de adaptadores tanto estructurales como mecánicos. El
filamento presenta una estructura más o menos rígida y el garfio posee una estructura
más flexible que le permite transmitir el movimiento desde el motor al filamento y
funcionar además, junto con el cuerpo basal, como exportador de componentes
estructurales y reguladores como el factor anti-σ-FlgM (McCarter, 2001; Samatey et al.,
2004). El ensamblaje tanto del filamento como del gancho tiene lugar de forma similar,
a partir de once protofilamentos, sin embargo las subunidades de flagelina que
conforman el filamento presentan en su mayoría estructuras de α-hélice, mientras que
las subunidades del gancho lo hacen en láminas-β. Esta variación confiere mayor
flexibilidad al gancho y una mayor rigidez al filamento que le permite funcionar como
propulsor (Vonderviszt et al., 1995; Samatey et al., 2004).
El cuerpo basal consiste en una estructura central con complejos protéicos en forma de
anillo, se encuentra embebido en la membrana bacteriana (DePamphilis y Adler, 1971;
Jarrell y McBride, 2008). Esta estructura se encarga de la exportación de los
componentes del flagelo como las proteínas del eje central y el gancho a traves de las
membrana interna y externa (Minamino y Macnab, 1999) y contiene el motor flagelar
(Berg, 2003).
Introducción
59
Figura 21. Estructura del flagelo de E. coli y S. enterica y diversidad de algunos de
los genes implicados en su formación y estructura (Pallen et al., 2005).
Los anillos que posee esta estructura se encuentran en las distintas zonas de la
membrama bacteriana, el anillo L se encuentra embebido en el lipolisacárido presente
en la membrana externa, y parece estar relacionado con el transporte de los
componentes del gancho y el filamento, el anillo P se encuentra en la capa de
peptidoglicano. Estos dos anillos solo están presentes en bacterias Gram negativas dada
la estructura de su membrana (Figura 22) (DePamphilis y Adler, 1971; Jarrell y
McBride, 2008; Minamino y Macnab, 1999).
El anillo MS se localiza entre la membrana citoplasmática y el espacio periplasmático y
el anillo C en el citoplasma, ambos anillos participan en la secreción de todos los
sustratos relacionados con la formación del flagelo y en la rotación del mismo. Las
Introducción
60
proteínas presentes en el anillo C activan y controlan la dirección de giro del flagelo
(Berg, 2003; Minamino et al., 2008).
Figura 22. Microscopía electrónica de transmisión de los flagelos purificados de E. coli (A) y B. subtilis
(B). En las imágenes se pueden ver las diferentes estructuras de los cuerpos basales, modificado de
(DePamphilis y Adler, 1971). (C) Modelo del sistema de exportación de las proteínas del flagelo a través
del cuerpo basal (Minamino y Macnab, 1999).
El motor flagelar mide alrededor de 50 nm de diámetro, está compuesto por varios tipos
de proteínas, es capaz de girar a unas 100.000 rpms cuando la energía se obtiene a
través de protones y a 18.000 rpms cuando utiliza iones sodio (Minamino et al., 2008;
Jarrell y McBride, 2008). Posee cuatro partes principales, el rotor formado por los
anillos MS y C, el eje de accionamiento que corresponderá con el eje central del cuerpo
basal y el cojinete que está formado por los anillos L y P (Minamino et al., 2008). El
estátor se compone de once o doce complejos MotA y MotB que son proteínas
transmembrana que permiten el paso de protones hasta el citoplasma. La energía
producida con el paso de los iones genera una fuerza electrostática que se transmite al
rotor, se produce un cambio conformacional en MotA y activa el giro del rotor a través
de la proteína FliG del anillo C produciendo un par de torsión que producirá el giro del
flagelo (Minamino et al., 2008; Thormann y Paulick, 2010). Además de las proteínas
MotA y MotB existen otras proteínas relacionadas con la generación de energía para el
giro. En algunas especies de Vibrio o Aeromonas la energía se genera a través del paso
de iones sodio, siendo las proteínas que permiten el paso PomA y PomB, que parecen
actuar junto con MotC y MotD para favorecer la interacción. En Vibrio además la
energía para el giro de los flagelos laterales proviene del paso de protones (McCarter,
2001; Thormann y Paulick, 2010). En el caso de P. aeruginosa existen dos tipos de
Introducción
61
estátores, cualquiera de los dos es válido para el movimiento tipo swimming, sin
embargo no son redundantes para el movimiento tipo swarming, siendo más importante
el estátor MotCD, además parecen influir en el twitching y en la adhesión a superficies
(Toutain et al., 2005; Toutain et al., 2007). En P. syringae pv. tabaci el comportamiento
parece ser distinto puesto que el estátor MotCD parece influir más en swimming,
swarming y adhesión a superficies (Kanda et al., 2011). En Xcc y X. campestris pv.
campestris existen los genes correspondientes a los dos tipos de estátores, sin embargo
no se ha descrito su papel en motilidad o adhesión (da Silva et al., 2002; Thormann y
Paulick, 2010).
El ensamblaje tiene lugar mediante el paso de las distintas proteínas a través del cuerpo
basal que posee una estructura similar al SST3. Las primeras proteínas que se
ensamblan son los anillos MS y C que forman el canal que atraviesan el resto de las
proteínas. Las distintas subunidades recién sintetizadas se transportan hacia la entrada
donde se linearizan y se estabilizan con chaperonas específicas para cada subunidad,
posteriormente atraviesan en esta forma todo el canal hasta el lugar donde se tienen que
ensamblar. El ensamblaje tiene lugar desde dentro hacia afuera, primero el eje
transversal, el gancho, la cubierta del filamento o HAP2 y finalmente el filamento desde
la zona distal hasta las subunidades más cercanas a la membrana. La traslocación de las
diferentes subunidades a través de la membrana requiere hidrólisis de ATP y fuerza
protomotriz (Evans et al., 2014).
La complejidad del flagelo y el gran número de proteínas que participan en su
formación hacen que sea un proceso altamente regulado. Los genes que codifican para
las distintas proteínas se encuentran regulados en forma de cascada, de manera que
primero se activan los genes que regulan la formación del flagelo, posteriormente los
que componen el cuerpo basal, el sistema de secreción, el gancho y los genes que
activan la transcripción de las flagelinas, finalmente los genes relacionados con
quimiotaxis y el motor flagelar. Aunque en esencia la regulación del flagelo sigue unas
pautas similares para todas las especies bacterianas existen variaciones en el tipo de
reguladores y determinadas proteínas en función del tipo de flagelación que presente la
bacteria, perítrica o polar (Soutourina y Bertin, 2003). La regulación del flagelo se ha
descrito para X. campestris pv. campestris cuyo proceso se puede ver en la Figura 23
(Yang et al., 2009), la describiremos a continuación y posteriormente la compararemos
con otros sistemas de regulación.
Introducción
62
Figura 23. Modelo de la cascada de regulación para la formación del flagelo en Xc. Modificado de Yang
et al. 2009.
En X. campestris la regulación del flagelo tiene lugar en forma de cascada (Figura 23).
Los primeros genes dentro de esta cascada son los dependientes de RpoN/FleQ, que
regulan la expresión de genes relacionados con el sistema de secreción flagelar
(fliEFGHIJ, fliLMNOP y fliQR), el eje central (flgBCDEF), el gancho (flgGHIJKL) y
los reguladores fliA (factor σ28
), fleN y flhF. Estos dos últimos genes están relacionados
en P. aeruginosa con la cantidad y distribución de flagelos en la bacteria (Dasgupta et
al., 2000). Además parece regular también la expresión de las proteínas FlhA y FlhB
que forman parte del sistema de secreción, entrando en contacto con las histonas que
estabilizan las distintas subunidades del flagelo (Evans et al., 2014). Mutantes en los
genes para estas dos proteínas ven reducida la transcripción de la flagelina y de fliA
(únicamente FlhB). Es posible que al no estar formado el sistema de secreción haya
acumulación de la proteína FlgM que se une a FliA impidiendo la regulación de los
genes de la flagelina. FlgM pertenece también a la Clase I de reguladores junto con
RpoN y FleQ, permanece unido a FliA hasta que es secretada a través del sistema de
secreción flagelar. Los genes que se activan en último lugar son dependientes de FliA,
esta proteína activa 21 genes, entre los que se encuentran la flagelina, y otros genes
relacionados con el motor flagelar y quimiotaxis. Además regula de forma positiva
cinco proteínas con dominio GGDEF y una con dominio HD-GYP, que están
relacionadas con la síntesis y degradación de diGMPc pudiendo regular la motilidad a
través de este sistema (He y Zhang, 2008; Mole et al., 2007; Yang et al., 2009).
Introducción
63
En P. aeruginosa la cascada de regulación posee cuatro niveles, a diferencia que en X.
campestris pv. campestris la transcripción de los genes relacionados con la formación
del gancho tiene lugar en un paso posterior. Al igual que en Xanthomonas en la clase I
se encuentran FleQ y RpoN, además de FliA cuya transcripción parece ser
independiente de los reguladores de clase I y II. Al igual que en Xc la regulación de los
genes dependientes de FliA se activa con la secreción de FlgM. En esta especie un
sistema de regulación de dos componentes, FleSR parece regular la transcripción de los
genes del gancho (Figura 24) (Dasgupta et al., 2003).
Figura 24. Modelo de regulación de la formación del flagelo en P. aeruginosa. Los símbolos (+)
significan regulación positiva y los (-) regulación negativa. (Dasgupta et al., 2003)
La principal diferencia entre la flagelación perítrica y la polar es la presencia de los
reguladores FleN/FlhG que controlan la activación de los genes dependientes de FleQ
evitando la formación de nuevos flagelos, además la posición del flagelo es controlada
por FlhF (Dasgupta et al., 2000; Kazmierczak y Hendrixson, 2013), tanto E. coli como
Salmonella carecen de estos genes que controlan el número y posición de flagelos
(McCarter, 2001).
Los movimientos realizados por las bacterias dependientes del flagelo son el swimming
y el swarming:
Introducción
64
Motilidad tipo swimming 5.1.1.
El swimming es el movimiento realizado por las bacterias en medio líquido o medio
semisólido (agar a una concentración de 0,3% o menor). La velocidad que pueden
alcanzar las bacterias en este medio puede llegar hasta 160 µm s-1
, aunque E. coli se
suele mover a una velocidad de entre 25 y 35 µm s-1
, la velocidad puede variar en
presencia de un compuesto quimioatrayente. Durante el swimming las bacterias realizan
dos tipos de movimientos, desplazamientos en línea recta denominados carreras y
cambios de dirección que se realizan mediante volteretas o tumbos. En un medio neutro
las carreras y tumbos son realizados de forma aleatoria, sin embargo en presencia de un
compuesto o estímulo atrayente las bacterias alargan sus carreras en la dirección de éste
orientándose mediante tumbos, si el estímulo fuera repelente, en vez de acercarse se
alejarían (Berg y Brown, 1972; Deepika et al., 2014; Jarrell y McBride, 2008; Larsen et
al., 1974). Larsen en 1974 describió que el flagelo giraba en sentido contrario a las
agujas del reloj cuando se dirigía hacia un compuesto atrayente y en sentido de las
agujas del reloj cuando el compuesto era repelente. Estudios posteriores mostraron que
cuando la bacteria se mueve en línea recta el giro del flagelo se realiza en el sentido
contrario a las agujas del reloj y cuando el sentido de uno o más flagelos cambia se
produce un tumbo y un redireccionamiento de la carrera. Normalmente los cambios en
el sentido del giro del flagelo son aleatorios, sin embargo en presencia de compuestos
determinados se activa el sistema de quimiotaxis que mediante una cadena de
fosforilación desde las MCPs y a través de las proteínas Che hacen que se produzca el
cambio en el giro del motor flagelar (Berg, 2003).
La motilidad tipo swimming es importante en la virulencia de muchas bacterias
patógenas o no de plantas y animales. Para colonizar las raíces de tomate y poder
penetrar en el interior de las mismas R. solanacearum requiere motilidad tipo
swimming, sin embargo una vez ha colonizado el xilema la motilidad dependiente del
flagelo no es necesaria (Tans-Kersten et al., 2001; Yao y Allen, 2006).
Motilidad tipo swarming 5.1.2.
El swarming se ha descrito como la translocación bacteriana que tiene lugar rápida y
coordinadamente en una superficie semisólida (Kearns, 2010; Tremblay y Deziel,
2010). Este tipo de movimiento permite a una población bacteriana colonizar nuevos
nichos rápidamente, activando genes relacionados con virulencia tanto en patógenos
Introducción
65
animales como vegetales así como en bacterias beneficiosas para las plantas (Pearson et
al., 2010; Verstraeten et al., 2008; Xu et al., 2012). La morfología más característica de
las colonias de swarming es el patrón dendrítico, sin embargo existen diversos patrones
que pueden realizar las bacterias en función de su especie, y las características del
medio, como la cantidad de nutrientes, el porcentaje de agar o la humedad del medio
(Figura 25).
Figura 25. Patrones descritos para la motilidad tipo swarming. A: B. subtilis. Este
patrón se produce cuando las células se dispersan de forma continua en la placa, es
difícil de ver a simple vista; B: Proteus mirabilis. En este tipo de patrón se
produce un crecimiento discontinuo de la colonia que está marcado por los
diferentes halos de crecimiento; C: P. aeruginosa. Se produce por la secreción de
distintos agentes surfactantes que interaccionan entre sí dando este patrón; D:
Paenibacillus vortex. Este patrón se caracteriza por el desplazamiento de grupos
de bacterias de forma circular, puede ser debido a la morfología curva de esta
bacteria; E: mutante de B. subtilis que ha perdido la capacidad de hacer swarming.
En este caso se produce el crecimiento de una colonia en el lugar de inoculación y
movimiento tipo sliding; F: mutante supresor de B. subtilis incapaz de hacer
swarming que presenta un crecimiento en la placa provocado por células que ha
conseguido recuperar el fenotipo del swarming (Kearns, 2010).
Las células swarmer en general se caracterizan por ser hiperflageladas, llegando a
doblar el número de flagelos en su superficie, por presentar aumento de tamaño y
multinucleación. En Proteus mirabilis el tamaño de la célula swarmer puede llegar a ser
hasta 40 veces mayor que la célula vegetativa, además se produce la secreción de
Introducción
66
agentes surfactantes que favorecen el desplazamiento en la superficie y regulación tipo
quorum sensing, puesto que el swarming es un comportamiento poblacional
(Verstraeten et al., 2008). Sin embargo P. aeruginosa no produce flagelos laterales,
únicamente produce dos flagelos polares (Köhler et al., 2000; Rashid y Kornberg,
2000), además es capaz de realizar swarming en medios con altas concentraciones de
agar en ausencia de flagelo y pili tipo IV, siendo por lo tanto uno de los factores más
importantes la producción de rhamnolípidos (Takahashi et al., 2008). Sin embargo en P.
syringae pv. tabaci el pilus tipo IV parece ser esencial para este movimiento (NGUYEN
et al., 2012). Los géneros Vibrio y Aeromonas poseen un flagelo polar necesario para la
motilidad tipo swimming y flagelos laterales que son utilizados en el movimiento tipo
swarming (Kirov et al., 2002; McCarter, 2004; Kirov et al., 2004).
El cambio de estado vegetativo a célula swarmer parece estar relacionado con el sistema
de transducción de señales de quimiotaxis a través del motor flagelar y con otros
sensores de superficie que son similares a las MCPs. Además el reconocimiento de
superficies puede tener lugar por variaciones en el lipopolisacárido de la membrana
bacteriana. En S. typhimurium el flagelo, además, es un sensor de la humedad presente
en el medio activando el paso a célula swarmer. Esta transición requiere un tiempo de
adaptación en la bacteria denominado “swarm lag” que es variable en función de la
especie bacteriana y posiblemente el medio. Hay casos en los que este tiempo es tan
largo que para inducir swarming en placa, las bacterias necesitan ser repicadas de una
placa de swarming y ser inoculadas en una nueva (Anderson et al., 2010; Belas, 2014;
Burkart et al., 1998; Kearns, 2010).
Durante las primeras etapas del swarming se incrementa la transcripción de los
reguladores iniciales de la formación del flagelo como flhDC en P. mirabilis o lafK o el
operón scrABC para la síntesis de flagelos laterales en V. parahaemolyticus, sin
embargo en algunas especies no parece observarse diferencias en la transcripción de los
genes relacionados con el flagelo sugiriéndose además una regulación post-
transcripcional para E. coli o Salmonella (Kearns, 2010; Patrick y Kearns, 2012;
Verstraeten et al., 2008). Durante la fase lag se produce también el aumento de tamaño
en la célula, en Proteus y Vibrio se ha observado que en esta etapa se inhibe la
expresión de genes relacionados con la formación del septum, lo que da lugar a células
multinucleadas. Además se activan genes que se han relacionado con la organización de
las membranas lipídicas y el peptidoglicano (Pearson et al., 2010). Otra característica
Introducción
67
importante para el movimiento tipo swarming es la producción de agentes surfactantes
que en muchos casos es dependiente del sistema de quorum sensing, por lo que para
poder realizar este movimiento se requiere una densidad poblacional alta, también se ha
descrito que en P. syringae es dependiente de FleQ, el regulador inicial del flagelo. Los
agentes biosurfactantes o surfactantes en general son moléculas anfipáticas como
lípidos, glicolípidos o lipopéptidos que facilitan el desplazamiento en superficie
disminuyendo la tensión superficial entre el medio y la bacteria. Entre los surfactantes
descritos en bacterias se encuentran los rhamnolípidos en P. aeruginosa, la
syringafactina en P. syringae y el HAA (3-(3-hidroxialcanoiloxi) ácido alcanóico) en
ambas especies, además se ha descrito la serrawetina para S. liquifaciens o surfactina en
B. subtilis (Kearns, 2010; Köhler et al., 2000; Verstraeten et al., 2008; Xu et al., 2012).
5.2. Motilidad tipo sliding
El sliding se describe como la translocación en superficie como resultado de las fuerzas
expansivas que tienen lugar durante el crecimiento de una colonia bacteriana en un
cultivo semisólido en combinación con propiedades específicas de la superficie celular
que reducen la fricción entre el medio y la bacteria (Henrichsen, 1972). Este tipo de
movimiento se ha descrito en varias especies bacterianas como las mycobacterias, o
Alcaligenes odorans y en mutantes carentes de flagelo y pili tipo IV de Pseudomonas
cuya translocación no se puede relacionar con swarming o twitching (Henrichsen, 1972;
Martínez et al., 1999; Murray y Kazmierczak, 2008).
Durante el sliding, las bacterias se encuentran unidas mediante fibras que no se han
relacionado con fimbrias o pili. Mycobacterium suele formar pseudofilamentos, aunque
las células también se encuentran unidas de forma lateral. Las bacterias del frente de
avance parecen no encontrarse unidas por fibras y son empujadas por aquellas que se
encuentran en la zona colonizada, que presentan un grado mayor de agregación
(Martínez et al., 1999). El desplazamiento en la superficie es facilitado por la presencia
de compuestos anfipáticos en la cubierta celular, en el caso de Mycobacterium existen
componentes específicos en su membrana que facilitan este proceso. Además las
células, durante este movimiento, parecen estar cubiertas por una masa mucosa cuya
composición es desconocida. En el caso de los mutantes en flagelo y pili tipo IV de P.
aeruginosa la producción de agentes surfactantes es esencial para este tipo de
movimiento, siendo también necesario para Serratia y Bacillus. Un artículo reciente
describe en mutantes no flagelados de S. enterica un desplazamiento distinto del sliding
Introducción
68
porque no hay producción de agentes surfactantes, y demuestran que es dependiente de
la concentración de magnesio, del sistema de dos componentes PhoP/PhoQ y de la
proteína PagM (Martínez et al., 1999; Murray y Kazmierczak, 2008; Park et al., 2015).
En P. aeruginosa el sliding parece estar reprimido en presencia de pili tipo IV, puesto
que este favorece la agregación celular. Además al igual que el swarming parece ser
dependiente de los niveles de diGMPc y de otros sistemas como GacA/GacS y RetS
(Murray y Kazmierczak, 2008). Mutantes en fleQ de P. fluorescens realizan un
movimiento en superficie de carácter dendrítico no dependiente del flagelo y en
presencia de pili tipo IV, este movimiento se ha considerado sliding por ser dependiente
de la viscosina, el surfactante de esta bacteria promotora del crecimiento en plantas
(Alsohim et al., 2014).
5.3. Movimiento tipo twitching
El movimiento tipo twitching es dependiente de pili tipo IV y de su capacidad de
elongación y retracción. El mecanismo por el que se produce el twitching está basado en
la unión no específica del pilus a una zona del tejido y la posterior retracción del mismo,
lo cual permite el desplazamiento de la bacteria hasta la zona donde el pilus se ancló
previamente (Craig et al., 2004). Este movimiento permite una rápida colonización del
huésped o de nichos determinados, favoreciendo al virulencia en muchos patógenos, así
como la formación de biopelículas o agregados y los cuerpos fructíferos de géneros
como Myxococcus (Mattick, 2002).
El movimiento tipo twitching puede tener lugar en superficies tanto orgánicas como
inorgánicas y aunque para efectuarlo la bacteria necesita alta concentración de
nutrientes, sus requerimientos de humedad son más bajos que los de los movimientos
descritos anteriormente (Mattick, 2002). Normalmente las bacterias se mueven en
grupos unidas a lo largo de su eje longitudinal, sin embargo hay casos en los que puede
haber desplazamientos realizados por bacterias individuales (Burrows, 2012). Se ha
descrito que cepas de Ralstonia solanacearum que presentan movimiento tipo twitching,
son capaces de migrar en placas de agar a las 20 horas de la inoculación cuando las
colonias no son todavía visibles (Figura 26). Las estructuras que se forman son similares
a zarcillos y varían en función de la cepa ensayada. Cuando la colonia es visible el
twitching no se puede observar debido al crecimiento celular y la producción de
exopolisacárido que lo enmascara. Este hecho no sucede en P. aeruginosa PAO1 donde
Introducción
69
las colonias siguen expandiéndose y la formación típica de twitching no se ve
enmascarada (Liu et al., 2001).
Figura 26. Evolución de una colonia en R. solanacearum, que presenta movimiento tipo twitching a
distintas horas del cultivo. Barra 2 mm (Liu et al., 2001).
El papel del twitching en virulencia puede verse enmascarado por otros factores como la
adhesión y formación de biopelículas en los que participa el pilus tipo IV. En algunos
casos la importancia de este movimiento es más clara, como en Dichelobacter nodosus,
donde mutantes que codifican para la ATPsa relacionada con este movimiento
mostraron una reducción de su virulencia (Burrows, 2012). En P. syringae pv. tabaci
6605 se ha demostrado que este movimiento es también importante para la virulencia.
En este patógeno para que tenga lugar el twitching es necesario que los pili se
encuentren glicosilados, sin embargo para adhesión y formación de biopelículas los pili
tipo IV no necesitan estar glicosilados. Cuando se inocula por inmersión hojas de tabaco
con el mutante en la glicosiltransferasa no hay desarrollo de la enfermedad, sin embargo
cuando es infiltrado si hay producción de síntomas (Nguyen et al., 2012).
X. citri subsp. citri es capaz de realizar este tipo de movimiento en medios nutritivos al
1% de agar, comprobándose que son dependientes de la presencia de pili tipo IV, sin
embargo hasta ahora no se ha demostrado su relación con la virulencia (Dunger et al.,
2014).
Otros movimientos en superficie dependientes del pili tipo IV son el denominado
walking descrito como aquél en el que la bacteria se mueve de forma perpendicular a la
superficie con baja persistencia direccional y a alta velocidad para explorar
microambientes, y el llamado crawling descrito como movimiento longitudinal de la
bacteria en una misma dirección (Conrad et al., 2011). Además existe un movimiento
similar al twitching realizado por myxobacterias, cianobacterias, Cytophaga,
Flavobacterium y micoplasmas, que es variable en función del grupo bacteriano que lo
Introducción
70
realice y se denomina gliding y solo en algunos casos es dependiente de pili tipo IV.
Aunque este movimiento en principio pueda considerarse similar al twitching, en
Myxococcus se ha dividido en dos tipos que se realizan de forma conjunta, un
movimiento social, que es dependiente de pili tipo IV y un movimiento individual en
superficies poco húmedas, que parece basarse en la propulsión producida por la
secreción de exopolisacárido. En el caso de Flavobacterium el movimiento parece
generarse a través de motores situados en la membrana bacteriana que desplazan
adhesinas a lo largo de la superficie (Jarrell y McBride, 2008; McBride, 2001).
5.4. Quimiotaxis
La supervivencia de las bacterias está determinada por su capacidad para adaptarse y
colonizar nuevos nichos. Poder reconocer un nicho determinado adaptando su desarrollo
a ese medio confiere ventaja ecológica frente a otros microorganismos que no poseen
esa cualidad, incluso aunque tengan los medios apropiados para poder sobrevivir en
tales condiciones. Como hemos mencionado antes, en muchas bacterias el motor
flagelar sirve como sensor de superficies, lo que conduce a activar los mecanismos de
movimiento en superficie o adhesión a dicha superficie. La carencia de este mecanismo
impide la adaptación de la bacteria a su nuevo modo de vida y los cambios necesarios
para su supervivencia haciéndola menos competitiva en ese medio. X. alfalfae subsp.
citrumelonis es un patógeno de cítricos que únicamente produce síntomas en hojas de
plantas jóvenes, siendo incapaz de infectar frutos. Estudios realizados en nuestro
laboratorio han mostrado que a pesar de ser capaz de pasar a un modo de vida sésil en
hojas formando biopelículas, en fruto no se ha observado ningún tipo de agregación por
parte de este patógeno. Este patógeno no es capaz de reconocer el huésped en el que se
encuentra y no pone los medios apropiados para asegurar su supervivencia (Sena-Vélez
et al., 2014).
La quimiotaxis es el mecanismo de percepción de señales del ambiente que permite a la
bacteria adoptar el comportamiento adecuado, generalmente una respuesta mótil, a las
variaciones producidas en el medio en el que se encuentra. Los procesos de quimiotaxis
permiten a las bacterias dirigirse hacia zonas o compuestos más adecuados para su
desarrollo, evitando compuestos repelentes o dañinos para ellas. Este comportamiento
fue descrito por primera vez a finales del siglo XIX, cuando Engelmann observó
mediante microscopía que las bacterias tendían a dirigirse y acumularse en zonas con
altas concentraciones de oxígeno como las burbujas o algas, además observó que en
Introducción
71
presencia de compuestos deletéreos para ellas, las bacterias huían y colonizaban las
zonas con menos acumulación de dicho químico (Miller et al., 2009). Dado que las
bacterias, por su tamaño, no pueden percibir gradientes, producen desplazamientos
aleatorios en el medio en el que se encuentran hasta percibir variaciones en la
concentración de uno o varios compuestos además otras características como el pH o la
osmolaridad. En presencia de un compuesto quimioatrayente las carreras que tienen
lugar durante el movimiento tipo swimming se alargan en dirección al compuesto,
disminuyéndose el número de tumbos que se realizan. En presencia de un repelente el
número de cambios de dirección es mayor aunque las carreras son más largas a medida
que se alejan del compuesto. En la naturaleza las bacterias están expuestas a una gran
cantidad de estímulos y eso implica que no solo influye la concentración de un solo
atrayente o repelente sino el balance de factores que puedan afectar a su supervivencia
(Miller et al., 2009; Porter et al., 2011).
La quimiotaxis es un factor importante en la virulencia de muchos patógenos tanto
vegetales como animales, así como en bacterias beneficiosas para las plantas (Porter et
al., 2011). Recientemente en Xcc se ha descrito mediante la mutación de distintos genes,
que la quimiotaxis juega un papel importante para el establecimiento de la infección.
Yaryura y colaboradores describieron que el mutante en el regulador XbmR veía
disminuida su capacidad infecciosa respecto a la cepa silvestre, además este mutante se
encontraba afectado en motilidad tipo swimming, formación de biopelículas y
quimiotaxis frente a extractos de hoja de pomelo. En este artículo, sin embargo se
discute si tanto la formación de biopelículas como la quimiotaxis podía ser un efecto
secundario de la falta de motilidad tipo swimming (Malamud et al., 2011; Yaryura et al.,
2015).
Sistema de transducción de señales que dirige a una respuesta quimiotáctica 5.4.1.
La percepción de un compuesto o quimioefector por parte de las bacterias da lugar a un
sistema de transducción de señales basado en el paso de fosfatos a través de las
proteínas Che, que producen un cambio en el sentido de giro del flagelo y un cambio en
la dirección de la bacteria mediante un tumbo. El sistema de quimiotaxis más estudiado
hasta ahora es el de E. coli, y aunque se encuentra bastante conservado en todos los
grupos bacterianos existen algunas excepciones. Por ejemplo, B. subtilis posee proteínas
accesorias no encontradas en E. coli, algunas de las cuales están también presentes en
los genomas de Xanthomonas. Además se ha descrito en diversas especies bacterianas
Introducción
72
sistemas de quimiotaxis alternativos que regulan la formación de biopelículas y
estructuras de resistencia como los quistes formados por Myxococcus, Azospirillum o
Azotobacter, motilidad basada en los pili tipo IV y producción de exopolisacárido entre
otros. Hasta la fecha sólo unos pocos han sido estudiados. En P. aeruginosa existen
cuatro rutas de quimiotaxis que regulan la respuesta quimiotáctica perse, el swarming,
el twitching, la virulencia y la formación de biopelículas, cada uno de estos sistemas
posee sus propios sensores que son homólogos a las MCPs (Tabla 3) (da Silva et al.,
2002; He y Bauer, 2014; Miller et al., 2009; Porter et al., 2011).
Tabla 3. Proteínas relacionadas con quimiotaxis en Xanthomonas patógenas de cítricos comparadas con
Pseudomonas y E. coli.
Organismo MCP CheW CheA CheR CheB CheV CheD CheZ Total
X. axnopodis pv. citri 306 22 5 4 3 5 1 1 1 42
X. axnopodis pv. citri 29_1 25 6 4 3 5 1 1 1 46
X. citri subsp. citri 12879 Aw
25 6 4 3 6 1 1 1 47
X. alfalfae subsp. citrumelonis 24 6 4 3 5 1 1 1 45
P. aeruginosa PAO1 26 7 4 4 4 1 1 1 48
P. putida KT2440 27 6 3 3 3 3 0 1 46
Escherichia coli 55989 5 1 1 1 1 0 0 1 10
Como se ha descrito anteriormente, el número de MCPs y sistemas de transducción de señales es menor
en E. coli que en el resto de las bacterias, además se observan diferencias incluso entre cepas
correspondientes a la misma especie, como es el caso de las X. citri subsp. citri. Los datos han sido
obtenidos de la base de datos MiST2 Database (Ulrich y Zhulin, 2010). La totalidad de los genes que
codifican para las proteínas de la tabla están presentes en el genoma.
Dado que es el sistema de transducción de señales más estudiado y que es común a la
mayoría de las especies bacterianas, describiremos como modelo el sistema de E. coli.
En esta especie la señal proviene de las proteínas aceptoras de grupos metilo (MCPs),
que en general poseen dominios sensores periplásmicos y dominios señalizadores en el
citoplasma. Normalmente se encuentran formando dímeros de la misma MCP asociados
en grupos de tres MCPs distintas en los polos de la bacteria (Figura 27). Estos conjuntos
de MCPs se encuentran unidos a una única proteína de unión CheW y a CheA que es
una histidín quinasa. Cuando los sensores unen un ligando o quimioefector se produce
Introducción
73
un cambio conformacional que se transmite al espacio citoplásmatico. Las interacciones
alostéricas que tienen lugar en este conjunto de proteínas producen una ampliación de la
señal de quimiotaxis, lo que permite a la bacteria percibir variaciones muy pequeñas en
la concentración del quimioefector. La histidín quinasa CheA produce la fosforilación
de CheY y CheB, la proteína CheY fosforilada (en la figura CheY-P) se desplaza hasta
el motor flagelar donde se une a las proteínas que controlan la dirección de giro del
flagelo (FliM y FliN) cambiando la dirección de giro del mismo y provocando un tumbo
y un cambio de dirección en la trayectoria de la bacteria. Finalmente la proteína CheY
es desfosforilada mediante la fosfatasa CheZ, siendo susceptible de recibir nuevamente
la señal de la MCP. Las proteínas CheR y CheB producen la metilación y desmetilación
del receptor MCP respectivamente. CheR que se encuentra activa de forma constitutiva,
añade grupos metilo a los dominios de metilación conservados en los quimiorreceptores
desde una S-adenosilmetionina.
Figura 27. Sistema de transducción de señales quimiotácticas
en E. coli. Modificado de (Bi y Lai, 2015).
Por otro lado cuando la proteína CheB recibe el grupo fosfato de CheA produce la
desmetilación del quimiorreceptor. Este proceso de metilación-desmetilación tiene una
fase de latencia que le confiere a la bacteria memoria a corto plazo, esta memoria le
Introducción
74
permite comparar la concentración del quimioefector en el área donde se encuentra con
la percibida anteriormente (Baker et al., 2006; Bi y Lai, 2015; He y Bauer, 2014; Miller
et al., 2009; Porter et al., 2011).
Proteínas aceptoras de grupos metilo 5.4.2.
Las proteínas aceptoras de grupo metilo o MCPs son sensores de moléculas o
compuestos químicos entre los que se encuentran aminoácidos, azúcares e incluso
metales pesados como el níquel o el cobre en bacterias y arqueas. Las MCPs están
altamente relacionadas con el movimiento de la bacteria puesto que son capaces de
inducir cambios el sentido de giro del flagelo y en la dirección de la carrera de la
bacteria.
Figura 28. Estructura de ensamblaje de las unidades sensoras en bacterias. Modificado de (Bi y Lai, 2015)
Las MCPs poseen un dominio de unión a ligandos cuya estructura es variable, que se
encuentra generalmente en el espacio periplasmático, un dominio transmembrana que
transforma la señal con un dominio HAMP, y un dominio de señalización que se
encuentra en el citoplasma que es el que controla la fosforilación. Este dominio se
subdivide en la zona de metilación, un dominio flexible y una zona de contacto de
proteínas. Los quimiorreceptores se agrupan en trímeros formados por tres MCPs
distintas con dos subunidades de una misma MCP (Figura 27), cada trímero va unido a
una proteína CheW y CheA. La agrupación de estos complejos tiene lugar de forma que
las proteínas CheA y CheW forman hexámeros mediante interacciones hidrofóbicas.
Los hexámeros a su vez se encuentran unidos a los trímeros de MCPs formando una
unidad funcional. Las unidades funcionales se unen entre sí formando una red que
Introducción
75
compone el sistema sensorial de la bacteria, localizado en los polos de la misma (Figura
28) (Bi y Lai, 2015).
El número de MCPs en las bacterias es variable y es dependiente del medio en el que se
encuentran y el tamaño del genoma de las mismas (Lacal et al., 2010b). Las arqueas
poseen de media 6,7 MCPs y las bacterias una media de 13,9 MCPs por genoma.
Magnetospirillum magnetotacticum posee 64 MCPs, mientras que E. coli únicamente 4
MCPs. Especies bacterianas como E. coli, cuyo nicho es muy específico o son
patógenos estrictos, tienen un bajo número de MCPs, y sin embargo bacterias del suelo,
agua o rizosfera poseen mayor número, debido a la variabilidad y complejidad tanto
física como química que poseen los medios que colonizan (Alexandre et al., 2004;
Miller et al., 2009).
Figura 29. Clasificación de MCPs en seis grupos descrita por Lacal y col en 2010 (Lacal et al., 2010b) y
abundancia de los distintos grupo en bacterias. LBR indica la región de unión a ligandos (del inglés
ligand binding residues) y MA significa zona de metilación.
La topología de las distintas MCPs es variada y ha llevado a establecer una clasificación
en 6 grupos que se muestran en la Figura 29. En estas proteínas la región de unión a
ligandos puede estar presente o ausente y dentro o fuera de la membrana bacteriana.
