UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRIDFACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
TESIS DOCTORAL
MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR
PRESENTADA POR
Gustavo Cobreros Mendazona
DIRECTOR:
María del Consuelo López Zumel
Madrid, 2015
© Gustavo Cobreros Mendazona, 1978
Modificaciones de la radiosensibilidad en macromoléculas de
interés biológico : estudio aplicado al DNA
-r -y
G OS.'
UNIVERSIDAD HOMPLUTENSE DE MADRID
FACULTAD DE MENDIAS QUIMICAS
UNIVERSIDAD COMPLUTENSE
5 3 2 2 3 5 4 7 1 8
MODIFICADORES DE LA RADIOSENSIBILIDAD EN MACROMOLECULAS DE INTERES BiOLOGlCO.
ESTUDIO APLICADO AL DNA.
i i s & m
MEMORIAque présenta
GUSTAVO CGBREROS MENDAZONA
para aspirar al
GRADO DE DOCTOR EN MENDIAS QUIMIDAS
UNIVERSIDAD COMPLUTENSE - MADRIDFacuitad de Clencias Qufmicas
B I B L I O T E C A N- Registre ..........
Institute de Quimica-Fisica «Rocasolano» (D.S.I.D.)
Seccién de Radiobiologia
Madrid, Noviembre de 1978
N ire gurasoei.
Este trabajo ha sido realizado en la Secciôn de Radiobiologia
del Instituto de Quîmica-Fîsica "Rocasolano", del Consejo Superior de
Investigaciones Cientîficas.
Quiero dedicar mi mas sincero agradecimiento a la D ra . M®
Consuelo Lôpez Zumel, Investigador Cientîfico, por haber aceptado la
direcciôn de esta tesis, y, sobre todo, por la inestimable ayuda cientî-
fica y Humana que en todo momento se ha prestado a ofrecerme.
Agradezco a la D ra . P ila r Usobiaga Altuna, Investigador
Cientîfico, haber aceptado la colaboracion en la direcciôn de este tra
bajo, asesorando los principales aspectos de la parte experimental.
Deseo agradecer a la D ra . Marîa D . Astudillo las facilida-
des que desde el primer momento me ofrecio para trabajar en esta Sec-
cion, asî como su constante estîmulo; a los Profesores de Investigaciôn
D r. J .M . Gamboa y D r . A . Albert por haberme permitido trabajar en
sus Departamentos, y al D r . G .A . Dâvila, Jefe del Grupo de Biofîsica
de la Junta de Energîa Nuclear, por lo que han supuesto los conocimien
tos adquiridos en su laboratorio y en sus clases teôricas.
De una forma especial quiero recorder a mis amigos los Doc
tores: Javier Avilés, Teofilo D îez-C aballero , José Luis Jorcano, M- Vie
toria A lvarez, Fernando Garces y Francisco M ingot, por sus valiosas
sugerencias en distintos aspectos del trabajo, asî como al D r . Vicente
Menéndez, por su paciente e insustituîble ayuda en la elaboraciôn de los
programas de calculo. Ha sido importante tambiên la colaboracion de Ire
ne Romo, Gloria P in illos, Isabel Delgado, Jesus Hernandez, Pedro N a-
varrete y Esiquio A rranz.
Por ultimo, mi mas sincera expresion de estima a mis compa-
heros de laboratorio y de Instituto, que tanto han contribuîdo a que la es
tancia fuera mas grata, y en quienes he encontrado grandes amigos.
I N D I C Epâg,
. IN TR O D U C C IO N ................................................................ 1
1 .1 . F I N AL IDAD DEL TRABAJO................................. 2
1 .2 . INTERACCION R A D IA C IO N -M A TE R IA 6
1 .2 .1 . Radiacîon corpuscular............................... 7
1 .2 .1 .1 . Con carga e lêctrica......................... 7
1 .2 .1 .2 . Sin carga elêctrica (neutrones).. 7
1 .2 .2 . Radiacion electromagnet ica ...................... 8
1 .2 .2 .1 . Interacciôn de las diferentes zo
nas del espectro electromagnêti-
co con la m ateria............................ 8
1 .2 .2 .2 . Radiacion electromagnet ica ioni-
zante..................................................... 11
1 .2 .3 . Ecuacion de Bethe-Bloch........................ 14
1 .3 . INTERACCION RADIACIO N lO N IZ A N T E -
DN A.......................... 19
1 .3 .1 . Radicales inducidos en el H^O.............. 23
1 .3 .2 . Accion de los radicales sobre la molêcu-
la de DNA....................................................... 28
pag.
1 .3 .2 .1 . Alteraciones en las bases................. 30
1 .3 .2 .2 . Rupturas simples de cadena 32
1 .3 .2 .3 . Rupturas dobles de cadena.............. 38
1 .3 .2 .4 . Enlaces cruzados............................... 42
1 .4 . M ODIFICADORES DEL EFECTO DE LA RA
D IA C IO N .................................................................... 45
1 .4 .1 . Daunomicina................................................... 50
1 .4 .2 . Cromomicina A^............................................ 53
1 .4 .3 . Antram icina................................................... 55
1 .4 .4 . cis-diclorodiaminplatino (I I ) . ................ 57
1 .4 .5 . Mitomicina C................................................... 60
1 .4 .6 . C loroquina..................................................... 61
M ATERIALES Y METODOS, EXPERIMENTALES
Y DE CALCULO.................................................................. 64
2 .1 . TRATAM IENTOS BAS I COS DEL DNA 65
2 .1 .1 . Obtencion y aislamiento............................. 65
2 .1 .2 . Conservacion y disolucion....................... 66
2 .1 .3 . Desnaturalizacion........................................ 68
2 .2 . M ODIFICADORES DEL EFECTO DE LA R A -
pag.
D IA C IO N ....................................... 70
2 .2 .1 . Daunomicina................................................... 70
2 .2 .2 . Cromomicina A^............................................ 71
2 .2 .3 . Antram icina................................................... 72
2 .2 .4 . cis-diclorodiaminp latino (I I ) .................... 73
2 .2 .5 . Mitomicina C................................................... 74
2 .2 .6 . C loroquina..................................................... 75
2 .3 . IRRA DIAC IO N DE LAS M UESTRAS 77
2 .3 .1 . Condiciones de la irrad iac io n ............... 77
2 .3 .2 . Dosim etrîa ................................................... 78
2 .4 . TECNICA S DE MED I D A ...................................... 79
2 .4 .1 . Ultracentrifugacion an a lîtic a ................. 79
2 .4 .1 .1 . Condiciones de centrifugacion.. . 79
2 .4 .1 .2 . Calculo de coeficientes de sedi-
mentacion.......................................... 81
2 .4 .1 .3 . Calculo de distribuciones y p ro -
medios de masa molecular 87
2 .4 .1 .4 . Calcules de rupturas y enlaces
cruzados............................................ 93
pag.
2 .4 .2 . Espectrofotometrîa.............. 94
2 .5 . PROGRAMAS DE CALCULO................................ 96
2 .5 .1 . Proqrama para el calculo de coeficien
tes de sedimentacion.................................. 96
2 .5 .2 . Proqrama para el calculo de distribucio
nes, promedios de masa molecular, rup
turas y enlaces cruzados............................. 99
2 .5 .3 . Proqrama auxiliar.......................................... 103
. PRESENTACIO N Y D ISC US I ON DE RESULTA-
D O S................................................................................................. 104
3 .1 . CARA CTERIZAC IO N DEL DNA.................................... 105
3 .1 .1 . Coeficientes de sedimentacion . . . . . . . . 105
3 .1 .1 .1 . DNA nativo................................ 108
3 .1 .1 .2 . DNA desnaturalizado...................... 110
3.1 .2 . Distribuciones y masas moleculares. . . I l l
3 .1 .2 .1 . DNA nativo.......................................... 113
3 .1 .2 .2 . DNA desnaturalizado...................... 118
3 .2 . R A D IO S E N S IB IL ID A D DEL DNA................................. 125
3 .2 .1 . Influencia de la concentracion sobre la
pag.
sedimentacion de muestras irrad iadas. , 125
3 .2 .2 . Efecto de diferentes dosis de radiacion
sobre el D N A. ........................................ 129
3 .2 .2 .1 . Rupturas dobles............................... 129
3 .2 .2 .2 . Rupturas simples............................. 135
3 .3 . M ODIFICADO RES DEL EFECTO DE LA RA
D IA C IO N .................................................................. 139
3 .3 .1 . Daunomicina................................................. 139
3 .3 .2 . Cromomicina A^.......................................... 147
3 .3 .3 . Antram icina....................................... 156
3 .3 .4 . cis-diclorodiaminp latino (I I ) . .............. 165
3 .3 .5 . Mitomicina C................................................. 169
3 .3 .6 . Cloroquina ................................................. 179
IV . CONCLUS I O N ES.............................................................. 188
V . B IB L I0 6 R A F IA ................................................................ 194
V I . A P E N D IC E S ..................................................................... 209
I . I N T R O D U C C I O N
- 2 -
1 .1 . F INAL I DAD DEL TRABAJO
En la mayor parte de los casos de procesos cancerosos se
suele emplear la radiacion como tratamiento terapeCitico, lograndose en
algunos de el los incluso la curacion mediante la apl icacion exclusiva de
este procedimiento. Contrariamente a lo que se cree con frecuencia, los
casos curados con radioterapia siguen en numéro a los de enfermos recu
perados por intervencion quirurgica, y exceden en mucho a los casos de
curacion registrados empleando otros tratamientos.
Es opinion generalizada entre los radioterapeutas que peque-
nos incrementos en la radiosensibilidad diferencial del tejido tumoral fren
te al tejido sano aumentarîan considerablemente la posibiIidad de contrô
ler los tumores incipientes y favorecerîan la capacidad de tra tar con efec
tividad los procesos metastasicos en Medicine. La razon de este supuesto
estriba en que el uso de la radioterapia esta Iimitado por las dosis de ra
diacion que se pueden sum inistrar, debido al pel igro que el lo supone pa
ra los tejidos normales que se encuentran prôximos o inevitablemente in
terpuestos en el volumen irradiado. Contribuye incluso de una forma ne
gative en este problème el hecho frecuentemente observado de que las ce
lulas tumorales, por encontrarse en condiciones de hipoxia, presentan
una resistencia mayor a la radiacion que las celulas normales bien oxi-
genadas.
En principio, hay dos posibi I idades que, bien de una forma a_[
ternativa, o bien, en el caso mas optimiste, aplicandolas conjuntamente,
darîan lugar a que se produjera por medios quimicos el deseado incremen
- 3 -
to de la radiosensibilidad diferencial en los tejidos y, como consecuen-
cia de ello , la apl icacion de dosis de radiacion mas bajas. Estas dos po
sibilidades son: 1) reducciôn selective de la radiosensibilidad de las cé -
lulas sanas mediante radioprotectores quîmicos; 2) incremento de la ra
diosensibilidad de los tejidos malignos con radiosensibilizantes que no
influyan en las células sanas. En ambos casos se tra ta , por consiguien-
te, de modificar convenientemente la radiosensibilidad celu lar, campo en
el que se viene investigando intensamente en los ùltimos anos.
Fruto de estos estudios es el descubrimiento de varios produc
tos, algunos de los cuales se estàn aplicando actualmente en clînica: meto
trexato, ciclofosfamida, flag il, e tc .. No obstante, ciertas caracterîsticas
taies como elevada toxicidad, dificultades de solubilizaciôn y otros proble
mas que suelen presentar estos compuestos obligan a continuar en la bûs-
queda de nuevos modificadores de los efectos de la radiacion que resulten
mas convenientes.
Una de las directrices seguidas en este empeno es la de ensayar
con productos que ya se hayan manifestado como citotôxicos o antitumorales.
En esta lînea se encuentra precisamente la idea que promovio el présente
trabajo: ensayar diversos productos como posibles modificadores de la ra
diosensibilidad de sistemas biolôgicos. Se eligio para ello la molécula de
DNA como objeto fundamental de estudio por ser la principal responsable
de los danos producidos por la radiacion en los seres vivos. Como posibles
modificadores se eligieron: un agente antimalârico, diferentes antibioticos
y un complejo inorgânico de platino, por ser compuestos que, segun la infor
macion bibiiografica, resultan prototipicos de distintas maneras de union al
- 4 -
DNA, y porque ademàs, existîan sobre el los datos relativos a propieda-
des antitumorales o de radiacion a otros niveles de estructuraciôn bio-
logica que sugerîan la posibiIidad de que se comportaran como modifica
dores de la radiosensibilidad del DNA, mas concretamente, como sens_[
bilizantes.
Las técnicas expérimentales utilizadas fueron fundamentalmen
te quim ico-fisicas, dada la ubicacion de los laboratorios en que se rea
lize el trabajo y los medios de que se dispuso, teniendo en cuenta, no obs
tante, que estuvieran entre las mas adecuadas al estudio propuesto.
Se eligio como técnica experimental bâsica la ultracentrifuga-
ciôn analîtica, empleando el me todo de velocidad de sedimentacion para,
una vez observadas las variaciones de masa molecular, calcular el nume
ro de rupturas de cadenas inducidas en el DNA por efecto de la radiacion.
Esta técnica, frente a la viscosim etrîa, por ejemplo, présenta ciertas ven
tajas: por una parte, acusa una menor influencia de los cambios de flexiW
lidad aparecidos en el DNA nativo como consecuencia de las rupturas sim
pies de cadena; por otra parte, si bien de las medidas de viscosidad se
pueden deducir valores medios de masa molecular, no es posible hacer es
tudios detallados de distribuciones de masa molecular sin recu rrir al iabo
rioso e impreciso fraccionamiento de la muestra. Se empleô tambiên la es
pectrofotometrîa para comprobar la formacion de complejos entre los corn
puestos ensayados y el DNA, asî como para estudiar el efecto de la radia
ciôn sobre las especies separadas o formando complejo. Finalmente, en
cuanto al tipo de radiacion, se eligieron los rayos X , debido a que, ade-
mâs de presentar caracterîsticas cualitativas similares a la radiacion y .
- 5 -
y emplearse asimismo en radioterapia, résulté ser la fuente de radiacion
a la que se tuvo mas fàcil acceso en la Junta de Energîa Nuclear.
A continuacion, y antes de presentar los resultados experimen
taies obtenidos, se hace una exposiciôn teorica resumida de los puntos que
se consideran necesarios para entender mejor el trabajo, y la explicacion
detallada de los materiales y métodos empleados.
- 6 -
1 .2 . INTERACCION R A D IA C IO N -M A TE R IA
Los fenomenos de interacciôn entre los distintos tipos de ra
diacion corpuscular o electromagnet ica y un sistema material son, ob-
viamente, de una gran complejidad, por lo que, tanto su estudio como
su exposiciôn, exceden los limites de este trabajo.
No obstante, résulta de interés hacer aqui una breve expos_[
ciôn de conjunto en relaciôn con las caracterîsticas que presentan los
procesos primarios de transferencia de energîa en los diferentes casos
que se pueden presentar de interacciôn radiaciôn-m ateria .
Por una parte, ello va a proporcionar una visiôn global del
fenômeno, pudiendo asî situar mejor, dentro del contexto general, el
caso particular de la interacciôn rayos X -D N A , que es el que concier-
ne a este trabajo. Por otra parte, esta exposiciôn revelara que, siem-
pre que se trate de radiaciones ionizantes, los procesos primarios im-
plicados en la interacciôn son siempre los mismos, pudiéndose resumir
la naturaleza de este fenômeno universal en las très conclusiones que
a continuaciôn se adelantan y que resultan ser de gran trascendencia pa
ra el présente trabajo:
1-) Cualquier tipo de radiaciôn ionizante, ya sea corpus
cular o electromagnética, desde el punto de vista de
su interacciôn con la materia, queda siempre reduci-
da a una mera interacciôn de partîculas cargadas
con el sistema m aterial.
2-) El sistema m aterial, por su parte, présenta una total
inespecificidad a nivel molecular frente a la radia
ciôn ionizante.
- 7 -
3 -) Como consecuencia de lo anterior, los sistemas biolôgi
cos no van a ser sino un caso mas, indistinguible de cuaj_
quier otro sistema m aterial, en lo que se refiere a la na
turaleza de estos fenômenos iniciales.
Tanto en relaciôn con el tema general de la interacciôn radiaciôn-
m ateria, como sobre las consecuencias mas especîficas, que se iràn dedu-
ciendo respecto a su incidencia e implicaciôn biolôgica, existe abundante in
formaciôn bibliografica ( 1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8).
1 .2 .1 . Radiaciôn corpuscular
1 .2 .1 .1 . Con carga elêctrica
Las radiaciones naturales a y 3 , asî como los protones, deutero-
nes, e tc ., poseen intrînsecamente naturaleza corpuscular cargada, por lo
que résulta inmediato que su tratamiento sea como taies partîculas cargadas
y, desde la perspectiva que aquî interesa, no precisen de mayor comenta-
rio .
1 .2 .1 .2 . Sin carga elêctrica (neutrones)
Dentro de la radiaciôn corpuscular, el caso de los neutrones pue-
de parecer en principio distinto, debido a su naturaleza no cargada. Esta
caracterîstica excepcional que presentan hace que su interacciôn primaria
con la materia tenga lugar exclusivamente a nivel de nucleos atômicos, a
travês de dos tipos de procesos: dispersiôn o absorciôn. En el primero de
estos casos, que es el mas frecuente cuando el material receptor esta cons
tituîdo por nucleos ligeros, se producen colisiones elasticas entre estos nu
cleos y los neutrones incidentes de moderada energîa. F rente al mecanismo
— 8 —
anterior, el segundo proceso, es dec ir, la absorciôn de neutrones por
parte de los nucleos, es mucho menos frecuente. La captura de neutro
nes da lugar entonces a nucleos atômicos altamente excitados, de vida
media corta, que en el caso de que se trate de elementos ligeros pueden
alcanzar un estado estable mediante la emisiôn de un fotôn Y , y en el
caso de nucleos intermedios o pesados, mediante la emisiôn de protones
o partîculas a .
Debido a que el H es el elemento mayoritario del material bio
lôgico, y considerando su favorable relaciôn de masas con el neutrôn, no
résulta extraho que un 85-95% de la energîa de los neutrones se trans
fiera al material biolôgico mediante col isiones elasticas con los nucleos
de H , los cuales, a su vez, se transforman asî en protones de retroceso.
Puede apreciarse, por consiguiente, que tambiên en el caso
de los neutrones el proceso queda reducido a la acciôn de partîculas car
gadas (véase 1. 2 . 2 . 2 . en relaciôn con los casos de emisiôn y ), debiên-
dose en real idad a esta acciôn, mas que a las propias col isiones y cap tu
ras iniciales de los neutrones, la mayor parte de los efectos biolôgicos
de este tipo de radiacrôn.
1 .2 .2 . Radiaciôn electromagnética
1 .2 .2 .1 . Interacciôn de las diferentes zonas del espectro e lec -
tromagnêtico con la materia
Con objeto de comprender mejor los procesos que tienen lugar
cuando la radiaciôn electromagnética interacciona con la m ateria, convie
ne tener présente que las variaciones que se observan a lo largo del es-
- 9 -
pectro electromagnético en toda su extension no obedecen,en realidad, a
cambios en la naturaleza de la energîa electromagnética. Desde un punto
de vista cualitativo se tra ta , por tanto, de algo gradual, sin discontinu!-
dades. La unica variacion que existe corresponde a la longitud de onda,
afectando, por consiguiente, a la energîa electromagnética desde un pun
to de vista cuantitativo.. , DENOMINACION
FrccuencMtHz) COMUN Er»ergio(eV) Loi)g.ondo(m)
Roybs X
Ultrovioleta
7 /7 7 7 ////N ibihteV rL V //. r /
Royof X
Infrcrrojo
Microondoi
Rodiofrccuencio
Figura 1 Espectro electromagnético
Por este motivo, y como se vera a continuacion, la division que
habitualmente se suele hacer del espectro electromagnético résulta ser pu
ramente convencional y de escasa relaciôn con el tema que aquî se trata .
Si se comienza el analisis del espectro por el extremo de ener-
gîas mas bajas ( f ig . l ) , la primera observacion importante que cabe hacer
es que la temperatura ambiente supone una energîa media de 1/40 eV , va
lor que se situa en el in frarro jo . Por consiguiente, toda absorciôn de un
fotôn con energîa inferior a la mencionada, es dec ir, de longitud de onda
- 10 -
superior a las del in frarro jo no supone ni el aporle energetico necesario
para alcanzar la temperatura ambiente, por lo que toda la region del es
pectro cor respond iente a microondas y radioondas no tendra la mas mîm
ma trascendencia en cuanto a los procesos de interacciôn que se estudian
aquî. La zona superior del in frarro jo , con energîas del orden de décimas
de eV , implica energîas de rotaciôn y vibraciôn, por lo que la interac
ciôn de esa parte del espectro con un sistema material supondra sôlo va
riaciones en la temperatura de éste.
Avanzando en el espectro en la misma direcciôn se encuentra
a continuaciôn una zona sorprendentemente estrecha, cor respond iente al
visib le , y otra mas extensa, el u ltrav io leta , en donde las energîas im pii-
cadas se encuentran relacionadas con la formaciôn de enlaces covalentes,
al ser posibles las transiciones electrônicas en el material receptor de la
radiaciôn. Incluso en ocasiones puede estar présente ya la ionizaciôn.
Por ultimo a longitudes de onda mas bajas, es dec ir, en la zo
na de rayos X y rayos y» cualquier fotôn implica ya tanta energîa que
siempre estaran présentes los fenômenos de ionizaciôn.
De este modo, la divisiôn que se puede hacer del espectro elec
tromagnético, si se toma como criterio su interacciôn con la m ateria, es
muy simple, quedando reducido en real idad a très zonas:
Una primera regiôn de bajas energîas (microondas, ra
dioondas, IR ), de nu la trascendencia para el material re
ceptor, a excepciôn tan sôlo de la parte mas energética
del IR , la cual puede dar lugar a incrementos de energîa
calorîfica.
- n -
- Una segunda zona (visible y U .V . ) , en donde pueden pro
ducirse absorciones especîficas de fotones en funcion de
las transiciones electrônicas posibles. Como consecuen
cia de ello se pueden observer cambios quîmicos en el ma
terial receptor.
- Una tercera zona de al tas energîas (rayos X y y )> que
siempre produce ionizaciones en un sistema m aterial. De
esta regiôn del espectro, que es la que interesa en el pre
sente trabajo, se pasa a hablar a continuaciôn con mas
detalle.
1 .2 .2 .2 . Radiaciôn electromagnética ionizante
En esta ultima zona del espectro, la elevada energîa de los foto
nés no implica, segùn se ha dicho, cambios cualitativos en la naturaleza
de la radiaciôn. Por esta razôn, no interesara ya demasiado distinguir en
tre la radiaciôn X y la y ; ambas son sim ilares, y el detalle de su proce-
dencia, que es lo unico que en real idad las diferencia, no va a tener impo£
tancia aquî.
Una propiedad de estas radiaciones es que su intensidad, l(x ),
decrece exponencialmente con el rango de penetraciôn, x , segun la expre-
sîôn:
I (x) = Iq . e (1 .1 )
en donde I es la intensidad de la radiaciôn incidente y y el coeficiente de o
atenuaciôn del material irradiado. Esta disminuciôn de intensidad puede
- 12 -
ôbedecer a dos causas: dispersion de los fotones, proceso en el que no
existe transferencia de energîa, sino un simple cambio de direcciôn en la
onda incidente, o bien, transferencia de energîa al m aterial. Es dec ir,
que el coeficiente de atenuaciôn, y , sera en general la suma de un coe
ficiente de dispersiôn, o , y de un coeficiente de absorciôn t :
y = a + T ( 1 . 2 )
Es évidente que en este estudio sôlo la radiaciôn absorbida es
la que puede in teresar, por lo que, en adelante se excluirâ de la discusiôn
todo lo referente a la radiaciôn dispersada o transmitida.
El proceso inicial de absorciôn de los rayos X o Y se produce
fundamental mente por interacciones con los electrones atômicos del mate
ria l receptor, segun très mecanismos bâsicos: efecto fotoeléctrico, efecto
Compton y producciôn de pares.
Efecto fotoeléctrico
En este proceso toda la energîa del fotôn incidente se trans
mite a un electrôn atômico. El electrôn sale despedido enton
ces con una energîa cinética, E^, igual a la diferencia entre
la energîa del fotôn, h v , y la de ionizaciôn, I .
E, = hv - I (1 .3 )K
Efecto Compton
En este caso sôlo una parte de la energîa del fotôn inciden-
- 13 -
te se transfiere al electrôn expulsado. El fotôn reduce por
tanto su energîa, es d ec ir, se incrementa su longitud de on
da, y cambia ademàs su direcciôn, dependiendo el ângulo de
la energîa transferida.
Producciôn de pares
Este proceso de interacciôn, menos intuitivo, se hace posj
ble cuando un fotôn de energîa superior a 1 MeV se aproxima
al nûcleo. En el campo nuclear tiene lugar entonces la apa-
riciôn de un par electrôn-positrôn, con energîa cinética dis
tribuîda entre ambos.
La probabil idad de que se produzca uno u otro de los tipos ante-
riores de absorciôn depende fundamental mente del numéro atômico, Z , del
âtomo absorbente, segun:
4Efecto fotoeléctrico 'v Z
Efecto Compton 'v Z
2Producciôn de pares 'v Z
De lo anterior se desprende (existe tambiên dependencia, aunque
menor, de la energîa del fotôn) que en los materiales pesados la absorciôn
se llevarà a cabo principalmente por efecto fotoeléctrico. Por el contrario,
se puede adelantar ya que en los sistemas biolôgicos, debido al bajo numéro
atômico de la casi total idad de sus àtomos componentes, exceptuados quizâ
S y P , la absorciôn se llevarà a cabo, en general, mediante efecto Compton,
- 14 -
Una vez vistas las très formas en que tiene lugar la transfe
rencia inicial de energîa por parte de los fotones incidentes, no résulta ex
trano que el principal efecto de estas radiaciones ionizantes sobre la ma
teria venga dado, no tanto por la accion inicial de los propios fotones co
mo por la accion posterior de los electrones rapidos que el las generan
(6). En efecto, estos electrones, a su vez, pierden progresivamente su
energîa cinética por interacciones culombianas con otros electrones pré
sentes en orbitales atômicos o moleculares que encuentran en su re c o rr i-
do. La transferencia de energîa por col isiones varîa entre cero y valores
muy altos, pero en la mayor parte de los casos es suficiente para produ-
c ir nuevas ionizaciones.
En definitive, como consecuencia del proceso inicial de trans
ferencia de energîa, queda un enjambre de ionizaciones y excitaciones en
el trayecto de la partîcula râpida.
1 .2 .3 . Ecuaciôn de Bethe-Bloch
Una vez que se ha visto que la radiaciôn ionizante queda redu-
cida a la acciôn de partîculas cargadas interesa estudiar brevemente el mo
do de acciôn de estas partîculas.
Si una partîcula cargada pasa prôxima a una molécula, la envol-
tura electrônica de ésta se ve perturbada. La probabil idad, d$, de que ten
ga lugar una transferencia de energîa de valor comprendido entre W y
W + dW, entre la partîcula cargada y un âtomo de los que encuentra a su pa
so viene dada por la expresiôn (9):
- 15 -
d t . Æ . (1 .4 )mv^
en donde e es la carga del electron, (ze) la carga de la partîcula, m la
masa en reposo del electron y v la velocidad de la partîcu la .
El numéro de estas transferencias que tienen lugar por uni-
dad de volumen, dv , en un material dado sera entonces:
4 2dv = N .Z . dj, = — ! — .N .Z . ~ (1 .5 )
mv^ W
siendo Z , en este caso, el numéro atômico efectivo del material y N el
numéro de atomos por unidad de volumen.
A partir de estas consideraciones se llega a la ecuaciôn de Be
the-Bloch (10), la cual define el concepto de "transferencia lineal de ener
g îa" , -3— , es decir, la pérdida de energîa que sufre la partîcula cargada dx
por unidad de recorrido, expresada precisamente en funciôn de los parâ-
metros anteriores:
dE 47t e^ (ze)^d T " —
mv
o 2 / 2 v 2
2mv V \ VIn —
c“ ' c2(1 .6)
en donde ademàs de las magnitudes ya vistas aparece el termine I, que es
el potencial medio de ionizaciôn y c, la velocidad de la luz (lo incluîdo en
tre corchetes son termines re lativ îsticos, estrictamente valides para par
tîculas pesadas; para el caso de electrones la expresiôn es mas compleja).
Observando esta ecuaciôn de Bethe-Bloch se pueden deducir
— 16 —
varias consecuencias importantes.
En primer lugar, que la transferencia de energîa es d irecta-2 2
mente proporcional a (ze) e inversamente proporcional a v , lo cual in -
dica que, aunque la magnitud de la interacciôn depende, como era de es -
perar,de la carga de la partîcula , las partîculas lentas son mucho mas
efectivas que las râpidas en relaciôn con este proceso. La capacidad de
transferencia de energîa de una partîcula résulta estar, por tanto, para
dôjicamente, en relaciôn inversa a su velocidad.
Pero la consecuencia realmente importante y que interesa des
tacar en relaciôn con el présente trabajo es la que se dériva de la p re -
sencia en la ecuaciôn an terio r, del termine N Z , correspondiente a la
"densidad electrônica". Puede observarse que NZ no hace referencia aj_
guna a la estructura molecular. En otras palabras, a la partîcula car
gada le résulta indiferente la forma quîmica en que se encuentren pré
sentes los àtomos y moléculas del material irradiado; la partîcula, en su
recorrido , sôlo "ve" nubes de electrones, presentando asî la materia
una total inespecificidad a nivel molecular frente a la radiaciôn ionizan
te.
Puede verse, por tanto, al Ilegar aquî que han quedado con-
firmadas las très conclusiones que se adelantaron en 1. 2 .
Cabe sin embargo hacer algunas precisiones en relaciôn con
los sistemas biolôgicos. Estos no sôlo van a ser un caso màs, indistin
guible de cualquier otro sistema m aterial, sino que, como se ha visto, el
valor tan parecido de numéro atômico que presentan sus elementos cons-
- 17 -
tituyentes hace que la inespecificidad, ademas de manifestarse a nivel mo
lecular, se manifieste a nivel atomico. El material biologico es, de
este modo, un material practicamente "homogéneo” trente a la radiacion
ionizante ( 11), en el que la transferencia de energîa tiene lugar de una
forma completamente aleatoria , casi exclusivamente mediante efecto Comg
ton.
Ahora bien, si se hacen algunas consideraciones de tipo Quan
titative en relaciôn con las dosis de radiacion ionizante que conducen a
efectos létales en los seres vivos, se deduce que el material biologico
présenta una marcada sensibilidad a la radiacion, hecho que parece es-
tar en contradicciôn con las conclusiones que se acaban de mencionar.
Asi por ejemplo (7), en el caso de E . Col i , haciendo calcules a partir
de los 4 Krad cor respond! entes a la dosis D , que es la necesaria pa-o7 10
ra provocar la muerte del 63% de la poblaciôn bacteriana, se llega a la
conclusion de que el aporte energético létal medio por célula es muy pe-14
queno: del orden de 2.10 cal/cé lu la , le que equivaldrla, si esa ener-
gia se distribuyera de una manera uniforme por toda la célula, a un in -—2
cremento de temperatura de tan solo 10 C . En cêlulas de mamîfero es
ta sensibilidad es aùn mayor, pues los mismos calculos conducen a valo-
res de milésimas de grado. En consecuencia, si se considéra de una for
ma global, el aporte energético de una dosis létal es absolutamente des-
preciable en comparacion con la importancia del efecto biologico que su
pone, y por tanto, la explicacion del hecho paradôjico de que a dosis tan
bajas la célula muera no se puede hacer teniendo en cuenta solamente as
pectos energéticos cuantitativos.
Queda entonces la pregunta de qué es lo que realmente sucede
- 18 -
en los seres vivos para que éstos presenter la singular caracterîstica
de poseer una sensibilidad tan acusada a la radiacion.
- 1 9 -
1 .3 . INTERACCION R A DIAC IO N I ON IZA N TE-D N A
La unica respuesta a la pregunta anterior que pueda ser com
patible con todo lo expuesto hasta aqui sera la que en Radiobiologîa for
mula la conocida teorîa del "bianco" o "diana" (12). Segun esta teorîa ,
en el material biologico existen determinados "elementos de volumen" en
los que la accion de la radiacion tiene como consecuencia la produccion
de una alteracion irrevers ib le en a I gun componente de trascendencia v i
tal para el ser vivo.
Teniendo en cuenta la enorme variedad de especies molecula-
res existentes en la célula, se comprende que muchas ionizaciones no con
duciran a una lesion observable si las estructuras o moléculas alteradas
pueden ser rapidamente eliminadas y posteriormente sustituidas. Solamen
te aquellos componentes celulares que no puedan ser reemplazados y al
mismo tiempo sean imprescindibles para un correcte funcionamiento de la
actividad celular constituiran un "bianco" en los procesos de transferen
cia de energîa de las particules cargadas.
Las I es i ones en las moléculas revestiran por tanto mayor g ra -
vedad cuanto menor sea el numéro total de moléculas de esa especie exis
tentes en la célula y cuanto mayor sea su importancia funcional.
Ambos factores concurren de una forma singular en la molécu
le del DNA, por lo que sobre esta molécule se ha de situar ya la sospe-
cha de que sea el principal blanco de la radiacion (7).
En efecto, en la molécule del DNA se encuentra almacenada to
da la informaciôn necesaria para m aterializar nada menos que la propia cé
- 20 -
lula y su funcionalidad. Ello hace pensar que cualquier alteracion o de-
terioro de otros componentes celulares se vera subsanado con cierta fa
cilidad, en virtud precisamente de esa capacidad potencial contenida en
el DNA. Por el contrario,la menor lesion que impida al propio DNA pro
seguir su actividad, lo incapacité para la dupiicacion o incluso afecte a
la actividad del nuevo DNA procedente de la dupIicacion, sera , por las
mismas razones, de consecuencias negatives para la pervivencia de la
célula o de su descendencia.
Queda, pues, explicada la elevada radiosensibilidad que pre
sentan los seres vivos. Ciertamente, el material biologico se comporta
como algo homogéneo e inespecîfico frente a la accion prim aria de la ra
diaciôn ionizante. Sin embargo, dentro de su propio nivel biologico, la
enorme heterogeneidad y diferencia numérica relativa de las especies
moleculares, asî como su jerarquizaciôn funcional, explican la diferen
cia de comportamiento de una célula respecte a un sistema quîmicamente
homogéneo. En un cristal inorganico u organico, por ejemplo, se nece-
sitan dosis de radiacion mucho mas altas para detectar perturbaciones.
En definitiva, la probabil idad de que se produzca una a lte ra
cion en la molécula de DNA es, en s î , baja, pero sus consecuencias son
de gran trascendencia para el ser vivo.
Hay, sin embargo,un punto muy importante a considerar aquî
(11). El 75% de la materia viva es agua. Por otra parte las disoluciones
acuosas de DNA con las que generalmente se trabaja, debido sobre todo
a su elevada viscosidad, practicamente nunca sobrepasan una concentra
ciôn en DNA de 1 mg/ml, lo que supone una relaciôn en peso DNA/H^O
- 21 -
muy baja (0 ,001). Es d ec ir, incluso en los casos de mayor concentra-
cion, las disoluciones de DNA son en real idad muy diluTdas.
La consecuencia de ésto es entonces inmediata: tanto "in \d
vo" como "in vitro" (excluyendo de este ultimo caso la irradiacion de
DNA solido), y considerando ademas la "homogeneidad" atomica que se
observa en ambos casos a efectos de la radiacion, es mucho mas proba
ble que la transferencia primaria de energîa se realice sobre las mole
culas de H^O. Es dec ir, el efecto que pueda producir la radiacion io
nizante sobre la molécula de DNA sera casi exclusivamente consecuen
cia de una accion indirecta. Nevada a cabo a p a rtir de las especies
reactantes formadas en el HgO. Esto no quiere dec ir, como es lôgico,
que no exista la posibilidad de que se produzca una interaccion directa
foton-DNA. Simplemente lo que significa es que esta interaccion resu_[
ta muy poco probable en comparacion con la interaccion foton-H^O.
Se debe considerar también que "in vivo" existe otra posi-
bilidad de llevarse a cabo la accion indirecta de la radiacion (6). Las
moléculas orgânicas prôximas al DNA pueden recib ir la lesion prima
r ia , a su vez directa o indirectamente, convirtiéndose en radicales.
Reacciones posteriores de estos radicales pueden contribuir a los ata -
ques que reciba la molécula del DNA. En real idad, procesos de este t i
po parecen estar impiicados en la actuaciôn de determinados modificado
res de la radiosensibil idad, concretamente los radiosensibil izantes
oxîgeno-miméticos.
Conviene, sin embargo,dejar claro aquî un punto. La teorîa
del blanco expl ica sa tisf actor lamente las curvas de supervivencia expo-
- 22 -
nenciales que continuamente aparecen en Radiobiologîa sin hacer men-
cion alguna a la naturaleza de los procesos primarios de transferencia
de energîa, ataques indirectes por radicales o al tipo de alteracion pro
ducida en la molécula del DNA. Es mas, no especifica siquiera que la
molécula de DNA sea el blanco crîtico de la radiacion ionizante. A tra
vés de los paramètres de la ecuacion de Poisson solo habla de "impac-
tos" en "elementos de volümen" (13).
