Microscopia de Microscopia de contraste de fasecontraste de fase
Microscopia de contraste de Microscopia de contraste de fasefase Contraste: diferença de iluminação entre amostras e os arredores ou o plano de fundo.
LUZLUZ
absorçãoabsorção
Transmissão = Transmissão = luz + fluorescência – (absorção + refração luz + fluorescência – (absorção + refração + reflexão)+ reflexão)
reflexãoreflexão
fluorescênciafluorescência
refraçãorefração
Tipos de contraste de faseTipos de contraste de fase1) 1) PositivoPositivo: amostra é mais escura do que o plano de fundo;: amostra é mais escura do que o plano de fundo;
2) 2) NegativoNegativo: amostra é mais clara do que o plano de fundo.: amostra é mais clara do que o plano de fundo.
EquaçãoEquação
I = intensidade de luz do campo (f) ou da amostra (a).I = intensidade de luz do campo (f) ou da amostra (a).
Contraste = (If - Ia) x 100 If
Microscopia de contraste de Microscopia de contraste de fasefase
Tipos de amostraTipos de amostra1) 1) AmplitudeAmplitude: alteram a intensidade da luz transmitida. Amostras transparentes coradas : alteram a intensidade da luz transmitida. Amostras transparentes coradas
causam o mesmo efeito.causam o mesmo efeito.
2) 2) FaseFase: não absorvem luz, mas causam mudança de fase nos comprimentos de onda que : não absorvem luz, mas causam mudança de fase nos comprimentos de onda que a atravessam.a atravessam.
Amostra transparente
Amostra tipo amplitude
Amostra tipo fase
Amostra tipo misto (maioria)
Microscopia de contraste de Microscopia de contraste de fasefase
Contraste em amostra Contraste em amostra com baixo retardo de fasecom baixo retardo de fase
Microscopia de contraste de Microscopia de contraste de fasefase
- Os raios não desviados são - Os raios não desviados são retardados cerca de ¼ de l em retardados cerca de ¼ de l em relação aos raios não desviados;relação aos raios não desviados;- a diferença de intensidade de luz - a diferença de intensidade de luz não é percebida pelo olho humano não é percebida pelo olho humano (não dá contraste).(não dá contraste).
amostra
Distânciafocal
condensador
Lente do tubo
Plano da imagem
ocular
objetiva
Raios não desviados
Raios desviados
O que o contraste de fase faz?O que o contraste de fase faz?1) 1) Contraste de fase positivoContraste de fase positivo
-- Acelera os raios não desviados em ¼ de Acelera os raios não desviados em ¼ de elevando a diferença de fase total para ½ de elevando a diferença de fase total para ½ de ;;
- a amostra fica - a amostra fica escura,escura, circundada por halo claro, sobre um fundo mais claro (menos claro que o halo). Dá contraste. circundada por halo claro, sobre um fundo mais claro (menos claro que o halo). Dá contraste.
2) 2) Contraste de fase negativoContraste de fase negativo
-- Retarda os raios não desviados em ¼ de Retarda os raios não desviados em ¼ de elevando a diferença de fase total para ½ de elevando a diferença de fase total para ½ de ;;
- a amostra fica - a amostra fica clara, clara, circundada por halo escuro, sobre um fundo mais escuro (menos escuro que o halo). Dá contraste.circundada por halo escuro, sobre um fundo mais escuro (menos escuro que o halo). Dá contraste.
Microscopia de contraste de Microscopia de contraste de fasefase
Microscopia de contraste de Microscopia de contraste de fasefase
ConfiguraçãoConfiguração
objetiva
amostra
condensador
Raios desviados90º fora de fase
Não desviados
não desviados + 90º Raios desviados180º fora de fase
Anel de fase
Anel de fase
Trabalha-se nos planosTrabalha-se nos planosda imagem conoscópicada imagem conoscópica
Microscopia de contraste de Microscopia de contraste de fasefase
ConfiguraçãoConfiguração
Parte central do anel mais fina que a periferia
Contraste positivo
Parte central do anel mais fina que a periferia
Contraste negativo
Microscopia de contraste de Microscopia de contraste de fasefase
Dados técnicosDados técnicos1)1) AAcessórios obrigatórioscessórios obrigatórios: anel de fase para condensador e objetivas com anéis de : anel de fase para condensador e objetivas com anéis de
fase;fase;
2) 2) Acessório extraAcessório extra: filtro verde. Isto porque os o sistema é projetado para funcionar : filtro verde. Isto porque os o sistema é projetado para funcionar melhor no centro do espectro visível (cor verde).melhor no centro do espectro visível (cor verde).
Técnicas e contrasteTécnicas e contraste
Amostra Técnica Contraste
Transparente Campo claro 2-5% Corada Campo claro 25%
Transparente Contraste de fase 15-20% Transparente Contraste diferencial
de interferência 15-20% Transparente Campo escuro 60-75% Transparente Fluorescência 60-75%
Microscopia de contraste de Microscopia de contraste de fasefase
Alinhamento dos anéis de faseAlinhamento dos anéis de fase- Usar telescópio de fase (o mesmo usado para ver a imagem conoscópica) para ver os anéis pela ocular;Usar telescópio de fase (o mesmo usado para ver a imagem conoscópica) para ver os anéis pela ocular;- Alinhar os anel do condensador movimentando os parafuso de ajuste no condensador próprio para a técnica;Alinhar os anel do condensador movimentando os parafuso de ajuste no condensador próprio para a técnica;- Sem alinhamento a técnica não funciona.Sem alinhamento a técnica não funciona.
Anéis não alinhados Anéis alinhados
Microscopia de contraste de Microscopia de contraste de fasefase
Microscopia de contraste de Microscopia de contraste de fasefase
IndicaçõesIndicações- Amostras vivas ou fixadas não coradas;- Amostras vivas ou fixadas não coradas;
- Melhorar contraste para visualização de detalhes em - Melhorar contraste para visualização de detalhes em amostras coradas (ex.: estriações transversais de músculos)amostras coradas (ex.: estriações transversais de músculos)
Microscopia de contraste de Microscopia de contraste de fasefase
LimitaçõesLimitações
- os halos podem obscurecer os detalhes que circundam a amostra;os halos podem obscurecer os detalhes que circundam a amostra;
- os anéis de fase reduzem a resolução da objetiva;os anéis de fase reduzem a resolução da objetiva;
- não é adequada para amostras espessas.não é adequada para amostras espessas.
Microscopia de contraste de Microscopia de contraste de fasefase
Contraste de fase positivo Contraste de fase negativo
ImagensImagens- Células de ovário de hamster- Células de ovário de hamster
Osso de dinossauro fossilizadocom quartzo no canal de HaversPreparo por desgaste
Contraste de fase Osso compacto humanoPreparo por desgaste
Contraste de fase + coloraçãoAterosclerose (placa de colesterolna parede da artéria)
Contraste de fase + coloraçãoPneumonia brônquica
Contraste de fase + HELíngua humana
Contraste de fase + HECartilagem hialina
Contraste de fasePólen de plantasc
Contraste de fase + HENeurônio multipolar