Como se puede ver en la figura, el modelo más abundante es el Ia en el que la región de
unión a ligandos está en el espacio periplásmico flanqueada por dos hélices
Introducción
76
transmembrana. La función de las MCPs o receptores que son completamente
citoplasmáticos puede estar relacionada con la monitorización de los niveles energéticos
en la bacteria (Alexandre, 2010; Lacal et al., 2010b; Bi y Lai, 2015).
Los quimiorreceptores están compuestos de una región de unión a ligandos (LBR del
inglés ligand binding residues) y un dominio señalizador. La región de unión a ligandos
es variable en tamaño, clasificándose en Clúster I aquellas LBR que tienen un tamaño
entre 120 y 210 aminoácidos, y en el Clúster II aquellas LBR cuyo tamaño esté
comprendido entre 220 y 300 aminoácidos. Estas últimas pueden tener dos módulos
estructurales que reconocen distintos tipos de ligandos (Lacal et al., 2010b), como
sucede en la proteína McpS de Pseudomonas putida KT2440, que une compuestos
intermediarios del ciclo de los ácidos tricarboxílicos (Lacal et al., 2010a) y acetato
(Pineda-Molina et al., 2012). Además los distintos módulos pueden unir su ligando sin
que la unión a uno de los módulos impida la unión del ligando al otro (Pineda-Molina et
al., 2012).
Se han descrito diferentes estrategias de percepción de señales por parte de las MCPs y
no todas ellas se basan en el reconocimiento directo del ligando. Existen mecanismos
descritos en los que tiene lugar la unión de distintas moléculas, ya sea con más de una
región de unión de ligandos o mediante la unión del complejo formado por el ligando y
una proteína secretada (Pineda-Molina et al., 2012).
La quimiotaxis y el reconocimiento de una señal no se encuentran siempre asociado al
consumo de los quimioefectores por parte de la bacteria. En muchos casos la señal
percibida por la bacteria es simplemente un indicativo de de la existencia de un nicho
apropiado para su desarrollo (Alexandre y Zhulin, 2001). D. dadantii, presenta
quimioatracción frente al ácido jasmónico, siendo esta sustancia únicamente un
indicativo de que hay una herida en la planta por la que puede penetrar y producir
infección (Antunez-Lamas et al., 2009b; Río-Álvarez et al., 2014). De hecho, el primer
tipo de quimiotaxis descrito fue el independiente del metabolismo, que es aquel en el
que el quimioefector no es metabolizado por la bacteria. Este tipo de quimiotaxis
cumple las pautas descritas por Adler para la quimiotaxis, análogos no metabolizables
de quimioatrayentes metabolizables son también atrayentes y la mutación de genes
implicados en el metabolismo del compuesto no suele alterar la quimiotaxis hacia dicho
compuesto. Por último los quimioefectores son atrayentes en presencia de otros
compuestos metabolizables. Se ha comprobado, sin embargo, que estos postulados no
Introducción
77
siempre se cumplen, hay casos en los que los quimioefectores han de ser metabolizados
para producir una respuesta, siendo los subproductos de este metabolismo los que
realmente producen dicha respuesta.
El reconocimiento de un quimioefector y su gradiente puede tener lugar mediante las
variaciones energéticas que se producen en la célula en presencia del compuesto. Este
proceso es mediado por el sistema de transporte de electrones y se le denomina taxis
energética, o en inglés energy taxis. En este tipo de taxis el nicho óptimo para las
bacterias es aquel en el que el rendimiento metabólico de las mismas es mayor. Las
variaciones energéticas no son solo debidas al metabolismo de compuesto químicos,
sino que pueden tener lugar además por la presencia de luz, aceptores finales de
electrones, o compuestos con actividad redox, considerándose además la aerotaxis como
un tipo de taxis energética (Alexandre, 2010; Alexandre y Zhulin, 2001).
6. Formación de Biopelículas
Las bacterias en su medio natural pueden encontrarse en forma libre o planctónica, o
estar asociadas en agregados formando una comunidad organizada. Se puede describir
biopelícula o biofilm como un conjunto de comunidades bacterianas sésiles adheridas a
superficies y con estructura más o menos tridimensional. Como grupo de bacterias
coordinadas entre sí presentan un comportamiento similar a un organismo multicelular
con altas tasas de transmisión génica, cooperación y estratificación. Las biopelículas
confieren a las bacterias múltiples ventajas frente al modo de vida planctónico,
favoreciendo la supervivencia de la población. Cuando las bacterias se encuentran
organizadas en biopelículas pueden llegar a ser hasta mil veces más resistentes a
antibióticos y condiciones deletéreas del medio. La formación de agregados organizados
permite a las bacterias colonizar un nicho o huésped apropiado para su desarrollo
(Busscher y van der Mei, 2012; Petrova y Sauer, 2012).
Xcc es capaz de agregarse y formar biopelículas tanto en superficies bióticas como
abióticas, esta estructura protege a las bacterias de las distintas condiciones adversas
que se pueden producir en la superficie vegetal como son la desecación, la presencia de
compuestos antimicrobianos y otros mecanismos de defensa de la planta, además
favorece la comunicación intercelular, el crecimiento en medios poco nutritivos o en la
hoja o fruto (Rigano et al., 2007), favoreciendo a su vez la generación de diversidad
Introducción
78
dentro de las población de la biopelícula (Boles et al., 2004). El proceso de infección
está directamente relacionado con el tamaño de la población en la superficie, y la
formación de lesiones puede depender de la efectividad de la bacteria para adherirse y
formar de biopelículas en la superficie vegetal (Rigano et al., 2007; Cubero et al., 2011).
6.1. Etapas en la formación de biopelículas
En un primer paso las bacterias se adhieren únicamente al tejido, lo que algunos autores
denominan biopelículas monocapa (Figura 30). Posteriormente, en función de las
condiciones ambientales, pueden pasar a un estado de adhesión irreversible y a
continuación formar una biopelícula compleja dando lugar en muchos casos a la
formación de estructuras similares a setas, columnas o agregados separados por canales
que los conectan. Entre las estructuras bacterianas que participan en las primeras etapas
de la formación se encuentra el flagelo y los pili. Durante el desarrollo de la biopelícula
se sintetizan diferentes tipos de adhesinas. Algunas de ellas promueven la fijación
irreversible de la bacteria a cualquier superficie y otras que lo hacen de forma específica
a determinados materiales (Karatan y Watnick, 2009; Petrova y Sauer, 2012).
Figura 30. Etapas en la formación de biopelículas (Molin y Tolker-Nielsen, 2003).
La primera etapa en la formación de biopelículas es la adhesión reversible que comienza
con una serie de interacciones entre la superficie del tejido y de la bacteria en las que
participan fuerzas atractivas de Van der Waals, fuerzas electrostáticas que pueden ser de
atracción o repulsión, la formación de puentes de hidrógeno y el movimiento
Browniano. A medida que la bacteria se va acercando a la superficie surgen fuerzas
repulsivas, debido principalmente a que tanto la carga de la membrana bacteriana y el
Introducción
79
tejido, animal o vegetal, son negativas. A pesar de existir fuerzas repulsivas entre las
superficies, la presencia de estructuras filamentosas como los pili o flagelos permiten la
adhesión superando las fuerzas de repulsión entre la bacteria y el tejido (Busscher y van
der Mei, 2012; Proft y Baker, 2009). Durante la etapa de adhesión reversible las
bacterias permanecen unidas a la superficie de forma polar a través del flagelo. En este
momento las bacterias pueden realizar diversos tipos de movimientos, además del
Browniano aleatorio de la bacteria, pueden vibrar, hacer twitching mediante los pili tipo
IV, desplazarse por la superficie o girar sobre sí mismas, spinning, este último tipo de
movimiento es indicativo de la unión de la bacteria al tejido mediante el flagelo.
En cuanto las bacterias entran en contacto con la superficie comienza a variar la
expresión génica de las mismas favoreciendo el modo de vida sésil (Kostakioti et al.,
2013). La adhesión irreversible es dependiente del sistema de regulación mediante
quorum sensing y de los niveles de di-GMPc en la bacteria. Los niveles de di-GMPc
regulan el swarming, la producción de exopolisacáridos y la modulación del flagelo. En
P. aeruginosa, la regulación del swarming y de la formación de biopelículas es
inversamente proporcional, altos niveles de di-GMPc favorecen la formación de
biopelículas y producción de exopolisacáridos mientras que bajos niveles de di-GMPc
favorecen el movimiento tipo swarming y no la formación de biopelículas (Kuchma et
al., 2007; Merritt et al., 2007a). En P. fluorescens y P. putida el paso a estado
irreversible tiene lugar mediante la localización de la proteína de adhesión LapA que es
regulada de forma post-traduccional por di-GMPc, los niveles de di-GMPc dependen
además de la presencia de fosfato inorgánico a través del regulón pho. Este sistema de
regulación de biopelículas se ha observado únicamente en Pseudomonas presentes en el
suelo y no parece estar relacionado con el movimiento en superficie ni la producción de
exopolisacáridos. En otros microorganismos el paso a estado no reversible depende de
la producción de determinadas estructuras de adhesión que impiden la rotación del
flagelo lo que produce variación en la regulación general de la bacteria y secreción de
exopolisacáridos (Gjermansen et al., 2005; Hinsa et al., 2003; Petrova y Sauer, 2012).
La estructura de las biopelículas es variable, las hay con una estructura tridimensional,
formando columnas o setas que abarcan una superficie pequeña, o aquellas que se
extienden a lo largo de una superficie a modo de lámina. La estructura de las
biopelículas depende tanto del medio donde se encuentran las bacterias como de
características propias de la misma incluyendo su capacidad para producir agentes
Introducción
80
surfactantes y agregarse o moverse, estando estos procesos asociados en su mayoría a
sistemas de regulación tipo quorum sensing (Karatan y Watnick, 2009). Además se
produce diferenciación celular en función de la posición que las células ocupen dentro
del agregado, dependiendo ésta de la disponibilidad de nutrientes, oxígeno y residuos
entre otros y llegándose a producir variantes fenotípicas y genotípicas dentro de la
biopelícula (McDougald et al., 2012).
Asimismo, la dispersión de las biopelículas tiene lugar cuando se dan determinadas
condiciones en el medio relacionadas con la concentración de nutrientes, la
concentración de oxígeno, la presencia de residuos en la biopelícula o una densidad
poblacional determinada (McDougald et al., 2012). Para que tenga lugar la dispersión se
tienen que activar genes relacionados con dispersión en gran parte del agregado
posiblemente mediante moléculas de pequeño tamaño que al final conducen a la ruptura
de la matriz (Oppenheimer-Shaanan et al., 2013). La ruptura de la matriz se produce por
la degradación del exopolisacárido, las adhesinas tanto fimbrilares como no fimbrilares
o el ADN extracelular (McDougald et al., 2012). En X. campestris la dispersión de la
biopelícula se produce al menos parcialmente al sintetizarse un manasa regulada
mediante quorum sensing (Dow et al., 2003). También se ha descrito el papel de
DNAsas extracelulares en la degradación de la matriz extracelular que en P. aeruginosa
puede estar relacionada con la reversión al estado planctónico (Mulcahy et al., 2010). La
ruptura y dispersión de las biopelículas puede también tener lugar por la presencia de
bacteriófagos, cuyos genomas están incluidos en un 60-70% de las bacterias. Los
bacteriófagos producen lisis bacteriana que deriva en la rotura del agregado, además
producen enzimas que disgregan la matriz extracelular favoreciendo este proceso. En P.
aeruginosa se ha comprobado que hay expresión de genes relacionados con profagos en
las etapas más tardías de la biopelícula, así como la presencia de los mismos
(McDougald et al., 2012). La lisis celular produce una gran cantidad de nutrientes que
pueden ser asimilados por las células que posteriormente se dispersan y así obtener la
energía suficiente para colonizar nuevos nichos (Karatan y Watnick, 2009). Cuando las
biopelículas han alcanzado un tamaño determinado, algunas de las células parecen
comenzar a expresar genes relacionados con la formación del flagelo y motilidad
pasando a estado planctónico, mientras las células de otras partes del agregado
permanecen sésiles, este proceso parece además ser dependiente de quorum sensing en
P. aeruginosa y Xc (Dow et al., 2003; Karatan y Watnick, 2009).
Introducción
81
6.2. Factores que determinan la formación y dispersión de biopelículas
La formación de biopelículas está regulada por varios factores, cuya implicación varía
en función de la especie o incluso de la cepa bacteriana. Esta variación posiblemente sea
debida a la adaptación de las diferentes bacterias a las distintas condiciones del medio.
Señales del medio en el que se encuentran las bacterias 6.2.1.
Para la formación de biopelículas es necesaria la presencia de una superficie, ya sea
viva o inerte y unas condiciones y señales en el ambiente que varían en función de la
bacteria. La formación de biopelículas requiere un gasto alto de energía, por lo que es
importante para las bacterias poseer un sistema preciso de regulación en relación al
ambiente (Busscher y van der Mei, 2012). Los mecanismos de quimiotaxis permiten a
las bacterias reconocer el medio en el que se encuentran y adoptar o no la conformación
de biopelícula, tal como se ha comprobado en P. aeruginosa (Hickman et al., 2005;
Kostakioti et al., 2013)
El reconocimiento de las superficies tiene lugar a través del flagelo. La disminución en
la velocidad del giro del flagelo cuando éste se encuentra en una superficie, parece ser
transmitida a través del motor de flagelo permitiendo así el paso a vida sésil. Está
descrito en varias especies bacterianas que mutantes que carecían de flagelo eran
capaces de adherirse a una superficie, pero mutantes que poseían flagelo y no era mótil,
debido a una mutación en el motor del mismo, no eran capaces de adherirse,
posiblemente porque no reconocían la superficie. Por ejemplo en P. aeruginosa
mutaciones en cualquiera de los dos motores flagelares (Sistemas MotAB o MotCD)
inhiben o dificultan la adhesión. El motor flagelar actúa como sensor mecánico
activando genes relacionados con la producción de exopolisacáridos que favorece la
formación de agregados. Además, se han descrito otros sensores de superficie cuya
señal es por ahora desconocida pero que estarían relacionados con el contacto de la
bacteria a la superficie. El funcionamiento de este tipo de sistema denominado Wsp en
P. aeruginosa es similar al de las MCPs y la cadena de transducción de señales en
quimiotaxis, parece participar en el proceso de adhesión y reconocimiento de superficies
(Belas, 2014; Busscher y van der Mei, 2012; Karatan y Watnick, 2009; Petrova y Sauer,
2012; Toutain et al., 2005; Toutain et al., 2007).
También existen señales nutricionales y metabólicas, que participan en la inducción de
los procesos de agragación bacteriana. La formación de agregados y biopelículas en la
Introducción
82
mayoría de las especies bacterianas, se ve favorecida en condiciones de limitación
nutricional, ya sean fuentes de carbono, nitrógeno o fosfatos. Sin embargo algunas
bacterias como E. coli K12 requieren fuentes de carbono que participen en rutas
metabólicas relacionadas con el acetato, indicándole a la bacteria que se encuentra en un
ambiente favorable para la formación de biopelículas. V. cholerae precisa la presencia
de monosacáridos, necesarios para la producción de exopolisacáridos y adhesinas, en el
ambiente para iniciar el proceso de agregación (Petrova y Sauer, 2012). P. putida es
capaz disgregar la biopelícula en ausencia de nutrientes o cuando se elimina el citrato
del medio (Gjermansen et al., 2005). Sin embargo otras especies bacterianas pasan a
estado planctónico en presencia de determinados nutrientes como citrato o glucosa
(Karatan y Watnick, 2009). La formación de biopelículas y agregados en Xcc se ve
favorecida en medios mínimos que mimetizan el apoplasto, además en medios ricos
como el PYM (Peptona, levadura y malta más glucosa) o LB no hay formación de
biopelículas complejas (Gottig et al., 2009; Rigano et al., 2007; Sena-Vélez et al.,
2014). El hierro, nutriente esencial para las bacterias, tiene un efecto en la formación de
biopelículas en función de la especie bacteriana. La falta de hierro dificulta la formación
de biopelículas en P. aeruginosa, y sin embargo bajas concentraciones de hierro
favorecen la formación de biopelículas en otros géneros como Actinomyces o
Staphylococcus. Los niveles de fosfato inorgánico son importantes también para la
formación de biopelículas, el sistema de regulación pho se activa a bajos niveles de
fosfato, lo que hace disminuir los niveles de diGMPc inhibiendo la formación de
adhesinas que son requeridas para la formación de biopelículas en Pseudomonas. Sin
embargo parece favorecer la formación de agregados en Agrobacterium (Danhorn y
Fuqua, 2007; Karatan y Watnick, 2009).
Otro factor que afecta la agragación es la osmolaridad, que regula la formación de
biopelículas en función del osmolito y de la especie bacteriana. Por ejemplo, el cloruro
sódico y la sacarosa inhiben la formación de biopelículas en Pseudomonas y Salmonella
y sin embargo en E. coli el cloruro sódico la regula de forma negativa y la sacarosa de
forma positiva. En Xcc se ha comprobado que concentraciones subletales de cloruro
sódico favorecen la formación de biopelículas (Redondo, C. et al., enviado; Karatan y
Watnick, 2009).
Las bacterias responden también a señales del hospedador mediante la formación de
agregados o biopelículas. Las plantas producen determinados compuestos para
Introducción
83
defenderse de agentes patógenos, o como en el caso de la interacción Rhizobium-
leguminosa para establecer la simbiosis. Muchos de estos compuestos son reconocidos
por las bacterias favoreciendo la formación de biopelículas (Danhorn y Fuqua, 2007).
Además las bacterias responden a la presencia de compuestos antimicrobianos, que a
concentraciones subletales o subinhibitorias pueden favorecer la formación de
biopelículas en un intento por aislarse lo más posible de compuestos dañinos. En P.
aeruginosa concentraciones bajas de tobramicina favorecen la formación de
biopelículas al igual que determinados biocidas lo hacen en Xcc (Redondo, C. et al.,
enviado; Karatan y Watnick, 2009).
La concentración de oxígeno y óxido nítrico intervienen en los procesos de agregación y
formación de biopelículas. Conforme la biopelícula se va desarrollando y aumentando
de tamaño la cantidad de oxígeno que es capaz de penetrar a las zonas más profundas de
la misma va disminuyendo, a la vez aumentan los compuestos que se producen en
condiciones de anaerobiosis como el óxido nítrico. Esta condiciones conducen a la
dispersión de las biopelículas (Karatan y Watnick, 2009).
Finalmente cabe destacar que los procesos de agregación bacteriana y formación de
biopelículas suelen estar relacionados con mecanismos de respuesta poblacional o
quorum sensing. Este tipo de mecanismos se activan por la secreción bacteriana de
moléculas como las acil-homoseril lactonas presentes en muchas proteobacterias,
gammabutirolactonas en el género Streptomyces, los factores de señalización difusibles
encontrados en los géneros Xanthomonas y Xylella y los oligopéptidos en bacterias
Gram positivas. Está probado que en varios patógenos vegetales se requiere la
activación del mecanismo de quorum sensing para la formación de biopelículas, como
Pseudomonas, Agrobacterium, Xanthomonas o Xylella (Danhorn y Fuqua, 2007;
Karatan y Watnick, 2009).
Mensajeros secundarios y cadenas de proteínas 6.2.2.
El di-GMP cíclico (diGMPc) es una molécula que regula de forma general un gran
número de procesos en las bacterias a nivel transcripcional, traduccional y post-
traduccional (Krasteva et al., 2012). En bacterias Gram negativas es el regulador central
en la formación de biopelículas actuando en el paso del estado sésil y a la adhesión
irreversible, además se encuentra relacionado con mecanismos de adaptación al medio
(Figura 31) (Karatan y Watnick, 2009).
Introducción
84
El diGMPc es sintetizado a partir de dos moléculas de guanosín trifosfato o GTP
mediante la acción de las diguanilato ciclasas, que son proteínas que contienen el
dominio GGDEF. La ruptura de esta molécula tiene lugar mediante la acción de
enzimas fosfodiesterasas que se caracterizan por tener domios HD-GYP o EAL. Si las
proteínas contienen un dominio EAL se formará una molécula de di-GMP lineal y si
contienen un dominio HD-GYP en dos GMP (Figura 31 B).
Figura 31. Resumen de la señalización por diGMPc. A: Formación
de biopelículas; B: Señalización del diGMPc. Modificado de
Krasteva et al., 2012.
Los dominios GGDEF y EAL están presentes en un gran número de especies
bacterianas y en muchos casos una misma proteína puede tener los dos dominios y
realizar las dos funciones en función de los sustratos presentes en el medio. Sin
embargo el dominio HD-GYP es menos común. Las bacterias que pueden estar
presentes en un gran número de nichos ambientales, por ejemplo los oportunistas,
poseen un gran número de proteínas con estos dominios. Sin embargo la mutación en
una de las proteínas que contiene un dominio GGDEF o EAL produce un cambio
importante en el fenotipo de la bacteria, por lo que estas proteínas deben de ser muy
específicas de un mecanismo determinado (Karatan y Watnick, 2009; Krasteva et al.,
2012).
Introducción
85
En el género Xanthomonas se ha confirmado la conexión entre el sistema de quorum
sensing y el diGMPc a través del sistema de dos componentes RpfC/RpfG y su relación
con la formación y dispersión de las biopelículas. Además el diGMPc regula otros
factores relacionados con funciones celulares esenciales, sistemas de detoxificación, el
SST3, la polimerización y despolimerización del pilus tipo IV y la síntesis de
lipopolisacáridos entre otros. Este sistema responde a señales extracelulares
relacionadas con quorum sensing activándose los dominios GGDEF y HD-GYP
presentes en estas proteínas, lo que produce una variación de los niveles de diGMPc. En
Xanthomonas, al igual que en otras bacterias Gram negativas, altos niveles de diGMPc
favorecen la formación de biopelículas y bajos niveles de este mensajero secundario
favorecen la producción de factores de virulencia y la dispersión de la biopelícula, como
se puede ver en la Figura 31B (Andrade et al., 2006; Guzzo et al., 2013; Mole et al.,
2007; Ryan et al., 2006).
Los sistemas de regulación de dos componentes en procariotas perciben las señales del
ambiente y transmiten la señal a través de la transferencia de grupos fosfato entre sus
componentes. Estos sistemas poseen un sensor histidín quinasa que es el responsable de
detectar la señal ambiental de forma directa o indirecta y un regulador de la respuesta
que modificará los niveles de transcripción en la bacteria produciendo una respuesta
determinada, siendo una de ellas el paso a vida sésil y la formación de biopelículas
(Karatan y Watnick, 2009). En el género Xanthomonas existen entre 92 y 121 genes que
codifican para sistemas de regulación de dos componentes, esta cantidad de reguladores
se atribuye a la capacidad de este género para vivir en distintos nichos (Qian et al.,
2008). Se ha mencionado anteriormente el sistema RpfG/RpfC que regula la formación
y dispersión de biopelículas en función de los niveles de DSF presentes en el medio
(Crossman y Dow, 2004; Ryan et al., 2006). En X. citri subsp. citri se han descrito
varios sistemas de regulación de dos componentes relacionados con la formación de
biopelículas además de RpfG/RpfC, entre ellos se encuentran BfdS/BfdR que además
regula la transcripción de rpfF de forma positiva (Huang et al., 2013), ColR/ColS que
regula varios factores de virulencia (Yan y Wang, 2011).
Existen además otros reguladores que controlan la formación de biopelículas en
bacterias. En X. campestris pv. campestris se ha descrito el regulador post-
transcripcional RsmA. Este regulador al igual que el homólogo CsrA en algunas
enterobacterias regula la formación de biopelículas a través del diGMPc; en X.
Introducción
86
campestris la mutación de este regulador produce agregación en cultivo líquido y una
alta adhesión a superficies en cultivos estáticos (Lu et al., 2012).
6.3. Composición de la matriz de las biopelículas
La matriz que forma parte de las biopelículas ocupa un volumen aproximado del 90%
de las mismas, a pesar de eso únicamente ha sido estudiada en un grupo pequeño de
especies bacterianas (Flemming y Wingender, 2010). Además de contener y proteger a
las bacterias, confiere estructura al agregado a modo de esqueleto, atrapa nutrientes y
moléculas de señalización como aquellas relacionadas con comunicación bacteriana y
contiene enzimas que son capaces de digerir sustancias presentes en la misma matriz,
haciendo estos compuestos disponibles para todas las células que forman el agregado.
Figura 32. Biopelícula teñida con tintes específicos para unas
estructuras determinadas; A: SyproOrange que tiñe proteínas; B:
Syto-9 que de une a ADN; C: Rojo Nilo que tiñe lípidos. En la
imagen D se muestra la superposición de las tres imágenes
anteriores viéndose en color azul los lípidos hidrofóbicos, en rojo las
proteínas y en verde los ácidos nucleicos. Las flechas indican; a:
proteína y ADN; b: proteína y lípido; c: lípidos (Lawrence et al.,
2003).
Debido a la alta capacidad higroscópica de la matriz, siendo el agua el componente
mayoritario de la misma, las células se encuentran protegidas de la desecación y son
capaces de desplazarse permitiendo el avance del agregado o colonia. Los principales
Introducción
87
componentes de la matriz son exopolisacaridos, lípidos, proteínas y ADN extracelular
(Figura 32). La mayoría de ellas pueden ser visualizadas mediante microscopía y el uso
de diferentes tinciones y sondas o anticuerpos marcados con tintes fluorescentes u oro
(Flemming y Wingender, 2010; Lawrence et al., 2003; Lindow y Brandl, 2003;
McDougald et al., 2012; Strelkova et al., 2013; Verstraeten et al., 2008).
Polisacáridos 6.3.1.
Los exopolisacáridos tienen un papel muy importante tanto en la formación de
agregados como en supervivencia de las bacterias. Comprenden el mayor volumen de la
matriz extracelular protegiendo a la bacteria de las fluctuaciones hídricas que tienen
lugar en la superficie foliar, además de la radiación ultravioleta y especies reactivas de
oxigeno (Lindow y Brandl, 2003).
En un gran número de especies bacterianas la presencia de exopolisacáridos es crucial
para la formación de biopelículas. De hecho, mutantes en los genes que codifican para
la producción de exopolisacárido tienen reducida esta capacidad o únicamente son
capaces de formar biopelículas sencillas (Karatan y Watnick, 2009; Flemming y
Wingender, 2010). Sin embargo, no todos los polisacáridos parecen tener un papel
importante en las primeras etapas de la formación de biopelículas, incluso en algunas
especies parecen ser contraproducentes como sucede en Vibrio vulnificus y el
polisacárido capsular del grupo 1, o en locus putativo CPS del antígeno O en V.
parahaemolyticus. Por otro lado, cepas no productoras de exopolisacárido sí que pueden
agregarse en biopelículas mixtas con otras especies productoras (Flemming y
Wingender, 2010; Petrova y Sauer, 2012).
En el género Xanthomonas la producción de goma xanthana se ha asociado a la
formación de biopelículas tanto en superficies bióticas como abióticas y con la
virulencia en X. campestris o X. oryzae pv. oryzae. Sin embargo en X. citri subsp. citri,a
pesar de ser un factor determinante para la formación de biopelículas y supervivencia en
superficie vegetal, no parece afectar altamente a la virulencia (Dunger et al., 2007;
Mhedbi-Hajri et al., 2011b; Qian et al., 2005; Rigano et al., 2007).
ADN extracelular 6.3.2.
El ADN extracelular (ADNe), presente en la matriz extracelular fue descrito por
primera vez en 1956 por Catlin (Catlin, 1956). Sin embargo la importancia de esta
Introducción
88
molécula en la estabilidad de la biopelícula no fue demostrada hasta 2002 cuando
Whitchurch estudió el efecto de la DNAsaI en la formación y degradación de
biopelículas en P. aeruginosa. Los resultados de estos trabajos mostraron que la
DNAsaI al ser añadida en las primeras etapas de adhesión a la superficie provocaba una
disminución en la cantidad de biopelícula. Cuando la DNAsa se añadía en etapas más
tardías no se producía ninguna variación, por lo tanto se confirmó que para la cepa de P.
aeruginosa PAO1 el ADNe tiene un papel importante en las primeras etapas de
adhesión a superficies (Whitchurch et al., 2002). Estudios posteriores en aislados
clínicos de esta misma especie mostraron que a diferencia de la cepa PAO1, el ADNe
parecía tener un efecto más importante en las etapas tardías y en la estructura final de la
biopelícula (Nemoto et al., 2003), por lo tanto el papel de ADNe en la formación de
biopelículas varía no solo en función de la especie bacteriana, sino a nivel de cepa. La
importancia de esta molécula en la formación de biopelículas y agregados es tal que se
usan tratamientos con DNAsa recombinante humana (Dornasa α) para combatir P.
aeruginosa en pacientes con fibrosis quística (Fuchs et al., 1994). El tratamiento tanto
con DNAsa como con Dornasa α de esputos en pacientes afectados con fibrosis quística,
disuelve completamente el esputo y elimina las estructuras formadas por ADN
(Manzenreiter et al., 2012). Al romper los agregados, las bacterias son más vulnerables
a otros tratamientos.
Posteriormente se ha descrito la importancia del ADNe en biopelículas para otras
bacterias tanto Gram positivas como Gram negativas, habiéndose detectado incluso en
arqueas, (Figura 33) (Chimileski et al., 2014; Conover et al., 2011; Das et al., 2010;
Hall-Stoodley et al., 2008; Nemoto et al., 2003; Vilain et al., 2009; Whitchurch et al.,
2002). A pesar de que se han realizado varios estudios en especies patógenas de
animales y presentes en el agua, el mar o en depuradoras, todavía no se ha estudiado su
importancia en especies bacterianas fitopatógenas. En algunos géneros patógeno como
Bortedella (Conover et al., 2011) una vez que la biopelícula ha madurado, es posible
que el ADNe no sea tan importante en su estabilidad, debido a la presencia de otros
compuestos en la matriz o a la presencia de exoenzimas que desactiven las DNAsas
(Whitchurch et al., 2002), sin embargo la adición de DNAsaI al medio únicamente
mostró reducción en la formación de biopelículas de más de 6 horas (Conover et al.,
2011).
Introducción
89
Figura 33. ADNe producido por; a: Bacillus cereus; b: Shewanella
oneidensis; c: E. coli; d: Listeria monocytogenes. En esta imagen el ADN
fue teñido con el marcador TOTO-1 (verde) y las bacterias con SYTO-60
(rojo). La escala es de 10 µm. Obtenido de (Okshevsky y Meyer, 2013).
El papel de ADNe puede ser estructural, dando estabilidad y consistencia a la
biopelícula o participando en la adhesión a superficies y la agregación celular. La
función del ADNe en adhesión a superficies se ha estudiado en distintas especies del
género Staphylococcus en bacterias adheridas a superficies tanto hidrofílicas como
hidrofóbicas, además se ha demostrado que el número y tamaño de los agregados se
alteraba después de tratamientos con DNAsaI. Las fuerzas de Lifshitz-Van der Waals no
están afectadas por la ausencia de ADNe ni el tipo de superficie, ya sea hidrofílica o
hidrofóbica, tanto en adhesión como en agregación. Sin embargo, la interacción acido-
base desaparece en superficies hidrofílicas en ausencia de ADNe; en superficies
hidrofóbicas únicamente se pierde la interacción acido-base entre las células, pero no
con la superficie. El ADNe en Staphylococcus parece formar una capa altamente
hidrofóbica alrededor de la bacteria que hace que tenga mayor facilidad para adherirse a
superficies de este tipo (Das et al., 2010). Las moléculas hidrofílicas de ADNe se unen a
los residuos hidrofílicos de la superficie celular de P. aeruginosa dejando expuestos
únicamente los residuos hidrofóbicos, lo que permite la adhesión a este tipo se sustratos
favoreciendo también la formación de agregados (Das et al., 2014). En Bacillus cereus
Introducción
90
el ADNe también actúa como adhesina revistiendo la superficie a la que se une
posteriormente (Vilain et al., 2009). El papel estructural del ADNe se ha confirmado en
varias especies bacterianas, puesto que el tratamiento con DNAsa es capaz de disgregar
las biopelículas, incluso aquellas formadas por hongos como Candida albicans o
Aspergillus fumigatus. Sin embargo hay bacterias que poseen ADNe en sus agregados
que no se dispersan en presencia de DNAsa, pero si se reducen (Jakubovics et al.,
2013). En S. aureus el ADNe se une a la toxina-β produciendo un complejo
nucleoproteico insoluble que da consistencia a la matriz (Montanaro et al., 2011) y en S.
mutants parece unirse a exopolisacárido y a fibras amiloides (Liao et al., 2014). Se ha
descrito también la unión a otros componentes de la matriz extracelular en bacterias
como Myxococcus xanthus, S. pneumonmiae, o N. meningitidis (Jakubovics et al.,
2013).
Figura 34. Representación esquemática del tipo de uniones que
tienen lugar en agregados de P. aeruginosa en presencia de
ADNe. A: agregación bacteriana; B: tipos de enlaces mediante
el ion Ca2+
e interacción ácido-base (AB), y en ausencia de
ADNe tras un tratamiento DNAsa; C: no hay agregación
bacteriana; D: en ausencia de ADNe no hay unión a los iones
calcio por lo tanto no se produce agregación) (Das et al., 2014).
EL ión Ca2+
se une a las moléculas de ADN que poseen carga negativa y es capaz de
unir varias hebras de ADNe (Figura 34) o unir ADNe a otras moléculas que también
unen estos iones, lo que aumenta la estabilidad del agregado. Se ha demostrado en
varias especies bacterianas que en presencia de ADNe y Ca2+
se produce una mayor
agregación (Das et al., 2014).
Introducción
91
En P. aeruginosa el ADNe se localiza al igual que en B. cereus en la superficie del
sustrato y además en el sombrero de la estructura de seta que se forma cuando la
biopelícula ha madurado, en la unión entre el tallo y el sombrero, y en la parte externa
del tallo (Allesen-Holm et al., 2006). Sin embargo en Neisseria gonorhoeae se
encuentra en el interior de la estructura con forma de seta (Zweig et al., 2014). La
presencia de ADNe favorece en P. aeruginosa la formación de agregados y el
movimiento hacia zonas da mayor concentración de ADNe, que es donde se asienta la
bacteria. En presencia de DNAsa al no haber ADNe, las bacterias muestran
movimientos desorganizados que impiden la agregación y la construcción de una
estructura organizada (Gloag et al., 2013). Además la DNAsa NucB es capaz de
dispersar biopelículas formadas por E. coli, B. subtilis, Mixococcus luteus, y de un gran
número de bacterias aisladas de pacientes con rhinosinusitis crónica (Jakubovics et al.,
2013; Shields et al., 2013), lo que confirma el papel del ADNe en la estructura final de
las biopelículas.
El ADNe protege a la bacteria de agentes antimicrobianos, dodecil sulfato sódico (SDS)
o sonicación. La adición de ADN a biopelículas formadas por P. aeruginosa aumenta su
resistencia frente a péptidos antimicrobianos y antibióticos como tobramicina y
gentamicina (Jakubovics et al., 2013). Por otro lado sirve como reservorio nutricional a
las células que forman parte de la biopelícula. En el fondo marino el ADN presente
comprende el 50% del fósforo disponible para los microorganismos siendo de una
cantidad de 0,45 gigatoneladas de ADN (Jakubovics et al., 2013). En las biopelículas
tienen lugar fenómenos de intercambio génico entre los microorganismos que las
componen, el ADNe es un reservorio génico en estas estructuras favoreciendo la
transferencia horizontal. En Streptococcus pneumonia este fenómeno además se
relaciona con mecanismos de competencia que es estimulada mediante la producción de
un péptido. A concentraciones determinadas del péptido se produce lisis de cierto
número de bacterias, siendo el ADN liberado en el medio adquirido por el resto de la
población.La presencia de este péptido favorece e incrementa la formación de
biopelículas (Montanaro et al., 2011).