Sin embargo, no existe incompatibilidad alguna en abordar
el estudio del problema considerando conjuntamente ambas perspectivas.
El hecho de que esta teorîa hable de una "accion localizada" en "volume
nés de blanco" muestra su validez, ya que estos volûmenes pueden in -
clu ir perfectamente al DNA y un cierto entorno acuoso.
Por ultimo, hay que mencionar brevemente un hecho muy impo_r
tante. Hoy en dîa esta comprobado que muchos tipos de lesion en la mis-
ma molécula de DNA son reparados por la propia célula mediante la in -
tervencion de determinadas enzimas (14), en un proceso complejo que ac
tualmente es objeto de estudio.
Los seres vivos demuestran poseer asî una asombrosa capaci
dad de defensa y recuperaciôn, al menos hasta un cierto grado, frente a
la radiacion.
Estos mecanismos de reparacion, que expl ican la formaciôn
de los "hombros" caracterîsticos que presentan las curvas de superviven
cia para dosis bajas de radiacion, tampoco contradicen la teorîa del blan
co. El concepto de accion localizada sigue siendo valido, si bien, como
consecuencia de este hecho, en el tratamiento matematico se ha de aban-
- 23 -
donar el primitivo supuesto de que sea 1 el valor de la eficiencia letal de
cada impacto en el blanco (13).
Esta mencion final a los procesos de reparacion celular ha de
serv ir al mismo tiempo para prévenir del peligro que supone olvidar la
enorme distancia que ha de existir entre los procesos que realmente t ie -
nen lugar "in vivo" y las exfrapolaciones que a aquella situacion se pue
dan efectuar desde la experimentacion "in v itro " .
1 .3 .1 . Radicales inducidos en el H^O
Debido a la importancia que, segun se ha puesto de manifiesto,
tienen los ataques indirectes a la molécula de DNA, se hara ahora un bre
ve resumen de las especies que se originan en el agua por la accion de la
radiacion.
El proceso inicial de la ionizacion de una molécula de H^O da
lugar a la aparicion de un ion radical, , (15) y un electron, e~ :
HgO ------- -— ► H^O"' + e" (1 .7 )
A partir de aquî, tanto el H^O como el e , pueden seguir dis
tintas vîas de reaccîôn, en ocasiones interdependientes, como se indica
a continuaciôn.
El radical ion H_0^ posee una vida extremadamente corta (16),-14reaccionando rapidamente (10 sg) con una molécula de H^O segùn;
- 24 -
+ H O -------- ► H^O'" + O H ’ (1 .8 )
proceso en el que, junto a un hidrogenion, aparece ya el radical O H *,
radical oxidante, estable y muy activo.
Por su parte, el electron e originado en la ionizacion pr_[
mera, mientras conserva suficiente energîa cinética, es capaz de pro
ducir nuevas ionizaciones en otras moléculas de H^O, repitiéndose
de este modo el proceso de la ecuacion (1 .7 ). No obstante, cuando su
energîa cinética ha disminuîdo suficientemente puede suceder, o bien
que se recombine con el ion radical H^O^, o bien que se produzca su
"solvataciôn".
La recombinacion con el ion radical da lugar a molé
culas de agua en estado excitado, H^O * , las cuales, por este motivo,
pueden disociarse, originando el radical reductor H* y el radical o)d
dante O H ', que de este modo aparece de nuevo:
e '+ H O " ^ ---------- ». H O * ► H ’ +OH’ (1 .9 )
La segunda de las posibilidades, la solvataciôn o h idrata-
ciôn del electrôn, se produce por deslocalizaciôn del electrôn "terma
lizado" entre un cierto numéro de moléculas de H^O (17):
e" + nH^O --------- ► e" ( 1. 10)2 aq
Aquî también se dan dos posibilidades de reacciôn para es
tos electrones solvatados.
- 25 -
La primera posibi lidad es que el e reaccione con los H 0 ^ ,aq 3
los cuales pueden estar présentes antes de la irrad iacion, en el caso de
que se trate de soluciones acidas, o bien en todo caso, como consecuen
cia de la radiacion, segùn se ha visto en la ecuacion (1 . 8):
e - + ► H . , 0 + H " ( 1 . 1 1 )aq 3 2
(tanto esta ecuacion (1.11) como la ecuacion (1 .9) tienen interés por dar
lugar a la aparicion del radical reductor H * , que es la ùnica especie re
ductora capaz de reaccionar con los solutos, a consecuencia de su vida
media mayor). No obstante, la reacciôn (1.11) queda inhibida en medios
alcalinos por competir con el la la reacciôn de neutral izaciôn, de cons
tante de velocidad mas alta .
La otra posibi lidad de reacciôn del electrôn solvatado es con
el disuelto en el medio:
e - + 0_ ► O- (1.12)aq 2 2
—
Posteriormente el asî formado reacciona con el H dando
el radical hidroperôxido, H :
o " + H'^ ► H O ' ( 1 . 1 3 )
radical al que también se puede Ilegar por otro camîno, reaccionando el
con la otra especie reductora, es dec ir, con el radical H *:
O + H* --------------------------------------------- (1.14)
— 26 —
Por ultimo, el radical HO^ puede, a su vez, recombinarse
consigo mismo, dando lugar a y H^O^:
2H0g ----------► Og + (1 .15)
Hay que decir aqui que tanto la reacciôn del e” con el 0_aq 2
(ecuaciôn 1. 12) como con el H^O (ecuaciôn 1 . 11) son reacciones sin
energîa de activaciôn, por lo que sôlo se veran controladas por la velo
cidad de difusiôn de las especies radicales. Por consiguiente, el cami-
no a seguir por los e~ dependerâ fundamental mente de las concentra-aq ^
ciones que existan de y H^O .
Todo este proceso de radiôl isis del H^O, que, como se ve, es
complejo, y sobre todo interdependiente, se puede apreciar mejor en la
fig . 2 , tomada de la revisiôn efectuada por Mingot (18) sobre este tema.
No obstante, y en relaciôn con las especies radicales que pue
dan interesar aquî por su capacidad de reacciôn frente a la molécula de
DNA, se puede resumir esquematicamente el proceso en la siguiente ta - .
bla I :
T A B L A I
Especies radicales primarias
Ausencia de Presencia de O2
Medio acido H* O H ’ HO^ OH*
Medio neutro e“ H* OH* 0_ OH*aq 2
Medio alcalino e“ OH* 0_ OHaq 2
- 27 -
CM
a>
CMo+CM
0CM
1 CM
XCMoCM
•C M
• CM
CM
CM CM
m
CMCM
CM
CM
oO)c
c_Ncoc
'2u.2-O(0L
0>•D
Oa
CM
— v A /W s A r ^
c(UÜ)«0;uÛ
c(/).2uq;aw
l i i
CM
(0c.Dcn
— 28 —
Es dec ir, salvo en aquellos casos en que la disolucion haya sj
do desgasificada antes de producirse la irradiacion, las especies reduc-
toras H* y e“ desaparece rân por reacciôn con el O disuelto, propor- aq 2
cionando, segun sea el pH del medio, los radicales 0^ y H^O *. Ahora
bien, en estas condiciones de no desgasif icacion previa, que son las que
interesan en el présente trabajo, la especie oxidante OH* siempre este
ra présente , siendo por otra parte la unica especie radical verdaderamen
te activa, ya que el radical H^O , debido a su baja reactividad frente a
los solutos organicos, no puede competir con aquélla (19).
Esta simplificaciôn del fenômeno es de suma importancia por-
que, como se vera a continuaciôn, el estudio de la acciôn indirecta de las
especies radioinducidas en el agua sobre la molécula del DNA quedara re
ducido, en la p ractica, al estudio de la reactividad que présente el radi
cal O H ’ frente a los componentes de aquella macromolecula (8) (18),
1 .3 .2 . Acciôn de los radicales sobre la molécula de DNA
El problema que se ha de abordar ahora es, pues, el de inten
ter interpreter las alteraciones o "lesiones" que aparecen en el DNA irra
diado, détectables a nivel experimental, desde esta perspective mecanîs-
tica de una acciôn indirecta. Las alteraciones de que se habla son las s i-
guientes (20):
- Alteraciones en las bases nitrogenadas
- Ruptures simples de cadena
- Ruptures dobles de cadena
- Enlaces cruzados entre cadenas
- 29 -
Ya en principio hay que decir que el problema es complejo y
dista aùn mucho de estar esclarecido, por lo que solamente se harâ una
breve re ferenda sobre algunos mecanismos que parecen intervenir en
los procesos, remitiendo cualquier ampiiacion sobre este tema a la re -
ciente revision efectuada por Ward (8).
La deducion que se ha hecho en el estudio de la radiolisis
del agua sobre el papel exclusive del radical OH* en el ataque al DNA
se ha visto confirmada mediante estudios expérimentales. Por una parte,
las lesiones producidas en el DNA disminuyen notablemente en presen
cia de sustancias captadoras de dichos radicales. Por otra parte, estu
dies mas complejos sobre las especies intermedias formadas por ataques
de otros radicales parecen revelar para éstos mucha menor cuantîa y
trascendencia biologica (8).
Queda de este modo plenamente justificado que se centre el
estudio sobre la accion del radical O H ’ , para lo cual se haran en primer
lugar algunas consideraciones sobre su reactividad.
En general, el radical O H’ tiende a pasar a ion oxhidrilo,
OH , que es su forma estable reducida. Esta reacciôn red-ox, con un po
tencial oxidante muy elevado, que habla de su alta reactividad, puede lie
varse a cabo segun tres mecanismos distintos, dependientes de la natura
leza de las moléculas con las que interacciona: 1) Reducciôn por transfe
rencia electrônica. 2) Reducciôn por transferencia de atomos de H . 3)
Reducciôn por adiciôn a insaturaciones. El primero de estos mecanismos
es el que normalmente se produce con los iones inorganicos, y el unico
interés que puede tener aquî se refiere a que es el fundamento de los sis
- 30 -
temas de dosimetrîa que se han utilizado en la parte experimental de es
te trabajo. El segundo de los mecanismos, tipico en la interaccion con
moléculas orgânicas saturadas, no va a interesar aquî. Sin embargo,
el tercero , présente como es lôgico frente a moléculas que posean insa
turaciones olefînicas, hace pensar ya en las bases nitrogenadas del
DNA.
1 .3 .2 .1 . Alteraciones en las bases
Uno de los puntos que parecen comprobados en relaciôn con
las alteraciones producidas en las bases nitrogenadas es precisamente la
inicial adiciôn de los radicales OH* a un doble enlace, dando lugar a un
radical hidroxiderivado. Este radical puede evolucionar posteriormente
de distintas maneras, dependiendo de las condiciones del medio (21).
En la fig . 3 se présenta un esquema de las consecuencias deM
vadas de la adiciôn del electrôn solvatado y del radical O H ’ al doble en
lace 5 ,6 de una pirim idina. En relaciôn con el radical OH , se puede ob
servar que, ademâs de una posible recombinaciôn entre los radicales
hidroxiderivados inicialmente formados, regenerando el doble enlace,
existen dos posibilidades distintas de evoluciôn. Si la concentracîôn de
OH* es elevada, el radical hidroxiderivado de las pirimidinas adiciona
un segundo radical O H ’ , dando lugar a un glicol, el cual puede a su vez
perder una molécula de agua, produciendo isobarbitûricos . Si en la so
luciôn existe O^ disuelto, el radical inicial evoluciona, formando hidro
xihidroperoxiderivado. Hay que decir, sin embargo, que incluso en es
tas ultimas condiciones los hidroxihidroperoxider ivados, peso a ser pro
- 31 -
CM
S
to o
U> u>
Og
(0c
I‘Za(Cc3d>-o
ID
LO
<UÜJ5c(U
■§■O
o"Oto"to>oU)c
vO
u(Ü
13
IOtoo13toc_
"Ô13c\0
13<totoc.3O)
— 32 —
ductos m ayoritarios, no son nunca exclusives,como se desprende de
los rendimientos radiolîticos de destrucciôn de pirimidinas y de pro
ducciôn de aquellos derivados. Sobre la formaciôn de otros derivados,
y los mecanismos posibles que les puedan dar lugar por ataque del ra
dical OH* no existen todavîa criterios seguros (8).
Respecte a la radiolisis de las purinas la situaciôn es aùn
mas oscura. Se sabe, no obstante, que el radical OH , en presencia
de O^ se adiciona al doble enlace 4 ,5 , dando origen a un radical h i-
droxihidroperoxidoderivado (22) (23).
Otro punto que, aunque interesante, no parece del todo escla
recido es el de las posibles diferencias de reactividad frente al radical
O H*, entre las bases pùricas y pirim idînicas. De confirmarse los datos
que existen en este sentido (24) (11), podria en principio pensarse en la
existencia de puntos de ataque preferenciales a lo largo de la molécula
de DNA. Sin embargo, la enorme cantidad de bases présentes en esta
biomolécula, junto con el hecho de que, en buena aproximaciôn, se pue
den considerar distribuidas al azar sobre la misma, permite minimizar
las consecuencias de aquella posibilidad. En definitiva, se puede admi-
t ir que el ataque radical tiene lugar en un punto cualquiera de la macro
molécula.
1 .3 .2 ,2 . Rupturas simples de cadena
Es évidente que una ruptura simple de cadena aparecerâ siem
pre que se produzca una discontinuidad en la serie sucesiva azùcar-fos-
fato que forma el armazôn de la cadena polinucleotîdica.
- 33 -
En el caso concreto de que la timina forme parte de un nu
cleoside o nucleôtido, parece demostrado que el hidroxihidroperoxi-
derivado que se forma después de la adiciôn del radical OH* al doble
enlace 5 ,6 de la base no conduce a la apariciôn de una ruptura in te r-
nucleotîdica. En este caso no se produce siquiera la hidrôlisis del en
lace N-glucosîdico establecido entre el nitrôgeno 1 de la timina y el
carbono 1 ' de la desoxirribosa, sino que el hidroxihidroperoxideriva
do permanece unido a la cadena (25). Este dato experimental reviste
una especial importancia en relaciôn con la interpretaciôn de los me
canismos que puedan dar lugar a la apariciôn de las rupturas simples
de cadena, porque pone de manifiesto que la alteraciôn de una base no
implica necesariamente la apariciôn de una ruptura.
De este modo, se hace necesario centrar el estudio en las
consecuencias que pueda tener el ataque radical sobre la molécula de
azucar.
La desoxirribosa puede ser atacada tanto por el radical re
ductor H * , para el que présenta sin embargo muy baja reactividad (26),
como por el radical oxidante O H*. En el caso de nucleôtidos, esta ùlU
ma reacciôn queda puesta de manifiesto por la I iberaciôn de ortofosfato
inorganico, Iiberaciôn que no tendria lugar si el ataque radical se efec
tuara sobre la base.
Ante el hecho sorprendente de no existir en la bibiiografîa
mas intentes de interpretaciôn mecanistica de la ruptura internucleotî-
dica que una referenda de Scholes (27) a la inestabiIidad de las 3 -c e -
to y 3 -aldehidoalcoholes frente a la hidrôlisis (28), Mingot (9) propuso
- 34 -
el estudio de très tipos distintos de ataque del radical O H’ a la molécu
la de desoxirribosa, segun el esquema de la fig . 4 . En este esquema pue
de observarse que la hidrôlisis del ester fosfôrico del azucar a que ha
ce re ferenda Scholes se produce como consecuencia del ataque del ra
dical al carbono 3 '. Asîmismo estan representados los ataques del radi
cal OH a los carbonos 5 ’ y V .
En la fig . 5 se muestran los diferentes tipos de ruptura a que
dan lugar las tres posibilidades de ataque mencionadas, detallandose la
naturaleza quîmica de los terminales que se producen asî como las espe
cies que se liberan.
Los datos expérimentales mas fidedignos de rendimientos radio
lîticos indican (29) que las rupturas radioinducidas en las cadenas polinu
cleotîdicas van acompahadas en el 80% de los casos de apariciôn de gru -
pos fosfato en posiciôn 5 ’ . Al mismo tiempo, en un 30% de estos casos apa
recen bases libres y en otro 30% de casos se liberan nucleôsidos a lte ra -
dos.
Confrontando estos resultados con las posibilidades de reac
ciôn antes mencionadas, se puede pensar que las tres rutas propuestas
por Mingot expl ican el 80% de los casos de apariciôn de terminales fosfato
en 5 ', con una eficacia aproximadamente équivalente para cada una de el las.
Queda, sin embargo, por explicar el restante 20% de los casos de forma
ciôn de terminales fosfato en 5 ', en el que al parecer se liberan nucleôsi
dos intactos.
Enfocando ahora el problema desde un punto de vista experimen
- 35 -
MO. ÇN;4) 1
A
\ MO CH,-0-
• o »
O P O ,H
,0 M
B Q C H - ,-0-
t k ^ ' lI ^0.
Figura 4 . - Mécanisme de oxidaciôn del carbono 3' de la desox_[
rribosa por el radical O H ’ (Mingot, 1 .972).
\
ATAOUC CM r - I S I
\
ATAQUE EN C ' I l l
\
A1A0UE EN C '- n i
\ \S - r °
0 « , H j
O n . , / o v . cK,-o-;;-o«
S > *OAOjHj
0 » - i / 0 s . CM^-O-f-OM 8 ^ , / O s . CM^O^OM
\+ + E3 + l 0 +
#m CM,-0-P-OM
< t> *» . / O S . CHO
< >8 , / 0 \ C H , OH
“O '
0^ MQ— 0 H 0>. CMj.OA.ON
OH "^O A O ,M ,
\ + + +» . ^ ^ 0 > ^ , - o - w , H a | > V ^ 0 s ^ ; OH
\
■ - « / o v C M r O - r o j M , 0 » . l / O S . CH,-0-P0,H;
%
Figura 5 . - Distintas posibilidades de ruptura internucleotidica (Del
gado y otros, 1.974).
- 36 -
ta I , las rupturas simples de cadena se pueden detectar por métodos de
valoraciôn de fosfatos liberados enzimâticamente. Sin embargo, una fo r
ma mas directa de refle jarse la aparicion de estas rupturas sera mediaj}
te la comprobaciôn de la disminucion de la masa molecular del DNA des-
naturalizado, es decir, DNA al que después de la irradiacion se le ha-
yan separado las cadenas complementarias que forman la doble hélice.
El estudio de la masa molecular de este DNA y su comparacion con la ma
sa molecular del DNA desnaturalizado correspondiente a un control no
irradiado, permite efectuar el calcule de las rupturas simples producidas,
Ahora bien, dado que en la mayor parte de las muestras de
DNA (exceptuadas las de virus aislados con especial cuidado) el material
de partida no es homogéneo desde el punto de vista de la masa molecular,
ésta no podra expresarse mas que como un promedio de las masas molecu
lares realmente existentes en un momento dado. En este sentido interesa
destacar aquî dos tipos de promedios de masa molecular, entre los que se
suelen définir en estos casos (30): la masa molecular promedio en peso
(1.16)^ n i M l
y la masa molecular promedio en numéro
Mn = (1.17)L ni
siendo ni en ambas expresiones el numéro de moléculas cuya masa mole
cular es M i.
- 37 -
Como es évidente, ambos promedios serân coincidentes en el
caso de una sustancia monodispersa, y por tanto, la relaciôn Mw/Mn pro
porciona una idea del grado de heterogeneidad de tamanos moleculares
existente. En distribuciones al azar de masas moleculares, caso frecuen
te en muestras de DNA, se suele observer una relaciôn Mw/Mn = 2 (31).
Conocidos los valores Mw y Mn del DNA irradiado y los Mw^ y
Moq correspondientes a un control sin irrad ie r del mismo DNA, se pueden
calculer las rupturas simples que se han producido a consecuencia de la
radiaciôn, aplicando la siguiente ecuaciôn general de Charlesby (32) que,
como se vera , también es valida para el calcule de ruptures dobles:
® = 1 ^ ) ( ' - 'G)
en donde B es el numéro de rupturas referidas a un nucleôtido y m la masa
media de éste.
No obstante, es frecuente también efectuar este calcule compa-
rando solamente los promedios en numéro de la masa molecular (33) (34).
En este caso el razonamiento es bien sencillo: si una masa molecular ini
cial Mn^ se reduce por efecto de la radiaciôn a un valor Mn, el numéro deMn.
rupturas sufridas por molécula habra side —------ 1. Por consiguiente, laMn
frecuencia de rupturas referida a un nucleôtido sera:
"mÎt - m!^ ) (1.19)
En el DNA irrad iado, tanto en estado sôlido (35) (36) como en
disoluciôn (33) (37), el numéro de rupturas simples por nucleôtido, ,
- 38 -
résulta ser directamente proporcional a la dosis D recibida;
= k .D (1.20)
siendo k la probabil idad de ruptura por nucleôtido y por unidad de do
sis.
1 ,3 .2 .3 . Rupturas dobles de cadena
En contraste con el insatisfactorio conocimiento que se po
see acerca de la naturaleza de la ruptura simple de cadena, existe hoy
un total acuerdo en admitir que, siempre que se trate de DNA irradiado
en soluciôn, la ruptura doble de cadena se produce como consecuencia
de la coincidencia, mas o menos estric ta , de dos rupturas simples, s i-
tuadas en lugares opuestos de cada una de las cadenas complementarias
del DNA.
El hecho de suponer a la ruptura doble como una consecuen
cia estadîstica de la coincidencia de rupturas simples fue pronto intuîdo
por los investigadores, al observar que el modelo teôrico de Charlesby
(38) (31), referente a la degradaciôn de homopolîmeros artific iales por
cualquier agente productor de rupturas no era exactamente aplicable al
caso del DNA irradiado en soluciôn.
En efecto, y sin entrar en los detal les de su deduciôn, segun
la teorîa de Charlesby, el grado de polimerizaciôn medio, u, después
de una dosis D viene dado por la expresiôn:
- 39 -
u = ------------------ (1 .21)k (Dq + D)
en donde k es la probabil idad de ruptura de un enlace cualquiera por um
dad de dosis y una "dosis" virtual que se supone darîa lugar a la dis
tribuciôn de partida de las masas moleculares, como consecuencia de la
ruptura de "una ùnica molécula orig inal".
Por otra parte , siendo la masa molecular promedio en nùme-
ro , Mn, proporcional al grado de pol imerizaciôn segùn:
Mn = u . m (1.22)
donde m es la masa molecular del monômero, se llega a la expresiôn:
Mn = ------- (1 .23)k (Dq + D)
Sometiendo este modelo teôrico a comprobaciôn experimental,
Cox y otros (39) (40) encontraron ciertas divergencias con los valores
obtenidos a partir de medidas viscosimétricas. No obstante, fueron ellos
mismos quienes ya supusieron que si el DNA era efectivamente una cade
na doble, su ruptura, es dec ir, la ruptura doble, podria producirse por
coincidencia de rupturas simples opuestas, siempre que hubiera un ata
que quîmico local por radicales.
Este nuevo supuesto, en real idad, no rechaza los planteamiej}
tos de la teorîa de Charlesby, sino que implica solamente una modifica-
ciôn en el punto cor respondi ente a la probabil idad del suceso de ruptura.
- 40 -
La probabil idad no sera ahora proporcional a la dosis, sino a su cuadra
do, con lo que la expresiôn (1 .23) se transforma en:
Mn = --------- (1 .24)
k (D + D)^O
La buena concordancia, en este caso, entre la teorîa y los da
tos expérimentales vino a confirmar la veracidad de esta nueva hipôtesis,
al mismo tiempo que debido a las fechas en que se realizaron, estos tra -
bajos tuvieron la importancia de aportar una prueba mas en favor del mo
delo bicatenario de Watson y C rick .
Los trabajos posteriores de Peacocke y Preston (41), asî co
mo los de Hagen (42) (33), no han hecho sino confirmar y ampliar las con
clusiones anteriores, haciendo referencias a la dependencia entre nume
ro de rupturas y dosis suministrada.
Se ha de destacar aquî el hecho de que, asî como se ha visto
que existe una inespecificidad local por parte de las cadenas polinucleo-
tîdicas en relaciôn con la producciôn de rupturas sencillas, la naturale
za puramente estadîstica del proceso de coincidencia de estas da lugar,
con mayor razôn, a que la ruptura doble se produzca al azar, sin ningun
tipo de preferencia local sobre la molécula de DNA (9).
Hay que hacer sin embargo una pequeha precisiôn a todo lo d_[
cho. La probabil idad de ruptura doble se ve I igeramente incrementada,
debido a que en el entorno prôximo a una ruptura simple, siempre se pro
duce una desestabilizaciôn de enlaces de H entre las bases, hecho que
- 41 -
da lugar a que la coincidencia no tenga que ser del todo estricta . Sobre
la valoraciôn y extensiôn de esta desestabil izaciôn local, y consiguien-
temente, el numéro de pares de nucleôtidos que pueden verse impi icados
en una ruptura doble puede consultarse un reciente trabajo real izado
por Jorcano (34).
En relaciôn ahora con el calcule de las rupturas dobles, ré
sulta évidente que si estas dan lugar a una degradaciôn del DNA nativo,
es dec ir, a la formaciôn de moléculas de menor masa molecular, aquî
también sera val ido el método de estudio que se ha visto para el DNA des
natural izado respecte al calcule de rupturas simples. Por tanto, api ican
do las mismas ecuaciones (1 .18) y (1.19) al estudio de los fragmentes de
DNA nativo irradiado, y relacionândolos con contrôles no irradiados, el
valor, Bg, que se obtiene corresponde en este caso a la frecuencia de
rupturas dobles referida a un nucleôtido par.
Por otra parte, teniendo en cuenta todo lo que se ha dicho so
bre la formaciôn de la ruptura doble, se comprende faciImente que la re
laciôn entre numéro de rupturas dobles y dosis suministrada venga dada
finalmente (33) por la expresiôn:
B = (g + B j / . n = (6 + k o / . n (1.25)
en donde B^, como ya se viô, es el numéro de rupturas simples por nu
cleôtido, 3 el numéro de rupturas simples présentes antes de la irra d ia -
ciôn (frecuentemente despreciable a altas dosis) y n es el numéro total
de pares de nucleôtidos desestabilizados en el entorno de una ruptura sim
pie.
- 42 -
La fig . 6 , elaborada a partir de datos expérimentales, confir
ma perfectamente esta dependencia de respecte de! cuadrado de la do
S I S .
Lo anterior contrasta,
pues, con los resultados que se
obtienen de la irradiacion del DNA
solido (35) (36). En este caso,
las rupturas dobles se producen
directamente como consecuencia
del impacto de los fotones, por lo
que la dependencia de con la do
sis es lineal.F ig . 6 . - Rupturas simples (B^)
y dobles (B ) a distintas dosis (Hagen, 1.967)
Por ultimo hay que decir que el modelo matemâtico propuesto
por Mingot (9), pretende explicar de una manera general la fenomenologîa
de los procesos de degradacion radiolitica del DNA en soluciôn, ofrecien
do asf una vision sintética de los resultados obtenidos en este campo, al
mismo tiempo que establece una correlacion con otros procesos de degra
dacion del DNA.
1 .3 .2 .4 . Enlaces cruzados
El ultimo tipo de alteraciôn del DNA irradiado que se conside-
rarâ aquî, mas complejo y no siempre présente, se re fiere a la apariciôn
de enlaces cruzados entre las distintas cadenas.
En el caso del DNA irradiado en seco esta comprobado que se
producen estos enlaces intermol ecu la res , y en su formacion parecen in-
- 43 -
tervenir los radicales que aparecen sobre las cadenas (35) (36). En fa
vor de esta hipôtesis esta precisamente la inhibicion parcial que sobre
este fenomeno produce la presencia de (35), hecho que se interpré
ta como una reaccion competitiva del con los radicales para formar
peroxirrad icales.
Respecte al DNA irradiado en solucion el problema es, sin
embargo, mas complejo. En el proceso de formacion de enlaces cruza
dos influyen en este caso numerosos factores, como el tamano, concen-
tracion y conformacion de las macromoléculas, fuerza ionica del d isol-
vente, efectos polares, etc.
No obstante, y a falta de datos respecte a la influencia de es
tes factores, pueden resultar interesantes ciertos estudios realizados
con polîmeros sintéticos en soluciôn (43). En estos estudios parece de-
mostrado que existe una concentraciôn optima y otra concentraciôn crî_
tica mînima en relaciôn con la producciôn de enlaces cruzados entre ca
denas. Por encima de la concentraciôn ôptima, la velocidad de forma-
ciôn de enlaces cruzados por unidad de dosis decrece progresivamente,
hasta aproximarse al valor obtenido en estado sôlido. Del mismo modo,
si la concentraciôn decrece respecto de la concentraciôn ôptima, la fre
cuencia de enlaces cruzados disminuye también, hasta que se llega a
una concentraciôn critica mînima, por debajo de la cual ya no se détec
ta la formaciôn de estos enlaces. No obstante, esta concentraciôn c r î -
tica, a su vez, guarda una relaciôn inversa con la masa molecular de
la macromolôcula irradiada, lo que da ya una idea de la complejidad del
problema. Asî por ejemplo, si la irradiaciôn se lleva a cabo en un ran
go intermedio de concentraciôn, los enlaces cruzados pueden aparecer
- 44 -
en una fase inîcial pero una vez que, por efecto de la dosis, los proce
S O S de degradacion van reduciendo la masa molecular de los fragmen-
tos présentes, la concentraciôn crîtica cor respond i ente résulta ser su
perior a la que realmente existe en esos momentos, razon por la que de
ja ya de observarse la formacion de estos enlaces. En estas condiclo
nes, por consiguiente, a altas dosis no tendrân lugar reacciones de en
laces entre cadenas.
La apariciôn de enla
ces cruzados (f ig .7), al igual que
las rupturas dobles, afecta a la
distribuciôn de masas molecula-
res de la muestra irrad iada. Por
esta razon el acceso a su estudio
desde un punto de vista experimej}
ta l, se efectüa también en este ca
so desde esta perspectiva de va-
riaciôn de la masa molecular. Es
Fig . 7 . - Distribuciones de DNA: control (A) e irradiado (B y C) (Coquerelle, 1.969)
dec ir, conocidos Mn, Mw, Mn^ y Mwq, se puede calculer la frecuencia
de enlaces cruzados por nucleotido, C , segùn la siguiente expresion,
propuesta también por Charlesby (32):
C =2m
"3“ i —\ Mn Mw Mw,JMn;) (1.26)
o bién, si unicamente se utilizan promedios en numéro de masa molecu
la r ,segùn la siguiente expresion, mas sencilla:
c = 1— - 1 'l — = m ( - j ______ L )^ Mrio y Mn \ Mn,, Mn ) (1 .27)
- 45 -
1 .4 . M ODIFICADORES DEL EFECTO DE LA R A DIAC IO N
Segùn se ha explicado ya en 1 . 1 . , uno de los campos que o fre -
cen mayor atencion a los investigadores en el momento presente es el es
tudio de sustancias que puedan modificar los efectos de la radiacion ioni-
zante sobre los seres vivos.
Sea cual fuere la accion concreta de tales sustancias, résulta
logico pensar que en ùltima instancia tengan alguna implicacion sobre los
procesos que se ban explicado hasta aqui, referentes a la accion de la ra
diacion sobre el DNA (8).
Dados los planteamientos del presente trabajo, lo que se expo
ne a continuacion harà referenda exclusivamente a los sensibilizantes.
No se tratara aquî, por consiguiente, lo relativo a las sustancias rad io-
protectoras.
En 1 .972 se estableciô una clasificaciôn de los radiosensibill_
zantes (44), aùn vigente, tomando como criterio su modo de accion. Se
gùn esta clasificaciôn, que no excluye la existencia de otras clases, ni
implica que los grupos sean completamente independientes entre s î, los
radiosensibil izantes se dividen en:
- Oxîgeno-mimêticos
- Analogos a los precursores del DNA
- Compuestos citotoxicos activados radioquîmicamente
Inhibidores de los procesos de reparaciôn
- Agentes enlazantes e intercalantes del DNA
- Agentes que afectan a los niveles de grupos tiolicos en
la célula
- 46 -
A continuacion se describe cada uno de estos tipos, si bien de
una forma breve, debido a que se trata de hipôtesis complejas, aùn no
confirmadas plenamente en la mayor parte de los casos, remitiendo a la
bibliografîa cualquier consulta o ampliacion (8) (44) (45).
- Oxîgeno-mimétîcos
Se incluyen en este grupo aquellos compuestos que
muestran un comportamiento sim ilar al del en su ac
cion radiosensibilizante. El interes de estas sustancias
rad ica fundamental mente en que la resistencia de ciertos
tumores a la radiacion se suele interpreter por la existen
cia en ellos de células hipôxicas.
Si bien hay puntos que permanecen bastante oscuros
en relaciôn con el modo de accion del y demas radio
sensibil izantes de este grupo, en general, todos ellos son
sustancias de una alta afinidad electrônica, propiedad que
les hace capaces de captar los electrones solvatados y ra
dicales inducidos a consecuencia de la radiacion, aumen-
tando asî su vida media y radio de accion. En el caso de
que esta interaccîôn alcance a los radicales producidos so
bre la molécula del DNA, podrîan dar lugar ademas, a in -
terferencias con los procesos de reparaciôn.
La ventaja que sueIen presenter estos oxîgeno-miméti-
cos frente al propio reside en su mayor capacidad de
difusiôn por la poblaciôn hipôxica, hecho que se debe a su
mas lenta destrucciôn metabôlica.
- 47 -
- Anâlogos a los precursores del DNA
Pertenecen a este tipo ciertas pirimidinas halogena-
das en las que el H de la posicion 5 de una citosina o ura
cilo se sustituye por un halôgeno.
Su accion estriba en que la célula es incapaz de dis-
tinguir las pirimidinas normales de las halogenadas, por
lo que ambas se incorporan igualmente al DNA en el mo
mento de su sîntesis. Ademas, parece que facilitan la
transmision de la energia a lo largo de la cadena del a eu
do, produciendo un incremento considerable en el numé
ro de lesiones inducidas por la radiacion. Su inconvenien
te radica en que no sensibilizan las células que no sinte-
tizan DNA en ese momento y en que se incorporan por
igual a células tumorales y normales.
- Compuestos citotoxicos activados radioquimicamente
Este grupo de radiosensibil izantes, quiza el menos
implicado directamente con el DNA, incluye aquellas sus
tancias que, como consecuencia de la radiacion, dan lu
gar a determinados derivados dentro de la célula, que re
sultan toxicos para ésta.
- I nhibidores de los procesos de reparaciôn
En este caso se trata de compuestos que interfieren
en los procesos de reparaciôn que poseen las células co
mo defensa frente a las lesiones producidas por la radia
cion sobre el DNA.
- 48 -
La accion de estos sensibilizantes puede radicar
tanto en la inactivacion de los sistemas enzimâticos
encargados de la reparaciôn, como en una profunda aj_
teraciôn de la lesiôn in ic ial, de modo que esta ya no
pueda ser reparada por la célula.
Este tipo de radiosensibil izantes es objeto de una
atenciôn especial en estos momentos, porque entre
otras cosas contribuiran a esclarecer los procesos im
plicados en el mecanismo de reparaciôn.
- Agentes enlazantes e intercalantes del DNA
Los compuestos encuadrados en este grupo, ademas
de que puedan producir la sensibilizaciôn por otros me-
canismos, parecen intimamente relacionados con el gru
po an terio r. Y es que résulta facil comprender que su
acoplamiento a la molécula de DNA dificulte el acceso
de algunas de las enzimas que intervienen en los proce
S O S de reparaciôn.
Este es, como se verà, el grupo que mas directa
mente se encuentra relacionado con el présente trabajo.
- Agentes que afectan a los niveles de grupos tiôlicos en
la célula
Parece ser que los grupos SH que se encuentran en
ciertas moléculas de la célula protegen a ésta de las ra
diaciones,por su capacidad para captar los radicales
radioinducidos y producir compuestos estables. Conse
- 49 -
cuentemente, aquellas sustancias que sean capaces de com
binarse con estos SH intracelulares disminuiran la capacd
dad protectora de la célula, dando lugar asi a un efecto de
sensibilizacion.
Résulta facil comprender que, tanto la accion protec
tora de los SH como,por el contrario, su anulaciôn por es
te tipo de sensibil izantes, tendrân una gran repercusiôn
en relaciôn con la acciôn del y demâs sensibil izantes
oxigeno-miméticos, hecho que pone de manifiesto la inter
relaciôn entre algunos de los mecanismos de acciôn de los
radiosensibiIizantes y , por tanto, las Iimitaciones de la
clasificaciôn an terio r.
Los compuestos estudiados en este trabajo: un agente antîma-
lârico, varios tipos de antîbiôticos y un complejo inorgânico de Pt que
recientemente se ha revelado como un importante agente antitumoral se
eligieron por varias razones. En primer lugar, por tratarse de sustan
cias que, segùn la informaciôn bibliogrâfica (46) (47) (48), se unen al DNA,
siendo a su vez prototipos de distintas maneras de uniôn: intercalaciôn, en
laces covalentes, interacciones de tipo iônico y enlaces aùn no détermina
dos de forma c lara . En segundo lugar, porque existîan datos sobre estos
compuestos relativos a propiedades antitumorales o experimentos de irra
diaciôn, a diferentes niveles de complejidad biolôgica, que los hacîan par
ticularmente interesantes en relaciôn con los objetivos de este trabajo.
A continuaciôn se detallara en particular cada uno de estos
compuestos.
