Métodos Modernos para Diagnostico de Tuberculosis
Licda. Yanira E. MeléndezLaboratorio Nacional de Referencia2012
Nuevas Técnicas Diagnosticas de la Tuberculosis
• El diagnostico actual se basa en las mismas técnicas bacteriológicas que descubrió Koch hace mas de 100 años.
• Se ha tomado conciencia que para lograr su eliminación es mas importante mejorar los métodos diagnósticos.
QUE ESTAMOS HACIENDO??
• Cultivos en medio Solido: Loweistein Jensen
Ogawa Kudoh
Cultivo por Kudoh en medio Ogawa
Crecimiento en Medio Ogawa
IDENTIFICACION DE LA ESPECIE.
Crecimiento:Medio en el que crece. Tiempo que tarda en crecer,
morfología de la colonia, producción de pigmentos con/sin luz…
Pruebas bioquímicas:Prueba de la niacina, reducción de nitratos,
catalasa, tween 80.
ESTUDIO DE SENSIBILIDAD
• METODOS CONVENCIONALES.Crecimiento de la micobacteria en medios con el
tuberculostàtico correspondiente
Medios sólidos: Método de las proporciones (Resultado del estudio: 2-3 meses desde la recogida
de la muestra)
DIAGNOSTICO DE TBC POR METODOS TRADICIONALES
PROCEDIMIENTO TECNICAS TIEMPO PROMEDIO DEL REPORTE DESDE
EL DIA EN QUE SE PROCESA LA MUESTRA
EXAMEN DIRECTO Coloración de KinyounColoración de Ziehl-
Neelsen 24 HORAS
DETECCION DE CRECIMIENTO
Lowestein-JensenOgawa- Kudoh 20-25 DÌAS
IDENTIFICACIÓN DE LA ESPECIE
Pbas bioquímicas tradicionales (Niacina, Catalasa, Reducción de
Nitratos etc)
50-55 DIAS
DIAGNOSTICO DE TBC POR METODOS TRADICIONALES
PROCEDIMIENTO TECNICAS TIEMPO PROMEDIO DEL REPORTE DESDE
EL DIA EN QUE SE PROCESA LA MUESTRA
PRUEBAS DE SENSIBILIDAD
Método de las proporciones
múltiples 60 DIAS
DIAGNOSTICO DE TBC POR METODOS RECOMENDADOS POR EL CDC
PROCEDIMIENTO TECNICAS TIEMPO PROMEDIO DEL REPORTE DESDE
EL DIA EN QUE SE PROCESA LA
MUESTRA
EXAMEN DIRECTO Coloración Auramina/Rodamina
24 horas
DETECCION DE CRECIMIENTO
BACTEC, 15 días
IDENTIFICACIÓN DE LA ESPECIE
BACTEC, Sondas de ADN, HPCL
18 días
DIAGNOSTICO DE TBC POR METODOS RECOMENDADOS POR EL CDC
PROCEDIMIENTO TECNICAS TIEMPO PROMEDIO DEL REPORTE DESDE
EL DIA EN QUE SE PROCESA LA
MUESTRA
PRUEBAS DE SENSIBILIDAD
BACTEC 30 días
Nueva metodología en Laboratorio Nacional de Referencia
Microscopía LED Una nueva alternativa diagnóstica
Qué es la microscopía LED?
Es un tipo de microscopìa fluorescente en la cual la fuente lumínica (halógena o de mercurio) ha sido reemplazada por un diodo emisor deluz
Qué es un diodo?Dispositivo semiconductorde paso de corriente eléctrica en un solo sentido
ZIEHL NEELSEN
Microscopio óptico. 800 – 1000
Bacilos de color rojo sobre fondo Azul y blanco.
AURAMINA O
Microscopio de fluorescencia 200 – 400
Bacilos flourescentes amarillos Y brillantes sobre fondo oscuro
La “Limitación” más importante de la baciloscopìa es su baja sensibilidad.
Muy importante: Obtener buenas muestras
Tiempo de observación
Nuevos métodos de CultivoMedios de cultivo Líquidos: Radiométricos ( BACTEC ): detecta automáticamente crecimiento bacteriano, en caldo Milddlebrook 7H12 midiendo la cantidad de CO2 marcado con Carbono Radioactivo (14CO2)
Sistema BACTEC
Ventajas
*Ahorro de tiempo en la detección del crecimiento(15 a 20 días)*Mayor sensibilidad, tanto para el aislamiento del M. tuberculosis como de otras Micobacterias.*Posibilidad de identificar M. tuberculosis en 4 a 5 días y de realizar PSD a fármacos de primera línea en 3 a 6 días.
Desventajas• Necesita utilizar radioisótopos.• Elevado costo del equipo, reactivo y
mantenimiento.• Uso de jeringas, lo que puede ocasionar
contaminaciones cruzadas entre muestras así como formación de aerosoles.
• Necesita permiso para manipulación y almacenamiento del 14C.