La producción o secreción de ADNe puede tener lugar de diversas formas dependiendo
de la especie, aunque la lisis celular provocada por la muerte de las bacterias de forma
natural es una fuente de ADNe a nivel basal. En algunos casos, como en P. aeruginosa,
la lisis celular está regulada mediante quorum sensing. A determinadas concentraciones
Introducción
92
de acil-homoseril lactonas y quinolonas, una parte de la población se autolisa
favoreciendo la supervivencia del resto y la formación de agregados (Allesen-Holm et
al., 2006; Montanaro et al., 2011). En otros casos, la lisis celular es provocada por otras
bacterias de la misma población, lo que se denomina fratricidio, en este caso se produce
una diferenciación celular entre atacantes y presas. Las células atacantes producen una
serie de factores a los que ellas son resistentes que producen la muerte de las células
presas, sensibles a dichos factores. Este último fenómeno se ha descrito en
Enterococcus. faecalis, B. subtilis y S. pneumoniae en el primero está regulado por
quorum sensing (Montanaro et al., 2011; Jakubovics et al., 2013).
Otro método de secreción de ADNe tiene lugar mediante vesículas, este fenómeno se ha
descrito en P. aeruginosa y S. mutants, siendo la producción de vesículas importante
para la formación de biopelículas (Montanaro et al., 2011; Liao et al., 2014). En el caso
de Neisseria gonorrhoeae la secreción de ADNe se produce a través de un sistema de
secreción tipo IV que no necesita de otra bacteria para exportar ADN, sino que lo hace
directamente al medio y que además en algunos casos es de hebra sencilla. Mutaciones
en ocho de los genes que codifican para la formación de este pilus producen
disminución en la producción de ADNe (Hamilton et al., 2005). El ADN secretado está
próximo a zonas con un origen de transferencia oriT (Salgado-Pabón et al., 2007).
Lípidos 6.3.3.
Los lípidos se suelen encontrar en la matriz extracelular en forma de lipopolisacáridos,
normalmente formados por un exopolisacárido con un grupo metilo o acetilo y se ha
comprobado que actúan como factores de virulencia en Xcc además de en otras especies
bacterianas. Tienen propiedades hidrofóbicas y en muchos casos se asocian a la
adhesión a superficies de esta naturaleza como son las ceras que cubren la superficie
foliar; también puede disgregar sustancias hidrofóbicas presentes en el medio
haciéndolas accesibles a las bacterias que conforman la biopelícula. Algunos lípidos
descritos son la serrawetina de Serratia marcescens o los rhamnolípidos de
Pseudomonas. En varios géneros bacterianos se han relacionado con la adhesión a
superficies, por ejemplo en X. campestris se ha relacionado un tipo de lipopolisacárido
con la colonización a través de los hiátodos y la adhesión a los mismos, la formación de
microcolonias, de la estructura tipo seta y la dispersión. Además, en muchos casos estas
moléculas favorecen la motilidad en superficie, la producción de los pili tipo I y el
Introducción
93
sistema de secreción tipo III (Flemming y Wingender, 2010; Mhedbi-Hajri et al.,
2011b).
Proteínas extracelulares 6.3.4.
Las proteínas que forman parte de la matriz extracelular de las biopelículas son tanto
proteínas estructurales tales como los pili y las fimbrias o enzimas que se han
relacionado con la degradación de biopolímeros y otras sustancias (Karatan y Watnick,
2009; Flemming y Wingender, 2010).
Las proteínas estructurales se han relacionado con la adhesión y la formación y
estabilización de las bacterias y del agregado. Existen determinadas proteínas que se
unen y dan estabilidad al exopolisacárido como las lectinas de P. aeruginosa, o
proteínas asociadas a la superficie bacteriana, como las fibras amiloides que se unen a
superficies y a las células del huésped pudiendo, además funcionar como agentes
citotóxicos siendo descritas en algunos casos como curli (Dueholm et al., 2010;
Dueholm et al., 2012; Flemming y Wingender, 2010). Además las fimbrias, el pilus tipo
IV y otras adhesinas no fimbrilares presentan un papel importante en la formación de
biopelículas en el género Xanthomonas y en otros géneros bacterianos (Mhedbi-Hajri et
al., 2011a; Mhedbi-Hajri et al., 2011b; Dunger et al., 2014).
Las enzimas secretadas al exterior celular durante la formación de biopelículas están
relacionadas con la degradación de determinadas sustancias, entre ellas polímeros
solubles en agua como exopolisacáridos, ácidos nucleicos y ciertas proteínas y
polímeros no solubles en agua como la celulosa, quitina y lípidos, además de moléculas
orgánicas que entran en contacto con la matriz extracelular. Su presencia y contención
en la matriz extracelular se debe a la unión a los componentes de la matriz mediante
enlaces que requieren poca energía. La lipasa A de P. aeruginosa se une al alginato
mediante este tipo de enlaces. Estas enzimas juegan un papel en la rotura de estas
macromoléculas para hacerlas accesibles a los microorganismos que componen la
biopelícula, y participan en la rotura de la biopelícula permitiendo la dispersión de las
bacterias a otro nichos. Además algunas de las enzimas secretadas a la matriz
extracelular pueden actuar como factores de virulencia o incluso romper la matriz de
biopelículas formadas por otras especies bacterianas (Flemming y Wingender, 2010).
Introducción
94
6.4. Biopelículas en Xanthomonas citri subsp. citri
Xcc es capaz de formar biopelículas tanto en superficies bióticas como abióticas (Figura
35). En este patógeno la formación de biopelículas es un importante factor de virulencia
puesto que mutantes que ven disminuida su capacidad para formar agregados y
biopelículas además tienen alterada su virulencia (Cubero et al., 2011; Gottig et al.,
2009; Li y Wang, 2011b; Malamud et al., 2011; Rigano et al., 2007; Sgro et al., 2012).
La formación de biopelículas parece estar favorecida por la presencia de medios poco
nutritivos, como se ha mencionado anteriormente y ser dependiente de la gama de
huésped de la cepa (Rigano et al., 2007; Sena-Vélez et al., 2014).
Figura 35. Biopelículas producidas por Xcc en superficie foliar. A y B: Xcc
MI a las 24 hpi en superficie de Swingle citrumelo. La imagen B es un zoom
de la A, permitiendo ver las estructuras extracelulares producidas por el
patógeno. C y D: imágenes tomadas del interior de una lesión en hoja de lima
mejicana producida por Xcc MI. Dado que estas imágenes fueron tomadas en
la lesión es probable que las células se estén desprendiendo de los agregados
para producir nuevas infecciones. Fotos realizadas por Marta Sena Vélez.
Etapas en la formación de biopelícula en Xcc 6.4.1.
En presencia de una superficie y en condiciones que favorezcan la agregación, las
bacterias se dirigen hacia el nicho más apropiado para su desarrollo utilizando para ello
motilidad dependiente del flagelo y quimiotaxis (Figura 36).
Introducción
95
Al igual que sucede en otras especies bacterianas el primer contacto de Xcc con la
superficie tiene lugar de forma polar, posiblemente mediante el flagelo o la adhesina
FhaB, la adhesión mediante fibras laterales y el pili tipo IV en planta, ya que esta
estructura no parece ser importante en adhesión a superficies abióticas (Malamud et al.,
2011; Li y Wang, 2011b; Dunger et al., 2014). Con suficiente concentración de
nutrientes y oxígeno en el medio en el que se han establecido, las bacterias comienzan a
adaptarse y diferenciarse para pasar a formar la biopelícula, además se produce división
celular y crecimiento del agregado. Posteriormente, las bacterias comienzan a
desplazarse en la superficie para colonizar un área mayor generando una biopelícula
monocapa. A medida que la población va creciendo se va formando una microcolonia
encontrándose las bacterias más cercanas a la superficie en condiciones de carencia de
oxígeno y nutrientes. A baja concentración de oxígeno parece que aumenta la
producción de exopolisacárido que junto con el lipopolisacárido, el ADNe y el pili tipo
IV favorecen el desarrollo vertical y la formación de columnas lo que se denomina
biopelícula madura, en este estado la diferenciación celular dentro del agregado llega a
su máximo nivel. En determinadas condiciones y mediante el sistema de regulación de
quorum sensing se activa la dispersión de las bacterias a partir del sombrero de la
estructura de seta que se abre permitiendo la liberación de las bacterias planctónicas
(Dunger et al., 2014; Li y Wang, 2011b; Malamud et al., 2013).
Figura 36. Formación de biopelículas en Xcc. Este modelo representa las diferentes etapas que tienen
lugar para la formación de una biopelícula madura y algunos de los factores implicados en cada una de las
etapas (Li y Wang, 2011b).
Introducción
96
Las bacterias que están presentes en el agregado parecen tener bajos requerimientos
energéticos, puesto que las proteínas relacionadas con metabolismo y energía están
reprimidas en este proceso comparado con el estado planctónico. Sin embargo están
activados mecanismos dirigidos al mantenimiento de la estructura y del flujo de
nutrientes y desechos dentro de la biopelícula (Zimaro et al., 2013).
Factores implicados en la formación de biopelículas en Xcc 6.4.2.
Se han descritos varios factores determinantes para la formación de biopelículas en Xcc,
muchos de ellos han sido descritos también como factores de virulencia y se han
mencionado anteriormente pero posiblemente su implicación en virulencia esté más
relacionada con la formación de agregados que con la virulencia de forma directa, entre
ellos encontramos la síntesis de exopolisacárido, presencia del flagelo y la síntesis de
adhesinas.
La presencia del flagelo favorece la adhesión y desarrollo de biopelículas. Mutantes en
los genes que codifican para la flagelina (fliC) y el garfio del flagelo (flgE) han
mostrado una reducción en la formación de biopelículas tanto in vitro como in planta,
aunque en las primeras etapas de adhesión no había alteración del fenotipo, el área
colonizada era menor (Malamud et al., 2011).
El exopolisacárido influye tanto en la formación de microcolonias como en el desarrollo
de la biopelícula madura. Los mutantes en gumB solo mostraron diferencias a partir de
las 3 horas de la formación de la biopelícula en superficie abiótica y 15 horas en planta,
por lo que su papel principal parece estar relacionado únicamente con el desarrollo de la
biopelícula (Li y Wang, 2012; Rigano et al., 2007).
Mutaciones en los genes wxacO, rfbC y nlxA que codifican para enzimas relacionadas
con la síntesis de lipopolisacárido, producen variaciones en esta molécula que
disminuye la formación de biopelículas (Li y Wang, 2011a; Yan et al., 2012).
Se ha descrito que la hemoglutinina filamentosa FhaB, que Xcc expresa en planta entre
los 3 y 4 días después de la inoculación, es esencial para la formación de biopelículas en
superficies abióticas y en superficie vegetal. Además tiene un papel importante en
agregación, puesto que mutantes en este gen no son capaces de agregarse en cultivo
estático, siendo sus biopelículas tanto en planta como in vitro desorganizadas y con
Introducción
97
grandes canales (Gottig et al., 2009). Además otras adhesinas no fimbrilares son
expresadas durante este proceso (Zimaro et al., 2013).
El SST3 es necesario para la formación de biopelículas en superficies tanto bióticas
como abióticas, sin embargo no parece participar de forma importante en la adhesión a
superficies vegetales. La mutación en algunos genes relacionados con el SST3 produce
alteraciones en la membrana externa de la bacteria que afectan a la interacción de la
célula con la superficie y que desemboca en una expresión génica similar a la que tiene
lugar durante el modo de vida planctónico (Zimaro et al., 2013; Zimaro et al., 2014).
El papel del pili tipo IV en la formación de biopelículas se ha descrito recientemente, y
parece ser esencial para el desarrollo de estructuras tipo seta y la maduración de la
biopelícula, así como para la dispersión de las células planctónicas y la adhesión a
planta. Sin embargo no parece afectar al crecimiento de la bacteria en la planta ni a la
producción de síntomas cuando el patógeno se inocula por infiltración (Dunger et al.,
2014).
Los transportadores dependientes de TonB, descritos como sensores en Xcc (Mhedbi-
Hajri et al., 2011a), transportan al espacio periplásmico complejos de hierro, sideróforos
y cobalamina, que parecen expresarse además en ambientes con baja concentración de
hierro, aunque es probable que también transporten moléculas vegetales. En el interior
de las biopelículas Xcc expresa un gran número de estos transportadores relacionándose
con la adaptación de la bacteria al estado sésil, al transporte de compuestos de carbono,
y a la percepción y transducción de señales (Li y Wang, 2011b; Zimaro et al., 2013).
Varios genes relacionados con la formación de biopelículas han sido descritos además
mediante el estudio de mutatecas de Xcc 306. El estudio de Malamud y colaboradores
en 2013 describió que mutantes afectados en motilidad y quimiotaxis hacia extractos de
pomelo también veían afectada su capacidad formadora de biopelículas (Malamud et al.,
2013), sin embargo en los resultados que muestran no hay descritos genes relacionados
con la estructura del flagelo o MCPs ni con otros sensores presentes en Xcc (Mhedbi-
Hajri et al., 2011a). Los genes descritos en este estudio poseen funciones relacionadas
con la producción de xanthano, síntesis de aminoácidos, metabolismo energético,
replicación de ADN, transcripción, transporte de membranas y transducción de señales.
Además se identificó el papel de dos genes relacionados con el SST2 en biopelículas
que mostraron baja actividad amilasa. Las estructuras formadas por los mutantes en
Introducción
98
estos genes eran compactas y no poseían canales (Malamud et al., 2013). El estudio
realizado por Li y Wang en 2011 se determinó la importancia en formación de
biopelículas de una posible DNAsa que participa en reparación, recombinación y
replicación de ADN, y otras proteínas hipotéticas que participan en metabolismo de
carbohidratos además de genes relacionados con exopolisacárido, lipopolisacárido, pili
tipo IV, motilidad y quimiotaxis. Además en un trabajo publicado en 2011 se sugiere la
participación de ADNe y las proteínas extracelulares en la formación de biopelículas (Li
y Wang, 2011b). Estudios proteómicos han mostrado sobreexpresión en biopelículas de
porinas que permiten el transporte de nutrientes, moléculas de desecho, señales
químicas y agua a través de la membrana bacteriana. Entre las porinas sobreexpresadas
se encuentra RpfN que puede regular el paso de hidratos de carbono como la fructosa.
Además se sobreexpresan otras proteínas que se han relacionado con la síntesis de
xanthano, y detoxificación (Zimaro et al., 2013).
Regulación en biopelículas formadas por Xcc 6.4.3.
La formación de biopelículas es un proceso que se encuentra altamente regulado en
bacterias, incluyendo Xcc (Figura 37). Para la formación de biopelículas en Xcc es
esencial la presencia de una superficie en la que las bacterias se puedan agregar.
Solamente en casos aislados se ha observado estructura en la interfase líquido/aire, pero
nunca a los niveles que tienen lugar en bacterias como B. subtilis (Romero et al., 2010).
En Xcc existen varios sistemas de regulación descritos que participan en la formación de
biopelículas que se muestran en la Figura 37. En muchos de ellos la regulación tiene
lugar a través del diGMPc que es el regulador central en Xanthomonas (Mole et al.,
2007), pero hay otros reguladores que lo realizan de forma independiente.
El sistema RpfC/RpfG en Xcc es el encargado de sensar los factores de señalización
difusibles (DSF) y de transmitir la señal, regulando la síntesis de DSF a través RpfF y
los niveles de diGMPc. Además activa el regulador de la respuesta del sistema
NtrB/NtrC que a través de RpoN (factor σ54
) regula la formación de biopelículas,
motilidad y quimiotaxis. Por otro lado al igual que en X. campestris pv. campestris (Xc)
podría regular la dispersión de la biopelícula. La mutación de estos genes y de otros
dentro de este sistema como rpfC y rpfF afecta a la adhesión y posterior formación de
biopelículas alterando además a la expresión de un gran número de genes (Andrade et
al., 2006; Dow et al., 2003; Guo et al., 2012; Li y Wang, 2011b). BfdS/BfdR regula de
Introducción
99
forma positiva rpfF en medio XVM2 y además es importante para la adhesión a
superficies bióticas y abióticas, sin embargo no afecta a motilidad (Huang et al., 2013).
Figura 37. Regulación de la formación de biopelículas en Xcc. En la figura se muestran las principales
vías de regulación descritas, siendo el regulador central el di-GMPc explicado anteriormente. En este
esquema las flechas de color negro indican regulación positiva, y las flechas en azul regulación negativa.
Las flechas discontinuas muestran procesos hipotéticos que no han sido comprobados experimentalmente
(Li y Wang, 2011b).
El sistema de regulación de dos componentes RbfS/RbfR reconoce señales tanto
extracelulares como intracelulares. La proteína RbfR posee dominios REC y GGDEF
N-terminales y un dominio EAL en el extremo C-terminal. Afecta a los niveles de
diGMPc, aunque es posible que también regule la producción de lipopolisacárido de
forma directa (Li y Wang, 2011b). El sistema RavS/RavR en X. campestris pv.
campestris parece ser un sensor de los niveles de oxígeno en el medio y regula la
formación de biopelículas a través del diGMPc en ambas especies, posiblemente
mediante la producción de exopolisacárido, la motilidad y la quimiotaxis (He. et al.,
2009; Li y Wang, 2011b). ColS/ColR también regula la formación de biopelículas en
Xcc, este sistema participa en la regulación de bastantes procesos celulares y en el
mantenimiento de la integridad y funcionalidad de la membrana externa. La regulación
en biopelículas tiene lugar por el efecto en la formación de SST3, y la producción de
lipopolisacárido (Li y Wang, 2011b; Yan y Wang, 2011). El regulador XbmR pertenece
a la familia de proteínas NtrC que poseen actividad ATPasa, está asociada a un gran
Introducción
100
número de procesos celulares, y regula el metabolismo de la bacteria, mediante el
diGMPc. La mutación de este gen afecta a la motilidad, quimiotaxis y formación de
biopelículas, sin embargo es posible que los dos últimos procesos se vean afectados
porque son dependientes de la motilidad dependiente del flagelo. Es posible que esta
proteína se una a RpoN2 para regular de forma positiva la formación del flagelo aunque
también es posible que los regule mediante diGMPc a través del FliA (Yaryura et al.,
2015). El regulador XRE y los sensores PKC y MASE1 participan en la formación de
biopelículas posiblemente mediante la regulación del exopolisacárido (Figura 37).
7. Fimbrias y pili
La mayoría de las bacterias patógenas tanto de animales como de plantas se adhieren a
la superficie del hospedador como paso previo a la infección para sobrevivir y colonizar
el tejido. El proceso de adhesión está mediado por varias estructuras de la superficie
bacteriana. Las estructuras filamentosas como los pili o las fimbrias permiten una mejor
adhesión y reconocimiento del huésped porque evitan las fuerzas repulsivas entre la
bacteria y la superficie del huésped que tiene lugar debido a la carga negativa tanto de la
superficie del tejido a colonizar como la de la bacteria. El pili permite a la adhesina
unirse al huésped (Proft y Baker, 2009). En bacterias Gram negativas se descubrieron en
1940 como receptores de bacteriófagos. Basándose en su estrategia de ensamblaje se
clasifican en 4 tipos:
7.1. Ensamblados mediante ruta de ujier-chaperona
Dentro de este grupo se encuentran los pili tipo I de enterobacterias, pili P de E. coli
uropatogénicas, y algunas adhesinas no fimbrilares, Chaperona/ujier (CU pili). En E.
coli uropatogénicas la presencia de esta estructura permite la adhesión al tejido del
tracto urinario y la colonización del mismo evitando que sean arrastradas por la orina
por lo que están implicadas en colonización y virulencia (Proft y Baker, 2009).
La estructura del filamento consiste una barra rígida con una única proteína adhesina en
la punta del filamento que se une de forma específica a hidratos de carbono presentes en
la superficie del tejido del hospedador.
Para el ensamblaje de esta estructura, las pilinas o subunidades estructurales del pilus,
son transportadas al espacio periplasmático mediante el sistema de secreción general
Introducción
101
donde se unen a una chaperona específica que participa en el plegamiento de las
subunidades y en el pre-ensamblaje de las mismas. Este complejo chaperona/pilina pasa
a la membrana externa uniéndose a una proteína ujier (usher) formando la base del
filamento. El ujier se encargará de abrir un poro en la membrana externa permitiendo el
paso de las subunidades de pilina (Proft y Baker, 2009).
Este tipo de pilus fue por primera vez descrito en Xanthomonadaceae en Xylella
fastidiosa, agente causal de varias enfermedades en plantas como la enfermedad de
Pierce en vid o la clorosis variegada de los cítricos. Tienen un tamaño comprendido
entre 0,4 y 1 µm de largo localizados en uno de los polos de la bacteria (Figura 38).
Figura 38. Pili y fimbrias en Xylella fastidiosa. A: microscopía de barrido de
las bacterias unidas a la superficie de forma polar mediante pili. B y C:
microscopía de transmisión de X. fastidiosa, los filamentos más largos
corresponden al Pili tipo IV y los cortos con el Pili tipo I. Modificado de
Meng et al. 2005.
Estas estructuras parecen estar implicadas en procesos de agregación y formación de
biopelículas ya que mutantes en genes relacionados con la formación de este pilus
mostraron menor adhesión y formación de biopelícula in vitro y mayor velocidad de
desplazamiento mediante twitching tanto in vitro como in planta, mostrando además
reducción significativa en su virulencia. Por otro lado su importancia en adhesión a
superficies es mucho mayor y más fuerte que la producida por los pili tipo IV y en
agregación intercelular. Sin embargo, los pili tipo I en Xylella, presentan baja similitud
Introducción
102
de secuencia con proteínas homólogas pertenecientes al género Xanthomonas (menos
del 25%) por lo que es posible que su función o su importancia en agregación sea
distinta (Li et al., 2007b; Meng et al., 2005; Mhedbi-Hajri et al., 2011b).
7.2. Pili tipo Curli
Se describió por primera vez en 1989 (Proft y Baker, 2009), es un polímero de proteínas
con estructura fibrilar en la que los monómeros se encuentran plegados de forma que las
láminas-β estén orientadas perpendicularmente a la dirección del pilus (Figura 39)
(Dueholm et al., 2012). Están presentes en E. coli y Salmonella spp donde se
describieron inicialmente (Proft y Baker, 2009). Estudios in silico han mostrado la
presencia de proteínas homólogas en un gran número de bacterias, la mayoría de ellos
en Proteobacterias en las subdivisiones α y γ-proteobacteria. Parecen, por tanto, estar
más extendidos de lo que en un principio se pensaba, una de las razones puede ser que
algunas de las secuencias proteicas que se ha descrito in silico como fibras amiloideas
de bacterias no enterobacterias comparten entre un 9 y un 33% de homología con la
curlina (CsgA) de E. coli (Dueholm et al., 2012).
Figura 39. Pili tipo Curli de cepas de E. coli enterohemorrágicas y
enteropatogénicas. Las barras miden 250µm (Saldaña et al., 2009).
El curli está formado por subunidades de curlina (CsgA), que poseen una estructura
característica y diferente de otras pilinas. La estructura de este pili se caracteriza por ser
un filamento no ramificado rico en láminas-β resistente a la digestión con proteasas y al
dodecyl sulfato de sodio (SDS) al 1%, lo que hace que requiera un tratamiento con
ácido fórmico para su separación en geles de SDS (Saldaña et al., 2009; Romero et al.,
2010). Además comparte características bioquímicas con las fibras amiloides de origen
eucariota encontradas en enfermedades neurodegenerativas como el Alzheimer y el
Introducción
103
Parkinson (Proft y Baker, 2009) y pueden ser detectados mediante la tinción con rojo
Congo.
El curli es ensamblado mediante nucleación/precipitación extracelular. Según este
modelo las subunidad CsgA, que es soluble, es secretada junto CsgB al exterior celular
mediante una lipoproteína de la membrana externa (CsgG) y dos proteínas accesorias
denominadas CsgE y CsgF que contribuyen además al ensamblaje. Una vez en el
exterior celular la curlina es nucleada formando una fibra mediante la proteína CsgB
(Proft y Baker, 2009).
Se ha caracterizado como PAMP (Pathogen-associated molecular pattern) activando la
respuesta inmune del hospedador (Proft y Baker, 2009), además su estructura favorece
la adhesión a superficies vivas y formación de biopelículas, pudiendo estar implicado en
virulencia de E. coli y Salmonella, además es probable que participe en la interacción
simbiótica entre Rhizobiales y leguminosas promoviendo la adhesión al tejido vegetal
(Saldaña et al., 2009; Dueholm et al., 2012). En Bacillus subtilis es un componente
mayoritario junto con los exopolisacáridos de la matriz que se forma en biopelículas
(Romero et al., 2010).
7.3. Familia Pilus CS1
Pilus CS1 es una familia serológicamente distinta de pili, asociada inicialmente con E.
coli enterotoxigénicas, se ha encontrado también en el género Salmonella que además
incluyen los pili CFA/I, CS2, CS4, CS14, CS17 y CS19 de E. coli enterotoxigénicas
patógenas de humanos (Folkesson et al., 1999; Proft y Baker, 2009; Sakellaris y Scott,
1998). En E. coli los genes encargados de la estructura y ensamblaje de este pilus
(cooBACD) parecen haber sido adquiridos recientemente, considerándose una isla de
patogenicidad (Sakellaris y Scott, 1998). El gen cooA codifica para la subunidad mayor
de esta pilina, siendo cooD la subunidad menor localizada en la parte distal del pilus,
cooB y cooC participan en el ensamblaje del pilus.
La subunidad mayor CooA tiene un tamaño inicial de 16k Da que pasa a 15,2 kDa
cuando está procesada (Sakellaris y Scott, 1998) y carece de homología de secuencia
con otras pilinas descritas, además de carecer de dos los residuos cisteína en el dominio
C-terminal que poseen los pilinas tipo IV y aquellas que son ensambladas mediante
chaperonas y ujier (Proft y Baker, 2009). Esta proteína junto con CooD son las proteínas
estructurales del pilus que participan en adhesión al huésped en un proceso aún
Introducción
104
desconocido. Aunque comparta únicamente un 13% de similitud con la subunidad
mayor, ambas proteínas comparten una secuencia conservada en el extremo C-terminal
común a las proteínas pertenecientes a esta familia A–G–x–Y–x–G–(x)6–T. CooD se
encuentra en la punta del pilus, en una proporción 1:8000 respecto a CooA por lo que
parece haber una subunidad de CooD por pilus. Es una proteína de 38kDa y es necesaria
para el ensamblaje del pilus (Sakellaris y Scott, 1998). CooC es una proteína ujier que
se encuentra en la membrana externa y que permite el paso de las subunidades de pilina
del espacio periplásmico al exterior celular. CooB es una proteína estabilizadora, forma
complejos con CooA, C y D evitando su proteólisis en el espacio periplásmico
facilitando además un correcto plegamiento y polimerización de las proteínas. Su
función es similar a la de las chaperonas, aunque no comparte secuencia con ninguna de
las chaperonas periplásmicas descritas (Sakellaris y Scott, 1998).
El mecanismo de ensamblaje se ha descrito como de ujier-chaperona alternativo (Proft y
Baker, 2009). Las pilinas son transportadas al periplasma a través del sistema de
secreción Sec donde se unen a CooB, el complejo CooD-CooB se une al
ujier/transportador CooC que también es estabilizado con CooB, una vez CooD se ha
unido a CooC el estabilizador se libera para transportar otras subunidades de pilina.
Parece que la unión de CooD con CooC modifica la estructura de la última permitiendo
la unión de la subunidad mayor CooA que permitirá la elongación del pilus (Sakellaris y
Scott, 1998).
7.4. Pili tipo IV
El término Pili tipo IV fue usado por primera vez por Ottow en 1975. Se encuentran
presentes en varias especies bacterianas tanto Gram negativas, E. coli, Pseudomonas
aeruginosa, Salmonella enterica, Vibrio cholereae, etc, como Gram positivas en los
géneros Clostridia y Ruminococcus, incluso también en cianobacterias (Proft y Baker,
2009).
Posee una estructura filamentosa formada por polímeros de uno o varios tipos de pilinas
de entre 15 y 20 kDa. Su tamaño comprende entre 50 y 80 Armstrong (Å) y varias
micras de largo que son capaces de unirse longitudinalmente pudiendo soportar fuerzas
de más de 100 pN (picoNewtons) (Figura 40) (Craig et al., 2004; Proft y Baker, 2009).
Introducción
105
Figura 40: extensión y retracción de pili tipo IV en Neisseria gonorrhoeae. Modificado de Alexey J
Merza y Katrina T Forest (Merz y Forest, 2002).
Las subunidades o pilinas que forman el pili tipo IV o el pseudopili tipo II tienen forma
de cucharón y poseen tres partes estructurales características que son las α-hélices en el
dominio N-terminal de la proteína, el dominio globular C-terminal y los bucles que
unen distintas estructuras en la proteína. El dominio N-terminal contiene el péptido
señal que está muy conservado dado que variaciones pequeñas incluso de un único
residuo pueden impedir el ensamblaje del pilus y la funcionalidad del mismo. Este
dominio, posee dos subdominios; el α1N-terminal que sobresale del dominio globular
C-terminal y sirve de anclaje de la pilina en la membrana interna, y el espacio
citoplasmático durante la formación y retracción del pilus, además es posible que sea un
dominio regulador. El otro dominio α1C se encuentra embebido en el dominio globular
C-terminal y es de naturaleza anfipática. En función de la longitud del péptido señal y la
secuencia modificada se han clasificado en pili tipo IVa y IVb. Los primeros se
encuentran en un gran número de bacterias con distinta gama de huésped (plantas,
animales y hongos) entre ellas P. aeruginosa, Neisseria spp. y Azoarcus spp., los
segundos parecen ser exclusivos de bacterias colonizadoras del intestino Vibrio
cholerae, Salmonella enterica y Escherichia coli (Craig et al., 2004; Craig y Li, 2008;
Giltner et al., 2012). La comparación de las estructuras tipo IVa y IVb muestra que la α-
hélice N-terminal y la estructura de ensamblaje están conservadas en ambos grupos,
pero presentan estructuras y secuencias diferentes en su superficie además de diferentes
plegamientos (Craig et al., 2004). El dominio globular C-terminal (head domain) está
formado hebras-β antiparelas. La mayor diversidad de las pilinas tiene lugar en los
bucles que conectan las distintas estructuras de las pilinas y son importantes en el
ensamblaje y estabilidad del pilus. Parece que pueden tener un papel en la interacción
Introducción
106
entre las subunidades que comprende el pilus. Además los bucles que se encuentran en
la parte superficial del pilus forman cavidades y pliegues que pueden servir de sitios de
unión para otras moléculas como el ADN en el caso del pilus o elastasas y secretinas en
el caso del pseudopilus. Existen tres tipos de bucles presentes en todas las pilinas; el
bucle que conecta la α-hélice N-terminal con el resto de la proteína, denominada bucle-
αβ, este bucle además puede presentar estructuras como hélices-α y hebras-β en pilinas.
El segundo bucle es el que conecta las hebras-β que forman la lámina-β y por último el
bucle C-terminal denominado región D, presente en la subunidades mayores y en
algunas de las menores de pilina que formarán el pilus. Este último se caracteriza por la
presencia de residuos de cisteína que forman puentes disulfuro y unen el extremo de la
proteína con la lámina-β. Esta parte es muy variable en secuencia y longitud siendo
además un epítopo importante (Giltner et al., 2012).
Las prepilinas son sintetizadas en el citosol e insertadas en la membrana citoplasmática
a través del sistema Sec (Giltner et al., 2012). Con el dominio C-terminal en la parte
externa de la membrana citoplasmática. Estas pilinas permanecen ancladas a la
membrana interna por la hélice en el dominio N-terminal donde es metilada. El dominio
globular de la pilina pasa al espacio periplásmico y los puentes disulfuro son catalizados
por una oxireductasa (Craig y Li, 2008).
Figura 41. Modelo e interpretación de la retracción del pili tipo IV propuesta por G. Oster
(Kaiser, 2000).
Para la extensión y retracción del pilus se necesita degradación de ATP a través de dos
ATPasas distintas pertenecientes a la superfamilia de NTPasas de secreción tipo II/IV
(Craig y Li, 2008).
Introducción
107
Está descrito en P. aeruginosa y en otras especies bacterianas que la regulación
transcripcional del pilus tipo IV tiene lugar a través de un factor σ54
(RpoN) que forma
un complejo con la RNA polimerasa y el ADN. Para que la transcripción tenga lugar es
requerida la presencia del regulador de la respuesta en forma fosforilada PilR
perteneciente al sistema de regulación de dos componentes (PilR-PilS). En este sistema
PilS es el sensor histidín-quinasa que es capaz de autofosforilarse al recibir una señal
que por ahora es desconocida, pasando el grupo fosfato a PilR y permitiendo por lo
tanto la expresión de la subunidad mayor de la pilina. Además de los factores
ambientales que controlan la expresión de PilA, ésta es además autorregulada por el
número de pilinas presentes en la membrana citoplasmática, a través de PilS
interacciona con el dominio N-terminal de las pilinas inhibiendo su transcripción
cuando hay muchas pilinas ancladas en la membrana y favoreciéndola cuando el
número de pilinas es menor (Giltner et al., 2012).
Todas las especies secuenciadas del género Xanthomonas poseen genes relacionados
con los pili tipo IV (Mhedbi-Hajri et al., 2011b; van Doorn et al., 2001). En algunas
especies, como en X. campestris pv. vesicatoria se han descrito dos genes que codifican
para los pili tipo IV, aunque parece haber predominancia en la expresión de uno sobre el
otro. Se han observado duplicaciones de los genes que codifican para la subunidad
principal del pilus en X. campestris pv. campestris cepas 8004 y ATTCC33913 y en Xcc
aunque su función todavía es desconocida (da Silva et al., 2002; Dunger et al., 2014;
Jalan et al., 2013b; Ojanen-Reuhs et al., 1997; Qian et al., 2005). Ralstonia
solanacearum también posee una duplicación pilA, el gen plpA con una similitud del
50% que no es necesario para la síntesis y ensamblaje del pilus tipo IV (Kang et al.,
2002). Además se ha descrito la participación de los pili tipo IV de X. hyacinthi en
virulencia, utilizándose esta estructura para la detección y diagnóstico de la enfermedad
mediante PCR (van Doorn J et al., 1994). En Xcc se ha investigado el papel del pili tipo
IV en unión a fagos, siendo además importante en el movimiento tipo twitching y en la
formación de biopelículas estructuradas y adhesión al huésped sin embargo, no parece
tener un papel importante en virulencia (Dunger et al., 2014; Su et al., 1999; Yang et al.,
2004).
Funciones del pili tipo IV 7.4.1.
Los pili tipo IV son capaces de realizar diversas funciones relacionadas con la secuencia
de la proteína, a veces un único residuo pueden afectar a la función del pili (Giltner et
Introducción
108
al., 2012). Por otro lado la función de esta estructura puede variar en los distintos
microorganismos que la poseen (Craig et al., 2004).
El pilus tipo IV posee un papel importante en la formación de agregados en X.
campestris pv. vesicatoria tanto in vitro como in planta. Mutantes en el gen que codifica
para pili tipo IV fueron incapaces de adherirse a los tricomas de la hoja y no mostraron
diferencias en infección cuando fueron inoculados por infiltración (Ojanen-Reuhs et al.,
1997). Los pili tipo IV de X. hyacinthi, agente causal del amarilleamiento del Jacinto,
parecen estar relacionados con adhesión a los estomas de la planta sugiriendo un papel
en las primeras etapas del desarrollo de la enfermedad (van Doorn J et al., 1994). En X.
fastidiosa parece tener un efecto contrario puesto que mutantes que carecen del pili tipo
IV muestran una mayor capacidad para agregarse, que podría deberse a una mayor
capacidad para hacer twitching y a la presencia de los pili tipo I, que como se ha
mencionado antes parecen tener un papel importante en la formación de agregados
(Meng et al., 2005). En Xcc 306 el pilus tipo IV parece estar relacionado con la
formación de biopelículas maduras y con la adhesión a superficies vegetales, sin
embargo su papel en virulencia no parece ser relevante cuando el patógeno se inocula
por infiltración (Dunger et al. 2014).