- 50 -
1 .4 .1 . Daunomicina
La daunomicina es un antibiotico con propiedades citotoxicas
y antimitoticas (49), que se obtiene del "Streptomyces peucetius” . A c-
tualmente esta clasificado como uno de los agentes mas poderosos en el
tratamiento de leucemias agudas (50) y ha sido objeto de estudio también
en relaciôn con los procesos de reparaciôn celular (51).
Este antibiotico, junto con otros (nogalamicina, cinerubinas,
pirnomicinas, adriamicina . . . ) pertenece al grupo denominado "antraci-
clinas” (52).
La estructura quîmica y la configuraciôn de la daunomicina se
conocen actualmente con detal le (53) (fig . 8) . Consta de un pigmento (dai£
nomicinona) unido a un amino-azûcarO OH
(daunosamina), ambos facilmente sé
parables por hidrôlisis.
,COCHj
[.CH,
HO
Figura 8 . - Daunomicina
Los principales efectos
bioquîmicos de la daunomicina, adria
micina y otros antîbiôticos similares
estan relacionados con los procesos
de sîntesis de los acidos nucleicos,
considerândose en la actualidad que es precisamente la uniôn directe de
estos compuestos con el DNA la responsable de las interferencias que
se observan cuando el DNA actua como molde (54).
Son numerosas las pruebas que evidencian la uniôn entre el
- 51 -
DNA y la daunomicina. A continuacion se harà una breve referencia de
algunas de el las, deducidas de diferentes estudios realizados (55X56).
La presencia con junta "in vitro" de DNA y daunomicina da lu
gar a que se observen ciertas alteraciones en las propiedades quîmico-
fîsicas de ambas sustancias. Por parte del DNA se observa un descenso
en el valor del coeficiente de sedimentaciôn, un incremento en la visco-
sidad y cambios en el comportamiento relativo a los procesos de desnatu
ralizaciôn-renaturalizacion y actividad optica. Por parte de la daunorm
cina se observan variaciones en su espectro de absorciôn, émision fluo
rescente y comportamiento polarogrâfico.
Sin embargo, el DNA previamente tratado con desoxirribonu
cleasa, el DNA apurînico o los derivados de pirimidina (nucleôsidos,
nucleotidos o bases libres) no presentan variaciones en sus propiedades
quimicofisicas cuando se ahaden a una disoluciôn de daunomicina. Solo a
altas dosis se observan algunos cambios en el espectro visible de estos
derivados quîmicos, cambios que, de todos modos, son distintos a los ob
servados en el DNA.
Los hechos anteriores se han de considerar, por consiguiente,
como manifestaciones de la formacion de un complejo entre la daunomicina
y el DNA. En la formacion de este complejo intervienen los siguientes fac
tores (55): 1) integridad de la molécula del antibiotico; 2) grado de polime
rizaciôn del DNA; 3) concentraciôn de ambos compuestos; 4) relaciôn mo
lar DNA/daunomicina; 5) composiciôn del disolvente.
Algunas de las variaciones observadas en ciertas propiedades
- 52 -
quîmico-fîsicas del DNA como consecuencia de la formacion del complejo
con la daunomicina, concretamente el aumento de viscosidad y la disminu
cion en el coeficiente de sedimentaciôn, se asemejan a las producidas por
la acridina y otros compuestos que se intercalan entre las bases del DNA
(57). Por este motivo, una de las primeras hipôtesis sobre la naturaleza
de la uniôn fue la de intercalaciôn entre las bases nitrogenadas (56) (58).
Sin embargo, existen también ciertas diferencias respecto al
comportamiento de las acridinas, que evidencian que la uniôn es mas fuer
te que la que se produce por una simple intercalaciôn del antibiôtico en
tre las bases del DNA. Asî por ejemplo, exceptuando el caso del MgCI^,
que a bajas concentraciones provoca la disociaciôn del complejo, éste
subsiste a fuerza iônica elevada y altas temperaturas, observandose in
cluse un aumento en la Tm del DNA (55).
Teniendo en cuenta todo lo anterior, se ha propuesto la exis
tencia simultanea de très tipos de interacciôn, responsables de la estaW
lizaciôn del complejo (59). El primer tipo de interacciôn es de naturale
za electrostatica, y tiene lugar entre el grupo amino protonado del azù-
car y el grupo fosfato cargado negativamente. Un segundo tipo de interac
ciôn se produce por enlaces de hidrôgeno, hecho que se demuestra por el
efecto que sobre el complejo ejercen ciertas sustancias como formamida
o urea. La tercera interacciôn corresponde al proceso de intercalaciôn,
el cual se ve favorecido por la estabilizaciôn hidrofôbica débil que tiene
lugar entre la molécula intercalante y los pares de bases adyacentes y por
la disminuciôn que se observa en la repulsiôn entre los grupos fosfato
cargados negativamente como resultado del incremento producido en las
distancias entre los pares de bases.
- 53 -
1 .4 .2 . Cromomîcina
La cromomîcina A^ es uno de los antîbiôticos que se obtienen
del "Streptomyces griseus". Entre otras cosas es conocido por su acU
vidad antitumoral frente a varios tipos de tumores expérimentales (60),
y ha sido usado incluso en terapeutica mêdica frente a ciertos cânceres
humanos (61) con el nombre de "Toyomicin". Sin embargo, su aplicaciôn
clînica se ha visto limitada, debido a su toxicidad y a las propiedades in
munorrepresivas que présenta (62) (63).
Se suele considerar a la cromomîcina A^ como prototipo del
grupo que forma junto con la m itram i-
cina y la olivomicina, antîbiôticos con
los que guarda üna gran similitud, tan ^
to en su estructura quîmica como en
lo referente a mecanismos de acciôn
(46) (47).
En cuanto a su estructura
quîmica, la cromomîcina esta cons fig u ra 9 . - Cromomîcina
tituîda por un pigmento central, la cromomicinona, y dos cadenas laté
ra les , en las que entra a formar parte el azucar cromosa (64) (fig . 9).
La cromomîcina A^ forma complejos estables con el DNA na
tive. La formaciôn de estos complejos (que no se producen con el RNA)
se pone de manifiesto por las alteraciones que se observan en el espec
tro visible del antibiôtico, asî como por los cambios producidos en la
I I * . C H i: Ac . CM, CO
- 54 -
densidad de flotaciôn del DNA (56). Sin embargo, la viscosidad del DNA
no expérimenta cambios. Tampoco se observa variacion en el valor de
su coeficiente de sedimentaciôn, a pesar de que se demuestra que el anU
biotico sedimenta conjuntamente con el DNA (65). Este comportamiento
hidrodinàmico del complejo sugiere ya que la cromomîcina A^ no se in
tercala entre las bases nitrogenadas del DNA (66). Por otra parte, el he
cho de que el complejo pueda disociarse por extraccion con disolventes
orgânicos indica que en la union tampoco existen enlaces de tipo covalen
te (67).
Al igual que en el caso de la actinomicina, la interacciôn en
tre el DNA y la cromomîcina A depende del contenido en guanina del DNA3
y de que este se encuentre en estado nativo (68). Concretamente, parece
que el grupo cromôforo del antibiôtico requiere un grupo amino en posi-
ciôn 2 de una purina (69). Sin embargo, existen otros detal les que diferen
clan el comportamiento de la cromomîcina A^ del de la actinomicina, como
lo ya mencionado acerca de la no intercalaciôn, el hecho de que la Tm del
DNA se incremente sôlo a altas concentraciones de antibiôtico (superiores
a 100 yg/ml) y la necesidad de la presencia de cationes Mg^^ para que se
forme el complejo (70) (71). En relaciôn con esto ultimo, el hecho de que
las variaciones espectrales maximas se observen cuando el antibiôtico y
el catiôn Mg^^ se encuentran a una relaciôn molar 1:1 (58) sugiere que
previamente a la interacciôn DNA-antibiôtico se produce la interacciôn
cromomîcina A^-Mg^^, teniendo lugar algùn fenômeno de isomerizaciôn
en la parte cromôfora del antibiôtico.
No esta clara aun la funciôn de las cadenas latérales en la
- 55 -
union, si bien parecen tener una inf luencia no despreciable en el proce
50, posiblemente relacionada con los fenômenos de cooperatividad que
se han observado en el curso de la formacion del complejo (72).
1 .4 .3 . Antramicina
La antramicina es un poderoso antibiôtico derivado del "S tre^
tomyces refuineus", que présenta propiedades bactericidas y antitumo
rales (73) (74) (75). Inhibe la sîntesis de DNA y RNA en células de mamî
fero (76) y su estructura quîmica (fig . 10) esta confirmada por sîntesis
total (77).
OH OH
Kohn y otros (76) demostraron que la antramicina reacciona
"in v itro" con el DNA, si bien el corn
plejo que se forma présenta ciertas
caracterîsticas especiales, que lo d_[
ferencian de los habitualmente forma
dos por uniôn no covalente entre el
DNA y otros antibiôticos. Este hecho
hace que no esté esclarecida la natu
raleza de la uniôn, aunque existen da
tos en favor de la hipôtesis de que en
ella se vea implicado algun tipo de en
lace cova lente labil. En consistencia
con este supuesto se hallan las observaciones que se hacen a continua
ciôn, procédantes del trabajo de Kohn y Spears (78).
CONH
Figura 1 0 .- Antramicina
La velocidad de reacciôn del antibiôtico con el DNA es rela
- 56 -
tîvamente lenta, résulta catalizada por los îones en un rango amplio
de pH y disminuye con la fuerza ionica del medio. Los cationes divalen-
tes Mg^^ y Mn^^, sin embargo, reducen mucho mas dràsticamente esta
velocidad, hecho que parece confirmer la existencia de algùn tipo de
union especîfica de estos iones con el DNA.
Una vez formado, el complejo DNA-antramicina résulta p a r-
ticularmente astable. Résisté las dialisis prolongadas, precipitaciones
con alcohol, filtraciones por gel, presencia de lauril sulfato o ion Ag^.
No obstante, sî se observa su disociaciôn a valores de pH inferiores a
3.
Un punto importante a considerar es que, si bien la forma
ciôn del complejo produce una elevacîôn de la Tm del DNA, no impide
su desnaturalizaciôn por medio alcalino, observandose que la cromomj^
cina A^ continua unida a las cadenas simples después de que estas se
han separado. En estas condiciones no serîa posible una reacciôn d i-
recta entre las cadenas simples y el antibiôtico.
La antramicina parece mostrar una elevada especificidad por
el DNA nativo. No reacciona frente a RNA ni desoximononucleôtidos. Los
polîmeros del tipo del RNA, rG :rC , tampoco reaccionan con el antibiôti
co, mientras que, por el contrario, el dG:dC sî reacciona. Este ultimo
hecho pone de manifiesto la preferencia del antibiôtico por estructuras
del tipo del DNA. Se observa asimismo selectividad respecto a la se-
- 57 -
cuencia de bases del DNA, aunque este punto permanece aùn bastante os
euro.
En relaciôn con los DNA alterados por desnatural izaciôn o
alquilaciôn extensiva, las velocidades de reacciôn con la antramicina se
ven notablemente reducidas. La dependencia, en este caso positiva, de
las velocidades de reacciôn del DNA desnaturalizado respecto de la fuer
za iônica sugieren una sensibilidad de la reacciôn a la conformacion.
Por ùltimo, la estabil idad quîmica de la antramicina se ve no
tablemente incrementada una vez que forma parte del complejo.
Lo mencionado anteriormente, junto con el hecho de que la es
tructura quîmica de la antramicina, carente de estructura planar, puntos
de carga o cadenas latérales, résulta peculiar respecto a otros antiblôU
C O S , hace que no se pueda pensar en un modelo obvio de uniôn con el DNA,
teniéndose que rechazar, concretamente, las uniones por simple interca
laciôn entre pares de bases o los enlaces de tipo iônico. Incluso, aunque
las caracterîsticas anteriores sugieren la formaciôn de un enlace cova-
lente entre las dos moléculas, no résulta inmediatamente évidente, del
estudio de la estructura del antibiôticq qué grupo podrîa ser el réacti
vé. Se ha encontrado, sin embargo, que los puntos libres 9 y 10 de la
molécula de antramicina son necesarios, tanto para la interacciôn con
el DNA como para su actividad biolôgica (79),.
1 .4 .4 . c i s-d ic I orod i am inp latino (I I)
Como consecuencia del descubrimiento accidentai de Rosenberg
( *) En adelante, para re ferirse al complejo Pt(NH^)^ Cl^ se usarâ la
abreviatura DDF (diclorodiamin platino (I I) ) .
- 58 -
en 1 .964 (80), han sido numerosos los trabajos que se han real izado en
relaciôn con las propiedades antitumorales de determinados complejos
de platino (81), especialmente el cis-DDP (82) (fig . 11), llegândose in
cluso en el caso de este ùltimo a su u tiliza -
ciôn en terapeùtica clînica (83). No obstan-
te, el uso mêdico de este complejo inorgàru / \
co se ha visto limitado a causa de su alta Cl
toxicidad. Por este motivo, actualmente seF ig . 11 . - cis-diclorodiamin
investiga de forma intensa en la sîntesis de ,platino ( I I )otros compuestos de platino (84), a fin de
encontrar algùn derivado nuevo que présente menor toxicidad para una
actividad antitumoral sim ilar o superior a la del c is -D D P .
Existen en la bibliografîa recientes revisiones sobre el c is -
DDP (48) (85), asî como trabajos relacionados con la radiacion (86) (87).
En la actualidad se admite, en general, que las propiedades
antitumorales del cis-DDP son consecuencia de su union al DNA, union
que se realiza directa e irreversiblemente a través de sus bases nitro
genadas. De todos modos, y si bien parecen conocerse algunas caracte
rîsticas sobre esta union, los datos que se poseen distan aùn mucho de
explicar satisfactoriamente la inhibicion del proceso de repiicacion del
DNA (88) y , consiguientemente, la detenciôn de la division celu lar. Exis
ten incluso datos en favor de una posible union con el DNA que se encuen
tra en la superficie de la célula tumoral (89), union que ayudarîa a un mas
rapido reconocimiento y posterior destrucciôn de la célula por parte del
sistema inmunolôgico (90).
- 59 -
El hecho de que los desplazamientos caracterîsticos que se
observan en el espectro del DNA como consecuencia de la union de es
ta molécula con el cis-DDP se vean reducidos en presencia de concen
traciones elevadas de iones Cl en el medio (91) sugiere que la especie
realmente reactiva ha de ser algùn ion complejo cargado positivamente,
résultante de la pérdida de uno o ambos Iigandos -C l del c is -D D P . De
ser esto asî, el medio intracelular resultarîa ser mucho mas favorable
para la disociaciôn de los Cl del c is -D D P , por tener una concentra
ciôn (10 M) muy inferior a la correspondiente concentraciôn en el plas
ma (10 M) (92). Ahora bien, todo esto es posible, tanto para el isôme
ro cis como para el isômero trans del DDP, y, sin embargo, las propie
dades antitumorales y la capacidad de inhibiciôn de la repiicaciôn del
DNA fueron descubiertas como exclusivas del isômero cis (48). Los fac
tores estéricos parecen, por tanto, tener una especial importancia en es
te caso.
Teniendo en cuenta las distancias interatômicas entre los
distintos grupos del cis-DDP y del DNA se han propuesto mode los de
uniôn que estén en concordancia con los resultados expérimentales (85).
El modo prédominante de uniôn parece ser una reacciôn bifuncional del
complejo de platino, una vez que ha perdido los dos iones Cl , con las
posiciones N-7 de dos bases guanina adyacentes. Se tra ta rîa , por tanto,
de uniones intracadena dentro de una misma molécula de DNA.
La posibiIidad de uniôn intercadena dentro de la propia molé
cula de DNA parece presentarse con mucha menor frecuencia (88), es-
tando exclusivamente reservada a enlaces entre dos grupos amino en
posiciôn 6 pertenecientes a adeninas situadas en cadenas opuestas.
- 60 -
1 ,4 .5 . Mitomicina C
La mitomicina C (fig . 12) es un antibiotico aislado por prime
ra vez en 1.956 por Wakiki y otros (93) a partir del "Streptomyces caes
pitosus". Se observô pronto su actividad bactericida y antitumoral(94),
y actualmente se le puede considerar como
representativo de los antibiôticos que se
unen al DNA mediante enlace cova lente. En
la bibliografîa se puede consulter una rev[
siôn detallada efectuada por Szybalski e
lyer (95) sobre su mecanismo de acciôn,
asî como varios trabajos en los que la mito
micina C se ha estudiado como sensibilizan
te de la radiaciôn (96) (97).
OCHs
Figura 1 2 .- Mitomicina C
Previa reducciôn enzimâtica o quîmica, la mitomicina C forma
enlaces con varios tipos de moléculas biolôgicas (98), hecho que se
debe considerar a la hora de intentar explicar su actividad biolôgica .
Sin embargo, es évidente que el interés principal de este antibiôtico ra
dica en su capacidad para unirse directamente al DNA.
La mitomicina C , una vez activada, forma enlaces covalentes
entre las cadenas complementarias del DNA (99). El numéro de estas
uniones que se observan "in vitro" con DNA purificado depende de la re
laciôn antibiôtico/DNA en la incubaciôn y es muy superior al que se pro
duce cuando el antibiôtico se pone en contacte con organismes biolôgi-
cos (99). Estas investigaciones, por otra parte, indican que aproxima-
damente de cada 5 ô 10 moléculas de antibiôtico que se unen al DNA sô-
— 61 —
lo una forma un enlace cruzado entre las cadenas complementarias, que
dando el resto unido a una base de una de las cadenas sencillas mediante
alquilacion monofuncional. Aunque esta probada la naturaleza cova I ente
de estos enlaces (94), no parece completamente esclarecido el tipo de es
pecies reactivas a que da lugar la mitomicina C (100) (101), ni los luga-
res exactos de las bases en donde se producen las uniones. No obstante
hay datos que senalan una preferencia por las bases guanina (94) concre
tamente en su posicion N -7 (102).
Una de las consecuencias de la formacion de estos enlaces
entre las cadenas complementarias es que queda impedida la compléta
desnatural izaciôn del DNA (99).
Precisamente las propiedades letales que présenta este an
tibiôtico "in vivo" se explican asimismo desde esta perspectiva de la for
maciôn de enlaces entre las cadenas complementarias del DNA, enlaces
que imposibilitan la separaciôn de las dos cadenas en el proceso de re -
plicaciôn, y consiguientemente la sîntesis del DNA (103).
1 .4 .6 . Cloroquina
La cloroquina (fig . 13) puede considerarse como prototipo de
las 4-aminoquinoleînas, compuestos
conocidos desde hace tiempo por sus CH (CH;)
propiedades antimalaricas (104). CII3ONH
ClParker e Irv in , en 1.952
(105), fueron los primeros en obser Figura 1 3 . - Cloroquina
var que el espectro de absorciôn de
— 62 —
la cloroquina se ve alterado en presencia del DNA. Posteriormente
(106) se vio que la cloroquina y otros antimalaricos (mepacrina, quini-32
na) inhibîan la incorporaciôn de P al DNA y RNA. Asimismo estos
compuestos son poderosos inhibidores de la DNA polimerasa en siste
mas celulares (107) (108), hecho que segùn se admite actualmente de
forma general, se debe precisamente a su union directa con la molécu
la del DNA, union que asimismo se observa con determinadas 8-am ino-
quinoleînas (primaquina, pamaquina. . . ) (109).
Recientemente se ha estudiado la acciôn con junta de la ra
diaciôn y la cloroquina a nivel celular ( 110), encontrandose efectos ra
diosensibil izantes , que han sido atribuîdos a una inhibiciôn de los pro
cesos de reparaciôn por parte de la cloroquina (111).
Teniendo en cuenta que la uniôn de la acridina con el DNA
se realiza mediante intercalaciôn entre las bases (57), y que la cloro
quina posee en parte una estructura planar, Hahn y otros (112) propu-
sieron, como consecuencia de los estudios que realizaron sobre pro
piedades hidrodinamicas y ôpticas del complejo DNA-cloroquina, que
en la formaciôn de éste se producirîa también una intercalaciôn del
anil lo de quinoleîna entre las bases del DNA. Si bien los datos que ob-
tuvieron experimental mente no hacîan referencia a la funciôn de la ca
dena lateral de 1-4 diaminopentano en esta uniôn, sugirieron que las
diaminas alifaticas y la espermina podrîan considerarse como modelos
de esta cadena lateral de la cloroquina. Efectivamente, las diaminas
al ifaticas estabil izan al DNA, estando relacionado este efecto con la
distancia entre los dos grupos amino primarios (113). La espermina,
conteniendo dos grupos amino secundarios separados por 4 atomos de
- 63 -
carbono, résulta ser tan efectiva como la cloroquina en relaciôn con
la elevacion de la temperatura de fusion del DNA (114), e inhibe tam
bién a la DNA y la RNA pol imerasa.
Se sugirio entonces que las aminas alifaticas se unir fan io
nicamente con los grupos fosfato del esqueleto polipeptîdico (115), y
que, por consiguiente, de una forma analoga, la cadena lateral de la
cloroquina, quedando fuera del entorno (116) de los pares de bases en
tre los que se produce la intercalaciôn del anillo de quinoleina, interac
cionaria con los grupos fosfato de las cadenas complementarias a lo lar
go del surco menor de la doble hélice. Este modelo de union ha sido pos
teriormente criticado por Yielding y otros (117), quienes proponen una
nueva forma de union en la que si bien la cadena lateral de la cloroqui
na interacciona en la forma vista anteriormente, el anillo de quinoleîna
podrîa interaccionar con otros anil los de la misma cloroquina por apila
miento o, eventualmente, con las bases que se asoman al surco mayor
de la doble hélice.
Estudios I levados a cabo con ana logos de la cloroquina re -
velaron que tanto la actividad antimalarica como su afinidad por el DNA
varîan con la longitud de la cadena lateral en cuestion. La presencia de
esta cadena es, por otra parte, necesaria para que se produzca un en
lace fuerte , y los estudios realizados sobre distancias interatômicas
demuestran que présenta unas condiciones optimas para unirse e lectro j
taticamente con dos grupos fosfato ( 112).
I I . M ATERIALES Y METODOS, EXPERIM ENTALES Y DE CALCULO
- 65 -
2 .1 . TRATAM IENTOS BAS I COS DEL DNA
2 .1 .1 . Obtencion y aislamiento
En el presente trabajo se utilizo siempre DNA de timo de te r -
nera.
Para procéder a su obtencion, se extirpé el timo de un animal
recién sacrificado, e inmediatamente la glandula se traslado congelada al
laboratorio.
El proceso de aislamiento del DNA se llevo entonces a cabo se
gun el metodo de Kay y otros (118), ligeramente modificado, de acuerdo
con los pasos que se indican a continuacion.
Se trocean 50 g aproximadamente de la glandula y se homogene_[
zan durante unos minutos con 200 ml de SSC (NaCI 0 ,15 M + citrato triso -
dico 0,015 M). La suspension résultante se centrifuge a 12.000 xg durante
10 min a 0 ^ 0 . Sobre el sedimento obtenido se repite tres veces la homoge
neizacion y centrifugacion con 200 ml de NaCI 0 ,14 M.
A continuacion se procédé a la separacion de las proteinas,
anadiendo 130 ml de SDS (dodecil sulfato sodico) al 5% en etanol. Se agi
ta durante 3 horas, transcurridas las cuales se eleva la concentraciôn de
NaCI a 1 M con producto sôlido y se continua la agitaciôn hasta su disolu
ciôn compléta. El enturbiamiento que se observa entonces se debe a la pre
cipitaciôn de las proteinas. Se centrifuge esta soluciôn a 30 .0 0 0 xg duran
te 1 hora y finalmente se élimina el sedimento de proteînas.
Al sobrenadante se le ahade entonces un volumen igual de
- 66 -
etanol al 95%, con lo que se produce la primera precipitacion de DNA,
el cual se recoge, en forma de fibras blancas, haciendo g irar una vaM
lia de v idrio .
El paso siguiente es la purificacion de este DNA. Para ello-4
se redisuelve lentamente en 700 ml de NaCI 10 M. Cuando esta com
pletamente disuelto, se anaden 80 ml de SDS y se agita durante 1 hora.
Nuevamente se eleva la concentraciôn de NaCI a 1 M con producto sôli
do y se centrifuga durante un mînimo de 2 horas. El sobrenadante se de
canta del resto precipitado y de nuevo se précipita el DNA con un volu
men igual de etanol al 95%.
Todo el proceso de la etapa anterior se repite nuevamente
y las fibras de DNA obtenidas en el precipitado de esta segunda purifl
caciôn se lavan varias veces con acetona hasta que en esta no se obse£
ve turbidez.
Se seca el producto y se guarda en nevera, a 4° C , en am-
biente seco.
El rendimiento de este método,en el que, por las caracterîs
ticas del tejido util izado se hace innecesaria la existencia de un proce
SO de eliminaciôn de RNA, es aproximadamente de un 10% en peso se
co.
2.1 .2 . Conservaciôn y disoluciôn
Se prestô una especial atenciôn a este punto, debido a que
el DNA, ademas de presenter como cualquier otro material biolôgico
- 67 -
una gran delicadeza en cuanto a su conservacion, plantea otra serie de
problemas, mas especîficos, derivados de su excepcional tamano mole
cular. Estes problemas se manifiestan principalmente en la exagerada
lentitud de I os procesos de disolucion del DNA solido y en su fra g ili-
dad respecte a cualquier tratamiento mecanico brusco que comporte
fuerzas tangenciales (119), a consecuencia de las cuales se produce
una disminucion en su masa molecular.
Per todo e lle , se tomaron las debidas precauciones en rela
cion con la permanencia de las disoluciones a temperatura ambiente y
los procesos mecanicos de pipeteo, agitaciorv e tc . Asîmismo se procu
ré ev ita r, tante las reiteradas disoluciones del DNA solido come, per
el contrario, el almacenamiento prolongado de las mismas, especialmen
te las diluidas. Para cumplir este objetivo, se préparé cada cierto
tiempo una disolucién concentrada de DNA, a p artir de la cual se p re -
paraban las disoluciones de trabajo en el memento oportuno. La prepa-
racién de esta disolucién concentrada de partida se hizo de acuerdo con
los pasos que se indican a continuacién.
Se pesa una pequena porcién del DNA sélido con objeto de
obtener 50 ml de disolucién a una concentracién superior a 700 pg/ml
y se deja durante un dîa con sélo unas gotas de NaCI 0,01 M. Después,
y progresivamente, se van anadiendo cantidades cada vez mayores del
mismo disolvente, hasta llegar a un total de 50 ml. Este proceso dura
varies dias, durante los cuales se procura evitar toda agitacién. F i -
nalmente, la disolucién se dializa frente al disolvente comun de traba
jo (NaCI 0 ,2 M + tampén fosfatos 0,025 M, pH 7 ,3 ) en e1 que se inclu- -4
ye EDTA 10 M. La adicién de este agente quelante tiene como fin a li-
- 68 -
dad la captura de los posibles iones que hubiera en el medio, los
cuales activarîan cualquier resto de DNAsas que quedara como impure
za, observàndose con el tiempo una degradacion del DNA. (En los ca
ses en que el modificador de la radiacion estudiado requirio en algùn
proceso la presencia de iones Mg^^, la alîcuota correspondiente tomada
de la disolucion de partida se dializô nuevamente frente al disolvente
comûn de trabajo con objeto de eliminar el ED TA ).
La concentracién de esta disolucién de partida de DNA se de
terminé por lectura espectrofotométrica y para su almacenamiento se
anadieron siempre unas gotas de cloroformo, con objeto de impedir todo
posible crecimiento bacteriano (120) ( 121).
Los procesos anteriores se realizaron siempre en camara
f r îa , a 8° C .
2.1 .3 . Desnaturalizacién
La desnaturalizacién del DNA se llevé siempre a cabo por
el mêtodo alcalino de Davison y otros (122).
Segùn este método, a 1 vol. de muestra de DNA en solucién
se le anade 1 vol. de NaOH 0 ,2 M, con lo que se produce la desnatura
lizacién. Después de 30 sg a temperatura ambiente, y con el fin de impe
dir la renaturalizacién, se anade 1 vol. de formaldehido al 37%. Por û_[
timo, y para neutra lizar, se anade 0,13 vol. de K^HPO^ IM .
. En el présenté trabajo las muestras asî desnaturalizadas se
- 69 -
dejaban dializando durante la noche frente al disolvente comun conte-
niendo un 2% de formaldehido, medio en el que siempre se realizaron
todas las caracterizaciones posteriores de ultracentrifugacion y med_[
das espectrofotometricas.
- 70 -
2 .2 . M O DIFICADO RES DEL EFECTO DE LA RA DIACIO N
2 .2 .1 . Daunomiclna
Se préparé inicialmente una disolucién de DNA en disolven
te comun a una concentracién de 400 yg/m l, eliminando todo resto de
EDTA procedente de la disolucién concentrada de partida mediante dia
lisis frente al disolvente comun.
Por otra parte, se realizaron experimentos de prueba de
formacién del comp le jo a relaciones DNA; antibiético de 3 ,5 : 1 y 8 ,7 : 1
(55), resultando ser esta ultima relacién la mas ajustada a los propés_[
tos del trabajo.
En consecuencia, se préparé una disolucién de daunomicina -41,52 .1 0 M en el disolvente comun, y se mezclaron posteriormente
volùmenes iguales de esta disolucién y de la disolucién de DNA. Se ob
tuvo asî una disolucién de complejo, en la que, manteniendose la re la
cién an terio r, la concentracién en DNA fue de 200 yg /m l, la habituai
en el momento de la irrad iacién .
La irradiacién del complejo se llevé a cabo suministrando
dosis de : 6 , 9, 12, 15, 18, 21, 24 y 27 Krad. Una parte de las alîcuo-
tas cor respondi entes al control y a cada una de las dosis se destiné d_|
rectamente a su estudio de sedimentacién, sin disociacién del comple
jo , mientras que otra parte se sometié a dialisis antes de ser cen tri-
fugada. Asimismo se reservaron fracciones destinadas a desnaturali-
zacion y estudios espectrofotométricos.
- 71 -
El procedimiento seguido con las muestras destinadas a d iâ -
Iisis consistio en una primera diluciôn con un volumen igual de disolven
te comûn conteniendo MgCl^ 0 ,4 M. Posteriormente se sometieron las
muestras a dial isis prolongadas frente a concentraciones cada vez me-
nores de MgCI^ en el mismo disolvente, hasta que los ûltimos cambios
de medio correspondieron a disolvente comûn.
Los calculos de sedimentacién correspondientes a las mues
tras irradiadas se hicieron siempre frente a contrôles que hubieran se
guido idéntico proceso.
2 .2 .2 . Cromomicina
Se préparé una disolucién inicial de DNA en disolvente co
mûn a 400 yg /m l, eliminando los restos de EDTA procedentes de la di
solucién concentrada de partida mediante dial isis frente a disolvente co
mûn.
Por otra parte se prepararon; una disolucién de cromomicina
A y una disolucién de MgCI , ambas en disolvente comûn y a una concen —5
tracién 6 . 10 M, mezclandose a continuacién volùmenes iguales de es
tas dos disoluciones.
Del mismo modo, se mezclaron posteriormente volùmenes
iguales de la disolucién de DNA y de la disolucién correspondiente al
complejo cromomicina A^-M g^^, incubandose esta nueva mezcla a
37° C durante 15 min (67). Tanto antes como después de la incubacién
se separaron alicuotas destinadas a su lectura en el espectrofotémetro.
- 72 -
Procedîendo de esta manera se consigue que en el complejo la concen-
traciôn de DNA sea la habituai del momento de la irrad iacién , 200
M I 2+
yg/m l, siendo por otra parte de 1 ,5 .10 M la concentracién, tanto pa
ra la cromomicina A^ como para el ién Mg
Las dosis de radiacién suministradas fueron de: 4 , 6 , 9 , 12,
16, 18, 21 , 22 y 24 Krad. Las alicuotas correspondientes a cada dosis
se divîdieron en distintas porciones, destinadas a experimentos de lec
turas en el espectrofotémetro, desnatural izacién y ultracentrifugacién.
Debido a que la cromomicina A^ no produce variaciones en
el coeficiente de sedimentacién del DNA (véase 1 .4 .2 .) no se procedié,
en este caso, a disociar el complejo por dial isis en las muestras desU
nadas a los experimentos de sedimentacién.
2 .2 .3 . Antramicina
Se préparé inicialmente una disolucién de partida de antra
micina en el disolvente comûn de trabajo a una concentracién de 31 ,6
m g /l, incubandose durante 1 hora a 37° C , con objeto de conseguîr
un espectro estable (78).
Por otra parte , se préparé una disolucién de DNA en el d i
solvente comûn a una concentracién de 400 yg /m l.
Con el fin de formar el complejo DNA-antram icina, se mez
claron volùmenes iguales de las disoluciones anteriores, incubandose
la mezcla a 26° C durante 100 min, tiempo de incubacién que se consi-
- 73 -
dero optimo, después de haberse efectuado varios experimentos de prue
ba a este respecto. Procediendo de esta manera se obtuvo una disolu
cion de complejo que presentaba una concentracién en DNA de 200 Jig/ml,
la habitual en el momento de la irrad iacién , y una concentracién en antra
micina de 15,8 m g/l.
En la irradiacién del complejo DNA-antramicina se suminis-
traron dosis de : 6 , 12, 18, 20, 24, 26, 32 y 38 Krad. Las alicuotas co
rrespondientes al control y a cada una de las dosis se dividieron en por
ciones, con objeto de rea liza r estudios espectrofotométricos, dial isis,
desnatural izacién y sedimentacién.
La escasa efectividad de las dialisis en relacién con la diso
ciacién del complejo, confirmada por estudios espectrofotométricos,
obligé a rea liza r los experimentos de sedimentacién con muestras no
dializadas. De todos modos, los calculos posteriores relatives a las
muestras irradiadas se hicieron en todo caso frente a contrôles que su
frieron idéntico proceso.
2 .2 .4 . cis-diclorodiaminplatino (I I)
Se préparé inicialmente una disolucién de DNA a 400 yg/ml
en NaCI 2 .10 M, eliminando los restos de disolvente de la disolucién
concentrada de partida mediante dialisis frente al nuevo disolvente. Es
te cambio de medio se hizo con el fin de evitar la interferencia de con-
centraciones elevadas de iones Cl en la formacién del complejo (véa
se 1 .4 .4 . ) .
- 74 -
Por otra parte, se prepare una disolucion de cis-DDP en-4
agua destilada, a una concentracién de 6 ,7 .1 0 M,
Con objeto de formar el complejo DN A-cis-DDP se mezcla
ron volùmenes iguales de las disoluciones anteriores y se incubé la mez
cia durante 7 horas a 37° C (91). De este modo, se consiguié una re la
cién P t/P = 0 ,5 en el complejo, quedando el DNA a una concentracién
de 200 yg/m l, que fue la habituai en el momento de la irradiacién.
A esta disolucién de complejo se le suministraron unas do
sis de: 6 , 12 y 18 Krad. Las alicuotas correspondientes al control no
irradiado y a cada una de las dosis fueron divididas en porciones, con
objeto de rea liza r lecturas espectrofotométricas, d ia lis is , desnatura
lizacién y centrifugacién,
Previamente a los experimentos de sedimentacién, las mues
tras se dializaron frente al disolvente comun de trabajo , con objeto de
que la sedimentacién se desarrollara en las condiciones habituales de
disolvente.
2 .2 .5 . Mitomicina C
Se préparé una disolucién de DNA en disolvente comûn a
400 y g /m l.
Por otra parte , se préparé una disolucién de mitomicina C
a una concentracién de 0 ,2 mg/ml, también en el disolvente comûn de
trabajo.
- 75 -
Debido a que la mitomicina C da lugar a enlaces entre las
cadenas complementarias dentro de la propia molécula de DNA (véase
1 .4 .5 . ) , y que este hecho plantea consiguientemente problemas a la
hora de la desnaturalizacién, se opté, en el caso de este compuesto
por estudiar sélo el efecto de su presencia en el momento de la ir ra
diacién, renunciando asî a la activacién necesaria para la formacién
del complejo.
Se mezclaron enfonces volùmenes iguales de las disoluclo
nés anteriores, con lo que se obtuvo una mezcla en la que la concen
tracién de DNA fue la habituai en el momento de la irradiacién (200
yg/ml) y la de mitomicina C , de 0,1 mg/ml.
La irradiacién se Ilevé a cabo en las condiciones habitua
les suministrandose dosis de: 6 , 12, 18, 24, 30, 36, 42 y 48 Krad.
Las alîcuotas correspondientes a cada dosis, junto con una del control
no irradiado, se dividieron en porciones, destinadas a estudios espec
trofotomêtricos, d ia lis is , desnatural izacién y sedimentacién.
En un experimento final se realizé el estudio espectrofoto-
métrico de las variaciones observadas al irrad ia r por separado mues
tras de mitomicina C, DNA y DNA + mitomicina C , en las mismas con
diciones de concentracién y dosis que en los casos anteriores.
2 .2 .6 . Cloroquina
Se préparé inicialmente una disolucién de DNA en disolven
te comun a 400 yg/m l.
- 76 -
Por otra parte , se préparé una disolucién de cloroquina-4
8 .10 M también en disolvente comun.
Se mezclaron volùmenes iguales de estas dos disoluciones,
con lo que se obtuvo una disolucién de complejo DNA-cloroquina en la
que la concentracién de DNA fue la habituai en el momento de la i r r a --4
diacién, 200 yg /m l, y la de cloroquina, de 4.10 M.
