1
MS/MS
Espectrometría en Tándem:
Información estructural de pequeñas moléculas
Secuenciación de péptidos
Espectrometría de masa
2
MS/MS: Espectrometría en Tándem
Espectrometría de masa
Seleccionar uno de los iones de la muestra, fragmentarlo y estudiar la formación de iones “hijos”
mp+ md
+ + mn0
Aplicaciones:
Identificación de moléculas
Secuenciación de péptidos “al vuelo”
Modificaciones posttraduccionales
3
MS/MS: Secuenciación peptídica
Espectro MS/MS:masa de los fragmentos
Mezcla de péptidos
MS/MS+
+
+
++
+
1 péptido seleccionado para MS/MS
Espectro MS
Carlos Cerveñansky
Espectrometría de masa
4
Espectrometría de masa
H2N CH C
R1
OHN CH C
R2
OHN CH C
R3
OH
O
b1
y2
b2
y1
N-terminal
C-terminal
MS/MS: Espectrometría en Tandem
Espectrometría de masa
Fragmentación peptídica
Roepstorff & Fohlman, Biomed.Mass Spec., 11,601(1984)
La fragmentación más común se da en el enlace peptídico, generando fragmentos b e y
6
MS/MS: Espectrometría en Tandem
Espectrometría de masa
Fragmentación peptídica
Roepstorff & Fohlman, Biomed.Mass Spec., 11,601(1984)
y ionsb ions
b1
b2
b3
b4
y4
y3
y2
y1
http://db.systemsbiology.net:8080/proteomicsToolkit/FragIonServlet.html
Espectrometría de masa
Las m/z medidas por MS/MS se comparan con tablas de masas teoricas obtenidas con la secuencia del peptido, que puede ser obtenida de bases de datos
b1
b2b3
y1
y2
y3
LF
K
G
G L
K
F
Rela
t ive
Inte
nsit
y
m/z
F L G K++
F L G K++
F L G K++
CID
F L G K++
F L G K++
F L G K++
b1
b2
b3
y3
y2
y1 F L G K++
F L G K+
Espectrometría de masa
Para asignar los iones b/y tenemos que conocer la secuencia de aa.
Se puede hacer secuenciacion “de novo” pero requiere experimentos adicionales e instrumentos de alta resolucion
Fragmentacion de Peptidos por MS/MS
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Rel
ativ
e A
bund
ance
395.2
y9
b4
400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400
m/z
887.6
986.6
774.51186.7494.3
1168.71085.7607.4 1243.7
673.5
1006.6 1119.6779.5476.3 589.3 984.6708.4466.3
885.61184.7
772.5
y13
y12
y12*y11
y10
y8
y7
b13
b12b11
b10
b8b7
b6
b5
b6*b5*
a5 a12
His-Gly-Thr-Val-Val-Leu-Thr-Ala-Leu-Gly-Gly-Ile -Leu-Lysb1 b4b3 b5 b6 b7 b8 b9 b10b2 b11 b12 b13
y13 y10y11 y9 y8 y7 y6 y5 y4y12 y3 y2 y1
MS/MS: Espectrometría en Tandem
Espectrometría de masa
Cómo se hace?
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MS/MS: Espectrometría en Tandem
Espectrometría de masa
ESI-QQ1Q2Q3: Triple Cuadrupolo.
Q1 Selecciona el ion molecular “padre”Q2 sirve de cámara de colisión: Se introduce un gas para que los iones acelerados choquen y se fragmenten (CID)Q3 Analiza los iones “hijo”
Select Parent Fragment Analyse Fragment
Masses
Q1 Q2 Q3
13
MS/MS: Espectrometría en Tandem
Espectrometría de masa
ESI-QQ1Q2Q3: Triple Cuadrupolo.
