TRIÁNGULO DEL DIAGNÓSTICO
PACIENTE
MÉDICO
MÉDICO PATÓLOGO
CLÍNICO
MÉTODOS DIAGNOSTICOS ESPECIALES EN PATOLOGÍA
Avances médicos en el área de patologíaInmunofluorescencia directaInmunohistoquìmicaCitometría de flujoPatología molecular
INMUNOFLUORESCENCIA DIRECTA
Anticuerpo primario marcado con fluoresceína (C3, C4, C1q, IgM, IgG, IgA)Antígeno celularMicroscopio de fluorescencia.
INMUNOHISTOQUÍMICA
“La inmunohistoquìmica es un método que utiliza anticuerpos seleccionados para identificar antígenos específicos”
En el laboratorio se unen el anticuerpo con el antígeno en combinación con un marcador visual.
En las técnicas de inmunoperoxidasa se utilizan como marcadores enzimas capaces de hacer cambiar de color un sustrato incoloro. Por ejemplo, las enzimas más frecuentemente utilizadas son peroxidasa y fosfatasa alcalina y los sustratos diaminobenzidina (color pardo), aminoetilcarbazol (color rojo) y nitroazul de tetrazolio
(color azul). Estos marcadores pueden unirse (conjugarse) directamente al anticuerpo primario o bien indirectamente mediante otros anticuerpos (secundarios) o sustancias como biotina o proteína A.
FUNDAMENTOS DE LA INMUNOHISTOQUÍMICA
UTILIDAD
PASOS BÁSICOS
DesparafinarHidratarBloquear la actividad de peroxidasa endógenaProteína bloqueadoraReacción con anticuerpo primarioPoner a reaccionar con anticuerpo secundario biotilinadoColocar complejo estreptavidinaperoxidasaColocación del cromógenoTinción de contrasteDeshidratar, aclarar y montar
La disponibilidad de anticuerpos monoclonales ha facilitado enormemente la identificación de productos celulares y de marcadores superficie.
INMUNOHISTO-QUIMICA
APLICACIONES
TIPIFICACIÓN DE AGENTES
INFECCIOSOS
DIAGNÓSTICO DIFERENCIAL EN
PATOLOGÍA ONCOLÓGICA
FACTORES PRONOSTICOS Y
PREDICTIVOS
TIPIFICACIÓN DE
AGENTE
S INFECCIOSOS
TOXOPLASMOSIS
HELICOBACTER PYLORI
PNEUMOCYSTIS CARINII
CITOMEGALOVIRUS
HERPESVIRUS DE
EPSTEIN-BARRHEPATITIS B
DIAGNOSTIC
O DIFERENCIAL EN
PATOLOGÍA ONCOLÓGICA
CITOMETRIA DE FLUJO
Se utiliza para medir:
Tamaño de la célulaComplejidad de la membranaCantidad de DNA de la célulaPloidia y aneuploidiaProliferación celularClasificación de Leucemias y Linfomas
PATOLOGÍA MOLECULAR
Se utiliza:
Dx de neoplasias malignas.Neoplasias hematotopoyéticas asociadas a translocaciones específicas.Pronostico de neoplasias malignasDetección de enfermedad mínima residual.
FACTORES
PRONÓSTICOS Y PREDICTIVOS
CARCINOMA DE MAMA
CARCINOMA DE COLON
CARCINOMA DE VEJIGA
URINARIACARCINOMA DE
PROSTATAGIST
Dx de la predisposición hereditaria de cáncerAnálisis de micromatrices de DNA y proteómica.
TÉCNICAS DE ANÁLISIS DE DNA DIAGNOSTICAS1. Southern Blott (SBH)2. Northern Blott3. Hibridización in situ (FISH)4. PCR (reacción en cadena de polimerasa) o Amplificación5. Secuencia
SOUTHERN BLOTTPara la detección de genes específicos en el ADN celular. El ADN problema es digerido por una endonucleasa de restricciónLos fragmentos obtenidos se separan por electroforesisSe transfieren los fragmentos de ADN a un gel Se incuba posteriormente con una sonda marcada que hibrida los fragmentos de ADN
que contiene la secuencia complementaria.Los fragmentos se visualizan tras la exposición del filtro a una película radiográfica.