MGIT 960/320
• Basado en el mismo principio, pero el marcador ha sido sustituido por Rutenio que emite fluorescencia detectable a medida que disminuye la tensión parcial de O2, usa tubos con caldo Milddlebrook 7H9
• Tiene una lectura automatizada• Aprobado como Gold Estándar• Buena concordancia con PS en medio sólido y BACTEC 460
MGIT 960/320
VENTAJAS
Mayor sensibilidad. Menor tiempoDESVENTAJAS
Mas costoso. Dependencia del proveedor Mayor preparación de personal
Crecimiento en caldo
Técnicas con Fagos: Se infecta a las Micobacterias con bacteriófagos específicos. Sensibilidad 50% y especificidad del 75% . Puede detectar 100 bacilos en una muestra . Este fago es capaz de replicarse en el interior de la micobacteria provocando lisis en su pared celular y liberación de nueva progenie de fagos
Técnicas con Fagos:
Ventajas y Desventajas
Ventajas• Bajo costo • Detecta 100 bacilos en una muestra• Puede ser utilizado para determinación de
resistencia a Rifampicina directamente de la muestra de expectoración
• Acorta el tiempo 2 días
Desventajas• Mayor frecuencia de contaminaciones
Nuevas Técnicas para Identificación:Test de NAP en Bactec 12B.
Sistema de cultivo
Medio base Mezclaantibiótica
Sistema de detección
Detección de M. tuberculosismedia (rango) en días
Detección de otrasMicobacteriasmedia (rango) en días
Otrascaracterísticas
Bactec 12 B
4 ml de 7H12 más POES
PANTA 14CO2
10(4-30) 13 (3-30) Radiomé-trico
Sigue….
POES :Contiene esterato de polioxietileno , sustancia que favorece el crecimiento.
PANTA : Polimixina B, Anfotericina B, Ac. Nalidixico, Trimetroprima, Azlociclina. Este suplemento al agregarse al medio 12B inhibe el crecimiento de gérmenes contaminantes.
BIOLOGIA MOLECULAR
• ADN: Molécula que tiene toda la información genética de cada individuo
• PCR: Reacción en cadena de la polimerasa
• Descubierta en 1985 por Karry Mullis (USA)
• La enzima ADN polimerasa permite fabricar una cadena de ADN complementaria a otra ya existente
• Técnica muy sensible y rápida
NUCLEO
CROMOSOMAADN
CELULA
TÉCNICAS MOLECULARES RECIENTESel Enchanced M. tuberculosis Direct Test
(E-MTD; Gen-Probe, San Diego).
• Este ensayo es basado en la transcripción mediada por un sistema de amplificación (TMA). El mycobacterial rRNA.
• EL RNA amplicon producido es detectado en solución usando luminometrico. Esta aprobado solo para muestras respiratorias
GENEXPERT MTB/RIF - Xpert®
• 1- La detección del ADN del complejo MTB en muestras de esputo o sedimento concentrado ya sea de esputo o LBA, BAAR + o BAAR -
• 2- La detección de la mutación del
gen rpoB /región 81bp que esta asociada a la resistencia a la rifampicina en pacientes de alto riesgo
• 3- La prueba MTB/RIF-Xpert® esta indicada en pacientes :
• con sospecha clínica de TBC • pacientes que no han recibido
tratamiento, • pacientes con menos de 7 días de tx.
o pacientes que no han recibido tx en los últimos 60 días
GeneXpert MTB/RIF•1). Primer instrumento de diagnóstico molecular homologado por la FDA
•2). El sistema GeneXpert es el único en combinar una preparación de muestra abordo con PCR en tiempo real
•3). Resultados de muestras no procesadas en aproximadamente 2 horas.
Principios de PCR en tiempo real• 1). Se monitoriza ciclo a ciclo el producto amplificado, a
través de una señal de fluorescencia en el momento en que se está dando la reacción de PCR
• 2). La señal de fluorescencia incrementa en proporción al producto amplificado
• 3). La señal fluorescente será colectada en la fase exponencial de la PCR ciclo a ciclo.
• 4). La medición puede ser graficada en forma logaritmica o lineal.
Correlación de Resultados
Baciloscopia
Cultivo en L J
GeneXpert Metodo de las Proporciones
Positiva Positivo Positivo Sensible/Resistente
Positiva Negativo Positivo No aplica
Negativa Positivo Negativo Sensible /Resistente
Negativa Negativo Positivo No aplica
1 Provenir del sitio de la lesión a investigar
2 Cantidad suficiente
3 Envase adecuado y limpio
4 Identificación
5 Conservación(tiempo deentrega)
6 Transporte
Muestra BiológicaAdecuada
Muestra biológica adecuada +
Técnica correcta
Resultado confiable y útil
• Los cultivos de bacteriología solo captan:
LA PUNTA DEL ICEBERG
La transmisión se da no solo por pacientes infectados,sino que también por pacientes colonizados