La naturaleza retráctil del pilus tipo IV es lo que permite el movimiento tipo twitching,
puesto que mutantes que carecen de PilT, la ATPasa encargada de la retracción del pilus
no son capaces de moverse. Sin embargo el hecho de que las bacterias posean pili tipo
IV retráctiles no implica que haya motilidad tipo twitching (Giltner et al., 2012). Se han
descrito en P. aureginosa movimientos tipo walking (andando) y crawling (gateando)
que también son dependientes del pili tipo IV y que se han comentado en el apartado de
motilidad.
Además del movimiento tipo twitching, el pilus tipo IV parece estar implicado en otros
movimientos en superficie. Mutantes en P. syringae pv. tabaci 6605 de genes que
codifican para la subunidad principal del pili (pilA), dos subunidades menores (fimU y
fimT) y pilO, mostraron fenotipos más lentos en el movimiento tipo swimming en medio
semisólido, pero no en medio líquido y también en swarming (Taguchi y Ichinose,
2011). Mutantes de R. solanacearun, patógeno del suelo que produce marchitez en un
gran número de especies vegetales, en pilQ, que codifica la proteína de la membrana
externa encargada de secretar al exterior el pilus tipo IV, y en pilA que codifica para la
subunidad mayor del pilus, vieron reducida su capacidad para hacer twitching, además
Introducción
109
de su capacidad de agregación y virulencia en plantas de tomate (Liu et al., 2001; Kang
et al., 2002). Por otro lado mutantes en X. fastidiosa en pilQ también vieron reducida su
capacidad mótil in vitro (Meng et al., 2005; Li et al., 2007b). Mutantes en la subunidad
mayor del pilus de Xcc 306 no fueron capaces de realizar twitching (Dunger et al.
2014).
En Neisseria gonorrhoeae la propia estructura del pilus y el ensamblaje de las
subunidades de pilina produce unas zonas, a modo de surcos, que recorren el pilus con
carga positiva a las que se une ADN. El ADN se introduce al interior de la bacteria
cuando el pilus se retrae (Craig y Li, 2008). Este fenómeno también se ha escrito que
tiene lugar en R. solanacearum (Kang et al., 2002).
Varias proteínas son secretadas a través del pilus tipo IV, entre ellas el factor de
colonización TcpF de V. cholerae, proteasas de D. nodosus y varios efectores (factores)
de virulencia en Fransciella tularensis (Giltner et al., 2012).
Como se ha mencionado anteriormente los pili tipo IV son capaces de unir el fago
filamentoso cf, puesto que mutantes de Xcc en una de las pilinas no muestran
susceptibilidad a este tipo de fago (Su et al., 1999). La unión a fagos mediante este pilus
se ha descrito también en otras bacterias Gram negativas como Neisseria gonorrheae,
N. meningiditis y P. aeruginosa.
111
CAPÍTULO 2: OBJETIVOS
CAPÌTULO 2: Objetivos
113
Objetivos de la tesis
El objetivo general de este trabajo era profundizar en el conocimiento de algunos
mecanismos que forman parte de los primeros estadíos de infección en la cancrosis
o chancro bacteriano de los cítricos: quimiotaxis, motilidad y formación de
biopelículas.
Este objetivo general se ha abordado siguiendo los siguientes objetivos parciales
1. Estudiar mecanismos de quimiotaxis en Xanthomonas citri subsp. citri en
comparación con otras Xanthomonas patógenas o no de cítricos
1.1. Determinar sustancias que inducen quimiotaxis en las diferentes especies
de Xanthomonas estudiadas
1.2. Determinar fracciones de plantas de diferentes especies que inducen
quimiotaxis en las distintas cepas de Xanthomonas estudiadas
1.3. Localizar y estudiar sensores de quimitaxis tipo MCPs en las diferentes
especies y cepas de Xanthomonas estudiadas
1.4. Asociar los perfiles resultantes del análisis de sustancias quimioefectoras,
fracciones de plantas y perfiles de MCPs al rango de huésped de las especiesde
Xanthomonas estudiadas
2. Estudiar la formación de biopelículas o biofilms en Xanthomonas citri subsp.
citri en comparación con otras especies de Xanthomonas y caracterizar algunos
de los componentes de la matriz de las mismas
2.1. Estudiar la formación de biopelículas en condiciones bióticas y abióticas
en especies de Xanthomonas patógenas de cítricos
2.2. Determinar diferencias en la formación de biopelículas entre cepas
perternecientes a la especie Xanthomonas citri subsp. citri con diferente gama
de huésped y con otras Xanthomonas patógenas o no de cítricos
2.3. Estudiar la composición de las matrices de biopelículas y determinar
posibles diferencias entre las diferentes cepas de Xanthomonas estudiadas
CAPÌTULO 2: Objetivos
114
3. Estudiar la expresión de genes implicados en motilidad y formación de
biopelículas y determinar las posibles diferencias entre cepas de amplia y
limitada gama de huésped de Xanthomonas citri subsp. citri
115
CAPÍTULO 3: MOTILIDAD Y QUIMIOTAXIS EN
Xanthomonas citri subsp. citri CON DISTINTA
GAMA DE HUÉSPED
Enviado a Environmental Microbiology Reports
Differential Chemotaxis and Motility of Xanthomonas citri subsp. citri
strains with different host range
Sena-Vélez, M., 1 Ferragud. E.
1, Graham, J.H.
2, Redondo, C.
1, Cubero, J
1.
1Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria (INIA), Ctra de
La Coruña Km 7,5 (Madrid), Spain. 2University of Florida, Citrus Research and
Education Center (CREC) 700 Experiment Station Road. Lake Alfred, FL 33850-2299,
USA.
CAPÍTULO 3. Motilidad y quimiotaxis en Xanthomonas citri subsp. citri con distinta gama de huésped
117
1. Abstract
Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc) A strain is the causal agent of citrus bacterial
canker (CBC) on most Citrus sp. and close relatives. Two narrow host range strains of
Xcc, Aw and A*, from Florida and Southwest Asia, respectively, infect Mexican lime
(Citrus aurantifolia) and alemow (C. macrophylla). In the initial stage of host infection,
these xanthomonads enter via stomata to reach the apoplast. Herein, we investigated the
differences in chemotactic responses for wide and narrow host range strains of Xcc A,
X. alfalfae subsp. citrumelonis, the causal agent of citrus bacterial spot, and X.
campestris pv. campestris, the crucifer black rot pathogen. These strains of
Xanthomonas were compared for carbon source utilization, the chemotactic responses
toward carbon compounds, and responses to leaf extracts or apoplastic fluids. Different
chemotactic responses occurred for carbon sources, leaf extracts and apoplastic fluids
depending on the Xanthomonas strain and the host plant from which the leaf fractions
were derived. Differential chemotactic responses to carbon sources and leaf fractions
suggest that these Xanthomonas strains sense host specific signals that facilitate their
location and entry of stomatal openings or wounds.
CAPÍTULO 3. Motilidad y quimiotaxis en Xanthomonas citri subsp. citri con distinta gama de huésped
118
2. Introduction
Citrus bacterial canker (CBC) is one of the most important bacterial diseases for citrus
in tropical and subtropical areas of the world. CBC is characterized by necrotic,
erumpent lesion on leaves, fruit and stems which when severe may cause premature
defoliation and fruit drop on Citrus species and close citrus relatives in the family
Rutaceae (Gottwald et al., 2001; Graham et al., 2004). Distinct types of CBC have been
described caused by different bacteria within the genus Xanthomonas. Symptoms of
these canker diseases are generally similar and initially all the causal bacterial strains
were classified within the same species of the genus (Gottwald et al., 2001; Graham et
al., 2004; Schaad et al., 2005; Schaad et al., 2006; Vauterin et al., 1995; Vauterin et al.,
2000). Currently two species of Xanthomonas are described as causal agents of CBC.
Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc), formerly X. axonopodis pv. citri, is by far the most
widespread and causes CBC A type on the broadest host range. X. fuscans subsp.
aurantifolii (formerly X. axonopodis pv. aurantifolii) causes CBC B and C types which
were described on lemon (C. limon) and Mexican or Key lime (C. aurantifolia) in
Argentina and Brazil, respectively (Gottwald et al., 2001; Graham et al., 2004). In
addition, two strain groups of Xcc A strain, A* and Aw, have been characterized as
genetically distinct from the Xcc A (Vernière et al., 1998; Sun et al., 2004). A* and Aw
strains occur in Southwest Asia and Florida, respectively, and have a narrow host range
that includes Mexican lime (C. aurantifolia) and alemow (C. macrophylla). Although in
field these strains only cause disease on lime, when they are infiltrated into leaves of
other citrus species they produce atypical lesions, slightly raised with no rupture of the
epidermis (Vernière et al., 1998; Sun et al., 2004). Furthermore, Xcc Aw strain is able to
cause hypersensitive response on Duncan grapefruit (C. paradisi) when infiltrated into
leaves (Sun et al., 2004).
Chemotaxis is the mechanism which enables bacteria to sense stimuli such as nutrients,
light and temperature, that attract them to the site that is optimally suited for host
colonization and infection (Adler, 1966). For example, jasmonate is a plant signal that
attracts Dickeya dadantii to wounds facilitating entry of the host and enhancing the
infection process (Antúnez-Lamas et al., 2009a). Moreover, Ralstonia solanacearum
strains isolated from different host and geographic areas show specific chemotactic
responses to a diversity of sugars and are more attracted by host root exudates than non-
host root exudates (Yao & Allen, 2006). Furthermore, mutations in the chemotaxis
CAPÍTULO 3. Motilidad y quimiotaxis en Xanthomonas citri subsp. citri con distinta gama de huésped
119
pathway of R. solanacearum reduce infection (Yao & Allen, 2006). Detection of some
environmental signals is mediated by methyl-accepting chemotaxis proteins (MCPs)
which have been characterized for several plant pathogenic xanthomonads including
Xcc (Mhedbi-Hajri et al., 2011a).
Xcc is dispersed by wind and rain. Wind speed increases the infection by facilitating
bacterial entry into the leaves via stomata or wounds (Graham et al., 2004; Bock et al.,
2010b). However, Xcc infection is also produced at low wind speed or in the absence of
wind (Bock et al., 2010b) which suggests the existence of other mechanisms allowing
bacteria to reach the apoplast. If there is water on the leaf surface, bacterial movement
and entry into stomata or wounds may be mediated by chemotaxis. This hypothesis is
supported by confocal laser scanning microscopy (CLSM) of Xcc A which showed
bacteria congregate at the edge of the stomata immediately after the spray-inoculation of
leaves (Cubero et al., 2011). In addition, strains Xcc MI (A type, wide host range) and
X. alfalfae subsp. citrumelonis F1 (Xac) were detected in the apoplast of Swingle
citrumelo leaves, while a non-host strain of Xcc 12879 (Aw type) was not present. In
contrast, all of these citrus strains were found to extensively colonize the apoplast of
Mexican lime leaves (Sena-Vélez et al., 2014). Similarly, Xc mutants in the flagellar
synthesis cascade (flhA) impaired in swimming motility were reduced in virulence on
cabbage plants (Yang et al., 2009), which indicates a putative role for motility in the
infection process. Furthermore, D. dadantii 3937 moved to wounds on chicory
(Cichorium intybus) leaves in response to jasmonate which increased infection
(Antúnez-Lamas et al., 2009a). Additionally, in a recent study of Pseudomonas
syringae B728a, chemotaxis and motility related genes were overexpressed during the
epiphytic stage of the interaction on bean leaves, but not after reaching the apoplast (Yu
et al., 2013). These events suggest the requirement for active bacterial motility and
chemotaxis on the plant surface to locate and colonize the apoplastic site.
Studies have elucidated the pathogenesis mechanisms that are responsible for the
differences in host range of Xcc strains (Al-Saadi et al., 2007; Rybak et al., 2009), but
they did not address early events in the infection process including motility mediated by
chemotaxis. Furthermore, a study suggests that environmental sensors in Xanthomonas
have evolved according to the adaptation of the bacterial species to the host (Mhedbi-
Hajri et al., 2011a). In this study, we characterized the chemotactic responses of Xcc A
and A* or Aw strains and compared their behavior with X. alfalfae subsp. citrumelonis
CAPÍTULO 3. Motilidad y quimiotaxis en Xanthomonas citri subsp. citri con distinta gama de huésped
120
(Xac), the causal agent of citrus bacterial spot (CBS), a disease of citrus nursery plants
and X. campestris pv. campestris (Xc), the cause of crucifer black rot (CBR). Our aim
was to identify profiles of compounds that act as attractants or repellents for
Xanthomonas strains, and to relate these profiles to their host range and carbon source
utilization. In addition, we evaluated the chemotactic response to apoplastic fluids and
extracts from citrus and non-citrus hosts to determine if the chemotaxis signals explain
host specificity of Xanthomonas strains at an early stage of infection.
3. Results
3.1. Carbon source utilization by Xanthomonas strains
Carbon source utilization was analysed for bacterial strains listed in Table 1 with Biolog
GN2 Microplate TM
(Biolog Inc. Hayward, CA, USA) following manufacturer
instructions.
Table 1. Strains and hosts of Xanthomonas spp. used in the study
Strain Taxon, or disease and CBC type Natural Host
Xcc 306 Xanthomonas citri subsp. citri, CBCa A Citrus spp.
Xcc 62 Xanthomonas citri subsp. citri, CBC A Citrus spp.
Xcc Iran2 Xanthomonas citri subsp. citri, CBC A* Citrus aurantifolia
Xcc Iran10 Xanthomonas citri subsp. citri, CBC A* Citrus aurantifolia
Xcc 12879 Xanthomonas citri subsp. citri, CBC Aw Citrus aurantifolia
Xac F1 Xanthomonas alfalfae subsp. citrumelonis, CBS Citrus spp.
Xc 1609 Xanthomonas campestris pv. campestris, CBRc Brassica spp.
aCitrus bacterial canker (CBC)
bCitrus bacterial spot (CBS)
cCrucifer black rot (CBR)
Readings were made at 0 and 24 h post inoculation (hpi) to detect the earliest metabolic
response. Carbon sources utilized by all strains were: Tween 40, N-acetyl-D-
glucosamine, D-cellobiose, D-fructose, D-galactose, gentiobiose, α-D-glucose, maltose,
D-mannose, D-psicose, D-trehalose, pyruvic acid methyl-ester, α-keto glutaric acid,
succinic acid, bromosuccinic acid, L-glutamic acid, L-proline, L-serine, L-threonine and
CAPÍTULO 3. Motilidad y quimiotaxis en Xanthomonas citri subsp. citri con distinta gama de huésped
121
glycerol. Differentially utilized carbon sources by Xanthomonas strains are presented in
Table 2. Citrus strains were able to utilize Cis-aconitic acid, L-alaninamide, L-alanyl-
glycine and glycil-L-glutamic acid, while Xc 1609 utilized Tween 80, D-saccharic acid
and uridine. Among the citrus strains, only Xcc Iran10 responded to uridine. Xcc A, A*
and Aw strains responded to sucrose while Xac did not. Xcc 306 was atypical compared
with all other Xcc A strains in that no activity was detected for dextrin, L-fucose,
lactulose and α-keto butyric acid. Utilization of glycyl-L-aspartic acid, propionic acid,
D-alanine and L-alanine differentiated the narrow host range strains A* and Aw, which
were able to metabolize these carbon sources, from the wide host range strains that did
not. Xcc A* strains were the only ones that responded to α-D-lactose, turanose and L-
aspartic acid. In addition, Xcc A* strains responded the same as Xac and Xc strains to D-
melobiose, α-hydroxybutiric acid, DL-lactic acid and DL- α-glycerol phosphate.
To study the relatedness of the metabolic response among Xanthomonas strains, cluster
analysis was performed by transforming the data to binary form (uninformative carbon
sources were dropped from the analysis). Cluster analysis demonstrated that citrus
pathogenic strains were grouped in the same cluster and Xcc A strains were grouped
according to host range i.e., Xcc A* and Aw
strains were clustered together and were not
close to the Xc strain causing cabbage black rot (Fig. 1A).
These results are consistent with previous findings wherein Xcc A strains showed a
common carbon source utilization profile (Vernière et al., 1993; Vernière et al., 1998;
Sun et al., 2004). In addition, among Xcc strains studied, those with a wide citrus range
were distinct from narrow host range strains Xcc, A* and Aw strains or Xac causing
citrus bacterial spot. These results are consistent with those of Vernière et al. (1998)
who reported that only 4.3% of Xcc A* strains were identified as Xcc A using Biolog.
These findings suggest for these strains that there is a relationship between host range
and carbon source utilization.
CAPÍTULO 3. Motilidad y quimiotaxis en Xanthomonas citri subsp. citri con distinta gama de huésped
122
Table 2. Biolog activity of carbon sources for species and strains of Xanthomonas pathogenic on citrus
and crucifersa.
Strains/additive Xcc
306
Xcc
62
Xcc Aw
12879
Xcc
Iran2
Xcc
Iran10
Xac
F1
Xc
1609
Dextrin - c + + + + + +
Glycogen + b + NI + + + NI
Tween 80 - - - - - - +
L-Arabinose - - - - NI NI -
D-Arabitol - - - - - NI -
L-Fucose NId
+ + + + + +
α-D-Lactose - - - + + NI -
Lactulose NI + + + + + +
D-Melobiose - NI - + + + +
D-Raffinose - - - NI NI NI NI
Sucrose + + + + + NI +
Turanose - - - + + NI NI
Succinic Acid Mono-
Methyl-Ester NI + + + + + +
Cis-Aconitic Acid + + + + + + -
D-Gluconic Acid - - - - NI - -
α-Hidroxybutyric Acid - - NI + + + +
β-Hidroxybutyric Acid - - - - NI NI NI
α-Keto Butyric Acid - + + + + + +
D,L-Lactic Acid - - NI + + + +
Malonic Acid NI NI + + + + +
Propionic Acid - - + + + - +
D-Saccharic Acid - - - - - - +
Succinamic Acid NI + + + + + NI
L-Alaninamide + + + + + + NI
D-Alanine - - + + + + -
L-Alanine NI - + + + + NI
L-Alanyl-Glicine + + + + + + -
L-Asparagine - - NI - NI - -
L-Aspartic Acid - - NI + + - NI
Glycyl-L-Aspartic Acid - - + + + - -
Glycyl-L-Glutamic Acid + + + + + + NI
Hydroxy-L-Proline - - - - NI - NI
Urocanic Acid - - - - NI - -
Uridine - - - - + - +
D.L-α-Glycerol Phophate - - NI + + + -
α-D-Glucose-1
-Phosphate - NI - + + NI -
D-Glucose-6-Phosphate - - - + + + - aCarbon source utilization was calculated by subtracting the time 0 absorbance from each well reading.
Substrate well readings were further adjusted against the substrate blank well and each activity value was
CAPÍTULO 3. Motilidad y quimiotaxis en Xanthomonas citri subsp. citri con distinta gama de huésped
123
the average of three assays with two replicates per assay. Wells with ≥160% of activity at 24h compared
to the blank were considered positive (+)b and ≤130% were considered negative (-)
c. Values from 130 to
160% were considered non-informative and dropped from further analysis (NI)d.
3.2. Chemotactic response of Xanthomonas strains to carbon compounds
In order to define the chemotactic profile for Xanthomonas strains, a novel chemotaxis
assay was developed. In this assay, the quantity of bacteria entering into a tip containing
the carbon source assessed the chemotactic response independently of bacterial growth.
The assay is similar to those described previously (Feng and Kuo, 1975; Han and
Cooney, 1993; Palleroni, 1976) with the additional capability to assess several
compounds simultaneously. This assay was validated with D. dadantii 3937 and the
results matched those previously reported; 10 mM cysteine was repellent, and 10 mM
sodium citrate, 10 mM glucose and 1 and 200 mM serine were attractants (Antúnez-
Lamas et al., 2009a; Antúnez-Lamas et al., 2009b).
All Xanthomonas strains responded to 10 mM cysteine as a repellent and 0.2% glycerol,
200 mM serine and 10 mM sucrose as attractants (Table 3). Sucrose was previously
reported as an attractant for other Xanthomonas such as Xc (Kamoun and Kado, 1990)
and X. oryzae (Feng & Kuo, 1975) which also validates the assay and suggests that
sucrose is a conserved chemoattractant for xanthomonads. The responses that
differentiated Xcc A strains from Xac F1 and Xc 1609 were 150 mM leucine, 0.2%
mannitol, 10 mM xylose and 10 mM serine. Furthermore, Xc 1609 was differentiated
from the citrus pathogenic strains for the following carbon sources: 10 mM alanine and
10 mM leucine as repellents, and 10 mM glucuronic acid as an attractant. Within the
Xcc A strains different chemotactic responses were observed, as reported for R.
solanacearum (Yao & Allen, 2006). Xcc 306 and Xcc 62 were uniquely attracted to 10
mM galacturonic acid and Xcc 62 to 10 mM arginine. Cluster analysis, performed as
explained above, was based on attractants identified from the chemotactic profiles
(Table 3). This analysis grouped Xcc A strains together and the narrow host range Xcc
Iran2 (A*) and Xcc 12879 (Aw) within a subgroup. Xcc A 62 was more closely grouped
with narrow host range strains than Xcc A 306 (Fig. 1B).
CAPÍTULO 3. Motilidad y quimiotaxis en Xanthomonas citri subsp. citri con distinta gama de huésped
124
Figure 1. Dendrograms showing relationships among Xanthomonas strains based on data from: A, Biolog
GN2 activity; B, chemotactic assay. Data were converted to binary form and similarity coefficients for
pairs of strains were calculated with the program NTSYS, version 2.1 (Exeter Software, Setauket, N.Y.)
using SIMQUAL with Jaccard coefficient and subjected to unweighted pair group method (UPGMA).
Similarities were calculated by using Jaccard coefficient and clustering was achieved by UPGMA using
program NTSYS, version 2.1 (Exeter Software, Setauket, N.Y.). r, refers to the cophenetic correlation
index.
Chemotactic responses were similar for narrow host range strains while responses of the
wide host range strains were variable between the two strains tested. Based on cluster
analysis of carbon source utilization and chemotaxis assays, groupings of Xcc A strains
were similar to those obtained with markers from MLSA and AFLP assays (Bui Thi
Ngoc et al., 2010), i.e., narrow host range A strains were more closely related to each
other than to wide host range strains (Fig. 1A & B). Strain Xcc 306, although
metabolically similar to Xcc 62, showed the most unique chemotactic profile among Xcc
strains.
CAPÍTULO 3. Motilidad y quimiotaxis en Xanthomonas citri subsp. citri con distinta gama de huésped
125
Table 3. Chemotactic response for species and strains of Xanthomonas pathogenic on citrus and crucifers.
a The assay was performed as follows; pipette tips containing 5 µL of the carbon source were inserted into
48 wells of a microtiter plate each filled with 200 µL of a 108
cfu mL-1
bacterial suspension. To measure
chemotaxis, the number of bacteria that entered the tip in one hour was estimated by means of serial
dilutions of the contents in the tip. The carbon source was considered a chemoattractant (+)b or
chemorepellent (-)d when the average number of bacteria that entered the tip in 6 replicates from at least 2
assays was significantly (P<0.05) higher or lower than the control with 10 mM MgCl2. When P>0.05 no
response was considered (0)c. Data were subjected to analysis of variance using Student-Newman-Keuls
method to determine significant differences between the means of the values for the carbon source
amended medium and the negative control. Statistical analyses were performed using STATGRAPHICS
Plus, version 5.1 (Copyright Manugistics Inc.).
Additive Xcc 306 Xcc 62 Xcc Iran2
A*
Xcc Aw2879 Xac F1 Xc 1609
Sodium Citrate 10mM +b
0c + + 0 0
Fructose 10mM 0 + 0 + -d 0
Galactose 10mM 0 + 0 + 0 +
Glucose10mM 0 0 0 + - 0
Maltose 10mM 0 + + + 0 +
Sucrose 10mM + + + + + +
Xylose 10mM 0 0 0 0 - -
Arginine 10mM 0 + 0 0 0 0
Arginine 100mM 0 + + + + +
Alanine 10mM 0 + + 0 0 -
Alanine 250mM + + + + 0 +
Cysteine 10mM - - - - - -
Leucine 10mM + 0 0 0 0 -
Leucine 150mM + + + + - 0
Serine 10mM 0 0 0 0 - -
Serine 200mM + + + + + +
Glycerol 0,2% + + + + + +
Mannitol 0,2% + + + + - 0
Galacturonic Acid 10mM + + 0 0 + 0
Glucuronic Acid 10mM 0 0 0 0 0 +
Citric Acid 10mM - 0 0 - 0 0
Succinic Acid 10mM 0 + + 0 + 0
Cumaric Acid 10mM 0 + 0 + + 0
CAPÍTULO 3. Motilidad y quimiotaxis en Xanthomonas citri subsp. citri con distinta gama de huésped
126
Biofilm formation has been reported as important factor for Xcc to establish the
infection and to survive on the plant surface (Cubero et al., 2011; Rigano et al., 2007).
Furthermore, a recent study reported that Xcc biofilm formation in planta varies
according the host range and the host, i. e., narrow Xcc host range strain Aw produces
less biofilm on non-host than host leaves (Sena-Vélez et al., 2014). Several studies have
reported that chemotaxis plays a key role in both bacterial attachment and biofilm
development possibly in response to the environment for several bacterial species
including Xcc (Kostakioti et al., 2013; Merritt et al., 2007b; Moreira et al., 2014;
Schmidt et al., 2011; Yaryura et al., 2015). Therefore, the variation in the chemotactic
profile of Xcc as observed for biofilm formation (Sena-Vélez et al., 2014) may also play
a role at early stage of the infection and on host range (Yaryura et al., 2015; Moreira et
al., 2014).
3.3. Chemotactic response of Xanthomonas strains to leaf fractions
To confirm the role of chemotaxis at an early stage of leaf infection and its relation to
host range, the strains were tested for response to leaf fractions from different plant
species. Chemotaxis was tested as described above for whole leaf extracts and
apoplastic fluid from sweet orange (C. sinensis) var. ‘Valencia Late’, Mexican lime and
Chinese cabbage (Brassica pekinensis) var. Kasumi F1. To obtain whole leaf extracts,
leaves were ground in liquid nitrogen, suspended in sterile distilled water and then
centrifuged to pellet the leaf tissue. Apoplastic fluid was extracted as previously
described for Solanum lycopersicum (Rico and Preston, 2008). All fractions were
sterilized by passing them through a 0.2 µm filter. To evaluate the effect of extracts and
apoplastic fluids, chemotaxis assays were performed with fractions of 200, 100, 50,
12.5, 6.3 and 3.1 mg of leaf per mL of sterile distilled water.
The relationship between apoplastic fluid or leaf extract concentration and the
proportion of the bacteria entering to the tip was expressed as the log cfu bacteria per
extract fraction divided by the log cfu bacteria for sterile distilled water (DW). Data
were subjected to two different statistical analyses. General linearized models (GLM)
procedure was used to test the broad response to all leaf fractions, different
concentrations, and to compare the response among the strains. Analysis of variance and
Student-Newman-Keuls test was used to compare the response to each leaf fraction
concentration for each strain, in order to determine the threshold concentration for
attractants.
CAPÍTULO 3. Motilidad y quimiotaxis en Xanthomonas citri subsp. citri con distinta gama de huésped
127
Figure 2. Chemotactic response of Xanthomonas strains to apoplastic fluids from sweet orange (A),
Mexican Lime (B) or Chinese cabbage (C) leaves. In order to compare the chemotactic response among
strains and apoplastic fluids the amount of bacteria entering into the tip with each apoplastic fluid was
normalized with the amount of bacteria entering in the tip in which no chemotactic stimulus was present.
The y-axis in the graphs is the log cfu of bacteria in the tip containing the apoplastic fluid divided by the
log cfu in the tip containing distilled water (DW) at different apoplastic fluid concentrations (x-axis). The
lines are linear regressions for each strain/leaf concentration combination.
CAPÍTULO 3. Motilidad y quimiotaxis en Xanthomonas citri subsp. citri con distinta gama de huésped
128
Figure 3. Chemotactic response of different Xanthomonas strains to leaf extracts from sweet orange (A),
Mexican lime (B) or Chinese cabbage (C) leaves. . In order to compare the chemotactic response among
strains and leaf extracts the amount of bacteria entering into the tip with each leaf extract was normalized
with the amount of bacteria entering in the DW tip. The y-axis in the graphs is the log cfu of bacteria in
the tip containing the plant extract divided by the log cfu in the tip containing distilled water (DW) at
different plant extract concentrations (x-axis). The lines are linear regressions for each strain/leaf
concentration combination.
CAPÍTULO 3. Motilidad y quimiotaxis en Xanthomonas citri subsp. citri con distinta gama de huésped
129
All strains evaluated showed attraction (P<0.05) to the leaf extracts and apoplastic
fluids from sweet orange, Mexican lime or Chinese cabbage at concentrations from 50
to 200 (mg leaf mL-1
). Although the strain Xcc 306 showed positive response for those
concentrations of sweet orange and Chinese cabbage leaf fractions, this strain only gave
a positive response at 200 mg leaf mL-1
for Mexican lime leaf extract and apoplastic
fluid. Furthermore, Xcc 306 response to apoplastic fluid from sweet orange was
significantly different from the response to cabbage or Mexican lime (Figs. 2 & 3). The
strongest response to sweet orange apoplastic fluid was observed for Xcc 306 compared
with the other strains tested. In addition, regression lines were obtained and compared
for the number of bacteria that entered into apoplastic fluid or leaf extract from leaf
concentrations in an interval from 0 to 50 mg mL-1
. Differences among the slopes for
the different strains after exposure to the leaf fractions from the different plant species
were evaluated. Regression and statistical analysis were performed using
STATGRAPHICS Plus, version 5.1.The slopes of the regression lines obtained from 0
to 50 mg mL-1
were significantly different (P<0.05) between Xcc 306 and the other
strains. Moreover, the response of Xcc 306 to apoplastic fluid was significantly different
(P<0.05) from the leaf extract. Similar differences were detected for Xc 1609 and
cabbage fractions, which produced a strong chemotactic response that increased with
extract concentration. The response of Xc 1609 to cabbage apoplastic fluid was
significantly greater (P<0.05) than the citrus strains response to this host apoplastic
fluids, which coincides with Xc 1609, Xac F1 and Xcc host range (crucifers and citrus,
respectively). In most cases, cabbage apoplastic fluid produced a significantly greater
response (P<0.05) compared to leaf extracts except for Xcc 62 which responded weakly
to both apoplastic fluid and leaf extracts. Mexican lime apoplastic fluid or leaf extract
produced a weak chemotactic response for all strains except Xac F1, the only strain that
significantly responded to increasing concentration of Mexican lime apoplastic fluid. In
addition, Xac F1 was the only strain that responded differentially to apoplastic fluid and
leaf extract from Mexican lime. The results showed that most citrus pathogenic strains
were attracted toward both citrus leaf and apoplastic fluid extracts. However, strain Xcc
306 showed stronger attraction towards sweet orange apoplastic fluid than leaf extract,
comparable to Xac F1 for Mexican lime and Xc 1609 for Chinese cabbage.
Similar chemotactic responses were observed for most of the citrus pathogenic strains
and leaf and apoplastic fluid extracts, however a chemotactic response was observed for
CAPÍTULO 3. Motilidad y quimiotaxis en Xanthomonas citri subsp. citri con distinta gama de huésped
130
Xc 1609 and Chinese cabbage extracts which confirms the host range of this strain and
its ability for colonizing the apoplastic site as a requisite for this pathogen’s infection
process (Yang et al., 2009). Recent studies of Xcc suggest that chemotaxis is necessary
to establish the infection since mutants impaired in chemotaxis towards grapefruit leaf
extract were reduced in ability to cause canker lesions on grapefruit leaves (Yaryura et
al., 2015) but not when grown in nutrient broth or XAM1 medium (Moreira et al.,
2014). As mentioned above, a lower number of narrow host range bacterial cells were
observed in the apoplast of Swingle citrumelo than in Mexican lime leaves, whereas the
wide host range strain was present in apoplastic sites of both citrus varieties (Sena-
Vélez et al., 2014). These evaluations were made in absence of wind force which
confirms that bacterial entry is mediated by active motility and chemotaxis in relation to
host range. Apoplastic fluids exuding from stomatal openings or leaf wounds are most
likely to be the chemotactic sources on the leaf surface. Response of Xcc 306, Xc 1609
and Xac F1 strains to apoplastic fluids from sweet orange, Chinese cabbage and
Mexican lime leaves, respectively, was generally host specific with a few exceptions.
These results are consistent with findings that R. solanacearum K60 is more attracted to
host root exudates than to non-host exudates (Yao & Allen, 2006), and that X. oryzae is
attracted towards root exudates based on susceptibility of rice cultivar (Feng & Kuo,
1975).
Comparing chemotaxis of citrus xanthomonads to sweet orange and Mexican lime
apoplastic fluids, the response to sweet orange was consistent among citrus strains but
response to Mexican lime was variable. Our hypothesis is that Mexican lime leaves
contain non-specific signals. Consistent with the host’s universal susceptibility to citrus
pathogenic xanthomonads (Brunings & Gabriel, 2003; Gottwald et al., 2001; Gottwald
et al., 2002b; Graham et al., 2004). Interestingly those strains which showed a variable
response towards the apoplastic fluid also exhibited a unique chemotactic profile among
the strains studied. Xcc 306 showed the most different chemotactic profile among Xcc
strains and also responded differentially toward sweet orange and Mexican lime leaf
fractions.
Xc 1609 showed strong attraction towards Chinese cabbage apoplastic fluids compared
with Chinese cabbage leaf extract and citrus extracts. This suggests Xc 1609 is a better
colonizer of its host apoplast, than citrus xanthomonads which responded less to
Chinese cabbage extracts. This result confirms the specificity of chemotactic profiles for
CAPÍTULO 3. Motilidad y quimiotaxis en Xanthomonas citri subsp. citri con distinta gama de huésped
131
xanthomonads from citrus and crucifers as well as the behaviour of Xcc 306, Xac F1 and
Xc 1609 toward apoplastic fluid from sweet orange, Mexican lime and Chinese cabbage
leaves, respectively. Our results along with those of Yaryura et al. 2015 and Moreira et
al. 2014 support the role of chemotaxis in the plant-bacteria interaction and
Xanthomonas host range.
To conclude, this is the first report of the link between the host range of the
Xanthomonas strains and the profile of carbon source utilization, chemotaxis response
to carbon sources and leaf apoplastic fluids. These results indicate there is a host
specific role of leaf apoplastic exudates in chemotaxis at the early stages of the bacterial
infection process.
Acknowledgements
This work was kindly supported by Citrus Advance Technology Program, project
CRDF546 as well as through Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y
Alimentaria (INIA) project RTA2008-00048. Marta Sena held a PhD fellowship from
INIA. We also thank Dra. María Milagros López, Dr. Rui Pereira Leite and Pablo
Rodriguez-Palenzuela for supplying some of the bacterial strains and Carmen Martínez
and Ana Redondo for supplying some of the plant material used in the study.
133
CAPÍTULO 4: PROTEÍNAS ACEPTORAS DE
GRUPOS METILO EN Xanthomonas Y SU
RELACIÓN CON LA GAMA DE HUÉSPED
Methyl accepting chemotaxis proteins in Xanthomonas and its relation
with host range
M. Sena-Vélez1, E. Ferragud
1, J.H. Graham
2, P. Rodríguez-Palenzuela
3, C. Redondo
1, J.
Cubero1.
1Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria (INIA), Ctra de
La Coruña Km 7,5 (Madrid), Spain. 2University of Florida, Citrus Research and
Education Center (CREC) 700 Experiment Station Road. Lake Alfred, FL 33850-2299,
USA. 3 University of Florida, Emerging Pathogen Institute. Gainesville, FL USA.
Capítulo 4. Proteínas aceptoras de grupos metilo en Xanthomonas y su relación con la gama de huésped
135
1. Abstract
Methyl accepting chemotaxis proteins (MCPs) are environmental sensors present in
bacteria able to sense chemical compounds or energy gradients. MCPs lead to a motile
response towards the more suitable environment for bacterial survival and growth. In
plant pathogenic bacteria some MCPs have been related with plant specific compounds
such as jasmonic acid which directs bacteria towards plant wounds facilitating the
entrance to the apoplastic site and produce the infection. In the genus Xanthomonas,
MCPs as well as other environmental sensors, have evolved according to the pathogen
adaption to the host.