La irradiacién se Ilevé a cabo suministrando dosis de: 12,
15, 18, 21 , 27, 30, 39 y 45 Krad. Las alîcuotas correspondientes a ca
da dosis, junto con la del control no irradiado, fueron divididas en por
ciones destinas a experimentos de lectura espectrofotométrica, d ia li
s is , desnaturalizacién y ultracentrifugacién.
Antes de efectuar los estudios de sedimentacién, se proce
dié a la disociacién del complejo, con objeto de eliminar de éste la cio
roquina. El lo fue debido a que la cloroquina, al presentar absorbancia
a 260 nm y modificar ligeramente el valor del coeficiente de sedimenta
cién del DNA (véase 1 .4 .6 .) podrîa in te rfe rir en el momento de la cen
trifugacién.
Las dialisis se llevaron a cabo frente a disolvente comun_2
conteniendo inicialmente MgCI^ 10 M. En los cambios de medio pos
teriores se redujo progresivamente la concentracién de MgCI^, hasta
que finalmente la dialisis se efectué frente a disolvente comun. El tiem
po total de dialisis necesario para la eliminacién de la cloroquina del
complejo no fue nunca superior a 48 horas.
- 77 -
2 .3 . IRR A D IA C IO N DE LAS MUESTRAS
La irradiacién de las muestras se efectué en la Junta de Ener
gia Nuclear utilizando un tubo de rayos X Isomatix, Modèle Milan, de
250 Kv.
2 .3 .1 . Condiciones de la irradiacién
Antes de cada irradiacién se procedîa al calibrado del apara-
to, con objeto de obtener unas condiciones de flujo constantes, de aproxj^
madamente 200 rad/min,fijando el vol ta je (250 Kv), amperaje (8 mA), f i l
tre (1 mm de Cu) y distancia desde la boca del tubo a la muestra (5 cm).
En el momento de la irrad iacién , la concentracién de DNA en
las disoluciones, tanto si se encontraba libre como si formaba parte de
un complejo, fue siempre de 200 yg /m l. Se eligié esta concentracién po_r
que, ademas de encontrarse en otros trabajos sobre irradiacién de DNA
(33) (34) (37) (123) (124), résulté ser la minima posible, habida cuenta de
los procesos de dilucién, desnatural izacién y dialisis que posteriormen
te siempre tenîan lugar. El disolvente fue el comûn de trabajo, con la ûm
ca excepcién del caso del cis-DDP (véase 2 .2 .4 . ) .
El recipiente de irradiacién fue siempre un vaso de vidrio cJ
lîndrico, de 4 cm de diametro y 2 ,5 cm de altura . Previamente a cada
irradiacién se lavaba con mezcla crémica, con objeto de evitar toda po
sible contamînacién con materia organica.
Las muestras se trasiadaban en un recipiente con hielo, si
bien la irradiacién se efectué siempre a temperatura ambiente.
78 -
2 .3 .2 . Dosimetria
El control de las dosis suministradas se efectuo por dosime
tria Fricke (125), en las mismas condiciones en que se irradiaban las
muestras.
La aplicacion de las distintas dosis se consiguio separando
alîcuotas a diferentes tiempos.
Aunque en el presente trabajo las dosis suministradas cubrie
ron un rango entre 4 y 50 Krad, en el estudio particular de cada modifica
dor, las dosis estuvieron logicamente condicionadas por las caracterîs -
ticas de radiosensibil idad presentadas por el propio modificador.
- 79 -
2 .4 . TE C N IC A S DE MEDIDA
2 .4 .1 . Ultracentrifugacion analitica
Las medidas de velocidad de sedimentacién se llevaron a cabo
en una ultracentrffuga Beckman, Modelo E , dotada de monocromador, mu_[
tip lexer, sistema de deteccién fotoeléctrica y registre grafico (126). Es
tos elementos permiten, una vez que se ha seleccionado una longitud de
onda (entre 200 y 2000 nm), centrifugerdentro de un mismo experimento,
hasta 5 cêlulas distintas, las cuales se pueden reconocer por separado
en el registre grafico que se efectua simultaneamente.
2 .4 .1 .1 . Condiciones de centrifugacién
La velocidad de centrifugacién fue de 20.000 r .p .m . en los es
tudios de caracterizacién del DNA native y desnaturalizado, asî como en
todos los experimentos posteriores de centrifugacién de DNA native. En
los casos de DNA irradiado y posteriormente desnatural izado, la velocJ
dad se incrementé a 36.000 r .p .m .
En experimentos iniciales de prueba, realizados a diferentes
velocidades de g iro , se puso de manifiesto que las velocidades anterio
res eran las mas adecuadas para el intervale de masas moleculares con
que se trabajé,permitiendo efectuar un numéro suficiente de registres.
Por otra parte, y como era de prever (127), a esas velocidades no se
observaron, dentro del mar gen de e rro r experimental del instrumente
( i 0,1 S ), efectos de influencia de la velocidad en el valor de los coe-
ficientes de sedimentacién.
- 80 -
El rotor util izado en todos los experimentos fue del tipo An G
de Titanio, con 6 orific ios, en los que se alojaban un contrapeso y las 5
células, siendo estas de sector dob le y pieza central K e l-F .
Las disoluciones se introducîan en el sector A de las células
(126) mediante una jeringuilla desprovista de aguja, con objeto de evitar
al maximo las posibles degradaciones del DNA por fuerzas tangenciales.
El sector B de la misma célula se destinaba al disolvente, cuidando siem
pre de introducir una cantidad de éste ligeramente superior a la de diso
lucion, con objeto de asegurar que a lo largo del registre quedara resta -
da la absorbancia debida al disolvente.
El proceso de sedimentacién se siguié mediante sistema ép ti-
co de absorcién a una longitud de onda de 265 nm, la cual permite disponer
de mayor cantidad de luz que a 260 nm sin, por otra parte, alejarse dema
si ado del maximo del DNA (126) (128). La cal ibracién en el registre graf_[
co vino dada por cinco escalones, proporcionados por el sistema e lec tré -
nico, correspondientes cada une de elles a un incremento de absorbancia
de 0 ,2 U .D .O .
En cada experimento, el numéro minime de registres fue de 6
para cada célula, lo que supuso, en general, un tiempo de sedimentacién
de 120 min aproximadamente, comenzandose a efectuar el primer registre
una vez transcurridos los primeros 5 minutes de centrifugacién.
En los casos en que se centrifugé DNA irradiado y posterior
mente desnatural izado, la mayor velocidad de sedimentacién del control
respecto de las demas muestras obligé, en general, a efectuar el regis
tre de la célula control de una forma compléta, o casi compléta, antes que
— 81 —
los de las demâs células.
La velocidad de barrido del monocromador fue de 0,21 mm/sg
y la velocidad del papel de registre fue de 1 mm/sg, excepte en los re
gistres destinados al estudio de distribuciones de coeficientes de sedi-
mentaciôn, en los que la velocidad del papel se aumento a 5 mm/sg.
La apertura de la rendija del fotomultiplicador, la escala de
la sensibilidad y el filtrado de ruido del registre se regularon en cada ca
so con objeto de obtener el mmimo de distorsion sin perjuicio de la sens2
bilidad .
2 .4 .1 .2 . Calcule de coeficientes de sedimentacién
En la fig . 14 se présenta esquemâticamente la corresponden-
cia entre el doble sector de una célula de la ultracentrffuga y su registre
grafico a un tiempo determinado.disolvcnti
El registre consiste
en una evaluacion de la distribu
cion de concentracién a lo largo
de la célula mediante sistema ég
tico de absorcién. En él pueden
observarse una lînea de referen
cia interna, LRI , y una lînea de
referenda externa, LR E , co
rrespondientes a las respectivas
referencias proporcionadas por
los dos orificios del contrapeso
4jisol venté
• selutb • .oire
F ig . 1 4 .- Correspondencia célu la-rogistro
- 82 -
a distancia fija conocida. El pico m es la senal correspondiente al menis
co, o limite a ire-liqu ido . La lînea base, B , la proporciona la absorban
cia debida al disolvente, y la meseta superior, P , corresponde a la zo
na de maxima absorbancia de la disolucion. El perfil creciente que se ob
serva entre la lînea base y la meseta refleja el gradiente de concentra-
cion formado por el frente de sedimentacién, el cual sépara la regién que
contiene moléculas de soluto y la zona en que, como consecuencia de la
sedimentacién ya sélo queda disolvente.
Para procéder al calcule del coeficiente de sedimentacién co
rrespondiente al 50% de concentracién del gradiente (129) (130) (131)
(132), también denominado coeficiente de sedimentacién medio, o simple
mente "coeficiente de sedimentacién", s, se détermina en primer lugar,
sobre el perfil del frente de sedimentacién, el punto medio, M, entre la
lînea base y la meseta.
A continuacién, se mide la distancia en cm, D , entre este pun
to y la LRI , distancia que hay que transformer en distancia real dentro
de la célula, d, multipiicandola por el factor de conversién correspon
diente. Este factor de conversién es la relacién entre la distancia real
existente entre los orificios de referencia del contrapeso, 1 ,6 cm, y su
correspondiente distancia en la grâfica, L, entre las referencias LRI y
LRE.
d = D . - L i (2 .1 )
En el présenté trabajo résulté siempre mas cémodo efectuar
todas las medidas correspondientes a cada célula respecto de una re fe -
- 83 -
rencia interna comun que coincidiera con una de las lineas del papel rm
Iimetrado del reg is tre , introduciéndose en el programa de calcule las
correcciones oportunas (véase 2 .5 .1 . ) .
El paso siguiente consiste en calculer las distancias reales,
r , al eje de g iro . Para e lle , a los valores de d anteriormente obtenldos
se les suma la distancia que hay desde el eje de giro al orificio interno
del contrapeso, valor que en el aparato, por no existir distorsion de ro
tor en el intervale de velocidades empleado, fue siempre de 5,70 cm.
r = d + 5,70 cm (2 .2 )
Finalmente se hallan los logaritmos neperianos de los valo
res anteriores y se representan graficamente frente a sus respectives
tiempos registrados en minutes. A partir de esta representacion g ra fi-
ca résulta inmediato el calcule del coeficiente de sedimentacién, calcule
que, como se vera mas adelante, sélo corresponde todavîa a un coeficien
te de sedimentacién aparente.
Teniendo en cuenta la definicién del coeficiente de sedimenta
cién (129):
s = ^ . (2 .3 )0) r
la expresién que, por integracién de la anterior permite calculer el coe
ficiente de sedimentacién aparente, siempre que éste se mantenga consta_n
te durante el proceso de sedimentacién, viene dada por:
- 84 -
2In r = In r_ + s w . 60 . t (2 .4 )o ap
en donde s es el coeficiente de sedimentacién aparente, w la velocidad ap
angular en rad /sg , t el tiempo en min y r la distancia radial en cm. Por
consiguiente, la representacién grafica mencionada anteriormente de In r
frente a t corresponde en este caso a una recta, de cuya pendiente se de
duce facilmente el sap
s = (2 .5 )600.2
Dividiendo este va lor, que viene expresado en segundos, por
10 se obtiene el coeficiente de sedimentacién expresado en unidades
"svedberg", S .
En el présente trabajo, esta fue la manera en que se realizé
el calcule de s , debido a que la representacién grafica anterior siem - ap
pre se ajusté a ina I înea recta (véase 3 .1 .1 . ) .
Ahora bien, la denominacién de "aparentes" hace referencia
al hecho de que los coeficientes de sedimentacién asî calculados, debido
a que estan,medidos en unas condiciones determinadas de disolvente, tem
peratura y concentracién, factores que a su vez influyen en su valor, pre
cisan todavîa de ciertas correcciones.
El coeficiente de sedimentacién correspondiente a condiciones
estandarizadas de disolvente y temperatura (agua y 20° C respectivamente),
se calcula segun la siguiente expresién (129) (130) (132):
c cs = s
- 85 -
^ t,w ^ t,sv ^20,w ’^20,w
20,. \,w(2 .6)
donde T) es la viscosîdad, p la densidad y v el volumen especîfico del
DNA; los subindices 20 y t se refieren a 20° C y a la temperatura de ex
perimentaciôn, respectivamente; sv se refiere al disolvente, w al agua
y el super indice c a la concentracién a la que se ha real izado el exper_[
mento. En el présente trabajo, como la centrifugacién tuvo lugar siem
pre a 20° C sélo fue preciso tener en cuenta los valores de viscosidad
y densidad del agua y del disolvente empleado correspondientes a 20°C .
En el caso del DNA nativo los valores util izados condujeron a un coefi -
ciente de correccién global o factor por el que habîa que multiplicar el
coeficiente de sedimentacién aparente de 1 ,038 (133). Para el DNA des
natural izado los valores parciales empleados (134) proporcionaron un
valor de 1 ,127 para el coeficiente de correccién global.
Por otra parte , este coeficiente corregido se ha calculado
para una concentracién determinada, y es sabido que la concentracién
influye sobre los valores del coeficiente de sedimentacién (130) (132).QPor tanto, si se quiere que s^q se ajuste a las condiciones de una
disolucién en la que la concentracién en DNA fuera nula hay que proce
der a determinar los coeficientes de sedimentacién correspondientes a
distintas concentrac iones y extrapolar luego a concentracién cero los
valores obtenidos. La dependencia de la sedimentacién respecto de la
concentracién se suele ajustar, en general, a la relacién (127):
’ ’ . (1 + k . c) (2 .7 )s<= so s
20, W 20, w
- 86 -
en donde s ° se refiere a los valores correspondientes a cada con-20, w
centracion, s° es el valor que se busca, correspondiente a concen 20, w -tracion cero, c es la concentracién y es una constante que depende
del soluto, de su masa molecular, de su heterogeneidad, del disolvente
y de la temperatura (135).
Como résulta évidente en este caso, la representacién gra
fica de los valores —^ ---- frente a c da lugar a una recta, correspon
®20,wdiendo el valor de s° al inverso de la ordenada en el origen.
20, w
En el présente trabajo se efectué esta extrapolacién a con
centracién cero en la caracterizacién inicial del DNA, tanto en su es -
tado nativo como desnaturalizado (véase 3 .1 .1 .1 . y 3 .1 .1 .2 . ) .
No obstante,y como se justificarâ con mas detalle al comen-
tar los resultados (véase 3 .2 .1 .) en los experimentos posteriores se
prescindié de esta extrapolacién, realizàndose la centrifugacién a una
concentracién fija , que fue de 25 ug/ml en el caso del DNA nativo y de
20 yg/ml en el del desnaturalizado.
Por otra parte, y por tratarse siempre de disoluciones
acuosas, no se tuvo en cuenta ningun tipo de correccién referente a
efectos de compresibilidad producidos por la velocidad (130) (132).
El efecto de dilucién radial debido a la forma sectorial de
la célula, aunque fue tenido en cuenta en el estudio de distribuciones
( véase 2 .4 .1 .3 . ) ,no mostré ninguna influencia sobre el coeficiente de
sedimentacién medio (véase 3 .1 .1 . ) , por lo que tampoco fue necesario
hacer correcciones de este tipo.
- 87 -
2 .4 .1 .3 . Calculo de distribuciones y promedios de masa mo
lecular
Una vez calculado el s° q ^ , se procedio, para cada célula,
al estudio detallado del perfil de sedimentacién, con objeto de determi
nar la distribucién integral de coeficientes de sedimentacién correspon
diente a esa concentracién.
La razén de este estudio (véase 1 .3 .2 .2 .) estriba en que to
das las muestras de DNA del présente trabajo, incluîdo los contrôles no
irradiados, presentaban heterogeneidad desde el punto de vista de la ma
sa molecular.
Los distintos tamahos moleculares, al sedimentar a velocida
des diferentes,dan lugar a un ensanchamiento del frente de sedimenta
cién, y , por consiguiente, al gradiente de concentracién caracterîstico.
Por esta razén, el estudio de la evolucién con el tiempo de este p e rfil,
en funcién de las concentrac iones relatives permite establecer una dis
tribucién integral de coeficientes de sedimentacién, y a p a rtir de ésta
la correspondiente distribucién de masas moleculares.
Existen varias maneras de efectuar en la practica estudios
de distribuciones (136) (137). En el présente trabajo se escogié el méto
do de Reitner (138) (139) debido a que conjuga sencillez y rigor teérico.
De acuerdo con este método, se elige en primer lugar un re
gistro cualquiera de la célula, correspondiente a un tiempo suficiente-
mente alto como para que se hayan separado de la zona de menisco las
masas moleculares mas pequenas, y sobre su perfil se elige a rb itra ria
— 88 —
mente un numéro suficiente de puntos (fig . 15). En el présente trabajo
este registre correspondio en general al ultimo de los realizados para
cada célula, registre que se am-
pliaba de tamano (véase 2 .4 .1 .1 . )
y sobre el que se determinaba un
numéro de puntos superior a doce.
Por otro lado, se cuido siempre
que estes puntos fueran mas abun
dantes en las zonas correspon
dientes a la "cabeza" y "cola" F ig . 1 5 .- Registre tîpico para el estudio
del p e rfil, por ser estas regiones de distribuciones
las que proporcionan mayor dificu[
tad de lectura (140) (34).
A continuacién, y al igual que se hizo en el caso del coefi
ciente de sedimentacién respecto del punto medio (véase 2 .4 .1 .2 . ) se rrn
de aquî, para cada uno de los puntos elegidos su distancia Di respecto
de la lînea de referencia interna, L R I, de la célula. De una manera ana
loga, a cada uno de esos puntos se le mide asimismo su correspondiente
altu ra . H i, respecto de la lînea base B . En la practica aquî también ré
sulté mas facil efectuar estas medidas respecto de referencias a rb itra -
rias que coincidieran con lîneas del papel milimetrado del registre , in -
troduciendose posteriormente las correcciones oportunas en los progra
mas de calculo (véàse 2 .5 .2 . ) .
Los valores correspondientes a las distancias sobre el pa
pel de los puntos de la curva, D i, asî como los correspondientes al me
nisco, Dm, y al punto medio del p e rfil, D^^, se transforman entonces en
- 89 -
las distancias radiales r . , r y r__, de modo anâlogo al indicado en 2 .4 .1 .2 ,I m 50
Los datos correspondientes a la altura de cada punto, H i, se
transforman, por su parte, en termines de porcentaje de concentracién, c .,
dividiêndolos por el valor de la altura que présenta la meseta en el primer
reg istre , H ° , valor que practicamente no ha variado respecto del momento
inicial de la sedimentacién:
c. = . 100 (2 .8 )
Estes valores de c ., a su vez, hay que corregirlos, debido al
efecto de dilucién radial producido por la forma sectorial de la célula (141)
(132). La relacién que expresa esta variacién de concentracién viene dada
por:
2..............- : (2 .9 )
en donde ademas de los términos ya conocidos, aparece el valor que se
busca, c f , relative a la concentracién que le corresponderîa al punto que
se estudia en el momento inicial de la sedimentacién o "condiciones de me
nisco".
c“ = c. ( - ^ ) = . ^ . 1 0 0 . ^ . ^ ^ (2 .10)' m ' ' m '
El paso siguiente, relative a la determinacién de los coeficien
tes de sedimentacién que corresponden a cada uno de esos puntos, se con
- 90 -
sigue mediante la aplicacion de la siguiente expresion, deducida teorica-
mente por Reitner (138):
= X.w log (""i ^ "^0 )
log (*"50 '^Sn)(2 . 11)
c*50.
pudiendose apreciar la inclusion en esta formula del termino s^. ,20,w
que como se sabe, corresponde al coeficiente de sedimentacién medio,
calculado previamente y de forma independiente en el mismo experimento.
Ahora bien, estos valores de coeficientes de sedimentacién se
refieren a los puntos que arbitrariamente se han elegido sobre la curva,
y , sin embargo, lo que realmente interesa es hallar los coeficientes de
sedimentacién que correspondan a un determinado numéro de fracciones
iguales que, segun un crite rio dado, se elijan sobre la curva.
Con este fin se considéré a los perfiles de sedimentacién di\d
didos en 10 fracciones iguales entre la linea base y la meseta (fig . 15)
desechandose las zonas por debajo del punto correspondiente al 5% y por
encima del correspondiente al 95%, debido a su dificultad de lectura (128).
Quedan de esta forma 9 fracciones iguales entre los puntos 5% y 15%, 15%
y 25%, ......... .. 85% y 95%, para cada una de las cuales, se hallé, por in
terpolacién, el coeficiente de sedimentacién s? correspondiente a su'20,w
punto medio, es dec ir, se obtienen los coeficientes de sedimentacién co
rrespondientes a los puntos de concentracién: 10%, 20%, 3 0 % ,......... ..
90%. La interpolacién de estos valores se realizé matematicamente apH
cando el método de Lagrange a los coeficientes de sedimentacién corres
- 91 -
pondientes a los 4 puntos mas proximos en el entorno del punto a interpo
la r .
De esta manera queda ya determinada la distribucién integral
de coeficientes de sedimentacién para esa concentracién.
Ahora bien, teniendo en cuenta el efecto de concentracién so
bre el coeficiente de sedimentacién (véase 2 .4 .1 .2 .) hay que procéder,
en rig o r, a extrapolar a concentracién cero los valores correspondien
tes a cada fraccién, lo que implica rea liza r los mismos calculos para
concentraciones distintas (140) (128).
En el présente trabajo, al igual que se hizo con el coeficien
te de sedimentacién medio, se efectué esta extrapolacién en los experi
mentos iniciales de caracterizacién del DNA, (véase 3 .1 .2 .1 . y 3 .1 .2 .2 ) ,
real izàndose medidas de sedimentacién a diferentes concentraciones.
Sin embargo, y remitiendo de nuevo la justificacién a los resultados ob
tenidos (véase 3 .2 .1 . ) , en los experimentos posteriores se prescindié
de esta extrapolacién, cor respondi endo las distribuciones a las concen
traciones fijas establecidas de 25 yg/m l para el DNA nativo y 20 y g/ml
para el desnaturalizado.
Existen varias correlaciones de tipo semiempîrico para trans
formar los valores de coeficientes de sedimentacién en valores de ma
sas moleculares, tanto para DNA nativo (120) (142) como desnaturaliza
do (33) (143) (144) (134). En el présente trabajo, para DNA nativo se
utilizé la expresién de Crothers-Zimm (142):
I0 ,445 log M = 1,819 + log (s° - 2 , 7 ) (2.12)
20, W
- 92 -
mientras que para el DNA desnaturalizado se empleo la expresion de
Mingot y otros (134):
s ° = 0 ,059 . (2.13)20, w
Estas correlaciones, estrîctamente, solo son validas para
coeficientes de sedimentaciôn extrapolados a concentracion cero, pero
por las razones ya aludidas, se utilizaron en el présente trabajo en las
condiciones de concentracion mencionadas. De igual modo, se siguieron
empleando estas ecuaciones incluse en aquellos cases en que el modîfi-
cador de la radiosensibilidad estudiado diô lugar a la formaciôn de un
complejo irreversib le con el DNA (cromomicina A^, antramicina, c is -
DDP y, en parte, daunomicina), si bien en estes cases la comparacion
de la masa molecular se efectuô siempre, en el calcule de rupturas,
frente a contrôles del mismo complejo que hubieran sufrido idénticos
procesos.
Una vez efectuadas las transformaciones anteriores de les
s, en M. se puede hacer una representaciôn grâfica de la distribuciôn
integral de masas moleculares. Por otra parte este virtual "fracclona
miento" permite calcular les promedios en peso, Mw, y en numéro, Mn,
de la masa molecular (véase 1 .3 .2 .2 .) les cuales, como consecuencia
del c rite rio establecido para la division en fracciones adoptaron la s i-
guiente forma (128):
Mw = M" = r r f e i
- 93 -
Del mismo modo, se calculé también la relaciôn Mw/Mn corres
pondiente al grado de heterogeneidad de tamanos moleculares.
2 .4 .1 .4 . Calcule de rupturas de cadena y enlaces cruzados.
La comparacion entre les Mw y Mn correspondientes a un DNA
irradiado y les Mw^ y Mn^ de un control no irradiado del mismo DNA, de
terminados de la forma que se acaba de explicar, permite el calcule de las
rupturas de cadena (o, en su case, enlaces cruzados) que se producer por
efecto de la radiaciôn.
En el présente trabajo, la frecuencia de rupturas se calculé
utilizando las dos férmulas que se han visto en la parte teérica (véase
1 .3 .2 .2 .) y que de nuevo se transcriber aquî. La mas rigurosa de Charles
by (ecuacién 1.18):
( J ______!______ ?_______y Mn Mw Mn^ Mw^ /
y la que unicamente considéra los promedios en numéro de la masa mole
cular (ecuacién 1.19):
B = m / J _____ L \y Mn Mn^ /
En ambas férmulas B expresa la frecuencia de rupturas re fe -
rida al monémero, por lo que, en caso de tratarse de DNA nativo, el va
lor que se obtiene, y que se représenta por B2 , corresponde a rupturas
- 94 -
dobles/nucleotido par, mientras que en el caso de DNA desnaturalizado
el valor obtenido, B-|, correspondent a rupturas simples/nucleotido.
El termino m en las ecuaciones anteriores hace referencia a
la masa molecular del monomero, por lo que es évidente que tratandose
de DNA este valor ha de ser necesariamente un valor promedio. En el
présente trabajo se adopté como masa molecular del nucleétido prome
dio de DNA de timo de ternera un valor de 310 Dalton (124), siendo por
tanto 620 Dalton el valor de m aplicado al caso de rupturas dobles.
Ademas de como frecuencia de rupturas por nucleétido, los
programas de calcule proporcionaron simultaneamente los valores de las
rupturas en termines de rupturas/molécula y de rupturas/10^ Dalton (véa
se apéndices 1 , 2 y 3), expresiones encontradas a veces en otros traba-
jos sobre DNA irradiado (145).
De modo s im ilar, en los cases en que se calcularon frecuencias
de enlaces cruzados, estas se determinaron mediante la ecuacién de Char
lesby (ecuacién 1.26):
c = Ü L / J L . + ^ ______ L _ \3 y Mn Mw MWq Mn^ J
2 .4 .2 . Espectrofotometrîa
Las medidas espectrofotométricas de tipo cuantitativo se lle -
varon a cabo en un espectrofotémetro Beckman, Modelo DU, de un solo haz
- 95 -
en cubetas de cuarzo emparejadas de 1 cm de paso de luz, tomando como
referencia el disolvente empleado en cada caso.
La determinaciôn de la concentracion del DNA se realize le -
yendo la absorbancia de la muestra en el U .V . a 260 nm (maxime de ab-
sorciôn del DNA). En estas condiciones se tuvo en cuenta que a 1 U .D .O .
le corresponde una concentracion de DNA de timo de ternera de 4 7 ,8y g /m l,
lo que en termines de "concentracion total de nucleotides" supone un coeH
ciente de extinciôn molar de e = 6.500 (11).
En los cases en que se estudiaron las variaciones espectrales
producidas como consecuencia de la formaciôn de complejos, efectos de
d ia lis is , o irradiaciôn, se efectuaron barridos a diferentes longitudes de
onda en un espectrofotômetro Hitachi Perkin -E lm er Modelo 200, de doble
haz y con registre incorporado. En esta ocasiôn también las lecturas se
realizaron en cubetas de cuarzo emparejadas de 1 cm de paso de luz, to-
mandose como referencia el disolvente empleado en cada caso. La concein
traciôn de las muestras en el memento de la lectura estuvo condicionada
a las caracterîstîcas de absorbancia de cada modificador. A sî, en aque
llos cases en que se estudiaron las alteraciones producidas en las zonas
del U .V . prôximas al maxime del DNA, la concentracion fue la de cen tri-
fugaciôn, es dec ir, aproximadamente 2 5 w g/ml en DNA. Por el contrario,
cuando la muestra presehtaba absorbancia en el visible, fue preferib lé
efectuar las lecturas a la concentracion de 200 y g/m l, propia del memento
de la irrad iac iôn . Hubo ocasiones, no obstante, en las que sobre un mis
mo registre se efectuaron lecturas a concentraciones distintas, como por
ejemplo en el caso de la comparacion entre los espectros del DNA y de un
modificador.
- 96 -
2 .5 . PROGRAMAS DE CALCULO
Con objeto de rea liza r todas las operaciones matemâticas des
critas en 2 .4 .1 .2 . , 2 .4 .1 .3 . y 2 .4 .1 .4 . , se elaboraron très programas
de câlculo. La ejecuciôn de estos programas, escritos en lenguaje "BA
S IC " , tuvo lugar en una calculadora Hewlett-Packard, Modelo 9830A, con
impresor 9866 A incorporado.
Aunque los Iistados de dichos programas aparecen completes
en los apéndices 1 ,2 y 3, solamente se harâ a grandes rasgos su descri
ciôn, dada la magnitud y complejidad de los mismos. No obstante, se ex-
plicarâ detalladamente, para cada une de e lles, el proceso de introduc-
cion de dates.
2 .5 .1 . Programa para el calcule de coeficientes de sedimenta-
cîon
Por medio de este programa (véase apéndice 1), se lleva a ca
bo fundamentalmente, la determinaciôn del coeficiente de sedimentaciôn,
segun los calcules descri tes en 2 .4 .1 .2 .
Las primeras lineas del programa,entre la 10 y la 350, corres
ponden principalmente a la introducciôn de dates. Entre las lîneas 360 y
890 el programa élabora estos dates, calcula por regresiôn lineal la pen-
diente de la recta (ecuaciôn 2 .4) y détermina el coeficiente de sedimenta
ciôn medio en condiciones estandarizadas.
En la linea 70 esta prevista la posibilidad de efectuar la extra -
polaciôn a concentraciôn cero para aquellos cases en que se disponga de
- 97 -
valores correspondientes a diferentes concentraciones, enviando los da
tos al bloque de lîneas que va de la 470 a la 580. En estos casos, y so
bre el valor extrapolado que finalmente se obtiene, se efectùa, a partir
de la lînea 900, una estimaciôn de la masa molecular suponiendo que
Mw/Mn = 2, asî como se da cabida a la posibilidad de efectuar calcules
de rupturas y enlaces cruzados para aquellos casos en que el correspon
diente DNA se quiera comparar con otro, considerado como control.
A continuacion se detalla la forma en que se introducen los da
tos, teniendo présente todo lo indicado en 2 .4 .1 .2 .:
APARECE EN PANTALLA
"EXPERIM ENTO NUMERO ?"
'NATIVO S I = 0 ?"
"NUMERO CONCENTRACIONES ?"
'FACTOR CORRECCION 2 0H 2O ? "
DATO A INTRQDUCIR
Numéro de referencia del ex
perimento . (No afecta a los câj_
culos.
En caso de DNA nativo, pul
sar la tecla 0 ; en caso de desna
turalizado, cualquier otra.
Numéro de experimentos que
se han efectuado a distinta con
centracion, para un mismo DNA,
con objeto de extrapolar a concen
traciôn cero (Numéro mâximo, 6).
Factor de correcciôn global
por el que hay que multipiicar los
coeficientes de sedimentaciôn apa
rentes para obtener los correspon
dientes a condiciones estandariza
das .
- 98 -
APARECE EN PANTALLA
"VELOCIDAD EN RPM ?"
"CELULA NUMERO ?"
"C O N C E N TR A C IO N ... ?"
"NUMERO DATOS C O N C .. . ?"
'R EFERENC IA IN T E R N A ... ?"
"R E FER EN C IA E X T E R N A ... ?"
" D IS T A N C IA .. . ?"
" T IE M P O ... ?"
DATO A INTRODUCIR
Velocidad de centrifugacion en
revoluciones por minute.
Numéro de referencia de la ce
lula en el rotor . (No afecta a los
calcules).
Concentracion del DNA, en
y g /m l, en la célula.
Numéro total de registres le î-
dos para una célula. (Numéro max[
mo, 12).
Distancia en cm desde la refe
rencia a rb itra ria determinada sobre
el papel hasta la lînea de referencia
interna de la célula.
Idem a la lînea de referencia ex
terna de la célula.
Idem al punto medio del frente
de sedimentaciôn.
Tiempo, en min, correspondiente
a esa lectura.
(cuando ha habido extrapolaciôn)
"MW CONTROL ?" Masa molecular promedio en peso
del DNA considerado como control,
- 99 -
APARECE EN PANTALLA
"MN CONTROL ?"
DATO A INTRODUCIR
con objeto de estimar rupturas y
enlaces cruzados a p artir de los
datos anteriores.
Idem, aunque promedio en nu
mero.
2 .5 .2 . Programa para el calcule de distribuciones, promedios de
masa molecular, rupturas y enlaces cruzados
El segundo programa (véase apéndice 2), sirve para el calculo
de distribuciones de coeficientes de sedimentaciôn y de masas moleculares,
promedios de masa molecular, grado de heterogeneidad, rupturas y enlaces
cruzados de cadenas, conforme a lo visto en 2 .4 .1 .3 . y 2 .4 .1 .4 .
Al igual que en el programa anterior aquî también existe una pr_[
mera parte, de la lînea 10 a la 740, destinada fundamentalmente al almace-
namiento de datos.
De la lînea 750 a la 910 se elaboran esos datos, pasando sucesl
vamente de Di a r. y a y de Hi a c.^. Entre las lîneas 1000 y 1410I 20 ,w Ise interpolan los valores ^ 20 w ’ a las fracciones en que
se ha dividido la curva, calculando simultaneamente las masas moleculares
correspondientes a cada uno de esos coeficientes de sedimentaciôn interpo
lados.
De la misma forma que en el programa anterior, en la lînea 120
esta prevista la posibilidad de hacer una extrapolaciôn a concentraciôn cero
— 100 —
para cada una de estas fracciones, en el caso de que se posean los da
tos correspondientes a concentraciones distintas, enviando los valores
al bloque de lîneas comprendido entre la 1650 y la 1950.
En todo caso, los valores de las masas moleculares de las
fracciones que forman una distribuciôn se elaboran, entre las lîneas
2010 y 2030, para dar las Mw, Mn y el grado de heterogeneidad.
Finalmente, a partir de la lînea 2120, y tras pedir los prome
dios de masa molecular correspondientes al DNA considerado como con
tro l, el programa calcula, tanto a partir de la ecuaciôn (1 .18) como a
partir de la ecuaciôn (1 .19), los valores de rupturas y enlaces cruzados,
valores que se expresan de distintas formas.
A continuaciôn se detalla la manera en que se introducen los
datos en el programa, teniendo présente todo lo que se explicô en 2 .4 .1 .3 .
y 2 .4 .1 .4 . :
APARECE EN PANTALLA
"EXPERIM ENTO NUMERO ?"
"N A TIV O S I = 0 ?"
'NUMERO DE CONCENTRACIONES?'
DATO A INTRODUCIR
Numéro de referencia del ex
perimento. (No afecta a los câ l-
culos).
En caso de DNA nativo pulsar
la tecla 0 ; en caso de desnatura
lizado, cualquier otra .
Numéro de distribuciones de
un mismo DNA que se han estudia
do a distintas concentraciones,
con objeto de extrapolar a concen
traciôn cero. (Numéro maximo, 5)
- 101 -
APARECE EN PANTALLA
'CORRECCION RADIAL S I = 0 ?'
"CELULA N U M E R O ... ?"
"C O N C E N TR A C IO N ... ?"
"FOTO NUMERO ?"
'NUMERO DATOS ?"
"R EFER EN C IA INTERNA ?"
"R EFER EN C IA EXTERNA ?"
"PLATEAU IN IC IA L ?"
DATO A INTRODUCIR
En caso de que se desee ha
cer la correcciôn radial sobre la
curva, pulsar la tecla 0 ; en caso
contrario, cualquier otra.
Numéro de referencia de la
célula en el ro tor. (No afecta a
los calculos).
Concentraciôn del DNA en
y g /m l, en la célu la.
Numéro del registre elegido pa
ra efectuar la lectura de distribu
ciôn en esa misma célula. (No afec
ta a los calculos).
Numéro de puntos leîdos sobre
la curva . (Mâximo, 18).
Distancia en cm desde la refe
rencia a rb itra ria para abscisas de
terminada sobre el papel a la lînea
de referencia interna de la célula.
Idem a la lînea de referencia
externa de la célula.
Distancia en cm desde la refe
rencia a rb itra ria para ordenadas,
determinada sobre el papel a la me
- 102 -
APARECE EN PANTALLA
"LINEA BASE ?"
'D IS T A N C IA PROMEDIO ?"
'D ISTA N C IA MEN I SCO ?"
"S PROMEDIO ?"
"A L T U R A ... ?"
DATO A INTRODUCIR
seta en el prim er reg istre . En
caso de que no se efectùe co-
rreccion rad ia l, corresponde-
râ a la meseta del registre que
se lee.
Idem a la lînea correspon
diente a la absorbancia debida al
disolvente.
Distancia en cm desde la refe
rencia a rb itra ria para abscisas,
determinada sobre el papel al pun
to medio del frente de sedimenta
ciôn. (Coincide con la détermina
da prevîamente, en el mismo expe
rimento, para el calculo del coe
ficiente de sedimentaciôn medio).
Idem a la lînea correspondiez
te al menisco.
Valor del coeficiente de sedi
mentaciôn medio, en condiciones
estandarizadas, calculado previa
mente para esa célula.
Valor de la altura de cada pun
to, elegido sobre la curva en cm,
desde la referencia a rb itra ria pa
ra ordenadas determinada sobre el
papel
- 103 -
APARECE EN PANTALLA
" D IS T A N C IA .. . ?"
"MW CONTROL ?"
’MN CONTROL ?"
DATO A INTRODUCIR
Distancia en cm desde la refe
rencia a rb itra ria para abscisas,
determinada sobre el papel, a ca
da punto elegido sobre la curva.