NORTHERN BLOTTVariante de la técnica de tranferencia de Southern.Detección de ARN en vez de ADN.La totalidad del ARN celular es extraída y fraccionada por electroforesis de gel.Los ARN se transfieren a un filtro y se detectan por hibridación con una sonda
radioactiva. (Similar al Southern)
HIBRIDACIÓN IN SITU (FISH)
El método de hibridación In Situ por fluorescencia se basa en la detección y localización de secuencia específicas de ADN o ARN dentro de las células de los tejidos. Consiste en colocar la sonda directamente sobre el espécimen que tiene la secuencia del ADN inmovilizada. El tejido es tratado con una enzima que permite el acceso de la sonda al ADN nuclear, el que ha sido previamente desnaturalizado por calor.La sonda se agrega para la hibridación y esta ocurre si está presente el ADN blanco complementario de la sonda. La sonda viene ligada a una sustancia fluorescente, que es observada mediante microscopio de fluorescencia.
HIBRIDIZACIÓN DEL ADN
la hibridización permite la localiación de ciertas secuencias de ADN in situ (FISH)
PCR (REACCIÓN EN CADENA DE POLIMERASA)
Es un método para conseguir un gran número de fragmentos de material genético a partir de una copia de ADN.
Una molécula de ADN sometida a 30 ciclos de amplificación da mil millones de copias. Esta técnica consiste en crear copias adicionales de la secuencia deseada o segmento
especifico de ADN. Se realiza a través de ciclos repetidos de desnaturalización, hibridación y extensión.
PASO 1
Desnaturalización con calor para abrir las hebras de ADN y permitir hibridización con oligonulétidos (“primer) (secuencia corta de pares de bases) iniciadores específicos.
PASO 2
La temperatura controla la tasa de fijación
A 55ºC, bajo la condiciones forman uniones de hidrógeno con el molde de ADN
PASO 3
Gracias a la estabilidad de la polimerasa aislada de bacterias que viven a altas temperaturas, la extensión se hace a una temperatura mayor a la de la fijación, asegurando especificidad.
RESULTADO
La secuencia entre los oligonucléotidos es copiada exponencialmente.
INMUNOHISTOQUIMICA EN NEOPLASIAS MALIGNAS INDIFERENCIADAS
Antígeno común leucocitario (linfomas)Melan A-HMB45 (melanoma)Citoqueratinas (pancitoqueratinas) y antígeno de membrana epitelial (carcinomas)CD99 (MYC2) (tumor neuroectodermico primitivo)Cromogranina-sinaptofisina (tumores neuroendocrinos)Vimentina (sarcomas)Proteína acido glial fibrilar (gliomas)
INMUNOHISTOQUIMICA EN NEOPLASIAS MALIGNAS INDIFERENCIADAS
Antígeno común leucocitario CD45 (linfomas)
CD20 (células B)CD3 (células T)CD4CD8CD30 (HODGKIN)CD15 (HODGKIN)Otros CD
INMUNOHISTOQUIMICA E NEOPLASIAS MALIGNAS INDIFERENCIADASMelanoma
-HMB45-MELAN A-S 100-VIMENTINACitoqueratinas (pancitoqueratinas) y antígeno de membrana epitelial (carcinomas)-CITOQUERATINA 20-CITOQUERATINA 7
*negativo para los dos anticuerpos (carcinoma renal)*positivo para citoqueratina 20 (cáncer de colon)*positivo para citoqueratina 7 (cáncer de pulmón)* positivo para ambas (cáncer de estomago)
CD99 (MYC2) (TUMOR NEUROECTODERMICO PRIMITIVO)Cromogranina – sinaptofisina (tumores neuroendócrinos).-CARCINOIDES-PARAGANGLIOMAS-CARCINOMAS NEUROENDOCRINOSTumores del estroma gastrointestinal (GIST) CD117 (c-Kit)Vimentina (sarcomas)-TUMORES DE MUSCULO LISO
*DESMINA*ACTINA DE MUSCULO LISO
-TUMORES DE MUSCULO ESTRIADO*DESMINA *MIOGENINA*MYO D1
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