In this study we have identified and compared the MCPs present in citrus bacterial
canker xanthomonads, X. alfalfae subsp. citrumelonis and X. campestris. Our results
showed which MCPs were conserved among the Xanthomonas studied and which were
related to host range or disease caused. Furthermore the analysis performed based on
presence or absence of MCPs clustered the studied bacteria according to host range and
disease produced.
Capítulo 4. Proteínas aceptoras de grupos metilo en Xanthomonas y su relación con la gama de huésped
136
2. Background
Methyl accepting chemotaxis proteins (MCPs) are the best characterized environmental
sensors in bacteria. MCPs are normally composed of a periplasmic or cytosolic ligand
binding region (LBR), a methyl accepting domain which contains the kinase control
module and the signal conversion module characterised by the presence of a HAMP
domain (present in histidine kinases, adenyl cyclases, methyl-accepting proteins and
phosphatases) which enhances the chemotactic signal (Bi and Lai, 2015; Lacal et al.,
2010b). MCPs are able to sense several chemical compounds as well as pH and oxygen
variation among other stimuli. A single MCP is able to sense several molecules, but
different MCPs can also bind the same ligand. The role of each MCP is therefore
complex and not so easy to totally determine (Armitage, 1999; Lacal et al., 2010a;
Lazova et al., 2012; Pineda-Molina et al., 2012; Río-Álvarez et al., 2014). Bacterial
adaptation to host has been related with sensing in the genus Xanthomonas where
several MCPs have been identified (Mhedbi-Hajri et al., 2011a). Herein, MCPs present
in citrus xanthomonads and Xanthomonas campestris pv. campestris were recognized
by analysis of complete genome or PCR detection based on those former studies when
no genome was available. Moreover, MCP content of these xanthomonads was related
to the host range and the chemotaxis behaviour.
3. Experimental procedures
3.1. Bacterial strains, culture media and growth conditions
Bacterial strains used in this study and their geographic origins are listed in Table 1.
Wide host range strains (A type) of Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc) and three
narrow host range strains (A* and Aw) from different geographic areas were evaluated
along with X. fuscans subsp. auranttifolii (Xfa) (CBC types B & C), X. alfalfae subsp.
citrumelonis and X. campestris pv. campestris (Xc), a non-citrus pathogen. Bacterial
strains were routinely grown on Luria Bertani broth (LB) (10 g tryptone, 5 g L-1
yeast
extract and 85.5 mM of sodium chloride) or on LB plates (1.5% bacteriological agar) at
27ºC for 48 h.
Capítulo 4. Proteínas aceptoras de grupos metilo en Xanthomonas y su relación con la gama de huésped
137
Genomic DNA from Xanthomonas was extracted by using QIAamp DNA Mini Kit
following manufacturer´s instruction (Qiagen). Purified DNA samples were used for
PCR reactions or store a t -20ºC until further use.
Table 1: Strains of Xanthomonas spp. used in the study
Strain/Isolate Taxon, or disease and CBC type Origin Xcc 306 Xanthomonas citri subsp. citri, CBC A Brazil Xcc 62 Xanthomonas citri subsp. citri, CBC A Japan
Xcc MI Xanthomonas citri subsp. citri, CBC A Florida (USA) 2766-107-1-2col2 Xanthomonas citri subsp. citri, CBC A Argentina 2800-1Z Xanthomonas citri subsp. citri, CBC A Argentina 2800-2 Xanthomonas citri subsp. citri, CBC A Argentina 2807-8-1 Xanthomonas citri subsp. citri, CBC A Argentina 2807-10-2 Xanthomonas citri subsp. citri, CBC A Argentina 2889col1 Xanthomonas citri subsp. citri, CBC A Argentina 2889col3 Xanthomonas citri subsp. citri, CBC A Argentina R2880-1a Xanthomonas citri subsp. citri, CBC A Argentina R2880-2a Xanthomonas citri subsp. citri, CBC A Argentina 3047-3a Xanthomonas citri subsp. citri, CBC A Argentina 3046-6 Xanthomonas citri subsp. citri, CBC A Uruguay 3011-3a Xanthomonas citri subsp. citri, CBC A Uruguay 3011-4b Xanthomonas citri subsp. citri, CBC A Uruguay 3024-5col7 Xanthomonas citri subsp. citri, CBC A Uruguay 3024-5col4 Xanthomonas citri subsp. citri, CBC A Uruguay 3026-1col8 Xanthomonas citri subsp. citri, CBC A Uruguay 3026-1col9 Xanthomonas citri subsp. citri, CBC A Uruguay 3023-2 Xanthomonas citri subsp. citri, CBC A Uruguay 3222-6col18 Xanthomonas citri subsp. citri, CBC A Uruguay 3222-19col25 Xanthomonas citri subsp. citri, CBC A Uruguay 3365-13col1 Xanthomonas citri subsp. citri, CBC A Uruguay 3365-14col5 Xanthomonas citri subsp. citri, CBC A Uruguay 8946 Xanthomonas citri subsp. citri, CBC A Brazil 8947 Xanthomonas citri subsp. citri, CBC A Brazil 12712 Xanthomonas citri subsp. citri, CBC A Brazil 12714 Xanthomonas citri subsp. citri, CBC A Brazil 12758 Xanthomonas citri subsp. citri, CBC A Brazil 12917 Xanthomonas citri subsp. citri, CBC A Brazil 12970 Xanthomonas citri subsp. citri, CBC A Brazil 12971 Xanthomonas citri subsp. citri, CBC A Brazil 13013 Xanthomonas citri subsp. citri, CBC A Brazil 14082 Xanthomonas citri subsp. citri, CBC A Brazil Xcc Iran 2
Xanthomonas citri subsp. citri, CBC A* Iran Xcc Iran 10 Xanthomonas citri subsp. citri, CBC A* Iran Xcc 12879 Xanthomonas citri subsp. citri, CBC A
w Florida (USA)
Xfa 69 Xanthomonas fuscans subsp. aurantifolii, CBC B Brazil Xfa 341 Xanthomonas fuscasn subsp. aurantifolii, CBC C Brazil Xac F1 Xanthomonas alfalfae subsp. citrumelonis, CBS Florida (USA) Xc 1609 Xanthomonas campestris pv. campestris, CBR
c Spain
aCitrus bacterial canker (CBC);
bCitrus bacterial spot (CBS);
cCrucifer black rot (CBR).
Capítulo 4. Proteínas aceptoras de grupos metilo en Xanthomonas y su relación con la gama de huésped
138
3.2. Detection of methyl accepting chemotaxis proteins in silico
Methyl accepting chemotaxis proteins (MCPs) were detected by using an ad hoc Perl
script, which enabled the automatically search for proteins containing the MCP signal
domain (PF00015) by using Hidden Markov Models implemented in the HMMER 2.3.2
package (Eddy, 1998). The script was applied to the genomes of citrus xanthomonads
and Xc for which the complete genome sequence was available. MCP sequences from
the genomes of Xcc 306 (NC_003919) (CBC A strain) (da Silva et al., 2002), Xac F1
(NC_016010) (Jalan et al., 2011), Xc ATCC_33913 (NC_003902) (da Silva et al.,
2002), and Xc 8004 (NC_007086) (Qian et al., 2005) were predicted. Furthermore,
MCPs from the draft genomes of Xfa 11122 (Bioproject: PRJNA47351), Xfa 10535
(Bioproject: PRJNA47495) (CBC B and C strains respectively) (Moreira et al., 2010a),
Xac 29_1 (NC_020800.1) (CBC A strain) (Ye et al., 2013) and Xcc 12879
(NC_020815.1) (CBC Aw strain) (Jalan et al., 2013b) were predicted by using Blast-P
from the protein sequence of one member of each group, usually Xcc 306. The protein
sequences were analysed, aligned using ClustalW and clustered by Neighbour-Joining
after p-distance analysis using Mega 5.0 software (Tamura et al., 2011). In order to
search for homologies to MCP sequences or those of other sensor proteins, BlastP was
performed using the putative ligand binding domain amino acid sequence of MCPs.
Transmembrane helix from the predicted MCPs were detected using TMHMM Server v.
2.0 (Center for biological sequence analysis, Denmark) (Krogh et al., 2001), "DAS"
Transmembrane Prediction server (Miklos Cserzo et al., 1997) and HMMTOP (Tusnády
et al., 2001).
3.3. MCP detection by conventional PCR
MCP sequences were validated by conventional PCR using a selected set of primers
described by (Mhedbi-Hajri et al., 2011a) which correspond with the following groups
in the phylogenetic tree in Fig. 1: group 2, primers corresponding to gene XCV1939;
group 3, XCV3261; group 5, XCV1942; group 6, XCV1944; group 8, XCV1954; group
9, XCV1955; group 11, XCV1702; group 12, XAC3768; group 14, XCV1947; group
16, XCV1951; group 21, XCC0324; group 22, XCV1778; and XAC3271 which is not
reflected in the phylogenetic tree. Primers for group 17, MSV_XCAW2504F
(ATGCTGTCGGAAATGCAGGA) and MSV_XCAW2504R
(AGGTGCTTGATCTCCTTGGC) and for group 19 MSV_XCAW02508F
(GCGTCGCTCAATAACGTCAC) and MSV_XCAW02508R
Capítulo 4. Proteínas aceptoras de grupos metilo en Xanthomonas y su relación con la gama de huésped
139
(GATGCTGCTTTCGTACTGCG) were designed in this study. PCR reactions were
carried out in a final volume of 25 µL containing 2 mM of MgCl2, 0.2 mM of dNTPs
(each), 2 units of DNA-polymerase (Biotools, Madrid, Spain) and 0.2 mM of each
primer. For fragments longer than 1000 bp, FastStart Taq-DNA polymerase from Roche
(Roche Diagnostics, Mannheim, Germany) was used to a final volume of 25 µL
containing 2 mM of MgCl2, 0.1 mM of dNTPs (each), 2 units of FastStart Taq-DNA
polymerase and 0.2 mM of each primer. The amplifications conditions consisted of
94ºC for 1 minute, annealing temperatures described by Mhedbi-Hajri (Mhedbi-Hajri et
al., 2011a) and 57ºC for XCAW2504 and XCAW2508 for 1 minute and 72ºC for 1
minute for 40 cycles plus an initial step of 95ºC for 10 minutes and a final step of 72ºC
for 10 minutes. 10µL of the PCR products were run in 1-1.5% (w/v) agarose gels
stained with ethidium bromide and visualized under UV transilluminator. Presence or
absence of PCR product for each MCP were converted to binary form and similarity
coefficients for pairs of strains were calculated as described above.
4. Results
4.1. Detection of Methyl accepting chemotaxis proteins in silico
Several putative MCPs from the Xanthomonas analysed were identified by
bioinformatics approaches. Xcc 306 (CBC type A) had 21 predicted MCPs; Xac 29_1
(CBC type A) had 24 predicted MCPs; Xcc 12879 (CBC type Aw) had 24 predicted
MCPs; Xac F1 (CBS) had 24 predicted MCPs; Xc ATCC_33913 and Xc 8004 (CBR)
had 20 predicted MCPs respectively; Xfa 11122 and Xfa 10535 (CBC types B & C) had
20 and 18 predicted MCPs, respectively. MCPs were clustered in twenty seven
phylogenetic groups (Fig. 1), fifteen of these groups included MCPs found in every
strain studied, and therefore, were considered to be conserved in Xanthomonas. Twelve
groups were more confined to certain strains, those groups were of interest due to their
possible link with the unique chemotactic profile for strains associated with host range
described previously. Two MCPs were specific of CBC type A and Aw (groups 2 & 6)
and one of CBC (group 12), four MCPs were present in citrus pathogenic strains but not
in Xc (groups 3, 5, 9 & 18), two MCPs for Xc and finally one MCP was present on Xac
F1 and Xc (group 8). In the group 3, two MCPs (Xac_2_346724201 and
Xac_22_346725933) from Xac F1, were clustered in the same group but the amino acid
Capítulo 4. Proteínas aceptoras de grupos metilo en Xanthomonas y su relación con la gama de huésped
140
sequence of Xac_2_346724201 was considered specific for this specie, because it
showed less than 70% of identity with the other citrus pathogenic strains contained in
this group. Furthermore, in several groups the major difference among CBR and citrus
pathogenic strains corresponded with the protein size, i.e., in group 15, Xc strains lacked
the putative ligand binding residues which correspond to a 153 aa sequence in citrus
strains flanked by two transmembrane helix. Minor variations were observed in the
putative ligand binding domain as amino acid modifications, and were more pronounced
between CBR and citrus pathogenic strains. However some MCPs were highly
conserved since the percentage of identity between citrus and crucifers was higher than
96%.
Capítulo 4. Proteínas aceptoras de grupos metilo en Xanthomonas y su relación con la gama de huésped
141
Capítulo 4. Proteínas aceptoras de grupos metilo en Xanthomonas y su relación con la gama de huésped
142
Figure 1. Neighbor-Joining dendrogram depicting phylogenetic relationships among the different MCPs
detected from the complete genome from several Xanthomonas strains. The dendrogram was constructed
using Neighbour-joining method and using p-distance parameter to calculate pairwise distance. Bootstrap
values (1000 replicates) are indicated at branch points. Each MCP was named with the name of the strain
they belong following of an ordering number and finally de GI number.
4.2. Presence of MCPs in non-sequenced Xanthomonas strains
In order to determine presence or absence of MCPs for the strains whose genomes were
not sequenced, a set of conventional PCR amplifications were performed using primers
and conditions described in Experimental Procedures. PCR results confirmed the
presence of MCPs for the sequenced strains, Xcc 306, Xcc 12879 Aw and Xac F1 (Table
2) and for CBC B and C types and Xc strains, which were not the same strains as those
already sequenced. Differences in the presence of specific MCPs were related to host
plant (citrus vs crucifers) and citrus pathogenic species (Xac vs Xcc strains) as was
shown by the in silico study (Fig. 1). From the 35 wide host range CBC strains tested,
82% showed identical MCP profile to that observed for CBC Aw and A* strains. Strains
306 and 12917, both of them from Brazil, lacked XCCAW2504, XCCAW2508 and
XCV1939 shown in all the other citrus pathogenic Xanthomonas tested, including CBS
strain. Three Xcc strains, from Brazil, Argentina and Uruguay lacked MCP XCV1947
and strain 12970 from Brazil lacked MCPs XCV1947 and XCV1955. Xfa 341, a type C
strain, did not show amplification for XAC3271 and XAC3768 and Xfa 69, a type B
strain, for gene XAC3271, in accordance to the data from the whole genome available
in database for strains Xfa 10535 and Xfa 11222 (C and B strains types, respectively).
Cluster analysis of the data obtained from PCR amplification of the MCPs (Fig. 2)
grouped citrus pathogenic strains apart from Xc 1609, and citrus pathogenic strains were
separated according to disease and host range. CBC strains were clustered together, but
type A strains were separated from types B and C. As expected most of CBC A type
strains were identical and clustered separately from those which showed a varied MCP
profile.
Capítulo 4. Proteínas aceptoras de grupos metilo en Xanthomonas y su relación con la gama de huésped
143
Tabla 4. PCR amplification of some xanthomonads MCPs using primers described by Mhedbi-Hajri in
2011 and those designed in this study
Primers/Strains
XA
C3271
XA
C3768
XC
CA
W2504
XC
CA
W2508
XC
V1702
XC
V1778
XC
V1939
XC
V1942
XC
V1944
XC
V1947
XC
V1951
XC
V1954
XC
V1955
XC
V3261
XC
C0324
CBC A type
Xcc 306 Xcc MI Xcc 62
2766-107-1-2col2 2800-1Z 2800-2
2807-8-1 2807-10-2 2889col1 2889col3 R2880-1a R2880-2a
3046-6 3047-3a 3011-3a 3011-4b
3024-5col7 3024-5col4 3026-1col8 3026-1col9
3023-2 3222-6col18 3222-19col25
8946 8947 12712 12714 12758 12917 12970 12971 13013 14082
3365-13col1 3365-14col5
CBC Aw type Xcc A
w
CBCA*type Xcc Iran2 Xcc Iran10
CBC B type Xfa 69 CBC C type Xfa 341
CBS Xac F1 CBR Xc 1609
Capítulo 4. Proteínas aceptoras de grupos metilo en Xanthomonas y su relación con la gama de huésped
144
Figure 2: Dendrogram showing relationships among Xanthomonas
strains based on data from PCR performed to detect different MCPs.
Similarities were calculated by using Jaccard coefficient using program
NTSYS, version 2.1 (Exeter Software, Setauket, N.Y.) and clustering
was achieved by Neighbor-Joining using MEGA 5 program (Tamura et
al., 2011).
13013
3365-13col1
12971
12758
12714
12712
8947
8946
3222-19col25
3222-6col18
3023-2
3026-1col9
3026-1col8
3024-5col7
3011-4b
3011-3a
3047-3a
3046-6
R2880-2a
R2880-1a
2889col3
2807-10-2
2807-8-1
2800-2
2800-1Z
2766-107-1-2col2
XccIran10
XccIran2
XccAw
Xcc62
XccMI
3365-14col5
Xcc306
12917
12970
2889col1
3024-5col4
14082
Xfa69
Xfa341
XacF1
Xc1609
0.05
Capítulo 4. Proteínas aceptoras de grupos metilo en Xanthomonas y su relación con la gama de huésped
145
5. Discussion
MCPs from the sequenced citrus pathogenic Xanthomonas strain as well as two
sequenced strains of Xc have been clustered in 27 phylogenetic groups. The tree showed
that most of the Xanthomonas MCPs were common for citrus and crucifers pathogens,
however analysis based on the MCPs protein sequence of those groups showed variation
in the ligand binding residues (LBR). These differences were encountered mostly
between citrus and crucifers Xanthomonas strains which is in agreement with the
Xanthomonas sensor adaptation to host described previously (Mhedbi-Hajri et al.,
2011a). These analysis also showed that CBC A type strains Xcc 306, 29_1 and 12879
(Aw type) showed a high MCP similarity at protein level (average % of identity among
MCPs from all groups is 99.75 with a standard deviation of 0.93), however strain Xcc
29_1 (wide host range CBC) MCPs were more similar to strain 12879 (limited host
range CBC) than to Xcc 306. The most conserved MCPs within each group were those
containing strains infecting the same host. Some MCPs showed high protein identity ,
those MCPs were also present in X. axonopodis pv. vesicatoria (Xav) strain 85-10 and
other Xanthomonas species (Mhedbi-Hajri et al., 2011a), so they were possibly
conserved within the genus Xanthomonas.
The results of conventional PCR amplification correlated to those obtained in silico,
which confirms the accuracy of the primers and PCR conditions. The tree built from the
presence or absence of MCPs grouped strains according to its host, disease and CBC
type. When compared the tree based on the chemotactic profile (showed in Chapter III)
and the MCP profile (Fig. 2) the strain clustering was similar, Xcc 62 was more related
to limited host range CBC strains than Xcc 306. Although strain Xcc 306 was
metabolically similar to Xcc 62 (Chapter III), it showed the most unique chemotactic
and MCP profile among CBC type A strains. Xcc 306 strain (as strain 12917) lacked 3
MCPs present in most citrus strains. However strains Xcc 62, 12879 and Iran 2 which
had an identical MCP profile showed a variable chemotaxis response. This maybe
explained because chemotaxis is mediated by several mechanisms besides MCPs, like
metabolism which is also variable among CBC strains with different host range
(Chapter III) (Alexandre, 2010; Alexandre and Zhulin, 2001; Egbert et al., 2010).The
metabolic response analyzed by using Biolog plates revealed variation in the metabolic
response among strain 62 and narrow host range strains. Furthermore slightly
differences were shown within narrow host range strains even if they were isolated from
Capítulo 4. Proteínas aceptoras de grupos metilo en Xanthomonas y su relación con la gama de huésped
146
the same geographic area (Iran 2 and Iran 10). Thus, the MCPs content is not the only
factor affecting chemotaxis but it is also related to the metabolic activity of each strain
resulting in a variable chemotactic response which is independent of the number of
MCPs. On the other hand differences in the MCP protein sequence might vary the
chemotactic response and that factor was not fully investigated here.
In addition Xanthomonas response toward apoplastic fluids (Chapter III) of strains
which showed different MCP profile, Xcc 306, Xac F1 and Xc 1609 showed a unique
response towards orange, Mexican lime and Chinese cabbage leaves apoplastic fluids
respectively which differed from the response of the other strains tested as well as from
its whole leaf extracts. However strains Xcc 62, 12879 and Iran2 which responded
similarly to apoplastic fluids and leaf extracts showed the same MCP profile. This
suggests a relationship between MCPs and the chemotaxis interaction with apoplastic
fluid. Therefore, specific MCPs may determine the chemotactic response that results in
colonization of the apoplast.
Blast-P analysis of the MCPs was performed to find homologies to previously described
MCPs, but due to the lack of information about the ligand binding residues of the
MCPs, we were unable to relate a specific chemotactic response to a particular MCP.
Unique MCPs may sense several chemicals and contain more than one ligand binding
site (Kondoh et al., 1979; Lacal et al., 2010b; Nishiyama et al., 2012; Pham and
Parkinson, 2011; Pineda-Molina et al., 2012). Further studies are required to elucidate
chemotaxis mechanism and the role for specific MCPs in xanthomonads.
The correlation between MCPs and chemotactic profiles of CBC strains as well as the
behaviour of Xcc 306, Xac F1 and Xc toward apoplastic fluid from sweet orange,
Mexican lime and Chinese cabbage leaves, supports the role of these components in the
plant-bacteria chemotaxis interaction.
147
CAPÍTULO 5: FORMACIÓN DE BIOPELÍCULAS
EN Xanthomonas citri subsp. citri CON DISTINTA
GAMA DE HUÉSPED
Publicado en Plant Pathology 2014
Differential biofilm formation among strains of Xanthomonas citri
subsp. citri with different host range
Sena-Vélez, M., Redondo, C., Gell, I., Ferragud, E., Johnson, E., Graham, J.H., Cubero,
J.
1Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria (INIA), Ctra de
La Coruña Km 7,5 (Madrid), Spain. 2University of Florida, Citrus Research and
Education Center (CREC) 700 Experiment Station Road. Lake Alfred, FL 33850-2299,
USA.
Capítulo 5. Formación de biopelículas en Xanthomonas citri subsp. citri con distinta gama de huésped
149
1. Abstract
Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc) A strain is the causal agent of citrus bacterial
canker (CBC) on most Citrus spp. and close relatives. Two restricted host range strains
of CBC, Aw and A*, from Florida and Southwest Asia, respectively, infect Mexican
lime. Several studies have linked biofilm formation by Xcc to bacterial colonization
prior to and after plant ingress, but none have evaluated biofilm formation in connection
with the behavior of the different strains of Xcc on citrus hosts and non-hosts. In this
study biofilm formation and swimming motility was evaluated for citrus pathogenic
xanthomonads including wide and restricted host range strains of Xcc, X. alfalfae subsp.
citrumelonis (Xac), the causal agent of citrus bacterial spot, compared to X. campestris
pv. campestris (Xc). Differential biofilm formation was observed in vitro and in planta
among the Xanthomonas strains assayed. Minimal medium XVM2 increased biofilm
formation, especially for those strains with a host range restricted to Mexican lime. In
planta, strains produced more biofilm on leaves or fruits of their host than on non-hosts.
Scanning electron microscopy of biofilms on leaf and fruit surfaces revealed differences
in structure of bacterial aggregates with respect to the strain’s host range. In addition,
swimming motility varied widely depending on host range of the strain.
Biofilm formation in vitro and in planta for strains of Xcc and Xac was related to their
host range, as these processes affect colonization at the early stages of the infection
process.
Capítulo 5. Formación de biopelículas en Xanthomonas citri subsp. citri con distinta gama de huésped
2. Introduction
Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc) (formerly X. axonopodis pv. citri) and X. fuscans
subsp. aurantifolii (Xfa) (formerly X. axonopodis pv. aurantifolii) cause citrus bacterial
canker (CBC), one of the most serious diseases on Citrus spp. (Graham et al.,
2004;Schaad et al., 2005). Xanthomonas alfalfae subsp. citrumelonis is the cause of
citrus bacterial spot (CBS), a minor foliar disease of young citrus plants in nurseries.
CBC is characterized by necrotic lesions on leaves, twigs and fruits that reduce fruit
quality and restrict commercialization of plants and fruits in markets free of CBC
(Graham et al., 2004). Xcc A strain is the causal agent of citrus canker A which is by far
the most damaging and widespread CBC pathogen that affects the widest range of citrus
species. Within Xcc A strains, host range variants have been identified. Xcc A* and Aw
are strains from Southwest Asia and Florida, respectively, with a host range restricted to
Citrus aurantifolia (Mexican lime) and C. macrophylla (Alemow). A recent analysis of
the genome sequence of Xcc Aw 12879 revealed differences among A strains in plasmid
profiles and genes for virulence effectors (Cubero & Graham, 2002; Jalan et al., 2013a;
Jalan et al., 2013b; Sun et al., 2004; Vernière et al., 1998). Wide (Xcc A) and restricted
(Xcc A*, Aw) host range strains have been extensively studied to elucidate the genetic
determinants for their different host range (Escalon et al., 2013; Jalan et al., 2013a;
Rybak et al., 2009). None of the studies of host strain interactions have evaluated the
early stages of host colonization and infection.
Initial studies of Xcc A strains on plant tissues demonstrated limited bacterial viability
on leaf and fruit surfaces (Gottwald et al., 2009; Graham et al., 2004; J.H.Graham et al.,
1987; Pruvost et al., 2002). However, as found for other plant pathogenic bacteria,
aggregation and biofilm formation have been confirmed as important in host plant
colonization by Xcc (Cubero et al., 2011; Danhorn & Fuqua, 2007; Lindow & Brandl,
2003; Rigano et al., 2007). Biofilms are composed of polysaccharides, proteins and
nucleic acids that function in attachment and protection of the bacterium from biotic and
abiotic agents. In plant pathogenic bacteria, biofilms may act as a virulence factor in
early stages of colonization and infection (Flemming and Wingender, 2010; Guttenplan
and Kearns, 2013). After ingress, formation of biofilm allows the bacterium to maintain
a critical mass of cells within the plant tissues (Danhorn & Fuqua, 2007). Innumerable
factors including bacterium genotype and host, temperature, moisture, pH, and
exogenous nutrients influence biofilm formation. There is a sequence of steps that
Capítulo 5. Formación de biopelículas en Xanthomonas citri subsp. citri con distinta gama de huésped
151
begins by contact of the bacterium with the plant surface that requires active motility,
adsorption to the surface, cell replication, production of cell to cell signaling molecules,
and eventually, release of planktonic bacteria from the biofilm (Danhorn & Fuqua,
2007; Karatan & Watnick, 2009). Mechanisms involved in biofilm formation and
especially the first steps of attachment and adherence to the plant surface are highly
specific. Attachment involves binding between bacterial and host polysaccharides and
proteins (Busscher & van der Mei, 2012; Proft & Baker, 2009). Biochemical stimuli
mediate motility so the bacterium can locate the optimum site for attachment and
aggregation on the plant surface (Mhedbi-Hajri et al., 2011a).
Herein, we have studied biofilm formation and motility of Xanthomonas strains with
varying citrus host range. Initially, aggregation was assayed on an inert surface, and
thereafter, evaluated on leaf and fruit surfaces. Bacterial motility, associated with first
stages of biofilm formation, was also compared among the strains.
3. Material and methods
3.1. Bacterial strains and growth conditions
Bacterial strains used in this study are described in Table 1. Three wide host range
strains of X. citri subsp. citri (Xcc), and three restricted host range strains (XccA* and
XccAw), were compared with one strain each of X. alfalfae subsp. citrumelonis (Xac)
and X. campestris pv. campestris (Xc). All strains were grown at 27ºC for 48 h in Luria
Bertani (LB) broth (10 g L-1
tryptone, 5 g L-1
yeast extract and 5 g L-1
sodium chloride)
used as a common nutritional medium or on agar plates of LB (1.5% agar) or XVM2
(20 mM NaCl, 10 mM (NH4)2SO4, 5 mM MgSO4, 1 mM CaCl2, 0.16 mM KH2PO4, 0.32
mM K2HPO4, 0.01 mM FeSO4, 10 mM fructose, 10 mM sucrose, 0.03% casamino acid)
culture medium to simulate apoplastic conditions (Astua-Monge et al., 2005; Wengelnik
et al., 1996). Xcc strains MIpUFJLVA, 12879pUFZLVA and 306pUFZLVA, and Xac
strain F1pUFZJLVA, expressing labile green fluorescent protein (GFP) (Cubero et al.,
2011; Zhang et al., 2009) were included to evaluate the location and viability of Xcc in
aggregates. MIpUFJLVA and F1pUFZJLVA were obtained in previous studies and
12879pUFZLVA and 306pUFZLVA were obtained in this work as previously described
(Cubero et al., 2011). All Xcc GFP strains were maintained on LB agar supplemented
with kanamycin at 50 µg mL-1
.
Capítulo 5. Formación de biopelículas en Xanthomonas citri subsp. citri con distinta gama de huésped
Table 1. Bacterial strains used in this study
Strain Species Origin Host Characteristics
306 aXcc Brazil Citrus spp. Citrus canker type A
62 Xcc Japan Citrus spp. Citrus canker type A
MI Xcc Florida Citrus spp. Citrus canker type A
Iran 2, Xcc Iran Key Lime Citrus canker type A*
Iran 10 Xcc Iran Key Lime Citrus canker type A*
12879 Xcc Florida Key Lime Citrus canker type Aw
F1 bXac
Florida Citrus spp. Citrus bacterial spot
1609 cXc
Spain Cabbage Crucifer black rot
306pUFZJLVA Xcc A 306 dUnstable GFP
MIpUFZJLVA Xcc A MI Unstable GFP
12879pUFZJLVA Xcc Aw 12879 Unstable GFP
F1pUFZJLVA Xac F1 Unstable GFP aXanthomonas citri subsp. citri,
bX. alfalfae subsp. citrumelonis,
cX. campestris pv. campestris.
dStrains
that express unstable green fluorescent protein (GFP) contain the pUFZJLVA plasmid.
3.2. Adhesion assays on an inert surface
Bacterial adhesion to an inert surface was measured by a polypropylene 96-well plate
assay as previously described (O'Toole et al., 1999). Adhesion to the well surface was
estimated after static bacterial growth in LB and XVM2 media for 72 h at 27ºC. After
removal of the medium using a micropipette, bacteria were incubated for an additional
72 h. Biofilm formation was measured after rinsing the plates with sterile distilled water
(SDW) and staining with 0.3 % crystal violet (CV) for 15 minutes. Excess stain was
removed by rinsing the plates with SDW. Residual CV was solubilized by the addition
of 200µL of 20:80 acetone:ethanol to each well and absorption quantified using a
microplate reader set at A570 nm wavelength. Absorption values for each strain are the
means of three readings of five wells from three assays. The means were compared by
analysis of variance (ANOVA) and separated by Student-Newman-Keuls (SNK)
multiple range test using Statgraphics Plus for Windows 4.1 (Statistical Graphics,
Rockville, MD).
Viability of the bacteria in aggregates was confirmed by assay of strain Xcc
306pUFZJLVA which fluoresces only when cells are viable (Cubero et al., 2011).
Aggregates were visualized by confocal laser scanning microscopy (CLSM).
Capítulo 5. Formación de biopelículas en Xanthomonas citri subsp. citri con distinta gama de huésped
153
3.3. Adhesion to plant surfaces
For the assessment of adhesion to plant surfaces, bacteria cultured overnight in LB broth
were diluted to 108
cfu mL-1
and spray-inoculated onto young plants of Mexican lime
(C. aurantifolia) and Swingle citrumelo (Poncirus trifoliata × C. paradisi) or Mexican
lime and grapefruit (C. paradisi) fruits. After inoculation, plants and fruits were
incubated in a growth chamber using a light/dark photoperiod of 16 and 8 hours
respectively for 20 days at 27ºC. Xcc MIpUFZJLVA (type A), Xcc 12879pUFZJLVA
(type Aw) and F1pUFZJLVA strains were used to evaluate biofilm formation and
bacterial viability on leaf and fruit surfaces. Inoculated leaves were examined at 24, 72,
216 h post inoculation (hpi) and inoculated fruit at 24 and 96 hpi by scanning electron
microscopy (SEM) and CLSM. For SEM, the leaves were fixed with 3% of
glutaraldehyde in 1M KPO4 buffer, then post fixed in 2% of OsO4 in 1M KPO4 buffer.
After washing in SDW, samples were dehydrated in an ethanol series and critical-point
dried with CO2. The samples were mounted on metal stubs and coated in
gold/palladium. SEM observations were made with a Hitachi S530 microscope. For
CLSM a small piece of the leaf or the fruit rind was mounted on a glass slide and
visualized under a Leica TCS-SL confocal microscope.
3.4. Swimming motility
To evaluate swimming motility, bacteria were grown in LB broth to the log phase.
Bacterial cells were harvested by washing twice with 10 mM MgCl2, then resuspended
in 1 mL of 10mM MgCl2 and centrifuged at 6350 g for 15 minutes. The supernatant was
removed and the pellet was inoculated with a toothpick in the centre point of plates of
XVM2 medium made with agar 3 g L-1
, or Minimal Medium A (MMA) (40 mM
K2HPO4, 22 mM KH2PO4, 0.4 mM Mg2SO4•7H2O, 7.5 mM (NH4)2SO4, 1.7 mM
sodium citrate, and 3 g agar L-1
SDW), LB (0.3% agar ) or peptone-yeast-malt extract
(PYM) medium (5 g L-1
peptone, 3 g L-1
yeast extract, 3 g L-1
malt extract, 10 glucose
and 3 g agar L-1
SDW). The plates were incubated at 27ºC at 100% relative humidity for
7 d. Colony diameter was measured at 1, 4 and 7 dpi. The increase in diameter of the
colony between 1 and 4 dpi for three replicates from at least three assays was compared
among Xanthomonas strains by ANOVA and SNK multiple range test as described
above.
Capítulo 5. Formación de biopelículas en Xanthomonas citri subsp. citri con distinta gama de huésped
4. Results
4.1. Adhesion and biofilm formation on an inert surface
Xanthomonas strains formed differing amounts of biofilm on an inundated
polypropylene surface depending on whether they were cultured in LB, a nutrient rich
broth, or XVM2 broth that simulates apoplast conditions (Figure 1). Viability of the
bacterial strains expressing a labile GFP in the biofilms was confirmed by CLSM
(Figure 2). Fluorescence of cells was detected after 6 days of desiccation in the adhesion
assay, confirming that the aggregates were bacterial biofilms and not artifacts.
When propagated in LB medium, the wide host range strain Xcc A formed significantly
(P<0.05) more biofilm than restricted host range strains Xcc Aw and Xcc A*(Figure 1).
Compared with Xcc strains, Xac produced an intermediate amount of biofilm.
Production of biofilm by the non-citrus strain Xc was similar to Xcc Aw and Xcc A*. All
bacterial strains formed significantly (P<0.05) more biofilm when grown in XVM2
medium than in LB medium. The highest biofilm formation response in XVM2
compared LB was measured for Xcc A*.
Figure 1. Biofilm formation by Xanthomonas strains [X. citri subsp. citri strains: 306
(XccA), 12879 (XccAw), Iran2 (XccA*); Xc1609 of X. campestris pv. campestris (Xc)
and F11 of X. alfalfae subsp. citrumelonis (CBS)] on polypropylene surface quantified
by absorbance of crystal violet stain. Values are means of three assays. Error bar
represents the standard deviation (SD) from the mean of three measurements from five
different wells. Bars labelled with different letters are significantly different according
to Student-Newman-Keuls multiple range test (P<0.05). Lower case letters refer to
differences among the strains grown in LB medium, upper case letters refer to
differences among the strains grown in XVM2 medium.