Masa molecular promedio en
peso del DNA considerado como
control.
Idem, aunque promedio en nu
mero.
2 .5 .3 . Programa auxiliar
Se elaborô también un programa de calculo adicional para aque
Nos casos en que se tuvieron unos valores conocidos de coeficientes de se
dimentacion, correspondientes a las fracciones de la distribuciôn integral.
Esta situacion se présenté principalmente cuando se realizo de forma ma
nual la extrapolaciôn de las distribuciones a condiciones de concentraciôn
cero y por tanto se deseaba proseguir los calculos a p artir de unos valores
de 1 /s ° conocidos.
En real idad este programa no es mas que una forma reducida del
programa anterior, en el que la unica variaciôn digna de resenar se produ
ce en el momento de la introducciôn de datos, cuando en pantalla aparecen
sucesivamente " 1 /S . . . . ?" en demanda de los valores ya mencionados.
Su listado aparece complete en el apéndice 3.
I I I . PRESENTACIO N Y D IS C U S IO N DE RESULTADOS
- 105 -
3 .1 . C A R A C TER IZA C IO N DEL DNA
Se exponen a continuacion los resultados de los experimentos
de velocidad de sedimentaciôn efectuados con objeto de caracterizar el
DNA.
En estos experimentos se re a lizô el calculo de coeficientes
de sedimentaciôn medios, s^q y se estudiô su dependence a respecte
de la concentraciôn. Asimismo se calcularon las distribuciones intégra
les de coeficientes de sedimentaciôn en funciôn de la concentraciôn, se
considéré la influencia del efecto de diluciôn radial y finalmente se cal
cularon las distribuciones intégrales y los promedios en peso y en nume
ro de las masas moleculares.
3 .1 .1 . Coeficientes de sedimentaciôn
En la tabla I I se muestra un ejemplo del câlculo del coeficien
te de sedimentaciôn para el caso de una de las concentraciones estudia-
das en la caracterizaciôn del DNA. La representaciôn grâfica que apare
ce en la fig . 16 corresponde a los mismos datos. Este ejemplo puede ccm
siderarse como representativo de todos los demâs casos de determinaciôn
de coeficientes de sedimentaciôn del présente trabajo, debido a que en
todos el los se real izô la representaciôn grâfica anterior, comprobândo-
se siempre un perfecto ajuste de los puntos a una recta. Este hecho con
firma como correcta la suposiciôn de que el coeficiente de sedimentaciôn
correspondiente al 50% del gradiente de concentraciôn permanece cons
tante durante la centrifugaciôn (vèase 2 .4 .1 .2 .) y , p o rtan te , la validez
de la ecuaciôn (2 .4 ). De no haber sido asî, como sucede en el caso de
- 106 -
oO'UJ
oLUCtCo:
u.LUoo
CÛ<t-
<9oo<9N
CCI N 'T iT» If) N 0)CL '■£• "3" —I 'J' fÜO Tf CCi J\ri. C:' .-I T-1 C J CCI -f IP ITiz ( - CCI co cc> co cc' CCI Cl:' oo
CTS <J, «-« '}■ 'T4 T CC' C'J ij'l)“i CC —i CC 1-1 CI' ' £' Tf T'-C'j r- C'J C'J '£' ':'j CC' —o c 1 — CJ C'J CH CH -tijH Ifi tJH CD CD '-ù 'D LD CO
CC 3' c J CH CJ C'J o If)Cl r - ij' i-i CH r- (T‘ üH TfCCI Cl C J U'J N i7 ' r - O'.CJ Tj- ÜH ‘D N cc c ^ C'J
c UH c II") U") c If) If) ou'.i C'J ii'i I'-1 - c f'- r- ©c 1-1 c 'D U") fi- i-< ^ CJ
CJ IM C'J C'J C'J C'J CH o r-
Ci ÜH '9 '%' © © '© IJ'I © LU © CJ Ü'.I Ü*| © © © C'J If)ûi ITj o ■ 'D © N IJH CH 'HH© N Ci. CH C- N f w f - © ©
© Ü"H © © © © '=' ÜH © I— © CJ iiH ir.i © '% '© CJ If)CL ^ CH © If 1-1 © CJ CJ 1-1© © © © © © © © '©
CJ © "f If) © C- OH ©
If© (=t ICL LU OC ID O Tfz ©'© '-H
© • •©O
'D 1=1 © CL I CC LU 1=1 © Z © ir If l - ' D © 'f
cri
•f©ILU LU H- ' D Z CJ LU ©i - i I ft=» ©LU © û .
CJCJ©Oi©
Li.LUOO
(0•UtocEt_0)o
"DC
xO*ô(0c.coocoü10c310t_coC L
■OQ)Ec
xOotoctuE’-B.tu©tu
1 3
(UOü
tu■O
3Uxtootu•ooo©Ctuutot_too
CL
E.94üJ
- 107 -
en
oa>
ou>
om
0)ooQ>-D
OaE0
•u(0t_
(/).2ôc(0
0■DC
vOu0c0U)0C.û .0XkO0(_3O)lZ
c'2ü0c0ET30(/)0•ü
- 108 -
aquellas sustancias con fuerte dependencia entre s y c , la representaciôn
grâfica de In r frente a t , a consecuencia del efecto de diluciôn radial a
lo largo de la célula, no hubiera dado lugar a una recta, sino a una lînea
con pendiente creciente (133), cosa que nunca se observô.
3 .1 .1 .1 . DNA nativo
Los coeficientes de sedimentaciôn en condiciones estandariza
das de disolvente y temperature, s^q ^ , correspondientes a las concen
traciones estudiadas de DNA nativo se indican en la siguiente tabla i l l :
TABLA I 11
c (y g /m l) s^ (S)20, w
34 23,9
28 23,5
24 25,2
19 25,0
15 25,4
La extrapolaciôn de estos valores a condiciones de concentra
ciôn cero (fig . 17 a) condujo a un valor de:
4 . W = 27.1 S
obteniendose de la pendiente de la recta, en este ajuste, un valor de
- 109 -
O)3 ^
CÛO
oCN
oi .
coü
<ZQ
O
JA COO
_ L _CMOO
Q)TJC\0ô<0c0)E"Oa>n(V-uw(Uc(U
oCM
O
moo
L OC D
C D
C D
C D
Q)"OOc.Q)ÜC
'2ô(0c_c(Uücoü
c'2"uJH0 a coL.
XÜJ1
00C-DO)
o■u00N
00[_3
mcen<ü-o3
- 110 -
k = 1 ,6 d l/g (ecuaciôn 2 .7 ) .
Comparando los valores anteriores con los encontrados en la
bibliografîa para DNA de timo de ternera en condiciones de trabajo sinru
lares, se desprende que, tanto los coeficientes de sedimentaciôn como
su dependencia con la concentraciôn, entran dentro del rango obtenido
por otros autores (120).
A continuaciôn se efectuô una estimaciôn de la masa molecu
la r, aplicando directamente la correlaciôn de Crothers-Zimm (ecuaciôn
2.12) al valor de s^_ . De esta forma se obtuvo un valor de M = 16,1.10^20, w
Dalton, que corresponde a un promedio que résulta ser, en general, l i -
geramente inferior al promedio en peso (133),
3 .1 .1 .2 . DNA desnaturalizado
Se procediô de idêntica manera con el DNA desnaturalizado,
obteniendo los valores de coeficientes de sedimentaciôn que se indican a
continuaciôn:
TABLA IV
c ( u g / m l ) =2 0 ^^ (S)
27 19,7
21 19,6
17 19,8
14 19,7
11 20,1
- I l l -
Como puede apreciarse, en este caso no se observô variaciôn
significative del coeficiente de sedimentaciôn en el rango de concentracio
nes estudiado, hecho que se encuentra de acuerdo con la informaciôn b i-
bliografica (144) (120) (34). Por este motive se considerô nula la pendien
te de la recta de extrapolaciôn (fig . 17 b) y, en consecuencia, también el
valor de k (ecuaciôn 2 .7 ) , adoptandose como s ° el promedio de los vas 20, w -
lores de coeficiente de sedimentaciôn anteriores:
Al igual que en el caso del DNA nativo, aunque aplicando en es
te caso la ecuaciôn (2 .1 3 ), se estimô una masa molecular de M = 3 ,49 .10^
Dalton. El bajo valor de esta masa molecular, comparado con el del DNA
nativo, indica la existencia de rupturas simples en las cadenas del DNA.
3.1 .2 . Distribuciones y masas moleculares
En los experimentos anteriores, ademas de los calculos de coe
ficientes de sedimentaciôn correspondientes al 50% de concentraciôn del
gradiente, se real izaron estudios de distribuciones intégrales de coeficien
tes de sedimentaciôn y masas moleculares, tanto para DNA nativo como pa
ra DNA desnaturalizado.
En la tabla V se presentan, como ejemplo representativo, los
datos que incluye et câlculo de distribuciones a una concentraciôn dada, co
rrespondientes, también en este caso, al ejemplo mostrado al hablar del
coeficiente de sedimentaciôn medio.
— 112 —
TABLA V
r \ r i ' : 5 :
CCLULA 4
C:-NC£tiTRnClOM 14.30 FOTO NUM. 4LRI 0.150 NUM. I'M:OS 14 LFE 30.150nuM. l'ATOS 14 LFE ;
PLAir A:j î'JT-:îAL 2.2001.1 Ht h E-.lt. O.40Ol'ISi . r-..iîEi:o i~.:ô0LIST. MEHISCO 6.050t FF'.;nEI'IO 25.010H h
0.-100 9.6000. -*50 10.4000.500 11.2000.600 12.1000.700 13.0000.300 14.2001 . 000 16.0001. 150 17.2001.300 15.9001.500 21.0001.600 22.4001.708 23.8001.850 26.4001.900 27.700
VALOFES INTEFFOLûI'OS:
1/S S M0.075d 13.26 2. 430E--060.060? 16.46 4.410E + -260.0496 20. 16 7.532E-060.043? 22.85 1.04OE-O70.0395 25.43 1.369E-070.0347 23.81 1.860E+070.031E 21.68 2. 35IL+'370.0286 34.98 2.997E+070.026M 58.4 4 3.768CT07
f f T - f f * f * * T f » * *MA ; A5 ru'.EC'JLAl [.3:
C/CT102030405060703330
IMI ♦oe M'.l - l,vl7E-0: nu Ml: ..OO-SE-.-tJ
Ejemplo caracteristico del câlculo de distribuciones de coe
ficientes de sedimentaciôn para una concentracion determi-?
nada.
- 113 -
3 .1 .2 .1 . DNA nativo
Se determinaron las distribuciones de coeficientes de sedimen
tacion para las distintas concentraciones de DNA nativo, y los valores obc'20, w
centracion cero.
tenidos para cada fraccion, , se extrapolaron a condiciones de con
AI mismo tiempo, se determinaron las ksj de las fracciones
(ecuacion (2 .7 )) a p artir de las pendientes de las rectas de extrapolaciôn
(fig . 18), con objeto de evaluar el grado de influencia de la concentraciôn
en la sedimentaciôn de cada una de las fracciones.
Finalmente, a partir de los coeficientes de sedimentaciôn ex-o2 0 ,w
trapolados a condiciones de concentraciôn cero, s;^^ , se calcularon
las masas moleculares de cada fracciôn, M^, y a partir de estas, el pro
medio en peso, Mw y el promedio en numéro, Mn, de las masas molecula
res de la distribuciôn, asî como el grado de heterogeneidad, Mw/Mn.
En la tabla V I aparecen detal lados los resultados obtenidos.
En relaciôn con ellos cabe comentar, en primer lugar, la in
fluencia normal que ejerce la concentraciôn sobre los coeficientes de se
dimentaciôn de las fracciones. Los valores de siL^ , en las fracciones20, w
équivalentes, aumentan conforme se hace menor la concentraciôn del ex
périmente. Esta dependencia, a su vez, es mas acusada cuanto mayor es c'2 0 ,w
moleculares mas altas.
el valor de , es dec ir, en las fracciones correspondientes a masas
Por otra parte , y en relaciôn con las masas moleculares ob-
- 114 -
0,07
0,05
0.03
c(ug/ml)
Figura 1 8 .- Extrapolaciôn a concentraciôn cero de los coeficientes de sedimein
taciôn correspondientes a las fracciones (fi) de distribuciôn del DNA
nativo.
- MO -
>
<_JCÛ<K
■D(0L.
C
üo(DC-c.ou0
1 CD O
"û.<0o>
mc<ZÛ"ôT5C
'2’ü(0NE
Buto(_(0u
<X)oX
D1TJU)
(f)O
U)
m$
oü.£^
y)
O lO [S CO CO CO iD OiD
ü [> o CO (O O CO CO en«— CM CM CM CO CO CO co
Ol o<0" (31 (31 CO CM CO O
CM 00 CM 00 CO O O»— '— CM co IT ) O
r - CT> (sD O
CM
m
r i(T>
CM
OCM
OCO O OIf) oVD R
O — CO CO
co CM UO CO CO m lO oCO IN <T 00 CO 00 co o'— '— CM CM CM CM co lO
co UO CM 00 UO 00 O O
co co o CM UO 00 T— UO 00’— *— CM CM CM CM CO co co
CO 00 r - CM UO r - O CO ir>co
ü CO co o CO UO 00 CO co«— CM CM CM CM CO CO co
00 CM CO 00 •— iT) CO
CM co (31 r— CO CD 00 ,_>— '— '— CM CM CM CM CO co
CM CO CO O O T— CM (31
CO CO (31 <— CO 00 O CMr— r— '— CM CM CM CM CO CO
O00 oC7»
tNCM
II
C
Colôoiovo
II■ c
col ô
Q<o
00inCM
II
5
CM O ^
ü )3 .
CO
m
U)jo(0c_10ac
'2’utoctuEiotuwtu
■a
toiJ
ca EL
C c(U 2uc o0 yiü tuto ao c13 Q)to OOa (UtO[_ E
oX L(U ac c
tou 3to O
Oc(U *ôE E
'■6 totu yim (0tu E13 »oc 2tu
Lü to3
o Oo O
o$ E
C3 tot/1
0.2^ toy) E• #, «
013 .
m
lO
o0.2^
(fl
c\ 0u3
"C
iotu
"Oc
'2üoto(_
013 .
en
c\ 0u_fOoato£_Xtu(U*0
10o —- -s
013 .
CM
CO
coCM
£1tua
ui
oL.tuüC
\0
13fO
;uÔ)ctuO)oc_ao
JZ
tu130
£_01
13tuiLac.
JODU
BoEtot/i
- 116 -
tenidas, se puede observar que la masa molecular correspondiente a! 50%
de concentracion del gradiente no varia significativamente segun se calcu
le a p a rtir del coeficiente de sedimentaciôn medio, s° , (véase 3 .1 .1 .1 . )20, w
o a partir del valor proporcionado por la fraccion 50% en las distribucio
nes de coeficientes de sedimentaciôn extrapoladas a concentraciôn cero,
hecho que confirma la escasa repercusiôn del efecto de diluciôn radial so
bre el valor del coeficiente de sedimentaciôn en ese punto (véase 3 .1 .1 , ) .
Sin embargo, el valor que finalmente se obtiene a partir de la distribuciôn
de masas moleculares para el promedio en peso, Mw, d ifiere considerable
mente de la estimaciôn previa efectuada a p a rtir del s^q ^ . Se puede atrd
buir esta discrepancia al hecho de que, independientemente de existir una
gran heterogeneidad, no se cumple la condiciôn de ser distribuciones s i-
métricas de masas moleculares (133), influyendo decisivamente en este ca
so el mayor porcentaje de masas moleculares elevadas en el aumento obsejr
vado del Mw.
Con objeto de ver la influencia del efecto de diluciôn rad ia l, en
la tabla V I I aparecen los resultados correspondientes a los mismos calcu
los que los de la tabla V I , si bien eliminando la correcciôn correspondiente
a este efecto. Comparando ambas tablas, se puede comprobar que no exis-
ten diferencias significativas entre los valores obtenidos en uno u otro ca
so. Este hecho justifica que se prescindiera de este paso en aquellas oca
siones excepcionales en las que, por dificultades en el registre grafico, fue
imposible determiner con exactitud la meseta in ic ia l. No obstante, esta co
rrecciôn fue efectuada como norma general.
Hay que sehalar aquî también que, antes de efectuar las ex tra -
— I I f —
><_1CD<t-
• D(0£_
C\0oooL .(_oÜ<D
T >
0 •DCd>1oU)<DLao>COc<ZÛ
"Oc
'2’c(0N
L<DO(0C .<0
U
VOO
X
0 )
3
je
( f )
o
(/)$
o
in
ro
V O C '- <3" CM CO CMi n m m i n O C O
CM t > r— V O VO r o (T>«— <— CM t ^ m
i no
CSJV O O
CMinCM
o o«— CM
oCO o oin go[ N
<y*
CM
§
m
CM CO C O I N V O
t ^ V O C O CO CM C S CM«— «— CM CM CM to 0 0 <3" m
C O m o > m 0 0 O <3- m
0 0 V O o T CM LtO o T 0 0 VO o T«— •— *— CM CM CM 0 0 0 0 0 0
o CO V O <- O D - <T> *— i n
0 0 m o T CM m CO r - V O CD' — <— «— CM CM CM 0 0 0 0
CTi <3" V O CO 00 o <3" 00 <3"
CM VO oT CM m CO r-T <3" O*— <— '— CM CM CM 00 00 00
m o CO CM i n o VO CO CM
CM V O CO t— 0 0 l O CO T— VO'— '— >— CM CM CM CM 0 0 0 0
O o o <3" c n I— <3- CO VO
0 0 V O cr> 1— 0 0 V O CO O'— ' — «— CM CM CM CM 0 0 0 0
ocr>
CT>
CM
II
c
co1ÔÛ
VO
c n
00II
c
co(0Û
VO
ro
VOCM
II
5
CM to O L
C— mu c o u
cn3 .
roto
OT5to
i'o(/>oÛ .
c0
JO OÜ o
Û .
g0 izC XO 0
c
'2 ‘o t o
c 0 £0 (/)
= ■§ s Itfl .20 O0L .0a
c'2o0c0E0(/)0■o
0 .S(A
■§Eo[_ac .
J233oE0(A0E
E s a
P.m
m- Ü
o
(A
C'2ÔD3C
J A
0"DC
'2ÜÜ0l_
c3u3oCl0£_X00"OO)3. 0
Z 3II L .
<)- 0Ü —-ë
D)a
CM
D)3.C OCM
(A
oL0oc\0
"O030c0oioC00j:0
T O
OTO0LO
TO0EoLa
c .33O3oE0(A
- 118 -
polaciones a concentracion cero de los coeficientes de sedimentacion de
las fracclones, el programa de calcule proporcionaba simultaneamente pa
ra cada fraccion un valor de masa molecular, M p determinado por aplica
cion directa de la ecuacion de Crothers-Zimm (ecuacion 2.12) a los coef[
cientes de sedimentacion, s^ , obtenidos a esa concentracion (vease'2 0 ,w
tabla V I ) . En la tabla V I I I aparecen estos valores de M , asi como los
que se obtienen efectuando su extrapolaciôn grâfica directa a condiciones
de concentracion cero (fig . 19). Los resultados revelan que los valores
asî obtenidos no difieren apreciablemente de los M?calculados a partir
de los coeficientes de sedimentacion extrapolados a concentracion cero, o'20, w
bien se observa, al igual que en aquel caso, una influencia de la concentra
ior> > excepto para las fracclones de masa molecular mas elevada. Tarn
ciôn que résulta ser mas acusada para las masas moleculares mas altas.
3 .1 .2 .2 . DNA desnaturalizado
De manera muy sim ilar se procediô con el DNA desnaturalizado,
obteniéndose los datos que figuran en la tabla IX . En este caso, sin emba£
go, y debido a que no se observaron efectos apreciables de concentracion
siderô como el promedio de las de cada fraccion. A los valo-
sobre los valores de coeficiente de sedimentacion de las fracciones, se con o'2 0 ,w ''' ' “ '2 0 ,w
res de sf_^ se les aplico la ecuacion (2 .1 3 ), obteniéndose unos valores '2 0 ,w
de masas moleculares cor respond lentes a cada fraccion, M °, los cuales
sirvieron de base para el calcule de los promedios Mw, Mn y el grado de
heterogeneidad, Mw/Mn de la distribuciôn.
Comparando estos resultados con los del DNA nativo se obser-
- 119 -
><—ICO<I -
"C0c_c
nOÜu0Lt_OOcoÜ(A0•D33Ü0OO>0c
<ZÛ0*D(A0[_33O3oE(A0(A0
VOo
X
o —
< " r—
woo 00 o ro o CM O
O ro 00 I— lO r - CN ro cnCM CM ro ro
ro
CM
lO lOlO mCM O o ro 00 o ro O O CM o
CMro lO cn ro VO roCM ro lO II
o5S
II
oc
r o r— r olO VO VO O IN j VO
CM CN O r o 0 0 r o O INIICM r o r o 1
VO VO cn m CMVO <± 0 0 0 0 <3" «— r o j lO 0 0
CM < t I N o r o N CM N r o )'
*— «— •— CM CM r o I II II
$ c2 2
cnO 0 0 VO CMCM r o VO - cn m lO «— VO I N 1 r o N
CM VO 0 0 r - 0 0 CM 0 0 j *“«— «— •— CM CM 1 II II
$ c2 s
CM r o CM CM VOcn<3"
r o CN o 0 0 lO m O 0 0 1 CM INCM VO on r - (N r S LO {
«— *— »— CM CM 1 II II
$ c5 2
O O O o o O o O O«— CM r o vr> VO IN 0 0 cn
CD cn
CM
CO
II
c
VO
O)3 .
<-ro
3
lA0
0-a33U0oc.33Ü3oE0(A0E
o—
c'2Ü33C3
0"Oc
'2Üu0L
II I jN U: .§
0?Oa0 •t_
OX L0 0l_ E3 '3
C3u c3 0o oE 00(A0
EoE L
at_o •— 02 3o
1 3\ o
E0
lO (A0II ElO co 2
Ë o(A\ 0O) a3. c<n 0o
II•O0o Eoc_
E a\D)3. "0
3<3" 0CM 3II 0ro E
O 0(A0
E E\013. §
200CM 0II c_
- 120 -
6 0
30
2 0
10o -
(^g/ml)302 010
Figura 1 9 .- Extrapolaciôn a concentracion cero de distribuciones de masas
moleculares del DNA nativo calculadas a cada concentracion.
- 121 -
CD<I-
T)(0LC\0*ou<D£_LOÜo"UcITJO
“û .toO"O(0N
*fÔL3Cwo"O<ZÛ15"Dc
'2"Û<0NLmuCO(_toU
VOo*x
$o
o.E:'
CD
o(/)
m
VO o <Ti O O CN t> O tNVO CN If) CN CN CN CO CN
o «— «— CN ro UO VO CO
« - ro ro ro CN VO VO
CO ro lO cnCN
roCN
lOCN CN
(J> VO CN ro cn ro o CO
o ro VO CO cn r-T ro in VOCN CN CN CN
ro CO o ro VO ro m
Ü o CN m l>- cn ro m D -'— *— «— CN CN CN CN
ro CO m ro r - ro O VOroÜ o CN in tN cn ro VO
«— •— '— *-* CN CN CN CN
CN VO CO CO cn cn cn CN VOCN
O O CN VO CO o CN m o*— «— '— '— CN CN CN CN
ro cr» (N CN
o to in CT> ^ roCN
oro O Oir> s oo
VOCN
OCO
COCN
Ocn
CO
VO
co"toÛ
cnoCN
VO
co*tôQ
CO[>ro
» Cl 0Ê o C_0
ED) 0 \33 o cr- ■O cCN 0 0II o oa0u [_ 0.. X Evn 0 o0 C_c c a0 '2 c_Ü Ô 00 0L 3c uC 0 00U E oc Eo 0 0
(AÜ (A(/) 0 00 •o Ec 0
c c(A 0 2Ô o(A (A0 0 0o a0 uL0a \ c0
2c CD
'2 o . r j 0o VA E0 oc0 E dE O)
L01 3 3VA Ü_00"D0
IIm
OE
u 0C0‘Ô 1
(A0E
0 cn sTo 3O <*- 2
$ II i_0o
u.r^cnc\0ÜIL
"Uc
'2ÛÜCOL.
O)3.
ro
O)3
CN
OLcuÜc\0’oCOLC
CN CU Ü Ü
"OCO;dcuccuO)oo0J:0*oo"O0c_O)
- 122 -
va una menor heterogeneidad, asî como una mayor simetrîa en la d is tr i-
bucion de las masas moleculares, lo que da lugar a una buena concordan
cia entre el valor de la masa molecular correspondiente al 50% del g ra -
diente de concentracion y el promedio en peso, Mw, calculado para el con
junto de la distribuciôn.
Al igual que en caso del DNA nativo, se repitieron los calcu-
los anteriores prescindiendo de la correcciôn rad ia l, llegândose a las
mismas conclusiones que a lII , es dec ir, se constatô la escasa importan-
cia de este efecto (tabla X ).
Asimismo se hicieron los calculos de M. a p artir de loS s;„-• ’zO,wobtenidos a cada concentraciôn, no observândose tampoco en este caso va
riaciones apreciables como consecuencia del efecto de concentraciôn (ta
bla X I ) . Se promediaron entonces los valores M-' de cada fracciôn, obte
niéndose unos valores Mj y unos promedios para la distribuciôn que, como
era lôgico esperar, no difieren apenas de los deducidos a partir de las
s9 '20,w.
— 123 —
X<_JÛÛ<
■ o0L
CsO
û0 0 L. L. O00
-D
101
üU)0L.ao■D0N
"0L.30c(A0■O<ZÛ"0T>C\0ü0N
%0O0c_0U
VO
( D
oo.s:*
(A
CD
OCN
m
r o
CN
O VO 00 00 r— ro CT> enVD CN CD ,-VD v£> VO 00 [> ro
O CN ro < - iT > r - o
m VO e n o r— CN e n oo ro m i> o CN VO or— «— «— '— CN CN CN CN ro
e n I N VO 00 e n ro Vf)
o ro VO 00 o r— ro VO 00r— T— «— CN CN CN CN CN
< - CN ro D» e n r— 00 CN Oo ro If ) tN e n CN CN e n«— »— r — '— r — CN CN CN CN
o c o O 00 ISo ro ifT 00 o CN <1- (S O«— «— «— •— CN CN CN CN ro
ro 00 CN < - 00 *“ es r - 00O CN LO es en CN
CN CNcsCN 8
ro VO o ro e n ro
CD < - i f T o CD CN 00«— «— '— CN CN CN CN ro
oCN R O O
m s oo § 8
00
Vû
co
"0Q
CN
(NIIC
VO
co
0û
enCN
O)3
oCN
(A
slA_00L0ac
'2ü0c0E
i o0(A0
T>
$
O
c\ 0UD
L
.2
0TJC
\0" ûo0L.
c l Oo e_o 0
E0 %3o C
" 2 C_ 0 0o oa0t_ 0X E0 o
Lc a
'2 e_o 00
Dc Ü0 _ 0E O
i o E0(A 0
(A0 0
"O E0C c0 2
’ ô o(A0 0o
u ac0$ o
C DG . £ ^ 0
(A Eoe_
Ê a\ i_0 ) 0
31 3u
f— 0II olO E
ü 0(A0
E E\O)3 5
2e_
K II _ 01 D1 O O
0O
E E\
G ) 03 lA
0E S E
IIr o 2
Goc_
Ë 0o
D) c3 '2
üCN 0
LI I CCN 0
" S;d0c0
200
J :0TJO
LO)
- 124 -
X<OQ<
V DO*X
V O
0
" s
csOuÜ0LLOU
cou
(A0" D_0
3Ü
0Ü
O"O0N
0 XL 30 C (A 0 *D
0■o(A0e_03O_0OE(A0(A0
in
C ^ 0 0 cnm C N o o I N o cn I N oVO C N [ N m ro C N C N 0 0 C N ro C No C N ro in VO 0 0
II II
5 c1 2 1 2
VO 0 0 0 0ro C N 0 0 V O V O CN I N m I N CNI N ro o 0 0 in C N V O ro ( NO C N C N ro m V O I N
II II
O3 cn
V O <3-r or o
r -r o
r or o 0 0
in
C D C N r o m VO 0 0
roo _ m r oV O T -
o »— »—
T- m00 in
c nCN
CN ro
r or o
m
c no
r oCN
00O
C N
C NC NV O O V O
C O •— C NO O »- minr - C N r o in VO
VOC N
00
VOr o oVO
C D
5 CNmCN
I Nr o
0 0C D
m
C N r o in cn
I N < -I N C D
r o CN
II II
% C
2 2
o VO0 0 C D
r o CN
II II
$ C
2 2
r o inV O cnr o
II II
5 c2 2
C Ncn *—
r o CN
II II
$ c2 2
OC N
Oro O Om
oVO
oo
o00 oc n
" ,1
E .0c n3
OCN
C_ 0c 0lA 0 L
u3 Ü 0
(A
T >
(A0
U
C\ 0
* u3jOL
W
i )
0TOc ■
'.2 "Û o 0 L
O
E(A0(A0E(A
_ 0
0TO
■ g
Eot_a
O )
3
m
cn3
cn3
C ^
II
— CN
O[_0E
\ 3C
c0
■ §
Eoc_aL
J53
J )
O
E0(A0E
" s 0u a c- 0
■ g
E o c_ a
J53OJ0o E
- g0
II E
ro
cn3
- 125 -
3 .2 . R A D IO S E N S IB IL ID A D DEL DNA
Una vez caracterizado el DNA se procediô al estudio de su ra
diosensibilidad, evaluando las rupturas dobles y sencillas inducidas por
distintas dos is de radiaciôn, con el fin de obtener datos comparatives res
pecto a la acciôn de los modificadores ensayados posteriormente.
3 .2 .1 . Influencia de la concentraciôn sobre la sedimentaciôn de
muestras irradiadas
Previamente a las pruebas de radiosensibiIidad propiamente d_[
chas, y con el fin de establecer mejor las condiciones de trabajo définitives,
se estudiô la influencia de la concentraciôn sobre la velocidad de sedimen
taciôn de muestras irradiadas, dada la escasa dependencia entre s y c pues
ta de manifiesto en los expérimentes de caracterizaciôn. Concretamente, el
objeto de este estudio fue considerar hasta que grado podrîa repercutir en
los valores obtenidos para el numéro de rupturas el hecho de rea liza r los
calcules a p a rtir de una distribuciôn correspondiente a una concentraciôn
suficientemente baja, en lugar de deducirlos a partir de los valores de ex
trapolaciôn a concentraciôn cero.
Con este fin , se tomaron alicuotas de una muestra de DNA na
tivo previamente irradiado a una dosis incluîda dentro del rango de i r r a -
diaciôn aplicado en los estudios posteriores, y a partir de ellas se prepa
raron muestras a concentraciones distintas, las cuales se destinaron a
ultracentrifugaciôn. Se determinô el coeficiente de sedimentaciôn medio,
S20,w» estas muestras asî como las distribuciones intégrales de coe-
- 126 -
ficientes de sedimentacion. Estas distribuciones, a su vez, se extrapola-
ron a condiciones de concentracion cero, de la misma manera que en el
caso de la caracterizaciôn del DNA nativo.
En la tabla X I I aparecen los resultados obtenidos, represen-c‘20,w
mo puede observarse, existe en este caso una menor dependencia de la
tandose en la fig . 20 la variaciôn de los con la concentraciôn. Co
concentraciôn que en el DNA no irradiado (vease 3 .1 .2 .1 . ) . Concreta
mente, y considerando sôlo la variaciôn entre el valor del s„„ corres20, w -
pondiente a 25yg/ml y el extrapolado a condiciones de concentraciôn cero,
se puede observer que mientras este expérimenta un incremento de un
8,7% en el caso del DNA nativo no irradiado (véase 3 .1 .1 . 1 . ) , para el
irradiado el incremento se reduce a un 2,5% . Esto no es sino una confie
maciôn mas del hecho de que la dependencia del coeficiente de sedimenta
ciôn respecto de la concentraciôn disminuye conforme se hace menor la
masa molecular del DNA.
A continuaciôn se realizaron calcules de rupturas a partir de
los datos correspondientes a las distintas concentraciones de centrifuga
ciôn del DNA irradiado, referidas a valores del control correspondien
tes también a distintas concentraciones de centrifugaciôn (todas ellas,
no obstante, en un rango inferior a 30 w g /m l). Se pudo observer que las
diferencias obtenidas en las distintas posibilidades de combinaciôn co-
rrespondîan en todo caso a un orden de magnitud inferior al habitualmente
encontrado para las rupturas (10 rupturas dobles/nucleôtido par), que-âdando por debajo de los valores "umbral" significatives que se calcularon
y que se detallaran mas adelante (véase 3 .2 .3 .1 , ) .
- 127 -
X<_jCD<h-
o>0c01B0c_L
VOO*x
O)
y)J:
10
< og0-ac\0Ô0c0E
" sU)_0C0c
sOo 0 c .
c 0 o c o o
0"U
o
I f )
00
IN VO D'<3- VO If) VO
CN IN O
VO *—
oCN
<- 00 <-r — «— CN
00OO
If ) O)e' er»CO
0000
00 If )
00 00 CN O O O 00 O VO
00 VO CO 00 VO o T CN IN CN»— «— CN CN CN CN 00 00 <3"
*— 00 •— O <3" 00 O'- CN
00 VO O ) CN ifT IN CD o TT— '— T— CN CN CN 00 00 00
CN CN CO - 3- 00 IN VO
IN O 00 If ) IN O ) 00 00r— T— CN CN CN CN CN 00 00
CN VO IN CN 00 00 00 If )
00 VO CT» CN <3" IN O ) 00 00»— '— '— CN CN CN CN 00 00
CN VO CN <3- VO o \ IN 00 Ou
00 VO cn CN <o 00 If) 3*— •— «— CN CN CN CN 00 00 JD
o oCN
O00 § o
I f )oVO
Oo o00
oO)
CN
CNIIc2\5
VO
co0Û
s00IIc
VO
0Q
oL.0 uc'OÜ 0 Lc 0 Üc o o
X 0
O)3
00
vnBU)JO0L.0ac\0o0o
— c 0 E■g(A0*o
OTJJOO&(_X0c
'2"Ü0c0E"g(A0TO
Oo.f"
(A
.2 ED)3
I f )
I f )
O)3
O)
O(A0ac0
■giLaL
JO3Ü_0OE0(A0E
c'2Ü
JOoa0c_X00■D0Ü0C.
CO h
II52
LJA
TO0
TOC
'2ou0L
O ^-S 0C 0O)
3
CNII
TOC0a
TO0-JO0c0O)oC-00z:0
TOO
TO0(.OJ
00 (A
O0
Jcc0
■gi(_a[_
JO3U0
3 : —
- 128 -
0,05
0,04
0,02
10 30 50 (ug/ml)
Figura 2 0 .- Extrapolaciôn a concentracion cero de los coeficientes de sedimentaciôn co
rrespondientes a las fracciones (fi) de distribuciôn del DNA irradiado.
- 129 -
Por todos estos motivos, se considerô justificado efectuar
todos los experimentos ulteriores de sedimentaciôn del DNA nativo a una
concentraciôn fija de 25 y g /m l, prescindiendo, por consiguiente, de la
extrapolaciôn a concentraciôn cero. Esta forma de procéder se puede
encontrar en otros trabajos clasicos de irradiacîôn de DNA (33), en los
que incluso la variaciôn con la concentraciôn del coeficiente de sedimen
taciôn correspondiente al 50% del gradiênte de concentraciôn es superior
al mencionado 8,7% del présente trabajo.
En el caso del DNA desnaturalizado, debido a que no se ob-
servô influencia de la concentraciôn en el estudio de caracterizaciôn
(véase 3 .1 .1 .2 . y 3 .1 .2 .2 . ) no se realizaron, como es évidente, estu
dios de este tipo para muestras irradiadas, fijândose una concentraciôn
de 20 y g/ml para todos los experimentos posteriores de sedimentaciôn,
forma de procéder encontrada también en otros trabajos (34).
3 .2 .2 . Efecto de diferentes dosis de radiaciôn sobre el DNA
Se suministraron 11 dosis distintas de radiaciôn, incluîdas
en un rango comprendido entre 4 y 50 Krad, a disoluciones de DNA que
presentaban la concentraciôn establecida de 200 y g /m l.
3 .2 .2 .1 . Rupturas dobles
En la tabla X I I I se muestran los datos deducidos de la sedi
mentaciôn de las muestras irradiadas de DNA nativo, para cada una de
las dosis recibidas.