Q2 sirve de cámara de colisión: Se introduce un gas para que los iones acelerados choquen y se fragmenten
CID: Collision Induced Dissociation
Se usa mucho para realizar cuantificaciones por LC-MS-MS
MassAnalysis
peptides
protein
peptides
++
+
+
++++
IonizationDigestion
m/z
MS
MS/MS: Espectrometría en Tandem
Espectrometría de masa
Ionization Isolation Fragmentation MassAnalysis
proteinpeptide
fragments
Digestion
peptides
+++
+
++
++ ++
+++
++
++++ +
m/zm/z
MS MS/MS
m/z
Isolation
MS/MS: Espectrometría en Tandem
Espectrometría de masa
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MS/MS: Espectrometría en TandemESI-ITIT: Trampa de IonesLa trampa de iones puede analizar los iones de una muestra MS
También puede seleccionar uno, y concentrarlo en la trampa
Luego se aceleran los iones para que choquen con Helio y se fragmenten
Luego se analizan los iones hijo
CID: Collision Induced Dissociation
Las trampas de iones tienen capacidad de hacer MSn se seleccionan iones hijo se fragmentan, analizan, seleccionan uno fragmentan, analizan, seleccionan uno hasta que les de la sensibilidad
MS2
Espectrometría de masa
Fragment 426.7
Isolate Parent Ion
Intact ions
Intact ion
Daughters
This analysis/isolation/fragmentation can be carried out in an ion trap
Tandem en el tiempo
Espectrometría de masa
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MS/MS: Espectrometría en Tandem
Espectrometría de masa
MALDI-TOFIones moleculares que se fragmentan durante el vuelo llegan juntos al “reflector” y pueden ser analizados por el mismo. PSD: Post Source Decay
ESQUEMA:
Instrumento de tecnología MALDI-TOF
Camera
Laser
plate
Pumping Pumping
Beam guide
Timed ion selector Reflector
Linear detector
Extractiongrids Reflector
detector
Espectrometría de masa
20
Espectrometría de masa
Identificación de sitios de modificación
Oxidación de citocromo c
Y74
Y67
Y48Y97
Y74
Y67
Y48Y97
Located in mitochondria, plays an important role in apoptosis intrinsic pathway and has been linked to oxidative stress responses
[H2O2]
37°C,1 Hr
aPLPC
TOCL
sh_2025_MM_102010p_alpha_PLPC #3206 RT: 29.05 AV: 1 NL: 6.69E2F: ITMS + c NSI d Full ms2 [email protected] [125.00-1510.00]
200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200m/z
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
85
90
95
100
Rel
ativ
e A
bund
ance
744.39567.35
638.40
415.40
480.27
631.47
857.32751.40
376.42
358.72 620.49 815.44235.14319.73 684.20484.34
265.93 928.57489.64 1220.79216.16783.42 996.71859.49 1108.26
b10y9
b8
b7
b6
y5
y4
b5y7(2+)
y5(2+)
y6(2+)
b7-CO(2+)
y12 y11 y10 y9 y8 y7 y6 y5 y4 y3 y2 y1T---E---R---E---D---L---I---A---Y*--L---K---Kb1 b2 b3 b4 b5 b6 b7 b8 b9 b10 b11 b12
Y+16
GAPDHReaction withNitro-oleic acid
Batthyany J.Biol.Chem. 2006, p.20450
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Identificación de proteínasPeptide mass fingerprinting y
proteomica
Espectrometría de masa
26
Identificación de proteínasEspectrometría de masa
Huella peptídica
Cada proteína, cortada con una proteasa de especificidad conocida, da una serie de péptidos de masa determinada que puede ser usada para identificar la proteína (huella peptídica)
En el 2003 se terminó de secuenciar el primer genoma humano.
De la secuencia del ADN se puede determinar la secuencia de aminoácidos de todas las proteínas potencialmente expresables.
Hoy contamos con cerca de 20.000 Genomas secuenciados, y mas por salir.