Capítulo 5. Formación de biopelículas en Xanthomonas citri subsp. citri con distinta gama de huésped
155
Figure 2. Confocal Laser scanning microscopy of viable aggregates of
Xanthomonas citri subsp. citri strain 306pUFZJLVA expressing
unstable GFP protein. The image represents an average projection of a
series of pictures from single section inside the aggregates.
4.2. Adhesion and biofilm formation on plant surfaces
Bacterial aggregation was demonstrated to occur on Mexican lime or Swingle citrumelo
leaves for all citrus Xanthomonas strains. However, differences in the amount and
structure of the biofilm varied among the strains depending on the host. Variation in the
quantity and viability of the aggregates on the leaf surface were confirmed by CLSM
using the unstable GFP expressing strains (Figure 3). For Swingle citrumelo inoculated
with Xcc A and Xac, viable aggregates were detected on the leaf surface one day post
inoculation (dpi) (Figure 3a & c), whereas no viable aggregates of Xcc Aw strain were
detected (Figure 3b). At 9 dpi, Xcc A and Xac were found in the intercellular spaces of
Swingle citrumelo leaves (Figure 3d & f). By comparison at 9 dpi, almost no Xcc Aw
aggregates were detected on the surface or inside the leaves of non-host Swingle
citrumelo (Figure 3e).
Capítulo 5. Formación de biopelículas en Xanthomonas citri subsp. citri con distinta gama de huésped
Figure 3. CLSM of aggregates formed on leaf surfaces by Xanthomonas citri subsp. citri type A (a, d, g,
j) or type Aw (b, e, h, k) and Xanthomonas alfalfae subsp. citrumelonis (c, f, i, l) on Swingle citrumelo (a,
b, c, d, e, f) or Mexican Lime (g, h, i, j, k, l) and 1 (a, b, c, g, h, i) or 9 (d, e, f, j, k, l) days after leaf
inoculation. Main images represent a single section of a part of the leaf surface. Two lateral views (x-z
and y-z planes) corresponding to cross sections of image series are shown below and on the right of the
main image.
Contrasting strain interactions were observed for Mexican lime which is susceptible to
all the citrus Xanthomonas strains. At one dpi, i.e. almost no viable Aw bacteria were
detected on leaves (Figure 3h), whereas a few viable cells of Xcc A strain were found
(Figure 3g). In contrast, a high concentration of Xac strain was detected on Mexican
lime leaves (Figure 3i). At 9 dpi, a few viable aggregates of Xcc A were detected on the
surface of Mexican lime leaves (Figure 3j) while extensive viable aggregates of Xac
were observed (Figure 3l). Viable cells of all the three citrus Xanthomonas strains were
found extensively in the intracellular space of Mexican lime leaves (Figure 3j, k & l).
Capítulo 5. Formación de biopelículas en Xanthomonas citri subsp. citri con distinta gama de huésped
157
Figure 4. CLSM of fruit infections by Xanthomonas citri subsp. citri type A (a, b) or type Aw (c, d) or
Xanthomonas alfalfae subsp. citrumelonis (e, f) on grapefruit fruit (a, c, e) or Mexican Lime (b, d, f) at 1
day post inoculation. Main images represent a single section of a part of the leaf surface. Two lateral
views (x-z and y-z planes) corresponding to cross sections of image series are shown below and on the
right of the main image.
Capítulo 5. Formación de biopelículas en Xanthomonas citri subsp. citri con distinta gama de huésped
Similar host strain interactions were shown when citrus xanthomonads were spray-
inoculated on fruit of Mexican lime and grapefruit (Figure 4). Aggregates of Xcc A or
Xcc Aw were detected at one dpi of Mexican lime fruit (Figure 4b & d), and of Xcc A on
grapefruit (Figure 4a) whereas on grapefruit only a few viable aggregates of Xcc Aw
were detected (Figure 4c). Xac also formed few viable aggregates on fruit surfaces of
Mexican lime and grapefruit (Figure 4e & f).
When inoculated leaves and fruits were observed at one dpi with SEM (Figure 5 &
Figure 6) and CLSM (Figure 7), Xcc A had developed interwoven fibers around the
cells (Figure 5a, d, & S2) and Xcc Aw formed linear fibers of less intricate structure
compared to those produced by Xcc A (Figure 5b & e). Xac displayed an intermediate
phenotype, i.e. linear structures, more complex than those formed by Aw strains (Figure
5c & f). No aggregates were formed by Xac on fruit of either grapefruit or Mexican lime
(Figure 6e & f) and by Xcc Aw on grapefruit (Figure 6c), but numerous aggregates were
observed for the wide host range Xcc on both fruit (Figure 6a & b) and for Xcc Aw on
Mexican lime fruit (Figure 6d). After 20 d, linear structures were observed by SEM on
Mexican lime leaf for Xcc Aw but not Xcc A (Figure 8).
Figure 5. Scanning electron microscopy of leaf infections by Xanthomonas citri subsp. citri type A (a, d)
compared with type Aw (b, e) or X. alfalfae subsp. citrumelonis (c, f) on Mexican Lime (a, b, c) and
Swingle citrumelo (d, e, f) at 24 h post inoculation.
Capítulo 5. Formación de biopelículas en Xanthomonas citri subsp. citri con distinta gama de huésped
159
Figure 6. Scanning electron microscopy of fruit infections by citrus xanthomonads on fruit of grapefruit
(a, c, e) or Mexican lime (b, d, f) at 4 d post inoculation. a and b.Biofilm developed by 4 d post
inoculation for wide host range Xcc A strain on grapefruit or Mexican lime (a, b) or for the restricted host
range Xcc Aw strain inoculated on Mexican lime (d), compared with patchy development for the restricted
host range Xcc A strain on grapefruit (c) and lack of biofilm formation for Xac strain on grapefruit and
Mexican lime (e, f).
Capítulo 5. Formación de biopelículas en Xanthomonas citri subsp. citri con distinta gama de huésped
Figure 7. CLSM of infections by Xanthomonas citri subsp. citri type A
(MIpUFZJLVA) on Mexican lime fruit surface at 24 h post inoculation. The image
shows the maximum projection of a series of pictures from single sections of the
inoculated fruit.
Figure 8. Scanning electron microscopy of stomatal infections by Xanthomonas citri
subsp. citri Aw on Mexican lime leaf 20 d post inoculation.
Capítulo 5. Formación de biopelículas en Xanthomonas citri subsp. citri con distinta gama de huésped
161
4.3. Swimming motility
Motility of citrus xanthomonads and Xc was assayed in both minimal and rich semisolid
agar media plates over a 7 d period. Swimming occurred in minimal media (MMA and
XVM2) (Figure 9), but was restricted in rich media (PYM or LB) that promoted rapid
growth of large colonies on the agar surface. Analysis of swimming motility on MMA
and XVM2 revealed significant differences (P<0.05) among the Xanthomonas strains
(Figure 9).
Figure 9. Swimming motility of Xanthomonas spp. on MMA medium plates at 96 h post inoculation. Five
strains from citrus: a. Xcc A 306, b. Xcc A 62, c. Xcc A* Iran 2, d. Xcc Aw 12879, e. Xac F11 and one
strain from cabbage f. Xc 1609.The graph shows the mean diameter of colonies formed by Xanthomonas
strains: X. citri subsp. citri strains (Xcc A): 306 and 62, 12879 (Xcc Aw), Iran2 and Iran10 (Xcc A*)
causing citrus bacterial canker (CBC), Xac F11 causing citrus bacterial spot (CBS) and Xc 1609 causing
crucifer black rot (CBR) on minimal medium A (MMA) and XVM2 medium. Error bar represents the
standard deviation (SD) of mean of three different assays with three replicates in each assay. Student-
Newman-Keuls multiple range test (P<0.05). Lower case letters refer to differences among the strains in
MMA medium, capital letters refer to differences among the strains in XVM2 medium.
Capítulo 5. Formación de biopelículas en Xanthomonas citri subsp. citri con distinta gama de huésped
In XVM2 medium Xcc Aw and Xcc A* displayed greater swimming motility than the
other xanthomonads. Xac and Xc produced an intermediate swimming phenotype
between wide and restricted citrus host range strains of Xcc A. Xcc A produced satellite
colonies at the edge of the swimming halo whereas Xcc Aw and Xcc A* did not. This
colony phenotype was also observed for the Xcc A strain expressing GFP (Figure 10).
Figure 10. Swimming motility on MMA medium 0,3 agar plates at 96 hpi
of Xcc 306 expressing GFP in the stable plasmid PUFZ75. Microcolonies
are shown at the edge of the swimming halo. Magnification: 40X.
Capítulo 5. Formación de biopelículas en Xanthomonas citri subsp. citri con distinta gama de huésped
163
5. Discussion
Biofilm functions as an important virulence factor in Xcc A (Huang et al., 2013;
Malamud et al., 2011; Malamud et al., 2013; Rigano et al., 2007; Torres et al., 2007).
Moreover, Xcc A establishment on leaf and fruit surfaces is dependent on biofilm
formation (Cubero et al., 2011; Favaro et al., 2014; Li and Wang, 2011b; Malamud et
al., 2011; Rigano et al., 2007; Zimaro et al., 2014). The present study identified
differences in biofilm production by wide and restricted host range strains of Xcc and
other xanthomonads depending on culture nutritional conditions and citrus host. Our
finding that greater biofilm formation occurred on minimal than rich media confirms a
previous report by Rigano et al. (2007). Less biofilm formation after growth in LB
medium may be a response to abundant nutrients and absence of stress (Petrova &
Sauer, 2012). Moreover, the biofilm response of restricted host range strains Xcc Aw and
A* in XVM2 medium, that simulates the apoplast, was more varied than for the wide
host range Xcc A. The apoplast is a nutrient-limited environment where the bacterium is
stressed by not only nutrient limitation, but also plant defense agents (Rico et al., 2009).
Greater biofilm production response of the restricted host range strains is maybe
indicative of less tolerance of biotic and abiotic stresses compared to wide host range
strains.
Biofilm formation on leaves and fruits by the three citrus xanthomonads, Xcc A, Xcc
Aw, and Xac, demonstrated a specific ability to produce viable biofilm on citrus hosts
versus non-hosts. Lower ability or inability of Aw to form biofilm, and therefore to
survive, on Swingle citrumelo leaves and on grapefruit fruit and of Xac strain on fruits
is consistent with the non-host status of these strains (Graham et al., 1992; Sun et al.,
2004). CBC resistance of ‘Okitsu’ mandarin has been partially explained by the reduced
ability of Xcc to produce biofilm on the leaf surface (Favaro et al., 2014). After artificial
inoculation of Duncan grapefruit by infiltration, Xcc Aw colonized the apoplast and
produced a hypersensitive response (Vernière et al., 1998; Sun et al., 2004).
Furthermore, the filamentous aggregates formed by Xcc Aw might not be as protective
as the more complex biofilm structures produced by Xcc A, perhaps a sign of
incompatibility of Aw with grapefruit.
Attachment to surfaces is dependent on the tissue surface conditions as well as the
bacterial genotype (Petrova & Sauer, 2012). In Xanthomonas, adhesive structures may
Capítulo 5. Formación de biopelículas en Xanthomonas citri subsp. citri con distinta gama de huésped
have evolved as an adaptation to the host environment the bacterium colonizes
(Mhedbi-Hajri et al., 2011a). Factors produced by the compatible host Mexican lime
may activate biofilm formation in citrus xanthomonads as all are able to colonize both
outside and inside the host tissue. Differences in transcription of genes possibly linked
to biofilm formation have been described when these strains are cultured in apoplast
simulating XVM2 medium (Jalan et al., 2013a; Jalan et al., 2013b). Regarding Xac
compared to Xcc 306, some variation has been identified in lipopolysaccharide and the
type IV pilus (Jalan et al., 2011) which participate in biofilm formation in Xanthomonas
and other plant pathogens (Mhedbi-Hajri et al., 2011b). Genomic and transcriptomic
variation could explain differences in adhesion, biofilm formation in vivo and in vitro
and bacterial motility.
Bacterial motility promotes entry into stomata or wounds. Flagellar dependent motility
allows bacteria to locate specific sites for adhesion and functions in biofilm formation,
initial attachment, maturation and dispersal (Danhorn & Fuqua, 2007). Differential
swimming ability among strains was observed in both XVM2 and MMA media. Higher
swimming motility was observed for restricted host range CBC strains. Meanwhile,
wide host range CBC strains showed more limited swimming ability with the
production of satellite colonies described before for motility mutants in Aeromonas
hydrophila AH-3 (Wilhelms et al., 2011). A relationship between swimming ability in
XVM2 media and biofilm formation was found. Narrow host range citrus Xanthomonas
strains that formed more biofilm also showed greater swimming ability in XVM2. This
relationship is supported by previous work wherein mutants lacking flagellin and
flagellar hook proteins were unable to swim, and produced less biofilm than the wild
type Xcc (Malamud et al., 2011). XVM2 has also been demonstrated to upregulate
several virulence related genes in xanthomonads (Astua-Monge et al., 2005; Jalan et al.,
2013a; Schulte and Bonas, 1992).
Our hypothesis is that although biofilm formation is not an essential step in the disease
cycle, it facilitates the bacterial entry and establishment in the substomatal chamber.
This may explain in part the ability of wide host range CBC strains to infect several
citrus species. On the other hand, restricted host range Xcc strains, which require a more
specific niche than the wide host range strains for infection, have higher swimming
ability to enable location of the colonization site in the substomatal chamber. Although
host range cannot be entirely explained by the different motility and biofilm formation
Capítulo 5. Formación de biopelículas en Xanthomonas citri subsp. citri con distinta gama de huésped
165
by citrus Xanthomonas strains, our results support the putative role of biofilm formation
in the initial steps of the infection process. Aggregation formation and structure appear
to be specific for the interaction between Xanthomonas strains and their compatible
host.
Acknowledgements
This work was kindly supported by Citrus Advance Technology Program, project
CRDF546 as well as through Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraría y
Alimentaria (INIA) project RTA2008-00048. Marta Sena held a PhD fellowship from
INIA.
167
CAPÍTULO 6: PRESENCIA DE ADN
EXTRACELULAR DURANTE LA FORMACIÓN
DE BIOPELÍCULAS EN Xanthomonas DE
CÍTRICOS Y CRUCÍFERAS
Enviado a Microbiology
Presence of extracellular DNA during biofilm formation in
Xanthomonas strains from citrus and cabbage
Marta Sena-Vélez1, Cristina Redondo
1, James H. Graham
2 and Jaime Cubero
1
1Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria (INIA), Ctra de
La Coruña Km 7.5 (Madrid), Spain. 2University of Florida, Citrus Research and
Education Center (CREC), 700 Experiment Station Road, Lake Alfred, FL 33850, USA
Capítulo 6. Presencia de ADN extracelular durante la formación de biopelículas en Xanthomonas de
cítricos y crucíferas
169
1. Summary
Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc) A strain causes citrus bacterial canker, a serious
leaf, fruit and stem spotting disease of several Citrus species, X. alfalfae subsp.
citrumelonis (Xac) is the cause of citrus bacterial spot, a minor disease of citrus nursery
plants, and X. campestris pv. campestris (Xc), is a systemic pathogen that causes black
rot of cabbage. Xanthomonas spp. form biofilms in planta that facilitate the host
infection process. Herein, the role of extracellular DNA (eDNA) was evaluated in the
formation and stabilization of the biofilm matrix. The presence of eDNA in biofilm was
confirmed for several Xcc strains and Xac. DNAse treatments of Xcc strains and Xac
reduced biofilm formation at the initial stage of development as well as disrupted
preformed biofilm. The DNAse effect on formation or disruption varied among Xcc
strains and Xanthomonas species and indicates differing roles for eDNA. Differences in
fiber structures containing eDNA in biofilms, bacterial cultures, and in twitching
motility assays were detected by SYTO-9 staining and fluorescence microscopy. The
proposed roles for eDNA in the early stages of biofilm formation are as an adhesin and
in mature biofilms as a structural component.
Capítulo 6. Presencia de ADN extracelular durante la formación de biopelículas en Xanthomonas de
cítricos y crucíferas
170
2. Background
Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc) (formerly X. axonopodis pv. citri) is the causal
agent of Asiatic citrus bacterial canker (CBC), a serious disease of many citrus species
(Graham et al., 2004; Schaad et al., 2006). X. alfalfae subsp. citrumelonis (Xac) is the
cause of citrus bacterial spot (CBS), a minor foliar disease of young citrus plants in
nurseries (Graham and Gottwald, 1990). Xcc produces necrotic lesions on leaves, twigs
and fruits that reduces fruit quality and marketability and restrict commercialization of
plants and fruits in markets free of CBC (Graham et al., 2004). Xcc A strain is by far the
most severe and widespread CBC pathogen and affects the widest range of Citrus
species. Within Xcc A strains, two limited host range variants have been described, Xcc
A* and Aw from Southwest Asia and Florida, respectively, that cause CBC on Mexican
lime (Citrus aurantifolia) (Cubero & Graham, 2002; Jalan et al., 2013a; Jalan et al.,
2013b; Sun et al., 2004; Verniere et al., 1998). X. campestris pv. campestris (Xc) is the
causal agent of black rot, one of the most important diseases of crucifers worldwide.
Black rot is a systemic vascular disease that causes symptoms including marginal leaf
chlorosis, necrosis, and darkening of leaf veins and vascular tissue within the stem
(Hayward, 1993; Vicente and Holub, 2013).
Biofilms adhere bacteria to surfaces within a tridimensional structure that protects the
bacterium against antibiotics and abiotic stresses (Busscher and van der Mei, 2012;
Costerton et al., 1999; Cubero et al., 2011; Petrova and Sauer, 2012). Biofilms are
composed of 10% bacteria and 90% extracellular polymeric matrix (Flemming &
Wingender, 2010). The extracellular matrix provides resistance to temperature, pH and
other deleterious conditions and also confers mechanical stability. The extracellular
matrix is composed of water, proteins, extracellular DNA (eDNA), exopolysaccharide,
lipopolysaccharide, lipids and surfactants (Flemming & Wingender, 2010; Strelkova et
al., 2013).
Xcc produces biofilm to facilitate the infection process (Cubero et al., 2011; Rigano et
al., 2007). Several mechanisms in Xcc contribute to biofilm formation during the host-
pathogen interaction: adhesins, type III secretion system, lipopolysaccharide,
exopolysaccharide, type IV pili and chemotaxis (Dunger et al., 2014; Gottig et al.,
2009; Li & Wang, 2011; Malamud et al., 2010; Malamud et al., 2013; Moreira et al.,
2014; Rigano et al., 2007; Sgro et al., 2012; Yaryura et al., 2015; Zimaro et al., 2014).
Capítulo 6. Presencia de ADN extracelular durante la formación de biopelículas en Xanthomonas de
cítricos y crucíferas
171
Furthermore, biofilm formation in planta is related to the different host range of Xcc
strains (Sena-Vélez et al., 2014).
eDNA is an important component of the extracellular matrix in biofilms for several
Gram-positive, Gram-negative bacteria (Conover et al., 2011; Das et al., 2010; Hall-
Stoodley et al., 2008; Nemoto K. et al., 2003; Vilain et al., 2009; Whitchurch et al.,
2002) and archaea (Chimileski et al., 2014). The presence of eDNA in the extracellular
matrix was described in 1956 (Catlin, 1956). The importance of eDNA in biofilm
formation was first demonstrated for Pseudomonas aeruginosa in the early stages of
bacterial adhesion (Whitchurch et al., 2002). In clinical isolates of the same species,
eDNA was also found to be important for stability of the biofilm (Nemoto K. et al.,
2003). In P. aeruginosa biofilms eDNA coats the surface like a net in which bacteria are
attached, and may also form a mushroom-like cap over the outer surface of the
aggregate (Allesen-Holm et al., 2006). Besides biofilm formation, eDNA contributes to
bacterial resistance to antibiotics, e.g., a Bacillus cereus mutant, that did not produce
eDNA, was more susceptible to actinomycin D than the wild type (Vilain et al., 2009).
eDNA has been demonstrated to be a nutrient source of phosphorus, nitrogen and
carbon. DNAse in P. aeruginosa secreted via Type II Secretion System is related with
nutrient acquisition, biofilm dispersal and horizontal gene transfer (Bakkali, 2013;
Jakubovics et al., 2013; Mulcahy et al., 2010). At high concentrations, eDNA produces
antimicrobial activity by chelating cations and destabilizing the bacterial outer
membrane through lipopolysaccharide modification (Mulcahy et al., 2008). These
findings identify eDNA as an important component of the extracellular matrix that plays
a role in several processes related to bacterial colonization and virulence.
The roles that eDNA play in attachment and biofilm formation are not well
characterized for plant-bacterial pathogen interactions. Presence of eDNA in the
extracellular matrix and in the different phases of biofilm formation have not been
extensively studied for Xanthomonas spp. Herein, we report on the contribution of
eDNA to biofilm formation for several pathogenic strains of Xanthomonas from citrus
and one from cabbage. In these studies, eDNA was visualized by fluorescence staining
of bacterial cultures, biofilms and motile bacteria.
Capítulo 6. Presencia de ADN extracelular durante la formación de biopelículas en Xanthomonas de
cítricos y crucíferas
172
3. Methods
3.1. Bacterial strains, culture media and growth conditions
Bacterial strains used in this study and their natural hosts are listed in Table 1. Two
wide host range strains of Xcc A, and two narrow host range strains, A* and Aw, were
evaluated along with X. alfalfae subsp. citrumelonis and X. campestris pv. campestris.
Bacterial strains were routinely grown in Luria Bertani (LB) broth (10 g tryptone, 5 g
yeast extract and 5 g sodium chloride per litre) or on LB plates (1.5% bacteriological
agar) at 27ºC for 48 h.
Table 1. Strains of Xanthomonas spp. used in the study
‡Citrus Bacterial Canker (CBC),
†Citrus Bacterial Spot (CBS) and
ǁCrucifer Black Rot (CBR).
3.2. Determination of eDNA in biofilms
To confirm the presence of eDNA in xanthomonads biofilm, DNAse
(Deoxyribonuclease I from bovine pancreas; Sigma Aldrich Inc., St. Louis, MO, USA)
was added at different concentrations to static cultures of Xanthomonas strains at
different times. To evaluate biofilm formation, bacterial cultures in log growth phase
were washed twice with 10mM MgCl2 and suspended at 108 cfu mL
-1 in XVM2
medium (20 mM NaCl, 10 mM (NH4)2SO4, 5 mM MgSO4, 1 mM CaCl2, 0.16 mM
KH2PO4, 0.32 mM K2HPO4, 0.01 mM FeSO4, 10 mM fructose, 10 mM sucrose, 0.03%
casamino acid) (Wengelnik et al., 1996; Astua-Monge et al., 2005). Microtiter plate
wells were filled with 200 µL of the bacterial culture and incubated without shaking for
72 h at 27ºC. After removing the medium, bacteria were incubated for an additional 72
h. Biofilm formation was measured after rinsing the plates with sterile distilled water
(SDW) and staining with 0.3 % crystal violet (CV) for 15 min. Excess stain was
removed by rinsing the plates with SDW. Residual CV in each well was solubilized in
Strain Taxon, or disease and CBC type Natural Host
Xcc 306 Xanthomonas citri subsp. citri, CBC‡ A Citrus spp.
Xcc 62 Xanthomonas citri subsp. citri, CBC A Citrus spp.
Xcc Iran 2 Xanthomonas citri subsp. citri, CBC A* C. aurantifolia
Xcc Aw 12879 Xanthomonas citri subsp. citri, CBC A
w C. aurantifolia
Xac F1 Xanthomonas alfalfae subsp. citrumelonis, CBS† Citrus spp.
Xc 1609 Xanthomonas campestris pv. campestris CBRǁ
Cabbage
Capítulo 6. Presencia de ADN extracelular durante la formación de biopelículas en Xanthomonas de
cítricos y crucíferas
173
200µL of an acetone (20%), ethanol (80%) mixture and the absorption of the extract
measured in a microtiter plate reader set at A570 nm wavelength. Absorption values for
each strain and treatment were calculated as the mean of readings from three wells from
at least three different assays. The means were compared by analysis of variance
(ANOVA) and separated by Student-Newman-Keuls (SNK) multiple range test using
Statgraphics Plus for Windows 4.1 (Statistical Graphics, Rockville, MD).
For the different treatments, DNAse I was suspended in 0.15 M of NaCl and then in
DNAse I reaction buffer (10mM of MgCl2 and 50% of glycerol suspended in 10mM of
Tris-HCl at pH 7.5) as previously described (Conover et al., 2011). DNAse I was added
at concentrations of 20 or 40 Kunitz mL-1
at 0, 24, 48 and 72 h post bacterial seeded
(hps) to evaluate eDNA effect on biofilm development or on preformed biofilm. In
order to determine if variation in biofilm was affected by the reaction buffer, a control
treatment with the buffer without DNAse I was included.
3.3. eDNA staining
To detect eDNA, samples were stained with SYTO-9 from the Live/Dead Bacterial
viability kit (Molecular Probes Europe BV; Leiden, The Netherlands) and observed with
fluorescence microscopy. CV staining was also performed to visualize extracellular
structures as previously described for flagella staining of Xcc (Kraiselburd et al., 2012).
Biofilm formation was assayed as described above. In the assay, 25 mL of the bacterial
culture in XVM2 and LB media was incubated without shaking at 27ºC in a 50 mL
borosilicate flask. After 72 h, bacteria growing on the bottom of the flask were collected
and stained either with SYTO-9 for 20 min in the dark or with CV. For mature biofilm,
the liquid medium was decanted and the flasks were incubated an additional 72 h. To
stain mature biofilm, bacteria were collected by adding 50µL of SDW and scraping
them from the bottom of the flask followed by the staining procedures described above.
To evaluate twitching motility, bacteria in log growth phase were washed twice with
10mM MgCl2 and suspended in 1.0 mL of MgCl2 in a 1.5 mL centrifuge tube. Bacteria
were then centrifuged at 10,000 g for 10 min and the supernatant was discarded.
Bacteria were inoculated with a toothpick in PYM agar medium (Peptone 0.5%, Yeast
extract 0.3%, Malt extract 0.3% and bacteriological agar 1%) supplemented with 2%
glucose. Plates were incubated at 27ºC for 7 d. To stain twitching bacteria, the medium
was removed and the bacterial colony present on the bottom plate stained with SYTO-9
Capítulo 6. Presencia de ADN extracelular durante la formación de biopelículas en Xanthomonas de
cítricos y crucíferas
174
or CV. After 20 min of staining, plates were washed with SDW and observed under the
light and fluorescence microscope.
4. Results
4.1. Importance of eDNA in Xanthomonas biofilms
The role of eDNA in biofilm formation by Xanthomonas strains was estimated by
measuring biofilm formation after DNAse I treatment at 0, 24, 48 or 72 hps. Biofilm
formation was compared in XVM2 medium, XVM2 medium plus buffer, and XVM2
medium plus buffer and DNAse I at 20 or 40 Kunitz mL-1
. In most cases, reduction of
biofilm formation was dependent on the timing of DNAse I treatment (Fig. 1).
Figure 1. Biofilm formation after treatment with DNAse I at different times after bacterial seeded with
different Xanthomonas species and strains (see Table 1). (a) DNAse added at 0 h post seeded (hps), (b)
DNAse added at 24 hps, (c) DNAse added at 48 hps, and (d) DNAse added at 72 hps. The absorbance
values were normalized to the control XVM2 plus buffer in order to compare the response for different
strains. Error bars represent the standard deviation. Graphs are a representative assay of at least three
assays with three replicates per assay. Statistical analyses were performed using STATGRAPHICS Plus,
version 5.1 (Copyright Manugistics Inc.).
Capítulo 6. Presencia de ADN extracelular durante la formación de biopelículas en Xanthomonas de
cítricos y crucíferas
175
Reduction of biofilm was significant (p<0.05) for citrus Xanthomonas strains and
DNAse I application time. In contrast, DNAse I reduction of biofilm formation by Xc
1609 strain was inconsistent. Citrus Xanthomonas strains varied widely in response to
DNAse I; at 0 hpi, DNAse I significantly (p>0.05) reduced biofilm production by all
citrus strains and no differences were observed between DNAse concentrations, Fig.
1(a); at 24 and 48 hpi, DNAse I did not reduce biofilm formation by wide host range
Xcc strains but reduced production by narrow host range Xcc strains and Xac, Figs. 1(b)
& (c); at 72 hpi, DNAse I only reduced biofilm production by the Iran 2 strain, Fig.
1(d).
4.2. Importance of eDNA in preformed biofilm
To evaluate the role of eDNA in mature biofilms, DNAse I treatments for 1 h or
overnight were performed. Biofilm disruption was observed after both incubation
periods but overnight treatment had greater effect, Fig. 2. DNAse I treatment for 1 h did
not produce a significant (p>0.05) effect for strains Xcc 306 and Xc 1609, but
significantly (p<0.05) reduced biofilm for strains Xcc 62, 12789, Iran 2 and Xac F1,
Fig. 2(a). Overnight treatment of citrus Xanthomonas strains with DNAse I reduced
biofilm up to 80-90%, Fig. 2(b). Similar treatment did not significantly (p>0.05) reduce
biofilm of Xc 1609 compared to the buffer control. Reduction of biofilm was greater for
Xcc strains than Xac F1 or Xc 1609.
Figure 2. Effect of DNAse treatment on preformed biofilms. (a) DNAse treatment of 1 hour of duration.
(b) DNAse treatment for an overnight period. The absorbance values were normalized to the control
XVM2 plus buffer in order to compare the response for different strains. Error bars represents the
standard deviation. Graphs are a representative assay of at least three assays with three replicates per
assay.
Capítulo 6. Presencia de ADN extracelular durante la formación de biopelículas en Xanthomonas de
cítricos y crucíferas
176
4.3. Detection of eDNA in Xanthomonas strains
Presence of eDNA in Xanthomonas biofilms was confirmed by SYTO-9 and CV
staining of static bacterial cultures at different stages of biofilm formation, Figs. 3 & 4.
SYTO-9 penetrated bacterial membranes and stained eDNA as previously reported
(Böckelmann et al., 2006; Lawrence et al., 2003). Furthermore, eDNA was observed in
bacterial cultures in the exponential growth phase, Figs. 5 & 6, and in twitching motility
assays, Fig. 7.
eDNA in Xanthomonas strains appeared as long fibers of variable thickness and as an
amorphous mass surrounding bacterial cells, Figs. 3, 4, 5, 6 & 7. Fibers of eDNA were
observed in static cultures after 72 h (early stage of biofilm formation) as well as in
biofilms, Figs. 3 & 4 respectively. For strains Xcc 306, Figs. 3 & 4(a), (b), (c) & (d) and
12879, Figs. 3 & 4(e), (f), (g) & (h), on LB and XVM2 media, the fibers appeared to
interconnect cells in the aggregates. The fibers shown after staining with CV, Figs. 3 &
4(a), (c), (e) & (g) were similar to those observed after staining with SYTO9, Figs. 3 &
4(b), (d), (f) & (h), suggesting the fibers were high in eDNA content. Similar results
were observed in the twitching motility assay, Fig. 7. eDNA fibers produced by the
limited host range strains Xcc 12879 and Iran 2, Figs. 7(c), (d), (e) & (f) were longer
than the fibers produced by Xcc 306, Figs. 7(a) & (b). Differences in the development of
eDNA fibers were also observed between Xcc 306, Fig. 5(a) and 12879, Fig. 5(b), in log
growth phase in LB media.
Capítulo 6. Presencia de ADN extracelular durante la formación de biopelículas en Xanthomonas de
cítricos y crucíferas
177
Figure 3. Light (a), (c), (e) & (g) and fluorescence (b), (d), (f) & (h) microscopy (1000X magnification) of
72 h static cultures on LB (a), (b), (e) & (f) or XVM2 (c), (d), (g) & (h) media. Strains Xcc 306 (a), (b),
(c) & (d) and Xcc 12879 Aw (e), (f), (g) & (g) stained with crystal violet (CV) at the early stages of
biofilm formation of Xcc visualized in LB medium as fibers interconnecting cells at different stages of
aggregation, from one to several cells (a) & (e). SYTO-9 staining revealed similar fiber structures (b) &
(f). In XVM2 medium, fibers were thicker and more consistent after staining with CV (c) & (g) and
SYTO-9 (d) & (h). eDNA in XVM2 medium appeared to cover the surface like a sheet rather than as
individual fibers (c) & (d).
Capítulo 6. Presencia de ADN extracelular durante la formación de biopelículas en Xanthomonas de
cítricos y crucíferas
178
Figure 4. Light (a), (c), (e) & (g) and fluorescence (b), (d), (f) & (h) microscopy (1000X magnification)
of mature biofilms on LB (a), (b), (e) & (f) or XVM2 (c), (d), (g) & (h) media. Strains Xcc 306 (a), (b),
(c) & (d) and Xcc 12879 Aw (e), (f), (g) & (h) were more aggregated in XVM2 than LB. A high level of
aggregation for strain 12879 in XVM2 made it difficult to observe eDNA fibers in aggregates (g) & (h).
In XVM2, strain 306 (c) & (d) was less aggregated and crystal violet (CV) and SYTO-9 staining revealed
eDNA surrounding the cells (c) & (d). In LB, CV (a) & (e) and SYTO-9 (b) & (f) staining of strains
revealed long fibers interconnecting aggregates. Strain 306 fibers had a lattice structure (a) & (b), while
strain 12879 strain had parallel fibers (e) & (f).
Capítulo 6. Presencia de ADN extracelular durante la formación de biopelículas en Xanthomonas de
cítricos y crucíferas
179
Figure 5. Fluorescence microscopy (1000X magnification) of Xcc 306 (a) and Xcc Aw 12879 (b) in LB
broth at exponential growth phase stained with SYTO-9. A high level of eDNA fibers was produced by
both strains. Fibers appeared to connect cells over a long distance (b). Xcc Aw 12879 fibers were well
developed while strain 306 fibers were more diffuse.
Figure 6. Flourescence microscopy (1000X magnification) of a pelleted culture of Xcc Aw
12879 at exponential phase in LB broth stained with SYTO-9. The bacterial aggregate
appeared to be breaking due to the forces between the slide and the coverslide, and the eDNA
fibers connecting the sides of the rupture. Abundant fibers appeared to stabilize aggregates.
Capítulo 6. Presencia de ADN extracelular durante la formación de biopelículas en Xanthomonas de
cítricos y crucíferas
180
Figure 7. Light (400X magnification) and fluorescence microscopy (1000X magnification) of
Xcc twitching motility in PYM agar medium. Cultures were stained with crystal violet (CV)
(a), (c), & (e) or SYTO-9 (b), (d) & (f). Twitching motility was observed between the plate
surface and the medium. CV and SYTO-9 staining of strains Xcc 306 (a) & (b), Xcc Aw
12879 (c) & (d) and Xcc Iran 2 (e) & (f) revealed similar twitching structures. Fibers
observed after CV staining appeared to have a high eDNA content. Twitching structures were
longer for Xcc Aw 12879 than for Xcc 306.
5. Discussion
Extracellular DNA (eDNA) is an important component of the biofilm matrix in several
bacteria, playing roles in adhesion, aggregate stability, nutrition, protection and gene
exchange (Bakkali, 2013; Jakubovics et al., 2013; Mulcahy et al., 2008; Mulcahy et al.,
2010; Vilain et al., 2009; Whitchurch et al., 2002). In this study, eDNA was detected at
Capítulo 6. Presencia de ADN extracelular durante la formación de biopelículas en Xanthomonas de
cítricos y crucíferas
181
different stages of biofilm formation for Xanthomonas strains from different host plants.