- 130 -
o>mc
<ZQ
”Ô)T)X
<_JCD< V)
c<üU)o
'-D03cc
If)IoX
DûN
VO
-O X
-§ s
VOoX
( /)
oCSJ
■O03L
X
wo
û
roCT>
VO Vf)CM
CMCM 00 ro o O ) ro O ) —
I f ) VO VO O IS o TCM
00CM Vf)
VOVO
ro m CMCM
CMCM
roVf) Vf) VO [S
- ro < - 00 < - VO 00CM
roVf) vô
roro
O + 1O00
VO
VO
00 ro Vf)ro
00< -
CMro
eno
CMES
Oenen
O )ro00
< f ro CM CM CM r-T eo eo
o o § VO00
+ 1 c T VO VO VO
CT>VO
Vf)mro ro
00o>CM
CMVO
CM00
CM
CM «—
lO
mGO
+ 1GO GO — CT»
ro GO en 00CM CM «— «—
en
VO
mlO
CM
uoVf) r-
ro
CM •—
CM T -
uoCM
VO VO IS VO D - Vf) OO 00 0 '-o CM CM ro ro Vf) Vf) VO
< - ,— VO 00 Vf) GO CM VO en Vf)r— CM CM ro ro ro ro
"S
iLaL_Ç0Dü
ç>
oE03U)03E
OU)0)ac0)
■gic_aLjç3O_03OE03U)03E
■D0)Ec
\ 0"üÜ2coE
-U<13m03
"U
oCM
03tf)
JO
00
csOô(03u03
JOc
s 30)03U)<0<n(0
“O(03U(0o
c_(0ao
;o\003o3CLOaU)03
JOo
•D<n(0c.3a3L0310gOC033 enO03Lu-« cCM sO
Dû ü(T3
o 3c. ü03 03E <T3%3C CC O03 0)
- 131 -
Aunque en la tabla figuran los coeficientes de sedimentaciôn
medios, s°^ ^ , los demâs valores que aparecen, relatives a promedios
de masa molecular y frecuencias de rupturas, estân calculados a p artir
de las distribuciones intégrales de coeficientes de sedimentaciôn y ma
sas moleculares que, como se sabe, se realizaron siempre en cada ex
périmente. Por otra parte, debido a que en los experimentos de centri
fugaciôn se introducîa un control junto con las muestras irradiadas, y
que las variaciones observadas en los datos correspondientes a estos
contrôles no afectaron de forma significativa a los numéros de rupturas,
el calcule de estas se realizô finalmente frente a promedios de los va
lores referentes a esos contrôles, promedios que son los que figuran
en la tabla.
En relaciôn con los calcules de rupturas, puede observarse
que existen variaciones en los correspondientes valores, segun se ha-
yan calculado mediante la expresiôn de Charlesby (ecuaciôn 1 .18) o a
p artir de la que unicamente considéra los promedios en numéro de la ma
sa molecular (ecuaciôn 1.19). La expresiôn de Char lesby, pese a ser mas
rigurosa por incluir promedios en peso y en numéro de masa molecular,
fue considerada con ciertas réservas, debido a que en ocasiones, para
DNA nativo irradiado a dosis bajas, proporciona valores negativos de
rupturas, hecho que no tiene sentido, por tratarse de muestras en las
que los valores de Mw y Mn son inferiores a los Mw^ y Mn^ del control
correspondiente. Esta puede ser una de las razones por las que en mu
chos trabajos (33) (34) se u tiliza unicamente la expresiôn de promedios
en numéro para el calcule de rupturas. No obstante, en la sucesiva ex-
posiciôn de resultados se seguirân mostrando los valores deducidos de
ambas formulas, con objeto de discutir, en cada caso, las discrepancias
- 132 -
observadas.
Otro hecho que se observa ya aquî, y que va a ser general
en todo el trabajo, es que a dosis elevadas, pequehas variaciones en
las masas moleculares del material irradiado tienen una gran repercu
sion sobre el numéro de rupturas calculadas frente a un control dete£
m inado. Por el contrario, apenas se detectan diferencias apreciables
cuando las rupturas correspondientes a una muestra irradiada se ca l-
culan refiriéndolas a contrôles distintos. Esta es, por consiguiente,
una de las razones que explican, tanto la decision de establecer una
concentraciôn fija para los experimentos de sedimentaciôn, como el
hacer calculos de rupturas frente a valores promediados de varies
contrôles. Las diferencias observadas en los valores de estes, que
por otra parte son los que mas acusan los efectos de concentraciôn,
resultan irrelevantes a la hora de medir los efectos de la radiaciôn,
debido a que se trata de ôrdenes de magnitud diferentes.
Como consecuencia de todo esto, se estimô de interés co-
nocer desde que valores las rupturas se podrian considerar como
significativas. Con este fin , se calculô el numéro de "rupturas" v ir
tuales a que darîa lugar la comparaciôn de los valores de Mw y Mn
calculados a partir de los datos obtenidos a las distihtas concentra
ciones de centrifugaciôn estudiadas en la caracterizaciôn del DNA,
con los Mw y Mn deducidos de los valores extrapolados a condicio
nes de concentraciôn cero. Los valores mâximos que se obtuvieron
fueron de 1 ,04 .10 rupturas dobles/nucleôtido par a p artir de la
formula de Charlesby y de 1 ,95 .10 rupturas dobles/nucleôtido
par segun la fôrmula de promedios en numéro, datos que dan una
- 133 -
idea de lo que puede ser los valores "umbral" significatives a conside
ra r en los calculos sucesivos de rupturas.
En la fig . 21 se representan los valores de rupturas dobles/
/ nucleotide par, , de la tabla X I I I frente a las correspondientes do
sis en Krad. Puede observarse una dependencia cuadrâtica con la dosis,
hecho que no hace sino confirmar que en estas condiciones de irra d ia -
ciôn, las rupturas dobles se producer como consecuencia de la coinci-
dencia, mas o menos estric ta , de dos rupturas sencillas en las cadenas
opuestas del DNA segun se ha visto ya en 1 .3 .2 .3 .
Para procéder al calcule de la ecuaciôn correspondiente a
la grâfica anterior se siguiô el método empleado por Hagen (33) en re
laciôn con la determinaciôn de los paramétrés de la ecuaciôn (1 .2 5 ),
que es la que rîge este proceso:
= ( 3 + kD)^ . n
En primer lugar, el termine 3 , correspondiente a las ru^
turas simples de cadena présentes antes de la irradiaciôn, se supone
despreciable para dosis altas de irradiaciôn. Teniendo entonces en
cuenta el valor de k que se obtiene del estudio de las rupturas simples
producidas por las mismas dosis, puede calcularse, para cada une de
los valores expérimentales de B^ un valor n que, como se sabe, corres
ponde al numéro total de pares de nucleôtidos que se desestabilizan al -
rededor de una ruptura simple. Obtenidos los diferentes valores de n
se establece un valor promedio, n, que es el que se considéra como pa
râmetro de la ecuaciôn. De esta manera se pueden "recalcular" los
- 134 -
*10
302010Dosis (Krad)
Figura 21 Dependencia con la dosis de la fnecuencia de rupturas dobles por nueIeo
tido par, del DNA ( o , valores calculados segun la ecuacion (1 .18);
• , idem, segun la ecuacion (1 .1 9 );— , curva ajustada segun la ecuaciôn
(1 .25 )).
- 135 -
numéros de rupturas correspondientes a las dosis suministradas, obte
niéndose una curva, que se puede considerar como la curva teôrica del
con junto.
Los resultados obtenidos para las distintas n, partiendo del -7 -1
valor k = 2 ,0 .1 0 rad deducido del estudio de las rupturas simples
efectuado en experimentos inmediatamente posteriores (véase 3 .2 .3 .2 . ) ,
dieron un valor de n = 5 ,5 8 . Considerando este valor como n = 6, se ob
tuvieron los puntos que forman la lînea continua de la grâfica an terio r,
la cual, por consiguiente, responde a la ecuaciôn:
Bg = 2 ,4 . 10
en donde D viene expresada en rad.
3 .2 .2 .2 . Rupturas simples
De una forma anâloga, en la tabla X IV se presentan los da
tos de sedimentaciôn de las muestras que fueron desnaturalizadas des
pues de la irradiaciôn.
En la fig . 22 se representan los valores de rupturas simples/
/nucleôtido, , frente a las dosis recibidas. La representaciôn, en es
te caso, se ajusta a una recta, hecho que confirma la informaciôn b ib lio -
grâfica (33) (37). De la pendiente de la recta, deducida de forma grâfica,-7 -1
se obtiene un valor de k = 2 ,0 .1 0 rad (probabilidad de ruptura por
nucleôtido y por rad), con lo que la ecuaciôn (1 .20) adopta la forma:
- 136 -
roIO
* X
of IN o> lO r- CM O t ro IN <7> OlO lO o CO CT» O ro lO O
(0 ' O CM ro to <" VO [N [N VO ro
>
X
<— ICD<I -
o■ DCON
1Ô[_3
cI/)<u■D
(UTJ• uCO■D
inc(UV)o'SCO
c n
VO
t/)
■DCOL.X
(/)oÛ
O ro VO CO ,— O ) r— VO CT> NVO CO CO ro cn lO to CM CO O I
CD CM ro lO to VO CN VO CM
so+1VOo>
m
o
(N
O
VOLO
IN r— O to CO to r— 00ro ro VO CD roO CO to to CM•“ o o CD o o CD CD CDO CD CD CD CD CD CD CD CD
IN ro to CO O ro toO 00 N IN CM VO O 00 VO 00to CM to ro cn 00 IN 00 IN INto CM CD O O O O CD OCD CD CD CD CD CD O CD CD CD CD
$ CD VO CDCD + 1 cn INCM r-U) cn
oVO
o-lO
olO
tN VO [N LOro
VO VO IN VO IN to CO 00 INo r— CM CM ro ro to to VO1— VO 00 to CD CM VO cn to'— «— <— CM CM ro ro ro ro
I ^ O 00 L «—aCO
oU)<uacd>
■ §
ILaL .J O
3UJ )OECO(/)COE
co
g(/)
U)CO
15COU
O
xOJ)o3CLoo.(/)_oaE
(/)( 0L3
IL0 >■ D
■gEC
\ 0
ÛjOc o E Î3O (/)
« I ;o CD xo
oLO
J
J■o(UE
OCO
30)JO
c'□)oV)
- 137 -
10 20 30Dosis (K rad)
Figura 2 2 Dependencia con la dosis de la fnecuencia de rupturas simples por nu-
cleotido, , del DNA. ( O , valores calculados segun la ecuacion (1.1
e , idem, segun la ecuaciôn (1 . 19);— ajuste grâfîco)).
- 138 -
-7= 2 ,0 .1 0 D
siempre que D se exprese en rad.
- 139 -
3 .3 . M O DIFICADO RES DEL EFECTO DE LA RADIAC IO N
3 .3 .1 . Daunomicîna
En los ensayos previos efectuados a relaciones DNArantibio
tico de 3 ,5 :1 y 8,7:1 se pudo comprobar espectrofotometricamente la
formaciôn del comp le jo DNA-daunomicina. No obstante, dado que las va
riacîones espectrales resultan mas difîciles de estudiar a la relacîon
3,5:1 , y que el efecto de las sales NaCI y KCI sobre la absorbancia del
comp le jo a 470 nm es mayor para relaciones inferiores a 8,7:1 (55), se
eligiô para todos los trabajos posteriores la relaciôn de 8 ,7 :1 .
En la fig . 23 se puede comprobar espectrofotometricamente
la formaciôn del comp le jo DNA-daunomicina a la relaciôn mencionada de
8 ,7 :1 . Se observa un desplazamiento en el mâximo del antibiôtico, de
475 a 500 nm . Asimismo puede observarse un desplazamiento en el mâx_[
mo del DNAv desde 260 nm hacia longitudes de onda menores, junto con
un incremento en la absorbancia, producido por solapamiento con la
absorbancia del antibiôtico en esa regiôn del espectro. El maximo que
la daunomicîna présenta a 333 nm queda enmascarado, al coincidir con
una zona de mînimo del DNA y estar présente el antibiôtico en mucha
menor proporciôn.
Las dialisis con MgCI^, efectuadas con objeto de disociar
el complejo y eliminar la daunomicîna, fueron exhaustivas, y como con
secuencia de ellas se observô un notable descenso en la coloraciôn de
las muestras del complejo. Esto apoya las opiniones encontradas en la
- 140 -
260 320 380 440 500A (n m )
Figura 2 3 .- Espectros comparativos de : 1) DNA (25 pg/ml); 2) Daunomicîna (9 ,5 .1 0-6
M); 3) DNA-daunomicina (relaciôn 8,7:1 , para 25 pg/ml en DNA y 9 ,5 .1 0
M en antibiôtico). Rango de absorbancia: 0-2 U .D .O . Rango fotometrico:
0 ,5 .
-6
- 141 -
bibliografîa acerca de la existencia de fuerzas electrostâticas en la fo r
maciôn del complejo (59). Sin embargo, el hecho de que las dial isis no con
siguieran nunca una decoloraciôn total de las muestras impi ica, a su vez,
una parcial irreversib ilidad para el complejo formado. Por estos motivos,
los estudios de sedimentaciôn se realizaron, tanto con muestras sin d ia -
lizar como con muestras que fueron sometidas a dial isis después de la
irrad iaciôn. En cuanto a la desnaturalizaciôn, esta se presentô sin p ro -
blemas, pudiéndose observar como consecuencia de ella la desapariciôn
total del pico de absorbancia caracterîstico de la daunomicina.
Por lo que respecta a los resultados de sedimentaciôn (tablas
XV y X V I) , los contrôles de complejo no dializados mostraron unos valo
res de coeficientes de sedimentaciôn Iigeramente inferiores a los del DNA
control, lo que también se encuentra de acuerdo con la bibliografîa (55)
(56). Sin embargo, el hecho de efectuar la centrifugaciôn de las muestras
irradiadas con dial isis o sin ella no mostrô ninguna influencia a la hora
de calcular las rupturas inducidas por la irradiaciôn frente a contrôles
que hubieran sufrido el mismo proceso. Como puede observarse en las
figuras 24 y 25, los valores de rupturas relatives a muestras irradiadas,
dial izadas y no dial izadas, quedan intercaladas entre s î, permitiendo
trazar una misma curva efecto-dosis,tanto para las rupturas dobles como
para las sencillas.
A la vista de los resultados de sedimentaciôn se puede dedu-
c ir , por consiguiente, que existe un notable efecto de radiosensibiIiza
ciôn del DNA por parte de la daunomicina, manifestado en el fuerte in
cremento de rupturas dobles y sencillas producidas sobre la molécula
del DNA. Hay que hacer notar aquî que a altas dosis de radiaciôn, los
- 142 -
>X
CD<I-
o>
c<ZQ1513C
'215Ü2c(UE13<üW0)
13(/)Om
13yj
_o
c<y(0c
Eoc3(0
13
(U13
O<ULU
O' m ro ro O'1 1JÛ If) 00 m (33 O 00 O roro O- o VO m ro CM ro mirP •” CM CM ro m*o
XCM
m VO'm O' O' 00 (33 (33CM 00 CM r - (3 in CO CM 00 00 roro 00 O CM 00 CS O in 00 00CM CM ro CO
(33 (X)03 CMCO CM CM CM VO (33 03o O O CM i> O' o O oo m IN m m 00 (3X + 1 + 1 If) m CM o - (3 o ro ro CM CM *— *“
(33 CM CM CM ,-T (3 r - (3 C3 (3 (3 C3 C3 (3é CO (33VO <j"
OVO (3 o mo CM CM O 03 ro 03 o ro (33 roX + 1 4-1 VO VO 03 VO o- (3 03 VO 00 CO VO
If)O CO ro - - —** C3 C3 (3 O OCM 03
s (33 r—
O$
+ 1 4-1 » - (33 o o o o c - m 03 ro CMo r - in o CM r-T r-T (3 a> (3 00 00 00 00
CO <—CM CM
13CO 13 13 D 13 13 13 13 13L 3 C 13 c C 13 C 13 c 3 c c 13 cX
(3) 03 o 00 00 ro ro IN CM VO r— f—CO o o CM CM CM ro roCO VO CO (33 CM CM m m 00 ,— IN INo CM CM CM CM
Û
2'aL.
JO3ÜoECO10COE
oCO(UQ.cCD
13CDEoi_a
13CDEc
'2ÜjOcCDE
13CD10CD
13
C
CDCO
CO CO
13 JO3
J3CO U
L COao
;u
\0 _0)u3 C(_OaCO
X )o13CO CO L.3Û .3U ^
03CO «—
'o cCD 3 Ü CD C_
oCDE
o
J
o13CON
13C
o13CON
13
C sOÜCO 3 O
CM CD
JO
'S’CO
OCM
CO13(DE
- 143 -
400
300
200
100
2010Dosis (Krad)
Figura 2 4 .- Efe.cto de la daunomicina en la dependencia con las dosis de la f re -
cuencia de rupturas dobles por nucleotido par, . ( o , valores caj
cul ados segûn la ecuacion ( 1 .1 8 ) ; * , idem, segùn la ecuacion (1.19);
□ , idem, después de la dialisis segûn la ecuacion (1 . 18); # , idem,
después de la dial isis segûn la ecuacion (1 . 19)).
- 144 -
>X
CÛ<I -
Eoc3(0
"O
d>"O
ü(ULU
7O
X
cd
o~DroN"tô3ro c 10 (D
•U
<Z Û13 •oc
\0"ûroc o E13 roU)■U(/)oro
13
o “Ç
ole
in
o
L.X
woQ
§
CVJIN
00
O+1o oM
D -
O+ 1
cr»o
lOo + 1
VOoT
ts00
uo
o
S
Vû IT)eno o
INLf)
N
r -es
00
00 oo m eo
00
eo
vo o> vo es lO
es lo es en 00 00 esr— r — t — r — r — r — C Q
00 CS iT) eo eo
O vo0 0 0 0 r -1— r— es
eo
T- en es • -
CD T- CIf) <"lD < tO O O
iDes 00 D-
00 00 r- o o
00eso
es00ocT
eso o<D
<f C3 00 Lf)1— T— f— 00EN tn eoo o o o
00If) <1"eo o en1— T— oo o o
00 Lf)00 lû om < t o o o
ts o in Ü3 00 U") O eo vo m <1-lO in 00 00 00 00 00
13c+
13
13 13 13 13 13 13 13 13■D C c 13 C c 13 C C 13 c C
en en 00 00 00 o o es vo vo r -o o «— es CSJ CS 00 00 00
vo vo en es es Vf? 00 00 r-T ■vt oes es es es
1 'Ii $a 3LJ2 S3 —üro
oI/)roacro
13roEo(_a
jo3ü_rooEroy)roE
13roEc
'2ürocroE
13ro(/)ro
13
c'2"ûro3Uro
JO
c'âro(/)
3
inro13JO3Orooojg
%o_ro
ü3Ce_oaU)
_ro
aEin
ro13
oes(/)
CÛ
oc_roE
\3CCro
oN
*rô
oc
(/)
g s
a3 L O
13roN
en
- 145 -
B,
:i(T*
30
20
10
2010Dosis (Krad)
Figura 2 5 .- Efecto de la daunomicina en la dependencia con la dosis de la f re -
cuencia de rupturas simples por nucleotido, B ^ ( o , valores calcu
I ados segûn la ecuacion (1 .1 8 );# , idem, segûn la ecuacion (1 .19);
□ , idem, después de la dial isis segûn la ecuacion (1 .18); ■ , idem,
después de la dialisis segûn la ecuacion (1 .19)),
- 146 -
8in
o
oom
oin oro o
A _0)
îo"5 -ooLU (U d V)o
<u c_■8wc
'.2ûm(0 c_
o -o
m (_
■ro <±
c lmtrqû3eséüc(0uoV)J3(00)"OoO)c(0tr
ou: 2!5cnjc0
tO VO I
E>N
C
enoS«0EX*fOE
woT)vn
_C0
(D•DOüO
W
men>><ZÛco
en3 .inCM
Eoc3fO7<zQ oen
voes(0
B ,
- 147 -
valores en el numéro de ruptures son mas divergentes, segûn se haya
utilizado en su câlculo la ecuacion (1.18)o la ecuacion (1.19), divergen
c e ya aparecida en el estudio de radiosensibilidad del DNA (véase
3 .2 .3 .1 . ) . No obstante, estas diferencias no son significatives a la ho
ra de interpreter la actividad sensibilizante de este compuesto, como
lo prueba el hecho de que tanto unos valores como otros quedan muy por
encima de los cor respond ientes a contrôles de DNA irradiados para
igual rango de dosis.
Los datos proporcionados por los espectros, por el contra
r io , no muestran variaciones apreciables para el complejo irradiado,
pudiéndose observer, en concrete, une gran constancia en el pico de
absorcion de la daunomicina (fig . 26), hecho que confirma efectivamen
te que el DNA es el principal receptor de la acciôn de la radiaciôn,
contribuyendo la daunomicina a incrementar notablemente este efecto.
3 .3 .2 . Cromomicina A^
La formaciôn del complejo DNA-cromomicina A^ se compro-
bo espectrofotometricamente. El mâximo que présenta la cromomicina
A^ a 407 nm se transforme en una especie de meseta entre 420 y 440 nm,
mientras que el mâximo correspondiente a 280 nm quedo absorbido y
desplazado por el del DNA a 260 nm (fig . 27). Estos datos confirmaron
asimismo que la cromomicina A^, en su union con el DNA, no présenta
la hipocromicidad caracteristica de los compuestos que se intercalan
entre las bases del DNA.
Basados en los datos bibiiogrâficos sobre disociabilidad del
— 148 —
in
04
CDm
mm
CO
04
oCD
o o04
o(0c Z
r ,Ü
iiC-uI
<ZQro
lOI
CO
EoEoLu
oD)CCDcr
04IO
(O .2u c
5£_ oU)ja <0o>TJ8)c05cr
O)3LIf )o i
< zQ— U) . . Ia; cT)
\0
ctoc0)
(/)o>"toc_<0aEoÜ(floLuoQ.in
LU
ro
CT)
> .i'< zQc <u
3LOOJ
(0cÛ£0Eot_Ü'—
04
(UJ3in>cd)ro
<05CÜ
EoEoC-o•—
<ZÛlO
o
m>c(U
A<u jj)a >iu
Cd)o
04 •—>d)
O a
O'04(0L&
iZ
- 149 -
complejo con disolventes orgânicos (67), hecho que prueba la no exis-
tencia de uniones covalentes en el complejo DNA-cromomicina A^» se
intenté la disociaciôn de este con dodecil sulfato sodico al 1% y poste
rio r dialisis frente al disolvente comùn. Sin embargo, surgieron diH
cultades en la dialisis del propio detergente, asî como interferencias
en el momento de la centrifugacion. Teniendo en cuenta entonces que
en los experimentos de sedimentacion realizados quedo patente que
la formaciôn del complejo no modifica el coeficiente de sedimentacion
del DNA, hecho que concuerda con la informaciôn bibI iogrâf ica (56),
se decidiô efectuar todas las medidas de sedimentacion sin dialisis
previa de las muestras. Por otra parte, la desnaturalizaciôn no pré
senté problèmes.
Los efectos de la radiaciôn se reflejaron tanto en las lec
turas espectrofotométricas como en los resultados de los estudios de
sedimentacién.
El mâximo de absorcién correspondiente al antibiético en
la zona del visible disminuye conforme aumenta la dosis de radiaciôn
(fig . 28), lo que parece indicar que se produce una degradaciôn de
la parte cromcfora de la cromomicina A^. Por otro lado, se observa
también un aumento en las absorbancias mâxima y minima del DNA con
la dosis (tabla X V I I ) , fenômeno que pudiera interpretarse como resu[
tado de una liberaciôn, al menos in ic ial, de bases nitrogenadas.
Los resultados de coeficientes de sedimentacién y prome-
dios de masas moleculares deducidos de la centrifugacién de las diso-
luciones de complejo irradiadas aparecen en las tablas XV I I I y X IX .
- 150 -c £0) W
CN
OLO
OVf
OVf
OOn
LOm
oCMro
oenCM
o(OCM
mCM
00ro>><
oi
ouoro
CLEoü"Ô5■DoL'u(UQ.U)d)(U(_JOO(flC
'2ümtoC-
0>"U
u0)üjI
côCM(0c_DO)
O)C(0q:
iL
k:roroCMCM
.2 E01c_ u I
< zQ o 0)
•otoL
CM
LO
ro■U(0c_
C7>
CM
■gbc:LOO
>Dctu
CM
sO _QJ !û ^i 5to >
- 151 -
>X
m<f-
ro
iiuI
<ZÛ
.2,_0)û.Eoo
"ô■ oU)oo
xd>Eo
o(_üa>ClU)d)U)o(0Q
Ec
oLOCM
<<
Ec
oroII
r <
• r<OQD<
•u(0L
V)oQ
Dv r— ro CT>CM ro . O CM
1O r— »— CM l> ro
CM
Dv LO O- 00 ro Oœ <3" CM CM LO t>
CO ctT • [N oT LO'— >— ro ro '— CM ro
O a> T— 00 O CM LO LOLO 00 CT> CT» O CT> O LOCM r— r— 1— t— CM y— CM CM
II ---- •— '— *— <— y— <— '— <—
O O m m LO CD LO LO lO LOro CD ro CM LO ro O ro CD lO
ro ro ro CM CM ro CM CMII CD (d CD CD CD CD CD CD CD
LO < - ro cr» ro CMO •— CM ro O CM ro
CD oT LO CM O vo LO r -y— CM r - CM
- 152 -
>X
CÛ<H-
o>mc<zQü*DC
nO"ûmc(UE
d>W)<üTJü)Om•Utn
coro
0"D
ü0LU
ts<7> 00 LO LO ts
ts CM CM IT> ts (T t O LO' CM LO (J ) O
CMCT» lO
mI
CMCD
Dvro CT» en 00
LO r— 00 ro o CO» 00 O' LO o • ît
CMoCM
ts
LOOX'c
Oro ro CM ts O
cr> m CO» 00 00
+ 1o CO m CM ro ro
Dv
00
< r ro CM o o O O O
LO
Dv<3"
CD LO COI CO» ts ts m o+ 1
CD CM cr» un CM CM 00 o
LO
LO m CM o
U)oCM(/)
■D(0k:
U)oQ
00o+1
o
LOCM
m r_ <3"un
m o CD LO00 ts £ CD CD CO» coT
LO CO» <3" 00 Dv CM roCD CD CM CM ro ro
<3" LO CO» CM LO 00 CMr— r — r — CM CM
iD 0 % J2
oy>0ac0
■o0EoLaL
JODO_0OE0w(0E
"D0Ec\0ô0c0E-B0V)0•u
oCM
C\DOJ0I/)
U)0T )JO3O0üL0Ûo[O
_0o3CLOa(/)i îo
TOy)0L3
■ë §ü "v"
§ Iu ü 0 0
1 3 0
ocT —c
2 'o) 0 0 E w)
'2 3c œ
o «—TO ^ 0 ^
: . ia o
- 153 -
xIO
200
150
100
10 20Dosis (Krad)
Figura 2 9 .- Efecto de la cromomicina en la dependencia con la dosis de la fre
cuencia de rupturas dobles por nucleotido par, ( 0 , valores calcu
lados segûn la ecuacion (1 .18); • , idem, segûn la ecuacion (1 .19).
- 154 -
X
X
<_JCD<H
OT>(0N
•— r— CNto CN O CD CD CD vo CN VO[_3
O ro VO C^ CN ifT 00 VO 00
"to r o " '1
CN ' CN ro
cin Otu X
"O
<Z 00Q vo VO
CD CD 00 e - 00 00tu to 1 •“
TO CN VO VO If ) O vo o O tNc CN CN ro < "
ÜBc0)E
"sU)
vT )ino"toT?in
_o
c0)
ro
0)■U
utu
ÜJ
vo
vo
in
oIN
"SLX
inoQ
<DO CD CD CN o - ro to 00 8Q <T ro o ro CD VO 00
+ 1CD CN oO O O O O O O o o
CNO
O O o O O O o o o
eg
egIf ) CD VO ro T— ro 00 If )
CD O CD IN CN VOo If ) CD 00 <± If ) < - If )+1 «— O O O o O O O o
<3 C3 O C3 o C3 C3 t3 C3lO
voC3
4-1O 00 i f ) VO 00 VO
ro VO ro ro roe -
ro
oCN
to CD 00 ro < -O O «— «— CN CN
<)" VO CD CN U1 vo
o -CN00
If )
rotoro
roroCNCN
voro
CN
IO 00L r -a
(0
oin0)Cl
c0)
■§
IaL_tO3O
J )oEtointoE
csOÜto3ulU
Iin
intoT3
JO3Otoo
Ô;u
- o
0
1LOa
saE
into(_3
IC_lU
■O
■gEc
\ 0u toc<uETO <u
•ë ;s m
OL.tuE
%3
JOCN T3
tuE
<T>
C'.2*0to
3(U
JO
c'g,tuin
- 155 -
30
20
10
10 20Dosis (Krad)
Figura 3 0 . - Efecto de la cromomicina A en la dependencia con la dosis de la fre -
cuencia de rupturas simples por nucleotido, ( o , valores calcula
dos segûn la ecuacion (1 ,18);@ idem, segûn la ecuacion (1 .19)).
- 156 -
Estos valores resultan ser muy inferiores a los Inducidos por iguales do
sis de radiaciôn en disoluciones que solo contienen DNA. EI lo impi ica ,
comparàndolos con los correspond ientes a contrôles del propio complejo
no irradiadiado, unos numéros de rupturas que, si se representan g ra fi-
camente frente a sus cor respond ientes dosis, proporcionan unas curvas
(figuras 29 y 30) que se encuentran muy por encima de las del DNA ir ra
diado.
De nuevo se observa aquf que, para dosis altas de radiaciôn,
existe una creciente divergencia entre los valores de rupturas, segun la
fôrmula que se haya empleado en su calcule. Concretamente, el hecho de
que la fôrmula de Charlesby (ecuaciôn 1 .18) proporcione numéros de rug
turas mas altos se puede atribu ir a una mayor repercusiôn de estas dosis
de radiaciôn sobre los valores del promedio en peso. Estas variaciones,
sin embargo, tampoco son obstaculo aquî para constatar el efecto c la ra -
mente sensibiIizante de la cromomicina A^, efecto que parece mas acusa-
do en el caso de las rupturas dobles.
3 .3 .3 . Antramicina
En relaciôn con la formaciôn del complejo DNA-antram icina,
se efectuaron ensayos previos con objeto de establecer el tiempo de incu-
baciôn a 37°C . Adoptado como mas adecuado un tiempo de 100 min, se pu-
do comprobar la formaciôn del complejo, espectrofotometricamente, al ob-
servar que el maximo que posee la antramicina a 333 nm se desplazô hasta
343 nm (fig . 31).
Aunque la antramicina no interfiere en las lecturas espectro-
- 157 -
A
80
60
20
300 350250
Figura 31 Espectros comparativos: 1) DNA (25 yg/m l); 2) Antramicina (31 ,6 mg/ml);
3) DNA-antramicina (25 yg/ml en DNA y 1 ,98 mg/ml en antibiotico); 4) :
Idem, dializado con MgCI^. Rango de absorbancia: 0 -3 U .D .O . (antramicn
na), 0 -2 U .D .O . (el resto). Rango fotometrico: 3 (antramicina), 1 ( el res
to para A=300 nm) y 0 ,2 (el resto para A=300 nm)).
- 158 -
fotometricas del DNA, dado que la absorbancia que présenta el antibio
tico a 260 nm es minima, se intenté deshacer el complejo mediante diâM
sis con MgCI^, sal que incluso a bajas concentraciones retarda la forma
cion del complejo (78). No obstante, los datos proporcionados por los
espectros probaron que no fue posible ta I disociacion.
La desnaturalizaciôn, sin embargo, se I levé a cabo norma I-
mente, observandose que el maximo de absorcion que présenta la antra
micina se conserva aun después de la separaciôn de las dos cadenas del
DNA. Este hecho esta de acuerdo con la informaciôn bibi iogrâf ica (78)
y demuestra que la antramicina continua unida a las cadenas sencillas
después de la desnaturalizaciôn (fig . 33).
La uniôn entre el DNA y el antibiético, tanto en muestras na
tivas como desnaturalizadas, persiste también después de recib ir d ife -
rentes dosis de radiaciôn, apreciandose unicamente una progresiva dis
minuciôn en la absorbancia caracterîstica de la antramicina (figuras 32
y 33). Cabe, por consiguiente, suponer una acciôn dégradante por par
te de la radiaciôn sobre el antibiético, acciôn que, sin embargo, no
afecta a su uniôn con el DNA.
En los experimentos de ultracentrifugaciôn de muestras de
complejo se obtuvieron valores de coeficientes de sedimentacién y ma
sas moleculares, magnitudes no registradas hasta ahora en la bibliogra
f îa . Estos datos no difieren de los correspondientes al DNA control,
por lo que se consideraron valides los câlculos posteriores de rupturas
realizados para las muestras irradiadas considerando como contrôles
los datos anteriores.
- 159 -
A
60
40
20
230 260 290 320 350
Figura 3 2 .- Efecto de la radiaciôn sobre el espectro del complejo DNA-antram i
cina (25 pg/ml en DNA y 1 ,98 mg/ml en antibiotico): 0) Control; 1)
6,09 Krad; 2) 12,18 Krad; 3) 18,27 Krad; 4) 24,36 Krad. Rango de
absorbancia: 0-2 U .D .O . Rango fotométrico: 1 (para A =300 nm) y
0 ,2 (para A = 300 nm)^
- 160 -
A
60
40
20
350290 320260230A (nm)
Figura 3 3 .- Efecto de la radiaciôn sobre el espectro del complejo DNA-antramicina
después de la desnaturalizaciôn (20 yg/ml en DNA y 1 ,58 mg/ml en anU
biôtico): 0) Control; 1) 6 ,09 Krad;.2) 12,18 Krad; 3) 18,27 Krad; 4) 24,36
Krad. Rango fotométrico: 1 (para X=300 nm) y 0 ,2 (para X=300 nm).
— 161 —
XX
OQ<f -
a>■D
Ü
H I
mIo*xo >
c<Z Û15 •ocxOo iS cd)Ea>(/)0)TJV)2 (0 "O(/)— ID
m
(0
ID
o*x
( /)
(_X
(/)oÛ
(OCS
roO
ir>
VOcr> CO CS < - CS <J> CSr o CD CS CDCS lOto CD< -
to min CJ> CD <T C3 IN D -CS CT> O r— O CS VO«— T— ro ro
CD r_ CS ro CS CS IN CD CO+ 1 o \ o CS CD O CS
m in ro ro ro CS >— «—
<D VO VO ro in CD 00 CS •Otu 3t_ .+ 1 ro CO m ro CS O E tu 0»CS ccT VO < - ro ro CS CS c ■U
IT )$ CD
O i 00 CD m 00 mo + 1CS .— CD VO VO vn CS CS(A CS
< "CS
(Tt
ID
00 IN O VO CD 00 INCS ro ro ro lOCS 00 CD vo CS COCS CS CS ro ro
Otoc0>E
T )Q)Ü)(U•D
g lo0)
JÜ JOo Eto (/)(0 E
o(/)Q)ac(U
•D(UEoLaLJO3U_Q>OE(0Ü)toE
itu(A'toInto■oJO
3ÜtoÜLt oao
nOjuo3CLOa$■8TD(AtoC_3
- a
cxO*0 to 3od)to
x3g(A
OCS
OQoLd>Ex 3Cc^ oo o —
TS ^0) W
1 1 CL Ü
- 162 -
40
30
20
10
10 20 30Dosis (K rad)
Figura 3 4 .- Efecto de la antramicina en la dependencia con la dosis de la
frecuencia de rupturas dobles por nucleotido par, ( o , va
lores calculados segûn la ecuacion (1 .18); • , idem, segûn la
ecuacion (1 .19)).
- 163 -
XX
CÛ<H
o■o(0NlôL30Ctno"O<ZQ
■oc\0ôjOcoE13(Dtn(D
13tnom13tn
co(0c
013OO0
>4-
ÜJ
roIOX
Cû"
voo
c
vooX
CO
oCSJ
13tOLX
tnoQ
o O CS VO O vo (T>00 CS 00 O m •— tn ro(3 CS ro < - tn tn o Ch
es tn ,— tn es 00 ro[> o vo en CT> tn tnC3 es ro ro tn < - IN Ch
vo vo CT> vo es tn< - CS 00 ro 00 o eso es ro O I > tn tn < - ro+1
ro O O o o o o
Ses
o O o O o o o o
00(N
VO
tnC3+1
o
es
o es 00 ro tN tnro ro
00es ro ro O o 00 VO
m es o oo o o O O o o o
oo (3> 00 vo *— es vo rocjT vo tn tn tn tn
(3> 00 O o VO <J> 00 OO CS ro ro ro tnVO CS 00 CD VO es 00
r— '— CS CS es ro ro
otn0ac0
130Eoe_o .e_jO3ü
_0OE<0tn(0E
"SEC
'2"ûfOc0E
0tn013
OCS
I(03U0J O
\3
gtn
tn(013JO3J 3(0U
O;o
_0o3CC.
âtn_0CLE
tn(0(_3Û.3L
C '.2 o (0 3 O 0
oT -
2 I 0 0 E U)'2 3S
i(-a
00
— 164 —
'4I
xIO
8
6
A
2
10 20 30Dosis (Krad)
Figura 3 5 .- Efecto de la antramicina en la dependencia con la dosis do la fre
cuencia de rupturas simples por nucleotido, B ( o , valores calcu
lados segûn la ecuacion ( 1 .18); # , idem, segun la ecuacion (1.19))
- 165 -
Los valores de sedimentacion correspondientes a las mues
tras irradiadas aparecen en las tablas XX y XX I . Puede observarse
que estos datos no difieren ostensiblemente de los correspondientes a
DNA irradiado en las mismas condiciones. Consecuencia de ello es que
los numéros de rupturas inducidas, calculados frente a contrôles del
mismo complejo, permiten trazar unas curvas efecto-dosis, tanto para
las rupturas dobles como para las sencillas (figuras 34 y 35), que pre-
sentan las mismas caracterîsticas que en el caso del DNA irradiado.
Se puede concluir, por tanto, que la antramicina, si bien da
lugar a un complejo muy estable con el DNA, no es capaz de modificar
notablemente la radiosensibilidad de esta biomolécula.