5000 7000 9000 11000 13000 15000
Mass (m/z)
0
6.0E+4
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
% In
tens
ity
Voyager Spec #1=>BC=>NF0.9[BP = 12364.9, 60367]
12366.46
6187.17
12583.58
12326.17
6292.68
12784.48
Espectro de masa del citocromo c de caballo
A. Molécula entera. Matriz: ácido sinapínico
GDVEKGKKIFVQKCAQCHTVEKGGKHKTGPNLHGLFGRKTGQAPGFTYTDANKNKGITWKEETLMEYLENPKKYIPGTKMIFAGIKKKTEREDLIAYLKKATNE
Secuencia AA citocromo c de caballo
Digestión in silicopor tripsina (corta despues de K o R)
Lista de péptidos teóricos
GDVEK GDVEKGKGK GKKIFVQK IFVQKCAQCHTVEKCAQCHTVEK CAQCHTVEKGGKGGKHKTGPNLHGLFGRKTGQAPGFTYTDANKNKGITWKEETLMEYLENPKKYIPGTKMIFAGIKKKTEREDLIAYLKKATNE
Se calculan las masas teóricas para todos los péptidos posibles y se comparan con los resultados de MS de cytc tratado con tripsina
1000 1160 1320 1480 1640 1800Mass (m/z)
0
2.0E+4
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
% In
tens
ity
Voyager Spec #1=>MC=>BC[BP = 1633.6, 19883]
1168.61
1190.54
1212.53 1433.76
1655.591170.181213.531296.681152.361046.18 1631.621350.70 1478.821124.52 1230.50
1633.82
B. Molécula digerida con tripsina. Matriz: ácido -ciano hidroxicinámico
Masa Teorica (Da)
Masa Medida (Da)
Error (Da) Residuos Secuencia
1168.61 1168.61 0.00 28-38 TGPNLHGLFGR 1296.71 1296.68 0.03 28-39 TGPNLHGLFGRK 1350.72 1350.69 0.03 89-99 TEREDLIAYLK 1433.77 1433.76 0.01 26-38 HKTGPMLHGGLFGR 1470.68 1470.67 0.01 40-53 TGQAPGFTYTDANK 1478.82 1478.82 0.00 89-100 TEREDLIAYLKK 1478.82 1478.82 0.00 88-99 KTEREDLIAYLK 1633.81 1633.82 0.01 9-22 IFVQKCAQCHTVEK
Niveles de información……… en la caracterización de proteínas por MS.
• medida de masa de una molécula entera 1 valor experimental
• medidas de masas en mapeo peptídico 5-20 valores experimentales
• secuenciado de péptidos por MS/MS más de 100 valores experimentales
…mejora en cantidad y calidad de la información
Peptide fragmentation fingerprinting
Enzymaticdigestion
In-silicodigestion
Protein(s) Peptides340.695086676.96063498.8283545.5641171.967066261.107346342.51458456.727405363.268365
MS/MS spectra of peptides
Ions peaklists
…MAIILAGGHSVRFGPKAFAEVNGETFYSRVITLESTNMFNEIIISTNAQLATQFKYPNVVIDDENHNDKGPLAGIYTIMKQHPEEELFFVVSVDTPMITGKAVSTLYQFLV …
- MAIILAGGHSVR- FGPK- AFAEVNGETFYSR- VITLESTNMFNEIIIK- YPNVVIDDENNDK…
Sequence database entry
361.107346338.695086676.96063498.82831045.5641171.967066342.51458457.827405263.268453
Theoretical peaklist
Theoretical proteolytic peptides
Match
Result: ranked list of peptide
and protein
candidates
Theoretical fragmented
peptides
-MAIILAG-MAIILA-MAIIL-MAII-MAI-M-M-AIILAG
In-silicofragmentation
PFF = ion search MS/MS database matching
Proteoma• El término “proteoma” fue acuñado por Marc
Wilkins en 1995, como el complemento de PROTEínas al genOMA
• Es el producto final del genoma más variedad• Es una entidad dinámica Fenotipo• Modificaciones posttraduccionales• No todos los genes se expresan como proteínas en
todos los estadios/tipos celulares
Proteoma• Del gen a la proteína final, pueden ocurrir
muchas modificaciones que no son predecibles por la secuencia de ADN original
• 1 gen ya no equivale a 1 proteína
Sujetos de estudio de la Proteómica
• Identificación de Proteínas (pept mass fingerprint)• Comparación de niveles de expresión de proteinas• Función de Proteinas• Modificaciones posttraduccionales de Proteinas• Localización y Compartimentalización de Proteinas • Interacciones Proteina-Proteina
Quantitative proteomics
Quantitative proteomics
MS-Imaging
MS-Imaging
ConclusionesLa espectrometría de masa es una técnica con muchísimas aplicaciones y aún tiene mucho potencial por desarrollar