In many cases, DNAse treatment reduced or disrupted biofilm depending on the strain
and the biofilm stage. DNAse did not cause mortality or reduce bacterial growth rate,
but was limited to the effect on biofilm formation. When DNAse treatment terminated,
bacterial attachment to the surfaces and aggregation resumed thereafter.
eDNA has been described as an adhesin in B. cereus (Vilain et al., 2009),
Staphylococcus epidermis, S. aureus, S. mutants (Das et al., 2010) and P. aeruginosa
(Whitchurch et al., 2002). Herein, similar eDNA properties were demonstrated for
citrus strains of Xanthomonas. eDNA appeared to be important for the early stages of
attachment by wide host range Xcc strains, whereas narrow host range strains required
eDNA for biofilm development over an extended period. This difference may be related
to biofilm formation in vitro and in planta for these two host range types. In planta, at
24 hpi, wide host range Xcc strains produced more complex structures in biofilms than
the narrow host range Xcc strains and Xac strain which aggregated by producing long
fibers (Sena-Vélez et al., 2014). The less interconnected fibers of the narrow host range
Xcc strains and Xac strain may have rendered them more susceptible to DNAse
disruption of aggregated cells. Other extracellular structures such as fimbria or flagella
could influence biofilm formation and those structures may possibly be associated with
eDNA since most of the fibers observed with CV stain were also stained with SYTO-9.
The role of eDNA in the stability of biofilms is important for bacteria including
Escherichia coli, B. subtilis (Shields et al., 2013), S. mutants (Liao et al., 2014), some
strains of P. aeruginosa (Nemoto K. et al., 2003) and, as this study reports, strains of
Xcc and Xac. Mature biofilms of citrus strains, but not the crucifer strain Xc 1609, were
disrupted when exposed to DNAse. This observation suggests that the systemic
pathogen Xc has a low dependence on eDNA for biofilm formation, surface attachment
and stability of the biofilm. Our hypothesis is that as Xc moves systemically,
aggregation would not be occurring at the initial stage of the plant colonization, as
bacterial release from biofilms produces infection (Dow et al., 2003). Hence, the role of
eDNA depends on the structure and function of biofilm in plant colonization and
process depends on the xanthomonad-host interaction.
Biofilm has been described as major factor for Xcc virulence and survival in citrus
(Cubero et al., 2011; Rigano et al., 2007). Several factors influence biofilm for wide
host range Xcc strains. Mutants in the type IV pili produced biofilm but less structured
Capítulo 6. Presencia de ADN extracelular durante la formación de biopelículas en Xanthomonas de
cítricos y crucíferas
182
than that produced by the wild type strain (Dunger et al., 2014). Non-fimbrilar adhesins
have been described in the initial attachment of Xcc to abiotic surfaces (Gottig et al.,
2009). Our findings indicate that eDNA acts as an adhesin in conjunction with other
adhesins.
SYTO-9 staining and fluorescence microscopy detected eDNA in Xanthomonas
biofilms, cell cultures, and twitching motility assays as fibers interconnecting bacterial
cells. Fiber structure was confirmed by CV staining and indicates a high eDNA content
in the biofilm of citrus xanthomonads. Amorphous eDNA was also observed which is
possibly eDNA that has been recently secreted, but not processed into fibers.
Microscopic observation of a high eDNA content in biofilms is consistent with DNAse
disruption of preformed biofilm. These findings confirm the role of eDNA in
maintaining the structural integrity of xanthomonad biofilm.
Fibers were observed during biofilm formation in LB and XVM2 media. However the
fibers formed in XVM2 appeared to be thicker and more uniform than those in LB
medium, which is consistent with previous reports of higher biofilm formation in
XVM2 medium (Rigano et al., 2007;Sena-Vélez et al., 2014). In XVM2, a culture
medium that mimics apoplast conditions, several pathogenicity factors are expressed for
Xcc strains (Astua-Monge et al., 2005; Jalan et al., 2013a) and among them, eDNA
could be considered important for biofilm formation during plant infection. We also
found that eDNA is produced in the exponential growth phase as fibers interconnecting
cells, Figure 5, and furthermore, that bacterial aggregates appear to be stabilized by
eDNA fibers, Figure 6.
In P. aeruginosa, eDNA is a factor associated with twitching motility (Gloag et al.,
2013). Twitching is enabled through the extension and retraction of type IV pili
(Mattick, 2002) which bind to DNA (Cehovin et al., 2013; van Schaik et al., 2005).
SYTO-9 staining of twitching assay plates revealed the presence of fibers containing
eDNA that corresponded with the fibers observed when the twitching halo was stained
with CV. Twitching structures varied among limited and wide host range Xcc strains as
also observed for biofilm formation on plant surfaces (Sena-Vélez et al., 2014).
Twitching motility has recently been described for Xcc (Dunger et al., 2014; Sena-Vélez
et al., 2012). Twitching fibers of limited host range strains were longer than those of the
wide host range strains which had more interconnecting fibers. Interestingly Xcc cells
Capítulo 6. Presencia de ADN extracelular durante la formación de biopelículas en Xanthomonas de
cítricos y crucíferas
183
were always connected to eDNA fibers. In P. aeruginosa, eDNA along with surfactants
were secreted onto the surface as the bacterium was undergoing motility (Gloag et al.,
2013). Xcc appear to track the eDNA possibly through the type IV pilus since no
surfactant activity was confirmed for Xcc in our assays (results not shown). Our
hypothesis is that eDNA is secreted as fibers onto the surface as the bacterium initially
colonizes. This enables bacteria to twitch across the surface by binding the type IV pilus
with eDNA fibers deposited on the surface.
Many studies describe the disruption of eDNA in animal bacterial pathogens, for
examples, use of recombinant DNAse as a treatment against P. aeruginosa for cystic
fibrosis patients (Fuchs et al., 1994) and extracellular DNAse (NucB) from B.
licheniformis to inhibit and break bacterial biofilms (Nijland et al., 2010). Although
biofilm formation and motility are well-described virulence factors for many plant
pathogenic bacteria, occurrence and function of eDNA in plant pathogens is less well
known. The determination of roles of eDNA in plant pathogenesis will lead to a better
understanding of the plant-pathogen interaction and perhaps the development of tactics
to disrupt eDNA to effect bacterial disease control.
Acknowledgements
This work was kindly supported by Citrus Advance Technology Program, project
CRDF546 as well as through Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraría y
Alimentaria (INIA) project RTA2008-00048. Marta Sena held a PhD fellowship from
INIA.
185
CAPÍTULO 7: CARACTERIZACIÓN DE LA
MATRIZ EXTRACELULAR PRODUCIDA
DURANTE LA FORMACIÓN DE BIOPELÍCULAS
EN CEPAS DE Xanthomonas citri subsp. citri CON
DISTINTA GAMA DE HUÉSPED
Characterization of extracellular matrix during biofilm formation and
surface motility for Xanthomonas citri subsp. citri strains with different
host range
Sena-Vélez, M.1,
Graham, J.H.2, Girón, J.A.
3, Redondo, C.
1, Cubero, J
1.
1Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria (INIA), Ctra de
La Coruña Km 7,5 (Madrid), Spain. 2University of Florida, Citrus Research and
Education Center (CREC) 700 Experiment Station Road. Lake Alfred, FL 33850-2299,
USA. 3 University of Florida, Emerging Pathogen Institute. Gainesville, FL USA.
Capítulo 7. Caracterización de la matriz extracelular producida durante la formación de biopelículas en
cepas de Xanthomonas citri subsp. citri con distinta gama de huésped
187
1. Abstract
Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc) causes citrus bacterial canker (CBC) on several
citrus species. Xcc requires bacterial aggregation and biofilm formation to survive on
plant surfaces. Those biofilms are dependent on the environment situation, and their
structures have been observed different according to the host range type of the Xcc
strain.
Herein, we have reported the variable extracellular structures produced by Xcc strains
with different host range at the early stage of biofilm formation, in mature biofilms or
during planktonic growth. Moreover, the presence of these structures was related to the
transcription of quorum sensing, flagellar and fimbrial related genes. In addition,
surface translocation was characterized for Xcc strains by transmission electron
microscopy and transcriptional analysis. Our results showed that the variation in Xcc
biofilm formation and surface motility found in different Xcc strains was associated
with the expression of fimbrial and flagellar genes which in some cases are dependent
of quorum sensing system.
Capítulo 7. Caracterización de la matriz extracelular producida durante la formación de biopelículas en
cepas de Xanthomonas citri subsp. citri con distinta gama de huésped
188
2. Introduction
Citrus bacterial canker (CBC) is caused by Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc) (CBC
type A) and X. fuscans subsp. aurantifolii (CBC types B and C). CBC is worldwide
distributed along tropical and subtropical areas restricting plants and fruits
commercialization from infested to non-infested citrus producing areas (Graham et al.,
2004). CBC is characterized by the appearance of circular water soaked lesions that
become slightly raised, brown coloured with a corky appearance (Brunings and Gabriel,
2003). CBC A type affects many Citrus species and cultivars, being considered the most
aggressive disease variant (Stall and Civerolo, 1991). Within CBC type A, two subtypes
are described, Aw and A* from Florida and Southwest Asia respectively (Sun et al.,
2004; Vernière et al., 1998). These subtypes show a narrow host range, infecting in the
field only Mexican lime (Citrus aurantifolia), although both of them are able to produce
non-canker lesions and increase bacterial population in other Citrus species.
Furthermore, CBC Aw type produce hypersensitive response in Duncan grapefruit (C.
paradisi) when infiltrated (Escalon et al., 2013; Rybak et al., 2009; Sun et al., 2004;
Vernière et al., 1998) .
Biofilms are described as bacterial communities attached to surfaces which provides
resistance against deleterious conditions to the bacterial population (Costerton et al.,
1999; Petrova and Sauer, 2012). In addition, biofilms have been described as important
for plant colonization and infection in several plant pathogenic bacteria including Xcc
(Cubero et al., 2011; Danhorn and Fuqua, 2007; Rigano et al., 2007).
The extracellular matrix is a large component of the bacterial biofilms (90%) which
consists of exopolysaccharide, lipopolysaccharide, proteins and extracellular DNA
(Flemming and Wingender, 2010; Petrova and Sauer, 2012). The importance of the
extracellular matrix relies on the biofilm structure, bacterial protection and contributes
in processes involved in nutrient acquisition, enzyme production and bacterial signaling
(Flemming and Wingender, 2010). Most of biofilm formation studies on CBC have
been focused on wide host range strains, mainly in strain Xcc 306 which was the first
citrus pathogenic Xanthomonas sequenced (da Silva et al., 2002). However few studies
have been performed on narrow host range strain types Aw and A*. Studies on A*
strains have been more related with its biochemical description, genetic
characterization, variability and worldwide distribution (Derso et al., 2009; Ngoc et al.,
Capítulo 7. Caracterización de la matriz extracelular producida durante la formación de biopelículas en
cepas de Xanthomonas citri subsp. citri con distinta gama de huésped
189
2007; Pruvost et al., 2014a; Pruvost et al., 2015; Vernière et al., 1998; Vernière et al.,
2014). Strain type Aw has recently become higher importance since its complete
genome sequence was published in 2013 (Jalan et al., 2013b) and some transcriptomic
studies have been performed to compare it with Xcc 306 strain (Jalan et al., 2013a). Up
to date, solely studies related with its description and molecular characterization had
been published (Sun et al., 2004).
A study has been published comparing the effector repertoires of the different CBC
strains types and their role in host range (Escalon et al., 2013). This study suggests that
other bacterial mechanisms, not related directly with effectors, might be involved in the
host range of Xcc strains. In addition a recent study showed differences in biofilm
formation, both on abiotic and plant surfaces, between narrow and wide host range
strains of Xcc (Sena-Vélez et al., 2014).
Flagella and type IV pili have been described to participate in biofilm formation in Xcc
in studies with bacterial mutants (Dunger et al., 2014; Malamud et al., 2011). In
addition other components of the matrix have been described such as eDNA and
exopolysaccharide (Rigano et al., 2007; Sena-Vélez et al., submitted). Herein, the
bacterial extracellular appendages, that conformed the three dimensional structure of the
biofilm, were identified and visualized in two CBC strains with different host range. As
well, we provided a transcriptional analysis of several biofilm related genes, associating
their transcription with the extracellular structures visualized during processes such as
the biofilm formation and surface motility for wide and limited host range strains of
CBC A in order to explain the structures observed both in vitro and in vivo for both
strains (Sena-Vélez et al., 2014).
3. Materials and methods
3.1. Bacterial strains and growth conditions
Xanthomonas strains used in this study are listed in Table 1. Two wide host range
strains of CBC A type, Xanthomonas citri subsp. citri 306 and Xcc MI, and a limited
host range CBC strains Xcc 12879 (CBC Aw), were used. Bacterial strains were
routinely grown on Luria Bertani broth (LB) (10 g tryptone, 5 g L-1
yeast extract and
Capítulo 7. Caracterización de la matriz extracelular producida durante la formación de biopelículas en
cepas de Xanthomonas citri subsp. citri con distinta gama de huésped
190
85.5 mM of sodium chloride) or on LB plates (1.5% bacteriological agar) at 27ºC for 48
h.
Table 1. Xanthomonas used in this study.
a Citrus Bacterial Canker
3.2. Extracellular protein purification
In order to evaluate the extracellular structures produced by Xcc, strains Xcc MI and Xcc
12879 were cultured on LB and XVM2 media (20 mm NaCl, 10 mm (NH4)2SO4, 5 mm
MgSO4, 1 mm CaCl2, 0.16 mm KH2PO4, 0.32 mm K2HPO4, 0.01 mm FeSO4, 10 mm
fructose, 10 mm sucrose, 0.03% casamino acid) (Astua-Monge et al., 2005; Wengelnik
et al., 1996) plates (1.5% agar) for 48 hours at 27ºC.
Bacteria were recovered from 20 plates and suspended in 50 mL of sterile distilled
water (SDW). To separate the extracellular structures from the cells, bacterial
suspensions were manually shaken for 5 minutes and centrifuged at 10,000 g and 4ºC
for 20 minutes to precipitate all bacteria from the suspension. In order to completely
remove bacteria and flagella, the supernatant was centrifuged again at 20,000 g and 4ºC
for 20 minutes and finally at 274,000 g and 4ºC for 2 hours to pellet all pili and fimbria
which finally were suspended in 500 µL of phosphate buffer (PBS, 40 mM NaH2PO4
and 25 mM KH2PO4). For further purification the extracellular structures were
precipitated with a 50% (NH4)2SO4 in SDW. All the proteins were recovered after 10
minutes centrifugation at 5,000 g at 4ºC and pellet suspension in 500 µL PBS. In order
to monitor the purification in each step of the protocol, a sample was stained with 1%
phosphotungstic acid for one minute and observed by transmission electron microscopy
(TEM).
Extracellular proteins were separated in 14% polyacrylamide SDS-PAGE gel
[Resolving gel: 12.25 mL of 40% Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1 (Bio-Rad
Laboratories, Hercules, CA, USA), 0.37 M Tris-HCl at 8.8 pH (resolving gel buffer),
Strain Taxon, or disease and CBC type Natural Host Origin
Xcc 306 Xanthomonas citri subsp. citri, CBC a
A Citrus spp. Brazil
Xcc MI Xanthomonas citri subsp. citri, CBC A Citrus spp. Florida
Xcc 12879 Xanthomonas citri subsp. citri, CBC Aw Citrus aurantifolia Florida
Capítulo 7. Caracterización de la matriz extracelular producida durante la formación de biopelículas en
cepas de Xanthomonas citri subsp. citri con distinta gama de huésped
191
0.1% SDS (Sodium Dodecyl Sulphate), 0.4% NaCl, 0.03 % (NH4)2S2O8, and 18 µL
Tetramethylethylenediamine (TEMED) in a final volume of 35 mL (4 gels). Stacking
gel: 1.7 mL 40% Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1, 0.25 M Tris-HCl at 6.8 pH (stacking
gel buffer), 0.1% SDS, 0.03% (NH4)2S2O8 and 45 µL TEMED to a final volume of 15
mL] at 100 V for 3.5 hours. Gels were stained by using a coomassie based staining
solution InstantBlueTM
(Expedeon Ltd., Harston, UK) for 1 hour and washed with
SDW. Before gel separation, the samples were denatured in 25% SDS reducing sample
buffer (0.06 M Tris-HCl, 26% glycerol, 2% SDS, 0.01 bromophenol blue and 5% β-
mercaptoethanol) and boiled for 5 minutes. The selected bands were cut from the gel,
introduced into a 1.5 mL centrifuged tube and sent to the sequencing service of the
Emerging Pathogen Institute (Gainesville FL., USA).
3.3. Evaluation of extracellular structures in Biofilm vs. Planktonic stages
Extracellular structures were analysed in biofilm and planktonic cells after culture onto
50 mL borosilicate flask amended with 25 mL of media. Bacteria in exponential growth
phase after 24 hours post inoculation (hpi) were washed twice with 10 mM MgCl2,
added to the flask to achieve a final concentration of 108 cfu (colony forming units) mL
-
1 and cultured at 27ºC. For biofilms, bacterial cultures were statically grown for 72
hours, at this time culture media were removed and the cells attached to the flask (early
stage of the biofilm on inundated surface) incubated for additional 72 hours at 27ºC in
dried conditions (mature biofilm). To evaluate extracellular structures in planktonic
cells, bacteria were cultured for 72 hours on a rotary shaker (150 rpms) at 27ºC.
Samples from early stage of the biofilm after 72 hours static growth, from mature
biofilm and from planktonic cells collected at stationary growth phase at 24 and 72 hpi
were taken and analysed by microscopy and qPCR as described below.
3.4. Extracellular structures characterization by microscopic approaches
In order to characterized the extracellular structures produced by Xcc strains, bacterial
samples were taking during bacterial growth, biofilm formation and surface motility and
observed by transmission electron microscopy (TEM) and light or fluorescence
microscopy.
Samples taken for TEM were diluted when necessary and 5 µL were deposited onto a
400 mesh copper grid and stained with 1% phosphotungstinc acid or 5% uranyl acetate
Capítulo 7. Caracterización de la matriz extracelular producida durante la formación de biopelículas en
cepas de Xanthomonas citri subsp. citri con distinta gama de huésped
192
for 1 minute. After staining, grids were washed with SDW dried and stored or observed
at the microscope.
Samples from biofilm formation in flasks were deposited onto a slide (60 µL), stained
with Cristal Violet (CV) as described for Xanthomonas (Kraiselburd et al., 2012) and
visualized in a Leica DMRE microscope.
To characterize extracellular structures in biofilms, without breaking the aggregates,
biofilm was induced onto borosilicate glass slides. Briefly, bacterial cultures in
logarithmic growth phase were washed and diluted at a concentration of 108 cfu mL
-1,
100 µL of this bacterial suspension were seeded on a glass slide and incubated for 72
hours at 27ºC into a petri dish. After 72 hours the medium was carefully removed and
the aggregate stained with CV as described above.
In order to determine the presence of DNA (eDNA) in the extracellular matrix of Xcc
formed during surface motility, samples obtained from the advancing edge of the
bacterial colony were deposited onto glass slides and stained with SYTO-9 from
Live/Dead Bacterial viability kit (Molecular Probes Europe BV; Leiden, The
Netherlands) for 20 minutes and dark and observed in fluorescence Leica DMRE
microscope.
3.5. Surface motility
Surface bacterial motility was analysed on PYM medium plates (0.5% peptone, 0.3%
yeast and 0.3% malt extract) amended with 2% of glucose and agar at 0.7%. Bacteria
cultured in LB at logarithmic phase were washed twice with 10mM MgCl2, suspended
in 1 mL of MgCl2 and centrifuged to pellet all bacteria. Bacterial pellets were inoculated
in the centre of a petri dish with a toothpick and incubated at 27ºC for four days. The
diameter of the colony was measured at 24 and 96 hpi and the colony growth from three
plates and at least three assays was compared among the Xanthomonas studied. Means
were compared by analysis of variance (ANOVA) and separated by Student-Newman-
Keuls (SNK) multiple range test using Statgraphics Plus for Windows 4.1 (Statistical
Graphics, Rockville, MD).
Samples for RNA purification for strains Xcc 12879 and Xcc 306 were taken at 96 hpi
from the colonized area in the plate centre, and in the advancing edge. TEM samples
Capítulo 7. Caracterización de la matriz extracelular producida durante la formación de biopelículas en
cepas de Xanthomonas citri subsp. citri con distinta gama de huésped
193
were taken for strains Xcc MI and Xcc 12879 at 96 hpi from the colonized area close to
the advancing edge.
3.6. RNA purification
Gene transcription analysis was performed on different biofilm formation stages, on
planktonic cells, in both LB and XVM2 media, and during surface motility, in order to
compare the bacterial behaviour of strains Xcc 306 and Xcc 12879 Aw.
RNA sample preparation was performed using TRIzol® Reagent following
manufacturer’s instructions (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA). Bacterial samples
from static or shaking liquid cultures were centrifuged at 5,000 g for 5 minutes and 4ºC,
then the bacterial pellet was suspended in 1 mL TriZol Reagent. To purify RNA from
mature biofilms, bacteria adhered to the flask were suspended in 1 mL of TRIzol
reagent. To recover RNA from the surface motility colony samples from the colonized
area and the advancing edge were recovered by using a loop and suspended in 1 mL of
TriZol.
Bacterial suspensions in TriZol were incubated at room temperature (RT) for 5 minutes.
After incubation 0.2 mL of chloroform were added to each tube and manually shaken,
then incubated at RT for 3 minutes and centrifuged at 12,000 g for 15 minutes and 4ºC.
The upper aqueous phase was recovered and 0.5 mL of isopropyl alcohol was added.
After an incubation of 10 minutes at RT, tubes were centrifuged at 12,000 g for 10
minutes at 4ºC. The pellet obtained was washed with 1 mL of 75% ethanol and
centrifuged at 7,500 g for 5 minutes at 4ºC. Finally, pellets were dried and suspended in
40 µL of Diethylpyrocarbonate treated water (DEPC).
After RNA purification, samples were treated with Turbo DNA-freeTM
(Ambion,
Austin, TX, USA) following manufacture’s instruction in order to remove any residue
of DNA from the sample. Total RNA concentrations were measured using NanoDrop
2000 spectrophotometer (Thermo Fisher Scientific Inc., Wilmington, DE, USA).
3.7. Primers and probes design and qPCR conditions
Primers and TaqMan probes, shown in table 2, were designed using Primer Express
software (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA).
RNA samples were lead to a concentration of 0.02 µg µL-1
and reverse transcribed into
cDNA by using PrimeScriptTM
RT reagent kit from Takara Bio Inc. (Otsu, Shiga,
Capítulo 7. Caracterización de la matriz extracelular producida durante la formación de biopelículas en
cepas de Xanthomonas citri subsp. citri con distinta gama de huésped
194
Japan), 12 µL of 5x PrimeScript Buffer, 3 µL of enzyme mix, 2.5 µM Oligo dT Primer
and 20 µM of random hexamers in a final volume of 60 µL. Reverse transcription was
performed at 37ºC for 15 minutes and the enzyme inactivation step of 85ºC for 5
seconds.
Table 2. Primers and probes used for qRT-PCR designed for this study1
1Primers and probes were designed based on the sequence of Xanthomonas citri subsp. citri strain 306.
2rpfB and rpfF genes codify for the enzymes related with the production of Diffusible Signal factors
(DSF) the quorum sensing molecule in the genus Xanthomonas (da Silva et al., 2002; Dow et al., 2003);
fimA 3241 codified for the major subunit of type IV pili (da Silva et al., 2002; Dunger et al., 2014); fimA
3240 codified for the major subunit of type IV pili (da Silva et al., 2002); pilA gene was previously
described to be the major subunit of type IV pili (da Silva et al., 2002); fleN is along with flhF a positive
regulator of FleQ and RpoN2 in Xc (Yang et al., 2009); fliC codifies for flagellin and in Xcc is required
for swimming motility and biofilm formation, but is not for surface translocation (Malamud et al., 2011);
motA codified along with motB for the flagellar motor (da Silva et al., 2002)
Quantitative Real Time PCR was used to analyze gene expression. For fimA 3240, fimA
3241, pilA, fleN, fliC and motA, qPCR reactions were assembled in a 20 µl volume
containing 10 µL of 2x GoTaq Probe qPCR Master Mix (Promega, Madison, WI, USA),
0.8 mM of each forward and reverse primers and 0.4 mM of TaqMan probe. rpfB and
rpfF genes amplification was performed by using FastStart Universal SYBR Green
Master (Rox) (Roche Applied Science, Mannhein, Germany), reaction mixture in 20 µl
volume containing 10 µL of reaction mix and 0.2 mM of both forward and reverse
primers. For ribosomal 16S RNA qPCR reactions were assembled in a 20 µl volume
containing 10 µL of 2x GoTaq Probe qPCR Master Mix, 0.2 mM of both forward and
Gene2 Forward Reverse Taq-man Probe (Fam-Tamra)
Rib16S GGGACAGAGGGCTGCAAA ATCCGGACTGAGATAGGGTTTCT CCGCGAGGGCAAGCCAATCC
rpfF GCCAGCAAAAGCGCATTT GAACCGACTGCGCCAGATT -
rpfB CCAACCTGACCGCCTACAA TTGGTTTTCGGCAACTCCTT -
fimA 3241 TGCCAAGTCGCAGGTCACT CAAAAGAGTTTCGTATTGCGTTTTAC CTGGCCGAGCTGAGCCCG
fimA 3240 CCGGCTTGGCCGAAGT TCGCTGTCATTGACCAAAATCT AGCCCCGGGAAGACGCGCTAC
pilA CGAGTTGGCGGCATTGA GGCCTTCACTGGCCAGAA CCGCAGATCACCGA
fleN GCGCGCTGCCGATAAG ATTCACGCGACTGCATGGT CCTGTACTCCGGAGCAC
fliC GCGCTGAACTCGGAAGTCA CGAACCGTCCAGCAGCTT CCTCTGAAATCGACCGCGTTG
motA GGCTACAACCCGAAGATTGC AGCTCGGACGCACATTGG AATTCGCGCGCAAGACCCTGC
Capítulo 7. Caracterización de la matriz extracelular producida durante la formación de biopelículas en
cepas de Xanthomonas citri subsp. citri con distinta gama de huésped
195
reverse primers and 0.4 mM of TaqMan probe. 2 µL of the retrotranscribed cDNA were
added to the reaction for each of the genes analyzed. For 16S rRNA samples, the cDNA
obtained was diluted 1:1000 before been added to the qPCR reaction.
qPCR reactions were performed in a 7500 Fast RealTime PCR System (Applied
Biosystems) using the Standard 7500 run mode consisting of 40 cycles of 95ºC for 15
seconds and 60ºC for 1 minute after an initial denaturation DNA and Taq Polymerase
activation step of 95ºC for 10 minutes. For SYBR Green reactions, melting curve
analysis was performed at the end of the amplification cycles to verify the presence of a
unique PCR product.
Data analysis was performed following the 2-ΔΔC
T method (Livak and Schmittgen,
2001). Expression levels were normalized to the control gen for ribosomal 16S RNA.
The means of the relative expression of each gene for each strain in the different
conditions tested were compared by analysis of variance (ANOVA) and separated by
Student-Newman-Keuls method. All statistical analyses were performed using
STATGRAPHICS Plus, version 5.1 (Copyright Manugistics Inc.).
4. Results
4.1. Visualization of extracellular structures produced by Xanthomonas citri subsp.
citri
TEM was performed in order to observe the presence of extracellular structures of citrus
pathogenic Xanthomonas under several conditions which include growth onto agar
plates, surface motility and biofilm formation.
Plate growth 4.1.1.
Xcc grown on petri dishes for 48 hours showed different extracellular structures
depending on the media. While on LB medium strain Xcc MI produced lots of thin
intertwined fibrils which became thick fibres when coiled (Fig. 1A), XVM2 medium
promotes the production of semi-rigid filaments which mislead to flagella, however
those filaments were made of fibres as ropes (Fig. 1B). Xcc 12879 in LB medium
produced flagella and very few fibrils (Fig. 1C), whereas in XVM2 medium (Fig. 1D)
fibres similar to those produced by Xcc MI strain were shown.
Capítulo 7. Caracterización de la matriz extracelular producida durante la formación de biopelículas en
cepas de Xanthomonas citri subsp. citri con distinta gama de huésped
196
Figure 2. Transmission electron microscopy of bacterial cultures incubated for 48 hours
on LB (A & C) or XVM2 (B & D) agar plates of Xcc MI (A & B) and Xcc 12879 (C &
D), stained with phosphotungstic acid. A, B & D images showed lots of extracellular
fibers surrounding the cells which seemed to be built from thin intertwined fibrils. Image
C showed narrow host range strain in LB medium and the presence of flagella and just a
few other extracellular structures.
Early stages of biofilm formation 4.1.2.
After 72 hours of static growth, cells deposited at the bottom of the flask showed several
extracellular structures (Fig. 2) which were more difficult to be observed in XVM2
medium for both strains due to the high density of the extracellular matrix (Figs. 2B &
D). However, in LB media variation regarding the strain was observed; while Xcc 306
strain produced lots of extracellular fibres which connect the aggregates (Fig. 2A), the
narrow host range strain Xcc 12879 showed less aggregation and less connections
among cells (Fig. 2C).
Capítulo 7. Caracterización de la matriz extracelular producida durante la formación de biopelículas en
cepas de Xanthomonas citri subsp. citri con distinta gama de huésped
197
Figure 2. Xcc strains with different host range at the early stages of biofilm formation (72
hours of static growth) in LB (A & C) or XVM2 (B & D) media. Wide host range strain
Xcc 306 is shown in images A & C and the limited host range strain Xcc 12879 in C & D.
Several extracellular structures were observed for both strains and media, however the
high density of the matrix observed in XVM2 medium (B & D), possibly produced by
high extracellular polysaccharide production impedes the visualization of filaments
interconnecting cells in the aggregates. In LB medium it is possible to observe for strain
Xcc 306 several extracellular filaments produced by bacteria connecting bacterial
aggregates. Strain Xcc 12879 (narrow host range) did not produce as much extracellular
structures and cell connections seemed to be produced by a single or few filaments (C).
Surface motility 4.1.3.
At 96 hpi on the colonized area close to the advancing edge, both strains were longer
(Figs. 2A & B) than those observed on plate growth (Fig. 1) and showed the presence of
one polar flagellum. Strain Xcc MI showed several pili like structures at the opposite
flagellar cell pole (Fig. 3A) which could be related with type IV pilus. The narrow host
range strain Xcc 12879 did not show any other extracellular structure but flagellum (Fig.
3B). SYTO-9 staining showed the presence of eDNA in the advancing edge of the
colony for both strains (Figs. 3C & D), as was described previously for biofilm
formation and twitching motility (Sena-Vélez et al., submitted).
Capítulo 7. Caracterización de la matriz extracelular producida durante la formación de biopelículas en
cepas de Xanthomonas citri subsp. citri con distinta gama de huésped
198
Figure 3. Microscopy of Xcc strains with different host range during surface motility on
PYM plates at 0.7% agar. A & B, transmission electron microscopy of Xcc MI and Xcc
12879 strains respectively. The presence of polar flagella have been observed on both
strains, however type IV pili like structures were solely observed for Xcc MI at the
opposite pole from the flagella (A). C & D, fluorescence microscopy of cells stained with
SYTO-9 DNA stain of Xcc 306 and Xcc 12879 strains respectively. The filaments
observed in images showed high extracellular DNA content, as reported previously for
Xcc (Sena-Vélez et al. submitted).
4.2. Extracellular protein purification and characterization
Extracellular protein purification was performed in order to determine variation among
strains in the extracellular protein profile and to identify and characterize them.
Extracellular protein extracts of strains Xcc MI and Xcc 12879 were compared in both
LB and XVM2 media. The same protein profile was observed for both strains and
media (Fig. 4A); however the amount of protein was higher in LB than XVM2 medium,
possibly due to the higher bacterial growth in this media. Several bands were observed
and identified in the SDS-PAGE protein gels. The slight bands probably corresponded
with soluble proteins, proteins bands around 60 kDa corresponded with leftover
flagellin after the purification. The band around 20 kDa was sequenced and
corresponded with a hypothetical protein, locus tag was XAC 0223, which is present in
Capítulo 7. Caracterización de la matriz extracelular producida durante la formación de biopelículas en
cepas de Xanthomonas citri subsp. citri con distinta gama de huésped
199
the Xcc strains sequenced. BLAST-P analysis revealed an identity of 93% and a query
coverage of 89% (E-value=7e-118
) with the Xanthomonas oryzae pv. oryzicola BLS256
activator of XA21-mediated immunity Ax21 (Locus Tag XOC 0319) (Lee et al., 2009).
Figure 4. Extracellular proteins of Xcc strains. A; 14% Acrylamide SDS-PAGE gel, lanes 1st & 2
nd
corresponded with molecular weight markers, the 3rd
and 4th
lanes show the extracellular protein profile
of Xcc MI and Xcc 12879 in LB medium which showed a similar protein profile. The highlighted band
(around 20 kDa) corresponded with XAC0223 protein from Xcc 306. The XAC 3241 protein is not
showed in the gel because it could not be denaturalized after the treatment performed and was found in
the gel well; B & C, show the extracellular proteins after ammonium sulphate precipitation of MI and Xcc
12879 strains in LB medium, which mainly precipitate pili.
This protein showed a signal peptide identified by using Signal-P program which is in
agreement with its extracellular location, furthermore this protein was possibly related
with quorum sensing in Xanthomonas (Han et al., 2011; Han et al., 2013). A band
which did not run into the gel was also selected and sequenced because some
extracellular proteins required further treatment to be denaturalized; interestingly that
band was identified as the major subunit of the type IV pilus (XAC 3241). This protein
has four cysteine residues which can produce disulphide bond which requires urea
treatment to denaturalize the protein.
4.3. Microscopy of Xanthomonas citri subsp. citri; biofilm formation and
planktonic growth
Microscopic studies were performed in order to visualize the extracellular structures
produced by Xcc strains during biofilm formation and planktonic growth. Furthermore,
extracellular structures were compared between the strains studied and the media
assayed. Bacteria were collected from both LB and XVM2 broth from planktonic
cultures after 72 hours shaking growth, bacteria deposited onto the flask bottom after 72
Capítulo 7. Caracterización de la matriz extracelular producida durante la formación de biopelículas en
cepas de Xanthomonas citri subsp. citri con distinta gama de huésped
200
hours of static growth (early stages of biofilm formation) and from mature biofilms. In
addition biofilm was also performed on microscope glass slides. Images of both strains
in LB medium are shown in Fig. 4 and in XVM2 medium in Fig. 5.
Figure 5. Optical microscope images of biofilm formation and planktonic cells in LB media
stained with CV (1000x). A, C & E: strain Xcc 306; B, D & F: strain Xcc 12879 Aw. Figures A &
B shows bacteria after 72 hour of incubation at 180 rpm, planktonic cells in which few
extracellular structures were observed. C & D, bacteria deposited at the flask`s bottom after 72
hours of static culture, semirigid filaments were observed which were longer for Xcc 12879
strain (D) and more connected for Xcc 306 strain (C). These bacteria are starting the biofilm
formation. E & F, mature biofilm, while Xcc 306 strain showed lots of thick fibres (E), Xcc
12879 showed thinner and longer fibres than Xcc 306 (F).
Capítulo 7. Caracterización de la matriz extracelular producida durante la formación de biopelículas en
cepas de Xanthomonas citri subsp. citri con distinta gama de huésped
201
Figure 6. Optical microscope images of biofilm formation and planktonic cells in XVM2 media
stained with CV (1000x). A, C & E: strain Xcc 306; B, D & F: strain Xcc 12879 Aw. Figures A &
B shows bacteria after 72 hour of incubation at 180 rpm, planktonic cells, no aggregation was
observed however some fibrils seemed to connect cells. C & D, bacteria deposited at the flask`s
bottom after 72 hours of static culture showed aggregation and fibres connecting the aggregates.
E& F, mature biofilm, higher aggregates were formed by Xcc 12879 strain (F).