3 .3 .4 . c i s-d ic I orodl am inp latino ( I I )
La existencia de un complejo DNA-cis DDF se puso de mani-
fiesto por las variaciones espectrales observadas en la region del mâxj_
mo y del mînimo del DNA. Los nuevos mâximo y mînimo se presentaron,
junto con un incremento de absorbancia, a las longitudes de 264 nm y
238 nm (fig . 36), resultado que concuerda con los datos bibi iogrâf icos
(91).
En cuanto a los resultados de los experimentos de sedimenta
cion, la formaciôn del complejo diô lugar a un incremento muy fuerte
en los valores de coeficientes de sedimentacion, hecho que résulta d i-
fic il de explicar desde las hipôtesis que sobre el tipo de uniôn entre
el cis DDF y el DNA se encuentran en la bibi iogrâf la (48). Los coefi
cientes de sedimentaciôn resultan ser très veces superiores, aproxi-
- 166 -
A
60
20
230 260 290 320A (nm)
Figura 3 6 .- Espectros comparativos: 1) DNA (25 pg/m l); 2) DNA-cis DDP (25
yg/ml en DNA y 4 ,16 .10 M en c is-D D P ). Rango de absorbancia:
0-2 U . D . O . Rango fotometrico: 1.
- 167 -
madamente^ a I os valores del DNA control (tabla XX I I ) . Aplicando las
ecuaciones de correlacion habitualmente empleadas en este trabajo, es
to supone masas moleculares de hasta 250.10^ Dalton, estimacion que,
no obstante, se ha de admitir con réservas, dado que para ese rango
de coeficientes de sedimentacion las ecuaciones de correlacion no t ie -
nen garantizada su validez.
Thomson, en su trabajo de revision (48), alude a la posibiM
dad de que existan très tipos de enlace en la union entre el DNA y el
cis DDP: enlaces dentro de una cadena sencilla, enlaces entre las dos
cadenas opuestas del DNA y formacion de quelatos dentro de una misma
base purica. Aunque solo existe confirmacion experimental sobre I os
enlaces del segundo tipo, todo parece indicar que el primero es el mas
abundante.
Los resultados obtenidos en el presente trabajo, sin embar
go, apuntan mas bien a la posibilidad de formacion de enlaces cruzados
entre distintas moléculas de DNA para dar lugar a agregados molecula
res mayores, puesto que una variacion de tal magnitud en el coeficien-
te de sedimentacion séria muy difîcil de explicar solo por cambios con
formacionales en la molécula de DNA, teniendo en cuenta ademâs que
las condiciones de fuerza iônica fueron las mismas que en otros: casos..
Ahora bien, si existen enlaces entre las cadenas opuestas de
la doble hélice, logicamente apareceran problemas en el momento de la
desnaturalizacion. Se procediô a la desnaturalizacion de las muestras
de complejos DNA-cis DDP por el sistema habituai y se observé que
los coeficientes de sedimentacion continuaban siendo de un orden ana-
- 168 -
XX
00<
acECO
13Ot_O
7in
(ÜTJ
oCD
ÜJ
u
If)I
0 >
c<ZQ
~Q}T>C
nOu(0c<DE1inCD
13inoCD
13in
_o
cCD
— c
CM00
U3O'x
0)
oCM
13COt_X
ino
Û
o If) lO lOCN If) CM o
00 00 00 CN
O
o "
INo
CO £N CM<0" ro CMIN IN IN LO —
00 (T i O CDCM (3) If) If)CM CM
fO IN IN rOO IN CMIN lO lO ci>
C3) CO D-O CMlO CM 00
ICOcCDE
13CDin
CLc"ÊCO
13ot_o
7in
(U13
UCD
LU
cvOÔCON
"cOc_D"cOcinCD
13CD
13
C0)
ECOloL
'2c
DinCD3cr
(D13C
nO
$ 00 00(3 IN <3) COCM IN if)
13COL.
X
inoÛ
O) 00 INo CM
o lO CM CO
(D|iaL
JODU
_0)oECOinCOE
oinCDacCD
7ic_ac_
JO3o
_0)oECOinCOE
13CDEc
'2ÜjOcCDE
13CDinCD
13
GO
cî2*ôCO3O0 (01in
' to
inTO13JO3OTOU
(_TOCl
o13kO -2 Ü 3 CLo ain
I I... 13
3O
oEc_oaino
13TON3C_ÜinTOoTOcTO
inTO c.3Û .3 i .TO
13.2 uo cTO 3 U TO (_
C3)
TO 00 5 oS §" Jc
CM O in z ;
c- s O CM -
CO
3TO TOC
oO)TOin
- 169 -
logo al de las muestras nativas (tabla X X I I I ) , hecho que induce a pensar que
existen enlaces entre las cadenas opuestas de una misma molécula, ademâs
de los enlaces cruzados entre distintas moléculas. Los câlculos que se rea
lizaron en este sentido dieron un valor de 7-9 enlaces cruzados por molécjj
la (tabla XX I I ) .
Todos estos problemas, y la escasa posibilidad de resolverlos
con las técnicas utilizadas en el présente trabajo hicieron que no se p ro -
fundizara en el estudio de la accion de la radiacion sobre el complejo D N A-
-c is DDP. Se suministraron entonces solo très dosis, las cuales dieron in -
dicios de producir cierto efecto dégradante (tabla XX I I ) . Por otra parte,
el efecto de la radiacion se mostro mas acusado sobre las muestras que des
pués se sometieron al tratamiento de la desnatural izacion (tabla XX I I I ) , le
que se puede interpreter como una consecuencia de la existencia de zonas
mas o menos extensas en las que la separaciôn de cadenas es mas factible.
En términos générales se puede dec ir, por tanto, que debido a
la formacion de estos complejos fuertes e irréversib les con el cis DDP, el
DNA no podrîa proseguir correctamente su actividad en la célula viva. El
efecto de la irradiaciôn serîa entonces despreciable, pues el dano biologi-
co mayor provendrîa de la propia interaccion entre el DNA y el cis DDP.
3 . 3 . 5 . Mitomicina C
En las lecturas espectrofotométricas se pudo observer (fig. 37)
que la molécula de mitomicina C présenta un mâximo de absorcion importan
te a 363 nm, otro a 218 nm y una concavidad en la region de 260 nm con ab-
- 170 -
GOm
U)m
o>CM
u>CM
OCM
OCO
L) cltoto JDc (.
u o(/)Eo
JÛto0)
E •0T 01
< czQ
COoc
(AU)
E '*2o VE 0)
-0'I 1/1o \tu
3a
If) Ü1CM o
•D
E(U
U ■OtocÛ
E 0o o
£ '2Z
CM« c
toE c
<uOl3. Ê
If)CM O)
E< CMz 1o O
If)CMI/)
o> >»toc_ <toa zE Q0 cu tutflo sLu
\01<u 3 .
aI/) If)HI1
CM
ttoc_D01iZ
»0)Eo
oC lc(0CC
qQD7o
.5*0
- 171 -
sorbancia ligeramente menor a la tercera parte de la medlda en los max_[
mos. Los espectros caracteristicos de las mezclas de DNA y mitomicina
C proporcionan curvas bien distintas de las de sus componentes, a con
secuencia de la aditividad de absorbancias.Asî, el mâximo de 260 nm es
ta al go incrementado y ligeramente desplazado a 255 nm, el mînimo de
230 nm se encuentra muy incrementado y desplazado a 236 nm, mientras
que, por el contrario, y como cabîa esperar, el mâximo del antibiôtico
a 363 nm permanece inalterado.
Con objeto de eliminar el antibiotico de las mezclas, se efec-
tuaron diâlisis frente al disolvente comun de trabajo antes de los experi-
mentos de ultracentrifugaciôn. Estas diâlisis consiguieron recuperar en
las muestras el espectro caracterîstico del DNA. De este modo, las de-
terminaciones de velocidad de sedimentacion correspondieron a DNA, y
todo efecto de radiacion que se observera, diferente del obtenido en los
estudios de radiosensibil idad del DNA serîa consecuencia de la presen-
cia del antibiôtico en el momento de la irradiaciôn.
En las tablas X X I V y XXV aparecen los resultados de la se-
dimentaciôn de las muestras irradiadas, asî como los cor respond lentes
a una media de contrôles no irradiados que habîan sufrido el mismo tra
tamiento. Puede observarse que los coeficientes de sedimentaciôn y las
masas moleculares son superiores a los inducidos por iguales dosis de
rayos X en soluciones de DNA. En las figuras 38 y 39 se representan
los valores de ruptures dobles y sencillas frente a sus dosis correspon-
dientes. Estos datos se calcularon en relaciôn a los contrôles ya mencio
nados, observândose como en casos anteriores ligeras discrepancias se
- 172 -
XX
CO < I—
o>
c<zÛ"0*Dc\0*o(0c0>EŸif)
0)-QV)O"to•ÜU)_oc(U(J(0c
IE
JO
<u-Oo(U
H I
o
COCM
O
"x'c
VOoX
%
in
oCM
■DCOL
X
U)oÛ
O ) If ) O If ) CO ,—
CO if ) CD [>
CM < - CO VO CO CN
lOo
o —
<TtCM
O + 1
If)CD + 1
T - CD
rO
rO
CD
00
00 VO CO«— CO <0- CM
fO VO ifT
CM CO D - CO IN CM if )CO CO if ) VO O If ) CO
If ) I f ) <± if ) CO CM
[NIN
CMVO
If)CO
VO VO
a>VO
If)
If)CM
OCO
If)If)rO
CD O O ) CM O ) CD if ) CM CO+ 1
O ) (D CO if )CM CM CM
CD CO o VO if ) CO CMO CM CO if ) VO CM
VO CM CO O VO CM COr— •— CM CO CO
m lJ O 3
Ü3 OUJ ) J O
0 cE \ 30)(0 0)(/) V)
(0Ec (A
2 (0TOCOo
y) 3(D Ua COc o0)o (_
10" Oo aE 0o(_p . v OL _2CO o
3D cU
-2 Lo O
aE VACO cu(ACO JOE o
TJ•* (A
5 toZ C
3o a
y3c_
(DE (U
TOc'2
CO
’o 'ojO C
<Uc 3CD OE CU
(_TO<U(/) CMcu CO
•D(I) o
(_c cu.2 Eo \3
Co c0 <uu o
CDCM
■oCDEoc.Û.
O)
cs3S'(/)
CO
- 173 -
CM
O
OCM
O
lAOO
I oD —CL O Û.U)
■§■o(0(_3Û.3C.O•D
(DT)
(/)O"O
0.c(U
-o
1-o
c'.2û(03üQ)JüC
'o )0)M
Eo
%)
00
(0 r—
C'2ü<03O<ü
JO
co050)(/)0)
-§_Ç03U(0üÜ505C.O
o m
EoÊ_fO(U
"U
ü0>
ÜJI
0000(0L305
CMCÛc_fOûo
;d
\0o
- 174 -
>XX
CÛ<H
o■ om_N75L3mc( /)(D
- O<ZÛ"m•D
c' 2’ ü2c0>E
'-B0U)0
- DU)O0T)( f l
C0U0C
Eo
E_00•O
o.0ü j
?oleCQ
(OoX
' c
COo
U)oCM
■ §LX
ü)OQ
CO 00 uo 00 iT) 00 r—00 CO 05 CM 00 05 00
O o O «— t — «— CM 00
00 O 00 CM 1— CO o r —
00 en 00 00 CO 00 IT)
C3 o C3 CM 00
CM CO (7500 un CM 05 EN
O 00 OO CN CM en un C35 (N+ 1 I T ) 00 CM CM o O
C75 O O O O o o o O
m00o+1
0000
05o+1
CO
00
o *— ,— 00 CO CO (N00 m o CO O < " O- CMO CO 00 00 CM «—t-T CD o CD o CD CD CD
c~-o 00 t— 00 O O m
00 OO C^ CO in
(35 00 (N CO in 00 CMo CM 00 m CO INCO CM 00 <t o CO CM 00
«— r— CM 00 00
I ^ o 00 c _ »— a
0
o«/)0Q.C0
■ sEoLaL_
_ 03ü
_ 0OE0ü)0E
c
0V )
7oin033ü0U
O; u
_ 0u3CLOaU)
_ 0aE
•5 m( 00c.3
%L0
■ D
■ O 0 E c
'2 o 0c 0 E
" stn
■§ 7s m
OL0E
\ 3
OCM ■ O0
E
05
C'2
o03ü0
_ 0
C% 3
O )0U)
- 175 -
CT>t_ f-Oa T-
#o
m
8
(/)_0)
t
m(0C-Da3L.
(U•D
C'2Û<03UJO
IV)
I*D
<ü"D
iflO■D
OC(Ü*DCCDaoTJ
cs3U )<uW)Ü)-8-JO3Ü
-5 15uc0)
U<0c
EoE
JO
<D"O
Ü<Uü ]I
o>COCOt_D)
lZ
0ÛoJO\0_0)u3C
- 176 -
A
60
60
40
20
260 300 380X(nm)
Figura 4 0 . - Efecto de la radiacion sobre él espectro de la mezcla DNA -f mitomi-—2
cina C (25 yg/ml en DNA y 1 ,25.10 mg/ml en antibiôtico): 0) Con
trol; 1) 6,09 Krad; 2) 12,18 Krad; 3) 18,27 Krad; 4) 24,36 Krad; 5)
30,45 Krad; 6) 36,54 Krad; 7) 42,63 Krad; 8) 48,72 Krad. Rango de
absorbancia: 0-2 U . D . O . Rango fotométrico: 1.
- 177 -
o
C Om
mm
<Nm
aiC H
CO
m<s
olO w
*D«0L
OvO
OLCOu
05E
CNJI
mCM
U(0c
Eo£_fO(DTJOC_Ü<uama>
<uc_Ol/lc
\0û.5Tl10£_
<üX»
ü(U
<4-LÜ
I
"0«0
CMC^
00<0"
CO
■oto[_
k :(OCO
CM
i f(0c_
k :
lO
CO(OCO
i f(0c_
in 0O
o c_00 %(UlO Eoi f o(0C- ■ ’o01
CO c<0CO 0 :
CM oQ
-ü(0 Dc_ CM1
o OCM
ÇO00 O
Cto
ro jQL
i f 0(0 l/lL O
to
00 tu•uO
CM Olcto
CM q :
(0L.301
U -
— 178 —
<ZQ(U*D
ÜC<u(/)(ULCl
C<ü(0•u<0
(0LL.
VOro
<ZÛ
CM O 0- O 00 ro 00(T> ro ro O CT> enro VO C7> CM Ol t—
CM
lOro
VOI
IN < - VO en r—CM CM en <n (N ro
U O O IN VO tN ro ro•— CM CM ro ro U O
>XX
m<h-
ufOc
Eo
Ejo0 ■oc\0û(0■oto(_01 <u "D
d)T)Oü
Û
% <ZQ
IN o CM VO CM C^ CD 0000 VO uo ro CD 00 U OU 1 U O uo U O ir> U O
O CO CD CD CD CD CD CD CD
ro VO UO O CM CM 00 CM00 en VO CM IN VO CM I NU O U O < " ro ro ro CM
CD CD CD CD CD CD CD CD <D
oc.o0)ÛLw(U
■oDm
ÜJ
"O(0LX
uioQ
en 00 C^ VO UO < t ro CMo «— CM ro U O VO CN
VO CM 00 CD VO CM 00'— CM ro ro
- 179 -
gun la formula utilizada. De todos modos, puede apreciarse que estas
grâficas se encuentran por debajo de las cor respond lentes a DNA irra
diado, de donde se deduce que el antibiotico ejerce una accion protec-
tora en la degradaciôn del DNA por la radiacion.
Por otra parte, en el estudio espectrofotométrico realizado
sobre muestras irradiadas sin d ia lizar (figuras 40 y 41) se observa que
el mâximo correspondiente a la mitomicina C decrece con las dosis c re -
cientes de radiacion, y que esta disminuciôn es aùn mayor que la apare
cida en las disoluciones de mitomicina C irradiadas (tabla X X V I ) , lo
que révéla que la degradaciôn del antibiôtico es mayor si el DNA esta
présente en la disoluclôn,
Ambos efectos inducen a pensar que existe una competencia
entre ambas moléculas por los radicales producidos como consecuencia
de la irradiaciôn. Igualmente, la presencia de DNA puede ejercer una
acciôn estabilizadora que alargue la vida media de los radicales, con
lo que la molécula de mitomicina C , mas sensible a la radiaciôn que el
DNA, résulta mas intensamente danada en presencia de éste que cuando
se encuentra sôla, explicândose de este modo la acciôn protectora del
antibiôtico respecto del DNA.
3 . 3 . 6 . Cloroquina
Entre las distintas bandas de absorciôn que présenta la clo
roquina en el U . V . , cor respond ientes a las longitudes de onda de 237,
257, 330 y 343 nm, se estudiô esta ultima en relaciôn con la uniôn en-
- 180 -
80
60
40
20
270 330300 A(nm)
Figura 4 2 . - Espectros comparatives de: 1) DNA (25 yg/ml); 2) Cloroquina-5 -5
(5.10 M); 3) DNA-cloroquina (25 yg/m l en DNA y 5.10 M en
cloroquina). Rango de absorbancia: 0-3 U . D . O . Rango fotomé
trico: 1 .
- 181 -
tre la droga y el DNA. La mezcla de las disoluciones de DNA y c lo ro -
quina dio lugar a un ligero desplazamiento (de 4 a 8 nm ) en la banda re
fe rid a , junto con un descenso de absorbancia (fig . 42), datos que, se -
gun la b ib iiografia, confirman la formacion del complejo (107).
Por otra parte, los maximos de la cloroquina correspondien
tes a 257 y 237 nm, al coincidir con regiones de absorbancia del DNA
plantearon el problema de su interferencia optica en el curso de la cen
trifugacion. Por este motive, y prescindiendo de que las absorbancias
pudieran ser simplemente aditivas, se prefirio eliminar la cloroquina
del complejo antes de procéder a la sedimentacion de las muestras. Es
te objetivo se consiguio plenamente mediante diâlisis con MgCI^» en pé
riodes de tiempo no muy largos (inferiores a 48 boras), demostrandose
la disociacion del complejo y posterior eliminacion de la cloroquina al
observar la total desaparicion del mâximo que esta présenta a 343 nm y
la perfecta recuperaciôn del espectro caracterîstico del DNA en la zo
na de 260 y 230 nm.
No obstante, antes de efectuar las diâlisis se hicieron prue
bas espectrofotométricas para las muestras irradiadas, con objeto de
estudiar la influencia de la radiacion sobre el complejo. Como puede
observarse en la fig . 43, no se detectaron cambios apreciables en nin
guna zona de) espectro, conservândose las bandas con intensidades se
me jantes.
Los datos de sedimentacion de las muestras irradiadas, cornes
pondientes, por consiguiente, a DNA que en el momento de la irradiaciôn
se encontraba en forma de complejo con la cloroquina, manifiestan la
- 182 -
A
80
60
40
20
330 360270 300A(nm)
Figura 4 3 . - Efecto de la radiacion sobre el espectro del complejo DNA-cloroqui-
na (25 yg/ml en DNA y 5.10 M en cloroquina). Rango de absorbancia:
0-3 U . D . O . Rango fotométrico: 3.
- 183 -
>XX
OÛ<K
o>roc<ZQ
"rô■DC\0uroc(UE
<U(/)0
"Umoro
13il)_oc0roc
’5E_oü
_ro
013
ü
LU
mIo*x
esCD
oX
VOo*x
m
(/>
■DroLX
(/)oÛ
oCM
00
00
O + 1
VO
es
es o 00 es 00 o[N D- o uo es 0000 00 00 es 00 VO o
CT> Oes
VO uo
o «— es es oes
O)00
VO
VO
uo
oo>
uo CTi VO CT> mVO es VO o es uo o» •— tsr— es es «— es VO «— <)"
+ 1
o
00
uo
00
I/O
o
uo uo
<J>
uo
VOes 000000
VO
es
VOeses
00
+ 1oV f)
eses 00VO
00O )
O)< "
00es eso
VO VO D - o - [> VO < t 00 00
00
uoVO
VO CO 1— o uo 00 c^es 00 UO uo VO,— es 00 [N o 00 en Vf)'— r— es es 00 00 00
3U c0
U )“ô ■ 0E if)
roU) roroE y)ro■oc _ro
2 3O
o roU)0 oa
c_c ro0 ao o
]00E %o0 0c. oa 3L Cro e_3 oü a
if)O 0E S ioroif) ■oro 0)E roL
D$ a2 3
Lo 0
130 roE uc c
'.2 0*ü 3Oro 0c (_0E es
1 OÛü) o0 e_
"0 00 E\3C C0 C[u 00 oO ’- BU 0
E5 oc_
O aes t_
if) J5
a>c\0üro3O0
J5c
S'i l )
00
c'2’üro3O0
- 184 -
TJ
e o
• o
oo(S
IDcoaU)
—
oT)V)10c_3a3C_
<D•U
<ü■D
mo•D
Vc(ü*DC0)a(D•Q
C0)(0c
*3ao£_O
(U"O
u<ÜüjI
<±mL3D)
Ll
a»
c'â<DU)
E0)•ou c(U 3 ü (D (_
CO —C\3O)0U)mo"O
_C03ü(0üm(Uc_oCO>
CM00L<0ao;u
'O<u
_ 185 -
>XX
CÛ<h -
o"O(0N
lôL.D(0Cü)(U
•D
<ZQ"ôj■ocsO"u(0cd)Ed)y)(ü
■üü)om
"UV)_oc(U(0c'5aoL_oUjOd)TJ
Üd)M-LlI
roI
mCO VO VO ro CM VO CN CM N O
00 CN 00 a> VO ro 00 OV(0
' o o o O »— o CM CM ro VO
VOo
X'c
VOo
*x
0)
oCM
TJ(0L.X
(/>oû
O VO VO C I ,— O O r - 00 vO OVO O 00 CT> CM CM O vO
O '— o O f — «— CM CM ro VO
mo
o+ 1
o<jt
m00
CD+ 1
mo
m
CN CM OlO VO ro N- VO CN CM VOO VO O VO CM CM < - CM CT> VO
CM ro CM CM CM O O O
O O O O O O O O O O o
CM 00 en 00 CM CN en en VO enroCN
vO VO CN 00 en en en CNvO ro ro ro CM CM o o
O O o O O o o o o o o
CD+ 1 S o e n vO CM
CN e n 00 00 CO 00
Vf)
cVO
VO
lOVO
VO
VO
CM
VO
VO
G)
ro VO 00 CM CN T— O VO O 00 NCM CM ro < - VO VO VO
en 1— CM VO 00 CN O ro en VO«— r— «— «— CM CM ro ro ro
Oy>d)acd)
■siLat_JE3OC)oE(0(/)(0E
•od)Ec
'2ü(0cd)Eiod)m<u
*u
oCM
I«03Ud)
JE
IU)
'fOen(0
13U(0u
OJDxO_d)ü3CC.Oaen
_d>aE
y)(0£_3
t ^
-S 2
ÛÛ -C
2 'o)d) d>E ^
'2 3c
œO * -
? — d) w
: Ia o
— 186 —
m
oCM
•O
CO
■ottV IoO
col31/) ü(U O
a COE
’(/) c%3
(/) 0)fO OL en3Û. E3 oL "OO
"O
.2 # ’
"ûc(U CO3O0>L c
JO '2u
<ü CO•u 3
Om oV)o JO
■D cm \3
O)c (Uo U)u enfO o
■oü JOco 3
T) uC cO(U Oa<u U)
*D OLto O
C CO(U >CO *C O3 '—'cro CÛ
_oo o
T3JÇO %
\0(U
"0 O0 3
Cu<ü L
OLU
1a
cX<0"COL3en
o>
Ll
- 187 -
accion dégradante de la radiacion, tanto para el caso de muestras nati
vas como desnatural izadas (tablas XXVI I y XXVI I I ) . No obstante, la
disminuciôn de los coeficientes de sedimentaciôn y masas moleculares
no es tan intensa como la que se observa cuando se irradian dosis igua
les sobre disoluciones anâlogas de DNA. Traducido ésto a valores de
rupturas dobles y sencillas, calculadas frente a contrôles que sufrîeron
el mismo proceso de d iâ lis is , se obtuvieron unas curvas efecto-dosis
que se hallan por debajo de las correspondientes al DNA irradiado (fi
guras 44 y 45).
Se puede concluir, por tanto, que la cloroquina, una vez que
forma complejo con el D N A , actua en relaciôn con esta biomolécula con
propiedades radioprotectoras.
I V. C O N C L U S I O N E S
- 189 -
ternera.
En este trabajo se utilizô un DNA que se extrajo de timo de
Se procediô en primer lugar a la caracterizaciôn de su ma-
sa molecular, obteniéndose para el DNA nativo unas masas moleculares
promedio en peso y promedio en numéro de:
Mw = 25,8 .10^ Dalton Mn = 9,46.10^ Dalton
valores que indican un grado de polimerizaciôn similar al encontrado en
otros trabajos para este tipo de DNA.
Para el DNA desnaturalizado, los valores obtenidos en esta
caracterizaciôn fueron :6 6
Mw = 3 ,78 . 10 Dalton Mn = 2 ,09 .10 Dalton
A continuaciôn se estudiô la radiosensibil idad de este DNA,
evaluando las rupturas simples y dobles que la radiaciôn induce sobre
las cadenas de la biomolécula. Dada la escasa trascendencia de los efec
tos de concentraciôn observados en la caracterizaciôn, se hizo aquT un
estudio de la repercusiôn de este efecto sobre los valores de rupturas
cal cul ados, con objeto de f ija r las condiciones de trabajo definitivas en
el momento de la centrifugaciôn. Con este fin, se hicieron los câlculos
pertinentes a partir de concentraciones distintas de DNA nativo, corres
pondiente a una muestra que fue irradiada previamente a una dosis deter
minada. Se llegô a la conclusiôn de que era innecesario efectuar expeN
mentos de sedimentaciôn a concentraciones distintas, calculândose al mis
mo tiempo los valores "umbral" de rupturas dobles, a partir de los cuales
estas se podîan considerar como significatives, y no como mera consecuen
cia de efectos de concentraciôn. Estos câlculos dieron como limite mâximo
- 190 -
un valor de 1,04.10 rupturas dobles/nucleôtido par.
Ya en los experimentos de radiosensibil idad propiamente
dichos, efectuados irradiando el DNA con diferentes dosis, incluîdas
en un rango comprendido entre 4 y 50 Krad, se obtuvo un con junto de
numéros de rupturas que se ajustaron a las siguientes expresiones:-13 2
= 2 ,4 .1 0 D
para las rupturas dobles, y:
8^ = -2 ,0 .10” D
para las rupturas sencillas.
Las curvas efecto-dosis asî obtenidas fueron util izadas pos
teriormente como referencia para calibrar las posibles modificaciones
que los compuestos estudiados indujeran en los valores de rupturas del
DNA.
Los compuestos ensayados como modificadores fueron: dauno
micina, cromomicina A^, antramicina, cis-diclorodiaminpiatino ( I l ) ,
mitomicina C y cloroquina.
Excepto en el caso de la mitomicina C, antibiôtico que sola-
mente se mezclô con el DNA, antes de la irradiaciôn se procediô a la
formaciôn de un complejo entre cada uno de los productos mencionados
y el DNA, hecho que se comprobô estudiando las alteraciones apare-
cidas en el espectro caracterîstico del producto, del DNA o de ambos
conjuntamente.
Una vez efectuadas las irradiaciones, y antes de realizar
los experimentos de sedimentaciôn de las muestras de DNA nativo para
- 191 -
calcular las rupturas dobles, se procediô o no, segun las caracterTs-
ticas de cada complejo, a su disociaciôn mediante diâlisis adecuadas.
No obstante, se reservaron siempre alicuotas de todas las muestras
de complejo sin disociar, con la doble finalidad de efectuar estudios
espectrofotometricos sobre su radiosensibil idad, y de someterlas al
proceso de desnaturalizaciôn necesario para poder calcular las rup
turas simples por sedimentaciôn. El câlculo de rupturas dobles y sen
cillas se hizo, en todos los casos, comparando las masas molecula
res de las muestras irradiadas con las correspondientes a contrôles
que sufrieron idénticos tratamientos.
Las representaciones grâficas de frecuencias de rupturas
frente a dosis de radiaciôn permitieron deducir, por comparaciôn con
la correspondiente grâfica de DNA irradiado, el comportamiento radio
sensibilizante o radioprotector de cada uno de los productos ensaya
dos, estudio del que se obtuvieron las siguientes conclusiones:
I) El antibiôtico daunomicina, capaz de formar complejos
con el DNA mediante interacciones mixtas de tipo electrostâtico, puen
tes de hidrôgeno e intercalaciôn entre los pares de bases, manifiesta
una notable resistencia a la acciôn dégradante de la radiaciôn, com-
portândose ademâs como un poderoso agente radiosensibi lizador res
pecto a rupturas dobles y sencillas inducidas en el DNA.
I I) La cromomicina A^, antibiôtico que forma complejos
estables de carâcter no covalente con el DNA, présenta importantes
efectos radiosensibilizantes sobre esta biomolécula, tanto desde el
punto de vista de las rupturas dobles como de las sencillas.
- 1 9 2 -
I I I) La antramîcina, antiblôtico de estructura no planar y
que se une al DNA de forma estable, aunque no bien estudiada, no mo-
dlfica las caracterîsticas de sedimentacion de! DNA native ni del desna
turalizado. En relacion con la radiacion, las muestras irradiadas de corn
plejo no presentan variacion en el numéro de rupturas respecte al DNA
irradiado. El compte je , por otra parte, résulta estable a la radiacion,
observândose ùnicamente una degradaciôn del grupo cromôforo del anti-
biôtico.
IV) El complejo inorganico cis-diclorodiaminplatine ( I I ) ,
que se une fuertemente al DNA mediante enlaces inter e intracadena,
actûa incrementando fuertemente el coeficiente de sedimentacion del
DNA e impide su desnaturalizacion. Este hecho se ha interpretado co
me consecuencia de la formacion de enlaces cruzados entre moléculas
de DNA. La acciôn de la radiacion parece , no obstante, disminuir les
valores del coeficiente de sedimentacion del DNA sometido a proceso de
desnatural izacion, hecho que sugiere la existencia de zonas en las que
se produce la separacion de cadenas.
V) El antibiôtico mitomicina C , que previa activacion es ca-
paz de formar enlaces covalentes con el DNA, al encontrarse mezclado
con esta molécula la protege de la acciôn dégradante de la radiacion, he
cho que se pone de manifiesto en la disminuciôn del numéro de rupturas
dobles y simples observada en el DNA. Este comportamiento se interpre
ta como consecuencia de un mécanisme de competencia entre ambas molé
culas por les radicales radioinducidos, proceso en el que la mitomicina
aparece como mas radiosensible.
- 193 -
V I ) La cloroquina, droga antimalarica cuyos complejos con
el DNA presentan caractères mixtes de union electrostâtica e interca-
laciôn entre las bases, se comporta, una vez formado el complejo, con
una gran resistencia a la radiacion, tante desde el punto de vista estruc
tural como espectral. El numéro de rupturas simples y dobles que se pro
ducen en su presencia sobre el DNA es claramente mener que el que se
induce sobre esta biomolécula cuando se irradia en condiciones normales,
actuando por consiguiente, la cloroquina como un radioprotector.
y V I I) No se ha ha II ado ninguna correlacion entre las caracte
rîsticas de union al DNA de les productos estudiados y su actividad como
modificadores de les efectos de la radiacion.
V. B I B L I O G R A F I A
- 1 9 5 -
(1) D E R TIN G ER , H .; JUNG, H.
"Molecular Radiation Biology". Springer-Verlag, Berlin . 1.970.
(2) ALTMAN, B .K . ; GERBER, G .B .; OK ADA, SH.
"Radiation Biochemistry" (vol. I ) . Academic Press. New York and
London. 1.970,
(3) FA B R IK A N T, J . l .
"Radiobiology". Year Book Medical Publishers. Chicago. 1.972.
(4) DALRYMPE, G .V . ; GAULDEN, M .E .; KOLLMORGEN, G .M .; VO
GEL, H .
"Medical Radiation Biology". W.B. Saunders Company. Philadelphia
London. Toronto 1.973.
(5) P IZARELLO, D .; W IT C O F S K I, R.
"Basic Radiation Biology". Lea and Febiger. Philadelphia. 1.970.
(6) BLOK, J .; LOMAN, H .
C u rr . Top. Radiat. Res. Quart. 165, (1.973).
(7) DA VILA , C .A .
Energîa Nuclear. 31, (1.970).
(8) WARD, J .F .
Adv. Radiat. Biol._5_, 182, (1.975).
(9) M INGOT, F .
Tesis Doctoral. Departamento de PubI icaciones. Universidad Com-
plutense. Madrid. 1.972.
(10) Cita (1), p. 41.
(11) DELGADO, M .D .; M INGO T, F . ; D A VILA , C .A .
Informe J .E .N . 286. Junta de Energfa Nuclear. Madrid. 1.974.
- 196 -
(12) Cita (1) p. 55.
(13) S A E Z , R .M .; DA VILA, C .A .
Informe J .E .N . 283. Junta de Energîa Nuclear. Madrid. 1 .974,
(14) TOWN, C .D . ; S M IT H , K .C . ; KAPLAN, H.
C u rr . Top. Radiat. Res. Quart. 351, (1.972).
(15) W EISS , J.
Nature 186, 751, (1.960).
(16) HOCHANADEL, C .J .
Radiat. Res. SuppI. 150, (1.964).
(17) ADAMS, G .E .
C u rr . Top. Radiat. Res. 1 (1.967).
(18) Cita (9), p. 34.
(19) BAXENDALE, J .H .
Radiat. Res. SuppI. 114, (1.964).
(20) FOX, B.W .; LAJTHA, L .G .
B r . Med. Bull, 29, 16, (1.973)
(21) DA NIELS , M.; SCHOLES, G.; W EISS, J.
J. Chem. Soc. 852, (1.956).
(22) SCHOLES, G.; W EISS , J.
Exptl. Cell. Res. SuppI. 219, (1.952).
(23) HOLIAN, J .; GARRISON, W.M.
J. Phys. Chem. JTj* 462, (1.967).
(24) SCHOLES, G.; SHAW, P .; WILLSON, R .L .; E B ER T, M.
en: "Puise Radiolysis". M. Ebert; J .P . Keene; A .D . Swallow,
- 197 -
J .H . Baxendole. Academic Press. New York. 1.965. p. 151.
(25) LATARJET, R .; E K ER T, B .; DEMENSEMAN, P .
Radiat. Res. SuppI. 3, 247, (1.963).
(26) DA NIELS , M.; SCHOLES, G.; W EISS , J .; WHEELER, C .M .
J. Chem. Soc. 226, (1 .957).
(27) SCHOLES, G.
Prog. Biophys. Mol. Biol. V3, 59, (1.963).
(28) L IN S TE A D , R .P . ; OWEN, L .N .; WEBB, R .E .
J. Chem. Soc. 1211, (1 .953).
(29) ULRICH, M.; HAGEN, U.
Int. J. Radiat. Biol. 1_9_, 507, (1 .971).
(30) FLORY, P .J .
"Principles of Polymer Chemistry". Cornell University Press, Itha
ca. New York. 1.953.
(31) CHARLESBY, A.
J. Polym. Sc i. 263, (1 .955).
(32) CHARLESBY, A.
"Atomic Radiation and Polymers". Pergamon Press. Oxford. Lon
don. New York. 1.960.
(33) HAGEN, U.
Biochim. Biophys. Acta 134 , 45, (1 .9 67 ) .
(34) JORCANO, J .L .
Tesis Doctoral. Departamento de PubI icaciones. Universidad Com-
plutense. Madrid. 1.976.
- 198 -
(35) HAGEN, U .; WELLSTEIN, H.
Strahlentherapie 128, 565, (1.965),
(36) LUCKE-HUHLE, CH. ; BRAUN, A .; HAGEN, U.
Z . Naturforsch 25, 1264, (1.970).
(37) COQUERELLE,TH.; BOHNE, L.; HAGEN, U .; MERKW ITZ, J. '
Z . Naturforsch, 24, 885, (1.969)
(38) CHARLESBY, A .
Proc. Roy. Soc. A224, 120, (1 .954).
(39) COX, R .A . ; OVEREND, W.G.; PEACOCKE, A .R . ; WILSON, S .
Nature ^76, 919, (1 .955).
(40) COX, R .A . ; OVEREND, W.G.; PEACOCKE, A .R . ; WILSON, S .
Proc. Roy. Soc. B149, 511, (1.958).
(41) PEACOCKE, A .R . ; PRESTON, B .N .
Proc. Roy. Soc. B153, 102, (1 .960).
(42) HAGEN, U.
Strahlentherapie 124, 428, (1.964).
(43) HENGLE IN , A .; SCHABEL, W.
C u rr . Top. Radiat. Res. 2, 1, (1 .966).
(44) ADAMS, G .E . ; WHITMORE, G .F . ; LOHMAN, W.; KAPLAN, H .S
en: "Advances in Chemical Radiosensitization". Proc. of a Panel
by I . A . E . A . Viena. 1.974. p. 147.
(45) ADAMS, G .E .
B r . Med. Bull. 29, 48, (1.973).
- 199 -
(46) NEWTON, B .A .
Advan. Pharmacol. Chemother. 8, 149, (1 .970).
(47) GOLDBERG, I .H . ; FR IEDM AN, P .A .
Anm. Rev. Biochem. 775, (1 .971).
(48) THOMSON, A .J .
Platinum Metals Rev. 22, 2, (1.977).
(49) Dl MARCO, A .; GAETANI , M.; O R E Z Z I , P .; SC A R PINATO, B .;
S IL V E S T R IN I , R .; SOLDATI , M.; CA SD IA , T . ; V A L E N T IN !, L.
Nature, 201. 706, (1 .964).
(50) SKOVSGAARD, T . ; N IE S S E N , N . l .
Danirh Med. Bull. 22, 62, (1.975).
(51) PANl , B .; M O N Tl-BR AG AD IN , C .; SAMER, L.
Experientia, 31, 787, (1.975).
(52) BROCKMANN, H .; BROCKMANN, H.
J r . Chem. Ber. 96_, 1721, (1.963).
(53) ARCAMONE, F . ; CASSI NELL I , G .; FR ANCESCH I , G . ; O R E ZZI; P
MONDELLI, R.
Tetrahedron. Lett. 3353, (1.968).
(54) Dl MARCO, A.
en: "Antibiotics" (vol. I) D. Gottlieb, and P .P . Shaw Springer-
Verlag Berlin 1.967. p. 190
(55) C A LE N D I, E .; Dl MARCO, A .; REGGIANI , M.; SCARP INATO, B.
V A L E N T IN I , L.
Biochim. Bioplys. Acta 103, 25, (1.965).
- 200 -
(56) KERSTEN, W.; KERSTEN, H .; SZYBALSKI , W.
Biochemistry, 5, 236, (1 .966).
(57) LERMAN, L .S .
J. Mol. B iol, 3, 18, (1.961).
(58) WARD, D .C . ; R E IC H , E .; GOLDBERG, I .
Science, 149, 1259, (1.965).
(59) Dl MARCO, A .; ARCAMONE, F .
Arzneim-Forsch. (Drug Res.) 25, 368, (1.975).
(60) NAYAK, R .; S I R S I , M.; RODDER, S .K .
Biochim. Biophys. Acta, 378, 195, (1 .975).
(61) CAUSE, G .F .
Adv. Chemother. 2, 179, (1.965).
(62) I MAI , Y . ; OCHIAI , H .; TAKIZAW A, H .; SHIG ENO, N .; KOBA-
Y A S H I , Y .
Niigata Igakkai Zasshi, 84, 715, (1.970).
(63) LYASHENKO, V .A . ; KOLESHNIKOVA, L .P .
Antibiotiki, JO, 808, (1.965).
(64) MIYAMOTO, M.; KAWAMATSU, Y . ; KOWASHIMA, K .; SHINOHARA,
M.; TANAKA, K .; TATSNOKA, S . ; NAKANISHI , K.
Tetrahedron, 421, (1.967).
(65) KERSTEN , W.; KERSTEN, H.
Biochem. Z . 341, 174, (1.965).
(66) WARING, M .J .
J. Mol. B io l. 54, 247, (1 .970).
-2 0 1 -
(67) BEHR, W.; HOMIKEL, K .; MARTMAN, G.
E u r. J. Biochem. _9_, 82, (1.969).
(68) K A Z IR O , Y . ; KAMIRYAMA, M.
Biochem. Biophys. Res. Commun. 22, 433, (1.965).
(69) MULLER, W.; CROTHERS, D .M .
J. Mol. B iol. 251, (1.968).
(70) C E R A M I, A .; R E IC H , E . ; WARD, B .C . ; GOLDBERG, I .H .
Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 57, 1036, (1.967).
(71) KAMI Y AM A, M.
J. Biochem. 63, 566, (1.968).
(72) HA Y AS AKA, T . ; I NONE, Y .
Biochemistry,^, 2342, (1.969).
(73) TENDLER, M .D .; KORMAN, S .
Nature, 2 ^ , 501, (1 .963).
(74) ADAMSON, R .H .; HART, L .G .; DE V IT A , V . T . ; O L IV E R IO , V .T
Cancer Res. 2B, 343, (1.969).
(75) HO RW ITZ, S .B . ; GROLLMAN, A .P .
Antimicrob. Ag. Chemother. 1968, 21, (1.969).
(76) KOHN, K .W .; BONO, V .H . ; KANN, H .E .
Biochim. Biophys. Acta. 155, 121, (1 .968).
(77) LEIMGRUBER, W.; BATCHO, A .D . ; CZAJKOW SKI, R .C .
J. Amer. Chem. Soc. 90, 5641, (1 .968).
(78) KOHN, K .W .; SPEARS, C .L .
J. Mol. Biol. 51, 551, (1 .970).
- 202 -
(79) STEPANOV 1C, V .
Biochem. Pharmacol. ]_7» 315, (1.968).
(80) ROSENBERG, B .; VAN CAMP, L.; KR IG AS, T .
Nature, 205, 698, (1.965).
(81) ROSENBERG, B .; VAN CAMP, L .; TROSKO, J .E . ; MANSOUR, V .H .
Nature, 2 ^ , 385, (1 .969).
(82) G O TTLIEB , J .A . ; DREWINKO, B.
Cancer Chemother. Rep. 621, (1.975).
(83) ROBERTS, J .J .
Recent Results in Cancer Research, 79, (1 .974).
(84) SZU M IEL, I .; N IA S , A .H .W .
Chem. Biol. Interact. T4, 217, (1.976).
(85) Z IP P , A .P . ; Z IP P , S .G .
J. Chem. Educ. 54, 739, (1.977).
(86) RICHMOND, R .C . ; S IM IC , M .G.
B r . J. Cancer 20, (1.978).
(87) WOD INSK Y, I .; SW INIAR SKI , J .; KENSLER, C H . ;VEND I T T I , J .M .
Cancer Chemother Rep. 4, 73, (1 .974).
(88) PASCOE, J .M .; ROBERTS, J .J .
Biochem. Pharmacol. 1345, (1.974).
(89) AGGARWAL, S .K . ; WAGNER, R .W .; Me ALLISTER, P .K . ; ROSEN
BERG, B.
Proc. Nat. Acad. Sc i. U .S .A . 72, 928, (1.975).
- 203 -
(90) ROSENBERG, B.
Cancer Chemother Rep., 589, (1.975).
(91) HORACEK, P .; DROBNIK, J.
Biochim. Biophys. Acta 254, 341, (1 .971).
(92) ROUTH, J . l .
en : "Introduction to Biochemistry", W.B. Saunders, Philadelphia,
1.971. p. 133.
(93) WAKIKI , S . ; MARUMO, H .; TOM I OKA, K .; S H IM IZ U , G .; KATO,
E .; KAMADA, S . ; FUJIMOTO, Y .
Antibiot. Chemother. (Washington D .C . ) 8, 228, (1 .958).
(94) SZYBALSKY, W.; IY E R , V .N .
Fed. Proc . Fed. Amer. Soc. Exp. Biol. 23, 946, (1.964).
(95) SZYBALSKY, W.; IY E R , V .N .
en: "Antibiotics. I . Mechanisms of Action". D. Gottlieb and P .O .
Shaw. Springer. Berlin 1 .967. p. 211.
(96) EHLING, U .H .
Mutat. Res. 13, 433. (1.971).
(97) WEST, S .C . ; EMERSON, P .T .
Mol. Gen. Genet. 1_5_1 » 57, (1.977).
(98) W EISSBACH, A .; L IS IO , A.
Biochemistry, 4, 196, (1.965).
(99) IYER , V .N . ; SZYBALSKI , W.
Proc. Nat. Acad. Sc i. U .S .A . 50, 355, (1 .963).
- 204 -
(100) MURAKAMI, H .
J. Theor. Biol. J_0, 236, (1 .966).
(101) P A T R IC K , J .B . ; WILLIAMS, R .P . ; MEYER, W .E .; FULMOR, W.;
COSULICH, D .B . ; BROSCHARD, R .W .; WEBB, J .S .
J. Amer. Chem. Soc. 86, 1889, (1 .964).
(102) L IP S E T T , M .N .; WEISSBACH, A.
Biochemistry, 4, 206, (1 .965).
(103) S H IB A , S .; TERAW AKI, A .; T A G U C H I, T . ; KAWAMATA, J.
Nature (London) 183, 1056, (1.959).
(104) IR V IN , J .L . ; IR V IN , E .M .; PARKER, F . S .
Science, 110, 426, (1.949).
(105) PARKER, F . S . ; IR V IN , J .L .
J. B iol. Chem. 199, 897, (1 .952).
(106) SCHELLENBERG, K .A . ; COATNEY, G .R .
Biochem. Pharmacol. 6, 143, (1 .961).
(107) COHEN, S .M .; Y IE L D IN G , K .L .
J. B iol. Chem. 2 ^ , 3123, (1 .965).
(108) ALLISON, J .L . ; O 'B R IE N , R .L .; HAHN, F .E .
Antimicrob. Ag. Chemother. 1965, 310 (1.966).
(109) WHI CHARD, L .P . ; MORRIS, C .R . ; S M IT H , J .M .; HOLBROOK, D
Mol. Pharmacol. , 630, (1.968).
(110) K IM , S .H . ; K IM , J . H . ; F R IE D , J.
Cancer (P h ila d e lp h ia )^ , 536, (1 .973).
205 -
(111) CLEAVER, J .E . ; P A IN T E R , R .B .
Cancer Res. 35.» 1773, (1 .975).
(112) HAHN, F .E . ; O 'B R IE N , R .L .; C IA K , J .; ALLISON, J .L . ; OLE
N IC K , J .G .
Mil. Med. T31, SuppI. 1071, (1.966).
(113) MAHLER, H .R . ; MEHROTRA, B .D .
Progr. Nucl. Acid. Res. 2» 231, (1 .963).
(114) TABOR, H .
Biochemistry, 2» 496, (1 .962).
(115) SUWALSKY, M.; TRAUB, W.; SHUMELI , U .; SUBIRA NA , J .A .
J. Mol. Biol, 363, (1.969).
(116) O 'B R IE N , R .L . ; HAHN, F . E .
Antimicrob. Ag. Chemother. 1965, 315, (1 .966).
(117) Y IE L D IN G , K .L . ; BLODGETT, L.W.; STERNGLANZ, H .; GAU
D IN , D.
Prog. Mol. Subcell. Biol. 2, 69, (1 .971).
(118) KAY, E .R . ; SIMMONS, N .S . ; BOUNCE, A .L .
J. Am. Chem. Soc. 74, 1724, (1 .952).
(119) FRE I FELDER, D .; DA VISO N, P . F .
Biophys. J. 2, 235, (1 .962).
(120) E IG N ER , J .; DOTY, P .
J. Mol. Biol. 12, 549, (1.965).
- 206 -
(121) A V IL E S , J.
Tesis Doctoral. Facultad de Ciencias. Universidad Autonoma. Bar
celona. 1.975.
(122) D A VISO N , P . F . ; FRE I FELDER, D .; HOLLOWAY, B.W.
J. Mol. Biol. 8, 1, (1 .964).
(123) BOPP, A .; HAGEN, U.
Biochim. Biophys. Acta, 209, 320, (1 .970).
(124) BOPP, A .; CARPY, S . ; BRUCKART, B .; HAGEN, U.
Biochim. Biophys. Acta 294, 47, (1.973).
(125) P R IC E , W.J.
en: "Nuclear Radiation Detection". Me C raw -H ill . Book C. Lon
don. 1.958. p. 240.
(126) "Model E Analytical Ultracentrifuge. Instruction Manual". Beckman
Instruments In c . , Stanford Industrial Park . Palo Alto. California.
1.973.
(127) E IG N E R , J .; SCHILDKRAUT, C .; DOTY, P.
Biochim. Biophys. Acta 55, 13, 1.962.
(128) MINGOT; F . ; JORCANO, J .L .; DAVILA, C .A .
Informe J .E .N . 301. Junta de Energia Nuclear. Madrid. 1.975.
(129) SVEDBERG, T H .; PEDERSEN, K .O .
"The ultracentrifuge". Clarendon Press. Oxford. 1.940.
(130) E L IA S , H .G .
"Méthodes de I ’ultracentrifugacion analytique". Beckman Instru
ments International S .A . Ginebra. 1.964.
- 207 -
(131) CHERVENKA, C .H .
"Manual of Methods for the analytical ultracentrifuge". Spinco Di
vision of Beckman Instruments Inc. Stanford. Industrial Park . Pa
lo Alto. California. 1.973.
(132) SCHACHMAN, H .K .
"Ultracentrifugation in Biochemistry". Academic Press. New York
and London. 1.959.
(133) HAGEN, U.
en: "Experimental Methods in Molecular Biology". C. Nicolau. Lon
don: John Wiley and sons. 1.970 p. 174.
(134) M INGOT, P .; JORCANO, J .L .; ACUNA, M. I .; DAVILA, C .A .
Biochim. Biophys. Acta 418, 315, (1 .976).
(135) COLSON, P .
Tesis Doctoral. Universidad de Lieja, Belgica. 1.972.
(136) WILLIAMS; J .W .; BALDWIN, R .L . ; SAUNDERS, W.M.; S Q U IR E , P . G
J . Amer. Chem. Soc. 74, 1542, (1 .952).
(137) SCHUMAKER, V .N . ; SCHACHMAN, H .K .
Biochim. Biophys. Acta 23, 628, (1 .957).
(138) R E IT N E R , K .E .
Biopolymers, 1_0, 275, (1.971).
(139) R E IT N E R , K .E . ; STRASSBURGER, J .; TR IE B E L , H.
Biopolymers, 1_0, 285, (1.971).
(140) TR IE B E L , H.
Biopolymers, 6, 449, (1.968).
— 208 —
(141) SVEDBERG, T H .; R IN D E , H.
J. Am. Chem. Soc. 943, (1 .923).
(142) CROTHERS, D .M . ; Z IM M , B .H .
J. Mol. Biol. 1_2, 525, (1.965).
(143) BOHNE, L .; COQUERELLE, T H .; HAGEN, U.
Int. J. Radiat. Biol. 17, 205, (1.970).
(144) HAGEN, U .; COQUERELLE, TH .
Biochim. Biophys. Acta 374 , 271, (1.974).
(145) C H R IS TE N S E N , R .C . ; TO B IA S , C .A . ; TAYLOR, W.D
Int. J. Radiat. Biol. 22, 457, (1.972).
V I . A P E N D I C E S
- 210 -
PROGRAMA PARA EL CALCLILO DE
C O E F IC IE N T E S DE SEDIMENTACION
lô rui X': ,'l IX •'•Cl 6 1.-. [ r 3:o i'X> ■ - ' 2 " i.io wTTirFo-
l'O :'T 1•iO WXi 2 ' 1 32' 'Elbi' r: rk -":"Ù : 1=0tC’ IX-UT if:ru i':8P 'FF'û C0NCEMTP9II1080 IXrUT90 16 IP-.-• 12010 1.911: ' 15' 121-0'1 l G 10 1:0i l l.MTE 15.1300'1? 2 2 F F 9 21 OR COFRECCIOM14 ::iPU* F!15 I 1 : P •"E-OCIPhp en R-M ;It 2117 XF ITE 'I:.130201.FI18 F2'F!1hT : ••VELOClIUip; . 119 F 8 F '=1 Tü NI20 M 8 F ■OELüLR NUMERO":21 INFUT H!22 UF ITE ■15.1360 'H:22 PI 89 "OO-MENTFRCION’.Kî24 INF JT25 WPITt ' 15, 1220::'C[K 326 LPITE ■ 15. 1 370',27 PI8P XUXEFO PriTOi. CÛNO"23 irJPüT N29 FOP I= 1 '0 N30 PI 8F PEREPENCIA INTERNA31 A32 PI8P •PERERENCIfi EXTERNA33 lUPUT34 PI8F' "DliTANClH".i;33 IMF'JT36 Il 18 F' 'RIEMPO",I:37 INPUT T33 F. = 5 , 7- I'-a:,*'' 1. 6 ' ‘ L-A ,39 \[ I ] =-OG.R40 WRITE ' 1 , u S U ' I » A < L * P, T 1410 Xi I ] =T42 NEXT I43 G08U& 62044 F = E45 02^2- F 1- 21.-604 6 8 = F '60-22^02 )*F 1 "-lOT 1347 LCr ]-1/848 WRITE 15,890 y 8,LIN 349 NEXT r50 FOR f.-1 TO NI51 "I K ] =-25 J5z XI K ]--:: K :51 i-e:'T54 .;r :t: ■ 15,1380)58 w: ITE :i:.1390)56 w=ui57 G ■'8 ut 62058 il -h59 n-'i/o60 WF ITE ‘ 1 '■« '.'00 , M, 061 GuTO - - 062 XI-X2 - 1 rr ,T = 062 FCP i-• '0 N64 XI:-2:1' i l ]65 '• r : i-xi I ]e' - ‘ : : ’•■.T 136 2 ’. i ; : • ',T ! 36 - !
V •1 !;i 1 ■ ' t
' . 1 . 1 1 ' ' N . " 1* • ’ i ' ' N
7 - 1' • (' . • 1 - ' t ' ■ 1 • ’ ' : 1 1 1:<]
- 211 -
75 0 • G : P ; ■’F " : . N - 1 \:>:o 1 . - : n ■ ♦ ■ ■ 1 0)770 . I- - - 9 ■ : ''' , iM. V N-1 '■730 \ - - l : l7^0300 f F I l KS 10 F RI NT3 : 0 F: INI FE: : I : NIE 1 " 3 : 0 :s où F PINT k . . . : : : I . 1, .B:4 . A.340 ,.F ITE 1: . 3: • J k850 c r i n :360 F f i n :870 F.E"ORN330 FôFXhT F 4 . 0 . : x , F 7 . 3 , SX. F" . . 7 . 5 - .F "830 RÈFM-T 5 'CvEF. -El ! . l ’EP • j ' - L l O .300 F6FM71 5 : EF . E X I F h F O . '310 F OF MAI . OORFELfiCION ■. 9 3 . 5 .3 : 0 IF V r P r r - £K 3 : 03 : 0 F l = 2 . 7340 R : = 0 . 0 1 5 2350 F : = + 0 . 4 45360 7 3 - 6 : 0370 GOTO 1020330 F 1=0330 F 2 = 0 . 0 5 3
înU-M CIEINV. h I-.L6U l ' .STA .1'
r :'[F'': M" ■ iVEr ■0'
F7. 4> E i û .
1000 F 7 = 0 . 3 561010 T 3 =3 ; 01020 M1 = ' ■ M - F 1 '. 9 ' 2) t a . -P3 :>1030 ! ‘0= i l i O.'R1040 f-2 = M 0- 0 . 51050 WRITE ' 1 5 , 1 4 0 0 )1060 U F I ' E ' .15 . 1 4 1 0 )1070 WRITE \ 15 , 1 : 1 0 :• n 1 . MO, M210::0 PI 7F ■TIW : c ‘ iTPOL" ;1030 INPi.'T C71100 1:15F "MN lONTROL";1110 INPUT ;1120 IF 13 *0 TrlE.I 115011 :0 73=6201140 GOTO 11601150 13=.: 101160 5 = 2 - 7 3 ^ ' 2 M 2 - 1 / M 0 - 2 / M 3 * !1170 ' M - - : / M0-'-2 G7 - 1 M ? ■' • :1130 W9ITE (15 , 1 1 3 0 )1130 FOR"AT : : FOR EL ME TOI :• DE CHARLESBY1 :00 WRITE ' 1 5 . i : 1 0 ) 7 . F1210 FORTPI JF T-UFA: r'üCLEOT l ' j . E l : . 2 .5 : : , "C = 0 5 5l i n - ': N'.'l l e .3t : dc'- - e i e . ?.1220 E'5=': M 3 'N : ■ -11230 B=' Eî .-NR -T31240 E2='.E. T3 ' T ' 1 0 1 6 '1250 WRITE ' 15 . 1 : 6 0 )1260 FijRWHT :■ : , Fi-ip EL OTRO ET'ODO". , /1270 WRITE ' 1 " • 1340)671-30 .1 .5 ' .' : . 6 212'R0 FWWîmT . ■ , 24 : : , T ' . h n h t : 0 ■. , ' , /1 300 9':iF"MT , . , 35.X, l 'NA De 5. T , r -T IDOFO" . / . , /1310 FOR-'AT 5 , • W" , E 1 0 . 2 . 5':'.. ■ .u , 6 : 0 . 2 . 5:1. ' FF:': M.WUWLRO' , E : 0 . 2 ' ' , /1220 F‘3F’7. i l . . 34: : . ' cwi , ,EwT’17 30 F'O^'Ih T 2: ... [ X P F R : r : N T u -LU: - • R 7 . 01 24 0 R..F7Fil , FUR TU' -A: F 3- ' 3. : . : w - i " , r i e . : .1 : 50 TOF ,".-iî ' P - F -UFA- NUL LEO: : J . : 1 - . e 1 . F ir TUF ! 101 : : " ' _ T0 .5 -E l 3 . 2 . /17. 0 w r y . , : 0 x , : f l u l h "-1370 - I.'r ' l i r . 10 ' , " lf I "l 2 . "3" . 1 " V . J ■ F ' . 1 1,:. "L-, F ■ . '1300 r w / ,13^0 FO^'WI 1: :l ; :t f , - Oi hc i . 3 ' .3-: :7, iTPr' : î . C-F' . ' . • /14.J.0 91.1:WX'T .
1410 F1J t ' ) r ( 1 , f / , 1 7. ., lFl5h.J M ■ E': " ,.FF5 5U1 'NIFLD'.' MU14 20 END
- 2 1 2 -
PROGRAMA PARA EL CALCULO DE D IS T R IB U C IONES,
PROMEDIOS DE MASA MOLECULAR, RUPTURAS Y ENLACES CRUZADOS
; i . P f : o 3 . : . i i x n s i i . t i l i o u ' f s s : i ‘ , 3 . v i î 3I M I M Û UJMèkü";
:''N3e :;r e r i:-e n i ü *fT,.û
3 71=0 I4 i:0 ZbO»940'';0 CONCïNTEhCICMES";EC CI ON RADIAL 51=0';No
l A NUMERO";
:270)K7 ENTFACION",j;0 10
NUMERO";370)C[ J],FlAN LATO; Al FRINCIPIO"
:.ATo;
:20. ,A.M,LL F I " , F 6 . 3 , I I X , 'NUM. DATOS " , F6 . 0 , 2Ù : : , "LF:E". F 10. 3» /
460 )B,"PLATEAU INICIRL",F3. n BASE';:O0)E."LINEr 5ASE“»F6.3 -N'IA FFOHEDIO";1 ]:40:'D[N-.l ], 'DIST. PF:o::£Dl j".Fi.c ANCIA m e n ISCO"!2)5 30 ■r'Ctw.2 3• "]'I3T. MENI3CC ,F3.3
10 DIM HL 1:* M !20' DI T' l30 INPUT N440 N«-'1TE \15-‘-I50 Fu, UAI 2 5Eu ni VF "NnTI'.l70 INPUT NI80 IF N1#0 T-F'90 WRITE »15..",100 GOTO 120110 WRITE V15.'120 ni3P "130 INPUT n 8140 DI3P '150 INPUT F 3160 FOR J= 1 TO170 DI3P "CE.-'JI180 INPUT K7190 WRITE .15.200 DI3P ■c c n:210 INPUT cc j :220 FOR 13= 1230 TC 133=0240 NEXT I3250 n i s p "FOTO260 INPUT FI270 WRITE 15.280 GOTO 350290 IU3P 'r Hi_T300 WAIT 2503310 GOTO 350320 LISP ■FA.-T330 WAIT 2500340 GOTO 350350 DI3P "NUriE360 INPUT N370 DI3P ■■PEFE380 INPUT A390 DI3P "RE-E400 INPUT L410 WRITE '15,420 FORMAT 5 ..430 DI3P 'PLAT440 INPUT e450 WRITE 115,460 FORMÛT 25X470 DI3P "LI'.E430 INPUT E490 WRITE ' 15' .500 FORMAT 2 5.510 HI3P 1' I .520 INPUT530 WC;ITE 15"540 FORMAT 25.55u DI3P "I' I : T560 INPUT DC .'1 -570 WRITE 'IN,530 FORMAT590 ni3p "3600 I !U UT PI610 WRITE ' 1 5 .630 FOPMHT630 WP [Ti: ' 15,640 IF N;--1 :P650 GOTO 630660 '33 = 0670 39=0630 FOP 1 =1690 M3R ■HL' ■700 INPUT tic , ;710 IH;P i ' l ' . '720 luuur I'C : 1730 Wf IT!. r .740 NEXT I
Eûù.'Pl. " i PRi ' t ' .EI i lO",9lO. 3, /
A", I l
'NC :A" . IJ
CM 'Hf I I . DCI ]
- 213 -
. '50 h " \ : ; ' ' N ' 2?•. 0 K i l l 1 M • >1 . 8 <C - O ' ' . 5.T 0 Ni T .7 .0 I ' M : ' u7^0 1 r ( ■ •• ■ -LM ‘ 20f r o .4 ! ; ; 3- i ' i - L ' :i'<A 1 0 :-W1 .0G20 • r 3 -E ' v L - E ' " 1 0 ' P7: j - : ' i :820 Nf .T :84(1 1 rc . X . 2 5 0
86 (1 X . 8 7 0 '87(1 F • 4>:. ML -iC.L: IN ' -WF' ' ' 18702: ' .82 0 1 . - IT£ ' ' 2 8 0 '8?C FC'p 1. ; = : TO N900 2 1 ’ 1 « l -LGT V PC t- n N* 1 ] LGTv .-"[ n+1 ]910 NE :T '920 F84U-* 2 • WFt:. ?, 1C'X,F2.3920 FL = M - ' 5 , 'NAT I940 f : - : i --- . . 2 : " . " INM l EJNA ' LFh t . IZAI iO"950 F i : : w C 2" "H . 1' ,- ' . ' i r , /980 F c n c 5 . "E :F- N . n ' . F 8 . 0 ,970 FOF'CI 5. . "C ÛN8 EMPhCION . F-2. 2. 1 5 : ; . / . .5: , .980 FÛ4M4- 'C ■C T " , 14;: . •• 1 . 15.x S" , 19X. ■990 GOTO 1110
NUM. F 5 . 0 ,
000 P = 0010 F ,3: I = 1 TO 4020 C = F[ I ]030 FOP - : = ; TO 404 0 IF ■ . : = : • THEN050 C=C*' i - : c J i ] '■/080 NE:\T J i070 P=?-!■(080 NEXT090 FOP'C T : : . , F 5 . 0 ,100 P E ~ . !■- i110 F 9=1120 K1 = 1120 X 1 = 10140 FOP I ■-=• 9 TO N-150 IP X : 19 ] <= XI180 NEXT 19170 N9=I9180 F 3=19 - 1190 IF ■'! 3=0 THEN200 i 7=19 - i210 F 8= I9 ' 2220 IF X 8 ; n .' th e n230 2[ 1 ] = [ F 3 ]240 : t ]250 : i - - ]280 : i 4 := i r . 3 : ,270 cr 2 1%- ' : , J ]280 F[ EX- J ]290 FI 3 := 3- t J ]800 FI 4 ;= 3Ci 3, J ]i 10 1000
: I t ; .IF •-! --•3 -MEN 13
34 0 rc t ; : = <■ C F l . J ] /85-0 1878380 TI FI :■= : n . .1 ]370 i;- r - ' 1 5 - 1-3-0)380 IF -<■; =1 THEN 19390 ♦10400 M =' 1 / !4 10 I - ' -'0 THE420 Ni4 ' O' : TC ' 1 5 - 1 9 4 0 )4 4 0 f = m. ;45 04 h 0 ; ' = -'4 . 0 r . I . . " ,41 0 r . , f : 1 ' ' ML4'<0 , I J : ! ■' H.J . ♦ ■ ' 3N ! U (.• -X' :'0
.1
290
220
0.445)I ' k . P . : i r 1 ]
140
'..'.■I' p , 111 ' t • I
- 214 -
I ' b O GOTO 15 u1570 'i->' 1-0 ' O.OTC 'T.j O.J
. r • i • o ' m : o o - o i . nIS-MO 1 - f 1 lii'ô 'L' = ".V3 I t 10 f)1620 N[:\T t1670 GOTO 20101640 <TOt16 50 ; . l = : . : - - Vl =V2= i2«0 1660 FOR !=1 TO NS 1670 M = t z r I ]1680 X2» > z r I ] $ : [ I 31690 V l = v : * V [ 1 ]1700 • 2 = V2*-Z[ I > vt I 31710 \ 8 I 3*>[ Î 31720 NEXT I1720 E=o;6»Yj-x:i*vn -ug» :2-x:$xi)1740 A= . V l - B - ; : i > N31750 ri = 'r,2*V3-Vl-Vl ' N3-(N8-1)''1760 2 2 = - .N 2 t : :2 -x i * . ' : r N S - c N - i ; -
.1770 I =srw r . N 6 - 1' = 1 1 1 - B * 3 *D 2 ■ ' C N 8 - 2 ) )1780 81=5 8ÛP-D24LN3-:)))1790 7 2 = i . ' N8 : ' « ' Xi/'NS:>1800 82=I - : QR ( 1 SS ) 4. ri2,' ( ( N8-1) '♦D2 > ) )1810 T=e 811820 F =h 8 2 ' . B - 8Q R( I 2 / 3 1 ) )1880 PRINT 1840 PRINT1850 PC'INT "PENDIEMTE"TABZO" : . 8TAt C' ARi r "AB40"0RrENA: .9 "T9E60" I i . STANDARD".1860 P=I-,T B . T AB2 0. S. : , T A&4 0, A - T AEEO, 821870 w r i t e ( 1 5 , 1920)R1880 PRINT1890 PRINT1900 RETURN1916 FORMAT 5 X , F - : . 0 , 5 X . F 6 . 2 > 5 : > F 4 . 0 1920 FORMAT 5%, "C8PRELACIC 'N" ,P9. 5, /1930 FORMAT 9X, CT = ", F3 .0« 14X- "80 = " , F 6 . 2 , I I X , "1 = , E : 0 . 3 1940 FORMAT 14X. "VAL0RE8 EXTRAPOLAIOS A CONiEN'FACICN CERO:1950 STOP 1960 88= t : k 13+88 1970 89=89+1. T C K l 3 1980 %1=.<1 + 10 1990 K1 =1:1+12000 IF XI / = 90 THEM 11402010 M l =9 892020 M2 = 0. 1 + ' . 8 8 / 0 . 9 )2030 R-M2 Ml2040 WRITE ( 1 5 , 2 0 5 0 )2u50 !"UR 'AT ./, 25.T» ' + +^ +++ + ♦ ++— + +++* * + + * "2060 WRITE ( 1 5 , 2 0 7 0 )2070 FOR-'AT .- ,26: :, "MA I AS MOLEUULARES: "2080 WC;ITt- ( 15, 20 90. ' Ml . M2, R2090 FOP-iAT . , 10.:, "MM = " , E10. 2, 5X, " MW = " , E 1 0 . 3 , 7 : : , MW MN = , E 1 0 . 3 , / , /2100 WRITE ( 1 5 , 2 1 1 0 ,2110 FORMAT .' , 25. :, " " , /2120 DI8P MM CONTROL";2130 INP.-T Cl2140 II89 MM CONTROL";2150 INPUT C22160 IF N1«0 THEN 21902170 T 9=8202180 GOT9 22002190 T9 = ?! . j2200 B=2-T ) , - ' : 2 ' 1 1 1 - 1 / 7 2 - 2 'C2+1 . 'Cl ) / 3 2210 C = 9 * T 9 * ' 1 M l - 2 / M 2 + 2 ' C l - l C2.- /3 2220 WRI 'E > 1 5 . 2 2 - A)2230 F('R-A" 2X':, ' POP Eu ME’’0T J IE CHARLEIBY:2240 i .FI TE ' ' 1 5 . 2 2 5 0 , 8 . 92250 FMR-'-.T "Fl.PTi.if+S W.irj L OTI lU" > E12. 3» 5:i, "CF GCGl I Ml 8 nUCLLO^ I TO", E12. 3, /, /2260 p.-jPx-T ;’(A n a t i'.u "2270 P -P':AT ' ,y CELUl A ' . F ^ . O . .2280 WPI 'F ' 1 5 , 2 + 0 )2290 E8= r 3 / M l - - 1 2300 FM. T92310 L2-*' I ‘ T' ' t ' l i jTA -2 320 WPI n • ■ 15. 2 5 ‘JyF.y2 CO MPI F < r . , 2 4N 1-5.B22 40 F ’ W- , ' ", I 'PTI'T .',5 NMC! ' - . ; ' 3 " . P 1 2 . , . 8 . : - " PIT TU'"' -3 ■■■'6 DAlX .N3' , E 1 2 . 2 , / , /2 3 5 . 3 F" + M' T u w - I . P A : O'- U <" F- U L , i , 1236 0 F. p!- . ' : r p i-. o ' n j u ? -t'Ci /2 370 END
- 215 -
PROGRAMA AUX IL I AR
10 M .'P ' :F ' h o r ; w i j îi'IIU F.U": 0 I.'M 1 T >80 W'\ I ' F . : 5 ' •; 14 0 F , Ri'O' u . C i 1P! ; l ’.: .NT(i N'5 0 l ' I . P ' .41 ;v - ; =o :6 0 IfO 'U l ..170 IF NX A- T , - :N 1 10GO WRITE* 0 F A ' . . 2 6 . D: <M N A I l V i100 G.'TO ;, 0
irp'.: -F'.p
110 u s i T t . r . i : r1 : 0 F OR Mu' ' . T r ' A : .e : i c t u k a l i : ' ' - l o " * -1 : 0 l i i P - I t L ' . l A NUM. :140 INPUT l :150 WRITE Î 5 , ' l û E2 160 I -1.F COwl l MTRACI Ùi r ; i r o INPUT n 180 WPMt ' l û . r z u c 1 190 r i î P 'FOTO NUMERO":200 INPUT FI 210 MS P TIEMPO";220 INPUT T1230 WRITE ■ 1 5 .720 >F1 . T1240 I I 3 P ' N P'JNTüS";250 l NPl . r N 260 WFITE <15 ,7400 270 86=0 280 89=0290 IF H I »0 THEN 240300 F 1=2 .7310 R2=0.Û152320 F 2 =0 .445330 GOTO 3^0340 P1=0350 P2=0.O59360 P2= 0. 28ô370 FOR I = : TO N380 DI8P ' 1 / 8 i ;390 INPUT T [ I ]400 8: I ]=1 T[ I ]410 MC l ]=: :8C I 3 - F l > / P 2 ' t a / P 3 >420 WRITE ' 1 5 , 5 2 0 ' I + :0,TC n , 8 [ I 3. MC n430 88=S8+MCI34 4 0 8 8 = 8 9 + 1 ' H C I 3450 NEXT I460 M l =9 89470 M2 = 0. H ( 8 8 ' 0 . 9 )480 F:=M2 Ml490 WRITE ( 1 5 , 5 0 0 )500 FOPMp-r / . 2 5 X , "MA8A8 MOLECULAPES:'510 WRITE ' 1 5 . 5 8 0 ''"<1, M2, P520 FORMAT 5X , P 6 . 0 , 1 1 X. F 8 . 4 , 1 1 X , - 6 . 2 - ! 2X . E12 . 3520 F'2F MAT / . 5' :, " MM . E 12. 2, 5!. , " MW ' . £ : 2. 3. 5X, " MW/MN " . £ 1 2 . 3 , ' . /540 WRITE ( 1 5 , 5 5 0 )550 F .1'" Mhl jLW , " + T + + + " , / , /560 DI :P "IX CONTROL":570 I N r i . r Cl580 DÎ8P 'MN CONTROL":590 INPUT C2600 IR NU Ô THEN 630610 T9=620620 GOTO 643620 Tû=3:2640 £ = : r - ' - ‘ ( 2 Ml -1 ' M : - 2 ' C 2 + 1 C 1 /650 C=2 + ’ / ♦ ' 1 " 1 - 2 î U + 2 / C l - l ' C2, '2
. 660 WC'TF 18,67: ' - ,670 FG-Mh ’ 20. ."WOR Eu METODC l'C C iP'-LESC,': ", ,/680 W-ITE r , 6 9 ) P,G690 F' . ; M û r ' F L ' / T j R F i 8 N U C l E Û T 1 MO; , E K . 3, 5 . ' , "G-OS :.L 1 U t . '2 N ' J C x . E û l IDu: , E l 2 . 3 , / , / 700 iVjTFj , 1 07 1 0 f C - n - ' I / , s . , F E L U ' . A NOM " . - 6 . 07 2 0 , C R M i , ' / , 5 : . , I. j N ' T M T F r C I ' - ' X , F 7 . : : ■720 rw:r i>; 5 f j ’ j |...M . F 5. w • i 0.. • T / MRi. , r . , . 2 , /7 4 o r 9 = : w r ' r c : , î i x , " i 2 ' : 2 1 , , i , ' x . M - 1 /7 5 0 w: 1 Tt ' 1 ' . , 6.V-7 G 0 f ' I - M - t ! •/'. f-OF EL O T F n ME" L j : " , / , '?uo F 8 - - " : :1! I7 x . j F 5^ ' I C . ' . I '7"'u 1 .■'-.•'i/. T9 ' , 1. ,16 CNN W. ] I i 1' 1" I 8R I O I - 1 /■ . • ' I " F ! I . U= :o. i ' : ; Tt c • : ; ■ ; 5 - .c :U W'.'- /, i t ■ R i / I M , ' 2 <1 f r • I ; . u , c . ' " I T " l " I M - . " ' I WT. / I =8 ' l t . l t .Mi t