Bacteria incubated for 72 hours and shaking (Figs. 5A & B, 6A & B) showed little
aggregation on both media, however some interconnecting fibres were observed
between cells. The presence of extracellular structures was higher in LB than XVM2
media. After 72 hours of static growth (Figs. 5C & D, 6C & D), the cells deposited onto
the flask showed higher bacterial aggregation compared with shaking growth (Figs. 5A
& B, 6A & B) as well as the presence of numerous fibres of variable thickness. In LB
medium lots of stiff fibres were observed for both strains, however in this medium
Capítulo 7. Caracterización de la matriz extracelular producida durante la formación de biopelículas en
cepas de Xanthomonas citri subsp. citri con distinta gama de huésped
202
strain Xcc 306 (Fig. 5C) showed great fibre density and more complex than strain Xcc
12879 (Fig. 5D). XVM2 medium did not show the long and stiff fibres observed in LB
media, however higher bacterial aggregates were observed being more complex than LB
(Figs. 6C & D). Structures observed in biofilms (Figs. 5E & F, 6E & F) were similar to
those observed after 72 hours of static growth but showing further aggregation and
structure thickness. In LB medium clear differences were observed among strains, while
Xcc 306 showed lots of thick fibres (Fig. 5E), the fibres in Xcc 12879 were less
interconnecting and thick (Fig. 5F). XVM2 medium aggregates were more complex
than those in LB, showing higher bacterial aggregation (Figs. 6E & F). Structures which
stabilize the biofilm were possibly hidden by the high cell density.
Biofilms formed on glass slides (Fig. 7) showed similar results as above, but on those it
was easier to observe the structure without disrupting the biofilm. Bacterial aggregates
were observed for all strains and media; however aggregation seemed to be higher in
Xcc 306 as compared to Xcc 12879 strain. Furthermore, aggregates in XVM2 medium
were higher and more consistent than those observed in LB, although the area covered
in LB was wider. In LB medium, at the edge of the biofilm, several structures similar to
those observed in twitching motility (Sena-Vélez et al., submitted) were observed as
long filaments with bacteria associated to them (Fig. 7A.2). Besides, flagella were
observed as well in cells close to the aggregates (Fig. 7A.3). In XVM2 media strain Xcc
306 showed a net interconnecting the aggregates made of thin fibres (Figs. 7B.2 & B.3).
Strain Xcc 12879 in XVM2 medium also produce a lattice net made of fibres which in
some cases become a wide thin layer onto the glass surface (Figs. 7D.1 & D.2).
The microscopic observations of Xcc strains at different stages of biofilm formation and
media revealed that the aggregation and biofilm response is more similar between
strains in XVM2 medium than in LB.
Capítulo 7. Caracterización de la matriz extracelular producida durante la formación de biopelículas en
cepas de Xanthomonas citri subsp. citri con distinta gama de huésped
203
Figure 7. Optical microscopy images of 72 hours post inoculation biofilms stained with crystal violet
flagellar stain described by Kraiselburd in 2012. Three images are shown for each strain a medium used
in order to demonstrate the different extracellular structures produced by the bacteria and the variable
aggregation. Row A, Xcc 306 biofilm in LB medium; row B, Xcc 306 in XVM2 medium; row C, Xcc
12879 in LB medium & row D, Xcc 12879 in XVM2 medium.
4.4. Gene transcription during biofilm formation
The gene transcription levels for quorum sensing, flagellar and fimbrial genes during
biofilm formation have been evaluated in CBC strains with different host range in order
to compare their variable response in LB or XVM2 media. Differences were observed
among both strains for some of the genes studied mainly in those related with fimbrial
Capítulo 7. Caracterización de la matriz extracelular producida durante la formación de biopelículas en
cepas de Xanthomonas citri subsp. citri con distinta gama de huésped
204
structures. Moreover, variation between LB and XVM2 media in the different biofilm
formation stages has been observed.
quorum sensing gene transcription analysis is shown in Fig. 8. For rpfB (Fig 8A) and
XVM2 medium, both strains, Xcc 306 and Xcc 12879 showed a similar transcription
pattern with relative stable transcription levels during planktonic growth and at the early
stages of biofilm formation. The levels of transcription of those genes in both strains
increased on mature biofilm. However the transcription levels on Xcc 306 were several
times higher than in Xcc 12879.
Figure 8. Transcription levels of quorum sensing genes rpfB (A) and rpfF
(B). Dark grey bars show the mRNA relative levels for the wide host range
strain Xcc 306 and light grey bars the narrow host range CBC strain Xcc
12879. Bar labels marked with different letters represents a significantly
different means according to Student Newman-Keuls multiple range test (P <
0.05) for each medium and strain analyzed separately, lower case letters
refers to XVM2 medium, and capital letters refers to LB medium. Bold
letters refers to Xcc 12879 strain. Graphs are a representative assay of five
assays.
In LB medium the transcription pattern varied among strains. Planktonic cells of Xcc
306 showed a stable profile during planktonic growth, however in Xcc 12879 an
Capítulo 7. Caracterización de la matriz extracelular producida durante la formación de biopelículas en
cepas de Xanthomonas citri subsp. citri con distinta gama de huésped
205
increase on transcription from those genes under bacterial growth was shown. After 72
hour of static growth the transcription levels observed were the lowest for both strains,
being higher in Xcc 306 as compared to Xcc 12879. The mRNA relative levels increased
on mature biofilm for both strains. The transcription level of rpfF gene is shown on Fig.
8B. In XVM2 and for Xcc 306 strain the transcription level was quite stable in the
samples analysed but the highest transcription was found after 24 hour of shaking
culture and the lower at the early stages of biofilm formation. However in Xcc 12879
strain a higher transcription in mature biofilms was shown as compared to the other
samples analysed. In LB medium, Xcc 306 and Xcc 12879 showed an increase of rpfF
gene transcription during planktonic growth being the lowest level observed at the early
stages of biofilm formation and the highest in mature biofilms or after 72 hours of
shaking or planktonic culture.
Transcription of flagellum related genes fliC, fleN and motA are shown in Fig. 9. The
transcription pattern for fliC (Fig. 9A) in XVM2 was similar for both strains; the
transcription level of this gene was similar for planktonic or static growth after 72
hours, being higher for Xcc 12879 than Xcc 306. The transcription for both strains
increased in biofilms. In LB medium, during planktonic growth, the mRNA levels of
fliC decreased in stationary growth phase for Xcc 306 but increased in Xcc 12879 strain.
At the early stages of biofilm formation the transcription level of fliC was the lowest for
both strains, however in Xcc 306 was higher than in Xcc 12879. In mature biofilms the
transcription of fliC increased at similar level for both strains. The transcription pattern
of fleN gene (Fig. 9B) for both strains and media was similar to fliC gene, uniquely in
XVM2 medium, planktonic growth, and early stages of biofilm formation, the
transcription was higher for Xcc 306 than for Xcc 12879. motA gene transcription in
XVM2 for strain Xcc 306 was similar for all the samples, the highest transcription was
observed at 24 hours of planktonic growth and the lowest in mature biofilms. Strain Xcc
12879 motA transcription was the same after 72 hours both static and shaking culture
growth, and higher after 24 hours or in mature biofilm stage, this last stage showed the
highest transcription level for motA gene. In LB medium the transcription pattern was
similar to those observed for fliC and fleN genes.
Capítulo 7. Caracterización de la matriz extracelular producida durante la formación de biopelículas en
cepas de Xanthomonas citri subsp. citri con distinta gama de huésped
206
Figure 9. Transcription levels of genes related with flagella formation and
structure fliC (A), fleN (B) and motA (C). Dark grey bars show the mRNA
relative levels for the wide host range strain Xcc 306 and light grey bars the
narrow host range CBC strain Xcc 12879. Bar labels marked with different
letters represents a significantly different means according to Student
Newman-Keuls multiple range test (P < 0.05) for each medium and strain
analyzed separately, lower case letters refers to XVM2 medium, and capital
letters refers to LB medium. Bold letters refers to Xcc 12879 strain. Graphs
are a representative assay of five assays.
Fimbrial genes fimA 3241, fimA 3240 and pilA transcriptions are shown in Fig. 10. fimA
3241 gene (Fig. 10A) showed higher transcription level in XVM2 than LB medium for
both strains in any of the samples, being similar for those media on mature biofilm. In
XVM2 medium the pattern was similar for both strains, the highest level was observed
after 24 hour of shaking growth and at early stages of the biofilm formation. The
Capítulo 7. Caracterización de la matriz extracelular producida durante la formación de biopelículas en
cepas de Xanthomonas citri subsp. citri con distinta gama de huésped
207
transcription level decreased after 72 hours shaking growth, being higher for Xcc 12879
than for Xcc 306 strain. The lowest level was observed on mature biofilm.
Figure 10. Relative transcription levels of fimbrial related proteins fimA 3241
(A), fimA 3240 (B) and pilA (C). Dark grey bars show the mRNA relative
levels for the wide host range strain Xcc 306 and light grey bars the narrow
host range CBC strain Xcc 12879. Bar labels marked with different letters
represents a significantly different means according to Student Newman-
Keuls multiple range test (P < 0.05) for each medium and strain analyzed
separately, lower case letters refers to XVM2 medium, and capital letters
refers to LB medium. Bold letters refers to Xcc 12879 strain. Graphs are a
representative assay of five assays.
In LB medium and strain Xcc 306 clear differences were observed between planktonic
vs. sessile growth, higher transcription level was observed at early stages of biofilm
formation and mature biofilm as compared to planktonic growth. However, the strain
Capítulo 7. Caracterización de la matriz extracelular producida durante la formación de biopelículas en
cepas de Xanthomonas citri subsp. citri con distinta gama de huésped
208
Xcc 12879 showed in LB and planktonic growth an increased transcription of fimA 3241
along the time and lower transcription at the early stages of biofilm formation than in
mature biofilm. In XVM2 and for the second gene codifying for the major type IV pili
subunit, fimA 3240 (Fig. 10B), the transcription was similar for both strains during
planktonic growth, being higher after 24 hours as compared to 72 hours of culture
shaking. Xcc 306 showed higher transcription at the early stages of biofilm than in the
mature biofilm and the opposite for Xcc 12879 where the transcription was higher in
mature biofilm as compared to the early stage of the biofilm formation. Furthermore in
biofilms the transcription was higher in Xcc 12879 than in Xcc 306. No big differences
were observed for this gene in LB medium for strain Xcc 306 during planktonic growth,
however for strain Xcc 12879 the transcription clearly increased in stationary growth
phase. Both strains showed less transcription at the early stages of biofilm formation
compared to the mature biofilm. pilA gene (Fig. 10C) in XVM2 medium was more
transcribed in biofilms than during planktonic growth and on mature biofilms as
compared to early stages in its formation. In LB medium strain Xcc 306 showed the
highest transcription at the 24 hours of planktonic growth and decreased at 72 hours
showing the same level than in mature biofilm. Strain Xcc 12879 transcription level, in
LB, increased during planktonic growth, as happened for strain Xcc 306 the lowest
transcription level was shown at the early stages of biofilm formation, increasing in
mature biofilms.
4.5. Surface motility in Xanthomonas strains
Xanthomonas motility onto a surface was performed in 0.7% agar PYM plates
supplemented with glucose at 2%. As shown in Fig. 11 differences were shown among
strains, Xcc 12879 was able to cover more area of the plate than Xcc 306 and both
strains showed a circular colony pattern.
In order to further characterized this type of motility the transcription levels of type IV
pili major subunit fimA 3241 and fimA 3240, flagellin fliC and fimbrial protein pilA
were compared between both strains. For such purpose, samples were taken from the
colonized area and in the advancing edge of the colony.
Capítulo 7. Caracterización de la matriz extracelular producida durante la formación de biopelículas en
cepas de Xanthomonas citri subsp. citri con distinta gama de huésped
209
Figure 11. Surface motility plates of Xanthomonas strains with different host
range on PYM medium and 0.7% of agar. The graphic shows the colony growth
among the 24 and 96 hours post inoculation. Letter represents a significantly
different means according to Student Newman-Keuls multiple range test (P <
0.05) from three assays with three replicates per assay. Plates represent the
motility colony after 96 hours post inoculation for the wide host range CBC
strain Xcc 306 and the narrow host range strain Xcc 12879.
Variable behaviour was observed among the Xcc strains which possibly explain the
different colonized area during surface motility (Fig. 12). Type IV pilus major subunit
fimA 3241 showed for Xcc 306 strain higher transcription level in the advancing edge
than in the colonized area, however de transcription was the opposite for strain Xcc
12879. fimA 3240 showed higher transcription in the colonized area than the advancing
edge for both strains, and same transcription pattern was shown for pilA gene. The
transcription of flagellin gene (fliC) was higher in the colonized area for Xcc 306 strain
meanwhile Xcc 12879 strain showed higher transcription in the advancing edge. For
fimA 3241, fimA 3240 and fliC genes, the transcription shown in the colonized area and
the advancing edge in Xcc 306 was always higher than in Xcc 12879 levels. Finally,
transcription level of pilA gene was more similar for both strains in the advancing edge
and higher in the colonized area for Xcc 306 as compared to Xcc 12879 (Fig. 12).
Capítulo 7. Caracterización de la matriz extracelular producida durante la formación de biopelículas en
cepas de Xanthomonas citri subsp. citri con distinta gama de huésped
210
Figure 12: Transcription levels of genes related with extracellular appendages
(fimA 3241, fimA 3240, pilA & fliC) produced by Xcc strains with different host
range 306 and Xcc 12879 during motility onto a surface. Dark grey bars show the
mRNA relative levels for the wide host range strain 306 and light grey bars the
narrow host range CBC strain Xcc 12879. Bar labels marked with different
letters represents a significantly different means according to Student Newman-
Keuls multiple range test (P < 0.05) for each strain and gene analyzed
separately. Capital letter refers to Xcc 306, and lower case letters to Xcc 12879.
5. Discussion
Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc) is able to produce biofilm on both biotic and
abiotic surfaces and the aggregation process is dependent of the medium and the host
(Malamud et al., 2011; Rigano et al., 2007; Sena-Vélez et al., 2014; Sendín et al., 2012).
Furthermore this structure is important for bacterial surface survival (Cubero et al.,
2011) and disease development (Rigano et al., 2007). Xcc is also able to perform
swimming and twitching motilities and a surface motility which have been described as
swarming or sliding (Dunger et al., 2014; Malamud et al., 2011). Fimbrial and flagellar
genes have been described in several bacteria including Xcc as important at the early
stages of biofilm formation, and have been related with the surface adhesion
phenomena, as well as the establishment of a mature biofilm (Dunger et al., 2014;
Karatan and Watnick, 2009; Malamud et al., 2011; Petrova and Sauer, 2012).
Previous studies described different biofilm formation in vitro for several strains of Xcc,
furthermore electron microscopy studies of biofilms in planta showed clear differences
Capítulo 7. Caracterización de la matriz extracelular producida durante la formación de biopelículas en
cepas de Xanthomonas citri subsp. citri con distinta gama de huésped
211
in the aggregate structures between wide and narrow host range CBC strains (Sena-
Vélez et al., 2014). Herein, no variation has been observed in the extracellular protein
profile of those strains, although distinct extracellular structures were observed
according to the media and the strains analyzed in the microscopy assays. Therefore
variation in extracellular proteins could be possibly attributed to a differential
expression of the genes involved in this process. The main extracellular proteins
purified and identified from the bacterial cultures associated to filaments corresponded
to FimA 3241, the major subunit of the type IV pilus whose importance in biofilm
formation was previously reported (Dunger et al. 2014). Another identified protein was
XAC 0223, a hypothetical secreted protein that possess a domain corresponded the
activator of AX21 dependent immunity in X. oryzae pv. oryzicola and has been
described in Xanthomonas genus as PAMP (Pathogen associated molecular pattern).
This protein is conserved among the Xanthomonas genus and other related genera like
Xylella or Stenotrophomonas (Lee et al., 2009; Ronald, 2011). Transgenic lines of
several Citrus sinensis cultivars expressing the rice resistance gene Xa21 showed
greater resistance than the non-transgenic lines (Mendes et al., 2010). AX21 protein has
been described as well as a quorum sensing factor, which regulates de expression of
several genes related with different bacterial process which included biofilm and
virulence (Han et al., 2011; Han et al., 2013). Further studies are required in order to
characterize this protein and its role in CBC disease.
Wide host range strain produced several intertwined, semirigid and coiled fibres when
grow in either high nutrient content medium such LB medium, or low nutrient content
apoplast mimic XVM2 medium. However in narrow host range strain those thick fibres
were observed exclusively in XVM2 medium. Similar observations have been
completed during biofilm formation and stationary growth phase. In LB medium narrow
host range strain showed fewer filamentous structures than wide host range strain which
showed a huge production of thick and rigid fibers stabilizing the aggregates. Although
narrow host range strains showed higher fiber production during biofilm formation it
was not as profuse as in wide host range strains. This reduction of extracellular fibers
would mean less adhesion to surfaces and less expansion of the biofilm (Li and Wang,
2011b), which would be in concordance with our previous results (Sena-Vélez et al.,
2014). In XVM2 medium robust aggregates were shown, those aggregates showed a
three-dimensional structure which made them difficult to be observed under the
Capítulo 7. Caracterización de la matriz extracelular producida durante la formación de biopelículas en
cepas de Xanthomonas citri subsp. citri con distinta gama de huésped
212
microscope. TEM studies, at the early stages of biofilm, showed in XVM2 medium high
extracellular matrix production surrounding the cells for both strains. On a glass slide
further filamentous structures were observed in XVM2 compared to LB media, mostly
in narrow host range strain whose fibers intertwined to produce a lattice net similar to a
sheet. Biofilms on glass slide for wide host range strain showed in LB medium
structures similar to those described for twitching motility (Dunger et al., 2014), and
also showed flagella on both media. Structures similar to flagella were not been
observed at the beginning of biofilm formation in LB medium for narrow host range
strain. These results correlate with the relative mRNA levels at the early stages of
biofilm formation in LB medium; wide host range strain showed higher fimA 3241,
fimA 3240 and fliC transcription than limited host range strain where no twitching-like
structures were observed. Type IV pili and flagella have been described in Xcc as
important for bacterial attachment to surface as well as biofilm formation (Dunger et al.,
2014; Li and Wang, 2011b; Malamud et al., 2011). The higher transcription levels
observed in strain Xcc 306 compared to Xcc 12879 for fimA 3241, fimA 3240 and fliC
and the varied extracellular structures observed could explain the differential biofilm
formation in LB medium for those strains. However in XVM2 medium transcription
levels of fimA 3241 and fimA 3240 were similar for both strains. It would be possible
that higher flagellin expression together with other extracellular components like pili or
eDNA would lead to the sheet-like structures observed in XVM2 medium for Xcc
12879.
Quorum sensing genes rpfB and rpfF codify for enzymes which build DSF (Diffusible
Signal Factors) producing proteins, rpfB codifies for a long-chain enoyl-CoA ligase
which produced DSF precursor and rpfF which codifies for an enoyl-CoA hydratase
finally produced the DSF. At low bacterial concentration RpfF protein was bind to DSF
receptor RpfC and DSF was slightly produced by the cell mainly by the action of RpfB
protein. At high bacterial and DSF concentration RpfF unbind RpfC and increase the
cell DSF production (Andrade et al., 2006; Dow et al., 2003). In Xcc the quorum
sensing signal lead to C-di-GMP and favors biofilm formation and other processes such
as flagellar motility, chemotaxis and exopolysaccharide production (Andrade et al.,
2006; Guo et al., 2012; Li and Wang, 2011b). Herein, we have shown that the relative
transcription levels of both rpf genes vary according to culture media; transcription of
rpfF (Fig. 8B) during bacterial planktonic growth increased in time in LB due to the
Capítulo 7. Caracterización de la matriz extracelular producida durante la formación de biopelículas en
cepas de Xanthomonas citri subsp. citri con distinta gama de huésped
213
increase of bacterial population, however under static conditions, a very low
transcription in LB was observed possibly because of the bacterial density onto the
flask. In XVM2 media less bacterial growth was observed and slight differences
between planktonic growth times and static growth were shown. Similar response was
observed for rpfB gene, however for this gene variation in transcription was observed
between strains. The transcription of rpfF gene is positively regulated in XVM2 by the
two component regulation system BfdS/BdfR which also regulates biofilm formation
and virulence (Huang et al., 2013). Although both rpfB and rpfF are important for DSF
production they seemed to be transcribed in a different manner. It is possible that rpfB
transcription was dependent of other regulators which responded to specific
environmental signals which can also vary among wide and narrow host range CBC
strains.
Transcription profiles of flagellar genes during biofilm formation for both types of
strains in LB and XVM2 media were in agreement to the results described previously
for strain Xcc 306 (Guo et al., 2012; Malamud et al., 2011). Flagellar genes transcription
pattern was similar to that of rpfB and rpfF genes. In apoplast mimic medium which is
XVM2, type IV pili or fimbria were described as independent of rpf regulon for wide
host range strain (Guo et al., 2012), and so occurred in our studies for both strains
assayed. Similar transcription pattern to rpf genes have been observed in LB medium
for fimA 3240 gene for both strains and for strain Xcc 12879 for fimA 3241 and pilA
genes in LB medium, however the transcription of the last gene seemed to be different
for strain Xcc 306. Therefore in high nutrient content medium other regulation systems
may influence the transcription of those genes and improved biofilm formation for
strain Xcc 306.
Interestingly variation for fimbrial genes transcription was observed after 72 hours of
static growth between XVM2 and LB media, transcription levels of the type IV pili
major subunits was higher in XVM2 as compared to LB medium and in LB medium
higher for wide as compared to narrow host range strain. These results suggest that 72
hours in our assays was a crucial time for biofilm formation, since the variation of fimA
3241 gene transcription was related with the ability to perform a mature biofilm
(Dunger et al., 2014). After 72 hours of static growth, bacteria have been deposited on
the surface, attached as a monolayer, and the type IV pili activated the transition to
mature biofilm (Dunger et al., 2014; Li and Wang, 2011b). Thereafter the low
Capítulo 7. Caracterización de la matriz extracelular producida durante la formación de biopelículas en
cepas de Xanthomonas citri subsp. citri con distinta gama de huésped
214
transcription levels of narrow host range strain in LB media for fimbrial and flagellar
related genes would not allow the establishment of a mature biofilm, explaining
therefore the low CV staining of LB biofilms assays described (Sena-Vélez et al., 2014),
and also the lack of more complex extracellular structures shown under the microscope.
However, the transcription rate of those genes increased after 72 hours of incubation
without liquid medium possibly because biofilm formation of this strain was delayed
and the dried and low nutrient conditions accelerated the mature biofilm stage. In
mature biofilms, for both strains and media, rpf, pilA and flagellar genes and fimA 3241
for narrow host range strain in LB, showed high transcription level several times higher
than at the beginning of biofilm formation. However the mRNA level from fimA 3241
of both strains in XVM2 medium was lower and no variation was observed for wide
host range strain and LB. Furthermore, the transcription levels of fliC or fleN were even
higher that those observed on planktonic growth for XVM2 medium. These results
suggest that cells from the biofilm would return to a planktonic state in response to a
variation of DSF in the biofilm as reported in other studies (Dow et al., 2003; He et al.,
2006; Li and Wang, 2011b). Quorum sensing induced flagellar motility allowing
bacterial release, possibly favored by type IV pili dependent motility of the cells inside
the biofilm.
Our results showed that the response in XVM2 apoplast mimicking media is more
conserved among wide and narrow CBC strains than in LB. Therefore is possible that
once Xcc reach the Citrus apoplastic site, its behavior was similar for any strain,
however the survival onto the plant surface was different regarding the host plant. This
hypothesis would confirm the appearance canker-like symptoms or hypersensitive
response caused by narrow host range strains on non-host Citrus when bacteria are
infiltrated.
Differential surface motility has been observed for the Xanthomonas strains tested, this
variation however was not related with the host range of the strain nor the disease
caused contrary to swimming motility (Sena-Vélez et al., 2014).
Wide host range strain showed in the close-advancing edge of the colony extracellular
appendages similar to type IV pili on the flagellum opposite cell pole and cell
elongation, while narrow host range strain only produced flagella and no other
extracellular structures. Furthermore, eDNA has been observed in the extracellular
Capítulo 7. Caracterización de la matriz extracelular producida durante la formación de biopelículas en
cepas de Xanthomonas citri subsp. citri con distinta gama de huésped
215
matrix of cells isolated from the advancing edge of the colony, as was described for Xcc
biofilms and twitching colonies (Sena-Vélez et al., submitted).
The transcription levels of the gene coding for the major subunit of type IV pili seemed
to be indirectly proportional to colony size. Wide host range strain Xcc 306 showed the
lowest colonized area and also showed the highest fimA 3241 transcription, meanwhile,
the wide host range strain MI showed structures similar to type IV pili, which confirms
the expression of this gene. Mutants in Xcc 306 unable to produce type IV pili (fimA
3241 gene) showed higher surface motility (Dunger et al., 2014; Guzzo et al., 2009) and
the same response was observed for P. aeruginosa ATCC 15692 (Anyan et al., 2014).
Furthermore, it was also described that type IV pili controlled the direction of bacterial
movements leading bacteria away of deleterious niches (Anyan et al., 2014). Flagellin
did not influence this kind motility (Dunger et al., 2014; Malamud et al., 2011), which
agrees with the slight variation observed in the mRNA relative levels of fliC among the
different areas of the colony for any of the strains.
The surface translocation performed by Xcc does not match with the description of
swarming motility, mainly because of the lowest motility rate and the lack of surfactant
production (Kearns, 2010; Tremblay and Deziel, 2010). A clear example of swarming
motility in Xanthomonas have been described in X. arboricola pv. pruni which
colonized the plate in 15 h showing a swarming dendritic pattern and surfactant
production (Garita-Cambronero et al. submitted). Sliding motility is more in agreement
with the translocation observed in Xcc. Our hypothesis is that the low displacement
observed in surface motility by Xcc strains, and the type IV pili transcription would lead
to biofilm formation onto the semisolid plate. This statement is supported by the fact
that in both LB (at the early stages of biofilm formation) and PYM media transcription
level of fimbrial and flagellin genes were higher in Xcc 306 strain than in Xcc 12879.
PYM is a nutrient rich medium which possibly influences negatively the biofilm
formation in narrow host range CBC strain as occurs in LB medium allowing therefore,
better bacterial displacement onto the PYM plate surface.
In this study we have reported the different extracellular structures produced by Xcc
during broth and plate growth, biofilm formation, and surface motility. Furthermore the
expression of type IV pili major subunit FimA 3241 was confirmed by extracellular
protein purification and protein identification. mRNA relative transcription levels at
different stages of biofilm formation and growth or surface motility, confirms the
Capítulo 7. Caracterización de la matriz extracelular producida durante la formación de biopelículas en
cepas de Xanthomonas citri subsp. citri con distinta gama de huésped
216
variable extracellular structures produced by two types of Xcc that differ in host range.
Besides the variable transcription observed by both strains on LB media showed a
variable response under same conditions, which induces variable biofilm formation.
Both, wide and limited Xcc strains, have the ability and the structural components to
produce a mature biofilm, however variation have been observed regarding the
environment in where bacteria were cultured (Jalan et al., 2013a; Jalan et al., 2013b;
Sena-Vélez et al., 2014). In Xcc 306 several sensor and regulation pathways induce the
transition from planktonic to sessile lifestyle and from monolayer to mature biofilms (Li
and Wang, 2011b). Therefore is possible that the less biofilm formation observed for the
narrow host range CBC strain in vitro and in planta was caused by variation in bacterial
sensors which have been described to evolve according to Xanthomonas host’s
adaptation (Mhedbi-Hajri et al., 2011a; Mhedbi-Hajri et al., 2013). Xanthomonas strains
assayed were able to translocate over surfaces; our results showed that type IV pili
transcription diminish this kind of motility in Xcc strains assayed and that the lower
relative mRNA expression levels are, the higher colony growth is observed. All these
results could partially explain the variable behavior observed among wide and limited
host range strains of CBC on biofilm formation and surface motility leading to a better
understanding of bacterial mechanisms related with the plant-host interaction and early
stages of the infection process.
Acknowledgements
This work was supported by Citrus Advance Technology Program, project CRDF546 as
well as through Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria
(INIA) project RTA2008-00048. Marta had a PhD fellowship from INIA.
217
CAPÍTULO 8: CONCLUSIONES
Conclusiones
219
Conclusiones de la tesis
1. El estudio de utilización de compuestos de carbono realizado con las cepas causantes
de cancrosis en cítricos Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc), la mancha bacteriana de
los cítricos X. alfalfae subsp. citrumelonis (Xac), y el agente causal de la
podredumbre negra en crucíferas X. campestris pv. campestris (Xc) mostró perfiles
de utilización de compuestos de carbono distintos. Dichos perfiles agruparon las
distintas cepas en función de su huésped, y la enfermedad producida.
2. Se ha desarrollado un nuevo método para el estudio de quimiotaxis en bacterias en el
que la respuesta quimiotáctica se analiza de forma independiente al crecimiento
celular. Este método permite el análisis de un gran número de muestras en un mismo
ensayo y un elevado número de réplicas por ensayo, cepa, y compuesto o extracto a
evaluar.
3. Se ha demostrado que la respuesta quimiotáctica de las Xanthomonas ensayadas está
relacionada con la gama de huésped y el tipo de enfermedad producida. Dentro de las
cepas causantes de cancrosis en cítricos la cepa modelo Xcc 306 mostró un perfil
quimiotáctico diferente al resto de las cepas estudiadas, mientras que las cepas de
limitada gama de huésped mostraron un perfiles más homogéneos entre ellas.
4. La cepa causante de cancrosis tipo A, Xcc 306 mostró una respuesta quimiotáctica
mayor frente a apoplasto de naranjo dulce, mientras que la causante de la mancha
bacteriana de los cítricos Xac F1 lo hizo frente a lima y la causante de la
podredumbre de las crucíferas, Xc 1609, frente a apoplasto de col china. La respuesta
de todas ellas fue siempre mayor frente a apoplasto que la obtenida frente a extractos
totales de hoja de las mismas plantas. Estos resultados sugieren el papel que juega el
contenido del apoplasto como señalizador en los procesos de colonización del
interior del tejido vegetal.
5. A partir de genomas completos disponibles se han identificado y clasificado las
proteínas aceptoras de grupos metilo (MCPs), sensoras de quimiotaxis en
Xanthomonas causantes de los distintos tipos de cancrosis de los cítricos, Xac y Xc.
Dichas MCPs se clasificaron en 27 grupos filogenéticos permitiendo definir aquellas
que son específicas de cada enfermedad.
Conclusiones
220
6. Los estudios por PCR para MCPs en 35 cepas de Xanthomonas causantes de
cancrosis tipo A mostraron que la mayoría de las cepas estudiadas presentaban un
perfil idéntico de MCPs independientemente de su gama de huésped y su origen
geográfico. Sin embargo seis cepas, entre las que se encontraba la cepa modelo Xcc
306, mostraban un perfil distinto. El árbol construido mediante Neighbor-Joinning
agrupaba en el mismo clúster las cepas causantes de chancro tipo A separadas de las
causantes de cancrosis tipo B y C, y Xac F1 o Xc 1609.
7. La relación entre la presencia de MCPs, el perfil quimiotáctico y la respuesta frente a
distintos extractos de plantas, sugieren el papel de la quimiotaxis en la colonización y
selección del huésped por parte de la bacteria.
8. Las cepas estudiadas tanto patógenas de cítricos como de crucíferas fueron capaces
de formar biopelículas en superficies abióticas, tanto en medios de cultivo con alta
concentración de nutrientes como en un medio que simula las condiciones del
apoplasto en el que además se observa mayor agregación bacteriana.
9. Los estudios de microscopía realizados en plantas con dos cepas causantes de
cancrosis tipo A en cítricos y la cepa causante de la mancha bacteriana de los
cítricos, han mostrado que la capacidad de formar biopelículas en hojas y frutos es
dependiente de la gama de huésped así como del tejido susceptible de ser infectado
por el patógeno.
10. Los estudios de microscopía electrónica de barrido en superficie vegetal de cítricos
han mostrado diferencias en la estructura de las biopelículas entre cepas causantes de
cancrosis de amplia y restringida gama de huésped, así como con la cepa causante de
la mancha bacteriana de los cítricos. Mientras que la cepa de amplia gama de
huésped era capaz de formar biopelículas complejas con un gran número de fibras
interconectando agregados, las cepas de limitada gama de huésped y de la mancha
bacteriana se agregaban formando filamentos simples.
11. Se ha demostrado que las cepas de Xanthomonas estudiadas son capaces de realizar
movimiento tipo swimming en medios con baja concentración de nutrientes. En
medios con alta concentración de nutrientes, sin embargo se vio favorecido el
movimiento en superficie. Además las cepas de Xcc de limitada gama de huésped
presentaron mayor movimiento tipo swimming que las cepas de amplia gama de
huésped.
Conclusiones
221
12. Se ha determinado la presencia de ADN extracelular (ADNe) en las cepas estudiadas
patógenas de cítricos y crucíferas en cultivos tanto líquidos como sólidos, formación
de biopelículas, movimiento tipo twitching y desplazamiento en superficie. Se ha
demostrado que el ADNe es un componente mayoritario en las estructuras
extracelulares de estos patógenos, que se presenta formando filamentos de longitud
variable en función de la cepa y el medio.
13. Los tratamientos con DNAsa en las primeras etapas de la formación de biopelículas
han confirmado la importancia de esta molécula en los procesos de iniciales de
adhesión a superficies, siendo más importante en las cepas de Xcc de limitada que en
las de amplia gama de huésped y la mancha bacteriana de los cítricos. Sin embargo el
papel del ADNe en Xc 1609 como adhesina no parece ser relevante.
14. Los tratamientos de las biopelículas con DNAsa en las Xanthomonas estudiadas
produjeron una ruptura de las mismas en las cepas patógenas de cítricos. La ruptura
llegó a ser mayor del 80% en las cepas de Xcc independientemente de su gama de
huésped. Sin embargo la cepa de Xanthomonas causante de la podredumbre de las
crucíferas no presentó rupturas estadísticamente significativas en los agregados a
ninguna de las concentraciones de DNAsa ensayadas.
15. El análisis de las proteínas extracelulares secretadas por dos cepas causantes de
cancrosis en cítricos con distinta gama de huésped no ha mostrado diferencias
cualitativas entre las dos cepas. En la matriz extracelular producida por estas cepas se
ha identificado la flagelina, la subunidad mayor del pilus tipo IV y una proteína
posiblemente relacionada con inmunidad en plantas y quorum sensing.
16. Los estudios de microscopía realizados en cultivos de las Xanthomonas estudiadas
durante la formación de biopelículas, han revelado la presencia de una gran cantidad
de estructuras filamentosas de grosores variables y distintas del flagelo. Estas
estructuras se producen en mayor cantidad durante la formación de biopelículas que
durante el crecimiento planctónico. Además en medio con alta concentración de
nutrientes se observaron menos estructuras en la cepa de causante de cancrosis de
limitada frente a la de amplia gama de huésped, lo que se relaciona con la baja
formación de biofilm por parte de esta cepa en dicho medio.
17. El análisis transcriptómico de genes relacionados con quorum sensing, flagelo y pili
tipo IV en medios con alta concentración de nutrientes, o simulando condiciones del
Conclusiones
222
apoplasto, confirmaron tanto la variación en la producción de estructuras
extracelulares entre las diferentes cepas como en la formación de biopelículas en
distintos medios. Dentro de los genes estudiados destaca el que codifica para la
subunidad mayor de los pili tipo IV, cuyo papel en las primeras etapas de formación
de biopelículas parece ser determinante para la completa producción de la misma.
18. Las cepas causantes de cancrosis de los cítricos han mostrado ser capaces de
desplazarse en superficie posiblemente mediante movimiento tipo sliding. La cepa de
limitada gama de huésped fue más eficiente en la colonización de la superficie que la
cepa de amplia gama de huésped. Los estudios de microscopía y transcriptómicos
realizados durante este tipo de movimiento, han mostrado que la presencia de
estructuras relacionadas con los pili tipo IV limitan la capacidad de moverse en la
superficie en las cepas de amplia gama de huésped, sin embargo los bajos niveles de
expresión de genes relacionados con el pili tipo IV en la cepa de limitada gama de
huésped así como la menor presencia de estas estructuras, confirmada mediante
microscopía, favorece el mayor desplazamiento en superficie.
19. Los resultados mostrados en este trabajo indican que tanto la formación de
biopelículas como la motilidad y quimiotaxis son factores implicados en las primeras
etapas de la infección causada por el chancro o cancrosis de los cítricos. La variación
observada en estos procesos entre las distintas cepas de las Xanthomonas estudiadas
confirman además el papel que juegan en la selección de las cepas por el huésped.
223
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